WO2010012965A2 - Association d'un ligand de tlr3 et d'un agent de chimiotherapie agissant sur la voie intrinseque de "l'apoptose" dans le traitement d'un cancer - Google Patents

Association d'un ligand de tlr3 et d'un agent de chimiotherapie agissant sur la voie intrinseque de "l'apoptose" dans le traitement d'un cancer Download PDF

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WO2010012965A2
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cells
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Serge Lebecque
Charles Dumontet
Yves Pacheco
Claire Rodriguez-Lafrasse
Florent Toscano
Yann Estornes
François VIRARD
Isabelle Coste-Invernizzi
Toufic Renno
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Hospices Civils De Lyon
Universite Claude Bernard Lyon I
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Definitions

  • the present invention relates to the field of drugs for the treatment of cancer. More specifically, the subject of the present invention is the medicinal combination of a TLR3 ligand and a chemotherapy or radiotherapy agent acting on the intrinsic pathway of "apoptosis" making it possible to obtain a synergistic effect in the context of treatment of cancer. Cancer treatments are actively researched.
  • the application WO2006 / 014653 has demonstrated that the receptor TLR3 (of the English "ToII Like Receptor 3”) is a therapeutic target in the treatment of cancer.
  • the family of TLRs comprises strongly conserved protein receptors, named TLR1 to TLR10.
  • TLRs transmembrane type 1 proteins comprising a "danger signal” extracellular domain and composed of numerous LRRs (Leucine-Rich Repeats) motifs, a transmembrane domain and an intracellular domain containing a Death Domain allowing the transduction of the activation signal.
  • LRRs Leucine-Rich Repeats
  • TLRs Although mammalian TLRs have a large number of common features and conserved signal transduction mechanisms, their biological functions are very different. When a TLR is activated, it selects a molecule named adapter to propagate the signal through its "Death Domain". Five adapters are known in the family of TLRs: MyD88, TIRAP (also named MAL), TRIF, TRAM and MRSA. The different biological functions are strongly related to the fact that these 5 different adapters are associated in various combinations with the TLRs and are the mediators of different signaling modes. In addition, TLRs are expressed in different ways in hematopoietic and non-hematopoietic cells. Therefore, the response of a TLR ligand depends on the one hand on the mode of TLR signaling and secondly the nature of the cells in which the TLR is expressed.
  • TLRs 1 to 10 The sequence of human TLRs 1 to 10 is described in patent application WO01 / 90151, although the sequence of these proteins is named differently in relation to the public nomenclature.
  • the nucleotide sequence and the amino acid sequence of TLR3 are accessible in "GenBank” respectively under numbers NM003265 and NP003256.
  • TLR3 TLR3 can directly trigger apoptosis in human cancer cells, J Immunol 2006, 176: 4894-4901), melanoma (Salaun et al.
  • TLR3 ligands are known, in particular viral and synthetic double-stranded RNAs, such as polyinosinic-polycytidylic acid (poly (I: C)), polyadenilic-polyuridilic acid (poly (A: U)) and the form modified (polyI: polyCi 2 U) (Carter et al .: Comparative studies of ampligen (mismatched double-stranded RNA) and interferons, J.
  • PoIy (I: C) The action of PoIy (I: C) is thus very likely independent of apoptosis, and the synergy with the platinum salt probably results from the proapoptotic effect of the platinum salt on the tumor and the immunostimulatory effect. of PoIy (I: C).
  • the mouse model can not be considered as a reliable model, the results of which can be transposed to humans.
  • the teaching of this document does not describe a method of therapeutic treatment in humans, any more than a drug incorporating, in addition to cisplatin, a TLR3 ligand.
  • WO 2007/144985 proposes to associate siRNA, an inhibitor of the expression of the RPN2 gene with chemotherapy agents, and in particular docetaxel or cisplatin.
  • the crystallographic analysis of the human TLR3 protein associated with its ligand suggests that the activation of the TLR3 receptor results from the multimerization of the receptor following its binding to a double-stranded RNA longer than 48 base pairs (Uu Lin, et al., "Structural basis of toll-like receptor 3 signaling with double-stranded RNA / 'Science (New York, N. Y) 1320 (2008), 379-81.) From this finding, siRNAs having a length of the order of 21 base pairs are considered as not being TLR3 ligands.
  • TLRs are capable of activating transcription of survival factors in many cell types
  • Pathogen-associated molecular patterns are growth and survival factors for human myeloma cells through Toll-like receptors , Leukemia 2006, 20: 1130-1137 .Hasan et al .: TLR9 expression and function is abolished by the cervical cancer-associated human papillomavirus type 16, J Immunol 2007, 178: 3186-3197, Bsibsi et al .: Identification of soluble CD14 as an endogenous agonist for Toll-like receptor 2 on human astrocytes by genome-scale functional screening of glial cell derived proteins, Glia 2007, 55: 473-482).
  • the invention relates to a medicament comprising separately or together (i) a TLR3 ligand and (ii) a chemotherapeutic agent acting on the intrinsic pathway of apoptosis selected from the topoisomerase 2 inhibitors, the alkylating agents platinum derivatives and PI3 kinase inhibitors, for simultaneous administration or spread over time in the treatment of cancer.
  • the drug according to the invention comprises a sequential administration (i) of an agent acting on the intrinsic pathway of apoptosis chosen from topoisomerase 2 inhibitors, platinum-derived alkylating agents and PI3 inhibitors. kinase (ii) and then a TLR3 ligand in the treatment of cancer.
  • this drug is intended for the treatment of squamous cell lung cancer, colon adenocarcinoma, mesothelioma, glioma, breast adenocarcinoma, melanoma, clear cell kidney cancer, prostate cancer. , hepatocarcinoma or multiple myeloma.
  • the chemotherapy agent is a platinum-derived alkylating agent, for example chosen from cisplatin and oxaliplatin.
  • the chemotherapy agent is an inhibitor of topoisomerase 2, for example chosen from etoposide and doxorubicin.
  • the chemotherapy agent is an inhibitor of PI3 kinase, for example chosen from wortmannin, LY294002, PIK-90 / BAY2-47, XL765, XL147, SFl 126, NVP-BEZ235, NVP-BGT226, GDC-0941, CAL-101 and GSK1059615.
  • PI3 kinase for example chosen from wortmannin, LY294002, PIK-90 / BAY2-47, XL765, XL147, SFl 126, NVP-BEZ235, NVP-BGT226, GDC-0941, CAL-101 and GSK1059615.
  • the TLR3 ligand used in combination with the above chemotherapy agents is a TLR3 agonist, and in particular a synthetic double-stranded RNA, such as poly (I: C) or a TLR3-specific ligand such as than poly (A: U).
  • a medicament comprising separately or together (i) a synthetic double-stranded RNA, a TLR3 ligand and in particular an agonist, such as poly (I: C), and ii) an alkylating agent derived from platinum, for example chosen from cisplatin and oxaliplatin, or a topoisomerase 2 inhibitor, for example selected from etoposide and doxorubicin, or an inhibitor of PI3 kinase, for example selected from wortmannin, LY294002, PIK-90 / BAY2-47, XL765, XL147, SF1 126, NVP -BEZ235, NVP-BGT226, GDC-0941, CAL-IO1 and GSK1059615, for simultaneous or time-course administration in the treatment of cancer.
  • an alkylating agent derived from platinum for example chosen from cisplatin and oxaliplatin, or a topoisomerase 2 inhibitor, for example selected from etop
  • the drug is in the form of a single pharmaceutical composition combining, in the same formulation, (i) a TLR3 ligand and (ii) a chemotherapy agent activating the intrinsic pathway apoptosis selected from topoisomerase 2 inhibitors, platinum-derived alkylating agents and PI3 kinase inhibitors.
  • the subject of the invention is therefore also the use of a TLR3 ligand and a chemotherapy agent acting on the intrinsic apoptosis pathway chosen from the topoisomerase 2 inhibitors, the alkylating agents derived from platinum and the PI3 kinase inhibitors, for the preparation of a medicament as defined above.
  • ligand refers to any molecule capable of specifically binding to another molecule or receptor.
  • ligand includes both agonists and antagonists.
  • a TLR3 ligand corresponds to a molecule or combination of molecules capable of driving the TLR3 multimerization and / or the conformational change necessary to activate the TLR3-controlled signaling pathway.
  • a ligand may be, for example, a small organic molecule, an antibody or antibody fragment, an oligonucleotide or a modified oligonucleotide, a polypeptide, a DNA or an RNA. From the nucleic acid and amino acid sequences of TLR3, those skilled in the art are capable of producing an antibody recognizing the protein, an oligonucleotide or a modified oligonucleotide, a polypeptide, a DNA or a MRIA according to the classical techniques of molecular biology.
  • the TLR3 ligands of the synthetic double-stranded RNA type as described on pages 20 to 26 of the patent application WO2006 / 054177, are preferred in the context of the invention.
  • agonist refers to a ligand capable of binding to a receptor and activating it.
  • TLR3 agonists can be identified by demonstrating their direct or indirect binding to the receptor (for example by biochemical, microscopic or flow cytometry techniques), and by demonstrating their ability to activate in cells expressing TLR3.
  • TLR3 functional at least one of the biological functions triggered by TLR3: production of inflammatory cytokines, type 1 interferon, activation of NF-kB and MAPKs p38 and JNK (Uematsu et al .: Toll-like receptors and Type I interferons, J Biol Chem 2007, 282: 15319-15323).
