WO2004076482A1 - Facteur soluble secrete par les cellules endotheliales des vaisseaux sanguins - Google Patents

Facteur soluble secrete par les cellules endotheliales des vaisseaux sanguins Download PDF

Info

Publication number
WO2004076482A1
WO2004076482A1 PCT/FR2004/000355 FR2004000355W WO2004076482A1 WO 2004076482 A1 WO2004076482 A1 WO 2004076482A1 FR 2004000355 W FR2004000355 W FR 2004000355W WO 2004076482 A1 WO2004076482 A1 WO 2004076482A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
statin
sequence
cells
protein
seq
Prior art date
Application number
PCT/FR2004/000355
Other languages
English (en)
Inventor
Fabrice Soncin
Virginie Mattot
Original Assignee
Centre National De La Recherche Scientifique
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National De La Recherche Scientifique filed Critical Centre National De La Recherche Scientifique
Publication of WO2004076482A1 publication Critical patent/WO2004076482A1/fr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C07K14/4703—Inhibitors; Suppressors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
    • C07K2319/42—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation containing a HA(hemagglutinin)-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/60—Fusion polypeptide containing spectroscopic/fluorescent detection, e.g. green fluorescent protein [GFP]

Definitions

  • the present invention relates to a new soluble factor secreted by endothelial cells of blood vessels, capable of blocking the recruitment of perivascular cells of the smooth muscle type, and to its applications, in particular for the treatment of pathologies such as cancer, retinopathies , atherosclerosis and restenosis.
  • the angiogenesis process results in the formation of new vessels from the vascular system, in response to many angiogenic factors.
  • the capillaries in formation are essentially composed of endothelial cells and their stabilization, as well as their maturation in functional vessels, depend on recruitment and on the interaction with perivascular cells constituted by smooth muscle cells (CML) and pericytes (Carmeliet, Nat. Med., 2000, 6, 389-395).
  • endothelial cells produce chemotactic, growth and survival factors [PDGF (Platelet-Derived growth factor: Zerwes and al, J. Cell. Biol, 1987, 105, 2037-2041) and FGFs (Fibroblast Growth Factor s: Schweigerer et al., Nature, 1987, 325, 257-259) which recruit smooth muscle cells at the level of neo vessels -formed (Conway et al., Cardiovasc. Res., 2001, 49, 507-521).
  • PDGF Plate-Derived growth factor: Zerwes and al, J. Cell. Biol, 1987, 105, 2037-2041
  • FGFs Fibroblast Growth Factor s: Schweigerer et al., Nature, 1987, 325, 257-259
  • Perivascular cells produce growth factors and chemotactic factors for endothelial cells such as VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor: Ferrara et al, Growth factors, 1991, 5, 141-148) and FGF-2 (Winkles et al , PNAS, 1987, 84, 7124-7128), which participate in the initial formation and progression of the capillaries, and probably in the maturation of the capillaries.
  • Perivascular and endothelial cells also produce angiopoietin 1 and 2 (Davis et al., Cell, 1996, 87, 1161-1169; Maisonpierre et al., Science, 1997, 277, 55-60; Witzenbichler et al., J. Biol.
  • Perivascular cells also produce TGF- ⁇ (Transforming Growth Factor ⁇ ) which, after activation by cell contacts, inhibits the proliferation and migration of endothelial cells (Orlidge et al., J. Cell.
  • TGF- ⁇ (Bjorkerud et al., Arterioscler. Thromb., 1991, 11, 892-902)
  • PTEN tumor suppressor factor
  • sphingosine 1-phosphate Payne et al., FEBS Letter, 2002, 531, 54-57
  • Endothelial cells form a monolayer that lines the inner border of all blood vessels, in direct contact with the bloodstream. With the exception of certain places, such as the renal glomerulus, the adrenal cortex and the choroid plexus, the endothelium forms a tight and selective barrier between the blood and the underlying tissues.
  • proteins which are expressed specifically or almost specifically by endothelial cells represent markers capable of identifying these cells. These markers are involved in essential functions of endothelial cells such as proliferation, survival and maintenance of the integrity of the endothelium.
  • VEGF receptors include the VEGF receptors, Flt-1 (De Vries et al., Science, 1992, 255, 989-991; Shibuy et al., Oncogene, 1990, 5, 519-524) and flk-1 (Terman et al ., Biochem. Biophys. Res. Corn., 1992, 187, 1579-1586; Yamgushi et al, Development, 1993, 118, 489-498), Tie receptors (Partanen et al., Mol. Cell.
  • vezfl vascular endothelial zinc finger 1
  • mDBl homologous to the human ubiquitous transcription factor hDB 1
  • VE-statin a factor which is specifically expressed by endothelial cells and they have shown that VE-statin is a secreted protein which suppresses the recruitment of smooth muscle cells but does not of effect on their proliferation.
  • the sequences of the precursor and of the mature form of human VE-statin are identical to those of the potentially secreted protein, of unknown function, called ZNEU1 described in International PCT Application WO 98/57983; the sequences of the murine VE-statin are identical to those of the precursor and of the mature form, described respectively in PCT International Application WO 99/54437 and Application US 2002/028508 (protein T125) and International PCT Application WO 98/57983 (protein ZNEU1).
  • PCT International Applications WO 99/54437, 01/48192, 98/57983 and American Application US 2002/028508 describe potentially secreted proteins of approximately 275 amino acids, comprising a signal peptide of approximately 20 amino acids and two EGF type domains (approximately positions 105 to 135 and 136 to 177), and having homologies with receptors of the NOTCH4 family; these proteins correspond to mRNAs expressed in numerous tissues and the function of these proteins is unknown.
  • VE-statin is a soluble factor useful for: (i) blocking the recruitment of smooth muscle cells responsible for the stabilization of neo-formed blood vessels in pathologies linked to angiogenesis, such as cancer and retinopathies, and ( ii) block the formation of atherosclerotic plaques and restenosis associated with vascular surgery, which are caused by excessive recruitment of smooth muscle cells.
  • the inventors cloned the cDNA coding for human and murine VE-statin and isolated the VE-statin gene which is located, respectively on chromosome 9 in humans and on chromosome 2 in mice.
  • the inventors have also shown that the cDNA of 3681 bp described by Xiong et al.
  • the first located between positions 1 to 2329 corresponds to l CDNA coding for mDB 1 which is transcribed from a gene located on chromosome 11 of the mouse and not on chromosome 2 as described in Xiong et al.
  • the second located 135 bp downstream of the authentic polyA sequence of mDBl corresponds to an incorrect and non-functional VE-statin cDNA sequence generated from an mRNA which is transcribed from a gene located on chromosome 2 of the mouse.
  • the 3681 bp cDNA described in Xiong et al. allows the production of the active mDB1 protein but only of a truncated, inactive VE-statin protein and this, only in the event of an internal reinitiation of translation from the ATG in positions 2519-2521.
  • a subject of the present invention is therefore the use of a protein called VE-statin, selected from the group consisting of:
  • sequence SEQ ID NO: 1 corresponding to the precursor of murine VE-statin, - sequences having at least 70% identity or at least 85
  • % similarity preferably at least 80% identity or at least 90% similarity, and preferably at least 95% identity or at least 99% similarity with the entire sequence SEQ ID NO: 1 , for the preparation of a medicament intended to inhibit the recruitment of perivascular smooth muscle cells.
  • said sequence is chosen from:
  • sequence SEQ ID NO: 1 in particular the sequence SEQ ID NO: 2 (positions 21 to 275) , corresponding to mature murine VE-statin, and
  • said medicament is intended for the treatment of pathologies such as cancer, retinopathies, atherosclerosis and restenosis.
  • the protein as defined above represents a new soluble factor, secreted by the endothelial cells of the blood vessels, which factor hereinafter called VE-statin, is capable of blocking the recruitment of perivascular cells of the smooth muscle type; the gene coding for said VE-statin is hereinafter called VE-statin.
  • the protein as defined above includes any protein (natural, synthetic, semi-synthetic or recombinant) of any prokaryotic or eukaryotic organism, in particular of a human or non-human mammal, comprising or consisting of a amino acid sequence of a functional VE-statin protein. It notably includes natural proteins isolated from any prokaryotic or eukaryotic organism, as well as recombinant proteins produced in an appropriate expression system.
  • said protein is a eukaryotic protein, preferably a mammalian protein.
  • telomere By “functional” is meant a protein having normal biological activity, in this case an activity which inhibits the recruitment of perivascular cells of the smooth muscle type (or smooth muscle cells perivascular). This protein can include silent mutations inducing no substantial change in its activity and producing no phenotypic modification.
  • a functional VE-statin protein has the following properties:
  • the measurement of the inhibitory activity of the recruitment of perivascular cells of the smooth muscular type is carried out by the conventional techniques known in themselves in particular by the "wound test” (Got Kunststoff et al., J. Cell. Physiol. , 1979, 100, 563-578) or by the “Boyden chamber test” (TW Jungi, J. Immunol. Methods, 1978, 21, 373-382).
  • the protein as defined above includes the precursor of VE-statin (intracellular form) which has a signal peptide at its NH end, as well as the mature protein (form secreted in the extracellular medium), derived from this precursor by cleavage of the signal peptide, as well as by post-translational modifications.
  • the homology of a sequence with respect to the sequence SEQ ID NO: 1 is assessed with respect to a sequence of length equivalent to that of the sequence SEQ ID NO: 1 (approximately 275 amino acids) , that is to say that the homology is analyzed over the entire sequence SEQ ID NO: 1 and not only over a portion thereof and therefore, the percentage of residues which are identical or similar is determined on a number of about 275 amino acid residues.
  • the comparison of the sequence SEQ ID NO: 1 with the protein sequences available on the databases is carried out using an appropriate software such as BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ Gorf / bl2.html). More specifically:
  • sequence with respect to a reference sequence is assessed according to the percentage of amino acid residues which are identical, when the two sequences - each of approximately 275 amino acids - are aligned, so as to get the maximum correspondence between them.
  • a protein having an amino acid sequence having at least X% identity with a reference sequence is defined, in the present invention, as a protein whose sequence of approximately 275 amino acids, can include up to 100-X alterations per 100 amino acids of the reference sequence, while retaining the functional properties of said reference protein, in this case its activity inhibiting the recruitment of perivascular cells of the smooth muscle type.
  • alteration includes deletions, substitutions or consecutive or dispersed insertions of amino acids in the reference sequence. This definition applies, by analogy, to nucleic acid molecules.
  • the similarity of a sequence to a reference sequence is assessed according to the percentage of amino acid residues which are identical or which are different by conservative substitutions, when the two sequences - each of approximately 275 amino acids - are aligned so as to obtain the maximum correspondence between them.
  • conservative substitution is intended to mean the substitution of one amino acid with another which has similar chemical properties (size, charge or polarity), which generally does not modify the functional properties of the protein, in particular the occurrence of its activity inhibiting the recruitment of perivascular cells of the smooth muscle type.
  • X% similarity with a reference sequence is defined, in the present invention as a protein whose sequence of approximately 275 amino acids, can include up to 100-X non-conservative alterations per 100 amino acids of the reference sequence .
  • non-conservative alterations includes deletions, non-conservative substitutions or consecutive or dispersed insertions of amino acids in the reference sequence.
  • the present invention also relates to a medicament, characterized in that it comprises at least one molecule selected from the group consisting of: a) a protein as defined above, b) a nucleic acid molecule encoding for the protein defined in a), said nucleic acid molecule consisting of a cDNA or fragment of genomic DNA representing the VE-statin gene, and c) a recombinant vector comprising an insert consisting of the defined nucleic acid molecule in B).
  • a drug is useful for blocking the recruitment of smooth muscle cells responsible for the stabilization of neo-formed blood vessels in pathologies linked to angiogenesis, such as cancer and retinopathies, but also for blocking the formation of plaques. atherosclerosis and restenosis associated with vascular surgery, which are due to excessive recruitment of smooth muscle cells.
  • the medicament according to the invention is used by the enteral (oral, sublingual), parenteral or local route. It can be in the form of tablets, simple or coated, capsules, granules, syrup, suppositories, injections, ointments, creams, gels, aerosol, which are prepared according to the usual methods .
  • the molecules as defined above are associated with excipients usually used in pharmaceutical compositions, such as talc, gum arabic, lactose, starch, magnesium stearate, cocoa butter , aqueous vehicles or not, fatty substances of animal or vegetable origin, paraffinic derivatives, glycols, various wetting agents, dispersants or emulsifiers, preservatives.
  • excipients usually used in pharmaceutical compositions, such as talc, gum arabic, lactose, starch, magnesium stearate, cocoa butter , aqueous vehicles or not, fatty substances of animal or vegetable origin, paraffinic derivatives, glycols, various wetting agents, dispersants or emulsifiers, preservatives.
  • the useful dosage varies depending on the condition to be treated, the route and the rhythm of administration, as well as the nature and weight of the species to be treated (human or animal).
  • the present invention also relates to a protein, characterized in that it has a sequence selected from the group consisting of: the sequences corresponding respectively to positions 17 to 275, 18 to 275, 19 to 275, 20 to 275, 22 to 275, 23 to 275 and 24 to 275 of the sequence SEQ ID NO: 1, and
  • the present invention also relates to the use of a monoclonal or polyclonal antibody specifically recognizing the VE-statin, for diagnosing a genetic or acquired disease involving a dysfunction of said VE-statin, in particular of its function inhibiting the recruitment of muscle cells smooth perivascular.
  • a monoclonal or polyclonal antibody specifically recognizing the VE-statin for diagnosing a genetic or acquired disease involving a dysfunction of said VE-statin, in particular of its function inhibiting the recruitment of muscle cells smooth perivascular.
  • Such antibodies are used to determine the expression profile of the VE-statin protein in endothelial cells and to detect a possible alteration of this profile in a tissue or a biological sample.
  • antibodies are obtained by conventional methods, known in themselves, comprising in particular the immunization of an animal with VE-statin or one of its peptides, in order to make it produce antibodies directed against said protein or said peptide.
  • the present invention also relates to an isolated nucleic acid molecule, characterized in that it has a sequence selected from the group consisting of:
  • sequences SEQ ID NO: 5 and 6 which correspond to the two species of cDNA (VE-statin-a and VE-statin-b) coding for the protein VE-statin murine; these cDNA species which differ at the level of the first 169 base pairs of their 5 'untranslated sequence, code for the same protein of 275 amino acids,
  • the invention encompasses the sequences of the VE-statin gene alleles from any mammal, as well as the sequences of natural or of the VE-statin gene coding for a functional VE-statin protein as defined above.
  • the subject of the invention is also fragments of at least 8 bp of the nucleic acid molecules as defined above, characterized in that they are selected from the group consisting of:
  • the nucleic acid molecules according to the invention are obtained by conventional methods, known per se, by following standard protocols such as those described in Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, W ⁇ ley and son Inc , Library of Congress, USA). For example, they can be obtained by amplification of a nucleic sequence by PCR or RT-PCR, by screening of genomic DNA libraries by hybridization with a homologous probe, or else by total or partial chemical synthesis.
  • the fragments as defined above can in particular be used as probes or as primers for detecting / amplifying nucleic acid molecules (mRNA or genomic DNA) encoding a VE-statin protein as defined above or else as probes for isolate the VE-statin gene from other species or alleles of this gene, in particular by screening a genomic DNA or cDNA library.
  • mRNA or genomic DNA nucleic acid molecules
  • nucleic acid molecules also make it possible either to determine the transcription profile of the VE-statin gene and a possible alteration of this profile in a tissue or a biological sample, or to highlight the VE-statin gene, allelic variants of this gene and a possible functional alteration of this VE-statin gene (substantial change in the inhibitory activity of perivascular cells of the smooth muscle type) resulting from a mutation (insertion, deletion or substitution) of one or more nucleotides at the level of at least one exon of said gene or of a chromosomal translocation involving said gene.
