WO2001086301A1 - Composition polymère pour former la surface d'un biocapteur - Google Patents

Composition polymère pour former la surface d'un biocapteur Download PDF

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hydrogen atom
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Kazunori Kataoka
Yukio Nagasaki
Hidenori Otsuka
Mitsuhiro Kaneko
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Center For Advanced Science And Technology Incubation, Ltd.
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Definitions

  • the present invention relates to a polymer composition for forming a surface of a biosensor to which surface plasmon resonance (SPR) is applied, a biosensor chip surface on which such a polymer is absorbed (or adsorbed), and a composition using the composition. It relates to a method for manufacturing a biosensor chip.
  • SPR surface plasmon resonance
  • SPR Surface plasmon resonance
  • BI ACORE available from Amersham Pharmacia Biotech Co., Ltd.
  • This BI ACORE is a chip in which a carboxylated dextran matrix is immobilized on a translucent gold thin film.
  • dextran matrices exhibit some resistance to non-specific adsorption of proteins, but have a considerable thickness (approximately 100 nm) so that, for example, analytes can partition into the matrix. May adversely affect thermodynamic and kinetic parameters.
  • the polymer represented by is automatically deposited on a thin layer of titanium (11-5 nm) deposited on a glass support (15 nm) and on a gold layer (12 nm) on a glass substrate (se 1 f-asse mb led mono). l ay er).
  • the authors suggest that monolayers formed from the above polymers with 2 to 7 ethylene glycol units are resistant to protein adsorption.
  • the results indicate that, for example, when polyethylene glycol (PEG) is grafted onto glass modified with trichloromethyl vinylsilane, the shorter the PEG chain, the lower the resistance to protein adsorption. This suggests that it does not agree with the theoretical prediction (SI J eon, et al., J.
  • An object of the present invention is to significantly reduce the nonspecific adsorption of any protein compared to the polymers of E. Ostuni et al., And to eliminate the above-mentioned disadvantages when using BIACORE's dextran matrix.
  • An object of the present invention is to provide a polymer composition for SPR that can be significantly improved.
  • the present invention provides a method for forming a surface of a biosensor using surface plasmon resonance (SPR) comprising the specific polymer (ie, a polymer represented by the following general formula (I)) as an active ingredient.
  • SPR surface plasmon resonance
  • L 2 and L 3 are each independently a valence bond or a linker. Where m is 0, 1 ⁇ and L 2 can be joined together to form a valence bond or one linker,
  • R 1 and R 2 are independently a hydrogen atom, an alkyl group of 1 to 5 carbon atoms, and p is an integer from 2 to 5,
  • X represents a hydrogen atom, a functional group or a ligand
  • n is an integer from 0 to: L 0, 0 0 0, and
  • n is an integer from 10 to 20;
  • the present invention provides a solution or suspension of a polymer containing a polymer represented by the above general formula (I), which has a surface selected from the group consisting of gold, silver, platinum and aluminum.
  • the sensor chip is processed, and the polymer is chemisorbed or absorbed on the surface via the mercapto group in the polymer, and then, if necessary, the ligand is covalently bonded through the functional group X in the polymer.
  • the present invention provides a method for producing a biosensor chip applying SPR, which is characterized by the following.
  • the present invention also provides use of the polymer represented by the general formula (I) for preparing a surface of a biosensor chip to which SPR is applied.
  • polymers themselves represented by the general formula (I) are almost known, and even if they are novel polymers, they can be produced according to similar known polymers.
  • Preferred of these polymers are those in which m in the general formula (I) is 0 to 10 or 100. Is 0, is a valence bond,
  • Li and L 2 together can be the linker defined above for, where q is an integer from 2 to 6 Or if m is other than 0, L 2 is one 0— or — 0— CH 2 CH 2 — 0—
  • L 3 is a valence bond or or — (CH 2 ) r —, where r is an integer from 1 to 6, and
  • X is a hydrogen atom, an aldehyde group (one CHO), a hydroxyl group, an amino group,
  • R 3 and R 4 independently represent a C! O alkyl group, or R 3 and R 4 together form an ethylene group which may be substituted with d-6 alkyl NR 5 R 6 (where R 5 and R 6 are independently a hydrogen atom or a d-6 alkyl group, provided that either R 5 or R 6 is hydrogen
  • R 5 and R 6 are independently a hydrogen atom or a d-6 alkyl group, provided that either R 5 or R 6 is hydrogen
  • a functional group selected from the group consisting of an acryloyl group, a methacryloyl group, a vinylbenzyl group, an aryl group and a P-toluenesulfonyl group, or a group consisting of a sugar residue, biotin, an antigen or an antibody, and a nucleic acid. Which represent the ligand of choice.
  • Preferred examples of the polymer used in the present invention include a polymer represented by the following general formula (I-a), for example, a polymer in which m in formula (I) is 0.
  • R 3 and R 4 independently represent a d-u alkyl group, or a R 3
  • n is an integer from 10 to 20,000
  • r is an integer from 1 to 6.
