WO2002004637A1 - Promoteur specifique du myocarde - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to a promoter active in the myocardium and to its application for expressing genes of interest in this tissue, in particular for the treatment of myocardial diseases.
- the impairment of myocardial functions can induce serious pathologies, for example familial hypertrophic cardiomyopathy, myocardial infarction and heart rhythm disturbances.
- the possibility of modulating the responses of cardiac muscle cells (cardiomyocytes) by directing the expression of a gene of interest in these cells can find many applications such as for example: in the case of cardiomyopathies of genetic origin, the synthesis functional non-mutated cardiac protein such as cardiac protein C (familial hypertrophic cardiomyopathy), in the case of acquired pathologies:
- control of cell division either to stimulate it, for example to regenerate a functional muscle after a heart attack, or to slow it down, for example to inhibit the growth of a heart tumor.
- This can be achieved, for example, by the manufacture of dominant negative mutants for growth factor receptors or by the use of antisense RNA,
- cardiomyocytes the study of the in vivo functions of cardiomyocytes, as well as the modification of these functions for therapeutic purposes requires the use of animal models making it possible to individually assess the role of each of the proteins expressed by cardiomyocytes, which '' it involves over-expressing or under-expressing a protein produced naturally by these cells, evaluating the activity of new potentially therapeutic molecules, or studying the functional consequences of the expression of a heterologous protein .
- MLCs myosin light chains
- ⁇ -MHC heavy chain of myosin ⁇
- Some of the promoters regulating the expression of the above genes have been cloned and used in vivo to direct the expression of heterologous genes in transgenic mice, in particular those of the MLC2v genes (HUNTER and al. , J. Biol. Chem., 270, 23173-23178, 1995), Ca (BIBEN et al., Cited above), ANF, (FIELD et al., Science, 239, 1029-1033, 1988), ⁇ - and ⁇ -MHC (RINDT and al., Transgenic Res., 4, 397-405, 1995; KNOTTS et al., Dev. Dyn., 206, 182-192, 1996) and cTnT (ZHU et al., Dev. Biol., 169, 487- 503, 1995).
- the promoter of the ⁇ -MHC gene is not adapted to transgenic expression in adults; its expression is restricted to the ventricles from the ninth day of development in mice, and drops a few days before birth (NG et al., Cire. Res., 68, 1742-1745, 1991),
- the promoter of the MLC2v gene is restricted to the ventricles (HUNTER et al., supra) (O'BRIEN et al., supra), the promoter of the ANF gene is restricted to the left ventricle during embryonic development before becoming specific for the atria in adults (ZELLER et al., Genes Dev., 1, 693-698, 1987; FIELD et al., cited above),
- the promoter of the ⁇ -MHC gene is expressed in the atria during embryonic development and its expression in the ventricles increases a few days before birth and persists after birth (PALERMO et al., Cell., Mol. Biol. Res. , 41, 501-509, 1995; NG et al., Cited above),
- the promoter of the ⁇ -cA gene (GUNNING et al., Mol. Cell. Biol., 3, 1985-1995, 1983) and the promoter of the cTNT gene (MAR et al., J. Cell. Biol., 107, 573-585, 1988; MAR et al., Symp. Soc. Exp. Biol., ⁇ ,, 237-249, 1992) are expressed both in the myocardium and in the skeletal muscle in the embryo and in l 'adult. Studies carried out in different species have made it possible to isolate a certain number of transcription factors involved in cardiac differentiation and cardiogenesis.
- MEF-2 proteins Myocyte Enhancer Factor-2
- homeo box factors Myocyte Enhancer Factor-2
- Biol., 13, 4432-4444, 1993 also influences the differential expression of muscle genes in the heart and could represent an additional mechanism for controlling the transcription of genes specifically in the heart (SARTORELLI et al., Cire. Res., 72, 925-931, 1993; LYONS et al., Curr. Opin. Genêt. Dev., 6, 454-460, 1996; OLSON et al., Supra; MABLY et al., Supra; FIRULLI et al., Trends Genêt., 13, 364-369 , 1997; DUROCHER et al., 1998, cited above).
- the cDNA and the MYBPC3 gene encoding human cardiac protein C were isolated (KASAHARA et al., J. Clin. Invest., 94, 1026-1036, 1995).
- the MYBPC3 gene is at least 21 kb in size, it is composed of 35 exons (CARRIER et al., Cire. Res., 80, 427-434, 1997) and is located on the fold 2 band of chromosome 11 (llpll.2), (GAUTEL et al., Cire. Res., 82, 124-129, 1998).
- CARRIER et al., Cire. Res., 80, 427-434
- SVpll.2 fold 2 band of chromosome 11
- GAUTEL et al. Cire. Res., 82, 124-129, 1998.
- no sequence controlling the transcription of this gene has been precisely identified.
- protein C is an abundant protein of the striated muscles which represents 2 to 4% of the fibrillar proteins (OFFER et al., J. Mol. Biol., 74, 653-676, 1973) . It is part of a set of proteins having structural and / or regulatory functions associated with the heavy chain of myosin in the thick filament (EPSTEIN et al., Science, 251, 1039-1044, 1991).
- cardiac protein C is restricted exclusively to the heart muscle and cannot be never found in skeletal muscle throughout development in humans and mice, and transcripts of the MYBPC3 gene (Myosin Binding Protein-Cardiac 3) encoding cardiac protein-C are present only in the heart and in a uniform manner , in mouse or human embryos (GAUTEL et al., cited above; FOUGEROUSSE et al., Cire. Res., 82, 130-133, 1998).
- MHC is a familial pathology which is transmitted in an autosomal dominant Mendelian fashion, characterized by an unexplained enlargement of the left ventricle, predominant in the interventricular septum and associated with large cellular and tissue disorganization (HENGSTENBERG et al., J. Mol. Cell. Cardiol., 26, 3-10, 1994).
- the present invention relates to a nucleic acid molecule derived from a mammalian MYBPC gene, which comprises the cis-regulatory elements necessary and sufficient to direct the specific expression of a gene in the myocardium.
- the nucleic acid molecule according to the invention essentially consists of the sequences necessary for controlling the initiation of transcription of the MYBPC3 gene (basal promoter), as well as by the sequences involved in the cis regulation of the initiation of the transcription, and this by mechanisms similar to the natural mechanisms regulating the transcription of the endogenous MYBPC3 gene.
- nucleic acid molecules according to the invention can advantageously be used to direct the expression of a heterologous gene, in particular a gene of therapeutic interest.
- heterologous relative to a sequence of a given gene means any nucleic acid sequence other than those which, in nature, are immediately adjacent to said sequence.
- RNA polymerase a canonical motifs recognized by RNA polymerase such as the sequences of TATA boxes and CAT boxes.
- a fragment of the MYBPC3 gene comprising the TATA box and two GATA-4 sites is capable of activating the expression of a heterologous gene, only in cardiomyocytes in vitro and in vivo.
- said nucleic acid molecule comprises two binding sequences for the transcription factor GATA-4 (canonical motif 5 '- (A / G) GATA (A / G) -3).
- said GATA-4 sites are located between positions -60 and -70 and between positions -1010 and -1020, relative to the site of initiation of transcription.
- the GATA factors belong to a family of nuclear proteins which have a specific DNA binding domain consisting of two adjacent zinc fingers of the C2 / C2 family (HYATT, EMBO J., 12, 4993-5005, 1993).
- the C-terminal zinc finger associated with an adjacent basic region constitutes the minimal domain for recognition of the canonical motif 5 '- (A / G) GATA (A / G) -3' (KO et al., Mol. Cell. Biol ., 13, 4011-4022, 1993; MERIKA et al., Mol. Cell. Biol., 13, 3999-4010, 1993).
- GATA-4/5/6 factors Six GATA factors have been characterized in vertebrates including the GATA-4/5/6 factors which are involved on the one hand in cardiogenesis and cardiac differentiation (JIANG et al., Dev. Biol., 174, 258-270, 1996; GOVE et al., EMBO J., 16, 355-368, 1997; GREPIN, Development, 124, 2387-2395, 1997), and on the other hand the differentiation of intestinal epithelial cells (GAO, Mol. Cell. Biol., 18, 2901-2911, 1998).
- the GATA-4/5/6 factors are capable of transactivating numerous cardiac genes expressed in cardiomyocytes ('LAVERRIERE et al., J. Biol.
- factor GATA-4 activates the genes for sarcomeric proteins such as troponin C.
- said nucleic acid molecule also comprises one or more site (s) for binding a factor involved in the restriction of transcription of the MYBPC3 gene in cardiomyocytes.
- said binding site (s) are selected from the group consisting of: factor NFAT-3 binding sequences, Ets protein binding sequences and RSRF factor binding sequences.
- the inventors have further observed that the sequence which extends from the position -1500 to -800 relative to the site of initiation of transcription of the MYBPC3 gene is involved in the restriction of the transcription of the gene in cardiomyocytes.
- the inventors analyzed said sequence and located potential binding sites:
- - RSRFs factors canonical motif of CarG type: 5 '-CC (A / T) GG-3'.
- the factor NFAT-3 which is capable of interacting with the factor GATA-4 is expressed in the heart, it plays a role in cardiogenesis (DE LA POMPA et al., Nature, 392, 182-186, 1998; RANGER and al., Nature, 392, 186-190, 1998) and is also involved in cardiac hypertrophy (MOLKENTIN et al., Cell, 93, 215-226, 1998).
- Ets proteins regulate tissue-specific expression via activation and repression mechanisms CONRAD et al., Mol. Cell. Biol., 14, 1553-1565, 1994; ROSEN et al., J. Biol. Chem ., 269, 15652-15660, 1994; UMEZAWA et al., Mol. Cell. Biol., 17, 4885-4894, 1997), among these, the ERP / Net protein which is expressed in many tissues is also present in the heart (LOPEZ et al., Mol. Cell.
- binding of these factors to elements of this sequence could be responsible for the restriction of the transcription of the MYBPC3 gene in cardiomyocytes and represents an additional mechanism for controlling the activity of the endogenous MYBPC3 promoter in cardiomyocytes.
- the GATA-4 sites as well as the NFAT-3, Ets and RSRFs sites, if they are present, are located respectively at the following positions, relative to the transcription initiation site:
- - NFAT-3 sites -822 / -815; -850 / -844; - Ets sites: -935 / -932; -1102 / -1099;
- a nucleic acid molecule according to the invention is represented for example by:
- nucleic acid molecules specified above which can be obtained from the murine MYBPC3 gene, only constitute an illustration of the object of the invention. This also includes in particular nucleic acid molecules reproducing homologous sequences existing in humans, or in other mammals, and which can be obtained by those skilled in the art by conventional techniques of molecular biology.
- nucleic acid molecules comprising at least the cis-regulatory elements of the MYBPC3 gene specified above
- a person skilled in the art can construct different nucleic acid molecules in accordance with the invention, for example by carrying out the mutation or the deletion of sequences located outside the cis-regulatory elements, and / or possibly their substitution by other sequences.
- nucleic acid molecules comprising the cis-regulatory elements of the MYBPC3 gene can be combined with regulatory cis-elements or else with a basal promoter originating from genes other than the MYBPC3 gene, according to different combinations, to obtain molecules chimeric nucleic acids which differ from each other by their level of activity and their degree of specificity.
- the nucleic acid molecules according to the invention can be used to control expression of a heterologous gene in mammalian cells, and advantageously, to obtain specific expression in cardiac muscle cells.
