WO2001098768A1

WO2001098768A1 - Procede d'analyse electrophoretique

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Publication number: WO2001098768A1
Application number: PCT/JP2001/005213
Authority: WO
Inventors: Natsuki Ikuta; Takeshi Hirokawa
Original assignee: Japan Science And Technology Corporation
Priority date: 2000-06-20
Filing date: 2001-06-19
Publication date: 2001-12-27
Also published as: JP2002005886A; US20070044541A1; EP1312915A1; JP3709123B2; EP1312915A4

Description

明細電気泳動分析方法技術分野本発明は、電気泳動分析方法に係り、特に、キヤビラリ一電気泳動法を用いて、未知試料に標準物質を添加してそれぞれの泳動時間を変換して、未知試料の実効移動度を求めることにより、未知試料を高い精度で迅速に同定する電気泳動分析方法に関する。背景技術近年、各種溶液中に含まれる高分子、コロイド粒子等を同定する場合、溶液中で高分子やコロイド粒子が電位差に応じて移動（泳動）する現象、いわゆる電気泳動を利用した分析方法が普及している。高分子、コロイド粒子の溶液中での泳動速度は、溶液中の電解質の種類や濃度だけでなく、高分子、コロイド粒子自身の粒子の形及び大きさに影響される。このため、この電気泳動を利用した分析方法のひとつである、キヤビラリ一電気泳動（C Z E、 cap i l l ary zone e l ectroph ores i s) は、例えば、タンパク質等に含まれる D N A断片の長さを分析するための重要な分析方法として注目されている。

このキヤピラリー電気泳動分析方法には、溶液中の未知物質（未知試料）の定性指標として直接用いられるピークポジションの高い再現性が求められる。このキヤビラリー電気泳動による分析結果を、横軸に溶液中の未知試料による泳動時間、縦軸にピークポジシヨンをとる座標軸に基づいたフエ口グラムで表現する場合、再現性の良いピークポジションを得るためには、泳動電圧（電流）、分離チ W

2 ャン/く一の温度及び電気浸透流のコント口ールがそれぞれ重要なファクタ一となる。

この泳動電圧（電流）及び分離チャンバ一の温度は、分析する際の条件（例えば、キヤビラリ一の内径、支持電解液等）を同じにすることで、コントロールすることが十分可能である。一方、電気浸透流のコントロールは、ジュール熱によるセパレ一シヨンチューブの温度上昇が避けられないため、困難となる。このため、時間軸を持つ通常のキヤピラリー電気泳動フエログラムの分析再現性は、高速液体クロマトグラフィー（H P L C) ほど高くはない。

溶液中の未知試料の泳動時間の再現性を妨げる要因としては、例えば、電気浸透流の変化、電位勾配の緩和効果（R P G) 、高電圧の印加に伴って発生するジユール熱による温度上昇等が挙げられる。これらは複合的な要因で起こるためコントロールが難しく、異なる装置を用いて測定した場合、試料や支持電解液が同じであっても同じ泳動時間を得ることが困難となることが想定される。したがつて、異なる装置を使用した場合での測定結果を正しく比較するためには、電気泳動データの標準化が必要とる。

一方、 L e eらは、電気量、すなわち、電流の積分値をキヤビラリ一の断面積とキヤビラリ一全長で割った値を用いる泳動指標（M I、 Migrat ion Index) と、さらに浸透流の M Iを補正した調節泳動指標（A M I、 Adjusted Migrati on Index) を提案した（M I、 A M Iの単位は、明細書中、 jw CZm³とした）。

A M Iは、支持電解液が同じであれば、かなり良い定性指標になると考えられたが、 AM Iのパラメータのひとつに支持電解液の伝導度が含まれているため、わずかな組成の違い（例えば、 p Hはほぼ同じでもカウンタ一イオンが異なる場合等）で測定結果が異なってしまう。発明の開示

上述の事項を防止するためには、定性指標として、試料イオンと支持電解液の条件だけに依存する実効移動度を用いる電気泳動分析方法を提案すればよい。しかしながら、従来の泳動時間から実効移動度への変換法では、ジュール熱による移動度の変化や電位勾配の緩和効果が考慮されていない場合が多かった。

ここで、本発明に関連する技術について説明する。

本発明者らは、ジュール熱による移動度の変化や電位勾配の緩和効果を補正する方法として、未知試料に標準物質を添加して、キヤピラリー電気泳動を実行し、標準物質の泳動時間を求め、浸透流の速度が時間に対し直線的に変化すると仮定して、この標準物質の泳動時間から実効移動度に変換する方法を既に出願している（特願平 1 1一 2 5 1 6 0 4 ) 。

この方法は、試料の実効移動度の温度依存性（サンプルイオン自身の温度依存性と支持電解液への温度依存性）などを、厳密な物理現象と関連させて補正するものでなく、浸透流の速度が時間に対し直線的に変化すると仮定した仮想的な浸透流速度を用いるので、この直線的変化を表す実験式中の係数にすべての現象が含まれてしまい物理的な意味合いがあいまいになってしまうことが想定される。そこで、本発明者らは、再現性を低下させる三つの要因（泳動速度に影響するサンプルイオン自身の温度依存性、支持電解液への温度依存性、電位勾配の緩和効果に基づく泳動時間の遅れ）を、本来の物理的な現象として捉えると共に、これらの要因を理論的に取り除く方法を模索した。

本発明は、以上の点に鑑み、キヤピラリー電気泳動法を用いて、未知試料を同定するために重要な役割を果たす実効移動度を、高い精度で迅速に求めることを目的とする。

また、本発明は、分析装置の動作条件による実効移動度のばらつきをなくし、未知試料毎の標準指標としてのデータの信頼性を高めることを目的とする。また、本発明は、異なる分析装置で同じ指標を使用することを目的とする。

本発明の第 1の解決手段によると、

未知試料を含む試料に標準物質を添加すると共に、電気泳動による標準物質及び未知試料の泳動時間と、移動度 0の物質の泳動時間又はシステムピークの泳動時間を測定するステップと、

