WO2001082969A2 - Medicaments destines au traitement des pathologies tumorales contenant le compose r05-4864 et un agent inducteur de l'apoptose - Google Patents

Medicaments destines au traitement des pathologies tumorales contenant le compose r05-4864 et un agent inducteur de l'apoptose Download PDF

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WO2001082969A2
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inducing apoptosis
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Didier Decaudin
Guido Kroemer
Marie-France Poupon
Fariba Nemati
Arnaud Beurdeley-Thomas
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Centre National De La Recherche Scientifique
Institut Curie
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • the subject of the present invention is the use of the compound Ro5-4864, and of compounds derived from the latter corresponding to formula (I) below, for the preparation of medicaments intended for the treatment of tumor pathologies.
  • cancer therapy consists of the use of radiation therapy, chemotherapy, or a combination thereof.
  • products used in chemotherapy there are the compounds inducing 1 "apoptosis, namely the compounds having an effect of stimulating programmed cell death. These methods have harmful side effects, and are poorly supported by patients.
  • the present invention follows from the demonstration on an animal experimental model by the Inventors of the fact that the compound Ro5-4864, and the compounds derived from the latter corresponding to the formula (la) below, have a stimulating effect on apoptosis induced by the apoptosis-inducing compounds, higher than that observed with Diazepam and the compound PKI 1195 indicated above.
  • the subject of the present invention is the use of at least one compound chosen from those of formula (I) below:
  • halogen atom such as Cl
  • the invention more particularly relates to products comprising:
  • Combination products defined above preferred within the framework of the present invention are those comprising, as compound of formula (I), the compound Ro5-4864, the formula of which is indicated above.
  • the invention also relates to the combination products as defined above, comprising at least one agent inducing apoptosis, where appropriate inserted into a vector suitable for gene therapy, in particular a vector of viral origin, said agent being chosen from those which damage DNA, the natural or synthetic ligands of the glucocorticoid receptor, or other pro-apoptotic compounds.
  • a more particular subject of the invention is the combination products as defined above, characterized in that the agent inducing apoptosis is chosen from:
  • nitrogen mustards in particular cyclophosphamide,. platinum complexes,
  • topoisomerase inhibitors such as:. topoisomerase 2 inhibitors, in particular anthracyclines, epipodophyllotoxin such as etoposide,
  • topoisomerase 1 inhibitors in particular camptothecin derivatives
  • antifolates especially methotrexate
  • antipurines in particular 6-mercaptopurine
  • antipyrimidines in particular 5-fluorouracil
  • - antimitotics such as:
  • taxoids in particular taxol, taxotere,
  • - cytolytic compounds such as:. bleomycin,
  • - compounds such as lonidamine or derivatives, - monoclonal or other antibodies, or any compound or other immunotherapy treatment.
  • the above-mentioned combination products of the invention contain a product of formula (I) in which R t and R 2 represent a halogen atom such as Cl, advantageously the compound RO5-4864, and an inducing agent d apoptosis in a weight ratio of about 1: 5 to about 1: 1.
  • the doses of RO5-4864 envisaged in humans are between 1 and 10 mg daily.
  • the above-mentioned combination products of the invention also comprise one or more pharmaceutically acceptable vehicles, and are presented in an admirable form by oral or parenteral route, in particular by intramuscular, intravenous, or subcutaneous route.
  • the invention also relates to the use of the above-mentioned combination products, for the preparation of a medicament intended for the treatment of tumor pathologies as defined above.
  • the invention will be further illustrated by means of the following description of the implementation of experiments for measuring the effect of the compound Ro5-4864 in stimulating apoptosis induced by the apoptosis-inducing compounds.
  • mice - Weekly weighing of mice. Measure tumors 3 times a week.
  • V tumor volume
  • VTR relative tumor volume
  • VTR Vx / Vi, Vx the average volume at time x, Vi the average volume at time JO.
  • mice treated with the apoptosis-inducing compound only Comparison of the results obtained in mice treated with the apoptosis-inducing compound only, with the results obtained on the one hand in mice treated with the apoptosis-inducing compound and the compound Ro5-4864, and, on the other hand in mice treated with the compound Ro5-4864 alone.
  • mice treated with the apoptosis-inducing compound and the compound Ro5-4864 mice treated with the compound Ro5-4864 alone.