- the object of the present invention also encompasses recombinant nucleic acid molecules comprising at least one nucleic acid molecule according to the invention linked to at least one heterologous sequence.
- the object of the present invention includes in particular: a) expression cassettes comprising: a nucleic acid molecule according to the invention; it may be a sequence from the gene
- these expression vectors comprise at least one expression cassette as defined above.
- nucleic acid molecule of interest can be inserted in order to introduce and maintain it in a eukaryotic or prokaryotic host cell, are known in themselves; the choice of an appropriate vector depends on the use envisaged for this vector (for example replication of the sequence of interest, expression of this sequence, maintenance of this sequence in extrachromosomal form, or else integration into the chromosomal material of the host), as well as the nature of the host cell.
- the invention further relates to prokaryotic or eukaryotic cells transformed with at least one nucleic acid molecule according to the invention.
- these cells are animal cells, in particular mammalian cells. It could be cardiac muscle cells or totipotent embryonic cells capable of differentiating into cardiac muscle cells.
- Transformed cells according to the invention can be obtained by any means, known in themselves, making it possible to introduce a nucleic acid molecule into a host cell.
- viral vectors such as adenoviruses, retroviruses, lentiviruses and AAVs, in which the sequence of interest has been inserted, may be used, among others.
- the transfer of genes into the heart muscle can for example be carried out using recombinant adenovirus, recombinant virus associated with adenovirus (AAV), liposomes, lipids or cationic polymers, or by direct injection of molecule nucleic acid.
- AAV recombinant virus associated with adenovirus
- viral or non-viral vectors can be administered either by direct injection into the myocardium or by coronary perfusion (BARR et al., Gene Therapy, 1, 51-58, 1994; BUDKER et al., Gene Therapy, 5, 272- 276, 1998) or even by injection into the pericardial envelope (LIM et al., Circulation, 83, 2007-2011, 1991; MUHIHAUSER et al., Gène Therapy, 3, 145-153, 1996; ROTHMANN et al. , Gene Therapy, 3, 919-926, 1996).
- the inventors also obtained transgenic animals, in which a heterologous gene was placed under transcriptional control of a nucleic acid molecule comprising the cis-regulatory elements of the MYBPC3 gene, according to the invention and thus found that the properties of this nucleic acid molecule, and in particular the specificity of expression in cardiac muscle cells was manifested not only ex vivo, but also in vivo at all stages of development, from the embryo to the adult.
- the subject of the present invention is animals and in particular non-human transgenic mammals, characterized in that all or part of their cells are transformed by a nucleic acid molecule according to the invention.
- animals and in particular non-human transgenic mammals characterized in that all or part of their cells are transformed by a nucleic acid molecule according to the invention.
- These are for example animals into which a gene of interest has been introduced under the control of cis-regulatory elements of the MYBPC3 gene, or a chimeric promoter constructed from cis-regulatory elements of this ci which confer specificity of expression in cardiac muscle cells; the gene of interest is then expressed specifically in cardiac muscle cells.
- the transformed cells and the transgenic animals in accordance with the invention can in particular be used as models for studying and / or modifying the expression of different genes in cardiac muscle cells.
- the invention also relates to the use of nucleic acid molecules in accordance with the invention for obtaining medicaments, in particular medicaments intended for the treatment of myocardial pathologies.
- FIG. 1 illustrates the restriction map and the organization of introns and exons of the 15 kb fragment of the MYBPC3 gene isolated from a mouse genomic library.
- This fragment comprises a 2.3 kb sequence between the Spi-1 gene and the MYBPC3 gene (intergenic region), containing the promoter of the MYBPC3 gene.
- S Sacl; Sp: SphI; Ac: AccI; Xb: Xbal; H: HindIII; E: EcoRI; K: Kpnl.
- the exons of the Spi-1 gene are shown in black and the exons of the MYBPC3 gene are shown in gray.
- FIG. 1 illustrates the restriction map and the organization of introns and exons of the 15 kb fragment of the MYBPC3 gene isolated from a mouse genomic library.
- This fragment comprises a 2.3 kb sequence between the Spi-1 gene and the MYBPC3 gene (intergenic region), containing the promoter of the MYBPC3
- FIG. 2 illustrates the comparison of the proximal sequence of the promoter of the human and murine MYBPC3 gene.
- (b) the sequence extending from position -255 to position +1 relative to the start site of transcription of the mouse MYBPC3 gene sequence is aligned with the corresponding of human MYBPC3 gene (accession number Y10129) and potential transcription factor binding sites are boxed.
- FIG. 3 illustrates the structure of the four fragments of 2.5, respectively; 1.5; 0.8 and 0.35 kb of the promoter of the MYBPC3 gene coupled to the reporter gene EGFP in the vector pEGFP.
- FIG. 4 illustrates the restriction map of an expression vector containing the fragment of 1.5 kb of the promoter of the MYBPC3 gene.
- Example 1 Molecular cloning and chromosomal location of the promoter of the murine MYBP-C3 gene A 15 kb fragment of the MYBPC3 gene was isolated by screening a ⁇ FIXII library of mouse genomic DNA using a probe of 215 bp corresponding to the 5 'end of the coding sequence for cardiac protein C.
- the restriction map of the 15 kb fragment is represented in FIG. 1: it contains exons 1 to 20 of the cardiac protein C gene, the last two exons of the Spi-1 oncogene (accession number: X17463) and 2.3 kb of intergenic sequence.
- the 2.3 kb intergenic region comprising the promoter of the MYBPC3 gene, derived from the plasmid pSac4, was then analyzed.
- the transcription initiation site was determined by the primer extension technique and by cloning the 5 'end of the protein messenger RNA. C cardiac, using respectively the AMV Reverse Transcriptase Primer Extension System kit (PROMEGA) and the 5 'RACE kit (Rapid Amplification System of cDNA ends), according to the manufacturer's instructions. The results show that the initiation site of the transcription of the MYBPC3 gene is located 47 bp upstream of the ATG.
- PROMEGA AMV Reverse Transcriptase Primer Extension System kit
- 5 'RACE kit Rapid Amplification System of cDNA ends
- the transcription initiation site is located 30 bp downstream of the first nucleotide of a TATA box (5 '-TAAATA-3') recognized by RNA polymerase II which is also present in the human promoter.
- TATA box 5 '-TAAATA-3'
- CAT box no canonical motif of the :: AAT type (CAT box) was identified in the first 200 nucleotides upstream of the site for initiating transcription of the murine or human promoter.
- CAAGT sequence of the murine promoter or the CAAT sequence of the human promoter, located between -137 / -141pb can play the role of a CAT box.
- the first MEF-2 binding site covers the TATA box and the second is adjacent to another cis-element for transcription regulation (box E).
- TRE thyroid hormone binding site
- the intergenic region was amplified by PCR from the plasmid pSac4 so as to generate fragments of 2.5 kb, 1.5 kb respectively (SEQ ID NO: 1), 1.1 kb (SEQ ID NO: 2), 0.8 kb and 0.35 kb, having an identical 3 'end corresponding to the position +28 relative to the site of initiation of transcription and a variable 5' end (FIG. 3).
- SEQ ID NO: 1 fragment of 2.5 kb, 1.5 kb respectively
- SEQ ID NO: 2 1.1 kb
- 0.8 kb and 0.35 kb having an identical 3 'end corresponding to the position +28 relative to the site of initiation of transcription and a variable 5' end (FIG. 3).
- the ATG in position +24 to +26 of the MYBPC3 gene which could disturb the initiation of translation at the level of the first ATG of a heterologous gene cloned behind these sequences is replaced by a SacI site.
- the amplification products obtained are cloned at the SacI site of the plasmid "pGEM-T easy vector" (PROMEGA) and then subcloned in both orientations (sense and antisense) at the SacI site of the plasmid pEGFP-1 (CLONTECH) which contains the Eucaryotic Green Fluorescent Protein (EGFP) cDNA.
- the plasmids obtained are called pEGFP4 (2.5 kb), pEGF 6 (1.5 kb), pEGFP8 (1.1 kb), pEGF 10 (0.8 kb) and pEGFP12 (0.35 kb).
- the plasmids containing the insert in its antisense orientation are used as negative controls and the plasmid containing the 2.5 kb fragment is used as a positive control.
- the plasmids containing the different promoter fragments are electropores in embryonic carcinoma cells of mouse C3H / He strain (P19 cells; Me BURNEY et al., Nature, 299, 165-167, 1982). Stable transfectants having integrated copies of these plasmids are selected in the presence of geneticin, then maintained in the undifferentiated state or induced in differentiation.
- P19 cells are totipotent embryonic cells capable of differentiating into cardiac cells in the presence of dimethyl sulfoxide, at the final concentration of 1% v / v.
- Embryonic bodies made up of cardiac cells in contact with each other, are recognizable by rhythmic beating zones, a phenotype characteristic of the heart developing in vivo (DOETSCHMAN, J. Embryol. Exp. Morphol. 87, 27-45, 1985 ,; RUDNIKI, Dev. Biol., 138, 348-358, 1990; MALTSEV, Mech. Dev., 44, 41-50, 1993).
- the P19 cells are maintained in the undifferentiated state in a proliferation medium (DMEM (GIBCO), 15% fetal calf serum, 0.1 mM ⁇ -mercaptoethanol). After trypsination, 2.10 6 to 5.10 6 cells in suspension are electroporated (GENE PULSER, BIO-RAD, set to 250 V and 500 ⁇ F) for 5 to 7 ms in a volume of 800 ⁇ l of phosphate buffer pH 7.4, containing 25 ⁇ g of plasmid. Then, the cells are distributed in culture dishes containing 0.1% gelatin supplemented with proliferation medium.
- DMEM fetal calf serum
- 0.1 mM ⁇ -mercaptoethanol ⁇ -mercaptoethanol
- the selection is carried out in a proliferation medium containing 0.7 mg / ml of geneticin.
- the differentiation is carried out in DMEM medium containing 20% fetal calf serum and 1% DMSO, by the technique of pendant drops; the cells in suspension (25,000 cells / cm 3 ) are deposited in drops of 20 ⁇ l (500 cells) on the lid of a cell culture dish and incubated for 3 days (the cells aggregate to form embryonic bodies), then the embryonic bodies are detached and cultivated in suspension for 4 days, and on the seventh day of differentiation they are transferred to a gelatin culture medium allowing their adhesion to the support.
- the swinging zones appear between the fourteenth and the twentieth day of differentiation.
- the promoter of the MYBPC3 gene contains 2 canonical GATA-4 motifs, the most proximal of which is between -63 / -58 bp (GATA.l site) is included both in the fragments of 1 , 5 kb, 0.8 kb and 0.35 kb, and the most distal (GATA.2 site) located between
- TGATAA site GATA.l
- AGATAA site GATA.2
- TCTAGA restriction site Xbal
- the GATA.l site present in the plasmids pEGFP10 and pEGFP12 was also mutated into the Xbal site.
- the plasmids obtained comprising these mutations are called pEGFP ⁇ .l, pEGFP6.2, pEGFP6.1.2, pEGFPlO.l and pEGFPl2.1.
- the constructs pEGFP6 and pEGFP ⁇ doubly mutated are transiently transfected in non-cardiac cells (quail fibroblast line QT6; MOSCOVICI et al., Cell, 11, 95-103, 1977), in the presence or absence of a plasmid vector for the expression of factor GATA-4.