  • polymers include, for example, polymers themselves described in W096 / 32434, W096 / 33233, WO97 / 06202, JP-A-11-322916, JP-A-11-322917, or precursors thereof. Can be produced, if necessary, by modifying it by a method known per se. ,
  • a 1 k is (( 6 alkyl group, M + is a potassium ion, A is a leaving group such as halogen, and R ′, R ⁇ X, n, m and L 3 is as defined above, B is
  • Xa is X- L 3
  • other abbreviations have the same meaning as above. .
  • an alkyl group means an alkyl group which may be branched, and d- 6 or d1 () preceding the term "alkyl group” represents a carbon atom of the alkyl group. It means that the number is 1-6 or 1-10.
  • examples of such alkyl groups include methyl, ethyl, n-propyl, i-propyl, n-butyl, sec-butyl, tert-butyl, n-methyl, n- Hexyl, n-octyl, n-decyl and the like.
  • the ligand according to the present invention can be one of a binding pair capable of forming a biological conjugate (complex).
  • a biological conjugate for example: Examples include biotin, a sugar in a sugar-lectin complex, an antigen or antibody in an antigen-antibody complex, and any nucleic acid in a nucleic acid-nucleic acid hybrid.
  • These ligands are prepared by introducing a functional group (for example, an aldehyde group) present at one end of the polymer of the general formula (I) into one end of the polymer by utilizing a reaction with an amino group in the ligand. Can be.
  • a ligand may be introduced after a polymer having a functional group at one end is fixed to a metal surface as described later.
  • n forming the polyethylene segment is 10 or more, preferably 10 to 250, more preferably 50 to 500.
  • the polymer of the general formula (I) having a mercapto group at one end can be used in various solvents, for example, tetrahydrofuran, lower alkanol (eg, ethanol), dimethylformamide, toluene, xylene, etc.
  • the polymer of the general formula (I), which can be dissolved or dispersed stably, is dissolved or dispersed in such a solvent, and is one of the polymer compositions for forming the surface of a biosensor to which SPR is applied according to the present invention. It is an aspect.
  • Such a polymer composition can include one or more polymers, and if necessary, other additives, such as a sulfuric acid rim that can fix the polymer to the surface at a high density. May be included.
  • the polymer composition thus prepared can be in any form, typically a thin film of titanium on a glass or silicon wafer, if necessary, to improve the adhesion of gold, silver, aluminum, etc. After vapor deposition, it can be chemisorbed (or adsorbed) on gold, silver or platinum by contacting the chip with a layer of gold, silver, platinum, palladium or aluminum deposited thereon. Chemical absorption (or adsorption), without being bound by theory, is understood to occur through the formation of metal-thiolates (hereinafter also referred to as complexes) by the reaction of the polymer's mercapto groups with the metal surface. ing.
  • complexes metal-thiolates
  • This absorption is performed, for example, by immersing a support carrying a translucent gold thin film in the polymer solution or by flowing the polymer solution over the surface of the support.
  • the optimum temperature varies depending on the type of the polymer used, it can be generally between the melting point and the boiling point of the solvent. Considering the operational convenience, it is preferable that the temperature be around room temperature. Process at around room temperature In this case, the contact time between the metal surface and the polymer solution is usually about 30 minutes, but may be 124 hours or more.
  • the polymer of the general formula (I) is absorbed (or adsorbed) on the metal surface, but the unabsorbed or unadsorbed polymer may be washed and removed if necessary.
  • the concentration of the polymer in the polymer solution is not particularly limited as long as the polymer is in a state of being dissolved or uniformly dispersed, but generally, 10 200 / g / m 1 is preferable.
  • the metal surface (eg, sensor chip surface) on which the polymer of the general formula (I) formed as described above is chemically absorbed (or adsorbed) via a mercapto group is covered with polyethylene glycol segments having an appropriate chain length. Therefore, it is considered that the surface charge is substantially zero, or substantially zero, without being directly affected by the metal surface.
  • species eg, positively charged proteins
  • N-succinimidol-3- (2-pyridylthio) propionate (SPDP) 0.4 mmo 1 (0.125 g) was dissolved in a small amount of distilled THF as a terminator, and the above-mentioned polymerization reaction solution was dropped to this solution under an equal pressure. The mixture was added dropwise under ice-cooling using a funnel. After stopping the reaction by stirring overnight, the polymer was recovered through washing with saturated saline, extraction with chloroform through form, reprecipitation from ether, and freeze-drying with benzene. The structure of the recovered polymer was confirmed by 1 H-NMR, and the amount of SPDP residue introduced at the end was confirmed by UV absorption of 2-thiopyridone released by reaction with 2-mercaptoethanol. did.
  • PEG-SS-Py 2.0 x 10- 2 mmo 1 (10 Omg) was dissolve in distilled water 4m 1, and further 5 times mo 1 of dithiothreitol 0. lmmo 1 a (15.42mg) was added, 30 at room temperature For a minute.
  • the polymer (hereinafter abbreviated as PEG5000) was recovered through washing with saturated saline solution, extraction of form from black mouth and reprecipitation from ether.