  • these different nucleic acid molecules make it possible to diagnose a pathological state or a genetic disease involving a dysfunction of the VE-statin, in particular of its inhibitory function for the recruitment of smooth perivascular muscle cells, and to screen for substances capable of modulating (activating or inhibiting) transcription of the VE-statin gene.
  • the detection of a mutation in the VE-statin gene is carried out by conventional techniques which are known per se, for example: (i) by amplification of a region of said VE-statin gene capable of containing a mutation, then detection of said mutation by sequencing or by digestion with a suitable restriction enzyme, of the PCR product obtained, or else (ii) by hybridization with a labeled probe specific for a region of said VE-statin gene capable of containing a mutation, then direct detection of mismatches and / or digestion with an appropriate restriction enzyme.
  • the present invention also relates to a recombinant vector, characterized in that it comprises an insert selected from the group consisting of the nucleic acid molecules encoding a VE-statin protein and their fragments as defined above.
  • said recombinant vector is an expression vector in which said nucleic acid molecule or one of its fragments is placed under the control of regulatory elements for appropriate transcription and translation.
  • vectors are constructed and introduced into host cells by conventional recombinant DNA and genetic engineering methods, which are known per se.
  • Numerous vectors into which a nucleic acid molecule of interest can be inserted in order to introduce and maintain it in a eukaryotic or prokaryotic host cell are known in themselves; the choice of an appropriate vector depends on the envisaged use for this vector (for example replication of the sequence of interest, expression of this sequence, maintenance of the sequence in extracliromosomal form or else integration into the chromosomal material of the host ), as well as the nature of the host cell.
  • the present invention also relates to prokyote or eukaryotic cells transformed by a recombinant vector as defined above.
  • the recombinant vectors and the transformed cells as defined above are useful in particular for the production of the VE-statin proteins according to the invention or in gene replacement therapy.
  • the present invention also relates to a non-human transgenic mammal, characterized in that it contains cells transformed with at least one nucleic acid molecule as defined above.
  • Non-human transgenic mammals and transformed cells as defined above are useful as tools for studying the VE-statin gene and the product of this gene.
  • the present invention also relates to a method of screening for an agonist or an antagonist of VE-statin, characterized in that it comprises at least the following steps: a) bringing into contact of perivascular smooth muscle cells , with a VE-statin protein as defined above, and a test substance, b) measuring by any suitable means the effect of said test substance on the migration of said smooth muscle cells, and c) selection substances capable of increasing or decreasing the migration of said smooth muscle cells, compared with the control (VE-statin alone).
  • the invention also comprises other arrangements which will emerge from the description which follows, which refers to examples of the use of the VE-statin gene and of its products (VE-statin cDNAs a and VE-statin-b and VE-statin protein) according to the present invention as well as in Table III summarizing the sequences of the Application: Table III: List of sequences
  • SEQ ID NO: 31 fragment of 789 bp from the intron lb of the murine gene
  • FIG. 1 illustrates the demonstration of the chimeric nature of the cDNA coding for vezfl (mDBl) described by Xiong et al. (above):
  • FIG. 1A the sequence coding for vezfl (mDBl), represented by a rectangle, is followed by a long 3 'sequence described by Xiong et al., as an untranslated sequence.
  • the inventors have demonstrated the presence in this sequence, of an internal polyA sequence 2302-2336 corresponding to the authentic polyA sequence of the cDNA coding for vezfl (mDBl), and of an EcoRJ site.
  • the arrows indicate the position of the different pairs of primers (pairs 1 to 4) used for the amplification by RT-PCR.
  • FIG. 1B amplification of the vezfl cDNA fragments by RT-PCR.
  • the total RNA of mouse embryo El 0.5 (0.28 ⁇ g) was analyzed by RT-PCR using pairs of primers 1 to 4.
  • Amplification of fragments overlapping the poly A2302- sequence 2336 / EcoRI is not possible (tracks 2 and 3 corresponding to pairs of primers 2 and 3), while the amplification of regions located on either side of this sequence results in the production of products of the size expected (tracks 1 and 4 corresponding to pairs of primers 1 and 4).
  • FIG. 2 illustrates the structure of the VE-statin cDNA: the complete sequence of the murine VE-statin-a cDNA is presented (SEQ ID NO: 5, 1371 bp) and the almost complete sequence of the VE-statin cDNA -b murine, which differs from that of VE-statin-a cDNA at the level of the first 169 base pairs, is shown in italics.
  • the coding sequence shown in capital letters codes for a protein of 275 amino acids (SEQ ID NO: 1), corresponding to an estimated molecular weight of 29.7 kDa.
  • FIG. 3 illustrates the sequence of the VE-statin gene: the upper part corresponds to the schematic representation of the structure of the human and murine VE-statin genes. Numbers and horizontal lines represent exons. Exons la and lb result from alternative transcription initiation sites and code for the transcripts VE-statin-a and VE-statin-b, respectively. The translation initiation ATG is located in exon 3 and the stop codon in exon 10.
  • the two genes have short, repeated, repeated sequences of the SINE (Short Interspersed Nuclear Element) type.
  • the polyadenylation signals are ATAATAAAGC and ACAATAAAAA, respectively in the murine and human genes.
  • the lower part illustrates the chromosomal localization of the human and murine genes by hybridization (FISH) using probes specific for the VE-statin gene.
  • FIG. 4 illustrates the analysis of the expression of the VE-statin transcripts:
  • FIG. 4A Northern blot analysis of the expression of VE-statin-a (top panel) and VE-statin-b (bottom panel) in different tissues, in mice.
  • VE-statin transcripts (1.6 kb, indicated by an arrow) are expressed at higher levels in the kidney, lungs and heart). The numbers indicate the size of the markers (kbp). No signal was detected at the expected position for the 4.2 kb vezfl transcript described in Xiong et al., Supra.
  • FIG. 4B analysis by RT-PCR of the expression of the VE-statin (total), VE-statin-a and VE-statin-b transcripts, by comparison with the controls (dbl and gadph) in the mouse embryo El 0.5, in the heart and in different cell lines.
  • the expression of VE-statin is detected in the tissues of mice and in endothelial cells but not in fibroblasts whereas dbl is expressed in all tissues and all cells.
  • VE-statin-a has 5 transcription initiation sites covering a region of approximately 60 bp (indicated by arrows), while VE-statin-b has a unique initiation site. The numbers on the left indicate the position of the markers.
  • FIG. 5 illustrates the in situ expression profile of the VE-statin and dbl genes: - Upper panel: analysis by in situ hybridization of gene expression: VE-statin (A, D, G), vegfr-2 (B, E, H) and dbl (C, F, I), in the mouse embryo E7.5 (A to C) and E10.5 (D to I).
  • stage E7.5 the VE-statin gene (A) and the vegfr-2 gene (B) are expressed in the primitive blood islets and in the yolk sac (indicated by arrows).
  • the vegfr-2 gene is also expressed in the intra-embryonic mesoderm (B, star).
  • dbl The expression of dbl is not detected at this stage of embryonic development (C).
  • the VE-statin (D) and vegfr-2 (E) genes are expressed similarly, in the forming blood vessels.
  • a larger magnification of the caudal region of the embryo shows that the expression profiles of the VE-statin (G) and vegfr-2 (H) genes in the endothelium (dorsal aorta (arrow)) and vessels of the hind limbs (arrowheads) are superimposable.
  • dbl is expressed ubiquitously in the embryo, with a higher level of expression in the neural epithelium (F, arrow).
  • the expression of dbl is never detected in the endothelium (I).
  • the scale represents 100 ⁇ m in A to C and G to I and 1 mm in D to F.
  • VE-statin gene analysis of the expression of the VE-statin gene in the embryo El 0.5 (J to L), El 3.5 (M to P), the newborn 3 days old (Q) and the adult (R).
  • the expression of the VE-statin gene is detected in the arteries of the 3 rd and 4 th branchial arches (J, respectively arrow and arrowhead); in the umbilical artery vein (K) and in the precursors of endothelial cells of the cephalic mesenchyme (L).
  • the VE-statin gene is expressed in the endothelial cells of the endocardium (M), in the primary pulmonary vascular network (N), in the blood vessels surrounding the ribs (O) and in the vascular network associated with the retinal pigment layer (P).
  • M endothelial cells
  • N primary pulmonary vascular network
  • O blood vessels surrounding the ribs
  • P retinal pigment layer
  • the expression of the VE-statin gene is detected in the renal artery (Q, arrow), the renal vein (arrowhead), in the glomerular capillary network (Q, star) and in the peritubular capillaries ( Q, arrow open).
  • the VE- gene statin is strongly expressed in the endothelial cells of the blood vessels of the mesometric decidue (R, arrow), a: atrium, cm: cephalic mesenchyme, gl: glomerulus, Li: liver, Rv: renal vein, Lu: lungs, md: decidue of the mesometer, n: neural epithelium, Ra: renal artery, rb: ribs, tu: renal tubules, na: umbilical artery, uv: umbilical vein, v: ventricle.
  • the scale represents 100 ⁇ m.
  • FIG. 6 illustrates the analysis of the expression, localization and secretion of VE-statin:
  • VE-statin-a and VE-statin-b were translated in vitro to confirm the presence of a translation initiation site common to the two transcripts; a single form of VE-statin, corresponding to the expected molecular weight of 30 kDa, is produced from the two transcripts, ctrl: control; a: VE-statin-a; b: VE-statin-b,
  • FIG. 6B the expression of VE-statin (transcribed and protein) was analyzed respectively by RT-PCR, by comparison with that of GAPDH (first two lines) and by Western-Blot (last line), from 3T3 cells transfected with the plasmid pcDNA3-VE-statin-HA (+) or the control plasmid pcDNA3 (-).
  • the arrow indicates the specific expression of VE-statin in cells transfected with the vector pcDNA3-VE-statin-HA,
  • FIG. 6C the cellular localization of the VE-statin was analyzed by direct immunofluorescence or by co-localization, in 3T3 cells transfected respectively by the plasmids pcDNA3-VE-statin-GFP (VE-stat-GFP, at left) and pcDNA3-VE-statin-HA (VE-stat-HA + PDI, right); 24 h after transfection, the cells were stained with Hoechst dye and observed directly under fluorescence microscopy (GFP, left) or else previously incubated with primary anti-HA antibodies and anti-isomerase with disulfide bond (specific marker endoplasmic reticulum), then with secondary antibodies labeled with fluorescein isothiocyanate (FITC) or rhodamine respectively (right).
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • FIG. 6D 3T3 fibroblasts were transfected with the plasmid pcDNA3-VE-statin-HA (VE-stat) or the control plasmid pcDNA3 (-) or else non-transfected (mock). The next day, the culture medium was replaced with medium alone (left panel) or medium containing brefeldine A (short) or monensin (Mon), (right panel). The cells were cultured for an additional 6 h then the VE-statin secreted into the extracellular medium was immunoprecipitated from the filtered culture supernatant, then detected by Western blotting. The arrow indicates the secreted VE-statin; ns: non-specific band.
  • FIG. 7A shows that VE-statin has no effect on the proliferation of smooth muscle cells (AoSMC) seeded at low density and cultured for 8 days in control medium (- • -) or medium containing VE-statin (- • -), supplemented with PDGF-BB (50 ng / ml); cells were counted daily and the medium was changed every other day.
  • AoSMC smooth muscle cells
  • FIGS 7B and 7C show that VE-statin inhibits the migration of smooth muscle cells (AoSMC); the AoSMC cells are cultured to confluence then the cell mats are damaged with razor blades and the cells are cultured for 2 additional days in the presence of: medium containing VE-statin with or without PDGF-BB (80 ng / ml; VE-statin; VE-statin + PDGF) or control medium (Ctrl; Ctrl + PDGF).
  • B observation of cells under a phase contrast microscope: the black bar indicates the position of the lesion.
  • C the number of cells having migrated corresponding to the mean ⁇ standard deviation, was determined on 3 to 7 separate fields.
  • Example 1 Materials and methods
  • the oligonucleotides are synthesized by GENSET and GENOSYS and the RT and PCR reagents are supplied by PERKIN ELMER.
  • Polyadenylation sites are predicted using the Hamming clustering method for the prediction of TATA and Poly-A sites (http://www.itba.mi.cnr.it/webgene).
  • the SINE ALU / MIR sequences were located using the Repeat Master internet server (07/16/00 version: http://ftp.genome.washington.edu/cgi-bin/RepeatMasker).
  • the protein domains were predicted using SMART software (v3.3 dated December 13, 2001: http://smart.ernbl-heidelberg.de).
  • L929 (murine fibroblast), H5V (murine cardiac endothelioma), 3T3 (murine fibroblast), MBE (murine brain capillary), MAE (endothelial cells murine aortics), EOMA (murine endothelioma), 1G11 (murine pulmonary endothelial cell line) and AoSMC (primary culture of human aortic smooth muscle cells, CLONETICS).
  • the cells are cultured at 37 ° C., in a humid atmosphere (5% CO 2 -95% air), under the conditions recommended by the supplier. 2) RT-PCR
  • RNA is extracted using the TRIzol® reagent (LIFE TECHNOLOGIES). Reverse transcription reactions are carried out using 1 ⁇ g of RNA, using random hexameric oligonucleotides, according to the manufacturer's instructions (PERKIN ELMER). The PCR reactions are carried out in PCR II buffer (PERKIN ELMER) containing the reverse transcription products, 150 ⁇ M of each of the NTPs and 1.25 IU of AmpliTaq Gold®, in a final volume of 50 ⁇ l.
  • PCR II buffer PERKIN ELMER
  • the amplification was carried out for 35 cycles comprising: a denaturation step at 94 ° for 30 s, a hybridization step at 53 ° C for 30 s and an elongation step at 72 ° C for 1 min.
  • PCR amplifications were carried out under conditions similar to the previous ones, using the pairs of primers, the MgCl 2 concentration, the hybridization temperature and the following number of cycles: - Primers mDBl (2 mM, 53.4 ° C, 35 cycles):
  • the PCR reactions are carried out using a thermal cycler (Gene Amp PCR System 2400 or 9600, PERKIN ELMER).
  • the amplification products are separated by agarose gel electrophoresis (1%) and viewed in UV light, after staining with ethidium bromide. 3) Cloning
  • Total E10.5 mouse embryo RNA was back transcribed and incubated with 50 ng of each of the primers ACA AAA AGA AGA AGG CTA CC (SEQ ID NO: 15) and CAG CGG CAG TGT CCT GGG CG ( SEQ ID NO: 16), in a High Fidelity PCR master mix (BOEHRTNGER).
  • the amplification was achieved seed under the following conditions: 94 ° C for 2 min, then 35 cycles of 94 ° C-30 s, 54 ° C-30 s and 72 ° C-1 min, followed by a final step of elongation at 72 ° C for 7 min.
  • the 416 bp product was purified, cloned into the vector PCR II-TOPO (INVITROGEN), sequenced and used as a probe to screen the cDNA libraries of mouse embryo and ovary (respectively 10 and 1.6 x 10 phages).
  • the complete VE-statin-a and VE-statin-b cDNA was then cloned into the expression vector pcDNA3 (STRATAGENE) and used to generate different probes specific for VE-statin for analyzes by Northern blot and hybridization. in situ.
  • the vector pGFP-VE-statin was constructed by cloning the sequence coding for VE-statin between the HindIII and BamHI sites of the vector pEGFP-N1 (BD-CLONTECH).
  • the expression vector pHA-VE-statin was constructed by cloning the sequence coding for the epitope of the hemagglutinin of the influenza virus (HA), in phase with the sequence coding for VE-statin, between the HindIII sites and BamHI of the pcDNA3 expression vector (STRATAGENE). 4) 5'RACE and isolation of genomic fragments.
  • the 5'-RACE analysis was carried out on normal human ovary and E7.5 mouse embryo cDNA, using the CLONTECH cDNA Marathon-ready kit).
  • the amplifications were carried out using the High Fidelity PCR master mix (BOEHRINGER) and GENEAMP thermal cyclers, according to the manufacturer's instructions.
  • the VE-statin gene was isolated, both by standard phage library hybridization (1 to 1.8 x 10 6 clones), using cDNA and genomic DNA probes specific for the VE-statin gene, and by amplification of fragments by PCR using the murine Genome Walker kit (CLONTECH) and different pairs of specific primers.
  • the PCR fragments thus obtained were subcloned into the vector PCR II-TOPO and sequenced using a DNA sequencer (Abiprism 377, APPLIED SYSTEM). 5) RNase protection test
  • Two specific genomic fragments of around 850 to 900 bp comprising 150 to 175 bp of exon la or lb were amplified from a 17 kbp genomic fragment of VE-statin, using the High Fidelity mixture PCR master mix R (ROCHE).
  • the amplified fragments were cloned into the vector pCR-TOPO and specific VE-statin probes a or b were synthesized using respectively: the primers TCC CAC AGG GAC AGG GAC AGG GGA TGG ACA GAG CC (SEQ ID NO: 21) and ATG CTG CGC AGG CCT GGC TGA GGC CAC CTC TGC TG (SEQ ID NO: 22) and Riboprobe Gemini System III kit (Promega), according to the manufacturer's instructions.
  • the RNase protection test was carried out using 5 ⁇ g of total RNA from E10.5 mouse embryo, H5V endothelial cells or yeast tRNA (control), using the RPA III kit. (AMBION). The reactions were analyzed by gel electrophoresis of 6% polyacrylamide-8M then the gels were dried and autoradiographed. 6) Northern-blolting