前記測定するステップによリ測定された、標準物質及び未知試料の泳動時間、移動度 0.の物質の泳動時間又はシステムピークの泳動時間と、標準物質の基準温度における既知の実効移動度に基づいて、未知試料の実効移動度を求めるステツプと

を含む電気泳動分析方法を提供する。

本発明の第 2の解決手段によると、

未知試料を含む試料に標準物質を添加すると共に、電気泳動による標準物質及び未知試料の泳動時間を測定するステップと、

前記測定するステップにより測定された、標準物質及び未知試料の泳動時間と、標準物質の基準温度における既知の実効移動度に基づいて、未知試料の実効移動度を求めるステップと

を含む電気泳動分析方法を提供する。図面の簡単な説明

図 1は、一般的なキヤビラリー電気泳動装置の概略構成図。

図 2は、本発明による電気泳動分析方法のフローチャート。

図 3は、本発明による泳動時間一実効移動度変換を適用しない実験により得られたフエログラム。

図 4は、式（8 ) を用いて移動度を算出した際のフエログラム。

図 5は、式（1 4 ) 及び（1 6 ) を用いて移動度を算出した際のフエログラム _c 図 6は、 M Iを横軸としたフエログラム。

図 7は、 A M Iを横軸としたフエログラム。

図 8は、実効移動度を横軸とした従来の分析方法によるフエ口グラム。

図 9は、実効移動度を横軸とした本発明者らが既に出願した分析方法によるフエログラム。

発明を実施するための最良の形態概要 1 - 1 . キヤビラリ- 電気泳動を用いた分析方法としては、 U字管電気泳動法、ァガロース電気泳動法、キヤピラリー電気泳動法等が知られている。本発明では、キヤピラリー電気泳動法を用いて、未知試料を同定するために重要な役割を果たす実効移動度を求めるため、まず、キヤピラリー電気泳動法についての概要を説明する。

キヤピラリー電気泳動は、水、有機溶媒を問わず、イオンの移動度の差により分離'分析する手法であり、液体クロマトグラフィ一法と比べて数段分離能が高く、近年非常に注目されている分析方法である。このキヤピラリー電気泳動は、何かの溶媒に溶け、電気を導通する事ができれば利用することができるので、分離する条件（溶媒、 _P H、添加剤等）さえ整えば、ほぼ Γ何でも j 分析することができる。但し、このキヤピラリー電気泳動は、そのままでは移動度の差がない中性物質や巨大分子などには適用されにくいため、これらの分離 ·分析には、他の電気泳動モードが用いられことが多い。

他の電気泳動法としては、例えば、中性分子の場合、ミセル動電クロマ卜グラフィ一（M E K C ) と呼ばれる方法が用いられ、巨大分子の場合には、電解液にゲルを添加するキヤビラリーゲル電気泳動法（C G E ) が用いられる。キヤビラリーゲル電気泳動法は、特に、ヒトゲノム計画のキーテクノロジーの一つで、塩基配列はこの手法を用いて決定されている。なお、本発明は、これらの電気泳動法にも適用可能な場合がある。

また、キヤピラリー電気泳動は、ゲノムプロジヱク卜の次の生化学研究の段階と考えられているプロテオーム（タンパクの機能'構造の特定）分析に対して有用と注目されており、特に、精密な移動度の決定ができれば、質量分析装置と組み合わせることで、タンパク質の研究に非常に有効な分析方法となることが幸 β告されている。さらに、廃液が大変少ないため（どんなに多くても数 m I ) 、環境への影響も考慮した分析方法といえる。

図"!は、一般的なキヤビラリ一電気泳動装置の概略構成図である。但し、分析対象は、試料内の陽イオンとし、この陽イオンの分析には、後述する間接吸収法を適用した。

このキヤビラリ'—電気泳動装置 1は、例えば、高圧電源部 2、バイアル 3、 4 W 01

6

、キヤピラリー 5、スリット 6、光源（例えば、 U Vランプ） 7、回折格子 8及びマルチチャンネルフォトダイオード 9を備える。高圧電源部 2は、例えば、出力 0〜3 0 k Vの高電圧電源であって、配線を介してバイアル 3、 4にそれぞれ接続されている。バイアル 3、 4は、図示しないターンテーブルや並進台上に載置されている。バイアル 3、 4には、 U V吸収のある適宜の支持電解液が注入される。また、バイアル 3には、分析するための U V吸収のない試料が導入される。キヤピラリー 5は、適宜の内径及び長さを有する管であり、キヤピラリー 5の一端はバイアル 3に揷入され、他端はバイアル 4に揷入されている。

キヤピラリー 5には、光源 7から照射される紫外線の幅を制限するための隙間を有するスリット 6が取り付けられている。このスリット 6を通過した光は、回折格子 8によって、適宜のスぺクトルに分解される。この得られたスぺクトルは、マルチチャンネルフォトダイオード 9によって、 U Vの吸光度として数値化される。なお、高圧電源部 2、バイアル 3、 4及びマルチチャンネルフォトダイォ —ド 9は、図示しないコンピュータにより制御されている。

キヤピラリー電気泳動装置 1の動作概要を説明する。

まず、支持電解液が注入されたバイアル 3と空のバイアル 4とをセッ卜する。バイアル 4を密封しバイアル 3に注入された支持電解液を吸引する。この吸引された支持電解液は、キヤピラリー 5内に満たされる。次に、例えば、落差法によリ、試料をキヤビラリ一 5の一端付近に注入する。具体的には、バイアル 4に支持電解液（水でもよい）、バイアル 3に試料を導入する。この際、バイアル 3の液面がバイアル 4の液面より高くなるように設定する。このバイアル 3、 4の液面差によるサイフォンの原理で、試料がバイアル 3からキヤビラリー 5の一端付近に注入される。次に、支持電解液が注入され、液面が同じ高さであるバイアル 3、 4をセットする。ここで、高圧電源部 2からの高電圧をキヤピラリー 5の両端に印加する。

