WO2002004656A2 - Biosonden und deren verwendung - Google Patents

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    • B03C—MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C5/00—Separating dispersed particles from liquids by electrostatic effect
    • B03C5/005—Dielectrophoresis, i.e. dielectric particles migrating towards the region of highest field strength

Definitions

  • the invention relates to biosondes which change their electrical and / or dielectric properties through specific binding to biological material and thereby enable detection and / or purification of the material modified in this way by means of electrophoresis and / or dielectrophoresis.
  • bioanalytics and diagnostics the task is often to selectively separate one or more biological species from a template of biological material or from a background that consists of very similar biological species.
  • the biological material can be tissue, cells, viruses, cell organelles, proteins, protein complexes, carbohydrates, lipids or other organic compounds or a mixture of the groups listed.
  • the different species accordingly come from at least one of these groups.
  • the differences in the properties of the different biological species on which the separation or detection principle is based can be very small, so that separation and / or detection is often very difficult or impossible to achieve.
  • Methods in which the biological material is selectively labeled in a specific way and only possible because of the labeling or because of the properties changed by the labeling separation or detection of the different species are all methods which are based on an antibody-antigen interaction. Examples of this are ELISA procedures (enzyme-linked immunosorbent assay) and certain variants of FACS (fluorescence-activated cell sorting) and MACS (magnetic-activated cell sorting). In these cases, using specific binding antibodies, an enzyme, a fluorescent dye or a magnetic bead is selectively bound to certain species of the biological material in order to enable detection or purification of the species thus labeled.
  • Free flow electrophoresis (Bauer, J. (1999) J. Chrom. B 722: 55) is an example of a method in which the separation of biological material is very difficult. In this process, a laminar flow of liquid is passed between two closely spaced glass plates. An electrical field applied perpendicular to the direction of flow enables the different species of the submitted biological material to be separated on the basis of their different charges. For example, if the FFE is used to separate cells, they will be attracted electrically by the cathode due to their negative charge. The lateral rate of migration of the cells depends on the surface charge density of the cells. Cells with different surface charge densities have different lateral ones
  • the decisive disadvantage of the FFE is that biological material often has very similar charging properties. Cells, for example, all have a negative and moreover, an almost identical surface charge density and can therefore only be separated from one another very poorly using FFE. A sufficient degree of selectivity can often only be achieved with the FFE if the surface charge density of the cells has been sufficiently modified by a pathogenic change. For this reason, the use of the FFE has declined very sharply today and the method has been replaced by other, often more expensive and more expensive equipment.
  • Dielectrophoresis is a process that takes advantage of the dielectric properties of biological material to separate it. Dielectrophoresis takes place when biological material is exposed to inhomogeneous alternating electrical fields. The biological material moves in the inhomogeneous electrical field due to its dielectric properties (permanent or inducible electrical dipole), which makes separation possible.
  • dielectrophoresis In cells, for example, there are different areas that can be polarized and can thus be used for dielectrophoresis. These include the electrical charge double layer that surrounds a cell, the cell membranes that bound the cell or the cell organelles, and the polar cytoplasm in the interior of the cell. Dielectrophoresis can be used, for example, to separate cells, bacteria and other microorganisms. The use of dielectrophoresis is also conceivable for the separation of other biological material such as nucleic acids, proteins, lipids or other organic compounds. Dielectrophoresis can be used, for example, to examine drinking water, food and biological fluids for pathogenic microorganisms or to enrich stem cells from the bone marrow or peripheral blood. The disadvantage of dielectrophoresis is that the dielectric properties of biological materials are often very similar to 'make it difficult to perform separation of different species.
  • the object of the invention is therefore to increase the selectivity of electrophoretic and / or dielectrophoretic methods and thus to provide an improved detection and / or cleaning method
  • the object is achieved by the specific binding of bio-probes to a specific species or to a group of specific species from a template of biological material which contains at least one species, which selectively and specifically changes the electrical and / or dielectric properties of the species thus labeled and thereby the cleaning and / or detection of the species so marked or of the complex formed by binding the biosonde and biosonde and biological species is possible.
  • the biological material in particular comprises at least one species from at least one group selected from tissue, cells, cell organelles, viruses, proteins, peptides, nucleic acids, carbohydrates, lipids or other organic compounds, it being possible for the species to also be modified.
  • the main advantage of the invention described here compared to the conventional methods lies in the possibility of simple and rapid separation and / or detection of the complex of biological species and biosonde which is formed by binding the biosonde to the biological species, which on the one hand can be used to to enable the detection or purification of the species so selectively labeled, but conversely it can also be used to selectively separate one or more biosondes from a template of biosondes with different binding specificities.
  • the biological material can be different before performing the separation process, in particular with a library of biosondes according to the invention Binding specificity can be contacted so that selectively binding biosondes can be identified and isolated from the library.
  • the decisive advantage of the method according to the invention compared to methods such as FACS and MACS is that the biosonde does not have to be modified in a complex manner with a fluorescent dye or a magnetic bead in order to enable detection and / or purification of the labeled biological material, and also that the outlay on equipment is also high , which is inevitable with processes such as FACS or MACS, is no longer required.
  • the method according to the invention for the detection or purification of biological material can in particular comprise the following steps: a) Presentation of biological material which contains different species. b) adding a biosonde containing a part A which binds specifically to at least one of the species and a part B which changes the electrical and / or dielectric properties of the species (s) marked by specific binding of the biosonde so that the detection and / or the purification of these labeled species (s) is made possible or improved by electrophoresis and / or dielectrophoresis, c) by establishing an electric field for the detection or purification of the complex or complexes from biological species (s) and specifically bound biosonde Electrophoresis or dielectrophoresis.
  • the method according to the invention can, in order to identify and isolate bio-probes that bind specifically to submitted biological material, in particular comprise the following steps: a) presentation of biological material which contains at least one species, b) addition of a bio-probe or different bio-probes, each containing part A, can bind specifically to at least one of the species, and a part B, which is the electrical and / or dielectric Properties of the species (s) marked by binding of a biosonde are changed, so that detection and / or purification of a complex of biological species (s) and biological material which is formed in this way is possible, the different biosondes having different binding specificities and at least one of the added ones
  • Biosonde binds to the biological material, c) Establishment of an electric field for the detection or purification of the complex or complexes of biological species (s) and specifically bound biosonde by electrophoresis or dielectrophoresis.
  • the various bio-probes according to point (b) can in particular be a library of bio-probes of different substrate specificity, which comprises more than 10 9 , in particular more than 10 12 different bio-probes.