  • the membranes for Northern Blot prepared from different human or murine tissues (CLONTECH), were incubated at 68 ° C. for one hour with probes specific for human or murine VE-statin-a or with an antisense probe.
  • VE-statin-b labeled with 32 P in an ExpressHyb R hybridization solution (CLONTECH). The membranes were then washed at 50 ° C. in 2 ⁇ SSC containing 0.05% SDS, dried and then autoradiographed. 7) Mapping by in situ hybridization (FISH)
  • a plasmid comprising a 17 kbp fragment of mouse genomic DNA was used as a specific murine probe.
  • BAC DNA and plasmid DNA were isolated according to conventional techniques, following standard protocols (QIAGEN). One ⁇ g of DNA was labeled, using the FITC-Nick translation kit, according to the manufacturer's recommendations (VYSIS).
  • the pair of primers GCT GTC TGG TGG TGC CTA TG (SEQ ID NO: 23) and TTA TTA TGA CAA AGA TGG AG (SEQ ID NO: 24) was used to screen the G3 set of Stanford radiation hybrid .
  • the reactions were carried out in PCR buffer containing 3 mM of MgCl 2 , 5 nmoles of each of the primers, 30 ng of DNA template and 0.5 IU of AmpliTaq Gold polymerase® (APPLIED BIOSYSTEM), using a Gen Amp Amp System 9700 device (APPLIED BIOSYSTEM).
  • the amplification was carried out under the following conditions: 35 cycles comprising 95 ° C-15 s, 55 ° C-19 s and 72 ° C-30 s, then the products were analyzed by agarose gel electrophoresis (2 %) and staining with ethidium bromide. A 163 bp PCR product was detected.
  • In situ hybridization was carried out using the following probes: a 1.3 kbp fragment of VE Statin cDNA cloned in pcDNA3 (INVITROGEN), a 1 kbp fragment of cDNA of murine VEGFR-2 cloned into pGEM-T-easy or an 800 bp fragment of murine DB1 cDNA cloned into PCRII-TOPO.
  • the sense and antisense probes were synthesized from linearized plasmids, using 350 ⁇ M of digoxigenin-labeled NTPs (ROCHE), as described in Wilkinson et al., Methods Enzymol., 1993, 225, 361 -373.
  • VE-statin expression vectors named pcDNA3-VE-statin-HA and pEGFP-VE-statin, containing the cDNA of VE-statin in phase, respectively with an epitope of the hemagglutinin of the influenza virus and the fluorescent protein GFP, under the control of the CMV promoter, were constructed as described in Example 1.3.
  • 3T3 cells (15,000 cells / cm) were seeded in 78.5 cm 2 culture flasks and then transfected the next day with 5 ⁇ g of recombinant vector pcDN A3 -VE-statin-HA or pcDNA3-VE-statin-GFP, or vector pcDNA3 (control), using the EXGEN 500® reagent (EUROMEDEX), according to the manufacturer's recommendations. After 6 h of incubation, the medium was replaced with serum-free culture medium and 24 h later, the culture supernatant containing the secreted VE-statin and the control medium were collected.
  • EUROMEDEX EXGEN 500® reagent
  • Cells (35,000 3T3 and H5V cells) are seeded on 14 mm diameter glass slides; 24 h later, the cells are transfected with 50 ng of one of the following plasmids: pcDNA3 -VE-statin-HA, pEGFP-VE-statin, pcDNA3 or pEGFP-N1 (controls).
  • the cells are washed with PBS, fixed, for 20 min at 4 ° C., in PBS containing 4% of para-formaldehyde, then they are stored in PBS (experiments of co-localization with cells transfected by pcDN A3 -VE-statin-HA) or they are stained for 3 min with Hoechst reagent (1 ⁇ g / ml), rinsed, then the slides are mounted before being analyzed (direct fluorescence experiments with cells transfected with pEGFP-VE-statin or pcDNA3).
  • the cells stored in PBS are incubated for 10 min in PBS containing 50 mM NH C1, permeabilized for 4 min in PBS containing 0.1% Triton X-100, blocked for 10 min in PBS containing 10% goat serum, then incubated for 1 h at room temperature, with a disulfide-linked rabbit anti-isomerase antibody (1/250, STRESSGEN) and an anti-HA mouse monoclonal antibody (1/200, BABCO), in PBS containing 10% of goat serum. The slides were then incubated for 1 h at room temperature with secondary antibodies coupled to rhodamine or to fluorescein tisothiocyanate (1/500, JACKSON IMMUNORESEARCH LABORATORIES).
  • the slides are mounted in extended antifade® medium (MOLECULAR PROBES) and observed using a fluorescence microscope (Axioplan 2, ZEISS). Images are recorded using video recording equipment (PRINCETON INSTRUMENTS INC.)
  • 3T3 cells (15,000 cells / cm 2 ) were seeded in 78.5 cm 2 culture flasks and then transfected the next day with 5 ⁇ g of recombinant vector pcDN A3 -VE-statin-HA or pEGFP-VE-statin, or pcDNA3 vector well (control), using the EXGEN 500® reagent (EUROMEDEX), according to the manufacturer's recommendations. After 6 hours of incubation, the medium was replaced by complete culture medium. 24 h later, the medium was changed again and the cells were incubated for 5 h in the presence of brefeldine A (GolgiPlug®, PHARMTNGEN) OR monensin (GolgiStop®, PHARMINGEN).
  • brefeldine A GolgiPlug®, PHARMTNGEN
  • monensin GolgiStop®, PHARMINGEN
  • the culture supernatant (5 ml) was then collected, filtered (0.22 ⁇ m) and added with: sodium deoxycholate (0.5%), Ip York CA630 (1%), SDS (0.1%), inhibitors proteases (Complhang®, ROCHE MOLECULAR BIOCHEMICALS) and anti-HA polyclonal antibody (50 ⁇ l, EUROGENTEC), then the mixture thus obtained was incubated overnight at 4 ° C, with rotary shaking. 50 ⁇ l of protein G-Sepharose (Protein-G Sepharose Fast Flow beads, AMERSHAM PHARMACIA) were then added, then the incubation was continued under the same conditions, for 1 h.
  • the beads were washed 4 times with PBS buffer and lysed in RIPA buffer containing protease inhibitors.
  • the samples were analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis in the presence of SDS (12% SDS-PAGE) followed by a Western blot, using a monoclonal anti-HA antibody (1/500, EUROGENTEC ). VE-Statin was then revealed by luminescence, according to the manufacturer's instructions (Aurora®, ICN).
  • VE-statin The effect of VE-statin on cell proliferation was tested under the following conditions: AoSMC cells were seeded in dishes culture (4 cm, 35,000 cells / cm) and cultured for 24 h, then the medium was replaced by control medium or medium containing VE-statin, prepared as described above (example 1.10), supplemented with PDGF (PDGF-BB: homomer of B chains; 50 ng / ml). Each day, the cells were harvested by trypsinization and then counted using a hemacytometer (Coulter®, COULTRONICS).
  • PDGF-BB homomer of B chains
  • VE-statin the effect of VE-statin on cell migration was tested by the "wound test", under the following conditions: AoSMC cells (50,000 cells) were seeded in culture dishes (28 cm) and grown to confluence, then the cell mats were damaged with a razor blade and rinsed 2 times with medium alone. The following media were then added to the cultures: control medium with or without PDGF-BB (80 ng / ml) and medium containing VE-statin, with or without PDGF-BB (80 ng / ml). After 48 h of incubation, the cells were rinsed with PBS, fixed for 20 min at 4 ° C with PBS containing 4% para-formaldehyde, rinsed again with PBS and observed under the microscope.
  • Example 2 Characterization of Human and Murine VE-statin cDNAs ( Figures 1 and 2) 1) Characterization of Human and Murine VE-statin cDNAs ( Figures 1 and 2)
  • the 1.35 kbp cDNA was cloned from a mouse ovary library and from two embryonic cDNA libraries, using an El 0 mouse embryo cDNA probe, 5 corresponding either to the 3 ′ region of the 3681 bp vezf-1 cDNA (positions 2480-2894, VE-statin probe), or to the coding sequence of mDB1 of the same cDNA (positions 1478-2294, control probe) .
  • VE-statin-a SEQ ID NO: 5 and FIG. 2.
  • VE-statin-a 5'-RACE analysis from an El i mouse embryo library confirmed that the 1.37 kbp sequence would correspond to a complete cDNA, called VE-statin-a, and to identify a second VE-statin cDNA (VE-statin-b 5 1.4 kbp: SEQ ID NO: 6 and Figure 2) which differs from VE-statin-a cDNA at the level of the first 169 base pairs.
  • VE-statin-a In humans, two transcripts VE-statin-a and VE-statin-b have also been isolated.
  • the complete VE-statin-b transcript (SEQ ID NO: 4) was isolated by 5 'RACE, from the partial sequence (GENBANK NM H6215); the product obtained contains an additional 236 bp 5 ′ of the sequence deposited in GENBANK.
  • Comparison of the human sequence with the murine sequences shows that the human VE-statin-b cDNA has 73% identity with the VE-statin cDNA -b murine and 59% with the VE-statin-a murine cDNA.
  • the VE-statin-a cDNA comprises EST BI 910383. 2)
  • the 3681 bp cDNA described in Xiong et al. has a translation stop signal at positions 1594-1596 of the sequence encoding DB1 and a C to T mutation at position 2602. In addition, it possesses neither the first 236 bp of the
  • VE-statin-a or the first 258 bp of VE-statin-b nor a base G between the bases in positions 2870 and 2871 and a base G between the bases in positions 2902-2903.
  • VE-statin is present downstream of the stop codon TGA in positions 2933-2935: mutation of G in C in position 3043, mutation of G in C in position 3045, mutation of GG in TT in positions 3073-3074, mutation of GG in CC in positions 3076-3077, presence of an intronic sequence in positions 3245-3410, absence of bases 1008-1085 of VE-statin-a, corresponding to bases 1030-1107 of VE-statin-b, absence of a base C between the bases in positions 3448-3449, absence of a base C between the bases in positions 3465-3466, absence of a CT sequence between the bases in positions 3469 - 3470, addition of GA bases between the bases in positions 3495-3496, absence of a G base between the bases in positions 3525-3526, and C to T mutation of the base in position 3572.
  • Example 3 Structure of the gene VE-statin ( Figure 3, Tables I and II)
  • the murine gene was isolated from two independent libraries of mouse genomic DNA, subcloned and sequenced. It has a size of more than 10 kbp and includes 11 exons and 11 introns (FIG. 3 and Table II), including two alternative exons (example and lb), corresponding respectively to the transcripts VE-statin-a and VE-statin-b. Exon 9 can be spliced alternatively, as some cDNA clones show variations in this exon.
  • the structure of the human gene has an organization similar to that of the murine gene (Figure 3), including most of the intron-exon junctions and the presence of short dispersed nuclear elements.
  • Hybrid radiation mapping confirmed the position of the human gene in the distal region of the long arm of chromosome 9, near the marker WI-17482, at the position of 151.488 Mb (with reference to the sequence of the UDV database http://bioinformatics.weizman.ac.il/udb/ and Santa Cruz: http://genome.ucsc.edu).
  • the human dbl gene was located on chromosome 17 (Genbank accession number NT 010651) and the murine dbl gene on chromosome 11, further confirming that the dbl and VE-statin genes are separate genes.
  • VE-statin-a transcript had several transcription initiation sites, the longest transcript covering approximately the 75 bases upstream of the first identified base, the initiation sites are distributed over approximately 60 bp ( Figure 4C). This variant is expressed at much lower levels than the VE-statin-b transcript, both in endothelial cells and in the embryo ( Figure 4C).
  • VE-statin-b transcript presents a unique transcription site, probably due to the presence of a CATAAAAAGC box, located 42 base pairs upstream of the first base of the transcript (FIG. 4C).
  • EXAMPLE 4 Demonstration of the Specific Expression of VE-Statin in Endothelial Cells (FIGS. 4 and 5)
  • VE-statin transcribed VE-statin-a and VE-statin-b
  • EOMA endothelial cells
  • fibroblasts 353 and L 929
  • VE-statin-a and VE-statin-b transcripts were also analyzed by Northern-Blot in adult tissues, using probes corresponding to the 5 ′ region specific for each cDNA. A major 1.6 kb transcript is recognized by each of the probes ( Figure 4A); this size corresponds to that of the VE-statin cDNAs.
  • the expression of VE-statin-a and -b is detected at high levels in the heart, lungs and kidneys and under these conditions, it is not detectable in other tissues ( Figure 4A).
  • the expression profile of the VE-statin gene was also analyzed by in situ hybridization in the mouse embryo and compared with that of the dbl gene and that of the specific endothelial factor vegfr-2, used to control mesodermal expression. early then specific endothelial. At E7.5, the expression of the VE-statin gene is detected exclusively in the primitive blood islets in which the first endothelial cells differentiate.
  • vegfr-2 is detected both in the primitive blood islets and in the intra-embryonic mesoderm (Breier and al., Blood, 1996, 87, 630-641; Yamaguchi et al., Development, 1993, 118, 489-498).
  • E10.5 expression of VE-statin gene is superimposed on that of VEGFR-2 in endothelial vein and umbilical artery cells, arteries of 3 rd and 4 -th branchial arches, aorta dorsal, and cephalic mesenchyme (Figure 5).
  • dbl As shown for the human gene, expression of dbl is ubiquitous at this stage of embryonic development in mice, with higher expression in the neural epithelium ( Figure 5) but is never detected in the vessels blood in formation. At 13.5 days post-conception, the expression profile of the VE-statin gene is still restricted to endothelial cells, as shown by its expression in the facial mesenchyme, the brain, liver, endocardium, lungs and the peri-costal vascular network, or in the pigment layer of the retina (Figure 5).
  • the expression profile of the VE-statin gene has also been studied after birth, in the kidney, since the blood vessels still develop and remodel in this organ. In newborns aged 3 days, the expression of the VE-statin gene is strictly limited to the endothelium. Interestingly, the VE-statin gene is expressed in both veins and arteries ( Figure 5), indicating that its expression is not restricted to the arterial or venous vascular network at this stage. The expression of the VE-statin gene is also detected in the peri-lobular and fenestrated glomerular capillaries and in the arched and interlobular arteries, indicating that, in this organ, its expression is not associated with a particular type of vessel. . In pregnant females, the expression of the VE-statin gene has also been detected in the blood vessels of the deciduous tissue of the uterus mesometer. Interestingly, expression of the vegfr-2 gene has been detected at much lower levels in this organ.
  • the initiation codon for the translation of the VE-statin protein has been located at codons AUG 28 ⁇ -283 and AUG 309-311 , respectively of the transcript VE-statin-a murine and human, due to the identification of following elements: - the presence of a minimal sequence of initiation of translation
  • Human and murine sequences have 78% identity and 87% similarity between them. Research in the databases of domains similar to those of other proteins has revealed the presence of: a cleavable signal peptide of 19 and 20 amino acids located at the NH 2 -terminal end of the human and murine sequences respectively and two domains similar to the domains of epidermal growth factor (EGF-like domains) characterized by the conservation of the essential cysteine residues of said EGF-like domains (FIG. 2).
  • EGF-like domains epidermal growth factor
  • Example 6 Analysis of the Expression, Location and Secretion of VE-statin (FIGS. 6B, 6C, 6D)
  • the analyzes were carried out using cells transfected with the recombinant vectors pEGFP-VE-statin and pcDNA3-VE -statin-HA, which overexpress the VE-statin in the form of a fusion protein with GFP or the HA epitope of the hemagglutinin of the influenza virus (FIG. 6B).
  • VE-statin prevents migration of GFP into the nucleus ( Figure 6C, left panel) and co-immunofluorescence experiments, respectively with an anti-vinculin and anti-cytochrome C antibody, show that VE-statin does not is neither associated with the cytoskeleton, nor with the mitochondria.
  • VE-statin is present in the endoplasmic reticulum, as shown by its co-localization with the disulfide bond isomerase which is a specific marker of this compartment ( Figure 6C, right panel).
  • VE-statin human and murine
  • VE-statin is not detectable in immunoprecipitated material, indicating that it is not exposed on the surface of the cells.
  • VE-statin The presence of VE-statin in the extracellular medium was analyzed from cells transfected under the same conditions, then the culture supernatant was harvested 48 h after transfection and analyzed by immunoprecipitation. Under these conditions, the VE-statin is secreted into the extracellular medium (FIG. 6D, left panel), this secretion is partially or strongly inhibited in the presence of inhibitors of the secretion, respectively monensin and brefeldine A.
  • FIG. 6 The results illustrated in FIG. 6 (6B, 6C and 6D) demonstrate that the VE-statin is produced in cells, in the form of a soluble factor secreted in the extracellular medium according to the conventional route of protein secretion.
  • the apparent molecular weight of the secreted VE-statin is greater than the apparent molecular weight predicted from its amino acid composition, which indicates that the VE-statin undergoes post-translational changes during secretion.
  • Example 7 Analysis of the Effect of VE-statin on the Migration and Proliferation of Smooth Muscle Cells (FIG.
  • VE-statin the effect of VE-statin on the proliferation of smooth muscle cells was analyzed on AoSMC cells seeded at low density and cultured for 8 days in control medium or in medium containing VE-statin. , in the presence or absence of PDFG-BB; PDGF-BB being added to maintain stimulation of proliferation.
  • the results show that VE-statin has no effect on the growth of AoSMC cells, in the presence or in the absence of PDGF-BB, as demonstrated by the perfect superposition of the growth curves of the treated and untreated cells.
  • VE-statin Figure 7A.
  • the effect of VE-statin on the migration of smooth muscle cells was analyzed using the “wound test”, on confluent cultures of AoSMC cells.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Utilisation d'un facteur soluble sécrété par les cellules endothéliales des vaisseaux sanguins, dénommé VE-statine pour bloquer le recrutement des cellules périvasculaires du type musculaire lisse, dans le traitement de pathologies telles que le cancer, les rétinopathies, l'athérosclérose et la resténose.

