WO2001098347A1

WO2001098347A1 - Facteur de croissance des cellules hepatiques canines

Info

Publication number: WO2001098347A1
Application number: PCT/JP2001/005362
Authority: WO
Inventors: Masashi Miyake; Shigehiro Iwabuchi; Yasuyuki Suzuta
Original assignee: Nippon Zenyaku Kogyo Ltd.
Priority date: 2000-06-22
Filing date: 2001-06-22
Publication date: 2001-12-27
Also published as: CA2413754C; EP1293511A4; US7129064B2; AU7459101A; US20030170685A1; EP1293511A1; AU2001274591B2; CA2413754A1; NZ523221A

Description

明細書

ィヌ肝細胞増殖因子技術分野

本発明は、ィヌ肝細胞増殖因子およびその 5アミノ酸欠失型ィヌ肝細胞増殖因子ならびにこれらをコードする遺伝子に関する。背景技術

ヒト肝細胞増殖因子（hepatocyte growth factor、以下「HGF」という）は、肝再生因子として精製され、それをコードする遺伝子もクローユングされ、その配列が決定されている。 HGF は、当初は肝細胞の増殖にのみ機能すると考えられていたが、その後の研究により肝細胞の増殖、再生のみならず、肺、腎臓、血管、心臓組織に対して、強い損傷防御、器官再生効果をもたらすことが明らかにされている。さらに、 HGFは、ある種のガンに対しては強力な抗ガン作用を示すなど、非常に多彩な機能を有する。

各種培養細胞を用いた研究から、 HGF は、増殖促進因子、運動性促進因子、形態形成促進因子、腫瘍抑制因子として機能することが明らかにされている。また、肝障害に応答して肺や腎臓などの臓器においても HGFの発現が高まり、血液を介した機構によっても肝再生は促進される。腎臓、肺などの他の臓器においても、同様な機構によって再生が促進されることが確認されている。これらの機能は、いずれも、組織、器官の構築およびその維持に必須な生物活性であり、根本的な治療法が確立されていない難治性臓器疾患に対する特効薬としてその臨床応用が期待されている。また、 HGF遺伝子を用いる、糖尿病患者の慢性閉塞性動脈硬化症に対する遺伝子治療が試みられようとしている。

HGFには、選択的スプライシングによる多くの変異体の存在が報告されている。中でも、受容体結合部位に相当する第 1クリングルドメイン内の 1 5塩基対の欠失、すなわち 5アミノ酸が欠失した変異型 HGFは、通常の HGFと比較し、上皮系細胞に対する増殖活性が 2〜 3倍高く、異なる生理作用を有することが明らかになっている。この 1 5塩基対欠失型の HGFは，上皮組織の傷害を主体とする疾患に対して、より高い治療効果が望まれる。

HGF による肝臓組織再生機構を詳述すると、様々な肝障害を伴い、肝臓のクッパー細胞、類洞内皮細胞などの間質細胞において HGF mRNAの発現が速やかに誘導される。間質細胞から、産生、分泌された HGFは、肝細胞ゃ胆管細胞などの上皮細胞に作用し、肝再生を促す。組換え型 HGFを疾患モデル動物に投与する実験により、多くの臓器障害に対する再生効果が報告されている。現在までに、肝臓 (肝硬変、肝炎、肝脂肪など）、腎臓（急性および慢性腎不全）、肺、心臓、胃など多くの組織において、組織再生が報告されている。

ヒト HGF遺伝子（以下「hHGF」という）の全長は約 7 0 k bにも及び、その転写産物である mRNA の全長は約 6 k b、そのうちタンパク質をコードしている領域は約 2 . 2 k bである。ヒト HGFは、最初 7 2 8アミノ酸からなる 1本のプレプロ HGF として合成され、 N末端の 3 1アミノ酸が切断された後に、 4 9 4番目の Argと 4 9 5番目の Valとの間がプロテアーゼによって切断され、ひ鎖と /3鎖が 1本のジフルフィド結合で結ばれた成熟分子となる。

現在までに、ヒト、マウス、ラットなどの HGF遺伝子がクローニングされその塩基配列が決定されている。

近年のペットの高齢化傾向により、ィヌの萎縮性、退行性をはじめとする各種加齢に伴う疾患の増加が問題となっており、その治癒に組織再生が必要な疾患を対象とした医薬品開発が重要なターゲットととして考えられている。また、これらの疾患は通常慢性化することが多い。慢性疾患に対する治療では、長期に渡つて薬剤を投与する必要があるため、種を超えて組み換え HGFタンパク質を投与することによって抗原性の問題から長期の投与ができない可能性が考えられる。したがって、ィヌのこれら慢性疾患の治療薬として抗原性の問題がなく長期間投与可能な組換ぇィヌ HGFの必要性が存在する。発明の開示

本発明は、ィヌ肝細胞増殖因子およびその 1 5塩基対欠失型、該ィヌ肝細胞増殖因子およびその 1 5塩基対欠失型肝細胞増殖因子をコードする遺伝子を提供することを目的とする。本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、 RT— PCR法を用い、ィヌ肝細胞増殖因子遺伝子配列を決定することに成功し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、以下の（a)又は（b)の組換えタンパク質である。

(a) 配列番号 2または 4で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質

(b) 配列番号 2または 4で表わされるアミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつィヌ肝細胞増殖因子活性を有するタンパク質

さらに、本発明は、以下の（a)又は（b)のタンパク質をコードする遺伝子である。

(a) 配列番号 2または 4で表わされるァミノ酸配列からなるタンパク質

さらに、本発明は、以下の（c)又は（d)の DNAを含む遺伝子である。

( c) 配列番号 1または 3で表される塩基配列を含む DNA

(d) 配列番号 1または 3の塩基配列を含む DNAとストリンジェントな条件下でハイブリイダズし、かつィヌ肝細胞増殖因子活性を有するタンパク質をコードする DNA

さらに、本発明は、上記遺伝子を含有する組換えベクターである。

さらに、本発明は、上記組換えベクターを含む形質転換体である。

さらに、本発明は、上記形質転換体を培養し、得られる培養物からィヌ肝細胞増殖因子を採取することを特徴とするィヌ肝細胞増殖因子の製造方法である。

さらに、本発明は、前記遺伝子の少なくとも一部の断片を含むィヌ肝細胞増殖因子の検出用試薬である。

さらに、本発明は、上記組換えィヌ肝細胞増殖因子を含有する医薬組成物であり、上記医薬組成物は、肝疾患、腎疾患、肺疾患、骨疾患、消化器疾患、心臓循環器疾患または脳神経系疾患治療用である。