  • the TLR3 agonists will in particular be characterized by a cytokine concentration or a level of transcription activation higher than the values observed with the non-activated cells plus 2 standard deviations.
  • telomere binding ligand a ligand which is recognized only by the membrane receptor TLR3, and not by the intracellular receptors: RIG-I, MDA-5, PKR.
  • TLR3 ligand a ligand which is recognized only by the membrane receptor TLR3, and not by the intracellular receptors: RIG-I, MDA-5, PKR.
  • poly (A: U) ligand or specific synthetic double-stranded RNA as opposed to poly (I: C) whose activity is based not only on its interaction with TLR3 but also by intracellular receptors, whereas PoIy (A: U) specifically acts on TLR3.
  • the inventors have also demonstrated that the apoptotic activity of Poly (I: C) depends exclusively on TLR3 because: the inhibition (by siRNA) of the expression of RIG-I, MDA-5, PKR has no effect on PoIy (I: C) in our experimental conditions, Inhibition (by siRNA) of TLR3 or TRIF (the only molecule that adjusts TLR3 signaling) inhibits poly (I: C) -induced apoptosis, and poly (A: U) triggers apoptosis of cells sensitive to PoIy (I: C).
  • an antagonist refers to a ligand capable of binding to a receptor and preventing its activation.
  • an antagonist can bind to a receptor agonist and thereby prevent it from binding to a receptor.
  • the TLR3 antagonists thus defined are capable of blocking the activation of at least one of the biological functions triggered by a TLR3 agonist.
  • apoptosis refers to the programmed death of cells.
  • introduction pathway activating agent of apoptosis is meant those agents that directly or indirectly activate the mitochondrial-dependent apoptosis pathway, as can be established by demonstrating the protective role of the combined overexpression of Bcl molecules.
  • Bcl-XL Garnier et al .: Methods for the assessment of mitochondrial membrane permeabilization in apoptosis, Apoptosis 2007, 12: 803-813).
  • chemotherapy agent any chemical molecule used in the treatment of cancer.
  • chemotherapeutic agent acting on the intrinsic pathway of apoptosis use is made of an agent chosen from topoisomerase 2 inhibitors, alkylating agents derived from platinum and PI3 inhibitors ki ⁇ ase .
  • Platinum-derived alkylating agents, topoisomerase 2 inhibitors and PI3 kinase inhibitors lead to stronger synergistic effects than other chemotherapeutic agents acting on the intrinsic pathway of apoptosis.
  • topoisomerase inhibitor a platinum-derived alkylating agent or a PI3 kinase inhibitor
  • a PI3 kinase inhibitor is not arbitrary, since another class of chemotherapy agents, namely metabolites such as gemcitabine and 5-fluorouracil, leads to a little or no synergistic effect, see antagonist, as shown by the examples below.
  • platinum-derived alkylating agent molecules capable of covalently binding to DNA via a platinum atom.
  • platinum oxa molecules capable of covalently binding to DNA via a platinum atom.
  • cisplatin molecules capable of covalently binding to DNA via a platinum atom.
  • carboplatin molecules capable of covalently binding to DNA via a platinum atom.
  • topoisomerase 2 inhibitor is meant a molecule capable of preventing the function of the enzyme topoisomerase 2 which changes the topology of the DNA molecule and controls the twisting and winding of both strands of the molecule.
  • the topoisomerase activity is demonstrated by the appearance of high molecular weight complex formed from double-stranded DNA rings in the presence of the enzyme and ATP.
  • PI3 kinase inhibitor is meant a phosphatidylinositol 3-kinase inhibitor (PI3 kinase) which inhibits the PI3K / AKT kinase (or protein kinase B) signaling pathway and thus has antineoplastic activity by increasing the permeability of the mitochondrial membrane and apoptosis.
  • Inhibitors of PI3 kinases are, in most cases, compounds that interfere with the binding of ATP in the ATP binding site of PI3 kinases, thereby more or less specifically preventing the activity of these kinases. . In some cases, PI3 kinase inhibitors are allosteric inhibitors.
  • Examples of PI3 kinase inhibitors include wortmannin, LY294002 from Lilly, PIK-90 / BAY2-47 from Bayer, XL765 and XL147 from Exelixis, SF1126 from Semafore (Cancer res.
  • cancer refers to any pathological condition that is typically characterized by unregulated cell growth.
  • examples of cancer include carcinomas, lymphomas, blastomas, sarcomas and leukemias, and more specifically squamous cell carcinoma, colon adenocarcinoma, mesothelioma, glioma, breast radenocarcinoma, melanoma, clear cell kidney cancer, prostate cancer, hepatocarcinoma and multiple myeloma.
  • treatment means any prophylactic or suppressive therapeutic measure of a disease or disorder leading to a desirable clinical effect or any beneficial effect, including in particular the suppression or decrease of one or more symptoms, regression, slowing or cessation of cancer progression or associated disorder. Such treatment applies exclusively to humans.
  • therapeutically effective amount is meant any amount of a composition that improves one or more of the characteristic parameters of the cancer.
  • the two treatments can be simultaneous sequential, successive, spread over time.
  • the two active ingredients namely the TLR3 ligand and the chemotherapy agent acting on the intrinsic pathway of apoptosis, used in combination in the context of the invention, can be administered separately, each in a separate pharmaceutical composition, the administration may be simultaneous or spread over time, or administered together in a single pharmaceutical composition, the administration then being simultaneous.
  • the TLR3 ligand may be administered before (eg, 5 minutes, 15 minutes, 30 minutes, 45 minutes, 1 hour, 2 hours, 4 hours, 6 hours, 12 hours, 24 hours, 48 hours, 72 hours, 96 hours , 1 week, 2 weeks, 3 weeks, 4 weeks, 5 weeks, 6 weeks, 8 weeks, or 12 weeks before), concomitantly, or after (eg, 5 minutes, 15 minutes, 30 minutes, 45 minutes, 1 hour, 2 hours, 4 hours, 6 hours, 12 hours, 24 hours, 48 hours, 72 hours, 96 hours, 1 week, 2 weeks, 3 weeks, 4 weeks, 5 weeks, 6 weeks, 8 weeks, or 12 weeks after) administration of the chemotherapy agent or irradiation.
  • the time spread of the administration of the TLR3 ligand and the chemotherapy agent acting on the intrinsic pathway of apoptosis will be the one that allows the strongest synergy between the activation of extrinsic and intrinsic pathways. apoptosis of cancer cells, respectively.
  • the present invention also relates to the order of administration of the two agents which begins with the administration of the chemotherapy agent which causes DNA damage, and which continues with that of the TLR3 ligand. hindering the repair process of DNA. This administration sequence significantly increases the synergy of the pro-apoptotic activity of the two agents.
  • the present invention also relates to pharmaceutical compositions containing, with suitable excipients, separately or in a single formulation, an effective dose of a TLR3 ligand, and a chemotherapeutic agent acting on the intrinsic pathway of apoptosis.
  • These pharmaceutical compositions are exclusively intended for humans.
  • excipients are chosen according to the pharmaceutical form and the desired mode of administration.
  • Pharmaceutically acceptable excipients are well known to those skilled in the art.
  • the active ingredient (s) selected from TLR3 ligands, and chemotherapy agents acting under the intrinsic pathway of apoptosis may be administered in unit dosage forms, in admixture with conventional pharmaceutical carriers, to animals and humans for the prophylaxis or treatment of disorders or cancers herein. -above.
  • Suitable unit dosage forms include oral forms such as tablets, capsules, powders, granules and oral solutions or suspensions, sublingual, buccal, intratracheal, intranasal, dosage forms.
  • the active ingredients can be used in creams, ointments, solutions, lotions or eye drops.
  • each unit dose may contain from 0.1 to 10,000 mg of active ingredient in combination with a pharmaceutical carrier. This unit dose can be administered 1 to 5 times per day so as to administer a daily dosage to obtain the desired effect.
  • the main active ingredient is mixed with a pharmaceutical carrier, such as gelatin, starch, lactose, magnesium stearate, talc, gum arabic or the like.
  • a pharmaceutical carrier such as gelatin, starch, lactose, magnesium stearate, talc, gum arabic or the like.
  • the tablets can be coated with sucrose, a cellulose derivative, or other suitable materials or they can be treated in such a way that they have prolonged or delayed activity and continuously release a quantity predetermined active ingredient.
  • a preparation in capsules is obtained by mixing the active ingredient with a diluent and pouring the resulting mixture into soft or hard gelatin capsules.
  • compositions may also be in liquid form, for example solutions, emulsions, suspensions or syrups.
  • suitable liquid carriers may be, for example, water, organic solvents such as glycerol or glycols, as well as their mixtures, in varying proportions, in water.
  • a preparation in the form of a syrup or elixir or for administration in the form of drops may contain the active ingredient together with a sweetener, preferably a calorie-free sweetener, methylparaben and propylparaben as an antiseptic, as well as a flavoring agent. and a suitable dye.
  • a sweetener preferably a calorie-free sweetener, methylparaben and propylparaben as an antiseptic, as well as a flavoring agent. and a suitable dye.
  • the water-dispersible powders or granules may contain the active ingredient in admixture with dispersing agents or wetting agents, or suspending agents, such as polyvinylpyrrolidone, as well as with sweeteners or scorers. disgust.
  • suppositories are used which are prepared with binders melting at the rectal temperature, for example cocoa butter or polyethylene glycols.
  • aqueous suspensions, isotonic saline solutions or sterile and injectable solutions which contain pharmacologically compatible dispersing agents and / or wetting agents, for example propylene glycol or butylene glycol, are used.