Description

FACTEUR SOLUBLE SECRETE PAR LES CELLULES ENDOTHELIALES DES VAISSEAUX SANGUINS
La présente invention est relative à un nouveau facteur soluble sécrété par les cellules endothéliales des vaisseaux sanguins, capable de bloquer le recrutement des cellules périvasculaires du type musculaire lisse, et à ses applications, notamment pour le traitement de pathologies telles que le cancer, les retinopathies, l'athérosclérose et la resténose. Le processus d'angiogénèse aboutit à la formation de nouveaux vaisseaux à partir du système vasculaire, en réponse à de nombreux facteurs angio- géniques. Les capillaires en formation sont composés essentiellement de cellules endothéliales et leur stabilisation, ainsi que leur maturation en vaisseaux fonctionnels dépendent du recrutement et de l'interaction avec des cellules périvasculaires consti- tuées par les cellules musculaires lisses (CML) et les péricytes (Carmeliet, Nat. Med., 2000, 6, 389-395). Le dialogue moléculaire complexe qui s'instaure pendant ce processus est essentiel pour le maintien ou Pélagage des capillaires néo-formés. Plusieurs molécules produites par chacun des deux types cellulaires (cellules endothéliales et cellules périvasculaires), qui participent à ces interactions ont été identifiées : les cellules endothéliales produisent des facteurs chimiotactiques, de croissance et de survie [PDGF (Platelet-Derived growth factor : Zerwes et al, J. Cell. Biol, 1987, 105, 2037-2041) et FGFs (Fïbroblast Growth Factor s : Schweigerer et al., Nature, 1987, 325, 257-259) qui recrutent les cellules musculaires lisses au niveau des vaisseaux néo-formés (Conway et al., Cardiovasc. Res., 2001, 49, 507-521). Les cellules périvasculaires produisent des facteurs de croissance et des facteurs chimiotactiques pour les cellules endothéliales tels que le VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor : Ferrara et al, Growth factors, 1991, 5, 141-148) et le FGF-2 (Winkles et al, P.N.A.S., 1987, 84, 7124-7128), qui participent à la formation initiale et à la progression des capillaires, et probablement à la maturation des capillaires. Les cellules périvasculaires et endothéliales produisent également de l'angiopoïétine 1 et 2 (Davis et al., Cell, 1996, 87, 1161-1169 ; Maisonpierre et al., Science, 1997, 277, 55-60 ; Witzenbichler et al., J. Biol. Chem., 1998, 273, 18514-18521), qui inter- agissent avec le récepteur spécifique des cellules endothéliales Tie-2 et jouent des rôles opposés dans la cohésion et la survie des cellules endothéliales (Maisonpierre et al., précité), en fonction de la disponibilité en VEGF (Lobov et al, P.N.A.S., 2002, 99, 11205-11210). Les cellules périvasculaires produisent aussi du TGF-β (Transforming Growth Factor β) qui, après activation par des contacts cellulaires, inhibe la prolifération et la migration des cellules endothéliales (Orlidge et al., J. Cell. Biol, 1987, 105, 1455-1462 ; Sacchi et al., Oncogene, 1991, 6, 2149-2154 ; Sato et al., J. Cell. Biol, 1989, 109, 309-315 ; Sato et al., J. Cell. Biol, 1990, 11, 757-763), induit la différenciation des cellules musculaires lisses et la sécrétion de la matrice extracellulaire, stabilisant ainsi les vaisseaux sanguins (Dickson et al., Development, 1995, 121, 1845-1854 ; Li et al, Science, 1999, 284, 1534-1537). Les contacts directs entre les cellules périvasculaires et les cellules endothéliales, et avec la matrice extracellulaire participent également à ce dialogue.
Ainsi, la formation d'un arbre vasculaire localement stable et fonc- tionnel dépend de l'ensemble de ces interactions complexes et la perturbation de ces échanges a des conséquences pathologiques majeures, par exemple :
- dans l'athérosclérose, le recrutement et la prolifération des cellules musculaires lisses et un endothélium endommagé sont les facteurs clés de la lésion initiale (Behrendt et al., Am. J. Cardiol., 2002, 90, 40L-48L), - dans les tumeurs solides, la formation d'un réseau vasculaire irrégulier et peu structuré est en partie le résultat d'un manque de coordination entre ces cellules (Carmeliet, Nature, 2000, 407, 249-257).
Parmi les molécules qui ont été identifiées, plusieurs facteurs de croissance et facteurs chimiotactiques sont capables d'induire le recrutement initial et la prolifération des cellules musculaires lisses autour des capillaires (Berk, Physiol. Rev., 2001, 81, 999-1030). D'autres facteurs répriment à la fois la prolifération et le recrutement des cellules musculaires lisses périvasculaires, notamment le TGF-β (Bjorkerud et al., Arterioscler. Thromb., 1991, 11, 892-902), le facteur suppresseur de tumeur PTEN (Huang et al, Arterioscl. Thromb. Vase. Biol., 2002, 22, 745-751) et la sphingosine 1-phosphate (Payne et al., FEBS Letter, 2002, 531, 54-57). En revanche, les facteurs qui diminuent et à l'extrême répriment spécifiquement le recrutement des cellules musculaires lisses lorsque les vaisseaux sanguins atteignent leur maturité n'ont pas été identifiés.
Les cellules endothéliales forment une monocouche qui tapisse la bordure interne de tous les vaisseaux sanguins, en contact direct avec la circulation sanguine. A l'exception de certains endroits, comme le glomérule rénal, les cortico- surrénales et le plexus choroïde, l'endothélium forme une barrière serrée et sélective, entre le sang et les tissus sous-jacents. Plusieurs protéines qui sont exprimées spécifiquement ou quasi-spécifiquement par les cellules endothéliales représentent des marqueurs capables d'identifier ces cellules. Ces marqueurs sont impliqués dans des fonctions essentielles des cellules endothéliales comme la prolifération, la survie et le maintien de l'intégrité de l'endothélium. Ils incluent les récepteurs du VEGF, Flt-1 (De Vries et al., Science, 1992, 255, 989-991 ; Shibuy et al., Oncogene, 1990, 5, 519- 524) et flk-1 (Terman et al., Biochem. Biophys. Res. Corn., 1992, 187, 1579-1586 ; Yamgushi et al, Development, 1993, 118, 489-498), les récepteurs Tie (Partanen et al., Mol. Cell. Biol., 1992, 12, 1698-1707 ; Sato et al, P.N.A.S., 1993, 90, 9355- 9358 ; Schnϋrch et al., Development, 1993, 119, 957-968) ou la molécule d'adhérence VE-cadhérine (Vascular Endothelial-cadherin : Breier et al., Blood, 1996, 87, 630- 641 ; Lampugnani et al., J. Cell. Biol, 1992, 118, 1511-1522). Un facteur de fonction inconnue dénommé vezfl (vascular endothelial zinc finger 1) ou mDBl, homologue du facteur de transcription ubiquitaire humain hDB 1 , a également été décrit comme exprimé spécifiquement dans les cellules endothéliales chez la souris (Xiong et al, Developmental Biology, 1999, 206, 123-141). Parmi ces marqueurs des cellules endothéliales, aucun n'est sécrété ou n'agit sur les cellules musculaires lisses.
De façon surprenante, les Inventeurs ont isolé un facteur, dénommé VE-statine, qui est spécifiquement exprimé par les cellules endothéliales et ils ont montré que la VE-statine est une protéine sécrétée qui réprime le recrutement des cellules musculaires lisses mais n'a pas d'effet sur leur prolifération. Les séquences du précurseur et de la forme mature de la VE-statine humaine sont identiques à celles de la protéine potentiellement sécrétée, de fonction inconnue, dénommée ZNEU1 décrite dans la Demande Internationale PCT WO 98/57983 ; les séquences de la VE-statine murine sont identiques à celles du précurseur et de la forme mature, décrites respectivement dans la Demande Internationale PCT WO 99/54437 et la Demande américaine US 2002/028508 (protéine T125) et la Demande Internationale PCT WO 98/57983 (protéine ZNEU1).
En effet, les Demandes Internationales PCT WO 99/54437, 01/48192, 98/57983 et la Demande américaine US 2002/028508 décrivent des protéines potentiellement sécrétées d'environ 275 acides aminés, comprenant un peptide signal d'environ 20 acides aminés et deux domaines du type EGF (environ des positions 105 à l35 et l36 à 177), et présentant des homologies avec les récepteurs de la famille NOTCH4 ; ces protéines correspondent à des ARNm exprimés dans de nombreux tissus et la fonction de ces protéines est inconnue. La VE-statine est un facteur soluble utile pour : (i) bloquer le recrutement des cellules musculaires lisses responsables de la stabilisation des vaisseaux sanguins néo-formés dans les pathologies liées à l'angiogénèse, telles que le cancer et les retinopathies, et (ii) bloquer la formation des plaques d'athérosclérose et la resténose associée à la chirurgie vasculaire, qui sont dues à un recrutement excessif de cellules musculaires lisses.
Les Inventeurs ont clone l'ADNc codant pour la VE-statine humaine et murine et isolé le gène VE-statine qui est localisé, respectivement sur le chromosome 9 chez l'Homme et sur le chromosome 2 chez la souris. Les Inventeurs ont également montré que l'ADNc de 3681 pb décrit par Xiong et al. ne correspondait pas à un seul ADNc comprenant une longue région 3' non-codante, mais résultait d'un artefact de clonage ayant généré la concaténation de deux ADNc correspondant à deux ARNm distincts, le premier situé entre les positions 1 à 2329 correspond à l'ADNc codant pour mDB 1 qui est transcrit à partir d'un gène localisé sur le chromosome 11 de la souris et non sur le chromosome 2 comme décrit dans Xiong et al. et le second situé 135 pb en aval de la séquence polyA authentique de mDBl (positions 2302 à 2329), correspond à une séquence d'ADNc de la VE-statine incorrecte et non- fonctionnelle, générée à partir d'un ARNm qui est transcrit à partir d'un gène localisé sur le chromosome 2 de la souris.
Contrairement à l'ADNc codant pour la VE-statine qui est fonctionnel et permet l'expression de la protéine VE-statine active, d'environ 275 acides aminés, qui est sécrétée dans le milieu extracellulaire et inhibe le recrutement des cellules musculaires lisses périvasculaires, l'ADNc de 3681 pb décrit dans Xiong et al. permet la production de la protéine mDBl active mais uniquement d'une protéine VE-statine tronquée, inactive et ce, uniquement dans l'éventualité d'une réinitiation interne de la traduction à partir de l'ATG en positions 2519-2521.
Ainsi, le profil d'expression spécifique des cellules endothéliales décrit dans Xiong et al., correspond à celui de la VE-statine et non à celui de vezfl/ mDB 1 qui est ubiquitaire, étant donné que Xiong et al. ont utilisé pour l'hybridation in situ, une sonde issue de cet ADNc de 3681 pb s'hybridant à la fois dans la région codante de mDBl et dans la région 3' adjacente décrite comme non-codante mais correspondant en fait à une séquence d'ADNc de la VE-statine incorrecte et non- fonctionnelle, comme précisé ci-dessus.
La présente invention a en conséquence pour objet l'utilisation d'une protéine dénommé VE-statine, sélectionnée dans le groupe constitué par :
- la séquence SEQ ID NO: 1 correspondant au précurseur de la VE- statine murine, - les séquences présentant au moins 70 % d'identité ou au moins 85
% de similarité, de préférence au moins 80 % d'identité ou au moins 90 % de similarité, et de manière préférée au moins 95 % d'identité ou au moins 99 % de similarité avec la totalité de la séquence SEQ ID NO: 1, pour la préparation d'un médicament destiné à inhiber le recrutement des cellules musculaires lisses périvasculaires.
Selon un mode réalisation avantageux de ladite utilisation, ladite séquence est choisie parmi :
- la séquence SEQ ID NO : 42 présentant le numéro d'accès NCBI NP_057299, correspondant au précurseur de la VE-statine humaine, - les séquences correspondant respectivement aux positions 17 à 275,
18 à 275, 19 à 275, 20 à 275, 21 à 275, 22 à 275, 23 à 275 et 24 à 275 de la séquence SEQ ID NO : 1, notamment la séquence SEQ ID NO : 2 (positions 21 à 275), correspondant à la VE-statine murine mature, et
- les séquences correspondant respectivement aux positions 16 à 273, 17 à 273, 18 à 273, 19 à 273, 21 à 273, 22 à 273 et 23 à 273 de la séquence SEQ ID NO : 42, notamment la séquence SEQ ID NO : 3 (positions 20 à 273), correspondant à la VE-statine humaine mature. Selon un autre mode de réalisation avantageux de ladite utilisation, ledit médicament est destiné au traitement de pathologies telles que le cancer, les retinopathies, l'athérosclérose et la resténose.
La protéine telle que définie ci-dessus représente un nouveau facteur soluble, sécrété par les cellules endothéliales des vaisseaux sanguins, lequel facteur dénommé ci-après VE-statine, est capable de bloquer le recrutement des cellules périvasculaires du type musculaire lisse ; le gène codant pour ladite VE-statine est dénommé ci-après VE-statine.
La protéine telle que définie ci-dessus inclut toute protéine (natu- relie, synthétique, semi-synthétique ou recombinante) de n'importe quel organisme procaryote ou eucaryote, notamment d'un mammifère humain ou non-humain, comprenant ou consistant en une séquence d'acides aminés d'une protéine VE-statine fonctionnelle. Elle inclut notamment les protéines naturelles isolées chez n'importe quel organisme procaryote ou eucaryote, ainsi que les protéines recombinantes produites dans un système d'expression approprié.
De préférence, ladite protéine est une protéine eucaryote, de manière préférée une protéine de mammifère.
On entend par "fonctionnelle", une protéine possédant une activité biologique normale, en l'occurrence une activité inhibitrice du recrutement des cellules périvasculaires du type musculaire lisse (ou cellules musculaires lisses périvasculaires). Cette protéine peut comprendre des mutations silencieuses n'induisant aucun changement substantiel dans son activité et ne produisant aucune modification phénotypique.
Une protéine VE-statine fonctionnelle présente les propriétés suivantes :
- elle est produite sous la forme d'un précurseur intracellulaire d'environ 275 acides aminés possédant (i) un peptide signal clivable d'environ 20 acides aminés, situé à son extrémité NH2, et (ii) 2 domaines du type de ceux du facteur de croissance épidermique (domaines "EGF-like" ou Epidermal growth factor-like) caractérisés par la présence de résidus de cystéine et d'un résidu de glycine conservés tels que prédits par les logiciels SMART (v3.3 du 13 décembre 2001 : http://smart.embl-heidelberg.de) ou PROSITE (http ://www. expasy. org/pro site/. version 17.37 du 1-02-2003), lesdits domaines étant situés respectivement des positions 107 à 136 et 141 à 178, en référence à la séquence murine SEQ ID NO: 1 (figure
2),
- elle est produite dans les cellules de mammifères, sous la forme d'une protéine soluble d'environ 30kDa, sécrétée dans le milieu extracellulaire ; cette forme mature dérive du précurseur par clivage du peptide signal, ainsi que par des modifications post-traductionnelles,
- elle est exprimée de façon constitutive, spécifiquement dans les cellules endothéliales de tous les vaisseaux sanguins des précurseurs embryonnaires précoces aux cellules matures chez l'adulte, indépendamment de leur nature (artère ou veine), de leur taille ou de leur origine tissulaire,
- elle inhibe le recrutement des cellules périvasculaires du type musculaire lisse.
La mesure de l'activité inhibitrice du recrutement des cellules péri- vasculaires du type musculaire lisse est réalisée par les techniques classiques connues en elles-mêmes notamment par le "test de la blessure" (Gotlieb et al., J. Cell. Physiol., 1979, 100, 563-578) ou par le "test de la chambre de Boyden" (TW Jungi, J. Immunol. Methods, 1978, 21, 373-382).
La protéine telle que définie ci-dessus inclut le précurseur de la VE- statine (forme intracellulaire) qui possède un peptide signal à son extrémité NH , ainsi que la protéine mature (forme sécrétée dans le milieu extracellulaire), dérivée de ce précurseur par clivage du peptide signal, ainsi que par des modifications post-traductionnelles.
Conformément à l'invention, l'homologie d'une séquence par rapport à la séquence SEQ ID NO:l s'apprécie par rapport à une séquence de longueur équivalente à celle de la séquence SEQ ID NO: 1 (environ 275 acides aminés), c'est à dire que l'homologie est analysée sur la totalité de la séquence SEQ ID NO: 1 et non uniquement sur une portion de celle-ci et par conséquent, le pourcentage de résidus qui sont identiques ou similaires est déterminé sur un nombre d'environ 275 résidus d'acides aminés. La comparaison de la séquence SEQ ID NO : 1 avec les séquences de protéines disponibles sur les bases de données est réalisée à l'aide d'un logiciel approprié tel que BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html). De manière plus précise :
L'identité d'une séquence par rapport à une séquence de référence s'apprécie en fonction du pourcentage de résidus d'acides aminés qui sont identiques, lorsque les deux séquences-chacune d'environ 275 acides aminés-sont alignées, de manière à obtenir le maximum de correspondance entre elles.
Une protéine ayant une séquence en acides aminés ayant au moins X % d'identité avec une séquence de référence est définie, dans la présente invention, comme une protéine dont la séquence d'environ 275 acides aminés, peut inclure jusqu'à 100-X altérations pour 100 acides aminés de la séquence de référence, tout en conservant les propriétés fonctionnelles de ladite protéine de référence, en l'occurrence son activité inhibitrice du recrutement des cellules périvasculaires du type musculaire lisse. Au sens de la présente invention, le terme altération inclut les délétions, les substitutions ou les insertions consécutives ou dispersées d'acides aminés dans la séquence de référence. Cette définition s'applique, par analogie, aux molécules d'acide nucléique.
La similarité d'une séquence par rapport à une séquence de référence s'apprécie en fonction du pourcentage de résidus d'acides aminés qui sont identiques ou qui sont différents par des substitutions conservatives, lorsque les deux séquences - chacune d'environ 275 acides aminés - sont alignées de manière à obtenir le maximum de correspondance entre elles. Au sens de la présente invention, on entend par substitution conservative, la substitution d'un acide aminé par un autre qui présente des propriétés chimiques similaires (taille, charge ou polarité), qui généralement ne modifie pas les propriétés fonctionnelles de la protéine, en l'occurrence son activité inhibitrice du recrutement des cellules périvasculaires du type musculaire lisse. Une protéine ayant une séquence en acides aminés ayant au moins
X % de similarité avec une séquence de référence est définie, dans la présente invention comme une protéine dont la séquence d'environ 275 acides aminés, peut inclure jusqu'à 100-X altérations non-conservatives pour 100 acides aminés de la séquence de référence. Au sens de la présente invention, le terme altérations non-conservatives inclut les délétions, les substitutions non-conservatives ou les insertions consécutives ou dispersées d'acides aminés dans la séquence de référence. La présente invention a, également, pour objet un médicament, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une molécule sélectionnée dans le groupe constitué par : a) une protéine telle que définie ci-dessus, b) une molécule d'acide nucléique codant pour la protéine définie en a), ladite molécule d'acide nucléique étant constituée par un ADNc ou fragment d'ADN génomique représentant le gène VE-statine, et c) un vecteur recombinant comprenant un insert constitué par la molécule d'acide nucléique définie en b). Un tel médicament est utile pour bloquer le recrutement des cellules musculaires lisses responsables de la stabilisation des vaisseaux sanguins néo-formés dans les pathologies liées à l'angiogénèse, telles que le cancer et les retinopathies, mais également pour bloquer la formation des plaques d'athérosclérose et la resténose associée à la chirurgie vasculaire, qui sont dues à un recrutement excessif de cellules musculaires lisses.