本明細書は，本願の優先権の基礎である日本国特願 2 0 0 0— 1 8 7 7 2 4の明細書および Zまたは図面に記載されている内容を包含する。発明を実施するための最良の形態

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明は、損傷を受けた臓器に対して強い再生能力を示し、根本的治療法が確立されていない難治性臓器疾患に対する臨床的応用が期待されているィヌ肝細胞増殖因子（Canine HGF ;以下 c HGF) をコードする遺伝子、組換え c H G F、該遺伝子を含有する組換えベクター、該組換えベクターを含む形質転換体、該 c H G Fの製造法、該 cHGFの検出法および該 c HGFを含有する医薬組成物に関するものである。また，通常の HGFと比較し、上皮系細胞に対する増殖活性が 2〜 3倍高く、異なる生理作用を有することが知られている，受容体結合部位に相当する第 1タリングルドメイン内の 1 5塩基対の欠失、すなわち 5アミノ酸が欠失した変異型ィヌ HGF (dcHGF) である。

本発明者らは、 RNAを抽出 ·精製し、 HGFに特異的と考えられるいくつかのブライマ一を設計し、 RT— PCRを行い、いくつかの DNA断片を得た。この得られた複数の DNA断片をプラスミドベクターにクローニングし、塩基配列を決定した。決定された塩基配列をもとに、各 DNA断片の重複する部分を除いた、目的のィヌ HGF 遺伝子配列を決定した。また，選択的スプライシングによる 1 5塩基対欠失型のィヌ HGFを単離し，塩基配列を決定した。本発明の遺伝子は、この方法により目的の遺伝子配列を決定したものである。

1 . 本発明の遺伝子のクローユング

(1) RT— PCRによる cDNAクローンの作製

mRNAの供給源としては、ィヌの肝臓、腎臓、肺、脳、胸腺、白血球などの組織が挙げられる。 mRNAの調製は、通常行われる手法により行うことができる。例えば、上記組織又は細胞から、グァニジゥムチオシァネ一ト -フエノール法などにより全 RNAを抽出した後、オリゴ dT-セルロースやポリ U-セファロース等を用いたァフィ二ティーカラム法、あるいはパッチ法によりポリ（A)+RNA(mRNA)を得ることができる。さらに、ショ糖密度勾配遠心法等によりポリ（A)+RNA をさらに分画してもよい。

このようにして得られた mRNAを鏺型として、オリゴ dTプライマー及ぴ逆転写酵素を用いて一本鎮 cDNAを合成する。自的の DNA配列を含むクローンを得るためには、例えば、既に取得されている肝細胞増殖因子タンパク質ファミリーのアミノ酸配列に対応する縮重センスプライマー及び縮重ァンチセンスプライマーを合成し、これを用いて PCRを行い、得られた断片を適当なクローニングベクターに組み込んで組換えベクターを作製する。そしてこの組換えベクターを用いて大腸菌等を形質転換し、テトラサイクリン耐性、アンピシリン耐性等を指標として形質転換体を選択することにより、 c HGFおよび dcHGF遺伝子の一部又は全長の配列を含むクローンを得ることができる。伹し、本発明においてはこれらのプライマーに限定されるものではない。

ここで、大腸菌の形質転換は、 Hanahanの方法 [Hanahan，D.： J. Mol. Biol. 166： 557-580(1983)] , すなわち塩化カルシウム、塩化マグネシウム又は塩化ルビジゥムを共存させて調製したコンビテント細胞に、組換えべクタ一を加える方法等により行うことができる。なお、ベクターとしてプラスミドを用いる場合はテトラサイクリン、アンピシリン等の薬剤耐性遺伝子を含有することが必要である。また、プラスミド以外のクローニングベクタ一、例えば； Iファージ ( ^ gtll 等）を用いることもできる。

(2) DNA断片の塩基配列の決定

上記 DNA断片を含む単一の又は複数の単離クローンについて、 PCR産物をテンプレートにして塩基配列を決定する。塩基配列の決定はマキサム-ギルパートの化学修飾法、又は M13ファージを用いるジデォキシヌクレオチド鎖終結法等の公知手法により行うことができるが、通常は自動塩基配列決定機（例えば Applied Biosystems社製 Model 310蛍光シークェンサ一等）を用いて配列決定が行われる。上記の方法によって得られた、単一又は複数の c H G F由来の DNA断片または，単一又は複数の d c H G F由来の DNA断片の塩基配列情報をもとに、重複する部分を除くことで目的の cHGFまたは dcHGFの塩基配列を決定する。

配列番号 1に本発明のィヌ肝細胞増殖因子遺伝子の塩基配列を、配列番号 2に本発明のィヌ肝細胞増殖因子のアミノ酸配列を，配列番号 3に本発明の 1 5塩基対欠失型ィヌ肝細胞増殖因子遺伝子の塩基配列を、配列番号 4に本発明の 5アミノ酸欠失型ィヌ肝細胞増殖因子のァミノ酸配列をそれぞれ例示するが、このアミノ酸配列からなるタンパク質がィヌ肝細胞増殖因子活性を有する限り、当該アミノ酸配列において少なくとも 1個、好ましくは 1若しくは数個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じてもよい。

例えば、配列番号 2または 4で表されるアミノ酸配列の少なくとも 1個、好ましくは 1又は数個（例えば 1〜10個、さらに好ましくは 1〜5個）のアミノ酸が欠失してもよく、配列番号 2または 4で表わされるアミノ酸配列に少なくとも 1 個、好ましくは 1又は数個（例えば 1〜10個、さらに好ましくは 1〜5個）のァミノ酸が付加してもよく、あるいは、配列番号 2または 4で表されるアミノ酸配列の少なくとも 1個、好ましくは 1又は数個（例えば 1〜10個、さらに好ましくは 1〜5個）のアミノ酸が他のアミノ酸に置換してもよい。

また、上記遺伝子と下記の条件下でハイプリダイズすることができる DNAであつてィヌ肝細胞増殖因子活性を有するタンパク質をコードする DNAも本発明の遺伝子に含まれる。すなわち、 DNA を固定したフィルターを用いて、 0. 7〜： L 0M の NaCl 存在下、 68°Cでハイブリダイゼーションを行った後、 0.：！〜 2倍濃度の SSC 溶液（1倍濃度の SSCとは 150mM NaCl、 15mMクェン酸ナトリウムからなる）を用い、 68°Cで洗浄することにより同定することができる条件をいう。