試料は、キヤピラリー 5内を有効長（試料が導入されたキヤピラリー 5の一端付近からキヤビラリ一 5に沿ったスリット 6までの距離）だけ泳動する。この試料内の陽イオンの泳動方向は、図中矢印で示すように、バイアル 3からバイアル 4に向かっている。この間に、試料内の各陽イオンは、各陽イオンの泳動速度（実効移動度）の差により分離される。この泳動速度（実効移動度）の差により分離された試料は、上述した回折格子 8によって、一定時間ごとのスペクトルデータとして検出される。このスぺクトルデータは、上述したマルチチャンネルフォトダイオード 9によって、 UVの吸光度として数値化される。なお、ここでは、試料内の陽イオンを分析したが、陰イオンを分析する場合は、高圧電源部 2の符号を逆にすればよい。

また、試料をキヤピラリー 5の一端付近に注入する際、落差法を採用したが、これ以外の方法としては、例えば、吸引法、加圧法及び電気的加圧法が挙げられる。吸引法では、バイアル 3に試料を詰め、バイアル 4を空にする。つぎに、空のバイアル 4を密封し吸引することにより、試料をキヤピラリー 5内に注入する。加圧法では、バイアル 3に試料を詰め、バイアル 4を空にする。つぎに、バイアル 3を密封し加圧することにより、試料をキヤピラリー 5内に注入する。電気的注入法では、バイアル 3に試料を詰め、バイアル 4に電解液（水でも可）を詰める。つぎに、高電圧を印加することにより、試料をキヤピラリー 5内に注入する。

1 -2. 泳動時間一実効移動度変換法による実効移動度の算出

キヤピラリー電気泳動法における電気泳動現象と実効移動度の算出の概要を説明する。

従来の泳動時間一実効移動度変換法では、実効移動度 mは以下のようにして求められる。

m= V _{i on}/E = ( I /t -V _{B O f}) / (V/L) (1 )

ここで、 Vは印加電圧、 Eは電位勾配、 Iは有効長、 Lはキヤビラリ一全長、 V i。_nは未知試料の泳動速度、 tは未知試料が検出器によって検出されるまでの時間（泳動時間）である。

また、 z _e。_f (電気浸透流速度、 el ectroosmotic flow velocity) は、移動度 0の物質の泳動時間又はシステムピークの泳動時間 t _e。_fを用いて以下の式から得られる。

e_of= I Zt _e。_f (2)

すなわち、式（1) は次のようになる。 m= ( I — I Zt _e。 _f) Z (VZL) (1) '

システムピークとは、間接吸収法を用いたとき、電気浸透流によってキヤビラリー内の液体が流され、試料を導入した部分が検出器に到達した場合に出現する、あたかも何か物質があるかのようなピークをいう。したがって、システムピークの泳動時間 t _e。_fは、システムピークが出現するまでの時間をいう。また、間接吸収法とは、例えば、試料に UV (紫外線）の吸収がない場合、電解液に UV 吸収のある物質を用いると、試料の部分だけ電解液の物質が減少し、 UVの吸光度が低下することを利用した検出方法である。

また、電気浸透流とは、例えば、シリカキヤビラリ一を用いたとき、キヤビラリー内壁にあるシラノール基が解離することにより内壁が負に帯電し、キヤビラリ一内部にある溶液が見かけ上正に帯電することにより、電場を印加すると液体全体が負電極側に流れる現象をいう。この電気浸透流は、キヤビラリ一に他の物質を用いても、ほとんどの場合、発生する（但し、物質や電解液の組成により流れる向きが変わることもある）。また、移動度 0の泳動時間 t _e。_fは、電場の印加により、上述のように、電気浸透流のためにキヤピラリー内の液体全体が押し流されるため、移動度を持たないような（即ち、移動度 0) 物質（例えば、中性物質）でも検出器によって検出されるので、このような電場を印加してから検出されるまでの時間である。

ここで、温度による移動度の変化を詳しく検討すると、サンプルの実効移動度 mの温度依存性は、次式のように、サンプルイオン自身の項 f (丁）と支持電解液への温度依存性の項 g (Τ) =εΖη (ε ：誘電率， η ：粘性係数）とに分けて考えられる。

m= f (T) ■ g (T) (3)

この式を基準温度 Τ。の周リでティラー展開すると、次のようになる。

m= ( f 0+ f f ₂ΔΤ² + -) (8₀+_{β ι}ΔΤ + ₂厶 T² + ",)

(4)

但し、 ΔΤ = Τ— Τ₀, f 。= f (Τ₀) , g₀=g (T₀)

ここで、温度変化によるイオンサイズの変化は、溶媒の粘度や誘電率の温度依存性と比較して非常に小さいため、イオン自身への影響の温度依存性を無視すると、実効移動度 mは次式で表される。

m= f o (_{g o}+_{g l}AT + g₂厶 T²十…）

= f o So (1 +¾ ₀■ AT + g₂Zg₀■ ΔΤ²十…） (5)

ここで、 ΔΤが小さいところでは 2次以降の項を無視することができ、さらに、

f ₀g。 = m₀, _{β ι}Ζ_ε。=αと置き換えると、物質に依らず移動度は

m= 厶 T) - m₀ (6)

と表される。ここで、 m。は基準温度におけるサンプルの実効移動度を表し、はサンプルイオンに依存しない温度係数を表す。一般に、 25°Cにおける温度係数の値は約 0. 02 (例： K 0. 01 91、 L i 0. 0228) である < 1 -3. 温度係数のみを考慮した変換法

次に温度係数のみを考慮した変換法について説明する。

既知標準物質（実効移動度 m_s) の基準温度 T。における実効移動度 m₀, _s は、式（1) ' を用いて次のように求められる。

m₀, _s= ( l /t _s- l /t _{ao f}) / { (1 +αΔΤ) Ε}

さらに、式（6) よ Wm_sと m₀, _sの関係は次のようになっている。

1 +aAT=m_sZm₀, _s (7)