  • biosondes according to the invention comprise part A, which is the specific one
  • Part B which changes the properties of the biological material in the desired manner, i.e. with regard to electrophoresis, the charge, with respect to dielectrophoresis, the dielectric constant or the specific conductivity or Polarizability changed.
  • Parts A and B do not have to be structurally separated.
  • Part A of the biosonde is or comprises, for example, a peptide that specifically binds to biological material.
  • a peptide receptor that is located on the biological material.
  • An example of such an interaction is that of the factor receptor Ste2p from Saccharomyces cerevisiae with the associated peptide ligand ⁇ factor.
  • Further examples are the TSH receptor (Schuppert et al. (1996) Thyroid 6: 575), the FSH receptor (Tilly et al. (1992) Endocrinology 131: 799), the EGF receptor (Christensen et al. (1998 ) Dan. Med. Bull. 45: 121), the TNF receptor (Murphy et al.
  • Thymus 23: 177 the transferrin receptor (Ponka and Lok (1999) Int. J. Biochem. Cell Biol. 31: 1111), the insulin receptor (Milazzo et al. (1992) Cancer Res. 52: 3924), the FGF receptor (Kiefer et al. (1991) Growth Factors 5: 1 15), the TGFß receptor (Derynck et al. (1994) Princess Takamatsu Symp. 24: 264), the IGF receptor (Peyrat and Bonneterre (1992) Breast Cancer Res. Treat. 22: 59) , the angiotensin II receptor (Smith and Timmermans (1994) Curr. Opin. Nephrol. Hypertens.
  • the specifically binding part A can also be an antibody, in particular, for example, an antibody that recognizes marker structures on cell surfaces.
  • An example of such a marker structure is the
  • Part A can also consist of a low-molecular structure that specifically binds to biological material.
  • a low molecular structure is acetylcholine, which is specifically bound by the acetylcholine receptor.
  • Part A of the biosonde can, for example, also be a carbohydrate, a lipid, an inorganic compound, a nucleic acid or another ligand that specifically binds to biological material, or can comprise one of these groups.
  • Part B of the biosonde which is linked to Part A, is or comprises a structure which, when bound to the biological material, changes its electrical and / or dielectric properties so that the behavior of the biological material thus modified changes in an electrical and / or dielectric field changed. This can be done, for example, by introducing electrical charge, by changing the dielectric constant and / or by changing the specific conductivity of the biological material.
  • Examples of carriers of electrical charge in this sense are acidic and basic amino acids (aspartate, glutamate, lysine, arginine), nucleic acids (single-stranded and double-stranded DNA and RNA, DNA / RNA heteroduplex), organic acids and bases (tartrate, citrate, amines) , polyquaternary amines and inorganic charge carriers.
  • Structures that change the dielectric behavior of the biological material include, in addition to the structures mentioned above, hydrophobic, electrically neutral structures such as lipids, fatty acids, waxes, oils and sterols.
  • part B of the biosonde is or comprises a nucleic acid which is covalently linked to part A of the biosonde directly or via an intermediate member.
  • the nucleic acid here preferably comprises at least 5 or 10, particularly preferably at least 15 or 20, nucleotides.
  • part B comprises the
  • Biosonde is a nucleic acid comprising the genetic information for Part A of the biosonde, wherein Part A of the biosonde comprises a protein or polypeptide and Part B of the biosonde comprises a single or double stranded RNA or DNA or an RNA / DNA heteroduplex which is covalent is linked to part A of the biosonde.
  • part A of the biosonde also comprises a ligand for the Ste2p receptor, the TSH receptor, the FSH receptor, the EGF receptor, the TNF receptor, the transferrin receptor, the insulin receptor, the FGF - Receptor, the TGFß receptor, the IGF receptor, the angiotensin II receptor or the somatostatin receptor and part B of the biosonde each have a nucleic acid which comprises the sequences coding for the ligands mentioned.
  • part A and part B of the biosonde are preferably covalently linked to one another via a unit which is able to take over the growing peptide chain in a ribosomally catalyzed translation reaction with the formation of a covalent bond.
  • this unit comprises, for example, a puromycin- or puromycin-analogous molecule and / or an amino acid or an amino acid-analogous molecule.
  • a puromycin- or puromycin-analogous molecule and / or an amino acid or an amino acid-analogous molecule.
  • Roberts et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Be. USA 94: 12297, WO98 / 16636 and Krayevsky et al. (1979) Progress in Nucleic Acids Research and Molecular Biology 23: 1.
  • a labeling of these species with a fluorescent dye, a dye (such as propidium iodide, calcofluor), a correspondingly labeled specifically binding antibody (e.g. FITC), a radioactive label (eg 35 S-methionine) or another compound that enables simple detection of the biological material.
  • a fluorescent dye such as propidium iodide, calcofluor
  • a correspondingly labeled specifically binding antibody e.g. FITC
  • a radioactive label eg 35 S-methionine
  • Biochips as described by Cheng et al. (Cheng et al. (1998) Anal. Chem. 70: 2321). Biochips allow separation and / or detection to be carried out in miniaturized form. Due to the miniaturization, the experimental effort e.g. compared to FACS can also be reduced.
  • the dielectric separation of cells on a chip has already been reported (Cheng et al. (1998) Anal. Chem. 70: 2321), in which case the differences in the dielectric properties of the species to be separated were large enough to to enable a separation.
  • the use of the biosondes according to the invention also allows biological species to be separated if the differences in the dielectric properties of the biological species themselves are not large enough to enable separation by means of dielectrophoresis.
  • the biosonde is based on a DNA sequence via an in vitro
  • the peptide formed during translation is covalently linked to its mRNA via a puromycin.
  • the peptide Share represents the specific binder, while the mRNA share changes due to its strong negative charge in the neutral pH range ' the physical properties of the biological material so that a selection or detection is made possible.
  • the biological material is a population of yeast cells of the species Saccharomyces cerevisiae of the mating type MATa, which express the ⁇ -factor receptor (STE2) (Davis and Davey (1997) Biochem. Soc. Trans. 25: 1015).
  • PCR Chain reaction
  • the DNA molecule contains the following sequence regions: a T7 promoter sequence, a TMV translation initiation sequence, a coding region with a 5 'coded E-tag, a ct factor sequence and a 3' coded Strep tag.