  • the structure of the recovered polymer was confirmed by 1 H-NMR, and the terminal SH group was quantified by reaction with 2_pyridinoledisulfide (2-PDS).
  • a polymer of n 10000 was obtained.
  • the respective polymers are abbreviated as PEG 2000 and PEG 10000.
  • the Mn value indicates the molecular weight of the PEG segment.
  • the quantification results were PEG2000, PEG5000 and PEG 100, respectively.
  • 00 is front (RUstart) and adsorption to adsorb and after SDS wash (RU S)
  • DS RU value
  • a laser beam of a specific wavelength is irradiated so that it is totally reflected, and the refractive index is measured.
  • the amount 1 n gZmm 2 is asked to set coefficients
  • these RU saturation values were divided by the molecular weight of the polymer, and the number of polymers adsorbed per 1 nm 2 was defined as the density of the fixed polymer.
  • Example 2 Adsorption characteristics of various proteins on polymer adsorption surface
  • PEG2000, PEG5000 and PEG10000 significantly reduce the non-specific adsorption of various proteins compared to CM5 with dextran adsorbed on the surface.
  • Lysozyme and Avidin About 11-15 to 20 are reduced.
  • a sensor chip in which non-specific adsorption of a biological component or the like to the biosensor surface is eliminated. Therefore, it can be used in the biosensor manufacturing industry and the diagnostic business using such a sensor.

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Description

明 細 書
バイオセンサーの表面形成用ポリマ一組成物
技術分野
本発明は、 表面プラズモン共鳴 （SPR) を応用したバイオセンサーの表面を 形成するためのポリマー組成物、 かようなポリマーを吸収 （または吸着） された バイォセンサーチップ表面、 および該組成物を用いるバイオセンサ一チップの作 製方法に関する。
背景技術
表面プラズモン共鳴 （SPR) は、 金属薄膜の表面およびその近傍における屈 折率変化に対して敏感である （例えば、 A. S z abo e t a 1 Cu r r. Op i n. S t rn c t. B i o l. 5 (1995) 699— 705参照） 。 SPRは、 表面と複雑な生物学的溶液との間で生じる過程のインサイチュ （i n s i t u) での観察が可能であり、 かつ、 例えば標識を使用することなくリア ルタイムに被検体からのデータが入手でき、 そして動力学的および熱力学的なパ ラメーターを取得するのに適している。 表面に固定される生体分子が固定される 層の曲折率の変化をもたらす場合には、 S PRで該生体分子の配座上の変化も検 出できる。
このような表面をもつバイォセンサーチップの典型的なものとしては、 アマシャ ム フアルマシア バイオテク （株） から入手できる B I ACOREがある。 こ の B I ACOREは、 末端がカルボキシル化されたデキストランのマトリックス が半透明の金の薄膜上に固定されているチップである。 このようなデキストラン マトリックスは、 タンパク質の非特異的吸着に対してある程度の抵抗性を示すが、 かなりの厚さ （約 100 nm) をもっために、 例えば、 被検体が該マトリックス 中に分配される等により、 熱力学的および動力学的パラメーターに悪影響を及ぼ す場合がある。
他方、 E. 0 s t u n i , e t a 1. , Co l l o i d s an d S u r f a c e B r B i o i n t e r f a c e s 15 (1999) 3— 30におい て、 一般式