  • the active ingredient may also be formulated in the form of microcapsules, optionally with one or more supports or additives, or with matrices such as a polymer or a cyclodextrin (patch, sustained-release forms). Treatment combining a chemotherapy agent and a TLR3 ligand may also be supplemented by radiotherapy.
  • the radiotherapy treatment may be performed before, during or after the administration of the pharmaceutical composition, a spacing of 1 minute to 96 hours that can be provided between the radiotherapy and the administration of the composition.
  • the radiotherapy treatment may be any type of radiation used to treat cancer. Ionizing radiation may be mentioned which causes the destruction of tumor cells or DNA damage in the area to be treated, and in particular X-rays or gamma or type of brachytherapy, irradiation, interstitial or intracavitary well known to those skilled in the art. The usual dosages can be used.
  • Figures 1A and 1B show the percentage changes of live NCIH-1703 cells at the end of culture in the presence of combinations of different concentrations of etoposide and PoIy (I: C) relative to the untreated culture.
  • Figure 2 shows the% of NCIH-H 1703 cells labeled by Annexin V at the end of culture after treatment with PoIy (I: C) determined in flow cytometry.
  • Figures 3A and 3B show isobolograms demonstrating the synergistic action of PoIy (I: C) with cisplatin and etoposide.
  • Figures 4A and 4B show the% of cells labeled with Annexin V at the end of culture after treatment with PoIy (I: C), etoposide and a combination of both.
  • Figure 5A shows the percentage changes of live NCIH-1703 line cells at the end of culture in the presence of combinations of different concentrations of Wortmannin and PoIy (I: C) relative to the culture without poly (I: C). .
  • Figure 5B shows the% of Annexin V labeled cells at the end of culture after treatment with Wortmannin, with or without PoIy (I: C). Materials and methods
  • Reagents Poly (I: C) was purchased from Invivogen (San Diego, CA, USA), trypsin (5% Trypsin EDTA) and DPBS Ix from Invitrogen (Cergy Pontoise, France).
  • Chemotherapy agents representing different classes were used: alkylating agents (Cisplatin (Cisplatin, Dako), Oxaliplatin (Eloxatin, Sanofi-Aventis)); topoisomerase 2 inhibitors (Etoposide (Etoposide, Merck), Doxorubicin (Adriblastine, Pfizer)); PI3 kinase inhibitors (wortmannin, Sigma),; anti-metabolite (5-Fluoro-Uracil (Fluouracil, Teva), gemcitabine (gemzar, LiIIy)); microtubule stabilizers of the taxane family (Paclitaxel (Taxol, Bristol Meyers), Docetaxel (Taxoter
  • the NCI-H292 and NCI-H 1703 cells are epidermoid lung cancer lines obtained from the ATCC (American Type Culture Collection).
  • the cells are cultured in dishes of 100 mm diameter in RPMI 1640 complete medium with glutabio (Laboratoires Eurobio, Les Ulis, France) supplemented with 10% fetal calf serum (FCS) (Invitrogen, Cergy Pontoise, France) and containing 100 U / ml penicillin (Invitrogen, Cergy Pontoise, France), 0.1 mg / ml streptomycin (Invitrogen, Cergy Pontoise, France), 1 mM sodium-pyruvate (Invitrogen, Cergy Pontoise, France), 10 ⁇ M d HEPES (Jacques Boy Institute of Biotechnology, Reims, France). These cells are maintained at 37 ° C. in a 5% CO 2 atmosphere.
  • RNAi Interference with / 1 RNA
  • siRNA small interfering RNA
  • Dharmacon small interfering RNA
  • control on-targetplus sicontrol non-targeting siRNA # 3; caspase 8 meaning
  • the NCI-H 1703 or NCI-H292 cells are cultured in a 100 mm dish and are then detached by trypsin and deposited in wells of 24-well plates at the rate of 50,000 cells per well in 400 ⁇ l of medium, and incubated. at 37 ° C during mix preparation.
  • siRNA duplexes are diluted in 100 ⁇ l of culture medium without serum or antibiotics, 3 ⁇ l of HiPerFect are added, then the solution is vortexed and incubated for 5-10 min. at room temperature.
  • the 100 .mu.l of mix are then added dropwise to the cells and the whole is homogenized by stirring the plate.
  • the culture medium is changed the next day.
  • siRNA concentration is 5 nM, and treatment with poly (I: C) is started 72 h after transfection.
  • poly (I: C) is started 72 h after transfection.
  • the efficiency of siRNAs caspase 8 and caspase 9 to decrease respectively the expression level of the caspase 8 and caspase 9 proteins was measured by Western blotting, and reached approximately 85% for siRNA caspase 8 and 75% for the siRNA caspase 9.
  • the cells were inoculated into a 96-well plate at the rate of 5,000 cells per 100 ⁇ l of complete medium per well.
  • the different chemotherapeutic agents were added at the final decreasing concentrations of 1 mM, 200 ⁇ M, 40 ⁇ M, or 8 ⁇ M (for oxaliplatin and 5-FU) or 100 ⁇ M, 20 ⁇ M, 40 ⁇ M, and 0, 8 ⁇ M (for cisplatin, gemcitabine, etoposide, doxorubicin, paclitaxel and docetaxel).
  • the culture media were aspirated and replaced with 100 ⁇ l of complete medium containing decreasing concentrations of Poly (I: C) (100 ⁇ g / ml, 20 ⁇ g / ml, 4 ⁇ g / ml, 0.8 ⁇ g / ml), and the cells were put back in culture for 7Oh.
  • Each treatment condition has been carried out in duplicate. The results are expressed in relative numbers of viable cells compared to the untreated control cultures.
  • the analysis was performed using the kit CellTiter 96® AQ ue0 u s One solution IECI Proliferation Assay (Promega, Charbonniere, France) following the manufacturer's instructions. Briefly, 20 ⁇ l of MTS were added to the culture medium of each well. Cells were placed for 2h in the incubator at 37 ° C. The analysis of the absorbance at 490 nm was carried out using a spectrophotometer (Multiskan® Ex, Thermo Fisher Scientific). A second measurement at 690 nm allowed the exclusion of non-specific absorbance. The Basic Optical Density (white) represents the average of 3 wells containing the culture medium alone and was subtracted from the recorded values. Each value corresponds to the average of the ODs of the duplicates. The results are expressed as relative values of the ODs relative to the untreated control cultures.
  • the cells are seeded in 24-well plates at a rate of 3.5 ⁇ 10 4 cells per well. After 48h, the culture medium is replaced at different times by culture medium alone or containing 100 ⁇ g / ml of Poly (I: C). The supernatant is recovered and the cells are rinsed with DPBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline). As before, the supernatant is recovered and the cells are treated with trypsin. Once the cells are detached, the action of trypsin is stopped with culture medium. The whole is recovered and mixed with supernatants previously recovered. The cells are centrifuged (1400 rpm, 5 min) and the supernatant is removed.
  • DPBS Dynabecco's Phosphate Buffered Saline
  • Annexin V-FUC / Propidium Iodide is labeled using an Annexin Kit V-FITC kit (AbCys SA, Paris, France) as indicated by the manufacturer. Briefly, the cells are resuspended in 100 ⁇ l of binding buffer, then incubated for 10 to 15 minutes at room temperature and protected from light with 2.5 ⁇ l. of Annexin V. A sufficient volume of propidium iodide is added to obtain a final concentration of 1 ⁇ g / ml. The samples were analyzed with a FACScablibur flow cytometer (BD Bioscience, San Jose, CA, USA) and the data processed using the FlowJo software (TreeStar, San Carlos, CA, USA).
  • Annexin Kit V-FITC kit AbCys SA, Paris, France
  • ICSOs Inhibitory Concentration 50%
  • CI combination index
  • the ICSO unit of the chemotherapies was homogenized in ⁇ g / ml.
  • the set of these IC50s makes it possible to calculate the ICs (Index of Combination), defined by the equation (IC50 C himiotherapy / poly (I: C) / IC50 c himiotitherapy) + (IC50 p0
  • the abscissa and the ordinate respectively represent the ICSOs of the poly (I: C) and the chemotherapy agent.
  • I1C50 of the poly (I: C) used alone and on the ordinate that of the chemotherapy molecule used alone.
  • a line connects these two points: it represents the theoretical additivity line.
  • C ⁇ S points are connected and constitute a curve whose ends are the crossings between the additivity line and the abscissa / ordinate axes. If the curve is confused with, or very close to, the additivity line, an additivity between the poly (I: C) and the chemotherapy agent is identified. If the curve is below or above, the two molecules act respectively in synergy or antagonism.
  • the cells are seeded the day before in T25 dishes (25 cm 2) at a rate of 1.10 6 cells / dishes. After 24 hours, the culture medium is replaced by a simple culture medium or containing poly (I: C) (10 ⁇ g / ml). One hour after the change of medium, the cells receive different doses of irradiation (2, 5, 10 Gy). After 24 hours, the cells are labeled with an Annexin V-FITC / Propidium Iodide kit as previously described. Results
  • Etoposide and PoIy have a complementary effect in vitro on reducing the number of living lung cancer cells.
  • Percentage changes of live NCIH-1703 line cells at the end of culture in the presence of combinations of different concentrations of etoposide and PoIy (I: C) relative to the untreated culture are shown in Figures 1A and 1B.
  • Figures 1A and 1B represent respectively the percentage of living cells at the end of culture as a function of (A) the concentration of etoposide or (B) that of PoIy (I: C).
  • Each Figure is representative of 6 independently performed experiments.