Le médicament selon l'invention est utilisé par voie entérale (orale, sublinguale), parentérale ou locale. Il peut se présenter sous la forme de comprimés, simples ou dragéifiés, de gélules, de granules, de sirop, de suppositoires, de préparations injectables, de pommades, de crèmes, de gels, d'aérosol, lesquels sont préparés selon les méthodes usuelles.
Dans ces formes galéniques, les molécules telles que définies ci- dessus sont associées à des excipients habituellement employés dans des compositions pharmaceutiques, tels que le talc, la gomme arabique, le lactose, l'amidon, le stéarate de magnésium, le beurre de cacao, les véhicules aqueux ou non, les corps gras d'ori- gine animale ou végétale, les dérivés paraffiniques, les glycols, les divers agents mouillants, dispersants ou émulsifiants, les conservateurs.
La posologie utile varie en fonction de l'affection à traiter, de la voie et du rythme d'administration, ainsi que de la nature et du poids de l'espèce à traiter (humaine ou animale). La présente invention a également pour objet une protéine, caractérisée en ce qu'elle présente une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par : - les séquences correspondant respectivement aux positions 17 à 275, 18 à 275, 19 à 275, 20 à 275, 22 à 275, 23 à 275 et 24 à 275 de la séquence SEQ ID NO : 1, et
- les séquences correspondant respectivement aux positions 16 à 273, 17 à 273, 18 à 273, 19 à 273, 21 à 273, 22 à 273 et 23 à 273 de la séquence SEQ ID
NO : 42.
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un anticorps monoclonal ou polyclonal reconnaissant spécifiquement la VE-statine, pour diagnostiquer une maladie génétique ou acquise impliquant un dysfonctionnement de ladite VE-statine, notamment de sa fonction inhibitrice du recrutement des cellules musculaires lisses périvasculaires. De tels anticorps sont utilisés pour déterminer le profil d'expression de la protéine VE-statine dans les cellules endothéliales et détecter une éventuelle altération de ce profil dans un tissu ou un échantillon biologique. .
Ces anticorps sont obtenus par les méthodes classiques, connues en elles-mêmes, comprenant notamment l'immunisation d'un animal avec la VE-statine ou l'un de ses peptides, afin de lui faire produire des anticorps dirigés contre ladite protéine ou ledit peptide.
La présente invention a également pour objet une molécule d'acide nucléique isolée, caractérisée en ce qu'elle présente une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par :
- la séquence SEQ ID NO: 4 (VE-statine-b) représentant l'ADNc codant pour la protéine VE-statine humaine de 273 acides aminés,
- les séquences SEQ ID NO: 5 et 6 qui correspondent aux deux espèces d'ADNc (VE-statine-a et VE-statine-b) codant pour la protéine VE-statine murine ; ces espèces d'ADNc qui diffèrent au niveau des 169 premières paires de bases de leur séquence 5' non-traduite, codent pour la même protéine de 275 acides aminés,
- la séquence située entre les positions 85512 et 98730 de la séquence présentant le numéro d'accès AL590226 dans la base de données GENBANK, laquelle séquence qui correspond au gène humain, est localisée dans la région distale du bras long du chromosome 9 (région 9q34.3-qter, à 151,488 Mb, près du marqueur WI- 17482) et présente une organisation exon-intron comprenant 11 exons et 11 introns et incluant des exons 1 alternatifs (exon-la et exon-lb) correspondant aux transcrits VE-statine-a et VE-statine-b (Tableau I),
Tableau I : Organisation exon-intron du gène VE-statine humain
Figure imgf000012_0001
- la séquence située entre les positions 4060576 et 4072108 de la séquence présentant le numéro d'accès Mm2_WIFeb01_25 dans la base de données GENBANK, laquelle séquence qui correspond au gène murin, est localisée sur le chromosome 2 (2B) et présente une organisation exon-intron similaire à celle du gène humain (Tableau II),
Tableau II : Organisation exon-intron du gène VE-statine murin
Figure imgf000012_0002
- les séquences complémentaires des précédentes, sens ou anti-sens. L'invention englobe, les séquences des allèles du gène VE-statine issues de n'importe quel mammifère, ainsi que les séquences des mutants naturels ou artificiels du gène VE-statine codant pour une protéine VE-statine fonctionnelle telle que définie ci-dessus.
L'invention a également pour objet des fragments d'au moins 8 pb des molécules d'acides nucléiques telles que définies ci-dessus, caractérisés en ce qu'ils sont sélectionnés dans le groupe constitué par :
- les amorces de séquence SEQ ID NO: 7 à 30, et
- le fragment de 789 pb de l'intron lb du gène VE-statine murin (SEQ ID NO: 31).
Les molécules d'acide nucléique selon l'invention sont obtenues par les méthodes classiques, connues en elles-mêmes, en suivant les protocoles standards tels que ceux décrits dans Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL,2000, Wïley and son Inc, Library of Congress, USA). Par exemple, elles peuvent être obtenues par amplification d'une séquence nucléique par PCR ou RT- PCR, par criblage de banques d'ADN génomique par hybridation avec une sonde homologue, ou bien par synthèse chimique totale ou partielle.
Les fragments tels que définis ci-dessus peuvent notamment être utilisés comme sondes ou comme amorces pour détecter/amplifier des molécules d'acide nucléique (ARNm ou ADN génomique) codant une protéine VE-statine telle que définie ci-dessus ou bien comme sondes pour isoler le gène VE-statine d'autres espèces ou des allèles de ce gène, notamment par criblage d'une banque d'ADN génomique ou d'ADNc.
Ces différentes molécules d'acides nucléiques permettent également, soit de déterminer le profil de transcription du gène VE-statine et une éventuelle altération de ce profil dans un tissu ou un échantillon biologique, soit de mettre en évi- dence le gène VE-statine, des variants alléliques de ce gène et une éventuelle altération fonctionnelle de ce gène VE-statine (changement substantiel dans l'activité inhibitrice des cellules périvasculaires du type musculaire lisse) résultant d'une mutation (insertion, délétion ou substitution) d'un ou plusieurs nucléotides au niveau d'au moins un exon dudit gène ou d'une translocation chromosomique impliquant ledit gène. Par voie de conséquence, ces différentes molécules d'acides nucléiques permettent de diagnostiquer un état pathologique ou une maladie génétique impliquant un dysfonctionnement de la VE-statine, notamment de sa fonction inhibitrice du recrutement des cellules musculaires lisses périvasculaires, et de cribler des substances capables de moduler (activer ou inhiber) la transcription du gène VE-statine.
La détection d'une mutation dans le gène VE-statine est réalisée par les techniques classiques qui sont connues en elles mêmes, par exemple : (i) par ampli- fication d'une région dudit gène VE-statine susceptible de contenir une mutation, puis détection de ladite mutation par séquençage ou par digestion par une enzyme de restriction appropriée, du produit de PCR obtenu, ou bien (ii) par hybridation avec une sonde marquée spécifique d'une région dudit gène VE-statine susceptible de contenir une mutation, puis détection directe des mésappariements et/ou digestion par une enzyme de restriction appropriée.
La présente invention a également pour objet un vecteur recombinant, caractérisé en ce qu'il comprend un insert sélectionné dans le groupe constitué par les molécules d'acides nucléiques codant une protéine VE-statine et leurs fragments tels que définis ci-dessus. De préférence, ledit vecteur recombinant est un vecteur d'expression dans lequel ladite molécule d'acide nucléique ou l'un de ses fragments sont placés sous le contrôle d'éléments régulateurs de la transcription et de la traduction appropriés.
Ces vecteurs sont construits et introduits dans des cellules hôtes par les méthodes classiques d'ADN recombinant et de génie génétique, qui sont connues en elles-mêmes. De nombreux vecteurs où l'on peut insérer une molécule d'acide nucléique d'intérêt afin de l'introduire et de la maintenir dans une cellule hôte eucaryote ou procaryote, sont connus en eux-mêmes ; le choix d'un vecteur approprié dépend de l'utilisation envisagée pour ce vecteur (par exemple réplication de la séquence d'intérêt, expression de cette séquence, maintien de la séquence sous forme extracliromosomique ou bien intégration dans le matériel chromosomique de l'hôte), ainsi que de la nature de la cellule hôte.
La présente invention a également pour objet des cellules proca- îyotes ou eucaryotes transformées par un vecteur recombinant tel que défini ci-dessus. Les vecteurs recombinants et les cellules transformées tels que défi- nis ci-dessus, sont utiles notamment pour la production des protéines VE-statine selon l'invention ou en thérapie génique substitutive. La présente invention a également pour objet un mammifère transgénique non-humain, caractérisé en ce qu'il contient des cellules transformées par au moins une molécule d'acide nucléique telle que définie ci-dessus.
Les mammifères transgéniques non-humains et les cellules trans- formées tels que définis ci-dessus, sont utiles comme outils pour l'étude du gène VE- statine et du produit de ce gène.
La présente invention a également pour objet une méthode de criblage d'un agoniste ou d'un antagoniste de la VE-statine, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins les étapes suivantes : a) la mise en contact de cellules musculaires lisses périvasculaires, avec une protéine VE-statine telle que définie ci-dessus, et une substance à tester, b) la mesure par tout moyen approprié de l'effet de ladite substance à tester sur la migration desdites cellules musculaires lisses, et c) la sélection des substances capables d'augmenter ou de diminuer la migration desdites cellules musculaires lisses, par rapport au contrôle (VE-statine seule).
L'étude de l'effet sur la migration des cellules musculaires lisses périvasculaires est réalisée, soit par mesure directe de la migration par les techniques classiques connues en elles-mêmes notamment par le "test de la blessure" (Gotleb et al., précité), par le "test de la chambre de Boyden" (TW Jungi, précité) ou bien à partir d'expiants de vaisseaux sanguins cultivés ex-vivo sur collagène (Villaschi et al, Am J Pathol., 1993, 143, 181-190), soit par des mesures indirectes, notamment par analyse de l'activation du facteur Rac, par exemple par détection de Rac (Immunofluores- cence) ou de la polymérisation locale de l'actine, au niveau du front de migration cellulaire.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du gène VE-statine et de ses produits (ADNcs VE-statine- a et VE-statine-b et protéine VE-statine) selon la présente invention ainsi qu'au Tableau III résumant les séquences de la Demande : Tableau III : Liste des séquences
Numéro Séquence d'identification
SEQ ID NO: 1 Protéine VE-statine murine (précurseur)
SEQ ID NO: 2 Protéine VE-statine murine (mature)
SEQ ID NO: 3 Protéine VE-statine humaine (mature)
SEQ ID NO: 4 ADNc VE-statine-b humain
SEQ ID NO: 5 ADNc VE-statine-a murin
SEQ ID NO: 6 ADNc VE-statine-b murin
SEQ ID NO: 7 à 30 amorces VE-statine
SEQ ID NO: 31 fragment de 789 pb de l'intron lb du gène murin
SEQ ID NO: 32 à 41 autre amorces utilisées dans les exemples
SEQ ID NO: 42 Protéine VE-statine humaine (précurseur : numéro d'accession NCBI NP_057299 ) et aux dessins annexés dans lesquels :
- la figure 1 illustre la démonstration de la nature chimérique de l'ADNc codant pour vezfl (mDBl) décrit par Xiong et al. (précité) :
- figure 1A : la séquence codant pour vezfl (mDBl), représentée par un rectangle, est suivie d'une longue séquence 3' décrite par Xiong et al., comme une séquence non- traduite. De façon inattendue, les inventeurs ont mis en évidence la présence dans cette séquence, d'une séquence polyA interne 2302-2336 correspondant à la séquence polyA authentique de l'ADNc codant pour vezfl (mDBl), et d'un site EcoRJ. Les flèches indiquent la position des différents couples d'amorces (couples 1 à 4) utilisées pour l'amplification par RT-PCR.
- figure 1B : amplification des fragments de l'ADNc vezfl par RT-PCR. L'ARN total d'embryon de souris El 0,5 (0,28 μg) a été analysé par RT-PCR à l'aide des couples d'amorces 1 à 4. L'amplification de fragments chevauchants la séquence poly A2302- 2336/EcoRI n'est pas possible (pistes 2 et 3 correspondant aux couples d'amorces 2 et 3), alors que l'amplification de régions situées de part et d'autre de cette séquence résulte en la production de produits de la taille attendue (pistes 1 et 4 correspondant aux couples d'amorces 1 et 4).
- la figure 2 illustre la structure des ADNc VE-statine : la séquence complète de l'ADNc VE-statine-a murin est présentée (SEQ ID NO: 5, 1371 pb) et la séquence quasi complète de l'ADNc VE-statine-b murin, qui diffère de celle de l'ADNc VE-statine-a au niveau des 169 premières paires de bases, est représentée en italique. La séquence codante représentée en capitales code pour une protéine de 275 acides aminés (SEQ ID NO: 1), correspondant à un poids moléculaire estimé de 29,7 kDa. La séquence minimale de Kozak est encadrée, le site de clivage du peptide signal est indiqué par une flèche, les séquences des 2 domaines EGF-like sont soulignées et les résidus de cystéine et de glycine conservés sont indiqués en gras. - la figure 3 illustre la séquence du gène VE-statine : la partie supérieure correspond à la représentation schématique de la structure des gènes VE-statine humains et murins. Les nombres et les lignes horizontales représentent les exons. Les exons la et lb résultent de sites d'initiation de la transcription alternatifs et codent respectivement pour les transcrits VE-statine-a et VE-statine-b. L'ATG d'initiation de la traduction est situé dans l'exon 3 et le codon stop dans l'exon 10. Les deux gènes possèdent de courtes séquences dispersées répétées du type SINE (Short Interspersed Nuclear Elément). Les signaux de polyadénylation sont ATAATAAAGC et ACAATAAAAA, respectivement dans les gènes murin et humain. La partie inférieure illustre la localisation chromosomique des gènes humain et murin par hybridation (FISH) à l'aide de sondes spécifiques du gène VE-statine.
- la figure 4 illustre l'analyse de l'expression des transcrits VE-statine :
- figure 4A : analyse en Northern-blot de l'expression de la VE-statine-a (panneau du haut) et de la VE-statine-b (panneau du bas) dans différents tissus, chez la souris. Les transcrits VE-statine (1,6 kb, indiqués par une flèche) sont exprimés à des niveaux plus élevés dans le rein, les poumons et le cœur). Les nombres indiquent la taille des marqueurs (kpb). Aucun signal n'a été détecté à la position attendue pour le transcrit vezfl de 4,2 kb décrit dans Xiong et al., précité.
- figure 4B : analyse par RT-PCR de l'expression des transcrits VE-statine (totaux), VE-statine-a et VE-statine-b, par comparaison avec les contrôles (dbl et gadph) chez l'embryon de souris El 0,5, dans le cœur et dans différentes lignées cellulaires. L'expression de la VE-statine est détectée dans les tissus de souris et dans les cellules endothéliales mais pas dans les fibroblastes alors que dbl est exprimé dans tous les tissus et toutes les cellules.
- figure 4C : analyse par un test de protection à la RNase des transcrits VE-statine-a et VE-statine-b, à partir d'ARNt (Contrôle : Ctrl), d'ARN d'embryon de souris E10,5 ou d'ARN de cellules endothéliales (H5V). La VE-statine-a possède 5 sites d'initiation de la transcription couvrant une région d'environ 60 pb (indiqués par des flèches), alors que la VE-statine-b possède un site d'initiation unique. Les nombres sur la gauche indiquent la position des marqueurs.
- la figure 5 illustre le profil d'expression in situ des gènes VE- statine et dbl : - Panneau supérieur : analyse par hybridation in situ de l'expression des gènes : VE- statine (A, D, G), vegfr-2 (B, E, H) et dbl (C, F, I), chez l'embryon de souris E7,5 (A à C) et E10,5 (D à I). Au stade E7,5, le gène VE-statine (A) et le gène vegfr-2 (B) sont exprimés dans les îlots sanguins primitifs et dans le sac vitellin (indiqués par des flèches). Le gène vegfr-2 est également exprimé dans le mésoderme intra-embryon- naire (B, étoile). L'expression de dbl n'est pas détectée à ce stade du développement embryonnaire (C). Au stade E10,5, les gènes VE-statine (D) et vegfr-2 (E) sont exprimés de façon similaire, dans les vaisseaux sanguins en formation. Un grossissement plus important de la région caudale de l'embryon montre que les profils d'expression des gènes VE-statine (G) et vegfr-2 (H) au niveau de l'endothélium (aorte dorsale (flèche)) et vaisseaux des membres postérieurs (pointes de flèches) sont super- posables.
A ce stade, dbl est exprimé de façon ubiquitaire chez l'embryon, avec un niveau d'expression plus élevé dans l'épithélium neural (F, flèche). L'expression de dbl n'est jamais détectée dans l'endothélium (I). L'échelle représente 100 μm dans A à C et G à I et 1 mm dans D à F.
- Panneau inférieur : analyse de l'expression du gène VE-statine chez l'embryon El 0,5 (J à L), El 3,5 (M à P), le nouveau-né âgé de 3 jours (Q) et l'adulte (R). L'expression du gène VE-statine est détectée dans les artères des 3ème et 4è e arcs branchiaux (J, respectivement flèche et pointe de flèche) ; dans la veine de l'artère ombilicale (K) et dans les précurseurs des cellules endothéliales du mésenchyme céphalique (L). Au jour 13,5 après la conception, le gène VE-statine est exprimé dans les cellules endothéliales de l'endocarde (M), dans le réseau vasculaire pulmonaire primitif (N), dans les vaisseaux sanguins entourant les côtes (O) et dans le réseau vasculaire associé à la couche pigmentaire de la rétine (P). Après la naissance, l'expression du gène VE-statine est détectée dans l'artère rénale (Q, flèche), la veine rénale (pointe de flèche), dans le réseau capillaire glomérulaire (Q, étoile) et dans les capillaires péritubulaires (Q, flèche ouverte). Chez la femelle gestante, le gène VE- statine est fortement exprimé dans les cellules endothéliales des vaisseaux sanguins de la décidue du mésomètre (R, flèche), a : atrium, cm : mésenchyme céphalique, gl : glomérule, Li : foie, Rv : veine rénale , Lu : poumons, md : décidue du mésomètre, n : épithélium neural, Ra : artère rénale, rb : côtes, tu : tubules rénaux, na : artère ombili- cale, uv : veine ombilicale, v : ventricule. L'échelle représente 100 μm.
- la figure 6 illustre l'analyse de l'expression, la localisation et la sécrétion de la VE-statine :
- figure 6A : les ADNc de la VE-statine-a et de la VE-statine-b ont été traduits in vitro pour confirmer la présence d'un site d'initiation de la traduction commun aux deux transcrits ; une seule forme de VE-statine, correspondant au poids moléculaire attendu de 30 kDa, est produite à partir des deux transcrits, ctrl : contrôle ; a : VE-statine-a ; b : VE-statine-b,