HS(CH2)u(OCH2CH2)nO-リンカー · リガンド (式中、 nは 2〜7の整数である）
で表されるポリマーを、 ガラス支持体上に蒸着させたチタンの薄層 （1一 5nm) 上にさらに付着させた金層 （12nm) 上に自動堆積単層 （s e 1 f - a s s e mb l e d mono l ay e r) を担持するチップを公表している。 上記総説 において、 著者らは、 エチレングリコール単位を 2〜7個有する上記ポリマーで 形成された単層はタンパク質の吸着に対して抵抗性を示すことを示唆している。 そして、 この結果は、 例えば、 トリクロ口ビニルシランで変性されたガラス上に ポリエチレングリコール （PEG) をグラフトした場合には、 PEG鎖が短くな ればなる程、 タンパク質の吸着に対する抵抗性が低下するとの理論的な予測 （S. I. J e on, e t a l.， J. Co l l o i d I n t e r f a c e S c i. 142 (1991) 149-158) に一致しないことを示唆している。 しかし、 E. Os t un iらが提案している PEG単位の小さいポリマ一は、 金属薄膜表面の影響を受け、 特定のタンパク質 （例えば、 全体として陽性の電荷 をもつもの） 等を非特異的に吸着する場合がある。
発明の開示
本発明の目的は、 E. Os t un iらのポリマーに比べ、 いかなるタンパク質 の非特異的吸着も有意に低減し、 しかも B I AC OREのデキストランマトリッ クスを用いるときの上記短所が解消されたかまたは有意に改善されうる SPR用 ポリマー組成物を提供することにある。
本発明者らは、 上記 E. Os t un iらのポリマーに比べて、 形成されるポリ マーマトリックスの層の厚さが遥かに厚くなることが予測されるのにもかかわら ず、 オリゴマーよりはむしろポリマーの範疇に入る PEOセグメントを有する特 定のポリマ一を金属薄膜上に化学吸収 （または吸着） させると、 タンパク質を初 めとする生体由来の成分の非特異的な吸着を有意に低減できることを見出した。 したがって、 本発明は、 該特定のポリマー （すなわち、 下記一般式 （I) で表 されるポリマー） を有効成分として含んでなる表面プラズモン共鳴 （SPR) を 応用したバイォセンサ一の表面を形成するためのポリマー組成物、 ならびに該ポ リマ一を表面に吸着した S P Rを検出するためのバイオセンサーチップを提供す る。 一般式 （ I ) ：
HS-L1 - (B)m-L2- (CH2CH20)„-L3-X (I) 上式中、 、 L 2および L 3は独立して、 原子価結合またはリンカ一を表し、 但し、 mが 0である場合には、 1^と L 2は一緒になつて原子価結合または 1個の リンカ一となることができ、
Bは式
Figure imgf000004_0001
0
-0(CH2)— C- または -0CH2CH- P CH3 を表し、 ここで R 1および R 2は独立して、 水素原子、 炭素原子 1〜5個のアルキ ル基であり、 そして pは 2〜 5の整数であり、
Xは水素原子、 官能基またはリガンドを表し、
mは 0〜： L 0 , 0 0 0の整数であり、 そして
nは 1 0〜2 0, 0 0 0の整数である。
別の態様の本発明は、 上記一般式 （I ) で表されるポリマーを含有するポリマ —組成物の溶液もしくは懸濁液で金、 銀、 白金およびアルミニウムからなる群よ り選ばれる表面を有するセンサ一チップを処理し、 該ポリマ一を、 そのポリマー 中のメルカプト基を介して該表面に化学吸着または化学吸収させ、 次いで必要に より、 該ポリマー中の官能基 Xを介してリガンドを共有結合させることを特徴と する S P Rを応用するバイォセンサーチップの作製方法を提供する。
また、 別の態様の本発明は、 S P Rを応用したバイオセンサーチップの表面を 作製するための一般式 （I ) で表されるポリマーの使用も提供する。
発明を実施するための最良の形態
一般式 （I ) で表されるポリマーそれら自体は、 殆ど公知であり、 また、 仮り に新規なポリマーであっても、 類似の公知ポリマーに準じて製造できる。 これら のポリマーで好ましいものとしては、 一般式 （I ) における mが 0〜1 0， 0 0 0であり、 が原子価結合、
-(CH2>^-0-
0
II
-CH2> -c- または CH2)— S-
のリンカ一を表すか、 あるいは mが 0である場合には、 Liと L2は一緒になつて、 上記で について定義したリンカ一であることができ、 ここで、 qは 2〜6の 整数であり、 あるいは mが 0以外の場合には、 L2は一 0—または— 0— CH2C H2— 0—であり、
L3が原子価結合またはまたは—（CH2)r—であり、 ここで rは 1〜6の整数で あり、 そして
Xが水素原子、 アルデヒド基 （一 CHO)、 水酸基、 アミノ基、
Figure imgf000005_0001
(ここで、 R3および R4は独立して C! Oアルキル基を表すか、 あるいは R3と R4は一緒になつて、 d-6アルキルで置換されていてもよいエチレン基を形成す る原子団である） 、 — NR5R6 (ここで R5および R6は独立して、 水素原子また は d-6アルキル基であり、 但し、 R 5および R 6はいずれか一方が水素原子以外 である） 、 ァクリロイル基、 メタクリロイル基、 ビニルベンジル基、 ァリル基お よび P-トルエンスルホニル基からなる群より選ばれる官能基、 または糖残基、 ピオチン、 抗原もしくは抗体および核酸からなる群より選ばれるリガンドを表す、 ものを挙げることができる。