- 500,000 QT6 cells cultured in DMEM medium containing 10% fetal calf serum are transfected with a mixture containing l ⁇ g of mutated or non-mutated pEGFP ⁇ plasmid, 1 ⁇ g of plasmid GATA-4 and- 3 ⁇ l of non-liposomal lipid Fugene ⁇ (BOEHRINGER ), according to the manufacturer's recommendations.
- the cells transfected with the mutated plasmids pEGFP ⁇ and pEGFP6 alone are used as a negative control. 48 hours after transfection, the emission of fluorescence is observed under an inverted fluorescence microscope.
- the mutated or non-mutated plasmids are electroporous in P19 cells differentiated into cardiac cells as described in Example 3.1.
- GATA has no activity
- the 1.5 kb fragment mutated on one or other of the GATA sites has weaker activities than that of the non-mutated fragment, 3) the shorter fragments (0.8 kb or 0.5 kb) which do not have any of the GATA sites by deletion and / or mutation still retain an activity.
- 1.5 kb constitutes a strong minimum promoter of the MYBPC3 gene best regulated in cardiac cells and makes it possible to establish that the two GATA-4 sites (-63 / -58 and -1015 / -1010) are essential for activity of this promoter.
- Ets sites 935 / -932, -1102 / -1099
- SRFR sites 1231 / -1221; -861 / -853; -870 / -865
- the factor NFAT-3 which binds to the canonical motif 5 '- (A / T) GGAAAAT-3' (HOEY et al., I munity, 2, 461-472, 1995) is part of a multigenic family whose members are mainly expressed in lymphocytes (RAO et al., Annu. Rev. Immunol., 15, 707-747, 1997).
- NFAT-3 is expressed in the heart and plays a role in cardiogenesis (DE LA POMPA et ai., Nature, 392, 182-186, 1998; RANGER et al., Nature, 392, 186-190, 1998), it It has also been reported that NFAT-3 interacts with GATA-4 to activate transcription of the BNP gene (type B Natriuretic Peptide), involved in cardiac hypertrophy (MOLKENTIN et al., cited above).
- Ets proteins which recognize the 5'-GGA (A / T) -3 'sequence regulate tissue-specific expression via activation and repression mechanisms (CONRAD et al., Mol. Cell. Biol., 14, 1553-1565, 1994; ROSEN et al., J. Biol. Chem., 269, 15652-15660, 1994; UMEZAWA et al., Mol. Cell. Biol., 17, 4885-4894, 1997).
- the ERP / Net protein which is expressed in many tissues including the heart (LOPEZ et al., Mol. Cell.
- This negative regulatory mechanism represents an additional mode of control of specific expression in the heart for the 1.5 kb fragment of the promoter of the MYBPC3 gene.
- Example 4 Construction of an Expression Vector According to the Invention An expression vector, called pU523, allowing the expression of a heterologous gene under the transcriptional control of the 1.5 kb fragment of the promoter of the MYBPC3 a gene was built in the following stages: 1) the Sall-NotI fragment of the multiple cloning site of the plasmid pSL1190 ⁇ superlinker phagemid "(PHARMACIA) was inserted between the SalI and NotI sites of the plasmid pEGFP-1 (CLONTECH) to give the plasmid p ⁇ EGFP, deleted from the promoter and from the coding part of the EGFP cDNA,
- a Pmel site was introduced by PCR at the ends of the Eco47III-Afl-II fragment of the plasmid p ⁇ EGFP (700 bp), containing the intron, the SD / SA and the polyadenylation sequence of SV40. 4) the amplification product obtained was cloned into the vector pGEM-T easy plasmid (PROMEGA) to give the plasmid pPmel, and
- the vector map pU523 is illustrated in FIG. 4: it comprises the 1.5 kb fragment of the promoter of the MYBPC3 gene, a small intron, a multiple cloning site and a polyadenylation sequence, bordered by a rare restriction site ( Pmel site) which allows the expression cassette to be isolated and cloned into another vector.
- Example 5 Activity of the minimum promoter of 1.5 kb ⁇ n vivo in transgenic mice.
- Example 6 Activity of the minimum promoter of 1.5 kb in vivo in the heart muscle after injection of a recombinant vector containing the promoter linked to the reporter gene for ⁇ -galactosidase 6.1. Injection of a recombinant plasmid
- a recombinant plasmid called pShMYBPC3-LacZ, containing the coding sequence of the lacZ gene, under the control of the 1.5 kb fragment of the murine MYBPC3 gene promoter was constructed by following the following steps.
- the Xhol-Sall fragment of the plasmid pCMV ⁇ (CLONTECH) containing the coding sequence of the lacZ gene was inserted at the SalI site of the adenovirus shuttle plasmid pAdeasy (HE et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 95, 2509 -2514, 1998).
- the plasmid obtained contains the coding sequence of the lacZ gene, flanked 5 ′ by a splice acceptor site, an intron and a splice donor site originating from the late region of SV40 and in 3 ′ a polyadenylation site.
- This plasmid was then digested with the endonucleases Xhol and HindIII and the Xhol-HindIII fragment of the plasmid pEGFP6 containing the promoter of the MYBPC3 gene was inserted between these two sites to give the plasmid pShMYBPC3-LacZ.
- the plasmid containing no promoter was used as a negative control and the plasmid pCMV ⁇ (CLONTECH) as a positive control for the expression of ⁇ -galactosidase in the two types of muscle tissue 7 days after the injection, the animals were sacrificed and the heart and muscle were removed. Serial transverse or longitudinal cryocuts of these two organs were performed.
- AdMYBPC3- ⁇ gal containing the ⁇ -galactosidase gene under the transcriptional control of the 1.5 kb fragment of the promoter of the MYBPC3 gene, in place of the El region of a defective adenovirus ⁇ E1, was obtained by homologous recombination from the shuttle plasmid of the adenovirus pShMYBPC3.
- adenovirus described by DAVIDSON et al. (Nature Genetics, 3, 219-223, 1993), containing the ⁇ galactosidase gene under the transcriptional control of the ubiquitous cytomegalovirus promoter (AdCMV- ⁇ gal) was used as a control.
- ⁇ -galactosidase After intrapericardial injection, the expression of ⁇ -galactosidase is limited to myocardial cells as well as to spleen cells in animals which have received AdMYBPC3- ⁇ gal while cells expressing ⁇ -galactosidase are observed in numerous organs (liver, heart, spleen, lung, kidney) of animals having received AdCMV- ⁇ gal.
- AdMYBPC3- ⁇ gal no cells expressing ⁇ -galactosidase are observed in animals having received AdMYBPC3- ⁇ gal while cells expressing ⁇ -galactosidase are observed in many organs, in particular in the liver, but never in the heart, animals having received AdCMV- ⁇ gal.
- This recombinant vector therefore makes it possible to limit the undesirable effects linked to the expression of a heterologous gene in a tissue other than the myocardium.
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Abstract
Promoteur spécifique du myocarde, issu du gène MYBPC d'un mammifère et comprenant les éléments-cis de régulation nécessaires et suffisants pour diriger l'expression spécifique d'un gène dans le myocarde. Application pour le traitement des maladies du myocarde.
Description
PROMOTEUR SPECIFIQUE DU MYOCARDE La présente invention est relative à un promoteur actif dans le myocarde et à son application pour exprimer des gènes d'intérêt dans ce tissu, notamment pour le traitement des maladies du myocarde.
L'altération des fonctions du myocarde, d'origine génétique ou acquise peut induire des pathologies graves, par exemple la cardiomyopathie hypertrophique familiale, l'infarctus du myocarde et les troubles du rythme cardiaque. La possibilité de moduler les réponses des cellules musculaires cardiaques (cardiomyocytes) en dirigeant l'expression d'un gène d'intérêt dans ces cellules peut trouver de nombreuses applications telles que par exemple : dans le cas de cardiomyopathies d'origine génétique, la synthèse de la protéine cardiaque non-mutée fonctionnelle telle que la protéine C cardiaque (cardiomyopathie hypertrophique familiale) , dans le cas de pathologies acquises :
* le contrôle de la division cellulaire, soit pour la stimuler, par exemple afin de régénérer un muscle fonctionnel après un infarctus, soit pour la freiner, par exemple pour inhiber la croissance d'une tumeur cardiaque. Ceci peut-être obtenu par exemple, par la fabrication de mutants dominants négatifs pour des récepteurs de facteur de croissance ou par l'utilisation d'ARN antisens,
* le contrôle de la force de contraction ou du rythme des contractions du muscle cardiaque.
D'autre part, l'étude des fonctions in vivo des cardiomyocytes, ainsi que la modification de ces fonctions dans un but thérapeutique nécessite l'utilisation de modèles animaux permettant d'évaluer individuellement le rôle de chacune des protéines exprimées par des cardiomyocytes, qu'il s'agisse de sur-exprimer ou de sous-exprimer une protéine produite naturellement par ces cellules, d'évaluer l'activité de nouvelles molécules potentiellement thérapeutiques, ou d'étudier les conséquences fonctionnelles de l'expression d'une protéine hétérologue.
Pour être en mesure d'utiliser effectivement les potentialités d'un transfert de gènes dans le muscle cardiaque, il faut disposer de vecteurs permettant d'obtenir une expression stable d'un gène d'intérêt dans les 5 cardiomyocytes, in vi tro et également in vivo ainsi que de techniques efficaces et fiables de transfert de gènes thérapeutiques dans les tissus concernés.
Cette expression doit en outre, dans certains cas, être spécifique de ce tissu, afin d'éviter les problèmes
10 qui pourraient résulter d'une expression ubiquitaire dans la mesure où certains vecteurs viraux tels que l'adénovirus sont capables de pénétrer dans de nombreux tissus.
On connaît actuellement un certain nombre de protéines qui sont exprimées plus ou moins spécifiquement
1. dans le muscle cardiaque, et dont les promoteurs constituent des candidats potentiels pour l'expression tissu spécifique d'un gène hétérologue ; les chaînes légères de myosine (MLCs), (O'BRIEN et al . , Proc. Nat . Acad. Sci., 90, 5157- 5161, 1993 ; LEE et al . , J. Biol . Chem. , 267, 15875-15885, 0 1992; KELLY et al . , J. Cell Biol.. 129, 383-396, 1995), la chaîne lourde α de la myosine (α-MHC) , (SUBRAMANI7AM et al . , J. Biol. Chem., 268, 4331-4336, 1993), la chaîne lourde β de la myosine (β-MHC) , (RINDT et al . , J. Biol. Chem., 268, 5332- 5338, 1993), la troponine T cardiaque (cTnT) , (IANNELLO et 5 al . , J. Biol. Chem., 266, 3309-3313, 1991 ; CHRISTENSEN et al . , Mol. Cell. Biol., 13, 6752-6765, 1993), la créatinine kinase musculaire (MCK) , (AMACHER et al . , Mol. Cell. Biol., 13, 2753-2764, 1993), le facteur atrial natriurétique (ANF) , (SEIDMAN et al . , Can. J. Physiol. Phar acol . , 69, 1486-1492, 0 1991 ; ARGENTIN et al . , Mol. Cell. Biol., 14, 777-790, 1994), l'α-actine cardiaque (α-cA) , (BIBEN et al . , Dev. Biol., 173, 200-212, 1996) , les peptides natriurétiques de type-A (ANP) et -B (BNP), (DUROCHER et al . , Dev. Genêt., 22, 250-262, 1998) . 5 Certains des promoteurs régulant l'expression des gènes ci-dessus ont été clones et utilisés in vivo pour diriger l'expression de gènes hétérologues dans des souris transgéniques, en particulier ceux des gènes MLC2v (HUNTER et
al . , J. Biol. Chem., 270, 23173-23178, 1995), Ca (BIBEN et al . , précité), ANF, (FIELD et al . , Science, 239, 1029-1033, 1988), α- et β-MHC (RINDT et al . , Transgenic Res . , 4, 397- 405, 1995 ; KNOTTS et al . , Dev. Dyn. , 206, 182-192, 1996) et cTnT (ZHU et al . , Dev. Biol., 169, 487-503, 1995).