また、試料物質（実効移動度 m) の基準温度 T。における実効移動度 m。は式 (1) ' を用いて次のように求められる。

m₀= ( l /t - l /-t _eof) / { (1 +αΔΤ) Ε}

さらに、 mと m₀の関係は、式（6) から次のようになる。

1 + α厶 T =mZm。

これらの式から、温度 T。における試料物質（イオン）の実効移動度 m。は次式のように得られる。

m₀ = m/ (1 +αΔΤ) = ( I Zt— I Zt _e。_f) Z { (1 +αΔΤ) E]

= ί (t eof/t -1) / (t _eof/t _s-1) } - m₀, _s (8) この式（8) によれば、 E, V, I , しといつた装置に依存するパラメータが消去されることになリ、装置の条件に依存しない電気泳動データの標準化が可能となる。したがって、本実施の形態では、以上の理論を用いて、未知試料に標準物質を添加してそれぞれの泳動時間から移動度を測定し、その移動度の値から物質を同定するキヤピラリー電気泳動法において、まず、実効移動度が温度のみに影響される場合の補正方法として、移動度 0の物質の泳動時間又はシステムピークの泳動時間 t _e。 _f、標準物質の泳動時間 t _sおよび標準物質の基準温度 T。における実効移動度 m。， _sから未知物質の実効移動度 m ₀を式（8 ) を用いて求める。なお、式（8 ) に含まれるパラメータである m。. _sは、論文'既存データから決定される。また、 t _e。_fは、例えば、キヤピラリー内の電解液の濃度のむら等により測定される。さらに、 t _e。_f、 t及び t _sは、既存データ '実験値、又はだいたいの見積もり等から、どの検出ピークがどの物質に対応するのか当たリを付けることができるので、後述する実験より得られたフエログラムからそれぞれの泳動時間を決定できる。

1 - 4 . 温度及び時間補正を考慮した変換法

次に、温度だけでなく、時間補正も考慮した変換法について説明する。

一般に、電位勾配の緩和効果によリイオンの泳動時間はすべて一定時間だけ遅れるものと考えられる。この電位勾配の緩和効果は、本発明者らがシミュレーシヨンにより見出した現象である（ Chromatogr. A, 898 (1999) 19- 29)。具体的には、定電圧電源を用いてキヤビラリ一の両端に高電圧をかけた場合、試料を導入した部分の電位勾配の時間変化のために、キヤビラリ一を流れる電流がすぐには一定にならず、しばらく時間がたつてから一定になる。そのため、従来電気泳動を用いて移動度を決定するときに用いられる平均電位勾配（電圧/キヤピラリー全長）は、すぐには得られないため、従来の計算方法で予測される泳動時間よりも、ある一定時間遅れて検出される現象をいう（この遅延時間を、本明細書中、 τ と表す）。

ここで、電気浸透流が測定中一定であるとして、この電位勾配の緩和効果を考慮に入れると、サンプルイオンの実効移動度 mは次のように表される。

m = I { ( t 一て） E } — m _e。_f ( 9 )

ここで、 m _e。_fは浸透流の移動度、 i _e。_f Z Eである。すなわち、この移動度は、ジュール熱により上昇したキヤピラリー内温度におけるものを表している。この式を上記式（6) に代入すると、基準温度丁。における実効移動度 m。を求めることのできる次式を得る。

m₀= { I Z (t—て） E-m_{eo f}] Z (1 +ひ ΔΤ) (10)

しかしながら、パラメーターお、 m_e。_fおよび 1 +ひ ΔΤは未知数である。そこで、移動度が既知である標準試料（標準物質） A, Bおよび移動度 0の物質又はシステムピークの泳動時間 t _e。_fから、これらのパラメータ一を決定する。標準試料 A, Bおよびシステムピークの移動度は以下の式で表される。

m₀, _A= [ I / { ( t _A- r) E} 一 m。_of] Z (1 + 厶 T) (1 1 ) m₀, _B= [ I Z { ( t B- zr) E} — m_eof] ノ（1 + ΔΤ) (12) m_eof= I / { ( t _eof- r) E] (13)

ここで、 t_A、 t_Bは、標準物質 A、 Bの泳動時間 m。， _A、 m₀, _Bは、

標準物質 A、 Bの基準温度 T₀における実効移動度である。

式（1 1 ) ~ (13) から、次式が得られる。

て = im₀. _A t _A ( t _eof一 m 0, B ¹ B ( e o f Λ) 1 Ζ

A (t _e。_f一 t_B) — m₀ B (t _e。_f一 t _A) ) (14)

また、式（1 1) を変形して、次式が得られる。

1 +Of ΔΤ= [ Ι Ζ { ( t _A- r) Ε] -m_eof] /m₀, _Α (15)

さらに、式（13) (15) を式（10) に代入すると

m₀= i (t _A - r) (t _{eo f}- t) / (t- r) (t _eof-t _A) } - m 0, A (16)

となる。この式（16) によれば、 E、 V、 I、 Lといった装置に依存するパラメータ一が消去されることになリ、装置の条件に依存しない電気泳動データの標準化が可能となる。

したがって、本実施の形態では、実効移動度 m。が温度に影響されるのみならず電位勾配の緩和効果による泳動時間遅れの影響も受ける場合の補正方法として、移動度 0の物質の泳動時間又はシステムピークの泳動時間 t _e。_f、二つ以上の標準物質の泳動時間 t _A、 t _Bおよび該標準物質 φ基準温度 τ₀における実効移動度 m₀, _A、 m₀, _Bから、未知物質の実効移動度 m₀を式（14) 及び（