さらに、上記 DNAに対する RNA、又は該 RNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる RNAであってィヌ肝細胞増殖因子活性を有するタンパク質をコードする RNAも本発明に含まれる。

なお、遺伝子に変異を導入するには、 Kunkel 法や Gapped duplex法等の公知の手法又はこれに準ずる方法により、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えば Mutant- K(TAKARA社製）や Mutant- G(TAKARA社製））などを用いて、あるいは、 TAKARA社の LA PCR in vitro Mutagenesis シリーズキットを用いて行うことができる。

本発明の遺伝子は、ィヌ肝細胞増殖因子のアミノ酸配列または， 1 5塩基対欠失型ィヌ肝細胞増殖因子のアミノ酸配列に対応する塩基配列を有している。

ー且本発明の遺伝子の塩基配列が確定されると、その後は化学合成によって、又は cDNAを铸型とした PCRによって、あるいは該塩基配列を有する DNA断片をプローブとしてハイブリダイズさせることにより、本発明の遺伝子を得ることができる。

2 . 組換えベクター及び形質転換体の作製

(1) 組換えベクターの作製

本発明の組換えベクターは、適当なベクターに本発明の遺伝子を連結 (挿入）することにより得ることができる。本発明の遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミド DNA、ファージ DNA等が挙げられる。

プラスミド DNAとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えば pBR322， _PBR325, PUC118, pUC119, pUC18， pUC19等）、枯草菌由来のプラスミド（例えば pUBllO , _PTP5 等）、酵母由来のプラスミド（例えば YEpl3， YE_P24, YCp50等）などが挙げられ、ファージ DNAとしてはファージ（Charon4A、 Charon21A、 EMBL3、 EMBL4、 X gtlO, ； L gtll、 λ ΖΑΡ 等) が挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ゥイノレス、パキュ口ウイノレスなどの昆虫ウィルスベクターを用いることもできる。

ベクターに本発明の遺伝子を揷入するには、まず、精製された DNAを適当な制限酵素で切断し、適当なベクター DNAの制限酵素部位又はマルチクローニンダサィトに揷入してベクターに連結する方法などが採用される。

本発明の遺伝子は、その遺伝子の機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、本発明のベクターには、プロモーター、本発明の遺伝子のほか、所望によりェンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリ Α付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列 (SD配列) などを含有するものを連結することができる。なお、選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、ァンピシリン耐性遺伝子、ネォマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。

(2) 形質転換体の作製

本発明の形質転換体は、本発明の耝換えベクターを、目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。ここで、宿主としては、本発明の DNAを発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、大腸菌（Escherichia coli)等のエッシェリヒァ属、バチルス ' ズプチリス (Bacillus subtilis)等のバチルス属、シユードモナス · プチダ（Pseudomonas putida)等のシユードモナス属に属する細菌が挙げられ、サッカロミセス 'セレビシェ (Saccharorayces cerevisiae) 、シンサッカロセス · ンべ (Schizosaccharomyces pombe)等の酵母が挙げられ、 COS細胞、 CH0細胞等の動物細胞が挙げられ、あるいは S121または， sf9等の昆虫細胞が挙げられる。その他, カイコ，ョトウガなどの虫体そのものが用いられる。

大腸菌等の細菌を宿主とする場合は、本発明の組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、本発明の遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。

大腸菌としては、例えばエツシェリヒア ' コリ（Escherichia coli) DH1または, JM109などが挙げられ、枯草菌としては、例えばバチルス ·ズプチリス（Bacillus subtilis)などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

プロモーターは、大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。例えば trp プロモーター、 lac プロモーター、 P_Lプロモーター、 Ρ_κプロモーターなどの、大腸菌やファージに由来するプロモーターが用いられる。 tac プロモーターなどのように、人為的に設計改変されたプロモーターを用いてもよい。

細菌への組換えベクターの導入方法は、細菌に DNAを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法 [Cohen， S.N. et al. ： Pro Natl. Acad. Sci.， USA, 69 : 2110(1972)]、エレクトロポレーション法等が挙げられる。

酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス ' セレビシェ（Saccharomyces cerevisiae)^ シンサッカロセス · ポンへ (schizosaccharomyces pomDe)、ピヒァ 'パストリス（Pichiapastoris)などが用いられる。この場合、プロモーターは酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、例えば gall プロモーター、 gallOプロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、 MFQ;1プロモータ一、 PH05プロモーター、 PGKプロモーター、 GAPプロモーター、 ADHプロモーター、 A0X1プロモーター等を用いることができる。酵母への組換えベクターの導入方法は、酵母に DNAを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーシヨン法 [Becker， D. M. et al. ： Methods. Enzymol.， 194 : 182(1990) ]、スフエロプラスト法 [Hinnen, A. et al.： Proc. Natl. Acad. Sci.， USA, 75： 1929(1978)]、酢酸リチウム法 [Itoh, H. ： J. Bacteriol.， 153： 163(1983)]等が挙げられる。

動物細胞を宿主とする場合は、サル細胞 COS- 1または COS- 7、 Vero, チヤィニーズハムスター卵巣細胞（CH0細胞）、マウス L細胞、ラット GH3、ヒト FL細胞などが用いられる。プロモーターとして SR aプロモーター、 SV40プロモーター、 LTR プロモーター、 CMV プロモーター等が用いられ、また、ヒトサイトメガロウィルスの初期遺伝子プロモーター等を用いてもよい。動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクト口ポレーシヨン法、リン酸カルシウム法、リポフエクション法等が挙げられる。

昆虫細胞を宿主とする場合は、 S121または sf9細胞などが用いられる。昆虫細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リボフェクション法、エレクト口ポレーション法などが挙げられる。

また，虫体そのものが用いられる場合，カイコ及びョトウガなどが用いられる。虫体への組み換えウィルスの導入は自然感染によるものが挙げられる。

(3) 本発明のタンパク質の生産

本発明のタンパク質は、本発明のィヌ肝細胞増殖因子遺伝子，または 1 5塩基対欠失型ィヌ肝細胞増殖因子遺伝子によりコードされるアミノ酸配列を有するもの、または該アミノ酸配列において少なくとも 1個のアミノ酸に前記変異が導入されたアミノ酸配列を有し、かつィヌ肝細胞増殖因子活性を有するものである。なお、本発明のタンパク質をィヌ肝細胞増殖因子タンパク質，その 1 5塩基対欠失型を 5ァミノ酸欠失型ィヌ肝細胞増殖因子タンパク質ともいう。