Même si ces séquences permettent d'exprimer des gènes au niveau cardiaque, leur profil d'expression est soit restreint à un compartiment du cœur, soit non spécifique du cœur, à des stades du développement embryonnaire ou chez l'adulte (LYONS et al . , J. Cell. Biol., 111, 2427-2436, 1990 et J. Cell. Biol., 111, 1465-1476, 1990).
A titre d'exemple :
- le promoteur du gène β-MHC n'est pas adapté à une expression transgénique chez l'adulte ; son expression est restreinte aux ventricules dès le neuvième jour de développement chez la souris, et chute quelques jours avant la naissance (NG et al . , Cire. Res., 68, 1742-1745, 1991),
- le promoteur du gène MLC2v est restreint aux ventricules (HUNTER et al . , précité) (O'BRIEN et al . , précité) , le promoteur du gène ANF est restreint au ventricule gauche au cours du développement embryonnaire avant de devenir spécifique des oreillettes chez l'adulte (ZELLER et al . , Gènes Dev., 1, 693-698, 1987 ; FIELD et al . , précité) ,
- le promoteur du gène α-MHC est exprimé dans les oreillettes au cours du développement embryonnaire et son expression dans les ventricules augmente quelques jours avant la naissance et persiste après la naissance (PALERMO et al . , Cell., Mol. Biol. Res., 41, 501-509, 1995 ; NG et al . , précité) ,
- le promoteur du gène α-cA (GUNNING et al . , Mol. Cell. Biol., 3, 1985-1995, 1983) et le promoteur du gène cTNT (MAR et al . , J. Cell. Biol., 107, 573-585, 1988 ; MAR et al . , Symp. Soc. Exp. Biol., ζ, , 237-249, 1992) s'expriment à la fois dans le myocarde et dans le muscle squelettique chez l'embryon et chez l'adulte.
Des études réalisées chez différentes espèces ont permis d' isoler un certain nombre de facteurs de transcription impliqués dans la différenciation cardiaque et la cardiogénèse. Ces facteurs se lient à des motifs de séquence spécifiques dans les régions régulatrices de ces gènes, appelés éléments-cis de régulation de la transcription et sont capables de transactiver de nombreux gènes cardiaques exprimés spécifiquement dans les cardiomyocytes. Parmi ces facteurs, les mieux connus sont : les protéines MEF-2 (Myocyte Enhancer Factor-2) , les facteurs à boîte homéo
Csx/Nkx2.5 et Mhox (Muscle Hox) , les facteurs GATA, les protéines ehand et dhand, et les facteurs TEF-1
( Transcription Enhancer factor-1 ) , (OLSON et al . , Science,
272, 671-676, 1996 ; MABLY et al . , Cire. Res., 79, 4-13, 1996) .
Cependant, alors que la participation de chacun des facteurs ci-dessus dans la régulation de l'expression de gènes musculaires endogènes est clairement établie, la combinaison exacte de ces facteurs tissu-spécifiques nécessaire et suffisante pour exprimer des gènes heterologues d'intérêt thérapeutique, spécifiquement dans le cœur n'a pas été déterminée.
A ce premier degré de complexité dans le contrôle de l'expression tissu-spécifique, s'ajoute un degré de complexité supplémentaire dans la mesure où il a été rapporté que la combinaison particulière de ces facteurs tissu- spécifiques avec des facteurs ubiquitaires tels que les facteurs apparentés au SRF ( Sérum Response Factor) dénommés RSRF (Rela ted Sérum Response Factor) (PARI et al . , Mol. Cell. Biol., 11, 4796-4803, 1991 ; KARNS et al . , J. Biol Chem., 270, 480-487, 1995 ; PARKER et al . , J. Biol. Chem., 267, 3343-3450, 1992 ; CHEN et al . , Mol. Cell. Biol., 16, 6372- 6384, 1996), Spl (SAFFER et al . , Mol. Cell. Biol., 11, 2189- 2199, 1991) et Egr-1 (MUTERO et al . , J. Biol. Chem., 270, 1866-1872, 1995 ; THOMPSON et al . , J. Biol. Chem., 266, 22678-22688, 1991 ; GUPTA et al . , J. Biol. Chem., 266, 12813- 12816, 1991 ; PARMACECK et al . , Mol. Cell. Biol., 14, 1870- 1885, 1994 ; ZHU et al . , Mol. Cell. Biol., 13, 4432-4444,
1993) influence également l'expression différentielle de gènes musculaires dans le cœur et pourrait représenter un mécanisme supplémentaire de contrôle de la transcription de gènes spécifiquement dans le cœur (SARTORELLI et al . , Cire. Res., 72, 925-931, 1993 ; LYONS et al . , Curr . Opin. Genêt. Dev., 6, 454-460, 1996 ; OLSON et al . , précité ; MABLY et al . , précité ; FIRULLI et al . , Trends Genêt., 13, 364-369, 1997 ; DUROCHER et al . , 1998, précité).
En conséquence, aucun promoteur permettant l'expression d'un gène d'intérêt dans tous les compartiments du cœur, précocement chez l'embryon et de façon durable chez l'adulte n'a encore été caractérisé. En outre, la combinaison d' éléments-cis, nécessaire et suffisante pour assurer l'expression d'un gène, spécifiquement dans le muscle cardiaque n'a pas été identifiée.
L'ADNc et le gène MYBPC3, codant la protéine C cardiaque humaine ont été isolés (KASAHARA et al . , J. Clin. Invest., 94, 1026-1036, 1995). Le gène MYBPC3 a une taille d'au moins 21 kb, il est composé de 35 exons (CARRIER et al . , Cire. Res., 80, 427-434, 1997) et est localisé sur la bande pli.2 du chromosome 11 (llpll.2), (GAUTEL et al . , Cire. Res., 82, 124-129, 1998). Cependant, aucune séquence contrôlant la transcription de ce gène n'a été précisément identifiée.
Parmi les protéines apparaissant exprimées spécifiquement dans le myocarde, la protéine C est une protéine abondante des muscles striés qui représente 2 à 4% des protéines fibrillaires (OFFER et al . , J. Mol. Biol., 74, 653-676, 1973). Elle fait partie d'un ensemble de protéines possédant des fonctions de structure et/ou de régulation associées à la chaîne lourde de la myosine dans le filament épais (EPSTEIN et al . , Science, 251, 1039-1044, 1991).
Il existe trois isoformes de protéine C, chacune codée par un gène et exprimée spécifiquement dans un type de muscle : la protéine C squelettique rapide, la protéine C squelettique lente et la protéine C cardiaque (cMyBPC) , (YAMAMOTO et al . , J. Biol. Chem., 258, 8395-8401, 1983).
L' expression de la protéine C cardiaque est restreinte exclusivement au muscle cardiaque et on ne la
retrouve jamais dans le muscle squelettique tout au long du développement chez l'homme et la souris, et les transcrits du gène MYBPC3 (Myosin Binding Protein-Cardiac 3) codant la protéine-C cardiaque sont présents uniquement dans le cœur et ce de manière uniforme, dans des embryons de souris ou humains (GAUTEL et al . , précité ; FOUGEROUSSE et al . , Cire. Res. , 82, 130-133, 1998) .
Chez l'homme, le gène MYBPC3 codant l' isoforme cardiaque est l'un des huit gènes impliqués dans les affections cardiaques du type CMH (TOWBIN et al . , Curr . Opin. Cell. Biol., 10, 131-139, 1998 ; MOGENSEN et al . , J. Clin. Invest., 103, 39-43, 1999). La CMH est une pathologie familiale qui se transmet selon un mode Mendélien autosomique dominant, caractérisée par une hypertrophie inexpliquée du ventricule gauche, prédominante au niveau du septum interventriculaire et associée à une large désorganisation cellulaire et tissulaire (HENGSTENBERG et al . , J. Mol. Cell. Cardiol., 26, 3-10, 1994).
A partir d'un clone génomique de souris comprenant u fragment du gène de la MYBPC3 codant la protéine C cardiaque, les Inventeurs ont maintenant identifié et clone la séquence du promoteur du gène MYBPC3 , et ont en outre localisé des séquences régulatrices nécessaires et suffisantes à l'activité tissu-spécifique de ce promoteur. Ces travaux leur ont permis d'isoler des fragments de ce promoteur capables d'activer l'expression d'un gène spécifiquement et exclusivement dans le myocarde à tous les stades du développement, de l'embryon à l'adulte.
La présente invention a pour objet une molécule d'acide nucléique issue d'un gène MYBPC de mammifère, qui comprend les éléments-cis de régulation nécessaires et suffisants pour diriger l'expression spécifique d'un gène dans le myocarde.
La molécule d'acide nucléique selon l'invention est essentiellement constituée par les séquences nécessaires au contrôle de l'initiation de la transcription du gène MYBPC3 (promoteur basai) , ainsi que par les séquences intervenant dans la régulation en cis de l'initiation de la
transcription, et ce par des mécanismes similaires aux mécanismes naturels de régulation de la transcription du gène MYBPC3 endogène.
Les molécules d'acide nucléique conformes à l'invention peuvent avantageusement être utilisées pour diriger l'expression d'un gène hétérologue, notamment un gène d'intérêt thérapeutique.
Au sens de la présente invention, on entend par "hétérologue" relativement à une séquence d'un gène donné, toute séquence d'acide nucléique autre que celles qui, dans ia nature, sont immédiatement adjacentes à ladite séquence.
Parmi les séquences nécessaires au contrôle de l'initiation de la transcription on peut citer notamment les motifs canoniques reconnus par l'ARN polymérase tels que les séquences des boîtes TATA et des boîtes CAT.
Parmi les séquences potentielles intervenant en cis dans la régulation de la transcription dans le muscle cardiaque on peut citer les séquences de liaison des facteurs de transcription, ubiquitaires ou spécifiques du muscle cardiaque, telles que les séquences de liaison des facteurs décrits ci-dessus.
De manière inattendue les Inventeurs ont montré qu'un fragment du gène MYBPC3 comprenant la boîte TATA et deux sites GATA-4 est capable d'activer l'expression d'un gène hétérologue, uniquement dans les cardiomyocytes in vi tro et in vivo .
Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention ladite molécule d'acide nucléique comprend deux séquences de liaison du facteur de transcription GATA-4 (motif canonique 5' -(A/G) GATA (A/G) -3) .
Avantageusement, lesdits sites GATA-4 sont situés entre les positions -60 et -70 et entre les positions -1010 et -1020, par rapport au site d'initiation de la transcription. Les facteurs GATA appartiennent à une famille de protéines nucléaires qui possèdent un domaine spécifique de fixation à l'ADN constitué par deux doigts de zinc adjacents de la famille C2/C2 ( HYATT, EMBO J. , 12, 4993-5005, 1993).