16) を用いて求める。なお、式（14) 及び（16) に含まれるパラメータである m₀. _A、 m₀, _Bは、論文■既存データから決定される。また、 t _eof 、 t及び t_A、 t_Bは、上述のように、例えば、既存データ '実験値又はだいたいの見積もり等から当たりを付け、物質との関係を把握することができるので、後述する実験より得られたフエログラムからそれぞれの泳動時間を決定できる。さらに、移動度 0の物質が添加できない、又は、システムピークを検出することができない（すなわち、 t _e。_fを特定できない）場合を考慮した変換法について説明する。まず、移動度が既知の標準物質 A、巳、 Cを試料に添加し、これらの泳動時間 t_A、 t_B、 t_cを測定することにより、必要なパラメータを決定する。

標準物質 A、 B、 Cの移動度は、上述したように次のように表される。

m 0, A' [ 1 { (t _A-r) E} ■m. _f3 / (1 + 厶 T) (1 1) m₀, _B= [ I { (t B- Γ ) El 一 m_eof] ノ（1 + 厶 T) (12) m₀. _c= [ \ { (t_c一て） E} -m_eof] / (1 +αΔΤ) (17) 式（1 1 ) (1 2) (17) から、次式が得られる。

て= im₀ A t A ( t _c- t _B) +m_{0 B} t _B ( t _A— t _c) +m_{0 c} t _c

(t _B- t_A) } /

{m₀ A ( t c— t _B) +m₀, B ( t _A— t _c) +m_{0 c} ( t _B— t _A) } (18)

1 +αΔΤ= Π ( t ； - t j) } / {E ( t , - Γ) ( t j—て）

ただし、 i、 jは A、 B、 Cのいずれかであり、かつ、 i≠ j

m_eof= I / { ( 一て） E} — m₀. ; (1 + ΔΤ) (20)

ただし、 iは A、 B、 Cのいずれかである。

このようにして得られたて、 1 + αΔΤ、 m_e。_fを式（10) に代入すると次式が得られる。

m₀= { (t i—t) (t j—て） (m₀, j-m₀, ,) } / { (t -2： )

(t「 t j) } +m₀, , (21)

ただし、 i、 jは、 A、 B、 Cのいずれかであって、かつ、 i≠ j ここで、 m_{o c}=0、 t _c= t _e。_f、 i =C、 j =Aとすると、式（14) 〜 (1 6) が得られる。

導出過程を以下に示す。

式（1 1) (1 2) (1 7) から、次式が得られる。

m_{eo f}= I / { (t _A-r) } — m₀. _A (1 +Qf ΔΤ) (1 1 ) '

m_{eo f}= I / { (t _B-r) } 一 m₀, _B (1 +ひ厶 T) (1 2) '

m_{eo f}= I / { (t _c—て） l 一 m₀, _c (1 +αΔΤ) (17) '

また、式（1 1 ) ' から式（1 2) ' および式（1 7) ' を引いて整理すると、次式が得られる。

(t _Α- Γ) (t _B—て） = { l (t _B- t _A) } / {Ε (1 +αΔΤ)

(m_{0 Α}— m_{0> Β}) } ( a )

( t _Α- Γ) ( t _c-r) = { I ( t _c— t _A) i Z tE 厶 T)

(m_{0 A}— m_{0 c}) } ( b )

さらに、（a) Z (b) から

( t _B—て） Z ( t _c— zr) = { ( t _B— t _A) (m₀, _A-m_{0i c}) }

{ (t _c一 t _A) (m₀, _A— m₀, _B) } =K (c)

とすると、次式が得られる。

て = (t _B— K t _c) / (1 -K) (c) '

ここで、 Γ の分子及び分母をそれぞれ整理すると、

ての分子 = t _Β— { (t _B- t _A) (m₀, _A-m₀, _c) t _c} /

t ( t _c— t _A) (m_{0i A}— m_{0 B}) }

= {m₀ A t _A ( t _c— t _B) +m_{0 B} t B ( _A— t _c) +m₀. _c t _c

( t B— t A) } Z t ( t _c~ t _A) (m_{0 A}— m_{0 B}) }

ての分母 = 1一 ί ( t _Β— t _Α) (m₀, _A-m₀, _c) } / { (t _c- t_A)

( ΠΓΊ Q 八一 m o _B ) }

= {m₀, A ( t c一 t B) +m₀, _B ( t A一 t _c) +m₀, _c ( t _B- t _A) } Z

{ ( t c一 t A) (m₀, _A一 m₀, B) }

となり、さらに、次式が得られる。

て = fm₀, A t A ( t _c— t _B) +m_{0 B} t _B ( t _A— t _c) +^mo. c * c ( t B— t A) } Z inn₀ A ( t _c— t _B) +m_{0 B} ( t _A— t _c) +m_{0 c}

(t _B- t _A) } (1 8)

また、式（a) もしくは（b) から、次式が得られる。

1 +αΔΤ= { I ( 一 t j) } / {E (t !—て） "）一て）

(m₀ i— m₀ j) ] (1 9)

また、式（1 1 ) ' (1 2) ' (1 7) ' のいずれかを使うことで、次式が得られる。

m_{eo f} = I / t (t i-r) } -m₀, (1 +α?ΔΤ) (20)

これにより、移動度 0の物質の泳動時間又はシステムピークの泳動時間 t _{eo f} を特定できない場合であっても、三つ以上の標準物質の泳動時間 t _A、 t _B、 t _c および該標準物質の基準温度 T。における実効移動度 m₀, _A、 m₀, _B、 m₀, _cから, 未知物質の実効移動度 m₀を式（1 8) 及び（21 ) を用いて求めることができる。但し、 m_{0 c}=0、 t _G= t _{eo f N} i =C、 j = Aとすると、式（1 4) と (1 8) 、式（1 6) と（21 ) は、それぞれ同等の式となるので、移動度 0の物質の泳動時間又はシステムピークの泳動時間 t _e。_fを特定できない場合での実験は、省略する。なお、式（1 8) 及び（21 ) に含まれるパラメータである m 0, A ^O, B ^M0 Cは、論文■既存データから決定される。また、 ·· A、セ

*_£：及び1は、上述のように、例えば、既存データ ■実験値又はだいたいの見積もり等から当たりを付け、物質との関係を把握することができるので、実験より得られたフエログラムからそれぞれの泳動時間を決定できる。