本発明のィヌ肝細胞増殖因子タンパク質は、前記形質転換体を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。「培養物」とは、培養上清、あるいは培養細胞若しくは培養菌体又は細胞若しくは菌体の破碎物のいずれをも意味するものである。

本発明の形質転換体を培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。

大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。

炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が挙げられる。

窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニゥム、硫酸アンモニゥム、酢酸ァンモニゥム、リン酸アンモニゥム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニゥム塩又はその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスティ一プリカ一等が挙げられる。

無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシゥム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が挙げられる。

培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、 37°Cで行う。なお、培地の pHの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。培養中は必要に応じてアンピシリンゃテトラサイタリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。

プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、必要に応じてィンデューサーを培地に添加してもよい。例えば、 Lac プロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル- ]3 - D-チォガラクトビラノシド（IPTG)等を、 trp プ口モーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはィンドール酢酸（ I AA)等を培地に添加してもよい。

動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地として、一般に使用されている RPMI1640培地、 DMEM培地又はこれらの培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。

培養は、通常、 5 %C0_?.存在下、 37°Cで 1〜30 日行う。培養中は必要に応じてカナマイシン、ぺニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。

培養後、本発明のタンパク質が菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を破砕することによりィヌ肝細胞増殖因子タンパク質を抽出する。また、本発明のタンパク質が菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモ-ゥム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換ク口マトグラフィ一、ァフィ二ティーク口マトグラフィ一等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中から本発明のタンパク質を単離精製することができる。

3 . 本発明の遺伝子を用いたィヌ肝細胞増殖因子の検出方法及び検出用試薬

(1)本発明の遺伝子又はその断片のプローブとしての利用

本発明においては、上記の DNA又は RNAとハイブリダィズし、該 DNA又は RNA を特異的に検出するプローブもィヌ肝細胞増殖因子の検出用試薬として提供される。該プローブは、通常使用される放射性同位元素 (例えば、 ³ 、 ³¾)、酵素（例えば、ディゴキシゲニン、フルォロレツセイン）、などにより標識され、通常のプ口ッティング分析、 In situハイブリダイゼーションなどにより該 DNA又は RNA と特異的にハイブリダィズし、検出させる。

本発明においてプローブとして使用する DNA又は RNAは、配列番号 2又は 3並びに配列番号 5又は 6に記載した DNA又は RNAの塩基配列のうち少なくとも一部を有するものである。プローブの長さは 200〜300塩基であるが、配列の全部を有するものであってもよく、特に限定されるものではない。

4 . 本発明の組換えィヌ肝細胞増殖因子を含有する医薬組成物

本発明の組換えィヌ肝細胞増殖因子又はその 1 5塩基対欠失型肝細胞増殖因子は、抽出精製された組換えィヌ肝細胞増殖因子又はその 5アミノ酸欠失型肝細胞増殖因子、あるいはプラスミド等に挿入され、ィヌの体内で翻訳させる組換えィヌ肝細胞増殖因子又はその 5アミノ酸欠失型肝細胞増殖因子であり、劇症肝炎、急性肝炎、肝硬変、肺繊維症、脂肪肝、肝臓癌などの肝疾患、急性腎不全、慢性腎不全/腎硬化症、腎移植、糖尿病性腎症などの腎疾患、急性肺炎、肺繊維症などの肺疾患、変形性骨関節症、リウマチ性関節炎などの骨疾患、胃潰瘍、糖尿病 (腌 ]3細胞の細胞死抑制、インスリン産生促進）などの消化器疾患、心筋梗塞、肥大型/拡張型心筋症、血管障害（糖尿病性網膜症、閉塞性動脈硬化症など）の心臓 ·血管 ·循環器系疾患、脳梗塞、パーキンソン病などの脳神経系疾患の治療用医薬組成物として使用される。

本発明の医薬組成物は、ィヌの慢性腎不全などの慢性疾患の治療に特に有用であり、抗原性の問題がなく長期間使用することができる。

本発明の医薬組成物は、ィヌ肝細胞増殖因子又はその 1 5塩基対欠失型肝細胞増殖因子，またはその塩またはプラスミド等に cHGF遺伝子または， dcHGF遺伝子を結合させ，ィヌの体内で翻訳させることが目的の DNA断片と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤を含む。本発明の医薬組成物は、種々の形態で投与することができる。このような投与形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与、あるいは注射剤、点滴剤、座薬などによる非経口投与を挙げることができる。かかる組成物は、公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤、賦形剤を含む。たとえば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、ステアリン酸マグネシウムなどが使用される。注射剤は、ィヌ肝細胞増殖因子またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製する。注射用の水性液としては、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが使用され、適当な溶解補助剤、たとえばアルコール、プロピレンダリコールなどのポリアルコール、非ィォン界面活性剤などと併用しても良い。油性液としては、ゴマ油、大豆油などが使用され、溶解補助剤としては安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用しても良い。

その投与量は、症状、年齢、体重などによって異なるが、通常経口投与では、 1 日 1頭当たり約 0 . 0 0 1 m g〜1 0 0 0 m gであり、 1回または数回に分けて投与される。また、非経口投与では、 1回 1頭あたり、 0 . 0 0 1 m g〜1 0 0 0 m gを皮下注射、筋肉注射、または静脈注射によって投与される。また、ィヌの体内で翻訳させるプラスミド等に挿入された組換え cHGF又は組み換え dcHGFは、数日または数週間または数ケ月おきに 1回 1頭あたり、 0 . 0 0 1 m g〜1 0 0 O m gを皮下注射、筋肉注射、または静脈注射によって投与される。図面の簡単な説明

図 1は，実施例 2において， COS- 1細胞及び CH0細胞で用いたタンパク発現用組み換え cHGF及び dcHGFベクターの構築を示す。

図 2は，実施例 2において， COS- 1細胞で生産された cHGF及び dcHGFの生物活性を示す。

図 3は，実施例 2において， CH0細胞で生産された cHGF及び dcHGFの生物活性を示す。

図 4は，実施例 3において，カイコ虫体および培養昆虫細胞で用いたタンパク質発現用組み換え cHGFウィルスベクターの構築を示す。

図 5は，実施例 3において，カイコ虫体を用いて生産された組換え cHGF のゥエスタンブロット解析結果を示す。レーン 1は、 cHGF組み換えウィルス感染カイコ体液を用いた場合の結果、レーン 2は、非組み換えウィルス感染カイコ体液を用いた場合の結果を示す。