Le doigt de zinc C-terminal associé à une région basique adjacente constitue le domaine minimal de reconnaissance du motif canonique 5' - (A/G) GATA(A/G) -3' (KO et al . , Mol. Cell. Biol., 13, 4011-4022, 1993 ; MERIKA et al . , Mol. Cell. Biol., 13, 3999-4010, 1993) . Six facteurs GATA ont été caractérisés chez les vertébrés dont les facteurs GATA-4/5/6 qui sont impliqués d'une part dans la cardiogénèse et la différenciation cardiaque (JIANG et al . , Dev. Biol., 174, 258-270, 1996 ; GOVE et al . , EMBO J. , 16, 355-368, 1997 ; GREPIN, Development, 124, 2387-2395, 1997), et d'autre part la différenciation des cellules épithéliales intestinales (GAO, Mol. Cell. Biol., 18, 2901-2911, 1998). Les facteurs GATA-4/5/6 sont capables de transactiver de nombreux gènes cardiaques exprimés dans les cardiomyocytes ('LAVERRIERE et al . , J. Biol. Chem., 269, 23177-23184, 1994 ; KELLEY et al . , Development, 118, 817-827, 1993 ; JIANG et al . , précité; MORRISEY et al . , Dev. Biol., 177, 309-322, 1996 ; 183, 21-36, 1997 ; PARMACECK et al . , Mol. Cell. Biol., 12, 1967-1976, 1992) . Par exemple, le facteur GATA-4 active les gènes des protéines sarcomériques telles que la troponine C.
Avantageusement, ladite molécule d'acide nucléique comprend également un ou plusieurs site (s) de liaison d'un facteur impliqué dans la restriction de la transcription du gène MYBPC3 dans les cardiomyocytes. De manière avantageuse, ledit ou lesdits site (s) de liaison sont sélectionnés dans le groupe constitué par : les séquences de liaison du facteur NFAT-3, les séquences de liaison des protéines Ets et les séquences de liaison des facteurs RSRFs . Les Inventeurs ont en outre observé que la séquence qui s'étend de la position -1500 à -800 par rapport au site d' initiation de la transcription du gène MYBPC3 est impliquée dans la restriction de la transcription du gène dans les cardiomyocytes. Les Inventeurs ont analysé ladite séquence et ont localisé des sites potentiels de liaison :
- du facteur NFAT-3 (" Nuclear Factor of Activa ted T cells-3" ; motif canonique 5' - (A/T) GGAAAAT-3' ) ,
des protéines Ets (motif canonique Ets 5'- GGA(A/T)-3', et
- des facteurs RSRFs (motif canonique de type CarG : 5' -CC (A/T) GG-3' ) . Le facteur NFAT-3 qui est capable d' interagir avec le facteur GATA-4 est exprimé dans le cœur, il joue un rôle dans la cardiogénèse (DE LA POMPA et al . , Nature, 392, 182-186, 1998 ; RANGER et al . , Nature, 392, 186-190, 1998) et est également impliqué dans l'hypertrophie cardiaque (MOLKENTIN et al . , Cell, 93, 215-226, 1998).
Les protéines Ets régulent l'expression tissu- spécifique via des mécanismes d' activation et de répression (CONRAD et al . , Mol. Cell. Biol., 14, 1553-1565, 1994 ; ROSEN et al . , J . Biol. Chem., 269, 15652-15660, 1994 ; UMEZAWA et al . , Mol. Cell. Biol., 17, 4885-4894, 1997), parmi celles-ci, la protéine ERP/Net qui est exprimée dans de nombreux tissus est également présente dans le cœur (LOPEZ et al . , Mol. Cell. Biol., 14, 3292-3309, 1994 ; PRICE et al . , EMBO J. , 14, 2589- 2601, 1995) et il semblerait qu'elle puisse interagir avec le site de liaison aux RSRFs (PRICE et al . , précité ; LOPEZ et al . , précité ; ASYLYK et al . , Eur. J. Biochem. , 211, 7-18, 1993) .
La liaison de ces facteurs à des éléments de cette séquence pourrait être responsable de la restriction de la transcription du gène MYBPC3 dans les cardiomyocytes et représente un mécanisme supplémentaire de contrôle de l'activité du promoteur MYBPC3 endogène dans les cardiomyocytes .
Avantageusement, les sites GATA-4 ainsi que les sites NFAT-3, Ets et RSRFs, s'ils sont présents, sont localisées respectivement aux positions suivantes, par rapport au site d'initiation de la transcription :
- sites GATA-4 : -63/-58 ; -1015/-1010 ;
- sites NFAT-3 : -822/-815 ; -850/-844 ; - sites Ets : -935/-932 ; -1102/-1099 ;
- sites RSRF de type CarG : -861/-853 ; -870/-865 ; -1231/-1221.
Une molécule d'acide nucléique conforme à l'invention est représenté par exemple par :
- la séquence qui s'étend de la position -1535 à la position +28 par rapport au site d'initiation de la transcription du gène MYBPC3 murin ; cette séquence est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO :1, et la séquence représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO :2 qui s'étend de la position 464 à la position 1563 de la séquence SEQ ID NO : 1 ci-dessus.
Il doit être bien entendu que les molécules d'acide nucléique spécifiées ci-dessus, qui peuvent être obtenues à partir du gène MYBPC3 murin ne constituent qu'une illustration de l'objet de l'invention. Celle-ci englobe également en particulier, des molécules d'acide nucléique reproduisant des séquences homologues existant chez l'homme, ou chez d'autres mammifères, et qui peuvent être obtenues par l'homme du métier par des techniques classiques de biologie moléculaire.
De même, à partir des molécules d'acide nucléique comprenant au moins les éléments-cis de régulation du gène MYBPC3 spécifiés ci-dessus, l'homme du métier peut construire différentes molécules d'acide nucléique conformes à l'invention, par exemple en procédant à la mutation ou à la délétion de séquences situées en dehors des éléments-cis de régulation, et/ou éventuellement à leur substitution par d'autres séquences.
Les molécules d'acide nucléique comprenant les éléments-cis de régulation du gène MYBPC3 peuvent être associées avec des éléments-cis de régulation ou bien avec un promoteur basai provenant de gènes autres que le gène MYBPC3, selon différentes combinaisons, pour obtenir des molécules d' acides nucléiques chimériques qui se distinguent entre elles par leur niveau d'activité, et leur degré de spécificité.
Les molécules d'acide nucléique conformes à l'invention peuvent être utilisées pour contrôler
l'expression d'un gène hétérologue dans des cellules de mammifères, et avantageusement, pour obtenir une expression spécifique dans les cellules musculaires cardiaques.
L'objet de la présente invention englobe également les molécules d' acide nucléique recombinantes comprenant au moins une molécule d' acide nucléique conforme à l'invention liée à au moins une séquence hétérologue.
L'objet de la présente invention englobe en particulier : a) des cassettes d'expression comprenant : une molécule d'acide nucléique conforme à l'invention ; il peut s'agir d'une séquence issue du gène
MYBPC3, ou d'une séquence chimérique, comprenant au moins les éléments-cis de régulation du gène MYBPC3, telles que définies ci-dessus, et une séquence hétérologue placée sous contrôle transcriptionnel de ladite molécule d' acide nucléique . b) des vecteurs recombinants, comprenant un insert constitué par une molécule d'acide nucléique conforme à l'invention. Avantageusement ces vecteurs d'expression, comprennent au moins une cassette d'expression telle que définie ci-dessus.
De nombreux vecteurs où l'on peut insérer une molécule d'acide nucléique d'intérêt afin de l'introduire et de la maintenir dans une cellule hôte eucaryote ou procaryote, sont connus en eux-mêmes ; le choix d'un vecteur approprié dépend de l'utilisation envisagée pour ce vecteur (par exemple réplication de la séquence d'intérêt, expression de cette séquence, maintien de cette séquence sous forme extrachromosomique, ou bien intégration dans le matériel chromosomique de l'hôte), ainsi que de la nature de la cellule hôte.
L'invention a en outre pour objet des cellules procaryotes ou eucaryotes transformées par au moins une molécule d'acide nucléique conforme à l'invention. De préférence, ces cellules sont des cellules animales, en particulier des cellules de mammifères. Il peut s'agir de
cellules musculaires cardiaques ou de cellules embryonnaires totipotentes capables de se différencier en cellules musculaires cardiaques.
Des cellules transformées conformes à l'invention peuvent être obtenues par tous moyens, connus en eux-mêmes, permettant d' introduire une molécule d' acide nucléique dans une cellule-hôte. Par exemple, dans le cas de cellules animales, on peut utiliser entre autres des vecteurs viraux tels que les adénovirus, les rétrovirus, les lentivirus et les AAV, dans lesquels a été insérée préalablement la séquence d'intérêt ; on peut également associer ladite séquence (isolée ou insérée dans un vecteur plasmidique) avec une substance lui permettant de franchir la membrane des cellules-hôte, par exemple une préparation de liposomes, de lipides ou de polymères cationiques, ou bien l'injecter directement dans la cellule hôte, sous forme d'ADN nu.
Le transfert de gènes dans le muscle cardiaque peut par exemple être réalisé à l'aide d' adénovirus recombinant, de virus recombinant associé à l' adénovirus (AAV), de liposomes, de lipides ou de polymères cationiques, ou par injection directe de molécule d'acide nucléique.
Ces vecteurs viraux ou non viraux peuvent être administrés soit par injection directe dans le myocarde, soit par perfusion coronaire (BARR et al . , Gène Therapy, 1, 51-58, 1994 ; BUDKER et al . , Gène Therapy, 5, 272-276, 1998) ou bien encore par injection dans l'enveloppe péricardique (LIM et al . , Circulation, 83, 2007-2011, 1991 ; MUHIHAUSER et al . , Gène Therapy, 3, 145-153, 1996 ; ROTHMANN et al . , Gène Therapy, 3, 919-926, 1996) . Les Inventeurs ont également obtenu des animaux transgéniques, dans lesquels un gène hétérologue était placé sous contrôle transcriptionnel d'une molécule d'acide nucléique comprenant les éléments-cis de régulation du gène MYBPC3 , selon l'invention et ont ainsi constaté que les propriétés de cette molécule d'acide nucléique, et en particulier la spécificité d'expression dans les cellules musculaires cardiaques se manifestaient non seulement ex
vivo, mais également in vivo à tous les stades du développement, de l'embryon à l'adulte.
La présente invention a pour objet des animaux et en particulier des mammifères transgéniques non-humains, caractérisés en ce que tout ou partie de leurs cellules sont transformées par une molécule d'acide nucléique selon l'invention. Il s'agit par exemple d'animaux dans lesquels on a introduit un gène d'intérêt sous contrôle d' éléments-cis de régulation du gène MYBPC3, ou d'un promoteur chimérique construit à partir des éléments-cis de régulation de celui-ci qui confèrent la spécificité d'expression dans les cellules musculaires cardiaques ; le gène d'intérêt est alors exprimé spécifiquement dans les cellules musculaires cardiaques.
Les cellules transformées et les animaux transgéniques conformes à l'invention sont en particulier utilisables comme modèles pour étudier et/ou modifier l'expression de différents gènes dans les cellules musculaires cardiaques.
L'invention a également pour objet l'utilisation de molécules d'acide nucléique conformes à l'invention pour l'obtention de médicaments, en particulier de médicaments destinés au traitement des pathologies du myocarde.