  • Apoptosis or programmed cell death, is controlled at the level of a common central effector located at the level of the mitochondria (Kroemer and Reed, 2000).
  • Mitochondrial membrane permeability (outer membrane) is the irreversible event that induces cell death. This permeability is under control, on the one hand, of a multiprotein complex allowing the opening or closing of membrane pores and, on the other hand, regulatory proteins such as Bcl-2 or Bax.
  • this multiprotein complex called the permeability transition pore, is the peripheral benzodiazepine receptor (RPB) (Zoratti and Szabo, 1995).
  • RPB ligands There are two benzodiazepine binding sites: the central receptors located in the S ⁇ C and at the level of the plasma membrane of the cells, and the peripheral receptors located mainly at the level of the external mitochondrial membrane.
  • RPB ligands endogenous ligands (DBI or diazepam binding inhibitor and porphyrins) and exogenous ligands (Benzodiazepines such as diazepam and 4 'chlorodiazepam (or R05-4864) and carboxamides of isoquinolines like the DBI or diazepam binding inhibitor and porphyrins) and exogenous ligands (Benzodiazepines such as diazepam and 4 'chlorodiazepam (or R05-4864) and carboxamides of isoquinolines like the
  • the human lines Jurkat (lymhoid T), SHEP (neuroblastoma) transfected with a control vector or with a vector bcl-2 or bcl-X, 143N2 (osteosarcoma) and SNB79
  • glioblastoma were cultivated in DMEM or RPMI 1640 (Sigma Chemical C °, St Louis,
  • the cells were cultured in the presence of anti-FasReceptor CHU antibodies (1 ⁇ g / ml; Immunotech, Marseille, France) or after exposure to R05-4864 (BioBlock Scientific, IHkirch, France), diazepam (Roche, Neuilly sur Seine, France), or PKI 1195 (BioBlock), at different concentrations.
  • Anti-FasReceptor CHU antibodies (1 ⁇ g / ml; Immunotech, Marseille, France) or after exposure to R05-4864 (BioBlock Scientific, IHkirch, France), diazepam (Roche, Neuilly sur Seine, France), or PKI 1195 (BioBlock), at different concentrations.
  • 2- Quantification of apoptosis and cell viability 2- Quantification of apoptosis and cell viability:
  • the lipophilic fluorochrome DiOC 6 (3) (Molecular Probes, Eu confusing, OR) was used to measure the membrane protein of the mitochondria ( ⁇ m ). Briefly, the cells were incubated for 15 min at 37 ° C. in the presence of 40 nM DiOC 6 (3), with immediate analysis of the incorporation of the fluorescence on a cytofluorometer of the Epies Profile II type (Coulter, Miami, FL). Hydroethydine (HE) (2 ⁇ M, 15 min at 37 ° C, Molecular Probes) was used to measure the production of superoxide anion (Marchetti et al., 1996). Finally, the proportion of cells that have lost part of the chromosomal DNA (subdiploid cells) was determined by propidium iodide on cells fixed in ethanol.
  • HE Hydroethydine
  • mice naked / naked, female, 6 to 8 weeks old and weighing about 30 g, were used for the in vivo experiments.
  • the mice grafted with human tumors were randomized into equivalent groups of 4 to 8 animals and treated as soon as the tumor reached a diameter of 5 mm (ie an approximate volume of 60 mm 3 ). Tumor growth was assessed by measuring the two perpendicular tumor diameters.
  • Chemotherapy administered intraperitoneally, included either etoposide alone at a dose of 12 mg / kg / day Dd on D3, or an etoposide combination 12 mg / kg / d + ifosfamide 90 mg / kg / d of Jl to J3.
  • RO5-4864 was prepared in an excipient containing 4- Tween ethanol and injected subcutaneously at a dose of 12 to 40 mg / kg / day from Dl to D3.
  • the control group received saline injections. 4- Statistical analyzes:
  • a suid t test was used to compare the growth of xenografted tumors in nude mice from different randomized groups.
  • RO5-4864, diazepam and PKI 1195 potentiate the apoptotic effect of the anti-FasR CHU antibody (Fig. 1A and IB).
  • This effect is maximum with RO5-4864 since, at equivalent concentration of 60 ⁇ M, the proportion of subdiploid cells (apoptotic) is 73%, 25% and 20% for R05-4864, PKI 1195 and diazepam, respectively, in association with the CHU.