本発明で使用するポリマーの好ましいもののうち、 一般式 （I) における mが 0であるポリマ一を例にすると、 次の一般式 （I一 a) で示されるものを挙げる ことができる。
一般式 （I— a) ：
HS-La- (CH2CH20) π - (CH2) r -Xa (I -a) 上式中、 L aは
-(CH2>^0-
0
- CH2)— C- または -CH2— S- q q を表し、 qは 2〜6の整数であり、 Xaは、 アルデヒド基または
Figure imgf000006_0001
(ここで、 R3および R4は独立して d—uアルキル基を表すか、 あるいは R3と
R 4は一緒になって C！ - 6ァルキル基で置換されていてもよいェチレン基を形成す る原子団である） であり、
nは 10〜 20, 000の整数であり、 そして
rは 1〜6の整数である。
これらのポリマ一は、 例えば、 W096ノ32434、 W096/33233、 WO 97ノ 06202、 特開平 11一 322916号公報、 特開平 11— 322 917号公報に記載されているポリマーそれら自体またはそれらの前駆体を、 必 要により、 それ自体公知の方法によって修飾することによって製造することがで きる。 ，
限定されるものでないが、 一般式'（I) の片末端にメルカプト基を有し、 他の 末端に官能基またはリガンドを有するポリマーの製造は、 下記の反応スキームに 従って行うことが好都合であろう。 それぞれ各工程は、 それら自体公知の方法に 準じて実施することができる。
スキーム I (特開平 11一 322917号参照） ： (Alk)3Si— S— CH2CH2— S一 、
(場合によって、 )
Figure imgf000007_0001
(Alk)3Si-S- -CH2CHzS-Bf ®
Figure imgf000007_0002
(Alk) 3Si-S-CH2CH2S-B)s CH2CH20)TirTCH2CH20 M
求電子剤 A— X
(Alk)3Si-S-CH2CH2S- B^(CH2CH20^-L3-M 脱シリル化
Figure imgf000007_0003
なお、 上記各式中、 A 1 kは（ ぃ 6アルキル基であり、 M+はカリウムイオンで あり、 Aはハロゲン等の脱離基であり、 そして R'、 R\ X、 n、 mおよび L3 は上記に定義したとおりであり、 Bは
-CCHC-CH0 、
II II
0 0
-C(CH2 - または -CHCH2-0- CH3 である。
スキーム I I (前駆体ポリマ一の製造については、 WO 96ノ 32434、 W 096/33233、 WO97Z06202参照） ：
Figure imgf000008_0001
XaOeM®-
XaO— (CH2CH20) -CH CH2O0M®
(場合によって、 )
Figure imgf000008_0002
XaO— (CH2CH20>— (B)®M
n m
Figure imgf000008_0003
還 兀
0
XaO— (CH2CH20)— (B)— CCH2CH2SH
n m なお、 上記各式中、 Xaは X— L3であり、 その他の略号は、 上記と同じ意味 を有する。 .
本明細書において、 アルキル基は、 分枝していてもよいアルキル基を意味し、 「アルキル基」 の語に先立つ d— 6または d 1()は、 それぞれアルキル基が有す る炭素原子の数が 1〜 6であるか 1〜 10個であることを意味する。 したがって、 限定されるものでないが、 かかるアルキル基の例としては、 メチル、 ェチル、 n -プロピル、 i-プロピル、 n-ブチル、 s e c-ブチル、 t e r t-ブチル、 n -ぺ ンチル、 n-へキシル、 n-ォクチル、 n-デシル等が挙げられる。
また、 本発明にいうリガンドは、 生物学的なコンジュゲート （複合体） を形成 しうる結合対の一方であることができる。 例えば、 ビォチ、ノ-了ビジン複合体の ピオチン、 糖-レクチン複合体における糖、 抗原-抗体複合体における抗原または 抗体、 核酸-核酸ハイプリッ ドにおけるいずれかの核酸を挙げることができる。 これらのリガンドは、 一般式 （I ) のポリマーの片末端に存在する官能基 （例え ば、 アルデヒド基） をリガンド中のアミノ基との反応を利用して、 該ポリマーの 片末端に導入することができる。 また、 このようなリガンドの導入は、 官能基を 片末端に有するポリマーを、 後述するように、 金属表面に固定した後に、 行って もよい。
本発明に従えば、 ポリエチレンセグメントを形成する nは、 1 0以上、 好まし くは 1 0〜2 5 0 0、 より好ましくは 5 0〜5 0 0である。
上記のように、 片末端にメルカプト基を有する一般式 （I ) のポリマーは、 様 々な溶媒、 例えば、 テトラヒドロフラン、 低級アル力ノール （例、 エタノール） 、 ジメチルホルムアミ ド、 トルエン、 キシレン等に安定に溶解もしくは分散できる 一般式 （I ) のポリマーをこうした溶媒に溶解もしくは分散させたものは、 本発 明にいう、 S P Rを応用したバイオセンサーの表面を形成するためのポリマー組 成物の一態様である。 かようなポリマー組成物には、 1種以上のポリマ一を含め ることができ、 また、 必要により、 他の添加剤、 例えば該表面に前記ポリマーを 高密度で固定できるような硫酸力リゥム等の無機塩を含めてもよい。