  • PoIy induces apoptosis of cells of cancerous lineages by activating the extrinsic pathway
  • Figure 2 demonstrates the effect of transfection of siRNAs caspase 8 and caspase 9 on the percentage of positive Annexin V cells induced by poly (I: C) treatment. 72 hours after transfection of control siRNA (sictrl), caspase 8 (sicasp ⁇ ), caspase 9 (sicasp9) or caspase 8 + caspase 9 (sicasp8 + 9), NCI-H 1703 cells are treated or not with 100 ⁇ g / ml of poly (I: C) for 24h.
  • Annexin V positive cells The percentage of Annexin V positive cells is measured by flow cytometry. The results presented are the average of 3 independent experiments. Error bar, +/- SE. Figure 2 shows that ⁇ 1/3 NCI-H1703 cells are apoptotic 24h after exposure to TLR3 ligand (against 11% in control wells).
  • Isobologram analysis illustrates the synergy of the combination of PoIy (LC) with cisplatin and etoposide on line NCI-H292H-1703
  • the IC50s of cisplatin, etoposide and PoIy (I: C) used alone with the cells of the NCI-H292 line are respectively 3.4 ⁇ M (+/- 0.8 ⁇ M), 18.67 ⁇ M (+/- 6.96 ⁇ M) and 14.3 ⁇ g / ml (+/- 2.09 ⁇ g / ml) (Table 1).
  • the isobolograms which represent the average of 6 independently performed experiments, show that the number of living NCI-H292 cells at the end of culture is reduced by 50% by combining cisplatin with a concentration of ⁇ 0.5 mM with PoIy ( I: C) at a concentration of ⁇ 0.5 ⁇ g / ml (FIG. 3A), or etoposide at a concentration of ⁇ 8 mM with poly (I: C) at a concentration of ⁇ 2 ⁇ g / ml (FIG. 3B).
  • the isobolograms illustrate the synergistic action of PoIy (I: C) with cisplatin and etoposide. Similar results were obtained for NCI-H 1703.
  • PoIy (I: C) induces apoptosis of NSCLC lines NCIH-1703 and NCIH-292.
  • the cells were labeled with the Annexin V after 24 hours of culture as provided in the material and methods.
  • the concentrations of PoIy (I: C) and chemotherapy agents were adjusted to correspond to the IC50s of each line.
  • the synergy is powerful: with wortmannin only 1 ⁇ M, 6% less living cells are observed after 24 hours, with the PoIy (I: C) alone lOO ⁇ g / ml, 26% less living cells after 24h, then only with the 2 molecules at the same concentrations, 71% less living cells are observed after 24 hours.

Abstract

La présente invention concerne un médicament comprenant séparément ou ensemble (i) un ligand de TLR3 et (ii) un agent de chimiothérapie agissant sur la voie intrinsèque de l'apoptose, pour une administration, simultanée ou étalée dans le temps dans le traitement du cancer, l'agent de chimiothérapie étant choisi parmi les inhibiteurs de la topoisomérase 2, les agents alkylants dérivés du platine et les inhibiteurs de PI3 kinase.

Description

Association d'un ligand de TLR3 et d'un agent de chimiothérapie agissant sur la voie intrinsèque de « l'apoptose » dans le traitement d'un cancer
La présente invention est relative au domaine des médicaments pour le traitement du cancer. Plus précisément, la présente invention a pour objet l'association médicamenteuse d'un ligand de TLR3 et d'un agent de chimiothérapie ou de radiothérapie agissant sur la voie intrinsèque de « l'apoptose » permettant d'obtenir un effet synergique dans le cadre du traitement d'un cancer. Les traitements de lutte contre le cancer font l'objet d'une recherche active. La demande WO2006/014653 a mis en évidence que le récepteur TLR3 (de l'anglais « ToII Like Receptor 3 ») est une cible thérapeutique dans le traitement du cancer. Comme mentionné dans la demande WO2006/014653, la famille des TLRs comprend des récepteurs protéiques fortement conservés, nommés TLRl à TLRlO. Ces TLRs humains sont des protéines transmembranaires de type 1 comportant un domaine extracellulaire récepteur du « signal de danger » et composé de nombreux motifs LRRs (de l'anglais « Leucine-Rich Repeats »), un domaine transmembranaire et un domaine intracellulaire contenant un Death Domain permettant la transduction du signal d'activation.
Bien que les TLRs des mammifères présentent un grand nombre de caractéristiques communes et des mécanismes de transduction du signal conservés, leurs fonctions biologiques sont très différentes. Quand un TLR est activé, il sélectionne une molécule nommée adaptateur pour propager le signal par l'intermédiaire de son « Death Domain ». Cinq adaptateurs sont connus dans la famille des TLRs : MyD88, TIRAP (également nommé MAL), TRIF, TRAM et SARM. Les différentes fonctions biologiques sont fortement liées au fait que ces 5 différents adaptateurs sont associés dans des combinaisons variées avec les TLRs et sont les médiateurs de différents modes de signalisation. De plus, les TLRs sont exprimés de manières différentes dans les cellules hématopoïétiques et non hématopoïétiques. Par conséquent, la réponse d'un ligand TLR dépend d'une part du mode de signalisation du TLR et d'autre part de la nature des cellules dans lesquelles le TLR est exprimé.
La séquence des TLR humains 1 à 10 est décrite dans la demande brevet WO01/90151, bien que la séquence de ces protéines soit nommée différemment par rapport à la nomenclature publique. La séquence nucléotidique et la séquence d'acide aminé du TLR3 sont accessibles dans « GenBank » respectivement sous les numéros NM003265 et NP003256.
L'expression des récepteurs TLR par les cellules cancéreuses humaines a conduit à l'étude des effets de leurs ligands sur la croissance tumorale. En particulier, les effets de l'activation de TLR3 sur des lignées de cancer du sein (Salaun B et al.: TLR3 can directly trigger apoptosis in human cancer cells, J Immunol 2006, 176:4894-4901), de mélanome (Salaun et al.: ToII- like receptor 3 expressed by melanoma cells as a target for therapy?, Clin Cancer Res 2007, 13:4565-4574), de myélome (Jego et al.: Pathogen- associated molecular patterns are growth and survival factors for human myeloma cells through Toll-like receptors, Leukemia 2006, 20:1130-1137), d'hépatome (Khvalevsky et al.: TLR3 signaling in a hepatoma cell line is skewed towards apoptosis, J CeII Biochem 2007, 100:1301-1312), du cancer du rein à cellules claires (Morikawa et al.: Identification of Toll-like receptor 3 as a potential therapeutic target in clear cell rénal cell carcinoma, Clin Cancer Res 2007, 13:5703-5709), de cancer de la prostate (.Paone et al.: Toll-like receptor 3 triggers apoptosis of human prostate cancer cells through a PKC-α dépendent mechanism, Carcinogenesis 2008), du gliome et du mésothéliome (observations non publiées) ont été analysés. Plusieurs ligands de TLR3 sont connus, notamment les ARN double brin viraux et synthétiques, tels que l'acide polyinosinique-polycytidylique (poly(I:C)), l'acide polyadénilique-polyuridilique (poly(A:U)) et la forme modifiée (polyI:polyCi2U) (Carter et al.: Comparative studies of ampligen (mismatched double-stranded RNA) and interferons, J Biol Response Mod 1985, 4:613-620) qui sont des ligands de haut poids moléculaire et de taille hétérogène (Alexopoulou et al.: Récognition of double-stranded RNA and activation of NF-kappaB by Toll-like receptor 3, Nature 2001, 413:732-738). Dans le cadre de l'invention, les inventeurs ont mis en évidence que les ligands de TLR3 qui agissent par la caspase 8, et donc par la voie extrinsèque de l'apoptose, conduisent, en combinaison avec des agents agissant par la voie intrinsèque, à un effet synergique, notamment sur l'apoptose des cellules de NSCLC. Les résultats présentés ci-après montrent des résultats de synergie obtenus avec différents agents, soit de radiothérapie, soit de chimiothérapie, et appartenant à des classes distinctes d'agents de chimiothérapie et ce de façon très reproductible.
Les publications antérieures commentées ci-après ne permettaient nullement d'envisager une telle association, dans le cadre d'un traitement thérapeutique :
- La publication dans Neoplasma, de Kovark J. et al., 1977 NLM270616), document Dl décrit l'efficacité de la combinaison de Poly(I:C) avec le cisplatine dans un modèle de leucémie myéloïde de rat (lignée RBA- le) in vivo. Néanmoins, dans le contexte expérimental décrit, il faut considérer que le Poly(I:C) active TLR3, mais aussi les récepteurs intracellulaires RIG-I et MDA-5. De plus, la sensibilité de la lignée RBA-Ie à l'activation de TLR3 (apoptose) n'est pas établie, et peu probable en fonction des résultats obtenus avec les tumeurs de souris. L'action du PoIy(I :C) est donc très vraisemblablement indépendante de l'apoptose, et la synergie avec le sel de platine résulte probablement de l'effet pro-apoptotique du sel de platine sur la tumeur et de l'effet immunostimulant du PoIy(I :C). Dans ce contexte, le modèle murin ne peut être considéré comme un modèle fiable, dont les résultats sont transposables chez l'homme. L'enseignement de ce document ne décrit nullement une méthode de traitement thérapeutique chez l'homme, pas plus qu'un médicament intégrant, en plus du cisplatine, un ligand de TLR3.