  • RO5-4864 reverses the resistance to the anti-FasR CHU antibody of the SHEP-control, SHEP-bcl-2, or bcl-X L , 143N2 and SNB79 lines. Conversely, this reversion is observed with diazepam and PKI 1195 only on the SHEP-control line alone (Figs. 2, 3 and 4).
  • mice grafted with the human tumor SCLC61 were treated with etoposide injected intraperitoneally at a dose of 12 mg / kg / day from Dl to D3, with or without RO5-4864 at a dose of 12 mg / kg / d SC Jl to J3.
  • Tumor growth was not modified by R05-4864 alone.
  • the anti-tumor effect of etoposide is increased by concomitant administration of R05-4864 (p ⁇ 0.005) (fig. 5A).
  • the excipient of RO5- 4864, injected alone or in combination with etoposide does not modify the tumor growth of the control group and of the etoposide group.
  • the grafted SCLC6 tumors were treated with the combination of etoposide 12 mg / kg / day + ifosfamide 90 mg / kg / day from Dd to D3, with or without RO5-4864 40 mg / kg / d from Dd to D3.
  • RO5-4864 on several varieties of human lines, is capable of raising resistance to anti-FasR antibodies and, on two small cell bronchial carcinoma tumors, of increasing the anti-tumor effect chemotherapy combining etoposide +/- ifosfamide.
  • SHEP neuroblastoma line transfected with the bcl-2 or bcl-X L genes RO5-4864 reverses the resistance to anti-FasR antibodies.
  • RO5-4864 reverses the resistance to anti-FasR antibodies.
  • Figure 1 Culture of Jurkat cells in the presence of CHU with (white histograms) or without (black histograms) RO5-4864, PKI 1195 or diazepam.
  • A determination of the proportion of subdiploid cells (on the ordinate), as a function of the concentration in ⁇ M of the PBR RO5-4864, PK11195 and DIAZEPAM ligands.
  • B determination of the proportion of subdiploid cells (on the ordinate), as a function of the concentration in ⁇ M of the PBR RO5-4864, PK11195 and DIAZEPAM ligands.
  • RO5-4864 20 gray
  • Evaluation of cell viability (methylene blue test; percentage of cells on the ordinate), as a function of the concentration of RO5-4864 (0, 100 ⁇ M or RO 100, 200 ⁇ M or RO 200).
  • Figure 3 Culture of the 143 ⁇ 2 line in the presence of CHU with (histograms> 5 black) or without (gray histograms) RO5-4864, PKI 1195 or diazepam. Evaluation of cell viability (methylene blue test; percentage of cells on the ordinate), as a function of the concentration of RO5-4864 (100 ⁇ M or RO 100, 200 ⁇ M or RO 200), PKI 1195 (50 ⁇ M or PK50, 80 ⁇ M or PK80) and DIAZEPAM (50 ⁇ M or DIA50, 80 ⁇ M or DIA80). .0 4.
  • Figure 4 Culture of the SNB79 line in the presence of CHU with (•) or without (o) RO5-4684. Evaluation of cell viability (methylene blue test; percentage of cells on the ordinate), as a function of the concentration ( ⁇ M) of RO5-4864.
  • FIG. 5 in A, SCLC61 tumor xenografted in nude mice and treated with etoposide with (o) or without (A) R05-4684. Two control groups received the excipient of R05-4864 alone ( ⁇ ) or with etoposide (o).
  • B SCLC6 tumor xenografted in nude mice and treated with etoposide + ifosfamide with (o) or without (A) RO5-4684. The median volume of tumors is indicated on the ordinate according to the number of days after the start of treatment.
  • Two control groups received injections of either RO-4864 alone (D) or 0.9% NaCl (#).

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Abstract

La présente invention a pour objet l'utilisation du composé Ro5-4864, et de composés dérivés de ce dernier, pour la préparation de médicaments destinés au traitement des pathologies tumorales. L'invention concerne également les composés susmentionnés en association avec un agent inducteur de l'apoptose, comme produits de combinaison pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps, en thérapie cancéreuse.