図 6は，実施例 3において，カイコ虫体を用いて生産した組換え cHGF タンパクの生物活性を示す。

図 7は，実施例 3において，培養昆虫細胞で生産された組み換え cHGF のゥェスタンプロット解析結果を示す。レーン 1は、 cHGF組み換えウィルス感染 Sf9細胞培養上清を用いた場合の結果、レーン 2は、非組み換えウィルス感染 Sf9細胞培養上淸を用いた場合の結果を示す。

図 8は，実施例 3において，培養昆虫細胞で生産された cHGFタンパクの生物活性を示す。実施例

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。伹し、本発明はこれら実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。

〔実施例 1〕ィヌ肝細胞増殖因子遺伝子の単離

(a) cHGF由来の DNA断片の取得ィヌ肝細胞増殖因子蛋白質翻訳領域全長をクローニングするため、当初は既に報告されているヒト肝細胞増殖因子遺伝子の 5'及び 3'蛋白質非翻訳領域に相当する塩基配列を基にプライマーを設計、 RT- PCR法による増幅を試みたが、目的のサィズの産物を増幅する事は困難であった。そこでまず、ヒト、マウスそしてラットの動物種を越えて比較的良く保存されている塩基配列を指標とし、プライマーを設計、 RT- PCR法によりィヌ HGFcDNA部分配列をクローニングの後、 5，および 3 側の未クローニング領域を 5，および 3，RACE(rapid amplification of cDNA ends ) 法によりクローニングした。

ィヌ肝細胞増殖因子部分配列のクローニング：ィヌ白血球から総 RNAをグァニジゥムチオシァネート-フエノーノレ法 (Trizol Reagent (Gibco-BRL) ) により抽出した。抽出した総 RNAから、 3， RACE System(Gibco- BRL)を用いて cDNAを合成し、 RT - PCR反応に供した。

既に報告されているヒト、マウス、ラットの動物種を越えて比較的良く保存されている塩基配列を指標とし、 HGF遺伝子蛋白質翻訳領域にプライマーを設定した。 PCR反応は以下の組成を有する反応液を用い、はじめに 94°C 2分反応させた後、 94°C 1分、 55°C 1分、 72°C 2分を 1サイクルとし、このサイクルを 30回繰り返し、最後に 72°C 5分反応の後、 4°Cに保存するサイクルで PCRを行った。反応液の組成： IX PCR緩衝液， 0. 2 mM dNTP , 0. 005 units/ μ ΐ Taqポリメラーゼ（TaKaRa EX Taq) , 0. 5 Μ各プライマー

マー： 5，CCATGAATTTGACCTCTATG3，（配列番号 5 )

マ一： 5'TGTGTATCCATTTTGCATAATATGCTACTC3' (配列番号 6 ) 得られた PCR産物は、ェチジゥムブ口マイド存在下ァガロースゲル電気泳動を行い、産物のサイズを確認した。予測されるサイズの産物を、ァガロースゲルより回収し（RECOCHIP (TaKaRa) )、プラスミドベクターのクローニングサイトに T4DNAリガーゼを用い結合させ（pGEM- T Easy Vector System (Promega) ), 宿主大腸菌 JM109 (Promega) を形質転換した。すなわち、大腸菌コンビテントセルとプラスミドを混和後、氷上で 30分、 42°Cで 45秒、氷上で 5分の温度処理を行い、 High-competence broth (二ツボンジーン）に浮遊して 37°Cで 1時間ィンキュベトした。その後 50 ^ g/mlアンピシリンを添加した LB寒天培地上に播種し、形質転換させた大腸菌コロニーを得た。 50 μ _δ/ηι1アンピシリンを添加した LB培地 ( 1% yeast extract , 0. 5% tr ipton , 1 % NaCl )に形質転換した大腸菌を 37°C、ー晚培養後、プラスミド DNAを精製し (ul tracl ean mini plasmid DNA pur ifi cat ion ki t , MO B IO)、塩基配列解析を行った（エスペックオリゴザービス社、および AB I310 DNA シークェンサ一）。得られた塩基配列に対して、オンライン相同性解析プログラムである BLASTを用いて相同性解析を行い、ヒトまたはその他の動物種の HGF遺伝子との間に高い相同性を示したことから、この配列はィヌ HGF遺伝子の部分配列であることが示唆された。

3' RACE法による 3'側未読領域のクローユング：得られたィヌ HGF部分配列の塩基配列を基にプライマーを設計し、 SMART RACE cDNA Ampl ifi cat ion Kit (Clontech) を用い 3' RACEを行った。一度目の PCR産物に対し、ァガロースゲル電気泳動、ェチジゥムブ口マイド染色を行ったが、増幅断片は観察されなかったため、ネスティド PCRを行い、 3'RACEによる増幅断片が得られた。

PCR反応液の組成は、キットが推奨する組成に従い、 PCR サイクルは、 94°C 5 秒、 68°C 10秒、 72°C 3分を 1サイクルとし、このサイクルを 25回繰り返すサイクノレで行った。

Is tプライマー： 5，ATGCAGCCAATACCATCAAGGGAAGGTGAC3，（配列番号 7 )

ネステイドプライマー： 5'TCAGGACCATGTGAGGGAGATTATGGTGGC3，（配列番号 8 ) 得られた増幅産物は、およそ 1. 7kbpであり、既に報告されているヒトおよびラット HGFの cDNAから予測される 3'蛋白質非翻訳領域、約 3. 6kbpとは異なっていた。しかし、塩基配列解析の結果、この増幅断片は終止コドン、ポリ Aシグナル、そしてポリ A配列を含んでいることから、 3'蛋白質非翻訳領域内の選択的スプライシングによる変異体であると示唆された。

5， RACE法による 5'側未読領域のクローニング：得られたィヌ HGF部分配列の塩基配列を基にプライマーを設計し、 SMART RACE cDNA Ampl ificat ion Kit (Clontech) を用い、 5' RACEを行い、 5'未読領域のクローニングを試みた。

5， RACEは、以下に示す反応液、 PCRサイクルを用いて行った。一度目の PCR産物に対し、ァガロースゲル電気泳動、ェチジゥムブ口マイド染色を行ったが、増幅断片は観察されなかったため、ネスティド PCRを行い、 5'RACEによる増幅断片が得られた。

1stプライマー： 5，CTTCGTAGCGTACCTCTGGATTGCTTGTG3，（配列番号 9 )