- Le document WO 2007/144985 propose d'associer des siRNA, inhibiteur de l'expression du gène RPN2 à des agents de chimiothérapie, et notamment le docetaxel ou le cisplatine. L'analyse cristallographique de la protéine TLR3 humaine associée à son ligand suggère que l'activation du récepteur TLR3 résulte de la multimérisation du récepteur suite à sa liaison à un ARN double brin d'une longueur supérieure à 48 paires de bases (Lin Uu, et al., "Structural basis of toll-like receptor 3 signaling with double-stranded RNA/' Science (New York, N. Y)1 320 (2008), 379-81). De cette constatation, les siRNA qui présentent une longueur de l'ordre de 21 paires de base sont considérés comme ne pouvant pas être des ligands de TLR3.
De plus, l'effet synergique mis en évidence dans le cadre de la présente invention n'était nullement évident, compte tenu du fait que :
- le rôle essentiel de la voie extrinsèque de l'apoptose pour induire la mort des cellules cancéreuses par l'activation de TLR3 n'avait pas été formellement démontré,
- de nombreux TLRs (y compris TLR3) sont capables d'activer la transcription de facteurs de survie dans de nombreux types cellulaires (Jego et al.: Pathogen-associated molecular patterns are growth and survival factors for human myeloma cells through Toll-like receptors, Leukemia 2006, 20:1130-1137 ; .Hasan et al.: TLR9 expression and function is abolished by the cervical cancer-associated human papillomavirus type 16, J Immunol 2007, 178:3186-3197; Bsibsi et al.: Identification of soluble CD14 as an endogenous agonist for Toll-like receptor 2 on human astrocytes by genome- scale functional screening of glial cell derived proteins, Glia 2007, 55:473- 482).
- des revues scientifiques récentes émettent des doutes sur la possibilité de combiner des ligands de TLR avec la chimiothérapie ou la radiothérapie pour traiter les cancers (Kelly et al.: TLR-4 signaling promûtes tumor growth and paclitaxel chemoresistance in ovarian cancer, Cancer Res 2006, 66:3859-3868 ; .Huang et al.: Listeria monocytogenes promotes tumor growth via tumor cell toll-like receptor 2 signaling, Cancer Res 2007, 67:4346-4352; Chen et al.: Régulation of IKKbeta by miR-199a affects NF- kappaB activity in ovarian cancer cells, Oncogene 2008).
Dans ce contexte, l'invention concerne un médicament comprenant séparément ou ensemble (i) un ligand de TLR3 et (ii) un agent de chimiothérapie agissant sur la voie intrinsèque de l'apoptose choisi parmi les inhibiteurs de la topoisomérase 2, les agents alkylants dérivés du platine et les inhibiteurs de PI3 kinase, pour une administration, simultanée ou étalée dans le temps dans le traitement du cancer.
De façon avantageuse, le médicament selon l'invention comprend une administration successive (i) d'un agent agissant sur la voie intrinsèque de l'apoptose choisi parmi les inhibiteurs de la topoisomérase 2, les agents alkylants dérivés du platine et les inhibiteurs de PI3 kinase (ii) puis d'un ligand de TLR3 dans le traitement du cancer.
Plus précisément, ce médicament est destiné au traitement du cancer pulmonaire épidermoïde, de l'adénocarcinome du colon, du mésothéliome, du gliome, de l'adénocarcinome du sein, du mélanome, du cancer du rein à cellules claires, du cancer de la prostate, de l'hépatocarcinome ou du myélome multiple.
Selon un mode de réalisation préféré qui conduit à un effet synergique important, l'agent de chimiothérapie est un agent alkylant dérivé du platine, par exemple choisi parmi le cisplatine et l'oxaliplatine.
Selon un autre mode de réalisation préféré qui conduit à un effet synergique important, l'agent de chimiothérapie est un inhibiteur de la topoisomérase 2, par exemple choisi parmi l'étoposide et la doxorubicine.
Selon un autre mode de réalisation préféré qui conduit à un effet synergique important, l'agent de chimiothérapie est un inhibiteur de la PI3 kinase, par exemple choisi parmi la wortmannin, le LY294002, le PIK- 90/BAY2-47, le XL765, le XL147, le SFl 126, le NVP-BEZ235, le NVP-BGT226, le GDC-0941, le CAL-101 et le GSK1059615.
De manière avantageuse, le ligand de TLR3 utilisé en combinaison avec les agents de chimiothérapie ci-dessus est un agoniste de TLR3, et notamment un ARN double brin synthétique, tel que le poly(I :C) ou encore un ligand spécifique de TLR3 tel que le poly (A :U).
La présente invention a donc pour objet, selon un mode de réalisation particulier, un médicament comprenant séparément ou ensemble (i) un ARN double brin synthétique, ligand de TLR3 et en particulier agoniste, tel que le poly(I :C), et {ii) un agent alkylant dérivé du platine, par exemple choisi parmi le cisplatine et l'oxaliplatine, ou un inhibiteur de la topoisomérase 2, par exemple choisi parmi l'étoposide et la doxorubicine, ou un inhibiteur de la PI3 kinase, par exemple choisi parmi ta wortmannin, le LY294002, le PIK- 90/BAY2-47, le XL765, le XL147, le SFl 126, le NVP-BEZ235, le NVP-BGT226, le GDC-0941, le CAL-IOl et le GSK1059615, pour une administration, simultanée ou étalée dans le temps dans le traitement du cancer.
Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, le médicament se présente sous la forme d'une composition pharmaceutique unique combinant, dans une même formulation, (i) un ligand de TLR3 et (ii) un agent de chimiothérapie activant la voie intrinsèque de l'apoptose choisi parmi les inhibiteurs de la topoisomérase 2, les agents alkylants dérivés du platine et les inhibiteurs de PI3 kinase.
L'invention a donc également pour objet l'utilisation d'un ligand de TLR3 et d'un agent de chimiothérapie agissant sur la voie intrinsèque de l'apoptose choisi parmi les inhibiteurs de la topoisomérase 2, les agents alkylants dérivés du platine et les inhibiteurs de PI3 kinase, pour la préparation d'un médicament tel que défini ci-dessus.
Les méthodes de traitement chez l'être humain correspondant à l'administration d'un tel médicament font également partie intégrante de l'invention. Définitions
Le terme « ligand » désigne toute molécule capable de se lier spécifiquement à une autre molécule ou à un récepteur. Le terme « ligand » inclut à la fois les agonistes et antagonistes. Un ligand de TLR3 correspond à une molécule ou une association de molécules capables d'entraîner la multimérisation de TLR3 et/ou le changement de conformation nécessaire pour activer la voie de signalisation contrôlée par TLR3.
Un ligand peut être, par exemple, une petite molécule organique, un anticorps ou fragment d'anticorps, un oligonudéotide ou un oligonucléotide modifié, un polypeptide, un ADN ou un ARN. A partir des séquences d'acide nucléique et d'acide aminé du TLR3, l'homme du métier est capable de produire un anticorps reconnaissant la protéine, un oligonucléotide ou un oligonucléotide modifié, un polypeptide, un ADN ou un ARIM selon les techniques classiques de biologie moléculaire. Notamment, les ligands de TLR3 du type ARN synthétique double brin, tels que décrits en pages 20 à 26 de la demande de brevet WO2006/054177 sont préférés dans le cadre de l'invention. A titre d'exemple non limitatif, on peut citer les dsRNA synthétiques poly(A:U), poly(I:C) commercialisés par la société Invivogen.
Le terme « agoniste » désigne un ligand capable de se lier à un récepteur et de l'activer. Pour plus de détails sur les agonistes de TLR3 qui peuvent être utilisés, dans le cadre de l'invention, on pourra se référer à la demande de brevet WO2006/054177, incorporée par référence. Les agonistes de TLR3 peuvent être identifiés par la démonstration de leur liaison directe ou indirecte au récepteur (par exemple par des techniques biochimiques, de microscopie ou de cytométrie de flux), et par la démonstration de leur capacité à activer dans des cellules exprimant le TLR3 fonctionnel au moins une des fonctions biologiques déclenchées par TLR3 : production de cytokines inflammatoires, dinterféron de type 1, d'activation de NF-kB et des MAPK p38 et JNK (Uematsu et al.: Toll-like receptors and Type I interferons, J Biol Chem 2007, 282:15319-15323). Le agonistes de TLR3 seront notamment caractérisés par une concentration en cytokines ou un niveau d'activation de transcription supérieur aux valeurs observées avec les cellules non activées plus 2 écarts types.
Par « ligand de TLR3 spécifique », on entend un ligand qui n'est reconnu que par le récepteur membranaire TLR3, et pas par les récepteurs intracellulaires : RIG-I, MDA-5, PKR. A titre d'exemple de tel ligand, on peut citer le ligand poly(A :U) ou des ARN double brin synthétique spécifique, par opposition au poly(I :C) dont l'activité est basée non seulement sur son interaction avec TLR3, mais aussi par les récepteurs intracellulaires, alors que le PoIy(A :U) agit spécifiquement sur le TLR3. Or, dans le cadre de l'invention, les inventeurs ont également démontré que l'activité apoptotique de Poly(I:C) dépend exclusivement de TLR3 car : - L'inhibition (par siRNA) de l'expression de RIG-I, MDA-5, PKR n'a aucun effet sur PoIy(I :C) dans nos conditions expérimentales, L'inhibition (par siRNA) de TLR3 ou de TRIF (la seule molécule adaptatrice de la signalisation de TLR3) inhibe l'apoptose induite par Poly(I:C), et que le poly(A :U) déclenche l'apoptose des cellules sensibles au PoIy(I :C).