Description

UTILISATION DU COMPOSE Ro5-48fJ4 ET DE COMPOSES DERIVES POUR LA PREPARATION DE MEDICAMENTS DESTINES AU TRAITEMENT DES PATHOLOGIES TUMORALES
La présente invention a pour objet l'utilisation du composé Ro5-4864, et de composés dérivés de ce dernier répondant à la formule (I) ci-après, pour la préparation de médicaments destinés au traitement des pathologies tumorales.
Actuellement, la cancérothérapie consiste en l'utilisation de la radiothérapie, de la chimiothérapie, ou de leur combinaison. Parmi les produits utilisés en chimiothérapie, on trouve les composés inducteurs de 1" apoptose, à savoir les composés ayant un effet de stimulation de la mort programmée des cellules. Ces méthodes ont des effets secondaires néfastes, et sont mal supportées par les patients.
L'utilisation d'agents pharmacologiques visant à augmenter la susceptibilité des cellules tumorales à l'induction de l' apoptose, serait très avantageuse dans la mesure où elle permettrait de réduire sensiblement la posologie des composés directement ou indirectement inducteurs d'apoptose utilisés en radio ou cl-imiothérapie.
A ce titre, le composé PKI 1195 de formule suivante
Figure imgf000002_0001
est décrit dans la demande internationale WO 99/66958 pour la préparation de médicaments destinés au traitement de cancers, en combinaison avec des inducteurs d'apoptose.
La présente invention découle de la mise en évidence sur un modèle expérimental animal par les Inventeurs du fait que le composé Ro5-4864, et les composés dérivés de ce dernier répondant à la formule (la) ci-après, ont un effet de stimulation de l'apoptose induite par les composés inducteurs d'apoptose, supérieur à celui observé avec le Diazépam et le composé PKI 1195 indiqué ci-dessus. La présente invention a pour objet l'utilisation d'au moins un composé choisi parmi ceux de formule (I) suivante :
Figure imgf000003_0001
dans laquelle : - Rj représente un atome d'hydrogène, ou un atome d'halogène tel que Cl,
- R2 un atome d'halogène tel que Cl, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des pathologies tumorales, ledit composé étant avantageusement en association avec au moins un agent inducteur de l 'apoptose, dans le cadre de produits de combinaison pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps, en thérapie cancéreuse.
L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation susmentionnée, du composé Ro5-4864 de formule suivante :
Figure imgf000003_0002
L'invention a plus particulièrement pour objet les produits comprenant :
* au moins un composé de formule (I) ci-dessus dans laquelle Rj et R2 représentent un atome d'halogène tel que Cl,
* et au moins un agent inducteur de l' apoptose, comme produits de combinaison pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps, en thérapie cancéreuse.
Des produits de combinaison définis ci-dessus préférés dans le cadre de la présente invention sont ceux comprenant à titre de composé de formule (I) le composé Ro5-4864 dont la formule est indiquée ci-dessus. L'invention concerne également les produits de combinaison tels que définis ci- dessus, comprenant au moins un agent inducteur de l' apoptose, le cas échéant inséré dans un vecteur approprié pour la thérapie génique, notamment un vecteur d'origine viral, ledit agent étant choisi parmi ceux qui endommagent l'ADN, les ligands naturels ou synthétiques du récepteur aux glucocorticoïdes, ou autres composés pro-apoptotiques. L'invention a plus particulièrement pour objet les produits de combinaison tels que définis ci-dessus, caractérisés en ce que l'agent inducteur de l'apoptose est choisi parmi :
- les dérivés des glucocorticoïdes, tels que la dexaméthasone,
- les agents alkylants tels que :
. les moutardes à l'azote, notamment le cyclophosphamide, . les complexes de platine,
. les dérivés de l'éthylène- riine,
. les dérivés de diméthane sulfonoxy-alcanes,
. les dérivés de la pipérazine,
- les inhibiteurs des topoisomérases tels que : . les inhibiteurs de la topoisomérase 2, notamment les anthracyclines, l'épipodophyllotoxine tel que l'étoposide,
. les inhibiteurs de la topoisomérase 1, notamment les dérivés de la camptothecine,
- les antirnétabolites tels que : . les antifolates, notamment le méthotrexate,
. les antipurines, notamment la 6-mercaptopurine, . les antipyrimidines, notamment la 5-fluorouracile, , - les antimitotiques tels que :
. les vinca-alcaloïdes,
. les taxoïdes, notamment le taxol, le taxotere,
- les composés cytolytiques tels que : . la bléomycine,
. la dacarbazine, . l'hydroxycarbamide, . l'asparaginase, . la mitoguazone, . la plicamycine,
- les radiations gamma,
- l'étoposide,
- la doxorubicine,
- des composés tels que la lonidamine ou dérivés, - des anticorps monoclonaux ou autres, ou tout composé ou autre traitement d ' immunothérapie .