ネスティドプライマ一： 5 TCCAGGGCTGGCATTTGATGCCACTC3' (配列番号 1 0 )

PCR反応液の組成は、キットが推奨する組成に従い、 PCR サイクルは、 94°C 5 秒、 68°C 10秒、 72°C 2分を 1サイクルとし、このサイクルを 25回繰り返すサイクルで行った。ネスティド PCRの産物に対し、ァガロースゲル電気泳動、ェチジゥムプロマイド染色を行った結果、複数のバンドを観察したため、最も長い増幅断片を上記の方法と同様にァガロースゲルから切り出し、 pGEM-T Easyベクターにクロー-ング、そして塩基配列の解析を行った。しかし、得られた増幅断片には、蛋白質翻訳開始点が含まれていなかった。

HGF遺伝子は、全長約 6 kbpと比較的大きな遺伝子であるため、 5'側末端の配列をクローユングする事は技術的に困難である。特にィヌ HGFの mRNAは、その塩基配列の特徴から、正常な逆転写反応が行われにくい高次構造をとると予想され、完全長の cDNAを得ることは、非常に困難であった。実際、ィヌ HGF遺伝子の翻訳開始点をクロー-ングするため、 SMART RACE cDNA Ampl ifi cat i on Kit (Clont ech) を用い、 3 種類の逆転写酵素、 Supers cr ipt l l (Gibco- BRL)、 Powerscr ipt l l (し lontechリ、そし一し M-ML V Revers e Transcriptase RNase Minus (Promega)それぞれを用いて合計 6種類の 5'RACE用の cDNA合成を行った。また、 PCR反応は、上記のィヌ HGF部分配列、および 1回目の 5'RACEにより明らかになつたィヌ HGF遺伝子の塩基配列を基に 9種類のプライマーを設計し、多数の組み合わせのネステイド PCR反応、増幅断片のクローニング、そして塩基配列の解析を行ったが、翻訳開始点を含むクローンを得るのは非常に困難であった。しかし、鋭意努力した結果、 M-MLV Reverse Trans cr iptase RNase Minus (Promega を用ヽて合成した cDNAを用い、以下の組み合わせのプライマ一によって PCR反応を行った結果、翻訳開始点を含むと予想される増幅産物が得られた。

1stプライマー： 5'GGCCTTGCAAGTGAATGGAAGTCC3，（配列番号 1 1 )

ネステイドプライマー： 5，ACGGCGACGGGCAGCAGGAGGAGGTGC3，（配列番号 1 2 ) 反応液の組成、及び PCRサイクルの条件は、 1回目の 5'RACEと同様に行った。得られた PCR産物は、単一の増幅産物ではなかったが、上記の方法と同様にァガロースゲルから回収、 pGEM-T Easyベクターにクローニングした。そして、 24クローンをランダムに選択し、それぞれの塩基配列を解析した結果、そのうち 3クローンが翻訳開始点を含んでいた。

(b)挿入断片の塩基配列解析

(a)で得られた遺伝子断片の塩基配列を、 Genetyx- win ver. 4ソフトウェア（ソフトウア開発）を用いて組み合わせ、ィヌ肝細胞増殖因子遺伝子蛋白質翻訳領域の全塩基配列を得た、その配列は配列番号 1に記載した。配列番号 1は、 2193 bp からなつており、 GENBANK/EMBL DNA Data Baseを使用し、配列番号 1に記载した塩基配列を検索したが、同一の配列は存在しなかった。従って、この塩基配列を有する DNAは全く新規なものであると認められた。オンライン相同性検索プログラムである BLAST、並びに Genetyxiin ver. 4ソフトウェアを用い、相同性検索を行ったところ、配列番号 1の塩基配列は、ヒト（92. 2 %)、マウス（87. 8 %)、そしてラット（87. 5 などの肝細胞増殖因子遺伝子塩基配列との間に、高い相同性が見られた。

配列番号 1の塩基配列から推定されるアミノ酸の配列は、配列番号 2に記載されている。塩基配列の場合と同様にアミノ酸配列について相同性解析を行ったところ、配列番号 2のアミノ酸配列は、ヒト（92. 3 %)、マウス（92. 1 %)、ラット（92. 0 %) 等の肝細胞増殖因子アミノ酸配列との間に、高い相同性が見られた。これらの事から、配列番号 1の塩基配列はィヌ肝細胞増殖因子遺伝子であることが強く示唆された。

(c)ィヌ HGF蛋白質翻訳領域全長の増幅

(a)で得られた塩基配列をもとに、ィヌ HGF蛋白質翻訳領域を増幅するようにプライマーを設定し、ィヌ白血球由来 cDNAを铸型に PCRを行った。 PCR反応は以下の組成を有する反応液を用い、はじめに 94°C 2分反応させた後、 94°C 30秒、 55°C 30秒、 68°C 2分を 1サイクルとし、このサイクルを 30回繰り返し、最後に 68°C 5分反応の後、 4°Cに保存するサイクルで PCRを行った。

反応液の組成： IX PCR緩衝液， lmM MgS0₄，0.2 mM dNTP, 0. 005 units/ μ 1 Taq ポリメラーゼ KOD Plus (Toyobo)、 0. 5 μ Μ各プライマーセンスプライマ一： 5，ATGTGGGTGACCAAGCTCC3，（配列番号 1 3 )

マ一： 5 GGGTGCTTCAGACACACTTACATCAG3' (配列番号 1 4 ) マー： 5'ATGTGGGTGACCAAGCTCCTGCCCCTG3，（配列番号 1 5 )

ネスティドアンチセンスプライマー： 5'CTATGACTGTTGTATCTTATACGTTAA3，（配列番号 1 6 )

得られた PCR産物について、ェチジゥムブ口マイド存在下ァガ口一スゲル電気泳動を行い、産物のサイズを確認した。上記の方法と同様にプラスミドベクターへクロ一ユング、塩基配列の解析を行った。解析の結果から、翻訳開始点から 414 番目の塩基が、アデニンそしてグァニンのクローンがそれぞれ存在することが分かった。それぞれについて複数個のクローンが得られているため、これは 1塩基多型によるものと思われる。しかし、両者がコードしているアミノ酸はともにグリシンであり、アミノ酸配列には違いは見られなかった。その他の配列は、（a) で得られた配列と完全に一致していた。