1一 5. 本発明による電気泳動分析方法の処理手順

図 2は、本発明による電気泳動分析方法のフローチャートである。なお、説明の便宜上、ここでのフローチヤ一卜の説明は、概略的なものとし、具体的な実験結果は後述する。

まず、未知物質（未知試料）を含む試料に標準物質を添加する（S 101 ) 。この標準物質を添加された未知試料を、キヤピラリー内に導入すると共に、上述したキヤピラリー電気泳動を実行する（S 103) 。つぎに、このキヤビラリ一電気泳動を実行することにより、上述 1—3で説明したように、実効移動度を求める際、温度による影響のみを考慮した場合、移動度 0の物質の泳動時間又はシステムピークの泳動時間 t _e。_f、標準物質の泳動時間 t _s及び未知試料の泳動時間 tが得られ、さらに、標準物質の基準温度 T。における既知の実効移動度 m。 _sを得る（S 1 05) 。これらのパラメータ値と式（8) に基づいて、未知試料の実効移動度 m₀を算出する（S 107) 。なお、この算出された未知試料の実効移動度 m。に基づいて、未知試料の物質の同定を行ってもよい（S 1 09 また、上述 1一 4で説明したように、実効移動度を求める際、温度だけでなく電位勾配の緩和効果による泳動時間遅れの影響も考慮した場合、移動度 0の物質の泳動時間又はシステムピークの泳動時間 t _e。_f、二つ以上の標準物質の泳動時間 t_A、 t _B及び未知試料の泳動時間 tが得られ、さらに、該標準物質の基準温度 T。における既知の実効移動度 m₀, _A、 m₀, _Bを得る（S 105) 。これらのパラメータ値と式（1 4) 及び（1 6) に基づいて、未知試料の実効移動度 m。を算出する（S 1 07) 。なお、この算出された未知試料の実効移動度 m₀に基づいて、未知試料の物質の同定を行ってもよい（S 109) 。

2. 実験および比較

2-1. 実験方法

ここで、発明した方法の有効性を検証するために利用したキヤビラリ一電気泳動装置には、内径（ I . D. ) 75 «mおよび 50 im、全長 4 O cm (有効長 27. 5 cm) とする、キヤビラリ一が備えられている。このキヤビラリ一は、設定温度 25°Cであり、 1 5 kVおよび 30 kVの電圧が印加される。さらに、波長を検出するために（座標軸上に測定結果を載せるために）、 265 nmの 3 , 5 -ルチジンの吸収を測定する間接吸収法を採用した。

試料は、 KC I , L i C I , TR I S (トリヒドロキシメチルァミノメタン、 Hydroxymethyl Am i nomethan) , ε—アミノカプロン酸とォクチルスルホン酸ナトリウム 3 OmMおよび 0. 3 mMの等モル混合試料を用いた。この 30 mM, 0. 3 mMの等モル試料は、それぞれ上述した落差法（2 cm 1 5 s) , (2 cm 75 s) を用いて注入した。支持電解液は、 20mM3, 5ルチジンに H C Iを加えて pH 6. 0に調節した溶液（支持電解液 A： S E2 OmM) と、 4 0mM3, 5 -ルチジンに酢酸を用いて p H 6. 0に調節した溶液（支持電解液 B : S E 4 OmM) を用いた。

2-2. 本発明による泳動時間一実効移動度変換を適用しない状態での実験図 3は、本発明による泳動時間一実効移動度変換を適用しない実験により得られたフエログラムを示す。フエログラムは、上から順に

(A) sample 3 OmM, S E 2 OmM (支持電解液 A) ， I . D. 75 j« m, V= 30 k V

(B) sample 3 OmM, S E 4 OmM (支持電解液 B) , I . D. 75 m, V= 30 k V

(C) sample 3 OmM, S E 40 mlVl (支持電解液 B) ， I . D. 50 jU m, V=30 k V

(D) sample 3 OmM, S E 4 OmM (支持電解液 B) ， I . D. 50 flm, V= 1 5 k V

(E) sample 3 OmM, S E 4 OmM (支持電解液 B) , I . D. 75 m, V= 1 5 k V

(F) sample 0. 3mM, S E 4 OmM (支持電解液 B) , I . D. 75 , V = 1 5 k V

の条件で測定して得られた。また、（C) では新しいキヤピラリーを内壁の処理なしで用い、それ以外の実験では、何度か測定に用いたキヤピラリーを用いた。表 1に泳動時間の測定結果（単位：秒）を示す。

表 1

K N a L i T r i s EOF

(A) 22.36 27.65 31.52 38.91 58.4

(B) 17.84 21.28 23.88 27.24 41.44

(0 35.32 48.42 59.93 82.1 233.3

(D) 72.29 94.99 112.76 147.3 260.8

(E) 57.72 74.15 86.22 102.64 176.1

(F) 61.58 77.52 89.59 107.46 185.71 したがって、ピークは、左から順に K+, N a⁺, L i +， TR I S, ε—ァミノカブロン酸，システムピーク，ォクチルスルホン酸である。同じ試料'電解液でも、このように実験条件を変化させることによリ様々なフエログラムが得られることがわかる。したがって、上述したように、異なる装置を使えば、このように泳動時間の異なるフエログラムしか得られないことになる。このため、多数の未知試料を同時に測定するには、上述したような同じ物質が同じ定性指標を示すような標準化法が有効となる。

2-3. 本発明による式（8) を用いた泳動時間一実効移動度変換の実験図 4は、式（8) を用いて移動度を算出（S 1 0 1〜S 1 07を実行）した際のフエログラムである。