  • the implementation of the PCR is state of the art and looks as follows: The following components are placed in a PCR reaction vessel:
  • 1 ⁇ l DNA (from the oligonucleotide synthesis corresponds to 1 nmol, Seq. 1) 10 ⁇ l Taq polymerase buffer 10x (Promega, Mannheim)
  • the PCR program is characterized as follows: 10 cycles with 1 min 95 ° C, 2 min 55 ° C, 2 min 72 ° C.
  • the DNA is quantified and about 1 nmol of the double-stranded DNA is expressed as
  • Template used for in vitro transcription The transcription is carried out using a commercially available system from Ambion (Austin, USA). The standard approach is as follows: 50 ⁇ l DNA template (1 nmol)
  • Chloroform extraction worked up (Davis et al. 1994) and then quantified.
  • the mRNA must be modified at the 3 'end so that there is a short DNA sequence on the mRNA and a puromycin at its 3' end. This technique is described by Roberts and Szostak (1997; see above). In the exemplary embodiment, the modification is as follows:
  • the mixture is heated to 70 ° C. for 3 min and cooled at RT for 15 min.
  • the puromycin-bearing linker is ligated to the mRNA at room temperature.
  • the entire batch is mixed with 10 nmol antisplint (Seq. 7) and opened for 5 min
  • the ligation mixture is then cooled on ice and the ligated mRNA is quantified.
  • Methionine (APbiotech, Freiburg), 15 ⁇ l amino acid master mix without methionine (Ambion, Austin) and 200 ⁇ l Retic Lysate IVT (Ambion, Austin) added and translated. It is made up to 300 ⁇ l with H 2 O. The mixture is incubated at 30 ° C for 30 min. Then 100 ⁇ l 2.5 M KCI and 70 ⁇ l 1 M MgCI 2 are added. The batch is stored at -20 ° C. overnight.
  • the translation mixture is mixed with 10 ml binding buffer (100 mM Tris / HCl pH 8.0; 10 mM EDTA pH 8.0; 1 M NaCl; 0.25%
  • the mixture is incubated at 4 ° C. for one hour.
  • the cellulose with the bound bio-probes is separated by filtration and with 8 ml Binding buffer washed.
  • the biosondes are eluted with 4 times 100 ⁇ l H 2 0.
  • the biosondes are quantified by determining the 35 S decays in a scintillation counter and can then be used for binding to the biological material.

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Abstract

Die Erfindung betrifft den Einsatz von Biosonden, die spezifisch an biologisches Material binden und dadurch die Detektion und/oder Trennung des so markierten Materials aus einer Umgebung ähnlichen biologischen Materials mittels Elektrophorese oder Dielektrophorese ermöglichen. Die Biosonden zeichnen sich dadurch aus, daß sie die elektrischen und/oder dielektrischen Eigenschaften des biologischen Materials verändern.

Description

Beschreibung
Biosonden und deren Verwendung
Die Erfindung betrifft Biosonden, die durch spezifische Bindung an biologisches Material dessen elektrische und/oder dielektrische Eigenschaften verändern und dadurch eine Detektion und/oder Reinigung des so modifizierten Materials mittels Elektrophorese und/oder Dielektrophorese ermöglichen.
In der Biotechnologie, Bioanalytik und Diagnostik stellt sich häufig die Aufgabe, eine oder mehrere biologische Spezies selektiv aus einer Vorlage von biologischem Material bzw. von einem Hintergrund, der aus sehr ähnlichen biologischen Spezies besteht, abzutrennen. Bei dem biologischen Material kann es sich hierbei etwa um Gewebe, Zellen, Viren, Zellorganellen, Proteine, Proteinkomplexe, Kohlenhydrate, Lipide oder andere organische Verbindungen oder eine Mischung der aufgeführten Gruppen handeln. Die unterschiedlichen Spezies stammen entsprechend aus mindestens einer dieser Gruppen. Die Unterschiede in den Eigenschaften der verschiedenen biologischen Spezies, auf denen das Trennungs- oder Detektionsprinzip beruht, können sehr gering sein, so daß eine Trennung und/oder Detektion oft sehr schwierig oder überhaupt nicht zu erreichen ist.
Es existieren eine Vielzahl von Lösungsstrategien zum Nachweis und zur Trennung von biologischem Material (Lottspeich and Zorbas (1998) Bioanalytik. Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg). Grundsätzlich kann man Methoden, die sich die Unterschiede in den Eigenschaften der aufzutrennenden Spezies zur Trennung und zum Nachweis nutzbar machen, von solchen unterscheiden, bei denen erst durch eine selektive Modifikation des vorgelegten biologischen Materials die Detektion und Trennung der Spezies erreicht werden kann. Die den dem biologischen Material eigenen Eigenschaften, die zur Detektion und/oder Trennung verschiedener Spezies- verwendet werden, sind u.a. Polarität, Hydrophobizität, Ladung, Größe, Gewicht und Dichte. Beispiele für Verfahren, die sich diese Eigenschaften zunutze machen, sind Elektrophorese, Gelfiltration, Affinitätschromatographie und Zentrifugation.
Verfahren, bei denen das biologische Material selektiv auf spezifische Weise markiert wird und erst aufgrund der Markierung oder aufgrund der durch die Markierung veränderten Eigenschaften Trennung oder Nachweis der verschiedenen Spezies möglich werden, sind alle Verfahren, die auf einer Antikörper-Antigen- Wechselwirkung basieren. Beispiele hierfür sind ELISA-Ver ahren (enzyme-linked immunosorbent assay) und bestimmte Varianten von FACS (fluorescence-activated cell sorting) und MACS (magnetic-activated cell sorting). In diesen Fällen wird unter Verwendung von spezifisch bindenden Antikörpern selektiv ein Enzym, ein Fluoreszenzfarbstoff oder ein Magnetkügelchen an bestimmte Spezies des biologischen Materials gebunden, um Detektion oder Reinigung der so markierten Spezies zu ermöglichen.