De préférence, les produits de combinaison susmentionnés de l'invention, contiennent un produit de formule (I) dans laquelle Rt et R2 représentent un atome d'halogène tel que Cl, avantageusement le composé RO5-4864, et un agent inducteur d'apoptose dans un rapport en poids d'environ 1 : 5 à environ 1 : 1.
De préférence encore, les doses de RO5-4864 envisagées chez l'homme se situent entre 1 et 10 mg quotidiens.
Avantageusement, les produits de combinaison susmentionnés de l'invention, comprennent aussi un ou plusieurs véhicules pharmaceutiquement acceptables, et se présentent sous une forme admimstrable par voie orale ou parentérale, notamment par voie intramusculaire, intraveineuse, ou sous-cutanée.
L'invention concerne également l'utilisation de produits de combinaison susmentionnés, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des pathologies tumorales telles que définies ci-dessus. L'invention sera davantage illustrée à l'aide de la description qui suit de la mise en oeuvre d'expériences de mesure de l'effet du composé Ro5-4864 de stimulation de l' apoptose induite par les composés inducteurs d'apoptose.
- Matériel : souris nu/nu femelles, d'un poids de 30 g, âgées de 6-8 semaines. Élevage dans des conditions dépourvues d'agents pathogènes, sous lumière artificielle (12 heures de clarté, 12 heures d'obscurité).
- Greffe sous-cutanée interscapulaire des tumeurs humaines étudiées.
- Traitement des souris avec un composé inducteur d'apoptose tel que défini ci- , dessus, et le composé Ro5-4864, lorsque les tumeurs atteignent un diamètre d'environ 5 mm (ou un volume de 60 mm3).
-Pesée hebdomadaire des souris. Mesure 3 fois par semaine des tumeurs.
- Analyse : mesure du volume tumoral (V) et du volume tumoral relatif (VTR) :
- N = a2 x b/2, a le plus grand diamètre et b le plus petit diamètre de la tumeur.
- VTR = Vx/Vi, Vx le volume moyen au temps x, Vi le volume moyen au temps JO.
- Comparaison des résultats obtenus chez les souris traitées par le composé inducteur d'apoptose seulement, avec les résultats obtenus d'une part chez les souris traitées par le composé inducteur d'apoptose et le composé Ro5-4864, et, d'autre part chez les souris traitées par le composé Ro5-4864 seul. - Sacrifice des souris lorsque les tumeurs atteignent un volume de 2500 mm3.
I- Introduction
L'apoptose , ou mort cellulaire programmée, est contrôlée au niveau d'un effecteur central commun localisé au niveau des mitochondries (Kroemer and Reed, 2000). La perméabilité membranaire mitochondriale (membrane externe) constitue l'événement irréversible qui induit la mort cellulaire. Cette perméabilité est sous contrôle, d'une part, d'un complexe multiprotéique permettant lOuverture ou la fermeture de pores membranaires et, d'autre part, de protéines régulatrices comme Bcl-2 ou Bax. Dans ce complexe multiprotéique, appelé pore de transition de perméabilité, se trouve le récepteur périphérique des benzodiazépines (RPB) (Zoratti and Szabo, 1995). Il existe deux sites de fixation des benzodiazépines : les récepteurs centraux localisés dans le SΝC et au niveau de la membrane plasmique des cellules, et les récepteurs périphériques localisés principalement au niveau de la membrane externe mitochondriale. De même, il existe différents types de ligands des RPB : des ligands endogènes (DBI ou diazépam binding inhibitor et porphyrines) et des ligands exogènes (les Benzodiazépines comme le diazépam et le 4' chlorodiazépam (ou R05-4864) et les carboxamides d'isoquinolines comme le
PKI 1195).