Le terme « antagoniste » désigne un ligand capable de se lier à un récepteur et d'empêcher son activation. De manière alternative, un antagoniste peut se lier à un agoniste du récepteur et ainsi l'empêcher de se lier à un récepteur. Les antagonistes de TLR3 ainsi définis sont capables de bloquer l'activation d'au moins une des fonctions biologiques déclenchées par un agoniste de TLR3.
Le terme « apoptose » désigne la mort programmée de cellules. Par « agent activant la voie intrinsèque de l'apoptose », on entend les agents qui activent directement ou indirectement la voie de l'apoptose dépendant de la mitochondrie, comme il peut être établi en démontrant le rôle protecteur de la surexpression combinée des molécules Bcl-2 et BcI-XL (Galluzzi et al.: Methods for the assessment of mitochondrial membrane permeabilization in apoptosis, Apoptosis 2007, 12:803-813).
Par « agent de chimiothérapie », on désigne toute molécule chimique utilisée dans le traitement du cancer.
Dans le cadre de l'invention, à titre d'agent de chimiothérapie agissant sur la voie intrinsèque de l'apoptose, on utilise un agent choisi parmi les inhibiteurs de la topoisomérase 2, les agents alkylants dérivés du platine et les inhibiteurs de PI3 kiπase. Les agents alkylants dérivés du platine, les inhibiteurs de la topoisomérase 2 et les inhibiteurs de PI3 kinase conduisent à des effets synergiques plus marqués, que d'autres agents de chimiothérapie agissant sur la voie intrinsèque de l'apoptose. En effet, Le choix d'un inhibiteur de topoisomérase, d'un agent alkylant dérivé du platine ou d'un inhibiteur de PI3 kinase n'est pas arbitraire, puisque une autre classe d'agents de chimiothérapie, à savoir les agents anti-métabolites tels que la gemcitabine et la 5-fluorouracile, conduit à un effet peu ou pas synergique, voir antagoniste, comme le montrent les exemples ci-après.
Par « agent alkylant dérivé du platine», on entend les molécules capables de se fixer à l'ADN de manière covalente par l'intermédiaire d'un atome de platine. A titre d'exemple, on peut citer l'oxa Ii platine, le cisplatine, le carboplatine.
Par « inhibiteur de la topoisomérase 2 », on entend une molécule capable d'empêcher la fonction de l'enzyme topoisomérase 2 qui change la topologie de la molécule d'ADN et contrôle la torsion et l'enroulement des deux brins de la molécule. On met en évidence l'activité topoisomérase par l'apparition de complexe de haut poids moléculaire formé à partir d'anneaux d'ADN double brin en présence de l'enzyme et d'ATP. Ces complexes sont révélés par un ralentissement de vitesse de migration de l'ADN dans un gel ou directement visualisés par microscopie électronique (Goto et al.: Cloning of yeast TOPl, the gène encoding DNA topoisomérase I, and construction of mutants defective in both DNA topoisomérase I and DNA topoisomérase II, Proc Natl Acad Sci U S A 1985, 82:7178-7182). A titre d'exemple d'inhibiteur de la topoisomérase 2, on peut citer l'étoposide, le ténoposide, la doxorubicine et l'adriamycine. Par « inhibiteur de la PI3 kinase », on entend un inhibiteur de phosphatidylinositol 3-kinase (PI3 kinase) qui inhibe la voie de signalisation PI3K/AKT kinase (ou protéine kinase B) et possède ainsi une activité antinéoplasique en augmentant la perméabilité de la membrane mitochondriale et l'apoptose. Les inhibiteurs des PI3 kinases sont, le plus souvent, des composés qui interfèrent avec la fixation de l'ATP dans le site de liaison de l'ATP des PI3 kinases, empêchant par là de manière plus ou moins spécifique l'activité de ces kinases. Dans certains cas, les inhibiteurs de PI3 kinases sont des inhibiteurs allostériques. On pourra notamment se référer aux publications suivantes qui décrivent des inhibiteurs de PI3 kinase, (plus ou moins spécifiques de la PI3 kinase), en développement dans le cadre de cancers : Romina Marone et al., "Targeting phosphoinositide 3-kinase: moving towards therapy," Biochimica Et Biophysica Acta, 1784 (2008), 159-185 et Saskia Brachmann et al., "PI3K and mTOR inhibitors: a new génération of targeted anticancer agents," Current Opinion in CeII Biology, 21 (2009), 194-198. On pourra notamment utiliser, dans le cadre de l'invention, les inhibiteurs de PI3 kinase décrits dans le Tableau 2 de la publication de Romina Marone et al., "Targeting phosphoinositide 3-kinase: moving towards therapy," Biochimica Et Biophysica Acta, 1784 (2008), 159-185. A titre d'exemple d'inhibiteur de PI3 kinase, on peut citer la wortmannin, le LY294002 de Lilly, le PIK-90/BAY2-47 de Bayer, le XL765 et XL147 de Exelixis, le SF1126 de Semafore (Cancer res. 2008, 68, 206-215), le NVP-BEZ235 (Mol. Cancer Ther., 2008, 7, 1851-1863) et le NVP-BGT226 de Novartis, le GDC-0941 de Genentech (J. Med. Chem., 2008, 51, 5522-5532), le CAL-101 de Calistoga Pharmaceuticals et le GSK1059615 de Glaxo-Smith Kline, dont les formules développées sont données dans le Tableau 2 de la publication de Romina Marone et al., "Targeting phosphoinositide 3-kinase: moving towards therapy," Biochimica Et Biophysica Acta, 1784 (2008), 159-185 à laquelle on pourra se référer pour plus de détails.
Le terme « cancer » désigne toute condition pathologique qui est typiquement caractérisée par une croissance déréglée des cellules. A titre d'exemple de cancer, on peut citer les carcinomes, lymphomes, blastomes, sarcomes et leucémies, et plus précisément le cancer pulmonaire épidermoïde, l'adénocarcinome du colon, le mésothéliome, le gliome, radénocarcinome du sein, le mélanome, le cancer du rein à cellules claires, le cancer de la prostate, l'hépatocarcinome et le myélome multiple. Le terme « traitement » désigne toute mesure thérapeutique prophylactique ou suppressive d'une maladie ou désordre conduisant à un effet clinique souhaitable ou à tout effet bénéfique, incluant notamment la suppression ou la diminution de un ou plusieurs symptômes, la régression, le ralentissement ou la cessation de la progression du cancer ou du désordre qui y est associé. Un tel traitement s'applique exclusivement à l'être humain. Par « quantité thérapeutiquement efficace », on désigne toute quantité d'une composition qui améliore un ou plusieurs des paramètres caractéristiques du cancer.
Les deux traitements, celui avec te ligand de TLR3 et celui avec l'agent de chimiothérapie, peuvent être simultanés séquences, successifs, étalés dans le temps. Les deux principes actifs, à savoir le ligand de TLR3 et l'agent de chimiothérapie agissant sur la voie intrinsèque de l'apoptose, utilisés en combinaison dans le cadre de l'invention, peuvent être administrés séparément, chacun dans une composition pharmaceutique distincte, l'administration pouvant être simultanée ou étalée dans le temps, ou administrés conjointement dans une composition pharmaceutique unique, l'administration étant alors simultanée.
Différents ordres d'administration peuvent être prévus dans le cadre d'une administration étalée dans le temps. Le ligand de TLR3 peut être administré avant (par exemple, 5 minutes, 15 minutes, 30 minutes, 45 minutes, 1 heure, 2 heures, 4 heures, 6 heures, 12 heures, 24 heures, 48 heures, 72 heures, 96 heures, 1 semaine, 2 semaines, 3 semaines, 4 semaines, 5 semaines, 6 semaines, 8 semaines, ou 12 semaines avant), de manière concomitante, ou après (par exemple, 5 minutes, 15 minutes, 30 minutes, 45 minutes, 1 heure, 2 heures, 4 heures, 6 heures, 12 heures, 24 heures, 48 heures, 72 heures, 96 heures, 1 semaine, 2 semaines, 3 semaines, 4 semaines, 5 semaines, 6 semaines, 8 semaines, ou 12 semaines après) l'administration de l'agent de chimiothérapie ou l'irradiation.
De préférence, l'étalement dans le temps de l'administration du ligand de TLR3 et de l'agent de chimiothérapie agissant sur la voie intrinsèque de l'apoptose sera celui qui permet la plus forte synergie entre l'activation des voies extrinsèques et intrinsèques de l'apoptose des cellules cancéreuses, respectivement. En particulier, la présente invention a également pour objet l'ordre d'administration des deux agents qui commence par l'administration de l'agent de chimiothérapie qui entraine des dommages de l'ADN, et qui se poursuit par celle du ligand de TLR3 qui entrave le processus de réparation de l'ADN. Cette séquence d'administration augmente significativement la synergie de l'activité pro-apoptotique des 2 agents.
La présente invention a également pour objet les compositions pharmaceutiques contenant avec des excipients convenables, séparément ou sous une formulation unique, une dose efficace d'un ligand de TLR3, et d'un agent de chimiothérapie agissant sur la voie intrinsèque de l'apoptose. Ces compositions pharmaceutiques sont exclusivement destinées à l'être humain.
Lesdits excipients sont choisis selon la forme pharmaceutique et le mode d'administration souhaité. Les excipients pharmaceutiquement acceptables sont bien connus de l'homme du métier.