こうして調製されるポリマー組成物は、 一般的に、 いかなる形態であってもよ く、 ガラスまたはシリコンゥヱファー上に、 必要により金、 銀、 アルミニウム等 の接着性を改善するためにチタンの薄膜を蒸着した後、 金、 銀、 白金、 パラジゥ ム、 アルミニウムの層を堆積させたチップと接触させて、 金、 銀または白金上に 化学吸収 （または吸着） させることができる。 化学吸収 （または吸着） は、 理論 によって拘束されるものでないが、 ポリマーのメルカプト基と金属表面との反応 による金属-チォレート （以下、 複合体ともいう） の形成を介して起こるものと、 理解されている。 この吸収 （または吸着） は、 例えば、 半透明の金薄膜を担持す る支持体を、 上記ポリマー溶液中に浸漬するかまたは該支持体表面にポリマー溶 液を流がすことによって行う。 処理温度は、 使用するポリマーの種類によって最 適温度が変動するが、 一般的に溶媒の融点から沸点ま.での間であることができる。 なお、 操作上の都合を考慮すると、 室温付近が好適である。 室温付近で処理する 場合、 金属表面とポリマー溶液との接触時間は、 通常、 30分程度で十分である が、 1 24膀またはそれ以上の時間であってもよい。 こうして、 一般式 （I) のポリマーが金属表面に吸収 （または吸着） されるが、 必要により未吸収または 未吸着のポリマ一は洗浄除去してもよい。
ポリマー溶液のポリマ一濃度は、 ポリマーが溶解もしくは均一に分散している 状態にあれば、 何等限定されないが、 一般に、 10 200 / g/m 1が好まし い。
以上によって形成される一般式 （I) のポリマーがメルカプト基を介して化学 吸収 （または吸着） された金属表面 （例えば、 センサーチップ表面） は、 適度な 鎖長のポリエチレングリコ一ルセグメントに覆われるので、 金属表面からの直接 的な影響を実質的に受けず、 表面電荷がゼロないしは限りなくゼロ近くになるも のと考えられる。 したがって、 本発明の組成物で形成された金属表面では、 例え ば 10未満のエチレングリコール単位からなる末端を有するアルキレンチオール で被覆された金属表面においてしばしば観察される表面電荷に起因する生体由来 の分子種 （例、 正荷電したタンパク質） 等の非特異的吸着は実質的に生じない。 以下、 具体例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、 これらの例に本発 明を限定することを意図するものではない。 なお、 下記の例において、 ポリェチ レンセグメントは PEGと略記する。
製造例 1 片末端にメルカプト基、 他末端にァセタール基を有するヘテロテレケ リック PEGを有するポリマーの合成
1. ァセタール- PEG- SH (Mn = 5000) の合成
Figure imgf000010_0001
アルゴン置換した受器中に蒸留テトラヒドロフラン （THF) 20mlと開始 剤 3 3-ジエトキシ- 1-プロパノール 0.2mmo 1 (0.032ml) を加え、 さらに当量の力リウムナフタレンを加えて 15分撹拌することでメタノレイ匕を行つ た。 その後、 エチレンォキシド 22.7mmo 1 (1, 135ml) を加え、 室温 で 2日間撹拌し重合させた。 停止剤として N-スクシンイミゾル- 3- (2-ピリジ ルチオ） プロピオネート （SPDP) 0.4mmo 1 (0.125 g) を少量の蒸 留 T H Fに溶解せさ、 この溶液に対し前記の重合反応溶液を等圧滴下漏斗にて氷 冷下で滴下した。 一晩撹拌して停止反応を行った後に、 飽和食塩水洗浄 · クロ口 ホルム抽出、 エーテル再沈、 ベンゼン凍結乾燥を経て、 ポリマーを回収した。 回 収したポリマーは1 H - N M Rにて構造を確認し、 末端に導入された S P D P残基 の量は、 2-メルカプトエタノールと反応させることによって遊離した 2-チォピ リ ドンの UV吸収によっても確認した。
PEG-SS-Py 2.0 x 10— 2mmo 1 (10 Omg) を蒸留水 4m 1に溶 解させ、 さらに 5倍 mo 1量のジチオトレイトール 0. lmmo 1 (15.42m g)を加え、 室温で 30分撹拌した。 反応後、 飽和食塩水洗浄 ·クロ口ホルム抽 出 ·エーテル再沈を経てポリマー （以下、 PEG5000と略記する） を回収し た。 回収したポリマーは1 H-NMRによって構造を確認し、 さらに 2_ピリジノレ ジスルフィ ド （2- PDS) との反応により、 末端 SH基の定量を行った。
さらに、 上記エチレンォキシドの仕込み量を、 それぞれ減少および増加させた こと以外、 実質的に上記の操作を繰り返し、 それぞれ、
Figure imgf000011_0001
ぉょび n = 10000のポリマーを得た。 それぞれのポリマーを、 以下、 P E G 200 0および PEG 10000と略記する。 なお、 Mn値は PEGセグメン卜の分子 量を表す。
実施例 1 ： J 1センサ一チップ上への PEGの固定化