Als Beispiel für ein Verfahren, bei dem eine Auftrennung von biologischem Material nur sehr schlecht möglich ist, sei die free flow-Elektrophorese (FFE) genannt (Bauer, J. (1999) J. Chrom. B 722: 55). Bei diesem Verfahren wird ein laminarer Flüssigkeitsstrom zwischen zwei eng beieinander stehenden Glasplatten hindurchgeleitet. Durch ein senkrecht zur Fließrichtung angelegtes elektrisches Feld kann eine Auftrennung der verschiedenen Spezies des vorgelegten biologischen Materials aufgrund ihrer unterschiedlichen Ladung erreicht werden. Wird die FFE beispielsweise zur Auftrennung von Zellen eingesetzt, so werden diese aufgrund ihrer negativen Ladung von der Kathode elektrisch angezogen. Die laterale Wanderungsgeschwindigkeit der Zellen hängt hierbei von der Oberflächenladungsdichte der Zellen ab. Zellen mit unterschiedlichen Oberflächenladungsdichten haben unterschiedliche laterale
Wanderungsgeschwindigkeiten und können so voneinander getrennt werden. Der entscheidende Nachteil der FFE ist, daß biologisches Material vielfach sehr ähnliche Ladungseigenschaften besitzt. Zellen etwa besitzen alle eine negative und zudem vielfach eine fast identische Oberflächenladungsdichte und können so nur sehr schlecht mittels FFE voneinander getrennt werden. Oft ist bei der FFE nur dann eine ausreichende Trennschärfe zu erreichen, wenn durch eine pathogene Veränderung die Oberflächenladungsdichte der Zellen hinreichend modifiziert ist. Aus diesem Grund ist der Einsatz der FFE heute sehr stark zurückgegangen und die Methode wurde durch andere, vielfach teurere und apparativ aufwendigere Methoden verdrängt.
Auch bei dem relativ neuen Verfahren der Dielektrophorese (Fiedler et al. (1998) Anal. Chem. 70: 1909; Betts et al. (1999) J. Appl. Microbiol. Symp. Suppl. 85: 201) hat man mit ähnlichen Problemen zu tun, wie sie sich bei elektrophoretischen Verfahren, wie der zuvor beschriebenen FFE ergeben. Die Dielektrophorese (DEP) ist ein Verfahren, bei dem man sich die dielektrischen Eigenschaften von biologischem Material zunutze macht, um dieses voneinander zu trennen. Dielektrophorese findet statt, wenn man biologisches Material inhomogenen elektrischen Wechselfeldern aussetzt. Das biologische Material bewegt sich in dem inhomogenen elektrischen Feld aufgrund seiner dielektrischen Eigenschaften (permanenter oder induzierbarer elektrischer Dipol), wodurch eine Auftrennung möglich wird. In Zellen beispielsweise gibt es verschiedene Bereiche, die polarisierbar sind, und damit für die Dielektrophorese nutzbar gemacht werden können. Hierzu gehören die elektrische Ladungsdoppelschicht, die eine Zelle umgibt, die Zellmembranen, die die Zelle bzw. die Zellorganellen begrenzen, sowie das polare Cytoplasma im Zellinnem. Die Dielektrophorese kann beispielsweise verwendet werden zur Auftrennung von Zellen, Bakterien und anderen Mikroorganismen. Denkbar ist der Einsatz der Dielektrophorese aber ebenso zur Auftrennung von anderem biologischen Material wie etwa Nukleinsäuren, Proteinen, Lipiden oder anderen organischen Verbindungen. Anwendungsmöglichkeiten der Dielektrophorese sind z.B. die Untersuchung von Trinkwasser, Lebensmitteln und biologischen Flüssigkeiten in Hinblick auf krankheitserregende Mikroorganismen oder die Anreicherung von Stammzellen aus dem Knochenmark oder periphären Blut. Der Nachteil der Dielektrophorese ist, daß auch die dielektrischen Eigenschaften von biologischem Material oft sehr ähnlich' sind, wodurch eine Auftrennung von unterschiedlichen Spezies erschwert wird.
Die erfindungsgemäße Aufgabe besteht deshalb darin, die Trennschärfe von elektrophoretischen und/oder dielektrophoretischen Verfahren zu vergrößern und damit ein verbessertes Nachweis- und/oder Reinigungsverfahren zur Verfügung zu stellen,
Gelöst wird die Aufgabe durch die spezifische Bindung von Biosonden an eine bestimmte Spezies oder an eine Gruppe bestimmter Spezies aus einer Vorlage von biologischem Material, das mindestens eine Spezies enthält, wodurch selektiv und spezifisch die elektrischen und/oder dielektrischen Eigenschaften der so markierten Spezies verändert werden und dadurch die Reinigung und/oder Detektion der so markierten Spezies bzw. des durch Bindung der Biosonde entstandenen Komplexes aus Biosonde und biologischer Spezies möglich wird.
Das biologische Material umfasst hierbei erfindungsgemäß insbesondere mindestens eine Spezies aus mindestens einer Gruppe ausgewählt aus Gewebe, Zellen, Zellorganellen, Viren, Proteine, Peptide, Nukleinsäuren, Kohlenhydrate, Lipide oder andere organische Verbindungen, wobei die Spezies auch modifiziert sein können.
Der wesentliche Vorteil der hier beschriebenen Erfindung gegenüber den üblichen Verfahren liegt in der Möglichkeit der einfachen und schnellen Trennung und/oder Detektion des durch Bindung der Biosonde an die biologische Spezies entstandenen Komplexes aus biologischer Spezies und Biosonde, was zum einen dazu verwendet werden kann, um den Nachweis oder die Reinigung der so selektiv markierten Spezies zu ermöglichen, umgekehrt aber auch dazu verwendet werden kann, eine oder mehrere Biosonden aus einer Vorlage von Biosonden mit unterschiedlichen Bindungsspezifitäten selektiv abzutrennen. In letzterem Fall kann das biologische Material vor Durchführung des Trennverfahrens insbesondere mit einer Bibliothek von erfindungsgemäßen Biosonden unterschiedlicher Bindungsspezifität kontaktiert werden, so dass aus der Bibliothek selektiv bindende Biosonden identifiziert und isoliert werden können.
Der entscheidende Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens gegenüber Verfahren wie FACS und MACS ist, daß die Biosonde nicht auf aufwendige Weise mit einem Fluoreszenzfarbstoff oder einem Magnetkügelchen modifiziert werden muß, um Detektion und/oder Reinigung des markierten biologischen Materials zu ermöglichen, und daß ebenfalls der apparative Aufwand, der bei Verfahren wie FACS oder MACS unumgänglich ist, wegfällt.