Dans les compositions pharmaceutiques de la présente invention pour l'administration orale, sublinguale, sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse, topique, intratrachéale, intranasale, transdermique, rectale ou intraoculaire, le ou les principes actifs choisis parmi les ligands de TLR3, et les agents de chimiothérapie agissant sous la voie intrinsèque de l'apoptose, peuvent être administrés sous des formes unitaires d'administration, en mélange avec des supports pharmaceutiques classiques, aux animaux et aux êtres humains pour la prophylaxie ou le traitement des troubles ou des cancers ci-dessus. Les formes unitaires d'administration appropriées comprennent les formes par voie orale telles que les comprimés, les gélules, les poudres, les granules et les solutions ou suspensions orales, les formes d'administration sublinguale, buccale, intratrachéale, intranasale, les formes d'administration sous-cutanée, intramusculaire ou intraveineuse et les formes d'administration rectale. Pour l'application topique, on peut utiliser les principes actifs dans des crèmes, pommades, solutions, lotions ou collyres.
Afin d'obtenir l'effet prophylactique ou thérapeutique désiré, chaque dose unitaire peut contenir de 0,1 à 10000 mg, de principe actif en combinaison avec un support pharmaceutique. Cette dose unitaire peut être administrée 1 à 5 fois par jour de façon à administrer un dosage journalier permettant d'obtenir l'effet souhaité.
Lorsqu'on prépare une composition solide sous forme de comprimés, on mélange l'ingrédient actif principal avec un véhicule pharmaceutique, tel que la gélatine, l'amidon, le lactose, le stéarate de magnésium, le talc, la gomme arabique ou analogues. On peut enrober les comprimés de saccharose, d'un dérivé cellulosique, ou d'autres matières appropriées ou encore on peut les traiter de telle sorte qu'ils aient une activité prolongée ou retardée et qu'ils libèrent d'une façon continue une quantité prédéterminée de principe actif.
On obtient une préparation en gélules en mélangeant l'ingrédient actif avec un diluant et en versant le mélange obtenu dans des gélules molles ou dures.
Les compositions pharmaceutiques peuvent aussi se présenter sous forme liquide, par exemple des solutions, des émulsions, des suspensions ou des sirops. Les supports liquides appropriés peuvent être, par exemple, l'eau, les solvants organiques tels que le glycérol ou les glycols, de même que leurs mélanges, dans des proportions variées, dans l'eau.
Une préparation sous forme de sirop ou d'élixir ou pour l'administration sous forme de gouttes peut contenir l'ingrédient actif conjointement avec un édulcorant, acalorique de préférence, du méthylparaben et du propylparaben comme antiseptique, ainsi qu'un agent donnant du goût et un colorant approprié. Les poudres ou les granules dispersibles dans l'eau peuvent contenir l'ingrédient actif en mélange avec des agents de dispersion ou des agents mouillants, ou des agents de mise en suspension, comme la polyvinylpyrrolidoπe, de même qu'avec des édulcorants ou des correcteurs de goût.
Pour une administration rectale, on recourt à des suppositoires qui sont préparés avec des liants fondant à la température rectale, par exemple du beurre de cacao ou des polyéthylèneglycols. Pour une administration parentérale, on utilise des suspensions aqueuses, des solutions salines isotoniques ou des solutions stériles et injectables qui contiennent des agents de dispersion et/ou des mouillants pharmacologiquement compatibles, par exemple le propylèneglycol ou le butylèneglycol. Le principe actif peut être formulé également sous forme de microcapsules, éventuellement ave un ou plusieurs supports ou additifs, ou bien avec des matrices telles qu'un polymère ou une cyclodextrine (patch, formes à libération prolongée). Le traitement associant un agent de chiomiothérapie et un ligand de TLR3 peut également être complété par une radiothérapie. Le traitement par radiothérapie peut être effectué avant, pendant ou après l'administration de la composition pharmaceutique, un espacement de 1 minute à 96 heures pouvant être prévu entre la radiothérapie et l'administration de la composition. Le traitement de radiothérapie, pourra être tout type de radiation utilisée pour traiter le cancer. On peut citer les radiations ionisantes qui entraînent la destruction de cellules tumorales ou endommagent l'ADN dans la zone à traiter, et notamment les rayons X ou gammas ou type de brachythérapie, irradiation, interstitielle ou intracavitaire bien connue de l'homme du métier. Les dosages habituels pourront être utilisés.
La partie expérimentale qui suit, en référence aux figures annexées, permet d'illustrer l'invention, et n'a aucun caractère limitatif. Les Figures IA et IB représentent les variations de pourcentages de cellules de la lignée NCIH-1703 vivantes en fin de culture en présence de combinaisons de différentes concentrations d'étoposide et de PoIy(I :C) par rapport à la culture non traitée.
La Figure 2 montre le % de cellules NCIH-H 1703 marquées par l'Annexin V en fin de culture après traitement avec le PoIy(I :C) déterminé en cytométrie de flux.
Les Figures 3A et 3B représentent des isobologrammes mettant en évidence l'action synergique de PoIy(I :C) avec le cisplatine et l'étoposide.
Les Figures 4A et 4B montrent le % de cellules marquées par i'Annexin V en fin de culture après traitement avec le PoIy(I :C), l'étoposide et une combinaison des deux.
La Figure 5A représente les variations de pourcentages de cellules de la lignée NCIH-1703 vivantes en fin de culture en présence de combinaisons de différentes concentrations de Wortmannin et de PoIy(I :C) par rapport à la culture sans poly(I :C).
La Figure 5B montre le % de cellules marquées par l'Annexin V en fin de culture après traitement avec la Wortmannin, avec ou sans PoIy(I :C). Matériels et Méthodes
Réactifs Le Poly(I:C) a été acheté chez Invivogen (San Diego, CA, USA), la trypsine (5% Trypsine EDTA) et le DPBS Ix chez Invitrogen (Cergy Pontoise, France). Les agents de chimiothérapie représentant différentes classes ont été utilisés : agents alkylants (Cisplatine (Cisplatin, Dako), Oxaliplatine (Eloxatine, Sanofi-Aventis)) ; inhibiteurs de topoisomérase 2 (Etoposide (Etoposide, Merck), Doxorubicine (Adriblastine, Pfizer)) ; inhibiteurs de PI3 kinase (la wortmannin, Sigma), ; anti-métabolite (5-Fluoro- Uracil (Fluouracile, Teva), gemcitabine (gemzar, LiIIy)) ; stabilisateurs des microtubules de la famille des taxanes (Paclitaxel (Taxol, Bristol Meyers), Docetaxel (Taxotere, Aventis)).
Cellules et Conditions générales de culture cellulaire
Les cellules NCI-H292 et NCI-H 1703 sont des lignées de cancer pulmonaire épidermoïde obtenues auprès de l'ATCC (American Type Culture Collection). Les cellules sont cultivées en boites de 100 mm de diamètre dans un milieu complet RPMI 1640 avec glutabio (Laboratoires Eurobio, Les Ulis, France) supplémenté par 10 % de sérum de veau fœtal (SVF) (Invitrogen, Cergy Pontoise, France) et contenant 100 U/ml de pénicilline (Invitrogen, Cergy Pontoise, France), 0,1 mg/ml de streptomycine (Invitrogen, Cergy Pontoise, France), 1 mM de Sodium-pyruvate (Invitrogen, Cergy Pontoise, France), 10 μM d'HEPES (Institut de Biotechnologies Jacques Boy, Reims, France). Ces cellules sont maintenues à 37° C dans une atmosphère à 5% de CO2.
Interférence avec /1ARN (RNAi)
Les duplexes de siRNA (small interfering RNA) contrôle (Dharmacon) et spécifiques de caspase 8 et de caspase 9 (Qiagen) utilisés sont les suivants :
1) contrôle : on-targetplus sicontrol non-targeting siRNA #3 ; caspase 8 sens
5'-r(GAG UCU GUG CCC AAA UCA A)dTdT-3', caspase 8 anti-sens 5'-r(UUG AUU UGG GCA CAG ACU C)dTdT-3' ; caspase 9 sens 5'-r(GAG UGG CUC CUG GUA CGU U)dTdT-3', caspase 9 anti-sens 5'-r(AAC GUA CCA GGA GCC ACU C)dTdT-3'. Les siRNAs ont été transfectés par l'agent de transfection HiPerFect (Qiagen) selon les recommandations du fournisseur. Brièvement, les cellules NCI-H 1703 ou NCI-H292 sont cultivées en boîte de 100 mm puis sont décollées par la trypsine et déposées dans des puits de plaques 24 puits à raison de 50 000 cellules par puits dans 400 μl de milieu, et incubées à 37°C pendant la préparation des mix. Pour cela, et pour un puits d'une plaque 24 puits : les duplexes de siRNAs sont dilués dans 100 μl de milieu de culture sans sérum ni antibiotiques, 3 μl de HiPerFect sont ajoutés, puis la solution est vortexée et incubée 5-10 min à température ambiante. Les 100 μl de mix sont ensuite ajoutés goutte à goutte sur les cellules et le tout est homogénéisé en remuant la plaque. Le milieu de culture est changé le lendemain. La concentration finale en siRNA est de 5 nM, et le traitement par le poly(I :C) est débuté 72 h après transfection. Pour ces conditions, l'efficacité des siRNAs caspase 8 et caspase 9 pour diminuer respectivement le niveau d'expression des protéines caspase 8 et de caspase 9 a été mesurée par Western blot, et atteint environ 85 % pour le siRNA caspase 8 et 75 % pour le siRNA caspase 9.