- figure 6B : l'expression de la VE-statine (transcrits et protéine) a été analysée respectivement par RT-PCR, par comparaison avec celle de la GAPDH (deux premières lignes) et par Western-Blot (dernière ligne), à partir de cellules 3T3 trans- fectées avec le plasmide pcDNA3-VE-statine-HA (+) ou le plasmide contrôle pcDNA3 (-). La flèche indique l'expression spécifique de la VE-statine dans les cellules transfectées par le vecteur pcDNA3-VE-statine-HA,
- figure 6C : la localisation cellulaire de la VE-statine a été analysée par immuno- fluorescence directe ou par co-localisation, dans des cellules 3T3 transfectées respectivement par les plasmides pcDNA3-VE-statine-GFP (VE-stat-GFP, à gauche) et pcDNA3-VE-statine-HA (VE-stat-HA + PDI, à droite) ; 24 h après la transfection, les cellules ont été colorées par le colorant de Hoechst et observées directement en microscopie de fluorescence (GFP, à gauche) ou bien préalablement incubées avec des anticorps primaires anti-HA et anti-isomérase à liaison disulfure (marqueur spécifique du réticulum endoplasmique), puis avec des anticorps secondaires marqués respectivement à l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC) ou à la rhodamine (à droite).
- figure 6D : des fibroblastes 3T3 ont été transfectés par le plasmide pcDNA3-VE- statine-HA (VE-stat) ou le plasmide contrôle pcDNA3 (-) ou bien non-transfectés (mock). Le lendemain, le milieu de culture a été remplacé par du milieu seul (panneau de gauche) ou du milieu contenant de la bréfeldine A (bref) ou de la monensine (Mon), (panneau de droite). Les cellules ont été cultivées pendant 6 h supplémen- taires, ensuite la VE-statine sécrétée dans le milieu extracellulaire a été immunopréci- pitée à partir du surnageant de culture filtré, puis détectée par Western-blotting. La flèche indique la VE-statine sécrétée ; ns : bande non-spécifique.
- la figure 7 illustre l'effet de la VE-statine sur la prolifération et la migration des cellules musculaires lisses :
- la figure 7A montre que la VE-statine n'a pas d'effet sur la prolifération des cellules musculaires lisses (AoSMC) ensemencées à faible densité et cultivées pendant 8 jours dans du milieu contrôle (-•-) ou du milieu contenant de la VE-statine (-•-), additionnés de PDGF-BB (50 ng/ml) ; les cellules ont été comptées chaque jour et le milieu a été changé tous les deux jours.
- les figures 7B et 7C montrent que la VE-statine inhibe la migration des cellules musculaires lisses (AoSMC) ; les cellules AoSMC sont cultivées jusqu'à confluence puis les tapis cellulaires sont abimés avec des lames de rasoir et les cellules sont cultivées pendant 2 jours supplémentaires en présence : de milieu contenant de la VE- statine avec ou sans PDGF-BB (80 ng/ml ; VE-statine ; VE-statine+ PDGF) ou de milieu contrôle (Ctrl ; Ctrl + PDGF). B : observation des cellules au microscope à contraste de phase : la barre noire indique la position de la lésion. C : le nombre de cellules ayant migré correspondant à la moyenne ± déviation standard, a été déterminé sur 3 à 7 champs distincts. Exemple 1 : Matériels et méthodes
Les oligonucléotides sont synthétisés par GENSET et GENOSYS et les réactifs de RT et de PCR sont fournis par PERKIN ELMER. Les sites de poly- adénylation sont prédits à l'aide de la méthode de clustering de Hamming pour la prédiction des sites TATA et Poly-A (http://www.itba.mi.cnr.it/webgene). Les séquences SINE ALU/MIR ont été localisées à l'aide du serveur internet Repeat Master (version du 16/07/00 : http://ftp.genome.washington.edu/cgi-bin/RepeatMasker). Les domaines de protéines ont été prédits à l'aide du logiciel SMART (v3.3 du 13 décembre 2001 : http://smart.ernbl-heidelberg.de). 1) Cellules Les lignées ou cultures primaires murines ou humaines suivantes ont été utilisées : L929 (fibroblaste murin), H5V (endothéliome cardiaque murin), 3T3 (fibroblaste murin), MBE (capillaire de cerveau murin), MAE (cellules endothéliales aortiques murines), EOMA (endothéliome murin), 1G11 (lignée de cellules endothéliales pulmonaires murines) et AoSMC (culture primaire de cellules musculaires lisses aortiques humaines, CLONETICS). Les cellules sont cultivées à 37 °C, en atmosphère humide (5 % CO2 -95 % air), dans les conditions recommandées par le fournisseur. 2) RT-PCR
L'ARN total est extrait à l'aide du réactif TRIzol® (LIFE TECHNOLOGIES). Les réactions de transcription inverse sont réalisées à partir d'1 μg d'ARN, à l'aide d'oligonucléotides hexamériques aléatoires, selon les instructions du fabricant (PERKIN ELMER). Les réactions de PCR sont réalisées dans du tampon PCR II (PERKIN ELMER) contenant les produits de transcription inverse, 150 μM de chacun des NTPs et 1,25 UI d'AmpliTaq Gold®, dans un volume final de 50 μl.
Pour les réactions RT-PCR de la figure 1, les couples d'amorces suivants ont été utilisés : - Couple 1 : TGA ACC TGC CCA CTC CTA TGA (SEQ ID NO: 32)
TTT CGT CTT GCC AGC TAC TAT CC (SEQ ID NO: 33)
- Couple 2: TGA ACC TGC CCA CTC CTA TGA (SEQ ID NO: 34)
TGT CAG TCT CCT ATG GAA CC (SEQ ID NO: 35)
- Couple 3 : TGA ACC TGC CCA CTC CTA TGA (SEQ ID NO : 36) GAG GCC TTG CGG GAG TCA CC (SEQ ID NO: 37)
- Couple 4: AGG CTA CGC CAC TTA CAG ATG C(SEQ ID NO: 7)
GAG GCC TTG CGG GAG TCA CC (SEQ ID NO: 8)
Après une étape de dénaturation à 95 °C pendant 2 min, l'amplification a été réalisée pendant 35 cycles comprenant : une étape de dénatura- tion à 94° pendant 30 s, une étape d'hybridation à 53 °C pendant 30 s et une étape d'élongation à 72 °C pendant 1 min.
Des amplifications PCR ont été réalisées dans des conditions similaires aux précédentes, en utilisant les couples d'amorces, la concentration en MgCl2, la température d'hybridation et le nombre de cycles suivants : - Amorces mDBl (2 mM, 53.4°C, 35 cycles) :
TGA ACC TGC CCA CTC CTA TGA (SEQ ID NO: 38) TTT CGT CTT GCC AGC TAC TAT CC (SEQ ID NO: 39). - Amorces mVE-statine (1 mM, 57.8°C, 30 cycles): AGG CTA CGC CAC TTA CAG ATG C (SEQ ID NO: 9)
GAG GCC TTG CGG GAG TCA CC (SEQ ID NO: 10).
- Amorces mVE-statine-a (2 mM, 54.7°C, 32 cycles): - AGA AGT TCA GTG GTG AGG (SEQ ID NO: 11)
- TCT TTT TGT GGC CTG TGG TCC GG (SEQ ID NO: 12).
- Amorces mVE-statine-b (2 mM, 57.4°C, 32 cycles): TGG GCA GCA GAC ATT CC (SEQ ID NO: 13)
TCT TTT TGT GGC CTG TGG TCC GG (SEQ ID NO: 14). - Amorces mGAPDH (3 mM, 61 °C, 25 cycles):
ACG GCA AAT TCA ACG GCA CAG TCA (SEQ ID NO: 40) CAT TGG GGG TAG GAA CAC GGA AGG (SEQ ID NO: 41).
- - Amorces hVE-statine (2mM, 65 °C, 27 cycles, produit de 372 pb) CCTGCAGGATGGCGGGGTGACA (SEQ ID NO: 25) GCGGCCGAGCTGCTGGAAGGAG (SEQ ID NO: 26)-3'
- Amorces hVE-statine-a (2mM, 62 °C, 30 cycles, produit de 188 pb)
CGCGCCACCTGAGATGC (SEQ ID NO: 27) CCGGTCCTGGGGGCTGCTTCC (SEQ ID NO: 28) - Amorces hVE-statine-b (ImM, 61 °C, 30 cycles, produit de 176
Pb)
CCCCAGCAAGGGCTAGGGTCCAT(SEQ IDNO: 29)
TGGCGGAGGAGAATCAGTCAT(SEQ ID NO: 30)
Les réactions de PCR sont réalisées à l'aide d'un thermocycleur (Gène Amp PCR System 2400 ou 9600, PERKIN ELMER). Les produits d'amplification sont séparés par électrophorèse en gel d'agarose (1 %) et visualisés en lumière UV, après coloration au bromure d'éthidium. 3) Clonage
De l'ARN total d'embryon de souris E10,5 a été rétro-transcrit et incubé avec 50 ng de chacune des amorces ACA AAA AGA AGA AGG CTA CC (SEQ ID NO: 15) et CAG CGG CAG TGT CCT GGG CG (SEQ ID NO: 16), dans un mélange High Fidelity PCR master mix (BOEHRTNGER). L'amplification a été réali- sée dans les conditions suivantes: 94°C pendant 2 min, puis 35 cycles de 94°C-30 s, 54°C-30 s et 72°C-1 min, suivis d'une étape finale d'élongation à 72°C pendant 7 min. Le produit de 416 pb a été purifié, clone dans le vecteur PCR II-TOPO (INVITROGEN), séquence et utilisé comme sonde pour cribler les banques d'ADNc d'embryon de souris et d'ovaire (respectivement 10 et 1,6 x 10 phages). L'ADNc complet VE-statine-a et VE-statine-b a ensuite été clone dans le vecteur d'expression pcDNA3 (STRATAGENE) et utilisé pour générer différentes sondes spécifiques de la VE-statine pour les analyses par Northern-blot et hybridation in situ.
Le vecteur pGFP- VE-statine a été construit par clonage de la séquence codant pour la VE-statine entre les sites HindlII et BamHI du vecteur pEGFP-Nl (BD-CLONTECH). Le vecteur d'expression pHA-VE-statine a été construit par clonage de la séquence codant pour l'épitope de l'hémagglutinine du virus influenza (HA), en phase avec la séquence codant pour la VE-statine, entre les sites HindlII et BamHI du vecteur d'expression pcDNA3 (STRATAGENE). 4) 5'RACE et isolement de fragments génomiques.
L'analyse par 5'-RACE a été réalisée sur de l'ADNc d'ovaire humain normal et d'embryon de souris E7,5, à l'aide du kit Marathon-ready cDNA CLONTECH). Les amplifications ont été effectuées à l'aide du mélange High Fidelity PCR master mix (BOEHRINGER) et de thermocycleurs GENEAMP, selon les instructions du fabricant.
Les paires d'amorces imbriquées murines et humaines sont respectivement CGG AGC CGC ACA TGG TCT GCA TC (SEQ ID NO: 17) et TCT TTT TGT GGC CTG TGG TCC GG (SEQ ID NO: 18), CCA CAT CAG CAG CAC CTC CTG AGA G (SEQ ID NO: 19) et GAG CGC CTC ATG GCC TGT GCC TCC A (SEQ ID NO: 20). L'isolement du gène VE-statine a été réalisé, à la fois par hybridation standard de banques de phages (1 à 1,8 x 106 clones), à l'aide de sondes d'ADNc et d'ADN génomique spécifiques du gène VE-statine, et par amplification de fragments par PCR à l'aide du kit murin Génome Walker (CLONTECH) et de différents couples d'amorces spécifiques. Les fragments PCR ainsi obtenus ont été sous-clonés dans le vecteur PCR II-TOPO et séquences à l'aide d'un séquenceur à ADN (Abiprism 377, APPLIED SYSTEM). 5) Test de protection à la RNase
Deux fragments génomiques spécifiques d'environ 850 à 900 pb comprenant 150 à 175 pb de l'exon la ou lb ont été amplifiés à partir d'un fragment génomique de 17 kpb de la VE-statine, à l'aide du mélange High Fidelity PCR master mixR (ROCHE). Les fragments amplifiés ont été clones dans le vecteur pCR-TOPO et des sondes spécifiques de la VE-statine a ou b ont été synthétisées à l'aide de respectivement : les amorces TCC CAC AGG GAC AGG GAC AGG GGA TGG ACA GAG CC (SEQ ID NO: 21) and ATG CTG CGC AGG CCT GGC TGA GGC CAC CTC TGC TG (SEQ ID NO: 22) et du kit Riboprobe Gemini System III kit (Promega), selon les instructions du fabricant. Le test de protection à la RNase a été réalisé à partir de 5 μg d'ARN total d'embryon de souris E10,5, de cellules endothéliales H5V ou d'ARNt de levure (contrôle), à l'aide du kit RPA III (AMBION). Les réactions ont été analysées par électrophorèse en gel de 6 % polyacrylamide-8M puis les gels ont été séchés et autoradiographiés. 6) Northern-blolting
Les membranes pour Northern Blot, préparées à partir de différents tissus humains ou murins (CLONTECH), ont été incubées à 68°C pendant une heure avec des sondes spécifiques de la VE-statine-a humaine ou murine ou avec une sonde anti-sens de la VE-statine-b, marquées au 32P dans une solution d'hybridation ExpressHybR (CLONTECH). Les membranes ont ensuite été lavées à 50°C dans du SSC 2X contenant 0,05% SDS, séchées puis autoradiographiées. 7) Cartographie par hybridation in situ (FISH)
Le clone BAC 611D20 obtenu à partir d'une banque génomique (INCYTE), a été utilisé comme sonde humaine spécifique. Un plasmide comprenant un fragment de 17 kpb d'ADN génomique de souris a été utilisé comme sonde murine spécifique. L'ADN de BAC et l'ADN plasmidique ont été isolés selon les techniques classiques, en suivant les protocoles standards (QIAGEN). Un μg d'ADN a été marqué, à l'aide du kit FITC-Nick translation, selon les recommandations du fabricant (VYSIS). 100 ng d'ADN marqué ont été mélangés avec 20 μg d'ADN humain Cot-1 (GIBCO-BRL), précipité à l'éthanol, et repris dans 10 μl de tampon d'hybridation (4X SSC, IX Denhardt's, 0,02 M NaPO4 pH 6,7, 1 μg/ml d'ADN de sperme de saumon, 10 % de sulphate de Dextran, 50 % formamide). Les chromosomes en métaphase ont été dénaturés dans 70 % formamide, 2X SSC pendant 2 min à 70°C et déshydratés immédiatement dans l'éthanol froid. Les étalements de chromosomes humains et murins ont été hybrides avec les sondes correspondantes, pendant 16 à 18h, à 37°C dans une enceinte humide. Les lames ont été analysées à l'aide d'un microscope à épifluores- cence (Axisphot 2, ZEISS), les images ont été enregistrées à l'aide du logiciel Quips (VYSIS).
8) Cartographie par hybride de radiation (RH mapping)
Le couple d'amorces GCT GTC TGG TGG TGC CTA TG (SEQ ID NO:23) et TTA TTA TGA CAA AGA TGG AG (SEQ ID NO:24) a été utilisé pour cribler l'ensemble G3 d'hybride de radiation de Stanford. Les réactions ont été réalisées dans du tampon PCR contenant 3 mM de MgCl2, 5 nmoles de chacune des amorces, 30 ng de matrice ADN et 0,5 UI d'AmpliTaq Gold polymérase® (APPLIED BIOSYSTEM), à l'aide d'un appareil Gène Amp PCR System 9700 (APPLIED BIOSYSTEM). L'amplification a été réalisée dans les conditions suivantes : 35 cycles comprenant 95°C-15 s, 55°C-19 s et 72°C-30 s, puis les produits ont été analysés par électrophorèse en gel d'agarose (2 %) et coloration au bromure d'éthidium. Un produit PCR de 163 pb a été détecté.
9) Hybridation in situ L'hybridation in situ a été réalisée à l'aide des sondes suivantes : un fragment de 1,3 kpb d'ADNc de la VE Statine clone dans pcDNA3 (INVITROGEN), un fragment de 1 kpb d'ADNc de VEGFR-2 murin clone dans pGEM-T-easy ou un fragment de 800 pb d'ADNc de DB1 murin clone dans PCRII-TOPO. Les sondes sens et anti-sens ont été synthétisées à partir des plasmides linéarisés, à l'aide de 350 μM de NTPs marqués à la digoxigénine (ROCHE), comme décrit dans Wilkinson et al., Methods Enzymol., 1993, 225, 361-373. L'hybridation in situ a été réalisée sur des coupes en paraffine de 5 μm, comme décrit dans Queva et al., Oncogene, 1993, 8, 2511-2520 et Mattot et al., J. Cell. Sci., 1995, 108, 529-535. La digoxigénine a été détectée comme décrit dans Wilkinson et al., en utilisant le NBT® et le BCIP® (ROCHE) pour la détection de l'activité phosphatase alcaline. Les lames ont été montées dans du Dako-glycergelR (DAKO) et examinées à l'aide d'un microscope DM LB (LEICA). Les images ont été enregistrées à l'aide d'un appareil photographique (JVC KY-F55B) et du logiciel QWin (LEICA).
10) Production de la VE-statine recombinante
Des vecteurs d'expression de la VE-statine, dénommés pcDNA3- VE-statine-HA et pEGFP- VE-statine, contenant l'ADNc de la VE-statine en phase, respectivement avec un épitope de l'hémagglutinine du virus influenza et la protéine fluorescente GFP, sous le contrôle du promoteur CMV, ont été construits comme décrit à l'exemple 1.3.
Des cellules 3T3 (15000 cellules/cm ) ont été ensemencées dans des flasques de culture de 78,5 cm2 puis transfectées le lendemain avec 5 μg de vecteur recombinant pcDN A3 -VE-statine-HA ou pcDNA3-VE-statine-GFP, ou bien de vecteur pcDNA3 (contrôle), à l'aide du réactif EXGEN 500® (EUROMEDEX), selon les recommandations du fabricant. Après 6 h d'incubation, le milieu a été remplacé par du milieu de culture sans sérum et 24 h plus tard, le surnageant de culture conte- nant la VE-statine sécrétée et le milieu contrôle ont été récoltés.
11) Analyse de la localisation cellulaire de la VE-statine par immunofluorescence
Des cellules (35000 cellules 3T3 et H5V) sont ensemencées sur des lames de verre de 14 mm de diamètre ; 24 h plus tard les cellules sont transfectées par 50 ng de l'un des plasmides suivants : pcDNA3 -VE-statine-HA, pEGFP- VE-statine, pcDNA3 ou pEGFP-Nl (contrôles). A 48 h (24 h post-transfection), les cellules sont lavées avec du PBS, fixées, pendant 20 min à 4 °C, dans du PBS contenant 4 % de para-formaldéhyde, puis elles sont conservées dans du PBS (expériences de co-locali- sation avec les cellules transfectées par pcDN A3 -VE-statine-HA) ou bien elles sont colorées pendant 3 min avec du réactif de Hoechst (1 μg/ml), rincées, puis les lames sont montées avant d'être analysées (expériences de fluorescence directe avec cellules transfectées par pEGFP- VE-statine ou pcDNA3). Pour les expériences de co-localisa- tion, les cellules conservées dans du PBS sont incubées pendant 10 min dans du PBS contenant 50 mM de NH C1, perméabilisées pendant 4 min dans du PBS contenant 0,1 % de Triton X-100, bloquées pendant 10 min dans du PBS contenant 10 % de sérum de chèvre, puis incubées pendant 1 h à température ambiante, avec un anticorps de lapin anti-isomérase à liaison disulfure (1/250, STRESSGEN) et un anticorps monoclonal de souris anti-HA (1/200, BABCO), dans du PBS contenant 10 % de sérum de chèvre. Les lames ont ensuite été incubées, pendant 1 h à température ambiante, avec des anticorps secondaires couplés à la rhodamine ou à Tisothiocyanate de fluorescéine (1/500, JACKSON IMMUNORESEARCH LABORATORIES).
Les lames sont montées dans du milieu prolong antifade® (MOLECULAR PROBES) et observées à l'aide d'un microscope à fluorescence (Axioplan 2, ZEISS). Les images sont enregistrées à l'aide d'un équipement d'enregistrement vidéo (PRINCETON INSTRUMENTS INC.)
12) Analyse de la sécrétion de la VE-statine
Des cellules 3T3 (15000 cellules/cm2) ont été ensemencées dans des flasques de culture de 78,5 cm2 puis transfectées le lendemain avec 5 μg de vecteur recombinant pcDN A3 -VE-statine-HA ou pEGFP-VE-statine, ou bien de vecteur pcDNA3 (contrôle), à l'aide du réactif EXGEN 500® (EUROMEDEX), selon les recommandations du fabricant. Après 6h d'incubation, le milieu a été remplacé par du milieu de culture complet. 24 h plus tard, le milieu a été changé à nouveau et les cellules ont été incubées pendant 5 h en présence de bréfeldine A (GolgiPlug®, PHARMTNGEN) OU de monensine (GolgiStop®, PHARMINGEN). Le surnageant de culture (5 ml) a ensuite été récolté, filtré (0,22 μm) et additionné de : désoxycholate de sodium (0,5 %), Ipégal CA630 (1 %), SDS (0,1 %), inhibiteurs de protéases (Complète®, ROCHE MOLECULAR BIOCHEMICALS) et anticorps polyclonal anti-HA (50 μl, EUROGENTEC), puis le mélange ainsi obtenu a été incubé une nuit à 4 °C, sous agitation rotative. 50 μl de protéine G-Sépharose (Protein-G Sepharose Fast Flow beads, AMERSHAM PHARMACIA) ont ensuite été ajoutés, puis l'incubation a été poursuivie dans les mêmes conditions, pendant 1 h. Les billes ont été lavées 4 fois avec du tampon PBS et lysées dans du tampon RIPA contenant des inhibiteurs de protéases. Les échantillons ont été analysés par électrophorèse en gel de poly- acrylamide en présence de SDS (12 % SDS-PAGE) suivi d'un Western-blot, à l'aide d'un anticorps monoclonal anti-HA (1/500, EUROGENTEC). La VE-Statine a ensuite été révélée par luminescence, selon les instructions du fabricant (Aurora®, ICN).
13) Analyse de l'effet de la VE-statine sur la prolifération et la migration cellu- laire