Das erfindungsgemäße Verfahren zum Nachweis oder zur Reinigung von biologischem Material kann insbesondere folgende Schritte umfassen: a) Vorlage von biologischem Material, das unterschiedliche Spezies enthält. b) Hinzufügen einer Biosonde, enthaltend einen Teil A, der spezifisch an mindestens eine der Spezies bindet, und einen Teil B, der die elektrischen und/oder dielektrischen Eigenschaften der durch spezifische Bindung der Biosonde markierten Spezie(s) verändert, so daß der Nachweis und/oder die Reinigung dieser markierten Spezie(s) durch Elektrophorese und/oder Dielektrophorese ermöglicht oder verbessert wird, c) Aufbau eines elektrischen Feldes zum Nachweis oder zur Reinigung des Komplexes bzw. der Komplexe aus biologischer Spezie(s) und spezifisch gebundener Biosonde durch Elektrophorese oder Dielektrophorese.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann zwecks Identifizierung und Isolierung von spezifisch an vorgelegtes biologisches Material bindende Biosonden insbesondere folgende Schritte umfassen: a) Vorlage von biologischem Material, das mindestens eine Spezie enthält, b) Hinzufügen einer Biosonde oder verschiedener Biosonden, enthaltend jeweils einen Teil A, der spezifisch an mindestens eine der Spezies binden kann, und einen Teil B, der die elektrischen und/oder dielektrischen Eigenschaften der durch Bindung einer Biosonde markierten Spezie(s) verändert, so daß Detektion und/oder Reinigung eines so entstehenden Komplexes aus biologischer Spezie(s) und biologischem Material möglich wird, wobei die verschiedenen Biosonden unterschiedliche Bindungsspezifitäten besitzen und mindestens eine der hinzugefügten
Biosonden an das biologische Material bindet, c) Aufbau eines elektrischen Feldes zum Nachweis oder zur Reinigung des Komplexes bzw. der Komplexe aus biologischer Spezie(s) und spezifisch gebundener Biosonde durch Elektrophorese oder Dielektrophorese. Bei den verschiedenen Biosonden gemäß Punkt (b) kann es sich hierbei insbesondere um eine Bibliothek von Biosonden unterschiedlicher Substratspezifität handeln, die mehr als 109, insbesondere mehr als 1012 verschiedene Biosonden umfaßt.
Die erfindungsgemäßen Biosonden umfassen einen Teil A, der die spezifische
Wechselwirkung zwischen der Sonde und dem biologischen Material vermittelt, und einen Teil B, der die Eigenschaften des biologischen Materials in der gewünschten Art verändert, also in Hinblick auf die Elektrophorese die Ladung, in Hinblick auf die Dielektrophorese die Dielektrizitätskonstante oder die spezifische Leitfähigkeit bzw. die Polarisierbarkeit verändert. Die Teile A und B müssen hierbei nicht strukturell voneinander getrennt sein.
Teil A der Biosonde ist oder umfaßt z.B. ein spezifisch an biologisches Material bindendes Peptid. In diesem Fall kommt eine spezifische Wechselwirkung zwischen dem Peptid und einem Peptid-Rezeptor, der sich auf dem biologischen Material befindet, zustande. Ein Beispiel für eine derartige Wechselwirkung ist die des - Faktor-Rezeptors Ste2p aus Saccharomyces cerevisiae mit dem dazugehörigen Peptid-Liganden α-Faktor. Weitere Beispiele sind der TSH-Rezeptor (Schuppert et al. (1996) Thyroid 6: 575), der FSH-Rezeptor (Tilly et al. (1992) Endocrinology 131 : 799), der EGF-Rezeptor (Christensen et al. (1998) Dan. Med. Bull. 45: 121), der TNF-Rezeptor (Murphy et al. (1994) Thymus 23: 177), der Transferrin-Rezeptor (Ponka and Lok (1999) Int. J. Biochem. Cell Biol. 31 : 1111 ), der Insulin-Rezeptor (Milazzo et al. (1992) Cancer Res. 52: 3924), der FGF-Rezeptor (Kiefer et al. (1991) Growth Factors 5: 1 15), der TGFß-Rezeptor (Derynck et al. (1994) Princess Takamatsu Symp. 24: 264), der IGF-Rezeptor (Peyrat and Bonneterre (1992) Breast Cancer Res. Treat. 22: 59), der Angiotensin Il-Rezeptor (Smith and Timmermans (1994) Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 3: 112) oder der Somatostatin-Rezeptor (Schonbrunn (1999) Ann. Oncol. 10 Suppl. 2: 17) und die Wechselwirkungen mit ihren jeweiligen Liganden. Analog sind alle Peptide einsetzbar, die in der Lage sind, spezifisch an das gewünschte biologische Material zu binden. Bei dem spezifisch bindenden Teil A kann es sich auch um einen Antikörper handeln, insbesondere etwa um einen Antikörper, der Markerstrukturen auf Zelloberflächen erkennt. Ein Beispiel für eine solche Markerstruktur ist der
Transferrin-Rezeptor. Teil A kann desweiteren auch aus einer niedermolekularen Struktur bestehen, die spezifisch an biologisches Material bindet. Ein Beispiel für eine derartige niedermolekulare Struktur ist Acetylcholin, das vom Acetylcholin- Rezeptor spezifisch gebunden wird. Teil A der Biosonde kann aber beispielsweise auch ein Kohlenhydrat, ein Lipid, eine anorganische Verbindung, eine Nukleinsäure oder ein anderer Ligand, der spezifisch an biologisches Material bindet, sein oder eine dieser Gruppen umfassen.