Nous avons montré, sur différentes lignées cellulaires, que l'effet antitumoral des anticorps anti-Fas-récepteur (FasR) était augmenté par des ligands du RPB (R05-4864, diazépam et PKI 1195) et que cet effet était nettement (au moins 3 ou 4 fois) supérieur avec le RO-4864 qu'avec les autres composés. D'autre part, seul le R05-4864 est capable, sur une lignée transfectee par un gène de résistance à l'apoptose telle que les lignées surexprimant les gènes bcl-2 ou bcl-XL, d'augmenter l'effet apoptotique des anticorps anti- FasR. De même, sur deux tumeurs humaines de carcinome bronchique à petites cellules greffées chez la souris nude, nous avons montré que le R05-4864 augmentait l'effet de la chimiothérapie antitumorale.
II- Matériel et méthodes :
1- Lignées cellulaires, conditions de culture et induction de l'apoptose :
Les lignées humaines Jurkat (lymhoïde T), SHEP (neuroblastome) transfecté avec un vecteur contrôle ou avec un vecteur bcl-2 ou bcl-X , 143N2 (ostéosarcome) et SNB79
(glioblastome) ont été cultivées en DMEM ou RPMI 1640 (Sigma Chemical C°, St Louis,
MO) supplémenté en SVF 10% (Dutscher, Bru ath, France), pénicilline G(102 Ul/ l) + streptomycine (50 μg/ml) (Sigma) et L-glutamine (2nM, Sigma).
Les cellules ont été cultivées en présence d'anticorps anti-FasRécepteur CHU (1 μg/ml ; Immunotech, Marseille, France)
Figure imgf000007_0001
ou après exposition au R05- 4864 (BioBlock Scientific, IHkirch, France), diazépam (Roche, Neuilly sur Seine, France), ou PKI 1195 (BioBlock), à différentes concentrations. 2- Quantification de l'apoptose et de la viabilité cellulaire :
Le fluorochrome lipophilique DiOC6(3) (Molecular Probes, Eugène, OR) a été utilisé pour mesurer le protentiel membranaire des mitochondries (Δψm). Brièvement, les cellules ont été incubées 15 min à 37°C en présence de 40nM de DiOC6(3), avec analyse immédiate de l'incorporation de la fluorescence sur un cytofluoromètre de type Epies Profile II (Coulter, Miami, FL). L'hydroéthydine (HE) (2 μM, 15 min à 37°C, Molecular Probes) a été utilisée pour mesurer la production d'anion superoxide (Marchetti et al., 1996). Enfin, , la proportion de cellules ayant perdu une partie de l'ADN chromosomal (cellules subdiploïdes) a été déterminée par iodure de propidium sur cellules fixées en éthanol
(Nicoletti et al, 1991).
La viabilité cellulaire a été mesurée par un test au bleu de méthylène (Dimanche- Boitrel et al, 1992).
3- Etudes in vivo :
Des souris suisses, nu/nu, femelles, âgées de 6 à 8 semaines et pesant environ 30g, ont été utilisées pour les expériences in vivo. Pour les essais thérapeutiques, les souris greffées avec les tumeurs humaines ont été randomisées en groupes équivalents de 4 à 8 animaux et traitées dès que la tumeur atteignait un diamètre de 5 mm (soit un volume approximatif de 60 mm3). La croissance tumorale a été évaluée par la mesure des deux diamètres tumoraux perpendiculaires.
Deux tumeurs humaines de carcinome bronchique à petites cellules ont été utilisées, la SCLC6 et la SCLC61. La chimiothérapie, administrée par voie intrapéritonéale, a comporté, soit de l'étoposide seul à la dose de 12 mg/kg/j Jl à J3, soit une association étoposide 12 mg/kg/j + ifosfamide 90 mg/kg/j de Jl à J3. Le RO5-4864 a été préparé dans un excipient contenant éthanol 4- Tween et injecté par voie sous-cutanée à la dose 12 à 40 mg/kg/j de Jl à J3. Le groupe témoin a reçu des injections de sérum physiologique. 4- Analyses statistiques :
Un test suident t a été utilisé pour comparer la croissance des tumeurs xénogreffées chez les souris nude des différents groupes randomisés.