ピークは、左から順に K⁺， N a⁺, L i ⁺， TR I Sである。また、図中の実線は標準試料として用いた L iの 25°Cでの既報値 34. 9 (式（8) の m。， _s) である。点線は左から K、 N a、 TR I Sの 25°Cでの既報値であり、それぞれ 69. 9、 46. 3、 24. 4である。この実験により、データのばらつきが大きく改善され、 N a、 L ί、 T r i sの移動度のそれぞれの平均（相対標準偏差）は、 66. 6 (3. 60%) 、 45. 7 ( 1 - 1 6 %) 、 22. 6 (8. 07%) であった。また、これの平均（相対標準偏差）は、既報値の値から 4. 74%、 1. 37%、 7. 49%のずれであった。特に、最も電力が小さく、内径が細く印加電圧の低いサンプル（D) では、 K, N aの移動度は、既幸艮値と 0. 930/₀、 0. 08%のずれしか生じなかった。しかしながら、他のデータは、 Kの移動度が既報値より小さく見積もられた。

すなわち、これは電位勾配の緩和効果による遅延時間てを考慮に入れていないため、泳動時間の小さな Kの誤差が相対的にやや大きくなつたと考えられる。例えば、移動度の小さな N aでは、その影響が小さくなつた。

2-4. 本発明による式（1 6) を用いた泳動時間一実効移動度変換の実験図 5は、式（ 1 4) 及び（1 6) を用いて移動度を算出（S 1 01〜S 1 07 を実行）した際のフエログラムである。

ピークは、左から順に K +， N a⁺, L i +, TR 1 Sである。また、図中の実線は、標準試料として用いた K、し iの 25°Cでの既報値であり、それぞれ 6 9. 9 (式（1 4) および（1 6) 中の m₀, _A) 、 34. 9 (式（14) および（1 6) 中の m_{0 B}) である。図中の点線は、左から N a、 T r i 5の25 °Cでの既報値であり、それぞれ 46. 3、 24. 4である。この実験によリデ一タのばらつきが顕著に改善された。 Na、 TR I Sの移動度の平均（相対標準偏差）は 46. 4 (0. 30%) 、 22. 2 (7. 68%) であった。また、これらは既報値の値から 0. 290/6、 9. 1 7%のずれであった。なお、 TR I Sの大きなずれは、テ一リングを起こしているためである。一方、 N aについては、移動度のばらっきを 0. 3 %以下にすることが可能であることが示された。また、参照温度での実効移動度に変換することが可能なため、例えば、伝導度法のような他の方法で求められた実効移動度と比較することが可能になリ、データの汎用性を向上させることができる。

3. 従来との比較

3— 1. 泳動指標（M I、 Migration Index) を用いた実験

図 6は、 M Iを横軸としたフエログラムである。

上述のように、 L e eらが提案した電気量、すなわち電流の積分値をキヤビラリーの断面積とキヤビラリ一全長で割った値を用いる、 M lを用いた場合、図 3 で示したフエログラムで、全く異なった泳動時間でピークが出ていた（B)

(D) (E) (F) が M 1で整理することにより、比較的良い一致を示した（ピ —クは、図 3と同様に、左から順に K+, N a+, L i +, TR I Sである）。しかしながら、支持電解液が異なる（A) や浸透流の速度が大きく異なる（C) では、大きく異なる M Iにピークが現れた。

すなわち、この M Iを用いたフエログラムは、 M Iでは温度の影響を除去することができるが、電解液の性質や浸透流の影響までは十分に除去できないことを示している。

3-2. 調節泳動指標（AMI、 Adjusted Migration Index) を用いた実験図 7は、 AM Iを横軸としたフエログラムである。

M lに対して、さらに浸透流の影響を考慮した AM Iを用いた場合では、同じ支持電解液を用いた（B) 〜（F) では、比較的良い一致を示している。図中の点線は、（B) 〜（F) のそれぞれの物質のピーク位置の平均値を示している。この点線を指標に AM Iの値を詳しく調べてみると、相対標準偏差（RSD) は 4. 83% (K) , 3. 77 % ( N a ) , 4. 70% (L i ) , 7. 08%

(T r i s) とばらついている。さらに、移動度がほぼ同じであるにもかかわらず、（A) では全く異なるフエログラムであった。この差は、支持電解液の伝導度が異なるために生じたものである。

すなわち、この AM〖を用いたフエログラムは、温度と浸透流の影響を除去することができるが、電解液の性質やまでは十分に除去できないことを示している, 3-3. 実効移動度を横軸とした従来の分析方法による実験

図 8は、実効移動度を横軸とした従来の分析方法によるフエログラムを示す。この従来の分析方法では、泳動時間から速度を求め、その速度から浸透流の速度との差を求め、その差を印加した電圧で割り、さらに、キヤビラリ一の全長をかけることで、実効移動度を算出する。この実効移動度を横軸としたフ Iログラ厶では、ピークは、左から順に K+， Na+, し ί +, TR I Sである。また、図中の点線は左から K、 N a、 L i、 T r i s、の 25 °Cでの既報値であり、それぞれ 69. 9、 46. 3、 34. 9、 24. 4である。それぞれのピークの移動度は大きくばらついておリ、 K、 Na、 L i、 T r i s、の移動度の平均（相対標準偏差）は、 90. フ（1 7. 50/₀) 、 62. 5 (1 9. 9 ) , 47. 8 (21. 0%) , 31. 1 (26. 0%) であった。

さらに詳しく考察すると、印加電圧 30 k Vの（A) 〜（C) は、 1 5 kVの (D) - (F) と比較して実効移動度が大きく見積もられている。これは系内で発生する電力が大きく、内部の温度が上昇しているため、実効移動度が大きくな³ つたことによる。特に、内径が太く濃い支持電解液を用いた（B) では、その傾向が顕著であった。さらに、既報値と比較してもすべての物質の移動度が大きく見積もられた。

このように、高電圧を印加するキヤピラリー電気泳動を用いて、再現性のあるデータを得るためには、上述の本実施の形態ような、内部温度の上昇を補正するためのデータ処理方法が有効となる。

3-4. 実効移動度を横軸とした本発明者らが既に出願した分析方法による実験図 9は、実効移動度を横軸とした本発明者らが既に出願した分析方法（特願平 1 1 -251 604) によるフエログラムを示す。