Teil B der Biosonde, der mit Teil A verknüpft ist, ist oder umfaßt eine Struktur, die bei Bindung an das biologische Material dessen elektrische und/oder dielektrische Eigenschaften verändert, so dass sich das Verhalten des so modifizierten biologischen Materials in einem elektrischen und/oder dielektrischen Feld verändert. Dies kann beispielsweise durch Einführung elektrischer Ladung, durch Veränderung der Dielektrizitätskonstanten und/oder durch Veränderung der spezifischen Leitfähigkeit des biologischen Materials geschehen. Beispiele für Träger elektrischer Ladung sind in diesem Sinne saure und basische Aminosäuren (Aspartat, Glutamat, Lysin, Arginin), Nukleinsäuren (einzelsträngige und doppelsträngige DNA und RNA, DNA/RNA-Heteroduplex), organische Säuren und Basen (Tartrat, Citrat, Amine), polyquarternäre Amine sowie anorganische Ladungsträger. Strukturen, die das dielektrische Verhalten des biologischen Materials verändern, sind neben den oben genannten Strukturen beispielsweise auch hydrophobe, elektrisch neutrale Strukturen, wie Lipide, Fettsäuren, Wachse, Öle und Sterole. In einer bevorzugten Ausführung ist oder umfaßt Teil B der Biosonde eine Nukleinsäure, die unmittelbar oder über ein Zwischenglied an Teil A der Biosonde kovalent geknüpft ist. Die Nukleinsäure umfaßt hierbei vorzugsweise mindestens 5 oder 10, besonders bevorzugt mindestens 15 oder 20, Nukleotide. In einer besonders bevorzugten Ausführung der Biosonde umfaßt Teil B der
Biosonde eine Nukleinsäure, die die genetische Information für Teil A der Biosonde umfaßt, wobei Teil A der Biosonde ein Protein oder Polypeptid umfaßt, und Teil B der Biosonde eine einzel- oder doppelsträngige RNA oder DNA oder eine RNA/DNA-Heteroduplex umfaßt, die kovalent an Teil A der Biosonde geknüpft ist. Besonders bevorzugt umfasst auch hier bei Teil A der Biosonde einen Liganden für den Ste2p-Rezeptor, den TSH-Rezeptor, den FSH-Rezeptor, den EGF-Rezeptor, den TNF-Rezeptor, den Transferrin-Rezeptor, den Insulin-Rezeptor, den FGF- Rezeptor, den TGFß-Rezeptor, den IGF-Rezeptor, den Angiotensin Il-Rezeptor oder den Somatostatin-Rezeptor und Teil B der Biosonde jeweils eine Nukleinsäure, die die für die genannten Liganden kodierende Sequenzen umfaßt. Bevorzugt sind bei dieser bevorzugten Ausführungsform Teil A und Teil B der Biosonde über eine Einheit kovalent miteinander verknüpft, die dazu in der Lage ist, in einer ribosomal katalysierten Translationsreaktion die wachsende Peptidkette unter Ausbildung einer kovalenten Bindung zu übernehmen. Diese Einheit umfasst in diesem Sinne beispielsweise ein Puromycin- oder Puromycin-analoges Molekül und/oder eine Aminosäure oder ein Aminosäure-analoges Molekül. Siehe hierzu beispielswiese auch Roberts et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94: 12297, WO98/16636 und Krayevsky et al. (1979) Progress in Nucleic Acids Research and Molecular Biology 23: 1.
Zusätzlich zur selektiven Markierung bestimmter Spezies aus dem vorgelegten biologischen Material mit einer spezifisch bindenden Biosonde kann eine Markierung dieser Spezies mit einem Fluoreszenzfarbstoff, einem Farbstoff (wie z.B. Propidiumjodid, Calcofluor), einem entsprechend markierten spezifisch bindenden Antikörper (z.B. FITC), einer radioaktiven Markierung (z.B. 35S-Methionin) oder einer anderen Verbindung, die eine einfache Detektion des biologischen Materials ermöglicht, durchgeführt werden. Der Nachweis und/oder die Auftrennung der mittels der Biosonde markierten biologischen Materialien kann entweder elektrophoretisch unter Verwendung eines konstanten elektrischen Feldes, beispielsweise durch free flow Elektrophorese, oder unter Verwendung eines inhomogenen Wechselfeldes durch Dielektrophorese erfolgen. Insbesondere bei der DEP kann durch die Verwendung der Biosonden eine signifikante Verbesserung der Trennschärfe erreicht werden.
Besonders bevorzugt anzuwenden ist das erfindungsgemäße Verfahren der Markierung von biologischen Spezies mit Biosonden und der anschließenden Auftrennung des biologischen Materials durch Elektrophorese oder Dielekrophorese bei der Verwendung von Biochips. Bevorzugt sind hierbei Biochips anzuwenden, wie sie von Cheng et al. beschrieben werden (Cheng et al. (1998) Anal. Chem. 70:2321). Biochips erlauben eine Durchführung der Trennung und/oder des Nachweises in miniaturisierter Form. Durch die Miniaturisierung kann der experimentelle Aufwand z.B. im Vergleich zu FACS zusätzlich reduziert werden.
Über die dielektrische Auftrennung von Zellen auf einem Chip ist bereits berichtet worden (Cheng et al. (1998) Anal. Chem. 70:2321), wobei in diesem speziellen Fall ι die Unterschiede in den dielektrischen Eigenschaften der aufzutrennenden Spezies groß genug waren, um eine Auftrennung zu ermöglichen. Die Verwendung der erfindungsgemäßen Biosonden erlaubt auch dann eine Auftrennung biologischer Spezies, wenn die Unterschiede in den dielektrischen Eigenschaften der biologischen Spezies selbst nicht groß genug sind, um Auftrennung durch Dielektrophorese zu ermöglichen.
Beispiele
Beispiel 1 :
Herstellung einer Biosonde Die Biosonde wird ausgehend von einer DNA-Sequenz über eine in vitro
Transkription und Translation hergestellt. Nach Roberts and Szostak (1997; Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94: 12297) wird das bei der Translation entstehende Peptid über ein Puromycin kovalent mit seiner mRNA verknüpft. Somit stellt der Peptid- Anteil den spezifischen Binder dar, während der mRNA-Anteil durch seine starke negative Ladung im neutralen pH-Bereich'die physikalischen Eigenschaften des biologischen Materials so verändert, daß eine Selektion bzw. Detektion ermöglicht wird. Im Ausführungsbeispiel ist das biologische Material eine Population von Hefezellen der Art Saccharomyces cerevisiae vom Paarungstyp MATa, die den α- Faktor-rezeptor (STE2) exprimieren (Davis and Davey (1997) Biochem. Soc. Trans. 25: 1015). Die detaillierte Ausführung wird im folgenden beschrieben: Ausgehend von einer DNA-Sequenz (Seq. 1), die über Standardverfahren (Oligonucleotid- Synthese) hergestellt werden kann, oder die kommerziell erhältlich ist (z.B. INTERACTIVA The Virtual Laboratory, Ulm), wird über eine Polymerase-
Kettenreaktion (PCR) ein doppelsträngiges DNA Molekül (Seq. 2) generiert. Das DNA Molekül enthält folgende Sequenzbereiche: eine T7-Promotorsequenz, eine TMV Translationsinitiationssequenz, einen kodierenden Bereich mit einem 5' kodierten E-tag, einer ct-Faktor Sequenz und einem 3' kodierten Strep-tag. Die Durchführung der PCR ist Stand der Technik und sieht wie folgt aus: In ein PCR-Reaktionsgefäß werden folgende Bestandteile gegeben:
1 μl DNA (aus der Oligonucleotid-Synthese entspricht 1 nmol, Seq. 1) 10 μl Taq-Polymerase Puffer 10x (Promega, Mannheim)
10 μl 25 mM MgCI2 (Promega, Mannheim) 10 μl 2,5 mM dNTP-Mix (Promega, Mannheim) 10 μl 10 μM Primer 1 (Seq. 3) 10 μl 10 μM Primer 2 (Seq. 4)
2 μl 5 U/μl Taq-Polymerase (Promega, Mannheim) Das PCR Programm ist wie folgt charakterisiert: 10 Zyklen mit 1 min 95°C, 2 min 55°C, 2 min 72°C.