製造例 1に従って得られる各ポリマーを pH = 8.0のポロンバッファーに溶解 し、 SH含有 PEGに換算して 1、 5、 10、 20、 50〃g/mlの溶液を用 意した （ここでの濃度は SH含有 PEGに関しての値であり、 実際のサンプルは OH末端を含むので PEG濃度としては二倍程度の濃度となっている）。 この溶 液を 1時間 J 1センサ一チップ （B I ACORE由来） に 5 1 /分の流速で流 した後に、 10〃 1Z分の流速で 0.5%ドデシル硫酸ナトリウム （SDS) を 30分流すことで非特異吸着物を洗い流し、 該チップの金表面上に結合した物質 の定量を行った。
定量の結果は、 それぞれ PEG2000、 PEG5000および PEG 100 00を吸着させる前 （RUstart) および吸着させ、 そして SDS洗浄後 （RUS
DS) の RU値 （表面プラズモン共鳴を応用した B I ACOREバイオセンサ一シ ステムにおいて、 特定波長のレーザ一光を全反射するように照射し屈折率を測定 することにより、 表面に吸着された物質の量 1 n gZmm2が 1000RUに対 応するように設定された係数） を求め、 RUSDS値から RUスタート値を差し引 いた値を RU飽和値として示す。 さらに、 これらの RU飽和値をポリマーの分子 量で割つて 1 n m 2当たりに吸着されたポリマーの本数を固定されたポリマーの 密度とした。
以上の結果を下記表 1にまとめる。
表 1：各調製表面の特性
ポリマー 表面に流した RU飽和値 固定された
ポリマーの濃度 ポリマーの密度 ( g/m 1 ) (本 Znm2)
Figure imgf000012_0001
実施例 2 ：ポリマー吸着表面への各種タンパク質の吸着特性
実施例 1で調製した各調製表面を有する J 1センサーチップと比較としての C M5 (デキストランを J 1センサ一チップに吸着： B I AC ORE由来） との各 表面に、 ゥシ血清アルブミン （BSA：分子量 69000、 等電点 4. 9) リ ゾチーム （Ly s o z yme ：分子量 14300、 等電点 11) およぴァビジ ン （Av i d i n：分子量 68000、 等電点 10〜10. 5) の lmgZm 1 (10mMの PBS， pH7. 4)溶液を 5 1 Zm 1で 20分間流し、 吸着 曲線を得た後、 実施例 1と同様にして各 RU値を得た。 BSA、 Ly s o z ym eおよび Av i d i nの吸着量 （RU) を、 それぞれ、 下記表 2、 表 3、 および 表 4に示す。 表 2 ：各表面の BS A吸着量 [RU]
ポリマー
PEG2000 154. 7
PEG5000 499. 6
PEG10000 645. 6
CM5 123. 5 表 3 ：各表面の Ly s 0 z y me吸着量 [RU]
ポリマー タンパク質吸着直後
PEG2000 1358. 0
PEG5000 1038. 0
PEG10000 1413. 4
CM5 8775. 0 表 4 ：各表面の A V i d i n吸着量 [RU]
ポリマー タンパク質吸着直後
PEG2000 2364. 2
PEG5000 1710. 4
PEG10000 1784. 4
CM5 32694. 9 以上より、 PEG2000、 PEG5000および PEG 10000は、 デキ ストランが表面に吸着された CM 5に比べ、 各種タンパク質の非特異的吸着が有 意に低減し、 特に、 Ly s o z ymeと Av i d i nについては、 約 1 15〜 1ノ20に低減している。
産業上の利用可能性
本発明によれば、 バイオセンサー表面への生体成分等の非特異的吸着等を排除 したセンサ一チップが提供される。 したがって、 バイオセンサ一製造業およびそ のようなセンサ一を使用する診断業等で利用可能である。

Claims

請 求 の 範 囲
1. 有効成分としての下記一般式 （I) で表されるポリマ一、 溶媒および、 場 合により、 添加剤を含んでなる、 表面プラズモン共鳴 （SPR) を応用したバイ ォセンサ一の表面を形成するためのポリマー組成物：
一般式 （ I )
HS-L1-(B)ra-L2-(CH2CH20)n-L3-X (I) 上式中、 L!、 L2および L3は独立して、 原子価結合またはリンカ一を表し、 但し、 mが 0である場合には、 1^と L 2は一緒になつて原子価結合または 1個の リンカ一となることができ、
Bは式
0 0
II II
-0CHC0CHC-
R1 R2
Figure imgf000014_0001
を表し、 ここで R1および R2は独立して、 水素原子、 炭素原子 1〜5個のアルキ ル基であり、 そして pは 2〜 5の整数であり、
Xは水素原子、 官能基またはリガンドを表し、
mは 0〜10, 000の整数であり、 そして
nは 10〜20, 000の整数である。
2. 該バイオセンサ一の表面が、 金、，銀、 白金およびアルミニウムからなる群 より選ばれる少なくとも 1種の金属から作製されており、 そして該ポリマ一がそ のポリマー分子中のメルカプト基を介して該表面に化学吸収 （または吸着） され るものである請求項 1記載のポリマー組成物。
3. 式 （ I ) における mが 0〜10, 000であり、
1^が原子価結合、 -(CH2>^-0-
0
-fCH2>— C-0- または -CH2— S- q q のリンカ一を表すか、 あるいは mが 0である場合には、 と L 2は一緒になつて- 上記で L!について定義したリンカ一であることができ、 ここで、 qは 2〜6の 整数であり、 あるいは mが 0以外の場合には、 L2は— 0—または一 0— CH2C H2— 0であり、