III- Résultats :
1- Etudes in vitro :
Sur la lignée lymphoïde T Jurkat, le RO5-4864, le diazépam et le PKI 1195 potentialisent l'effet apoptotique de l'anticorps anti-FasR CHU (Fig. 1A et IB). Cet effet est maximal avec le RO5-4864 puisque, à concentration équivalente de 60μM, la proportion de cellules subdiploïdes (apoptotiques) est de 73%, 25% et 20% pour le R05-4864, le PKI 1195 et le diazépam, respectivement, en association avec le CHU. Le RO5-4864 réverse la résistance à l'anticorps anti-FasR CHU des lignées SHEP- contrôle, SHEP-bcl-2, ou bcl-XL, 143N2 et SNB79. Inversement, cette réversion n'est observée avec le diazépam et le PKI 1195 que sur la seule lignée SHEP-contrôle (fig. 2, 3 et 4).
2- Etudes in vivo :
Les souris greffées avec la tumeur humaine SCLC61 ont été traitées par l'étoposide injecté par voie intrapéritonéale à la dose de 12 mg/kg/j de Jl à J3, avec ou sans RO5-4864 à la dose de 12 mg/kg/j SC Jl à J3. La croissance tumorale n'a pas été modifiée par le R05-4864 seul. Par contre, l'effet antitumoral de l'étoposide est augmenté par radministration concomitante de R05-4864 (p < 0.005) (fig. 5A). L'excipient du RO5- 4864, injecté seul ou en association avec l'étoposide, ne modifie pas la croissance tumorale du groupe contrôle et du groupe étoposide.
Les tumeurs SCLC6 greffées ont été traitées par l'association étoposide 12 mg/kg/j +ifosfamide 90 mg/kg/j de Jl à J3, avec ou sans RO5-4864 40 mg/kg/j de Jl à J3.
L'effet antitumoral de la chimiothérapie a été augmenté par le RO5-4864 (p<0.05) (fig. 5B). IV- Conclusion
L'ensemble de ces expériences montre que le RO5-4864, sur plusieurs variétés de lignées humaines, est capable de lever la résistance aux anticorps anti-FasR et, sur 2 tumeurs de carcinome bronchique à petites cellules, d'augmenter l'effet antitumoral d'une chimiothérapie associant étoposide +/- ifosfamide. De plus, sur la lignée de neuroblastome humain SHEP transfectee par les gènes bcl-2 ou bcl-XL , le RO5-4864 réverse la résistance aux anticorps anti-FasR. Différentes expériences ont montré que l'effet du RO5-4864 était nettement supérieur à celui du diazépam ou du PKI 11 5 et que, en particulier, le RO5-4864 était le seul capable de réverser la résistance aux anticorps anti-FasR sur la lignée SHEP transfectee par les gènes bcl-2 ou bcl-X .
V- Références :
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NI- Légendes des figures :
5
1. Figure 1 : culture des cellules Jurkat en présence de CHU avec (histogrammes blancs) ou sans (histogrammes noirs) RO5-4864, PKI 1195 ou diazépam. En A, détermination de la proportion de cellules subdiploïdes (en ordonnée), en fonction de la concentration en μM des ligands PBR RO5-4864, PK11195 et DIAZEPAM. En B,
10 détermination du % de cellules (en ordonnée), avec chute du (Δψm) (histogrammes noirs), production d'anion superoxide (histogrammes gris) et subdiploïdes (histogrammes blancs), en absence (o) ou en présence d'anticorps antiFas CHU (encore désigné Mab); en fonction de la concentration en μM des ligands PBR RO5-4864 (à 30μM ou RO30, et à 60 μM ou RO60), PKI 1195 (à 40μM ou PK40, et à 60 μM ou PK60) et DIAZEPAM (à 90μM ou
15 DIA90, et à 120μM ou DIA120).
2. Figure 2 : culture des lignées SHEP de contrôle (SHEP.control), des lignées SHEP transfectées par bcl2 (SHEP.Bcl2), et des lignées SHEP transfectées par bclXL (SHEP.BclXL), en présence de CHU avec (histogrammes noirs) ou sans (histogrammes
20 gris) RO5-4864. Evaluation de la viabilité cellulaire (test au bleu de méthylène; pourcentage de cellules en ordonnée), en fonction de la concentration de RO5-4864 (0, 100μM ou RO 100, 200μM ou RO 200).