Die DNA wird quantifiziert und etwa 1 nmol der doppelsträngigen DNA werden als
Template für die in vitro Transkription verwendet. Die Transkription erfolgt mit einem käuflichen System von Ambion (Austin, USA). Der Standard-Ansatz sieht wie folgt aus: 50 μl DNA-Template (1 nmol)
20 μl Reaction Puffer (Ambion, Austin)
20 μl 75 mM ATP (Ambion, Austin)
20 μl 75 mM CTP (Ambion, Austin) 20 μl 75 mM GTP (Ambion, Austin)
20 μl 75 mM UTP (Ambion, Austin)
20 μl Enzyme-Mix (Ambion, Austin)
30 μl H20 Der Ansatz wird für eine Stunde bei 37°C inkubiert. Die RNA wird über PhenoN
Chloroform Extraktion aufgearbeitet (Davis et al. 1994) und anschließend quantifiziert.
Die mRNA muß zur Herstellung der Biosonde am 3' Ende modifiziert werden, so daß sich an der mRNA eine kurze DNA-Sequenz und an deren 3' Ende ein Puromycin befindet. Diese Technik ist bei Roberts und Szostak (1997; s.o.) beschrieben. Im Ausführungsbeispiel erfolgt die Modifikation wie folgt:
2 nmol mRNA
2 nmol Linker (Seq. 5; INTERACTIVA, Ulm)
2 nmol Splint (Seq. 6; INTERACTIVA, Ulm) ad 125 μl H20
Der Ansatz wird für 3 min auf 70°C erwärmt und 15 min bei RT abgekühlt.
Anschließend werden 15 μl 10x Ligase-Puffer (Promega, Mannheim) und 10 μl 20
U/μl T4 DNA-Ligase (Promega, Mannheim) zugegeben. Durch Inkubation für 4 h bei
Raumtemperatur wird der Puromycin-tragende Linker mit der mRNA ligiert. Der gesamte Ansatz wird mit 10 nmol Antisplint (Seq. 7) versetzt und für 5 min auf
80°C erwärmt. Anschließend wird der Ligationsansatz auf Eis abgekühlt und die ligierte mRNA wird quantifiziert.
Zur Herstellung der Biosonde werden 200 pmol ligierte mRNA mit 10 μl 35S-
Methionin (APbiotech, Freiburg), 15 μl Aminosäure Mastermix ohne Methionin (Ambion, Austin) und 200 μl Retic Lysate IVT (Ambion, Austin) versetzt und translatiert. Es wird auf 300 μl mit H2O aufgefüllt. Der Ansatz wird bei 30°C für 30 min inkubiert. Anschließend werden 100 μl 2,5 M KCI und 70 μl 1 M MgCI2 zugegeben. Der Ansatz wird über Nacht bei -20°C gelagert.
Zur Aufarbeitung der Biosonden wird der Translationsansatz mit 10 ml Bindungspuffer (100 mM Tris/HCI pH 8,0; 10 mM EDTA pH8,0; 1 M NaCI; 0,25 %
Triton X-100) versetzt und es werden 10 mg Oligo-dT Cellulose (Apbiotech,
Freiburg) zugegeben. Der Ansatz wird eine Stunde bei 4°C inkubiert. Die Cellulose mit den gebundenen Biosonden wird durch Filtration abgetrennt und mit 8 ml Bindungspuffer gewaschen. Die Biosonden werden mit 4 mal 100 μl H20 eluiert. Durch eine Bestimmung der 35S-Zerfälle in einem Scintillationszähler werden die Biosonden quantifiziert und können anschließend zur Bindung an das biologische Material eingesetzt werden.
Sequenzen
Seq 1
GGTGCGCCGGTGCCGTATCCGGATCCGCTGGAACCGCGTTGGCATTGGTTGC
AACTAAAACCTGGCCAACCAATGTACTGGAGCCACCCGCAGTTTGAGAAA Seq 2
TAATACGACTCACTATAGGGACAATTACTATTTACAATTACAATGGGTGCGCCG
GTGCCGTATCCGGATCCGCTGGAACCGCGTTGGCATTGGTTGCAACTAAAACC
TGGCCAACCAATGTACTGGAGCCACCCGCAGTTTGAGAAAGCAGGTGCATCCG
CT Seq 3
TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA TTA CTA TTT ACA ATT ACA ATG GGT
GCG CCG GTG CCG TAT
Seq 4
AGC GGA TGC TTT CTC AAA CTG Seq 5
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACC-Puromycin
Seq 6
GCGCGCTTTTTTTTTNAGCGGATGC

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zum Nachweis oder zur Reinigung von biologischem Material durch Elektrophorese oder Dielektrophorese, folgenden Schritte umfassend: a) Vorlage von biologischem Material, das unterschiedliche Spezies enthält. b) Hinzufügen einer Biosonde, enthaltend einen Teil A, der spezifisch an mindestens eine der Spezies bindet, und einen Teil B, der die elektrischen und/oder dielektrischen Eigenschaften der durch spezifische Bindung der Biosonde markierten Spezie(s) verändert, so daß der Nachweis und/oder die Reinigung dieser markierten Spezie(s) durch Elektrophorese und/oder Dielektrophorese ermöglicht oder verbessert wird. c) Aufbau eines elektrischen Feldes zum Nachweis oder zur Reinigung des Komplexes bzw. der Komplexe aus biologischer Spezie(s) und spezifisch gebundener Biosonde durch Elektrophorese oder Dielektrophorese.
2. Verfahren zum Nachweis oder zur Reinigung von Biosonden, die spezifisch an biologisches Material binden, durch Elektrophorese oder Dielektrophorese, folgende Schritte umfassend: a) Vorlage von biologischem Material, das mindestens eine Spezie enthält. b) Hinzufügen einer Biosonde oder verschiedener Biosonden, enthaltend jeweils einen Teil A, der spezifisch an mindestens eine der Spezies binden kann, und einen Teil B, der die elektrischen und/oder dielektrischen
Eigenschaften der durch Bindung einer Biosonde markierten Spezie(s) verändert, so daß Detektion und/oder Reinigung eines so entstehenden Komplexes aus biologischer Spezie(s) und biologischem Material möglich wird, wobei die verschiedenen Biosonden unterschiedliche Bindungsspezifitäten besitzen und mindestens eine der hinzugefügten
Biosonden an das biologische Material bindet. c) Aufbau eines elektrischen Feldes zum Nachweis oder zur Reinigung des Komplexes bzw. der Komplexe aus biologischer Spezie(s) und spezifisch gebundener Biosonde durch Elektrophorese oder Dielektrophorese.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, charakterisiert dadurch, daß Teil A der Biosonde ein Protein, bevorzugt ein Antikörper oder Peptid, eine anorganische Verbindung, ein Kohlenhydrat, eine Nukleinsäure, ein Lipid oder eine andere spezifisch an biologisches Material bindende organische Verbindung ist oder mindestens eine der genannten Gruppen umfaßt.