La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de Description qui va suivre, qui se réfère à des exemples décrivant l'obtention et la caractérisation du promoteur du gène MYBPC3 et des fragments de celui-ci permettant une expression spécifique dans le muscle cardiaque, ainsi qu'à leur utilisation pour l'expression de gènes heterologues spécifiquement dans les cellules musculaires cardiaques dans des cultures de cellules et dans des animaux transgéniques, ainsi qu'aux dessins annexés dans lesquels :
- la figure 1 illustre la carte de restriction et l'organisation des introns et des exons du fragment de 15 kb du gène MYBPC3 isolé à partir d'une banque genomique de souris. Ce fragment comprend une séquence de 2,3 kb entre le gène Spi-1 et le gène MYBPC3 (région intergénique) , contenant le promoteur du gène MYBPC3. S : Sacl ; Sp : SphI ; Ac :
AccI ; Xb : Xbal ; H : HindIII ; E : EcoRI ; K : Kpnl . Les exons du gène Spi-1 sont représentés en noir et les exons du gène MYBPC3 sont représentés en grisé. la figure 2 illustre la comparaison de la séquence proximale du promoteur du gène MYBPC3 humain et murin. (a) la séquence qui s'étend de la position -238 à la position +83, par rapport au site d'initiation de la transcription (+1) du gène MYBPC3 de la souris est présentée et les sites potentiels de fixation de facteurs de transcription sont encadrés, (b) la séquence qui s'étend de la position -255 à la position +1, par rapport au site d' initiation de la transcription, du gène MYBPC3 de la souris est alignée avec la séquence ' correspondante du gène MYBPC3 humain (numéro d'accession Y10129) et les sites potentiels de fixation de facteurs de transcription sont encadrés.
- la figure 3 illustre la structure des quatre fragments de respectivement 2,5 ; 1,5 ; 0,8 et 0,35 kb du promoteur du gène MYBPC3 couplés au gène rapporteur EGFP dans le vecteur pEGFP.- - la figure 4 illustre la carte de restriction d'un vecteur d'expression contenant le fragment de l,5kb du promoteur du gène MYBPC3.
Exemple 1 : Clonage moléculaire et localisation chromosomique du promoteur du gène MYBP-C3 murin Un fragment de 15 kb du gène MYBPC3 a été isolé par criblage d'une banque λFIXII d'ADN genomique de souris à l'aide d'une sonde de 215 pb correspondant à l'extrémité 5' de la séquence codante de la protéine C cardiaque.
Trois fragments de 2 kb, 4 kb et 6 kb, obtenus par restriction du fragment de 15kb issu du clone genomique avec l'enzyme Sacl ont été sous-clonés au site Sacl du plasmide pBluescript (STRATAGENE) . Les plasmides obtenus dénommés respectivement pSac2, pSac4 et pSacδ ont été séquences et la séquence des fragments ci-dessus a été comparée avec les banques de données.
La carte de restriction du fragment de 15 kb est représentée à la figure 1 : il contient les exons 1 à 20 du gène de la protéine C cardiaque, les deux derniers exons de
l'oncogène Spi-1 (numéro d'accession : X17463) et 2,3 kb de séquence intergénique .
Chez l'homme, l'organisation chromosomique des gènes Spi -1 (MOREAU-GACHELIN, Oncogene, 4, 1449-1456, 1989) et MyBPC3 (GAUTEL et al . , précité) est similaire à celle observée chez la souris : ils sont tous les deux localisés dans la région pli.2 du chromosome 11.
La région intergénique de 2,3 kb comprenant le promoteur du gène MYBPC3 , issue du plasmide pSac4, a ensuite été analysée.
Exemple 2 : Analyse du promoteur du gène MYBPC3 humain et murin
2.1. Détermination du site d'initiation de la transcription du gène MYBPC3 murin Le site d' initiation de la transcription a été déterminé par la technique d'extension d'amorce et par clonage de l'extrémité 5' de l'ARN messager de la protéine C cardiaque, à l'aide respectivement des kit AMV Reverse Transcriptase Primer Extension System (PROMEGA) et du kit 5 'RACE (Rapid Amplifica tion System of cDNA ends) , selon les instructions du fabricant. Les résultats montrent que le site d' initiation de la transcription du gène MYBPC3 se situe 47 pb en amont de l'ATG.
2.2. Recherche des motifs spécifiques de liaison de facteurs de transcription dans les gènes MYBPC3 humains et murins
L'alignement de la séquence de 2,3 kb avec la séquence du gène humain (numéro d'accession Y10129 ) montre une homologie de près de 80% entre les positions -200pb et +1 (Figure 2b) . La séquence de 2,3 kb a été analysée à l'aide du logiciel Ma tlnspector qui permet la recherche de sites de fixation de facteurs impliqués dans la transcription (QUANDT et al . , Nucleic Acid Res., 23, 4878-4884, 1995 ; http//www. gsf . de/biodv/matinspector .html) . Des éléments de séquences décrits comme ayant une importance dans la régulation de gènes codant des protéines musculaires ont également été recherchés directement sur ces séquences.
Les sites potentiels de liaison de facteurs de transcription ubiquitaires ou spécifiques du cœur identifiés dans la séquence proximale -238 à +83 du promoteur murin et la conservation de ces séquences dans le promoteur humain sont présentés respectivement sur les figures 2a et 2b.
L'analyse du promoteur murin montre que le site d'initiation de la transcription est situé 30 pb en aval du premier nucléotide d'une boîte TATA (5' -TAAATA-3' ) reconnue par l'ARN polymérase II qui est également présente dans le promoteur humain. En outre, aucun motif canonique de type ::AAT (boîte CAT) n'a été identifié dans les 200 premiers nucléotides en amont du site d' initiation de la transcription du promoteur murin ou humain. Cependant, il est possible que la séquence CAAGT du promoteur murin ou la séquence CAAT du promoteur humain, située entre -137/-141pb, puissent jouer le rôle d'une boîte CAT.
Des sites de liaison de facteurs de transcription suivants ont été identifiés dans le promoteur murin aux positions spécifiées, ceux identiques dans .le promoteur humain sont indiqués en gras. :
• si tes riches en GC de liaison des facteurs Spl et Spl - like :
-47/-41 ; -192/-187 ; -282/-278
• si tes riches en GC de liaison des facteurs Egr-1 : -169/-161 ; -227 / '-222 ; -293 /-287 ; -503 /-490 ;
-669/-662
• si tes riches en AT de liaison des facteurs MEF-2 :
-32/-24 ; -92/-83 Le premier site de liaison de MEF-2 recouvre la boîte TATA et le second est adjacent à un autre élément-cis de régulation de la transcription (boîte E) .
• si tes riches en AT de liaison de protéines à homéodomaines telles que MHox :
-260/-252 ; -758/-752 ; -813/-806 ; -1071/-1063 ; -1710/-1697
• motifs canoniques GATA-4 ( (5 ' - (A/G) GATA (A/G) -3 ' ) :
-63/-58 ; -1015/-1010 ; -2239/-2234
• motif GATA-4 like
-117/-112 ;-244/-239
• motif canonique Nkx2. 5 (5 ' -TNAAGTG-3 ' ) :
-981/-975 ; -1078/-1072 ; -1631/-1625, (sur le brin anti-sens)
• si tes GTIIC, SphI et SpHII de liaison des facteurs TEF-1
-105/-100 ; -640/-646 ; -812/-804 ; -2132/-2124, Les sites en position -105/-100 et -640/-646 sont juxtaposés à une boîte E.
• site de liaison à l 'hormone thyroïdienne (TRE : Thyroïd Responsive Elément) :
-70/-64 ; -161/-143 ; -205/-198 ; -967/-959 ; -1591/-1585 ; -1611/-1604,
• motif canonique 5 r -CA (G/C) (C/G) TG-3 ' (boite E) :
-82/-11 , -109/-104,
• motif canonique (5' ' -GGA (A/T) -3 ' ' ) des facteurs Ets :
-101/-95 ; -935/-932 ; -1102/-1099,
• motifs palindromiques de forte affinité pour les facteurs Ets :
-116/-128
• si tes riches en AT de type CarG ou GArC de liaison des facteurs RSFR :
-820/-814 ; -848/-843 ; -870/-865 ; -861/-853 ; -1231/-1221 ;
-1721/-1710,
• motif canonique (5 ' - (A/T) GGAAAAT-3 ' ) de liaison du facteur NFAT-3 (Nuclear Factor of Activa ted cells) :
-822/-815 ; -850/-844 ; -2200/-2193 . Ces résultats montrent d'une part que de nombreux facteurs de transcription sont susceptibles de se lier au promoteur du gène MYBPC3 murin et humain, et d'autre part que la plupart des sites de liaison de ces facteurs sont conservés entre les promoteurs humains et murins. Cependant, la présence de ces sites mêmes s'ils sont canoniques ne signifié pas pour autant qu' ils soient directement impliqués la régulation du promoteur endogène. En conséquence, seule l'analyse fonctionnelle du rôle de ces
différents sites dans l'activité du promoteur du gène MYBPC3 permet de déterminer la combinaison minimum de ces séquences, capable d'assurer l'expression tissu-spécifique du gène MYBPC3 dans le cœur. Exemple 3 : Détermination d' un fragment de promoteur minimum spécifique des cellules cardiaques
3.1 Activité promotrice de la séquence intergénique de 2,3 kb et de fragments issus de cette séquence
La région intergénique a été amplifiée par PCR à partir du plasmide pSac4 de façon à générer des fragments de respectivement 2,5 kb, 1,5 kb (SEQ ID NO :1), 1,1 kb (SEQ ID NO :2), 0,8 kb et 0,35 kb, possédant une extrémité 3' identique correspondant à la position +28 par rapport au site d'initiation de la transcription et une extrémité 5' variable (figure 3) . Dans l'amorce 3', l'ATG en position +24 à +26 du gène MYBPC3 qui pourrait perturber l'initiation de la traduction au niveau du premier ATG d'un gène hétérologue clone derrière ces séquences est remplacé par un site Sacl. Les produits d'amplification obtenus sont clones au site Sacl du plasmide "pGEM-T easy vecteur" (PROMEGA) puis sous-clonés dans les deux orientations (sens et anti-sens) au site Sacl du plasmide pEGFP-1 (CLONTECH) qui contient l'ADNc de l'EGFP ( Eucaryotic Green Fluorescent Protein) . Les plasmides obtenus sont dénommés pEGFP4 (2,5 kb) , pEGF 6 (1,5 kb) , pEGFP8 (1,1 kb) , pEGF 10 (0,8 kb) et pEGFP12 (0,35 kb) . Les plasmides contenant l' insert dans son orientation anti-sens sont utilisés comme témoins négatifs et le plasmide contenant le fragment de 2,5 kb est utilisé comme témoin positif.
Les plasmides contenant les différents fragments de promoteur sont electropores dans des cellules de carcinome embryonnaire de souris de souche C3H/He (cellules P19 ; Me BURNEY et al . , Nature, 299, 165-167, 1982). Des transfectants stables ayant intégré des copies de ces plasmides sont sélectionnés en présence de généticine, puis maintenus à l'état indifférencié ou induits en différenciation.
Les cellules P19 sont des cellules embryonnaires totipotentes capables de se différencier en cellules cardiaques en présence de diméthyl sulfoxide, à la
concentration finale de 1% v/v. Les corps embryonnaires constitués de cellules cardiaques en contact les unes avec les autres, sont reconnaissables par des zones battantes rythmiques, un phénotype caractéristique du cœur en développement in vivo (DOETSCHMAN, J. Embryol. Exp . Morphol. 87, 27-45, 1985, ; RUDNIKI, Dev. Biol., 138, 348-358, 1990 ; MALTSEV, Mech. Dev., 44, 41-50, 1993).