(d)15塩基対欠失型 cHGFのスクリーニング

(a)に記したィヌ HGF遺伝子部分配列の塩基配列を解析した際、解析した 3ク口ーンのうち 1クローンは、第 1クリンダルドメインに相当する部位に選択的スプライシングによる 15塩基対の欠失が見られた。同様の選択的スプライシングは、ヒト、ラットそしてマウスで報告されているが、ィヌ HGF遺伝子においても第 1 クリングルドメイン内に 15塩基対を欠失する選択的スプライシングが起きることを初めて明らかにした。この 15塩基対欠失型 cHGF (以下、 dcHGF) をスクリーニングするため、欠失部位を挟むようにプライマーを設計し、（c )に記した cHGF 遺伝子の蛋白質翻訳領域全長を結合したベタタ一 DNA で形質転換された大腸菌コロニーを铸型として、以下の組成を有する反応液を用い、はじめに 94°C 2分反応させた後、 94°C 30秒、 55°C 30秒、 72°C 30秒を 1サイクルとし、このサイクルを 30回繰り返し、最後に 72°C 5分反応の後、 4°Cに保存するサイクルで PCRを行った。

反応液の組成： IX PCR緩衝液， 0. 2 mM dNTP , 0. 005 units/ μ 1 Taqポリメラーゼ（TaKaRa EX Taq)、 0. 5 μ Μ各プライマー

マー： 5， CTATCACTAAGAGTGGCATC 3，（配列番号 1 7 )

マー： 5， GGAATGTCACAGACTTCGTAG 3，（配列番号 1 8 ) 得られた PCR産物について、ェチジゥムプロマイド存在下 4%ァガロースゲル電気泳動を行い、各クローンの増幅断片長の比較を行った。通常よりも増幅断片が短いクローンを選択、前述のようにー晚 LB培地で培養の後、プラスミド DNAを精製し、塩基配列の解析を行った。その配列は配列番号 3に記載した。また、配列番号 3から予測されるァミノ酸配列は、配列番号 4に記載した。得られた dcHGF クローンは、第 1クリングルドメインに相当する部位に 15塩基対の欠失を有しており、その結果、 5 アミノ酸が欠失していた。また（c ) で記したのと同様に、 1 5塩基対欠失型 dcHGFにおいても、翻訳開始点からの 414番目の塩基が、アデニンのものと、グァニンのものであるクローンがそれぞれ存在した。その他の塩基配列およびアミノ酸配列に違いは見られなかった。

〔実施例 2〕哺乳動物細胞による組み換え cHGFおよび dcHGF蛋白の作出

(a) cHGFおよび dcHGFをコードする DNAを含む動物細胞発現用組み換えプラスミドの作製

実施例 1 (c)および（d)で得られたプラスミド g を 10 ュ-ットの制限酵素 Sailおよび Not I (TaKaRa) で 37°C、 2時間消化し、ァガロースゲル電気泳動を行レ、、約 2. 2 kb の cHGFおよび dcHGFの DNA断片を RECOCHIP (TaKaRa)を用いて回収した。一方、哺乳動物細胞用発現べクタ一である pCl-neo Mammalian Expression Vector(Promega) l gを、 10ユニットの制限酵素 Sailおよび Notl (TaKaRa) で 37°C、 2 時間消化し、常法に従いフエノール ' クロ口ホルム処理およびエタノール沈殿を行い、最終濃度 50η_§/ _μ 1に調整した。上記の cHGFおよび dcHGFの DNA 断片と、発現ベクター DNAを ligation kit ver. 2 (TaKaRa) を用いて連結し、前述の方法により大腸菌を形質転換し、 cHGFおよび dcHGF遺伝子が含まれる大腸菌クローンを選択し、プラスミド DNAを精製した（図 1 )。そして、発現ベクター由来シークェンスプライマーである T7- EEV (Promega)を用いて塩基配列の解析を行い、設計通りに cHGFおよび dcHGFの DNA断片が連結されていることを確認した。 (b) COS-l細胞での組み換え cHGFおよび dcHGF蛋白の生産

アフリカミドリザル COS- 1細胞は、 10%ゥシ胎児血清（Moregate)、 0. 3% Tryptose Phosphate broth (DIFCO) を含む E- MEM (日水製薬）培地中で、 37°C、 5%C0₂存在下で継代を行った。形質転換の前日、飽和細胞密度まで増殖させた COS- 1細胞を、 PBS緩衝液で洗浄の後、トリプシン- EDTA溶液を加え、室温で約 2分間静置した。上記の増殖用培地を加え、細胞を良く懸濁した後、 1，200 rpm、 4°C、 5 分間遠心した。上清を除き、再度増殖用培地に懸濁した後、常法に従い細胞数をカウントした。 5mlの培地中に 8X 10⁵個となるように細胞数を調整し、直径 60mmのシヤーレ（FALCON) に播き、 37°C、 5%C0₂存在下で一晩培養した。（a) で得られた cHGF および dcHGF 発現用プラスミド DNA を精製し（Wizard SV Minipreps DNA purification system (Promega)) , 蒸留水中に 1 μ g/ μ 1の濃度となるように調整した。 COS- 1細胞への遺伝子導入は、 Lipofectamine2000 Regent (GIBCO- BRL) を用いて行い、遺伝子導入操作は、説明書に従い行った。遺伝子導入後、 37°C、 5%C0₂ 存在下で 48時間培養し、組み換え cHGFおよび dcHGFが生産された培養上清を得た。この培養上清を回収し、実施例 4に記載のとおりに生物活性の測定し、 MDCK 細胞の運動性亢進が観察され、 COS- 1細胞産生組み換え cHGFおよび dcHGF蛋白が生物活性を有することを確認した（図 2 )。

(c)組み換え cHGFおよび dcHGF蛋白を安定的に発現する細胞株の作出

チヤィニーズハムスター CH0細胞を用い、組み換え cHGFおよび dcHGF蛋白を安定的に発現する細胞株を得た。 CH0細胞は、 10%ゥシ胎児血清（Moregate)、 0. 3% Tryptose Phosphate broth (DIFCO) を含む E - MEM (日水製薬）培地中で、 37°C、 5%C0₂ 存在下で継代を行った。形質転換の前日、飽和細胞密度まで増殖させた CH0細胞を、前記の方法のとおりプレートより剥離、培地中に浮遊させ、細胞数をカウントした。そして、 500 μ 1の培地中に 1. 2X 10⁵個となるように細胞数を調整し、 24 穴シャーレ（FALCON) に播き、 37°C、 5%C0₂存在下で一晩培養した。（a) で得られた cHGFおよび dcHGF発現用プラスミド DNAを精製し（Wizard SV Minipreps DNA purification system (Promega)) , 蒸留水中に 1 μ g/ μ 1の濃度となるように調整した。 CH0細胞への遺伝子導入は、 Lipofectamine2000 Regent (GIBCO- BRL) を用いて行い、遺伝子導入操作は、説明書に従い行った。遺伝子導入後、 37°C、 5%C0₂ 存在下で一晩培養を行い、上記の方法の通りに細胞を剥離させ、 600 g/ml の GENETIC IN (GIBCO BRL) を含む上記の増殖培地 12ml に再懸濁、 24 穴シャーレ