この分析方法によって算出した実効移動度を横軸としたフエログラムでは、ピークは、左から順に K+, N a+, L i +, TR I Sである。また、図中の実線は標準試料として用いた K、 L i、の 25°Cでの既報値であり、それぞれ 69. 9、 34. 9である。図中の点線は左から Na、 T r i sの 25°Cでの既報値であり、それぞれ 46. 3、 24. 4である。この実験によれば、データのばらつきが大きく改善され、 N a， T r i sの移動度の平均（相対標準偏差）は、 46 . 9 ( 1. 050/0) 、 _{2 1} 8 (8. 1 1 %) であった。また、これらは既報値の値から 0. 64%、 1 0. 7%のずれであった。なお、 TR I Sの泳動時間の評価は、テールを引いているために困難であると M i k k e r sらが報告しているとおり、 T r i sの移動度は既報値と大きくずれたが、 N aは、既報値とほぼ一致した。

これにより、この方法は、非常に有用な方法であるが、上述のように物理的な意味合いがあいまいなとなってしまう場合が想定される。

以上、本実施の形態による式（8) 、 (1 4) 及び（16) を用いた泳動時間一実効移動度変換の実験と、従来の方法である、 M I及び AM Iを用いた実験、実効移動度を横軸とした従来の分析方法による実験及び本発明者らが既に出願した分析方法による実験とを、比較することにより、キヤビラリ一電気泳動により測定したデータを、本実施の形態による処理を施せば、混合物中の未知試料のある参照温度での実効移動度が迅速かつ正確に求めることができる。

また、本実施の形態では、一つの装置でもその動作条件によって異なっていた実効移動度のばらつきをなくし、物質毎に標準指標としてのデータの蓄積ができる。また、異なる装置で同じ指標が使用できるため、これらのデータベースの蓄積が進めば、将来未知物質を同定する際、非常に迅速かつ正確な分析が期待される。

産業上の利用可能性本発明によると、以上説明した通り、キヤビラリ一電気泳動法を用いて、未知試料を同定するために重要な役割を果たす実効移動度を、高い精度で迅速に求めることができる。また、本発明によれば、分析装置の動作条件による実効移動度のばらつきをなくし、未知試料毎の標準指標としてのデータの信頼性を高めることができる。また、本発明によれば、異なる分析装置で同じ指標を使用することができる。

Claims

1. 未知試料を含む試料に標準物質を添加すると共に、電気泳動による標準物質及び未知試料の泳動時間と、移動度 0の物質の泳動時間又はシステムピークの泳動時間を測定するステップと、

青

前記測定するステップによリ測定された、標準物質及び未知試料の泳動時間、移動度 0の物質の泳動時間又はシステムピークの泳動時間と、標準物質の基準温度における既知の実効移動度に基づいての、未知試料の実効移動度を求めるステツプと

を含む電気泳動分析方法。囲

2. 前記未知試料の実効移動度を求めるステップは、

未知試料の実効移動度 m。を、標準物質の泳動時間 t _s、未知試料の泳動時間 t、移動度 0の物質の泳動時間又はシステムピークの泳動時間 t _e。_f、及び、標準物質の基準温度における実効移動度 m。. _sに基づいて、次式、

m₀= { (t _eof/t - 1) / (t _eof/t _s-1) } - m₀,

を用いて求めるようにした請求項 1に記載の電気泳動分析方法。

3. 前記未知試料の実効移動度を求めるステップは、

2つ以上の標準物質の泳動時間、未知試料の泳動時間、移動度 0の物質の泳動時間又はシステムピークの泳動時間、及び、該標準物質の基準温度における実効移動度に基づいて、未知試料の実効移動度を求めるようにした請求項 1に記載の電気泳動分析方法。

4. 前記未知試料の実効移動度を求めるステップは、

未知試料の実効移動度 m₀を、 2つ以上の標準物質のうち任意の 2つの物質の泳動時間 t A, t _B、未知試料の泳動時間 t、移動度 0の物質の泳動時間又はシステムピークの泳動時間 t _e。_f、及び、該標準物質の基準温度における実効移動度に基づいて、次式、

m₀= { ( t _A—て）（ t _e。_f一 t ) / ( t一て）（ t e。_f — t _A) } ■ m₀, て = {^0, t (t _e。_f一 t _B) -m₀ t (t _e。_f— t_A) I Z

(^mo. ( t _B) -m_0i (t _e。_f— t _A) 1

を用いて求めるようにした請求項 3に記載の電気泳動分析方法。

5. 未知試料の実効移動度から未知試料の物質を同定するステップをさらに含む請求項 1乃至 4のいずれかに記載の電気泳動分析方法。

6. 未知試料を含む試料に標準物質を添加すると共に、電気泳動による標準物質及び未知試料の泳動時間を測定するステップと、

前記測定するステップによリ測定された、標準物質及び未知試料の泳動時間と

、標準物質の基準温度における既知の実効移動度に基づいて、未知試料の実効移動度を求めるステップと

を含む電気泳動分析方法。

7. 前記未知試料の実効移動度を求めるステツプは、

未知試料の実効移動度 m。を、 3つ以上の標準物質のうち任意の 3つの物質の泳動時間 t_A、 t _B、 t _c、未知試料の泳動時間 t、及び、該標準物質の基準温度における実効移動度 m。， _A、 m₀, _B、 m。， _cに基づいて、次式、

m₀= { ( t , - t ) ( t ；一て）（m₀ j— m₀, ·, ) } / { ( t—て）

( t i一 t j ) } +m₀, .,

ただし、 i、 jは、標準物質 A、 B、 Cのいずれかであって、かつ、 i≠ j て = t ( t _c一 t _B) +m₀, t ( t 一 t _c) +m₀, _c t _c

( t _B— t _A) } / {m₀, ( t _c- t _B) +m₀, _B ( t _A- t _c) +m₀, _c

(t _B~ t _A) }

を用いて求めるようにした請求項 6に記載の電気泳動分析方法。