Les cellules P19 sont maintenues à l'état indifférencié en milieu de prolifération (DMEM (GIBCO) , 15% sérum de veau fœtal, 0,1 mM β-mercaptoéthanol) . Après trypsination, 2.106 à 5.106 cellules en suspension sont électroporées (GENE PULSER, BIO-RAD, réglé sur 250 V et 500 μF) pendant 5 à 7 ms dans un volume de 800 μl de tampon phosphate pH 7,4, contenant 25 μg de plasmide. Puis, les cellules sont réparties dans des boîtes de culture contenant de la gélatine à 0,1% additionnée de milieu de prolifération.
2 jours après l' électroporation, la sélection est effectuée en milieu de prolifération contenant 0,7 mg/ml de généticine.
La différenciation est réalisée en milieu DMEM contenant 20% de sérum de veau fœtal et 1% de DMSO, par la technique des gouttes pendantes ; les cellules en suspension (25000 cellules /cm3) sont déposées en gouttes de 20 μl (500 cellules) sur le couvercle d'une boîte de culture cellulaire et incubées pendant 3 jours (les cellules s'agrègent pour former des corps embryonnaires), puis les corps embryonnaires sont détachés et cultivés en suspension pendant 4 jours, et au septième jour de différenciation ils sont transférés dans un milieu de culture gélatine permettant leur adhésion au support. Les zones battantes apparaissent entre le quatorzième et le vingtième jour de différenciation.
L'expression de l'EGFP est déterminée à partir d'un ensemble de 15 corps embryonnaires observés au microscope inversé à fluorescence (OLYMPUS IX50/IX70+IX=FLA) et évaluée par le pourcentage de corps embryonnaires émettant de la fluorescence au niveau des zones battantes.
Les résultats de cette expérience sont les suivants :
1) Aucune expression de l'EGFP n'est observée dans les cellules P19 différenciées ou non différenciées, électroporées avec les plasmides dans leur version antisens, ce qui démontre que la fluorescence observée est spécifique de l'activité du promoteur.
2) Avec les plasmides pEGFPlO ou pEGFP12, - on observe une expression très faible de l'EGFP dans les cellules P19 non-différenciées, et dans les cellules P19 différenciées en cellules cardiaques, on observe une expression majoritaire de l'EGFP dans les zones battantes avec une expression faible et variable dans des cellules à l'extérieur de ces zones battantes.
3) Avec les plasmides pEGFP4, pEGFP6 et pEGFP8 on observe une absence d'expression de l'EGFP dans les cellules P19 indifférenciées et une expression de l'EGFP uniquement au niveau des zones battantes dans les cellules P19 différenciées en cellules cardiaques.
Ces résultats permettent d'établir que seuls les fragments de 2,5 kb, 1,5 kb et 1,1 kb contiennent l'ensemble des séquences du promoteur du gène MYBPC3 murin permettant une expression spécifique des cellules musculaires cardiaques .
3.2. Détermination des éléments de séquences impliqués dans la spécificité cardiaque du promoteur. 3.2.1. Mutagénèse des sites GATA-4
Il a été montré précédemment (exemple 2) que le promoteur du gène MYBPC3 contient 2 motifs canoniques GATA-4 dont le plus proximal situé entre -63/-58 pb (site GATA.l) est compris à la fois dans les fragments de 1,5 kb, de 0,8 kb et de 0,35 kb, et le plus distal (site GATA.2) situé entre
-1015/-1010 pb est compris uniquement dans le fragment de
1,5 kb (figure 3) .
Ces motifs étant importants dans l'expression spécifique de gènes cardiaques, les séquences TGATAA (site GATA.l) et AGATAA (site GATA.2) ont été mutées indépendamment en site de restriction Xbal (TCTAGA) dans le plasmide pEGFP6.
Le site GATA.l présent dans les plasmides pEGFPlO et pEGFP12 a également été muté en site Xbal. Les plasmides obtenus
comprenant ces mutations sont dénommés pEGFPβ.l, pEGFP6.2, pEGFP6.1.2, pEGFPlO.l et pEGFPl2.1.
3.2.2 Transfection des plasmides mutés dans des cellules non- cardiaques . Afin de vérifier que les mutations empêchent bien la fixation du facteur de transcription GATA-4, les constructions pEGFP6 et pEGFPδ doublement muté (pEGFP6.1.2) sont transfectées de manière transitoire dans des cellules non-cardiaques (lignée de fibroblastes de caille QT6 ; MOSCOVICI et al . , Cell, 11, 95-103, 1977), en présence ou en l'absence d'un vecteur plasmidique d'expression du facteur GATA-4.
500 000 cellules QT6 cultivées en milieu DMEM contenant 10% de sérum de veau foetal sont transfectées par un mélange contenant lμg de plasmide pEGFPδ muté ou non muté, 1 μg du plasmide GATA-4 et- 3 μl de lipide non-liposomal Fugeneβ (BOEHRINGER) , selon les recommandations du fabricant. Les cellules transfectées par les plasmides pEGFPδ et pEGFP6 mutés seuls sont utilisées comme témoin négatif. 48h après la transfection, l'émission de fluorescence est observée au microscope inversé à fluorescence.
On observe que seule .la construction mutée sur les deux sites n'est pas transactivée par l'expression du facteur GATA-4. Les autres constructions le sont à des degrés plus ou moins importants, la transactivation la plus importante étant obtenue avec le plasmide pEGFP6 non muté. Ces résultats établissent donc que seuls les deux sites canoniques en position -63/-58 et -1015/-1010 permettent une bonne transactivation du fragment de 1,5 kb du promoteur, par le facteur GATA- .
3.2.3 Transfection des plasmides mutés dans des cellules cardiaques .
Les plasmides mutés ou non mutés sont electropores dans des cellules P19 différenciées en cellules cardiaques comme décrit à l'exemple 3.1.
Les résultats de 2 séries d'expériences indépendantes sont présentés dans le tableau I ci-dessous.
Tableau
*ND= non déterminé
Les résultats observés permettent d'établir que dans les cellules cardiaques : 1) le fragment de 1,5 kb muté sur les deux sites
GATA ne présente aucune activité,
2) le fragment de 1,5 kb muté sur l'un ou l'autre des sites GATA présente des activités plus faibles que celle du fragment non muté, 3) les fragments plus courts (0,8 kb ou 0,5 kb) qui ne possèdent aucun des sites GATA par délétion et/ou mutation conservent toujours une activité.
Les résultats confirment que le fragment de
1,5 kb constitue un promoteur minimum fort du gène MYBPC3 le mieux régulé dans les cellules cardiaques et permettent d'établir que les deux sites GATA-4 (-63/-58 et -1015/-1010) sont indispensables à l'activité de ce promoteur.
D'autre part, les résultats observés avec les plasmides pEGFPlO.l et pEGFP12.1 comparés à ceux observés pour le plasmide pEGFPδ.1.2 permettent d'établir qu'il existe un mécanisme de régulation négatif impliquant les séquences
-15007-800.
L'analyse des 700 pb (voir exemple 3) révèle des motifs consensus de liaison au facteur de transcription NF- AT3 [-822/-815 pb (5' -TGGAAAAT-3' ) , -850/-844 pb (5'-TGGAAAT- 3')] .
En outre, les sites Ets (-935/-932, -1102/-1099) et les sites SRFR (-1231/-1221 ; -861/-853 ; -870/-865) sont
des cibles potentielles du facteur ERP/Net, qui est exprimé dans le cœur.
Le facteur NFAT-3 qui se lie au motif canonique 5'-(A/T)GGAAAAT-3' (HOEY et al . , I munity, 2, 461-472, 1995) fait partie d'une famille multigénique dont les membres sont exprimées essentiellement dans les lymphocytes (RAO et al . , Annu. Rev. Immunol., 15, 707-747, 1997). NFAT-3 est exprimé dans le cœur et joue un rôle dans la cardiogénèse (DE LA POMPA et ai., Nature, 392, 182-186, 1998 ; RANGER et al . , Nature, 392, 186-190, 1998), il a également été rapporté que NFAT-3 interagit avec GATA-4 pour activer la transcription du gène BNP (type B Natriuretic Peptide) , impliqué dans l'hypertrophie cardiaque (MOLKENTIN et al . , précité).
Les protéines Ets qui reconnaissent la séquence 5'-GGA(A/T)-3' (TREISMAN et al . , Curr. Opin. Dev. Genêt., 4, 96-101, 1994) régulent l'expression tissu-spécifique via des mécanismes d' activation et de répression (CONRAD et al . , Mol. Cell. Biol., 14, 1553-1565, 1994 ; ROSEN et al . , J. Biol. Chem., 269, 15652-15660, 1994 ; UMEZAWA et al . , Mol. Cell. Biol., 17, 4885-4894, 1997). Parmi celles-ci, la protéine ERP/Net qui est exprimée dans de nombreux tissus dont le cœur (LOPEZ et al . , Mol. Cell. Biol., 14-3292-3309, 1994 ; PRICE et al., EMBO J. , 14, 2589-2601, 1995) interagit avec un seul site de fixation Ets (LOPEZ et al . , précité) et il semblerait qu'elle puisse également interagir avec le site de liaison aux SRFRs (PRICE et al . , EMBO J. , 14, 2589-2601, 1995 ; LOPEZ et al . , précité ; WASYLYK et al . , Eur. J. Biochem. , 211, 7- 18, 1993) .
Ce mécanisme de régulation négatif représente un mode de contrôle supplémentaire de l'expression spécifique dans le cœur pour le fragment de 1,5 kb du promoteur du gène MYBPC3 .
Exemple 4 : Construction d'un vecteur d'expression selon 1' invention Un vecteur d'expression, dénommé pU523, permettant l'expression d'un gène hétérologue sous le contrôle transcriptionnel du fragment de 1,5 kb du promoteur du gène MYBPC3 a été construit selon les étapes suivantes :
1) le fragment Sall-Notl du site multiple de clonage du plasmide pSL1190 Λ superlinker phagemid" (PHARMACIA) a été inséré entre les sites Sali et Notl du plasmide pEGFP-1 (CLONTECH) pour donner le plasmide pΔEGFP, délété du promoteur et de la partie codante de l'ADNc de l'EGFP,
2) le fragment Xhol-Smal du plasmide pCMVβ (CLONTECH) contenant un intron ainsi qu'un site donneur et un site accepteur d'épissage (SD/SA) a été inséré entre les sites Sali et Smal du plasmide pΔEGFP,
3) un site Pmel a été introduit par PCR aux extrémités du fragment Eco47III- Afl-II du plasmide pΔEGFP (700 pb) , contenant l'intron, le SD/SA et la séquence de polyadénylation de SV40. 4) le produit d'amplification obtenu a été clone dans le plasmide pGEM-T easy vecteur (PROMEGA) pour donner le plasmide pPmel, et
5) le fragment SalI-HindIII du plasmide pGEM-T6 contenant le fragment de l,5kb du promoteur du gène MYBPC3 , obtenu comme décrit à l'exemple 3 , a été inséré entre les sites Xhol et HindIII du fragment Pmel du plasmide pPmel pour donner le plasmide pU523.