(FALCON) に 500 μ 1ずつ分注し、 37°C、 5%C0₂存在下で培養を行った。その後、おおよそ 3日毎に培地を交換し、約 2週間継続して培養を行い安定発現株を得た。得られた細胞株から、培養上清中の HGF活性の高い細胞株を限界希釈法によりスクリーエングし、組み換え cHGFおよび dcHGF蛋白高生産株を得た。得られた高生産株を、上記の増殖培地にて 37°C、 5%C0₂存在下で数日間培養し、組み換え cHGF および dcHGF蛋白が生産された培養上清を得た。この培養上清を回収し、実施例に記載のとおりに生物活性の測定を行い、 MDCK細胞の運動性の亢進が観察され、 CH0細胞産生組み換え cHGFおよび dcHGF蛋白が生物活性を有することを確認した

(図 3 ) ₀

[実施例 3] カイコ虫体および培養昆虫細胞による組み換え cHGF蛋白の生産

(a) カイコ虫体での組み換え cHGF蛋白の生産

実施例 1 ( c ) で得られたプラスミドベクターを用い、片倉工業株式会社 Superwormサービスにより、 cHGFをコードする DNAで組み換えられた組み換えパキュ口ウィルスを得た（図 4 )。得られた組み換えウィルスのウィルス液をカイコ虫体に投与し、数日間飼育の後、虫体体液を回収した。カイコ虫体体液サンプルを常法に従い、 SDS-ポリアクリルアミド電気泳動の後、ウェスタンブロッテイング解析を行い、分子量約 8万〜 9万の位置に組み換え cHGF蛋白を検出した（図 5 ) _c また、実施例 4に記載のとおりに生物活性の測定を行い、 MDCK細胞運動性の亢進が観察され、カイコ虫体産生組み換え cHGF蛋白が生物活性を有することを確認した（図 6 )。

(b) 培養昆虫細胞での組み換え cHGF蛋白の生産

前記で得た組み換え体ウィルス液を、 Sf9細胞培養上清に添加し、約 1週間培養を行った後、培養上清を回収した。培養上清サンプルを常法に従い、 SDS-ポリアクリルアミド電気泳動の後、ゥヱスタンプロッテイング解析を行い、分子量約 8万〜 9万の位置に組み換え cHGF蛋白を検出した（図 7 )。また、実施例 4に記載のとおりに生物活性の測定を行い、 MDCK細胞運動性の亢進を観察し、培養昆虫細胞産生組み換え cHGF蛋白が生物活性を有することを確認した（図 8 )。

： [実施例 4] 組み換え cHGFおよび dcHGF蛋白生物活性の測定

組み換え cHGFおよび dcHGF蛋白の生物活性は、ィヌ腎上皮（Madin- Darby Canine Kidney; MDCK) 細胞の運動性亢進を観察することにより行った。 MDCK細胞は、前記増殖培地中で継代を行った。飽和細胞密度に達した細胞を前記の方法でプレートより剥離、細胞数を力ゥントし、 3xl0⁴個/ mlとなるように調整した。この細胞懸濁液を 96穴プレート（FALCON) 1ゥエルあたり 100 1ずつ分注した。そして、実施例 2で得られた cHGFおよび dcHGF発現べクタ一を導入した C0S-1および CH0 細胞の培養上清を 50 1ずつ加えた。また、実施例 3で得られたカイコ虫体体液は、 MDCK細胞増殖培地で 2000倍に希釈し、培養昆虫細胞上清は、同様に 4倍希釈を行い、それぞれ 50 1ずつ加えた。サンプル添加 24時間後、 1/10容量の 25% グルタルアルデヒド溶液（和光純薬）を加え細胞を固定し、ギムザ染色を行い顕微鏡下で細胞の運動性、形態について観察した。

本明細書で引用した全ての刊行物，特許および特許出願をそままま参考として本明細書に取り入れるものとする。産業上の利用可能性

本発明により、ィヌ肝細胞増殖因子およびその 5ァミノ酸欠失型ィヌ肝細胞増殖因子、該ィヌ肝細胞増殖因子をおよびその 5アミノ酸欠失型肝細胞増殖因子をコードする遺伝子が提供される。本発明の耝換えィヌ肝細胞増殖因子およびその 5アミノ酸欠失型組み換えネコ肝細胞増殖因子は，ィヌの肝疾患、腎疾患等の慢性疾患等の治療に有用である。

Claims

i請求の範囲

1 . 以下の（a)又は（b)の組み換えタンパク質。

(b) 配列番号 2または 4で表わされるアミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が欠失，置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み，かつィヌ肝細胞増殖因子活性を有するタンパク質

2 . 以下の（a)又は（b)のタンパク質をコードする遺伝子。

3 . 以下の（c)又は（d)の DNAを含む遺伝子。

(c) 配列番号 1または 3で表される塩基配列を含む DNA

(d) 配列番号 1または 3の塩基配列を含む DNA とストリンジェントな条件下でハイプリダイズし、かつィヌ肝細胞増殖因子活性を有するタンパク質をコードする DNA

4 . 請求項 2または 3に記載の遺伝子を含有する組換えベクター。

5 . 請求項 4記載の組換えベクターを含む形質転換体。

6 . 請求項 5記載の形質転換体を培養し、得られる培養物からィヌ肝細胞増殖因子を採取することを特徴とするィヌ肝細胞増殖因子の製造方法。

7 . 請求項 2または 3に記載の遺伝子の少なくとも一部の断片を含むィヌ肝細胞増殖因子の検出用試薬。

8 . 請求項 1に記載の組換えィヌ肝細胞増殖因子を含有する医薬組成物。

9 . 肝疾患、腎疾患、肺疾患、骨疾患、消化器疾患、心臓循環器疾患または脳神経系疾患治療用である請求項 8に記載の医薬組成物。