3. Figure 3 : culture de la lignée 143Ν2 en présence de CHU avec (histogrammes >5 noirs) ou sans (histogrammes gris) RO5-4864, PKI 1195 ou diazépam. Évaluation de la viabilité cellulaire (test au bleu de méthylène; pourcentage de cellules en ordonnée), en fonction de la concentration de RO5-4864 (100μM ou RO 100, 200μM ou RO 200), PKI 1195 (50μM ou PK50, 80 μM ou PK80) et DIAZEPAM (50μM ou DIA50, 80μM ou DIA80). .0 4. Figure 4 : culture de la lignée SNB79 en présence de CHU avec (•) ou sans (o) RO5-4684. Évaluation de la viabilité cellulaire (test au bleu de méthylène; pourcentage de cellules en ordonnée), en fonction de la concentration (μM) de RO5-4864.
5. Figure 5 : en A, tumeur SCLC61 xenogreffée chez la souris nude et traitée par étoposide avec (o) ou sans (A) R05-4684. Deux groupes contrôles ont reçu l'excipient du R05-4864 seul (Δ) ou avec étoposide (o). En B, tumeur SCLC6 xenogreffée chez la souris nude et traitée par étoposide + ifosfamide avec (o) ou sans (A) RO5-4684. Le volume médian des tumeurs est indiqué en ordonnée en fonction du nombre de jours après le début du traitement. Deux groupes contrôles ont reçu des injections soit de RO-4864 seul (D), soit de NaC1 0,9% (#).

Claims

REVENDICATIONS
1. Produits comprenant :
* au moins un composé de formule (I) suivante :
Figure imgf000013_0001
dans laquelle Rt et R2 représentent un atome d'halogène tel que Cl,
* et au moins un agent inducteur de l'apoptose, comme produits de combinaison pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps, en thérapie cancéreuse.
2. Produit selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend à titre de composé de formule (I) le composé Ro5-4864 de formule suivante :
Figure imgf000013_0002
3. Produit selon la revendication 1 ou 2, se présentant sous une forme administrable par voie orale ou parentérale, notamment par voie intramusculaire ou intraveineuse.
4. Produit selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un agent inducteur de l'apoptose, le cas échéant inséré dans un vecteur approprié pour la thérapie génique, notamment un vecteur d' origine viral, ledit agent étant choisi parmi ceux qui endommagent l'ADN, les ligands naturels ou synthétiques du récepteur auxj glucocorticoïdes, ou autres composés pro-apoptotiques.
5. Produit selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'agent inducteur de l'apoptose est choisi parmi :
- les dérivés des glucocorticoïdes, tels que la dexaméthasone,
- les agents alkylants tels que : . les moutardes à l'azote, notamment le cyclophosphamide,
. les complexes de platine,
. les dérivés de l'émylène-jctnine,
. les dérivés de diméthane sulfonoxy-alcanes,
. les dérivés de la pipérazine, - les inhibiteurs des topoisomérases tels que :
. les inhibiteurs de la topoisomérase 2, notamment les anthracyclines, l'épipodophyllotoxine tel que l'étoposide,
. les inhibiteurs de la topoisomérase 1, notamment les dérivés de la camptothecine, - les antimétabolites tels que :
. les antifolates, notamment le méthotrexate,
. les antipurines, notamment la 6-mercaptopurine,
. les antipyrimidines, notamment la 5-fluorouracile,
- les antimitotiques tels que : . les vinca-alcalo'ides,
. les taxoïdes, notamment le taxol, le taxotere, - les composés cytolytiques tels que :
. la bléomycine, . la dacarbazine, . rhydroxycarbamide, . l'asparaginase,
. la mitoguazone, . la plicamycine,
- des composés tels que la lom^amine ou dérivés,
- ou des anticorps monoclonaux ou autres, ou tout composé ou autre traitement d'immunothérapie.
6. Produit selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un agent inducteur de l'apoptose choisi parmi :
- les radiations gamma, - l'étoposide,
- la doxorubicine,
- la dexamethasone,
- la lonidamine.
7. Produits selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisés en ce qu'ils contiennent un produit de formule (I) et un agent inducteur d'apoptose dans un rapport en poids d'environ 1 : 5 à environ 1 : 1.
8. Produits selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisés en ce qu'ils comprennent aussi un ou plusieurs véhicules pharmaceutiquement acceptables.
9. Utilisation de produits selon l'une des revendications 1 à 8, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des pathologies tumorales.
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