L'effet de la VE-statine sur la prolifération cellulaire a été testé dans les conditions suivantes : des cellules AoSMC ont été ensemencées dans des boîtes de culture (4 cm , 35000 cellules/cm ) et cultivées pendant 24 h, puis le milieu a été remplacé par du milieu contrôle ou du milieu contenant de la VE-statine, préparé comme décrit ci-dessus (exemple 1.10), additionnés de PDGF (PDGF-BB : homo- dimère de chaînes B ; 50 ng/ml). Chaque jour, les cellules ont été récoltées par trypsi- nation puis dénombrées à l'aide d'un hémacytomètre (Coulter®, COULTRONICS). Alternativement, l'effet de la VE-statine sur la migration cellulaire a été testé par le «test de la blessure», dans les conditions suivantes : des cellules AoSMC (50000 cellules) ont été ensemencées dans des boîtes de culture (28 cm ) et cultivées jusqu'à confluence, puis les tapis cellulaires ont été endommagés à l'aide d'une lame de rasoir et rincés 2 fois avec du milieu seul. Les milieux suivants ont été ensuite ajoutés aux cultures : milieu contrôle avec ou sans PDGF-BB (80 ng/ml) et milieu contenant de la VE-statine, avec ou sans PDGF-BB (80 ng/ml). Après 48 h d'incubation, les cellules ont été rincées avec du PBS, fixées pendant 20 min à 4 °C avec du PBS contenant 4 % de para-formaldéhyde, rincées à nouveau avec du PBS et observées au microscope. Exemple 2 : Caraetérisation des ADNcs VE-statine humains et murins (figures 1 et 2) 1) Caraetérisation des ADNcs VE-statine humains et murins (figures 1 et 2)
L'analyse de la séquence 3' non codante de l'ADNc de vezf-1 qui code pour l'homologue murin du facteur DB1 humain (Xiong et al., Develop. Biology, 1999, 206, 123-141) a révélé de façon inattendue, la présence d'une séquence polyA interne, située en aval de la séquence codante de la protéine vezf-1 (positions 2302 à 2336, en référence à la séquence de la figure 4 de Xiong et al., précité), qui pourrait représenter la séquence polyA authentique de vezf-1, immédiatement suivie par un site EcoRI. Ces résultats, indiquent que l'ADNc de 3681 pb décrit par Xiong et al. (précité) pourrait correspondre à la concaténation de deux ADNc correspondant à deux ARNm distincts ; la séquence (1-2336) correspondant à l'ADNc de vezf-1 (mDBl) et la séquence de 1,35 kpb située en aval de la séquence polyA (2302-2336) provenant d'un ADNc distinct de celui de vezf-1 (mDBl), ont été vérifiées expérimentalement. D'une part, en dépit de nombreuses tentatives, il a été impossible d'amplifier la séquence complète de 3681 pb correspondant à l'ADNc décrit par Xiong et al.. D'autre part, la preuve formelle a été apportée par l'analyse RT-PCR d'ARN total d'embryon de souris, à l'aide de couples d'amorces s'hybridant de part et d'autre de la séquence polyA 2302-2336 qui a montré qu'il était impossible d'amplifier un fragment chevauchant la séquence polyA 2302-2336 (pistes 2 et 3 de la figure 1). En revanche, des produits correspondant à ceux attendus sont obtenus lorsque l'amplification PCR est réalisée avec deux amorces s'hybridant dans la région en amont (piste 1 de la figure 1) ou en aval (piste 4 de la figure 1) de cette séquence polyA.
L'ADNc de 1,35 kpb a été clone à partir d'une banque d'ovaire de souris et de deux banques d'ADNc embryonnaire, à l'aide d'une sonde d'ADNc d'embryon de souris El 0,5 correspondant, soit à la région 3' de l'ADNc vezf-1 de 3681 pb (positions 2480-2894, sonde VE-statine), soit à la séquence codante de mDBl du même ADNc (positions 1478-2294, sonde contrôle).
Parmi 82 des clones d'ADNc complets obtenus, aucun n'hybride à la fois avec la sonde VE-statine et la sonde mDBl, alors que 40 hybrident avec la sonde mDB 1 et 42 avec la sonde VE-statine. Le clone le plus long qui hybride avec la sonde VE-statine possède une séquence de 1,37 kpb (VE-statine-a : SEQ ID NO: 5 et figure 2).
L'analyse 5'-RACE à partir d'une banque d'embryons de souris El i, a permis de confirmer que la séquence de 1,37 kpb correspondrait à un ADNc complet, dénommé VE-statine-a et d'identifier un second ADNc VE-statine (VE- statine-b5 1,4 kpb : SEQ ID NO: 6 et figure 2) qui diffère de l'ADNc VE-statine-a au niveau des 169 premières paires de base.
Chez l'homme, deux transcrits VE-statine-a et VE-statine-b ont également été isolés. Le transcrit VE-statine-b complet (SEQ ID NO: 4) a été isolé par 5 'RACE, à partir de la séquence partielle (GENBANK NM H6215) ; le produit obtenu contient 236 pb supplémentaires en 5' de la séquence déposée dans GENBANK. La comparaison de la séquence humaine avec les séquences murines (alignement multiple à l'aide du logiciel CLUSTAL.W (1.8)) montre que l'ADNc VE- statine-b humain possède 73 % d'identité avec l'ADNc VE-statine-b murin et 59 % avec l'ADNc VE-statine-a murin. L'ADNc VE-statine-a comprend l'EST BI 910383. 2) L'ADNc décrit dans Xiong et al. code pour une protéine VE-statine tronquée inactive
L'ADNc de 3681 pb décrit dans Xiong et al. présente un signal d'arrêt de traduction en positions 1594-1596 de la séquence codant DB1 et une muta- tion de C en T en position 2602. En outre, il ne possède, ni les premières 236 pb de la
VE-statine-a ou les premières 258 pb de la VE-statine-b, ni une base G entre les bases en positions 2870 et 2871 et une base G entre les bases en positions 2902-2903.
En conséquence, dans l'éventualité d'une ré-initiation interne de traduction à partir de l'ATG 2519-2521 correspondant à l'ATG initiateur de la VE- statine, les absences précitées entraînent un changement du cadre de lecture considéré et la formation d'une protéine de 138 acides aminés de séquence MWGSGELLVA WFLVLAADGT TEHVYRPSRR VCTVGISGGS ISETFVQRVY QPYLTTCDGH RACSTYRTIY RTAYRRSPGV TPARPRYACC PGWKRTSGLP GACGAAICQP PCGNGGSSSA QDTAAALWMA GRYLPDRC, dont les 117 premiers acides aminés correspondent aux 117 premiers acides aminés de la VE-statine, les 21 acides aminés restant ne correspondant plus à la VE-statine du fait du premier changement de cadre (2870-2871), puis du second (2902-2903). Ces deux changements de cadre induisent la création d'un codon stop TGA d'arrêt de traduction en positions 2933-2935.
En outre, des mutations additionnelles dans la séquence de la VE- statine sont présentes en aval du codon stop TGA en positions 2933-2935 : mutation de G en C en position 3043, mutation de G en C en position 3045, mutation de GG en TT en positions 3073-3074, mutation de GG en CC en positions 3076-3077, présence d'une séquence intronique en positions 3245-3410, absence des bases 1008-1085 de la VE-statine-a, correspondant aux bases 1030-1107 de la VE-statine-b, absence d'une base C entre les bases en positions 3448-3449, absence d'une base C entre les bases en positions 3465-3466, absence d'une séquence CT entre les bases en positions 3469- 3470, ajout des bases GA entre les bases en positions 3495-3496, absence d'une base G entre les bases en positions 3525-3526, et mutation de C en T de la base en position 3572. Exemple 3 : Structure du gène VE-statine (figure 3, Tableaux I et II)
Le gène murin a été isolé à partir de deux banques indépendantes d'ADN génomique de souris, sous-cloné et séquence. Il a une taille de plus de 10 kpb et comprend 11 exons et 11 introns (figure 3 et Tableau II), incluant deux exons alternatifs (exon- la et lb), correspondant respectivement aux transcrits VE-statine-a et VE-statine-b. L'exon 9 peut être épissé de façon alternative, dans la mesure où certains clones d'ADNc montrent des variations au niveau de cet exon. La structure du gène humain présente une organisation similaire à celle du gène murin (figure 3), incluant la plupart des jonctions introns-exons et la présence de courts éléments nucléaires dispersés.
Les gènes ont été localisés par hybridation (FISH) à l'aide de sondes du gène VE-statine, sur les chromosomes 9 (9q34.3-qter) et 2 (2B), respectivement chez l'homme et la souris (figure 3). La cartographie par hybride de radiation (RH mapping) a confirmé la position du gène humain dans la région distale du bras long du chromosome 9, à proximité du marqueur WI- 17482, à la position de 151,488 Mb (en référence à la séquence de la base de données UDV http://bioinformatics.weizman.ac.il/udb/ et Santa Cruz : http://genome.ucsc.edu). Par comparaison, le gène dbl humain a été localisé sur le chromosome 17 (numéro d'accès Genbank NT 010651) et le gène dbl murin sur le chromosome 11, confirmant davantage que les gènes dbl et VE-statine sont des gènes distincts.
Les sites d'initiation de la transcription des transcrits VE-statine ont été précisés par des analyses complémentaires de celle effectuée par 5 'RACE, à savoir : des essais d'extension d'amorce et de protection à la RNase, à partir d'ARN total de cœur d'embryon ou de cellules endothéliales (H5V) et des fragments géno- miques correspondant à la VE-statine-a et à la VE-statine-b. Ces expériences ont montré que le transcrit VE-statine-a possédait plusieurs sites d'initiation de la trans- cription, le transcrit le plus long couvrant environ les 75 bases en amont de la première base identifiée, les sites d'initiation se répartissent sur environ 60 pb (figure 4C). Ce variant est exprimé à des niveaux beaucoup plus faibles que le transcrit VE- statine-b, et ce à la fois dans les cellules endothéliales et chez l'embryon (figure 4C). En revanche, le transcrit VE-statine-b présente un site unique de transcription vraisemblablement en raison de la présence d'une boîte CATAAAAAGC, située 42 paires de bases en amont de la première base du transcrit (figure 4C). Exemple 4 : Mise en évidence de l'expression spécifique de la VE-statine dans les cellules endothéliales (figures 4 et 5)
L'expression de la VE-statine (transcrits VE-statine-a et VE-statine- b) a été analysée par RT-PCR à partir de différentes lignées cellulaires in vitro. Les 2 variants sont exprimés dans les cellules endothéliales (EOMA, H5V et 1G11) mais pas dans les fibroblastes (353 et L 929), (figure 4B). Par comparaison, mDBl est exprimé à un niveau équivalent dans toutes les lignées testées.
L'expression des transcrits VE-statine-a et VE-statine-b a également été analysée par Northern-Blot dans les tissus adultes, à l'aide de sondes corres- pondant à la région 5' spécifique de chaque ADNc. Un transcrit majeur de 1,6 kb est reconnu par chacune des sondes (figure 4A) ; cette taille correspond à celle des ADNcs de la VE-statine. L'expression de la VE-statine-a et-b est détectée à des niveaux élevés dans le cœur, les poumons et les reins et dans ces conditions, elle n'est pas détectable dans les autres tissus (figure 4A). Le profil d'expression du gène VE-statine a également été analysé par hybridation in situ chez l'embryon de souris et comparé à celui du gène dbl et de celui du facteur endothélial spécifique vegfr-2, utilisé comme contrôle de l'expression mésodermique précoce puis endothéliale spécifique. A E7,5, l'expression du gène VE- statine est détectée exclusivement dans les îlots sanguins primitifs dans lesquels se différencient les premières cellules endothéliales. En revanche, dbl n'est pas détecté dans ces îlots sanguins primitifs, et comme cela a déjà été montré, l'expression de vegfr-2 est détectée à la fois dans les îlots sanguins primitifs et dans le mésoderme intra-embryonnaire (Breier et al., Blood, 1996,87, 630-641 ; Yamaguchi et al., Development, 1993, 1 18, 489-498). A E10,5, l'expression du gène VE-statine se superpose à celle de vegfr-2 dans les cellules endothéliales de la veine et de l'artère ombilicale, des artères des 3Ième et 4lème arcs branchiaux, de l'aorte dorsale, et du mésenchyme céphalique (figure 5). Comme cela a été montré pour le gène humain, l'expression de dbl est ubiquitaire à ce stade du développement embryonnaire chez la souris, avec une expression plus élevée dans l'épithélium neural (figure 5) mais n'est jamais détectée dans les vaisseaux sanguins en formation. A 13,5 jours post-conception, le profil d'expression du gène VE-statine est toujours restreint aux cellules endothéliales, comme le montre son expression dans le mésenchyme facial, le cerveau, le foie, l'endocarde, les poumons et le réseau vasculaire péri-costal, ou dans la couche pigmentaire de la rétine (figure 5).
Le profil d'expression du gène VE-statine a également été étudié après la naissance, dans le rein, dans la mesure où les vaisseaux sanguins se développent encore et se remodèlent dans cet organe. Chez les nouveaux-nés âgés de 3 jours, l'expression du gène VE-statine est restreinte strictement à l'endothélium. De façon intéressante, le gène VE-statine est exprimé à la fois dans les veines et les artères (figure 5), ce qui indique que son expression n'est pas restreinte au réseau vasculaire artériel ou veineux, à ce stade. L'expression du gène VE-statine est égale- ment détectée dans les capillaires glomérulaires péri-lobulaires et fenestrés et dans les artères arquées et interlobulaires, indiquant que, dans cet organe, son expression n'est pas associée à un type particulier de vaisseaux. Chez la femelle gestante, l'expression du gène VE-statine a également été détectée dans les vaisseaux sanguins de la décidue du mésomètre de l'utérus. De façon intéressante, l'expression du gène vegfr-2 a été détectée à des niveaux beaucoup plus faibles dans cet organe.
Exemple 5 : Structure de la protéine VE-statine (figures 2 et 6A)
Le codon d'initiation de la traduction de la protéine VE-statine a été localisé aux codons AUG28ι-283 et AUG309-311, de respectivement le transcrit VE- statine-a murin et humain, du fait de l'identification des éléments suivants : - la présence d'une séquence minimale d'initiation de la traduction
(séquence de Kozak ; Kozak, J. Cell. Biol., 1989, 108, 229-241) dans les deux espèces,
- la présence de codons stops dans les autres cadres ouverts de lecture, et - le degré élevé de similarité (79%» d'identité) entre les séquences humaines et murines, à partir de ce point (figure 2).
Ces cadres ouverts de lecture sont traduits en protéines de 275 (SEQ ID NO: 1) et 273 acides aminés (SEQ ID NO: 42) respectivement chez la souris et l'homme, correspondant à des poids moléculaires estimés de 29,8 kDa et 29,6 kDa. Des expériences de traduction in vitro ont permis de vérifier que ces cadres ouverts de lecture étaient fonctionnels ; les ADNc VE-statine-a et VE-statine-b sont tous les deux traduits en une protéine majeure d'environ 30 kDa, correspondant au poids molécu- laire attendu d'après la séquence codante (figure 6A) ; aucun autre produit spécifique n'a été détecté.
Les séquences humaines et murines présentent 78 % d'identité et 87 % de similarité entre elles. La recherche dans les bases de données de domaines analogues à ceux d'autres protéines a mis en évidence la présence : d'un peptide signal clivable de 19 et 20 acides aminés situé à l'extrémité NH2-terminale des séquences respectivement humaines et murines et de deux domaines semblables aux domaines du facteur de croissance épidermique (EGF-like domains) caractérisés par la conservation des résidus de cystéine essentiels desdits domaines EGF-like (figure 2).
Aucune ressemblance entre la VE-statine et des facteurs connus n'a été identifiée.
Exemple 6 : Analyse de l'expression, la localisation et la sécrétion de la VE- statine (figures 6B, 6C, 6D) Les analyses ont été réalisées à partir de cellules transfectées par les vecteurs recombinants pEGFP-VE-statine et pcDNA3-VE-statine-HA, qui surexpriment la VE-statine sous la forme d'une protéine de fusion avec la GFP ou l'épitope HA de l'hémagglutinine du virus influenza (figure 6B).
La localisation cellulaire des protéines de fusion a été analysée par immunofluorescence dans des cellules endothéliales (1G11) et fibroblastiques (3T3, figure 6C). La VE-statine empêche la migration de la GFP dans le noyau (figure 6C, panneau de gauche) et des expériences de co-immunofluorescence, respectivement avec un anticorps anti-vinculine et anti-cytochrome C, montrent que la VE-statine n'est ni associée avec le cytosquelette, ni avec les mitochondries. En revanche, la VE- statine est présente dans le réticulum endoplasmique, comme le montre sa co-localisa- tion avec l'isomérase à liaisons disulfures qui est un marqueur spécifique de ce compartiment (figure 6C, panneau de droite).
Dans la mesure où la VE-statine (humaine et murine) possède un peptide signal, la présence de cette protéine, à la surface de la membrane plasmique et dans le milieu extracellulaire a été analysée de la façon suivante :
- la présence de la VE-statine à la surface cellulaire a été vérifiée à partir de cellules 3T3 transfectées par le plasmide pcDN A3 -VE-statine-HA, marquées à la biotine à l'aide d'un agent de couplage incapable de traverser la membrane plasmique (sulfo-NHS-biotine). Après solubilisation, les protéines membranaires (marquées à la biotine) ont été immunoprécipitées à l'aide de billes de streptavidine. Dans ces conditions, la VE-statine n'est pas détectable dans le matériel immunopréci- pité, indiquant qu'elle n'est pas exposée à la surface des cellules.
- la présence de la VE-statine dans le milieu extracellulaire a été analysée à partir de cellules transfectées dans les mêmes conditions, puis le surnageant de culture a été récolté 48 h après la transfection et analysé par immunoprécipitation. Dans ces conditions, la VE-statine est sécrétée dans le milieu extracellulaire (figure 6D, panneau de gauche), cette sécrétion est partiellement ou fortement inhibée en présence d'inhibiteurs de la sécrétion, respectivement la monensine et la bréfeldine A.
Les résultats illustrés dans la figure 6 (6B, 6C et 6D) démontrent que la VE-statine est produite dans les cellules, sous la forme d'un facteur soluble sécrété dans le milieu extracellulaire selon la voie classique de sécrétion des protéines. Le poids moléculaire apparent de la VE-statine sécrétée est supérieur au poids moléculaire apparent prédit à partir de sa composition en acides aminés, ce qui indique que la VE-statine subit des modifications post-traductionnelles au cours de la sécrétion. Exemple 7 : Analyse de l'effet de la VE-statine sur la migration et la prolifération des cellules musculaires lisses (figure 7) L'effet de la VE-statine sur la prolifération et la migration des cellules musculaires lisses a été testé à l'aide de VE-statine recombinante, produite comme décrit à l'exemple 1.10 et de cultures primaires de cellules musculaires lisses aortiques humaines (AoSMC), dans les conditions telles que décrites à l'exemple 1.13.
De manière plus précise, l'effet de la VE-statine sur la prolifération des cellules musculaires lisses a été analysée sur des cellules AoSMC ensemencées à faible densité et cultivées pendant 8 jours dans du milieu contrôle ou dans du milieu contenant de la VE-statine, en présence ou en l'absence de PDFG-BB ; le PDGF-BB étant ajouté pour maintenir la stimulation de la prolifération. Les résultats montrent que la VE-statine n'a pas d'effet sur la croissance des cellules AoSMC, en présence ou en l'absence de PDGF-BB, comme le démontre la superposition parfaite des courbes de croissance des cellules traitées et non traitées par la VE-statine (figure 7A). L'effet de la VE-statine sur la migration des cellules musculaires lisses a été analysé à l'aide du « test de la blessure », sur des cultures confluentes de cellules AoSMC. Les résultats montrent qu'après deux jours de culture dans du milieu contenant de la VE-statine, la migration est réduite à celle observée avec le milieu de base et le PDGF-BB n'a quasiment pas d'effet sur la migration des cellules AoSMC (figures 7B et 7C). Par comparaison, la migration en présence de milieu contrôle, avec et sans PDGF-BB est respectivement 3,4 fois et 2 fois plus importante qu'en présence de VE-statine (figures 7B et 7C). Des résultats similaires ont été obtenus par le test de la chambre de Boyden. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en œuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention.