La carte du vecteur pU523 est illustrée par la figure 4 : il comprend le fragment de l,5kb du promoteur du gène MYBPC3 , un petit intron, un site multiple de clonage et une séquence de polyadénylation, bordés d'un site de restriction rare (site Pmel) qui permet d'isoler la cassette d'expression et de la cloner dans un autre vecteur.
Exemple 5 : Activité du promoteur minimum de 1 , 5 kb ±n vivo dans des souris transgéniques.
Le plasmide pEGFP6, obtenu comme décrit à l'exemple 3, a été digéré par les endonucléases Sacl et AflII et le fragment de restriction obtenu, qui comprend le fragment de 1,5 kb du promoteur du gène MYBPC3 lié au gène de l'EGFP a été purifié. Ce fragment a été injecté dans des œufs de souris fertilisés qui ont ensuite été réimplantés dans des souris pseudo-gestantes .
L'expression de l'EGFP dans les 10 lignées de souris obtenues a été analysée par observation directe de différents organes au microscope inversé à fluorescence.
7 des 10 lignées expriment fortement l'EGFP, cette expression est détectée uniquement au niveau du cœur
Ces résultats permettent d'affirmer que le fragment de 1,5 kb est actif in vivo et permet d'exprimer un gène hétérologue à des niveaux élevés, exclusivement dans le cœur. La cassette d'expression telle que définie ci-dessus permet donc d'évaluer l'activité de nouvelles molécules thérapeutiques à visée cardiaque ou cardiovasculaire et d'étudier les conséquences fonctionnelles de l'expression d'une protéine hétérologue dans le muscle cardiaque. Exemple 6 : Activité du promoteur minimum de 1 , 5 kb in vivo dans le muscle cardiaque après injection d'un vecteur recombinant contenant le promoteur lié au gène rapporteur de la β-galactosidase 6.1. Injection d'un plasmide recombinant
Un plasmide recombinant dénommé pShMYBPC3-LacZ, contenant la séquence codante du gène lacZ, sous le contrôle du fragment de 1,5 kb du promoteur du gène MYBPC3 murin a été construit en suivant les étapes suivantes. Le fragment Xhol- Sall du plasmide pCMVβ (CLONTECH) contenant la séquence codante du gène lacZ a été inséré au site Sali du plasmide navette de l' adénovirus pAdeasy (HE et al . , Proc. Nat . Acad. Sci., 95, 2509-2514, 1998). Le plasmide obtenu contient la séquence codante du gène lacZ, flanquée en 5' d'un site accepteur d'épissage, d'un intron et d'un site donneur d' épissage provenant de la région tardive de SV40 et en 3' d'un site de polyadénylation. Puis ce plasmide a été digéré par les endonucléases Xhol et HindIII et le fragment Xhol- HindlII du plasmide pEGFP6 contenant le promoteur du gène MYBPC3 a été inséré entre ces deux sites pour donner le plasmide pShMYBPC3-LacZ . Des rats Wistar adultes de sexe mâle ont été injectés avec 50 à 500 μg du plasmide recombinant obtenu, contenant le gène de la β-galactosidase sous le contrôle transcriptionnel du fragment de 1,5 kb du promoteur du gène
MYBPC3. 2 séries d'expérimentation ont été réalisées sur des lots de 3 animaux :
1) injection intramyocardique, au niveau de la paroi du ventricule gauche, de 50 à 250 μg de plasmide recombinant dans du soluté glucose à 5% P/V dans un volume d'injection de 100 μl,
2) injection intramusculaire, au niveau du muscle squelettique Tibialis anterior de 50 à 500 μg de plasmide recombinant dans du soluté glucose à 5% P/V dans un volume d'injection de 100 μl .
Le plasmide ne contenant pas de promoteur a été utilisé comme témoin négatif et le plasmide pCMVβ (CLONTECH) comme témoin positif de l'expression de la β-galactosidase dans les deux types de tissus musculaires 7 jours après l'injection, les animaux ont été sacrifiés et le cœur ainsi que le muscle ont été prélevés. Des cryocoupes transversales ou longitudinales sériées, de ces deux organes ont été effectuées.
Après incubation en présence du substrat X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-galactoside) , les coupes ont été observées au microscope afin d'analyser les cellules exprimant la β-galactosidase.
Après injection du plasmide témoin sans promoteur dans le myocarde ou bien dans le muscle squelettique, aucune cellule exprimant la β-galactosidase n'est détectée dans les deux types de muscles.
Après injection dans le myocarde, de nombreuses cellules exprimant la β-galactosidase sont détectées aussi bien chez les animaux ayant reçu le plasmide pCMVβ que chez les animaux ayant reçu le plasmide pShMYBPC3-LacZ .
En revanche, après injection dans le muscle squelettique, aucune cellule exprimant la β-galactosidase n'est détectée chez les animaux ayant reçu le plasmide pShMYBPC3-LacZ alors que de nombreuses cellules exprimant la β-galactosidase sont détectées chez les animaux ayant reçu le plasmide pCMVβ.
Ces résultats permettent d' affirmer que l'administration in vivo d'un vecteur d'expression
plasmidique contenant un gène hétérologue sous le contrôle du fragment de 1,5 kb du promoteur MYBPC3 permet d'exprimer ce gène hétérologue, uniquement dans le myocarde. 6.2 Injection d'un adénovirus recombinant Un adénovirus recombinant, dénommé AdMYBPC3-βgal contenant le gène de la β-galactosidase sous le contrôle transcriptionnel du fragment de 1,5 kb du promoteur du gène MYBPC3, en lieu et place de la région El d'un adénovirus défectif ΔE1, a été obtenu par recombinaison homologue à partir du plasmide navette de l' adénovirus pShMYBPC3.
L' adénovirus recombinant décrit par DAVIDSON et al . (Nature Genetics, 3, 219-223, 1993), contenant le gène de la βgalactosidase sous le contrôle transcriptionnel du promoteur ubiquitaire du cytomégalovirus (AdCMV-βgal) a été utilisé comme témoin.
Des lots de 3 rats Wistar adultes de sexe mâle ont été injectés avec 109 ufp (unités formant plage) de l' adénovirus AdMYBPC3-bgal ou AdCMV-βgal. 4 séries d'expérimentation ont été réalisées : 1) injection intramyocardique, au niveau de la paroi du ventricule gauche, de la préparation d' adénovirus dans du soluté Ringer-lactate dans un volume d'injection de -100 μl,
2) injection intramusculaire, au niveau du muscle squelettique Tibialis anterior de la préparation d' adénovirus dans du soluté Ringer-lactate dans un volume d'injection de 100 μl,
3) injection intrapéricardique, selon le procédé décrit dans FROMES et al . (Gène Therapy, 6, 683-688, 1999), de la préparation d' adénovirus dans du soluté Ringer-lactate dans un volume d'injection de 750 μl,
4) injection intraartérielle de la préparation d' adénovirus dans du soluté Ringer-lactate, dans un volume d'injection de 100 μl 7 jours après l'injection, les animaux ont été sacrifiés et le cœur, le muscle ainsi que les autres organes (poumon, diaphragme, foie, rein , rate) ont été prélevés. Des
cryocoupes transversales et/ou longitudinales sériées, de ces organes ont été effectuées.
Après injection dans le muscle squelettique, aucune cellule exprimant la β-galactosidase n'est détectée dans les animaux ayant reçu l' AdMYBPC3-βgal alors que de nombreuses cellules positives sont observées chez les animaux ayant reçu l'AdCMV-βgal .
Après injection intrapéricardique, l'expression de la β-galactosidase est limitée aux cellules du myocarde ainsi qu'à des cellules de la rate chez les animaux ayant ceçu 1 ' AdMYBPC3-βgal alors que des cellules exprimant la β-galactosidase sont observées dans de nombreux organes (foie, cœur, rate, poumon, rein) des animaux ayant reçu 1' AdCMV-βgal. Après injection intraartérielle, aucune cellule exprimant la β-galactosidase n'est observée chez les animaux ayant reçu l'AdMYBPC3-βgal alors que des cellules exprimant la β-galactosidase sont observées dans de nombreux organes, en particulier dans le foie, mais jamais dans le cœur, des animaux ayant reçu l' AdCMV-βgal .
Ces résultats permettent d'affirmer que l'administration in vivo, directement dans le cœur ou bien par voie systémique, d'un adénovirus recombinant contenant un gène hétérologue sous le contrôle du fragment de 1,5 kb du promoteur MYBPC3 permet d'exprimer ce gène hétérologue, à des niveaux élevés, uniquement dans le myocarde.
Ce vecteur recombinant permet donc de limiter les effets indésirables liés à l'expression d'un gène hétérologue dans un autre tissu que le myocarde.
Claims
REVENDICATIONS 1°) Molécule d'acide nucléique capable de diriger l'expression spécifique d'un gène dans le myocarde, caractérisée en ce qu'elle comprend les éléments-cis de régulation de la transcription du promoteur d'un gène MYBPC3 de mammifère, lesquels éléments de régulation de la transcription comprennent au moins deux séquences de liaison d'un facteur de transcription GATA-4.
2°) Molécule d'acide nucléique selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend un site
GATA-4 entre les positions -60 et -70 et entre les positions
-1010 et -1020, par rapport au site d'initiation de la transcription.
3°) Molécule d'acide nucléique selon la revendication 2, caractérisée en ce qu'elle comprend également un ou plusieurs sites de liaison d'un facteur de transcription impliqué dans la restriction de la transcription du gène MYBPC3 dans les cardiomyocytes, le ou lesdits sites de liaison étant choisis parmi les séquences de liaison du facteur NFAT-3, les séquences de liaison des protéines Ets et les séquences de liaison des facteurs RSRFs.
4°) Molécule d'acide nucléique selon la revendication 3, caractérisée en ce que lesdits sites de liaison sont localisés aux positions suivantes par rapport au site d'initiation de la transcription :
- sites GATA-4 : -63/-58 ; -1015/-1010 ;
- sites NFAT-3 : -822/-815 ; -850/-844 ;
- sites Ets : -935/-932 ; -1102/-1099 ;
- sites RSRF de type CarG : -861/-853 ; -870/-865 ; -1231/-1221.
5°) Molécule d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que sa séquence est sélectionnée dans le groupe constitué par : la séquence représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO :1, et la séquence représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO :2.
6°) Vecteur recombinant comprenant un insert constitué par une molécule d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 5.
7°) Cellule transformée par au moins une molécule d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 5.
8°) Cellule transformée selon la revendication 7, caractérisée en ce que ladite cellule est une cellule, de mammifère . 9°) Animal transgénique non-humain, caractérisé en ce que tout ou partie de ses cellules sont transformées par une molécule d' acide nucléique selon une quelconque des revendications 1 à 5.
10°) Animal transgénique selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un mammifère.
11°) Utilisation d'une molécule d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 pour l'obtention de médicaments.
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Kind code of ref document: A1 Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NO NZ PL PT RO RU SD SE SG SI SK SL TJ TM TR TT TZ UA UG US UZ VN YU ZA ZW |
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| AL | Designated countries for regional patents |
Kind code of ref document: A1 Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GW ML MR NE SN TD TG |
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| 121 | Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application | ||
| DFPE | Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101) | ||
| REG | Reference to national code |
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| WWP | Wipo information: published in national office |
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| WWE | Wipo information: entry into national phase |
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| WWW | Wipo information: withdrawn in national office |
Ref document number: 2001955410 Country of ref document: EP |
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| NENP | Non-entry into the national phase |
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