L3が原子価結合または—（CH2)r—であり、 ここで rは 1〜6の整数であり、 そして
Xが水素原子；アルデヒド基 （一 CHO) ；水酸基；アミノ基；
Figure imgf000015_0001
の基、 ここで、 R3および R4は独立して d— 10アルキル基を表すか、 あるいは R3と R4は一緒になつて、 d— 6アル'キルで置換されていてもよいエチレン基を 形成する原子団である ；— NR5R6の基、 ここで R5および R6は独立して、 水素 原子または C卜 6アルキル基であり、 但し、 R 5および R 6はいずれか一方が水素 原子以外である ；ァクリロイル基；メタクリロイル基； ビニルベンジル基；ァリ ル基；およびパラトルエンスルホニル基からなる群より選ばれる官能基または糖 残基； ピオチン；抗原もしくは抗体および核酸からなる群より選ばれるリガンド を表す、 請求項 1または 2記載のポリマー組成物。
4. 式 （I) で表されるポリマ一が一般式 （I—a)
HS-La- (CH2CH20) n - (CH2) r -Xa (I一 a)
式中、 L aは — (CH 0—
0
II
-CH2)- -c- -o- または -CH2)— S- q を表し、 qは 2〜6の整数であり、 Xaは、 アルデヒド基または
Figure imgf000016_0001
の基、 ここで、 R3および R4は独立して C!— 10アルキル基を表すか、 あるいは R 3と R4は一緒になつて d -6アルキル基で置換されていてもよいエチレン基を形 成する原子団である、 を表し、
5 nは 10〜20， 000の整数であり、 そして
rは 1〜6の整数である
で表される請求項 1〜 3の 、ずれかに記載のポリマ一組成物。
5. 下記一般式 （I) で表されるポリマーが、 その片末端に存在するメルカプ ト基を介してセンサーチップ表面に吸収 （または吸着） した表面プラズモン共鳴0 (SPR) を検出するためのバイオセンサーチップ。
一般式 （ I )
HS-L1-(B)m-L2-(CH2CH20)„-L3-X (I)
上式中、 L!、 L2および L3は独立して、 原子価結合またはリンカ一を表し、 但し、 mが 0である場合には、 と L2は一緒になつて原子価結合または 1個の5 リンカ一となることができ、
Bは式 0 0
II II
-OCHC0CHC- R1 R2
0
-0(CH2)— C- または -0CH2CH- P CH3 を表し、 ここで R1および R2は独立して、 水素原子、 炭素原子 1〜5個のアルキ ル基であり、 そして pは 2〜 5の整数であり、
Xは水素原子、 官能基またはリガンドを表し、
mは 0〜10, 000の整数であり、 そして
nは 10〜20， 000の整数である。
6. 該センサーチップ表面が、 金、 銀、 白金およびアルミニウムからなる群よ り選ばれる少なくとも 1種の金属から作製されている請求項 5記載のバイオセン サ一チップ。
7. 表面プラズモン共鳴 （SPR) を応用したバイオセンサ一チップの表面を 形成するための、 下記一般式 （I)で表されるポリマーの使用：
一般式 （ I )
HS-L1-(B)m-L2-(CH2CH20)„-L3-X (I) 上式中、 L2および L3は独立して、 原子価結合またはリンカ一を表し、 但し、 mが 0である場合には、 1^と L2は一緒になつて原子価結合または 1個の リンカーとなることができ、
Bは式 0 0
II II
-0CHC0CHC-
R1 R2
0
-0(CH2)— C- または -0CH2CH- P CHS を表し、 ここで R1および R2は独立して、水素原子、 炭素原子 1〜5個のアルキ ル基であり、 そして pは 2〜 5の整数であり、
Xは水素原子、 官能基またはリガンドを表し、
mは 0〜10, 000の整数であり、 そして
nは 10〜20， 000の整数である。
8. 一般式 （I) ：
HS-L1-(B)ra-L2-(CH2CH20)n-L3-X (I) 上式中、 L!、 L2および L3は独立して、 原子価結合またはリンカ一を表し、 但し、 mが 0である場合には、 1^と L 2は一緒になつて原子価結合または 1個の リンカ一となることができ、
Bは式
Figure imgf000018_0001
0
-0(CH2)— C- または -0CH2CH- P CH3 を表し、 ここで R1および R2は独立して、 水素原子、炭素原子 1〜5個のアルキ ル基であり、 そして pは 2〜 5の整数であり、
Xは水素原子、 官能基またはリガンドを表し、
mは 0〜10, 000の整数であり、 そして nは 1 0〜2 0 , 0 0 0の整数である
で表されるポリマーの溶液もしくは懸濁液を金、 銀、 白金およびアルミニウムか らなる群より選ばれる表面を有するセンサ一チップの表面と接触させ、 該ポリマ —を、 そのポリマー中の片末端に存在するメルカプト基を介して該表面に化学吸 着または化学吸収させ、 次いで必要により、 該ポリマー中の官能基 Xを介してリ ガンドを共有結合させることを特徴とする表面プラズモン共鳴 （S P R) を応用 するバイオセンサーチップの作製方法。
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