4. Verfahren nach Anspruch 3, charakterisiert dadurch, daß Teil B der Biosonde eine Nukleinsäure, ein elektrisch geladenes Peptid, ein polyquarternäres Amin, eine organische Säure, eine organische Base, eine anorganische Substanz, ein
Lipid, eine Fettsäure oder eine Verbindung aus der Familie der Wachse, Öle oder Sterole ist oder mindestens eine der genannten Gruppen umfaßt.
5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, charakterisiert dadurch, daß Teil A der Biosonde ein Peptid oder Protein und Teil B der Biosonde eine für das Peptid oder Protein kodierende Nukleinsäure ist, die kovalent an dieses Peptid oder Protein gebunden ist, wobei die kovalente Bindung des Peptids bzw. Proteins an die Nukleinsäure vorzugsweise über ein Puromycin-Molekül erfolgt.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 5, wobei es sich bei der Nukleinsäure um einzelsträngige RNA, doppelsträngige RNA, einzelsträngige DNA, doppelsträngige DNA oder um eine DNA/RNA-Heteroduplex handelt.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 6, wobei es sich bei dem spezifisch bindenden Peptid, das Teil A der Biosonde ist oder von diesem umfaßt wird, um einen Liganden handelt, der an einen Rezeptor aus der Gruppe der folgenden Rezeptoren bindet: Ste2p-Rezeptor aus Saccharomyces cerevisiae, TSH-, FSH-, EGF-, TNF-, Transferrin-, Insulin-, FGF-, TGFß-, IGF-, Angiotensin II- oder Somatostatin-Rezeptor.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei es sich bei dem biologischen Material um Gewebe, Zellen, Zellorganellen, Viren, Proteine, Peptide, Nukleinsäuren, Kohlenhydrate, Lipide oder andere organische Verbindungen handelt oder dieses zumindest eine der genannten Gruppen umfaßt.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei dem elektrophoretischen Verfahren um die free flow Elektrophorese handelt.
10. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, charakterisiert dadurch, daß das elektrophoretische oder dielektrophoretische Verfahren unter Verwendung von Biochips durchgeführt wird.
11.Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, charakterisiert dadurch, daß das mit Hilfe der Biosonden spezifisch markierte Material zusätzlich auf andere Weise spezifisch markiert wird.
12. Verfahren nach Anspruch 1 1 , charakterisiert dadurch, daß es sich bei der zusätzlichen Markierung um eine Farbmarkierung, eine Fluoreszenzmarkierung oder eine radioaktive Markierung handelt.
13. Molekül, im folgenden Biosonde genannt, das einen spezifisch an einen Rezeptor bindenden Proteinteil enthält, der unmittelbar oder über ein Zwischenglied kovalent mit einer Nukleinsäure verknüpft ist, wobei die Nukleinsäure vorzugsweise mehr als 5 Nukleotide umfaßt, gekennzeichnet dadurch, daß der Proteinteil des Moleküls einen Liganden für einen Rezeptor aus der Gruppe der folgenden Rezeptoren umfaßt: Ste2p-Rezeptor aus Saccharomyces cerevisiae,
TSH-, FSH-, EGF-, TNF-, Transferrin-, Insulin-, FGF-, TGFß-, IGF-, Angiotensin II- oder Somatostatin-Rezeptor.
14. Biosonde nach Anspruch 13, wobei die Nukleinsäure die genetische Information für den Proteinteil umfaßt.
15. Biosonde nach Anspruch 13 oder 14, wobei es sich bei der Nukleinsäure um einzelsträngige RNA, doppelsträngige RNA, einzelsträngige DNA, doppelsträngige DNA oder um eine DNA/RNA-Heteroduplex handelt.
16. Molekül, im folgenden Biosonde genannt, das einen spezifisch an biologisches Material bindenden Proteinteil enthält, der unmittelbar oder über ein Zwischenglied kovalent mit einem Lipidmolekül verknüpft ist, wobei es sich bei dem biologischen Material um Gewebe, Zellen, Zellorganellen, Viren, Proteine, Peptide, Nukleinsäuren, Kohlenhydrate, Lipide oder andere organische Verbindungen handelt oder dieses zumindest eine der genannten Gruppen umfaßt.
17. Molekül, im folgenden Biosonde genannt, das einen spezifisch an biologisches Material bindenden Proteinteil enthält, der unmittelbar oder über ein Zwischenglied kovalent mit einer polyquartemären Ammoniumverbindung verknüpft ist, wobei es sich bei dem biologischen Material um Gewebe, Zellen, Zellorganellen, Viren, Proteine, Peptide, Nukleinsäuren, Kohlenhydrate, Lipide oder andere organische Verbindungen handelt oder dieses zumindest eine der genannten Gruppen umfaßt.
18. Biosonde nach Anspruch 16 oder 17, wobei es sich bei dem Proteinteil um ein Molekül handelt, das einen Liganden für einen Rezeptor aus der Gruppe der folgenden Rezeptoren umfaßt: Ste2p-Rezeptor aus Saccharomyces cerevisiae, TSH-, FSH-, EGF-, TNF-, Transferrin-, Insulin-, FGF-, TGFß-, IGF-, Angiotensin II- oder Somatostatin-Rezeptor.
19. Biosonde nach einem der Ansprüche 13 bis 18, wobei das Zwischenglied ein Puromycin-Molekül umfaßt.
20. Komplex aus biologischem Material und einer spezifisch an dieses gebundenen Biosonde nach Anspruch 13 bis 19, wobei es sich bei dem biologischen Material um Gewebe, Zellen, Zellorganellen, Viren, Proteine, Peptide, Nukleinsäuren, Kohlenhydrate, Lipide oder andere organische Verbindungen handelt oder dieses zumindest eine der genannten Gruppen umfaßt.
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