Claims

REVENDICATIONS
1°) Utilisation d'une protéine dénommée VE-statine, sélectionnée dans le groupe constitué par :
- la séquence SEQ ID NO: 1 correspondant au précurseur de la VE- statine murine,
- les séquences présentant au moins 70 %> d'identité ou au moins 85 % de similarité, de préférence au moins 80 % d'identité ou au moins 90 % de similarité, et de manière préférée au moins 95 % d'identité ou au moins 99 % de similarité avec la totalité de la séquence SEQ ID NO: 1, pour la préparation d'un médicament destiné à inhiber le recrutement des cellules musculaires lisses périvasculaires.
2°) Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que ladite séquence est choisie parmi :
- la séquence SEQ ID NO : 42 présentant le numéro d'accès NCBI NP_057299, correspondant au précurseur de la VE-statine humaine,
- les séquences correspondant respectivement aux positions 17 à 275, 18 à 275, 19 à 275, 20 à 275, 21 à 275, 22 à 275, 23 à 275 et 24 à 275 de la séquence SEQ ID NO : 1, notamment la séquence SEQ ID NO : 2 (positions 21 à 275), correspondant à la VE-statine murine mature, et - les séquences correspondant respectivement aux positions 16 à 273,
17 à 273, 18 à 273, 19 à 273, 21 à 273, 22 à 273 et 23 à 273 de la séquence SEQ ID NO : 42, notamment la séquence SEQ ID NO : 3 (positions 20 à 273), correspondant à la VE-statine humaine mature.
3°) Utilisation selon la revendication 1 ou la revendication 2, caracté- risée en ce que ledit médicament est destiné au traitement du cancer, des retinopathies, de l'athérosclérose et de la resténose.
4°) Médicament, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une molécule sélectionnée dans le groupe constitué par : a) une protéine telle que définie à la revendication 1 ou la revendica- tion 2, b) une molécule d'acide nucléique codant pour la protéine définie en a), et c) un vecteur recombinant comprenant un insert constitué par la molécule d'acide nucléique définie en b). 5°) Protéine, caractérisée en ce qu'elle présente une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par :
- les séquences correspondant respectivement aux positions 17 à 275, 18 à 275, 19 à 275, 20 à 275, 22 à 275, 23 à 275 et 24 à 275 de la séquence SEQ ID NO : l, et - les séquences correspondant respectivement aux positions 16 à 273,
17 à 273, 18 à 273, 19 à 273, 21 à 273, 22 à 273 et 23 à 273 de la séquence SEQ ID NO : 42.
6°) Molécule d'acide nucléique isolée, caractérisée en ce qu'elle présente une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par : - la séquence SEQ ID NO: 4 représentant l'ADNc codant la VE- statine humaine telle que définie à la revendication 2,
- les séquences SEQ ID NO: 5 et 6 représentant les ADNc codant la VE-statine murine telle que définie à la revendication 1,
- le fragment de séquence situé entre les positions 85512 et 98730 de la séquence présentant le numéro d'accès AL590226 dans la base de données
GENBANK, représentant le fragment d'ADN génomique correspondant au gène de la VE-statine humaine telle que définie à la revendication 2,
- le fragment de séquence situé entre les positions 4060576 et 4072108 de la séquence présentant le numéro d'accès Mm2_WIFeb01_25 dans la base de données GENBANK, représentant le fragment d'ADN génomique correspondant au gène de la VE-statine murine telle que définie à la revendication 1, et
- les séquences complémentaires des précédentes, sens ou anti-sens, 7°) Amorce pour l'amplification d'une molécule d'acide nucléique selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'elle est sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO: 7 à 30. 8°) Vecteur recombinant, caractérisé en ce qu'il comprend un insert sélectionné dans le groupe constitué par les molécules d'acides nucléiques selon la revendication 6 et leurs fragments tels que définis à la revendication 7.
9°) Cellules, caractérisées en ce qu'elles sont transformées par un vecteur recombinant selon la revendication 8.
10°) Mammifère transgénique non-humain, caractérisé en ce qu'il contient des cellules transformées par au moins une molécule d'acide nucléique selon la revendication 6.
11°) Méthode de criblage d'un agoniste ou d'un antagoniste d'une protéine telle que définie à la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins les étapes suivantes : a) la mise en contact de cellules musculaires lisses périvasculaires, avec une protéine telle que définie à la revendication 1 ou la revendication 2, et une substance à tester, b) la mesure par tout moyen approprié de l'effet de ladite substance à tester sur la migration desdites cellules musculaires lisses, et c) la sélection des substances capables d'augmenter ou de diminuer la migration desdites cellules musculaires lisses, par rapport au contrôle.
PCT/FR2004/000355 2003-02-17 2004-02-17 Facteur soluble secrete par les cellules endotheliales des vaisseaux sanguins WO2004076482A1 (fr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR0301875A FR2851249A1 (fr) 2003-02-17 2003-02-17 Nouveau facteur soluble secrete par les cellules endotheliales des vaisseaux sanguins, capable d'inhiber le recrutement des cellules perivasculaires du type musculaire lisse et ses applications
FR0301875 2003-02-17

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2004076482A1 true WO2004076482A1 (fr) 2004-09-10

Family

ID=32749612

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/FR2004/000355 WO2004076482A1 (fr) 2003-02-17 2004-02-17 Facteur soluble secrete par les cellules endotheliales des vaisseaux sanguins

Country Status (2)

Country Link
FR (1) FR2851249A1 (fr)
WO (1) WO2004076482A1 (fr)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005117968A2 (fr) * 2004-04-14 2005-12-15 Genentech, Inc. Compositions et methodes destinees a la modulation du developpement vasculaire
US7947278B2 (en) 2006-07-17 2011-05-24 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods of modulating angiogenesis
US10689427B2 (en) 2008-08-14 2020-06-23 Acceleron Pharma Inc. Combined use of GDF traps and erythropoietin receptor activators to increase red blood cell levels

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998057983A2 (fr) * 1997-06-18 1998-12-23 Zymogenetics, Inc. Proteine de mammifere de type facteur de croissance nerveuse
WO1999054437A2 (fr) * 1998-04-23 1999-10-28 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Nouvelles molecules de la famille des proteines liees a t125 et utilisations de celles-ci
WO2000053752A2 (fr) * 1999-03-08 2000-09-14 Genentech, Inc. Activation ou inhibition de l'angiogenese et de la cardiovascularisation
WO2001048192A1 (fr) * 1999-12-23 2001-07-05 Genesis Research & Development Corporation Limited Polynucleotides, polypeptides exprimes par les polynucleotides et procedes d'utilisation associes
US20020028508A1 (en) * 1998-04-23 2002-03-07 Holtzman Douglas A. Novel genes encoding proteins having prognostic, diagnostic, preventive , therapeutic and other uses

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998057983A2 (fr) * 1997-06-18 1998-12-23 Zymogenetics, Inc. Proteine de mammifere de type facteur de croissance nerveuse
WO1999054437A2 (fr) * 1998-04-23 1999-10-28 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Nouvelles molecules de la famille des proteines liees a t125 et utilisations de celles-ci
US20020028508A1 (en) * 1998-04-23 2002-03-07 Holtzman Douglas A. Novel genes encoding proteins having prognostic, diagnostic, preventive , therapeutic and other uses
WO2000053752A2 (fr) * 1999-03-08 2000-09-14 Genentech, Inc. Activation ou inhibition de l'angiogenese et de la cardiovascularisation
WO2001048192A1 (fr) * 1999-12-23 2001-07-05 Genesis Research & Development Corporation Limited Polynucleotides, polypeptides exprimes par les polynucleotides et procedes d'utilisation associes

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AITSEBAOMO J ET AL: "Vezf1/DB1 is an endothelial cell-specific transcription factor that regulates expression of the endothelin-1 promoter.", THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY. UNITED STATES 19 OCT 2001, vol. 276, no. 42, 19 October 2001 (2001-10-19), pages 39197 - 39205, XP002260902, ISSN: 0021-9258 *
XIONG J W ET AL: "Vezf1: A Zn finger transcription factor restricted to endothelial cells and their precursors.", DEVELOPMENTAL BIOLOGY. UNITED STATES 15 FEB 1999, vol. 206, no. 2, 15 February 1999 (1999-02-15), pages 123 - 141, XP002260901, ISSN: 0012-1606 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005117968A2 (fr) * 2004-04-14 2005-12-15 Genentech, Inc. Compositions et methodes destinees a la modulation du developpement vasculaire
WO2005117968A3 (fr) * 2004-04-14 2006-06-08 Genentech Inc Compositions et methodes destinees a la modulation du developpement vasculaire
US8790646B2 (en) 2004-04-14 2014-07-29 Genentech Inc. Compositions and methods for modulating vascular development
US7947278B2 (en) 2006-07-17 2011-05-24 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods of modulating angiogenesis
US10689427B2 (en) 2008-08-14 2020-06-23 Acceleron Pharma Inc. Combined use of GDF traps and erythropoietin receptor activators to increase red blood cell levels

Also Published As

Publication number Publication date
FR2851249A1 (fr) 2004-08-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7045302B2 (en) Expressed ligand-vascular intercellular signaling molecule
Nemer et al. Transcriptional activation of BMP-4 and regulation of mammalian organogenesis by GATA-4 and-6
US6379925B1 (en) Angiogenic modulation by notch signal transduction
Hermansand et al. Wnt signaling in cardiac disease
KR100404011B1 (ko) 세포-주기조절단백질및그것의사용방법
CZ20011608A3 (cs) Nukleotidové a proteinové sekvence genů Nogo a metody na nich zaloľené
WO1998057621A1 (fr) Modulation angiogenique par transduction du signal de notch
JP2011500075A (ja) Ｇｄｎｆのスプライスバリアントおよびその用途
JP2012246296A (ja) 血管形成及び心血管疾患の調節に使用する肝細胞成長因子の新規インヒビター
JP2004154140A (ja) 血管形成及び心血管新生の促進又は阻害
JP2003531811A5 (fr)
JP4792582B2 (ja) 心肥大及びそれに起因する心疾患を予防または治療するための医薬組成物
JP2002539827A (ja) 間質細胞由来のポリヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列
CN106661581A (zh) 新的samdori2基因及其用途
JP2003508011A (ja) ヒトｆｅｚ１遺伝子である新規ガン抑制遺伝子に関する組成物、キットおよび方法
WO1999002179A1 (fr) Gene axine et ses utilisations
WO2004076482A1 (fr) Facteur soluble secrete par les cellules endotheliales des vaisseaux sanguins
US6852515B1 (en) Stimulation of angiogenesis via enhanced endothelial expression of syndecan-4 core
Barton et al. Molecular biology of cardiac development and growth
WO1997035974A9 (fr) Sequences en amont du gene sm22, vecteurs les contenant et leurs utilisations therapeutiques, notamment dans le traitement des maladies vasculaires
CA2250099A1 (fr) Sequences en amont du gene sm22, vecteurs les contenant et leurs utilisations therapeutiques, notamment dans le traitement des maladies vasculaires
JP2004506595A (ja) 血管形成及び心臓血管新生の促進又は阻害
TWI291963B (en) Expression of zebrafish bone morphogenetic protein 4
EP1299539A1 (fr) Promoteur specifique du myocarde
US8969080B2 (en) Remedy for the treatment of cardio-vascular diseases or disorders

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): BW GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IT LU MC NL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
122 Ep: pct application non-entry in european phase