Conditions de cultures des combinaisons chimiothérapie + PoIy(LC) Les cellules ont été ensemencées en plaque 96 puits à raison de 5 000 cellules pour 100 μl de milieu complet par puits. Les différents agents de chimiothérapie ont été ajoutés aux concentrations finales décroissantes de 1 mM, 200 uM, 40 uM, ou 8 uM (pour l'oxaliplatine et le 5-FU) ou de 100 uM, 20 uM, 40 uM, et 0,8 uM (pour le cisplatine, le gemcitabine, l'étoposide, la doxorubicine, le paclitaxel et le docetaxel). Après 2h d'incubation à 370C, les milieux de culture ont été aspirés et remplacés par 100 μl de milieu complet contenant des concentrations décroissantes de Poly(I:C) (100 ug/ml, 20μg/ml, 4μg/ml, 0,8μg/ml), et les cellules ont été remises en culture pendant 7Oh. Chaque condition de traitement a été réalisée en duplicata. Les résultats sont exprimés en nombre relatif de cellules viables par rapport aux cultures témoins non traitées.
Analyse du nombre de cellules vivantes L'analyse a été réalisée à l'aide du kit CelITiter 96® AQue0us One solution CeII prolifération Assay (Promega, Charbonnière, France) suivant les indications du fabricant. Brièvement, 20 μl de MTS ont été ajoutés au milieu de culture de chaque puits. Les cellules ont été placées pendant 2h dans l'incubateur à 37°C. L'analyse de l'absorbance à 490 nm s'est effectuée à l'aide d'un spectrophotomètre (Multiskan® Ex ; Thermo Fisher Scientific). Une seconde mesure à 690 nm a permis l'exclusion de l'absorbance non spécifique. La Densité Optique de base (blanc) représente la moyenne de 3 puits contenant le milieu de culture seul et a été soustraite des valeurs enregistrées. Chaque valeur correspond à la moyenne des DO des duplicatas. Les résultats sont exprimés en valeurs relatives des DO par rapport aux cultures témoins non traitées.
Marquage Annexln V-FUC/Iodure de Propidium
Les cellules sont ensemencées dans des plaques 24 puits à raison de 3,5.104 cellules par puits. Après 48h, le milieu de culture est remplacé aux différents temps par du milieu de culture seul ou contenant 100 μg/ml de Poly(I:C). Le surnageant est récupéré et les cellules sont rincées au DPBS (de l'anglais « Dulbecco's Phosphate Buffered Saline »). Comme précédemment, le surnageant est récupéré et les cellules sont traitées à la trypsine. Une fois les cellules détachées, l'action de la trypsine est arrêtée avec du milieu de culture. L'ensemble est récupéré et mélangé aux surnageants précédemment récupérés. Les cellules sont centrifugées (1400 tour/min, 5 min) et le surnageant est éliminé. Le marquage Annexin V-FUC/Iodure de propidium s'effectue à l'aide d'un kit Annexin V-FITC kit (AbCys SA, Paris, France) suivant les indications du fabricant. Brièvement, les cellules sont remises en suspension dans 100 μl de tampon de liaison, puis incubées pendant 10 à 15 minutes à température ambiante et à l'abri de la lumière avec 2,5 μl d'Annexin V. Un volume suffisant d'iodure de propidium est rajouté pour obtenir une concentration finale à 1 μg/ml. Les échantillons sont analysés avec un cytomètre de flux FACScablibur (BD Bioscience, San José, CA., USA) et les données traitées à l'aide du logiciel FlowJo (TreeStar, San Carlos, CA, USA).
Analyse mathématique des effets de la combinaison de la chimiothérapie et du PoIy(I :C) sur la survie cellulaire
Les ICSOs (Concentration Inhibitrice 50%) de chacune des molécules utilisées seules ou en combinaison ont été déterminées, et définies comme les doses nécessaires pour obtenir 50% de cellules en moins que le contrôle non traité en fin de culture. Les ICSOs représentent les moyennes de toutes les expériences réalisées. Pour déterminer mathématiquement la nature de l'interaction entre les deux molécules, deux méthodes complémentaires ont été utilisées : le calcul de l'index de combinaison (CI) (Chou et al. Quantitative analysis of dose-effect relationships: the combined effects of multiple drugs or enzyme inhibitors, Adv Enzyme Regul 1984, 22:27-55) et la construction de Ifsobologramme (Steel et al. [Exploitable mechanisms in combined radiotherapy-chemotherapy: the concept of additivity, Int J Radiât Oncol Biol Phys 1979, 5:85-91).
L'unité d'ICSO des chimiothérapies a été homogénéisée au ug/ml. L'ensemble de ces IC50s permet de calculer les CIs (Index de Combinaison), définis par l'équation (IC50Chimiothérapie/poly(I:C) / IC50chimiottiérapie) + (IC50pθ|y(i:C)/chimiothérapie /
IC50poly(l:C)) + ((IC50Chimiothérapie/poly(I:C) X IC50poly(l:C)/chimiothérapie) / (ICSOchimiothérapie X IC50po|y(l:Q)), OÙ ICSOchimiothérapie et IC50poly(l:C) représentent respectivement les ICSOs de la chimiothérapie et du poly(I :C) utilisés seuls, et IC50Chimiothérapie/poiy(i:c) et IC50pθiy(i:C)/chimiothérapie représentent respectivement les ICSOs de la chimiothérapie et du ρoly(I :C) utilisés en combinaison. La moyenne de l'ensemble des CIs est calculée afin d'obtenir le CI moyen déterminant la nature de l'interaction entre les 2 molécules, selon sa valeur : CI : 0,1 - 0,9 = synergie ; CI = 0,9 - 1,1 = additivité ; CI = 1,1 - 10 = antagonisme.
Figure imgf000020_0001
Pour construire les isobologrammes, l'abscisse et l'ordonnée représentent respectivement les ICSOs du poly(I:C) et de l'agent de chimiothérapie. Sur l'abscisse est reportée I1C50 du poly(I:C) utilisé seul, et sur l'ordonnée celle de la molécule de chimiothérapie utilisée seule. Une droite relie ces deux points : elle représente la droite d'additivité théorique. Sur le graphe sont reportées les IC50Chimiothérapie/poly(I:C) et IC50poly(i:C)/chimiothérapie. CβS points SOnt reliés et constituent une courbe ayant pour extrémités les croisements entre la droite d'additivité et les axes des abscisses/ordonnée. Si la courbe est confondue avec, ou très proche de la droite d'additivité, on identifie une additivité entre le poly(I:C) et l'agent de chimiothérapie. Si la courbe est au dessous ou au dessus, les deux molécules agissent respectivement en synergie ou en antagonisme.
Conditions de cultures des combinaisons radiothérapie + PoIy(LC)
Les cellules sont ensemencées la veille dans des boites de T25 (25 cm2) à raison de 1.106 cellules/boites. Après 24h, le milieu de culture est remplacé par un milieu de culture simple ou contenant du poly(I :C) (lOμg/ml). Une heure après le changement de milieu, les cellules reçoivent différentes doses d'irradiations (2, 5, 10 Gy). Après 24h, les cellules sont marquées à l'aide d'un kit Annexin V-FITC/Iodure de Propidium comme décrit précédemment. Résultats
L'étoposide et le PoIy(IiC) ont un effet complémentaire in vitro sur la réduction du nombre de cellules vivantes de cancer du poumon. Les variations de pourcentages de cellules de la lignée NCIH-1703 vivantes en fin de culture en présence de combinaisons de différentes concentrations d'étoposide et de PoIy(I :C) par rapport à la culture non traitée sont présentées sur les Figures IA et IB. Les Figures IA et IB représentent respectivement le pourcentage de cellules vivantes en fin de culture en fonction de (A) la concentration d'étoposide ou de (B) celle du PoIy(I :C). Chaque Figure est représentative de 6 expériences réalisées indépendamment.
On observe que l'effet d'une concentration intermédiaire de PoIy(I :C) seul (p.ex. 4μg/ml) qui réduit le nombre de cellules vivantes de ~35% est multiplié par 2 (réduction de ~70%) par une pré-incubation pendant 2h avec 20μM d'étoposide (Figure IA). Réciproquement, l'étoposide seul à la concentration de 4μM entraine une perte d'environ 25% de cellules viables, et cette réduction s'élève à ~60% après addition de 60 μg/ml de PoIy(I :C) (Figure IB).
Le PoIy(I :C) induit i'apoptose des cellules de lignées cancéreuses en activant la voie extrinsèque
En relation avec le mécanisme de réduction du nombre de cellules vivantes, le % de cellules marquées par l'Annexiπ V en fin de culture après traitement avec le PoIy(I :C) a été déterminé en cytométrie de flux. La Figure 2 met en évidence l'effet de la transfection des siRNAs caspase 8 et caspase 9 sur le pourcentage de cellules Annexin V positives induites par le traitement au poly(I:C). 72h après transfection des siRNA contrôle (sictrl), caspase 8 (sicaspδ), caspase 9 (sicasp9) ou caspase 8 + caspase 9 (sicasp8+9), les cellules NCI-H 1703 sont traitées ou non avec 100 μg/ml de poly(I:C) pendant 24h. Le pourcentage de cellules Annexin V positives est mesuré par cytométrie de flux. Les résultats présentés sont la moyenne de 3 expériences réalisées indépendamment. Barre d'erreur, +/- SE. La Figure 2 montre que ~l/3 des cellules NCI-H1703 sont en apoptose 24h après exposition au ligand de TLR3 (contre 11% dans les puits contrôle).
L'inhibition de l'expression de la caspase 8 (par transfection d'un siRNA spécifique) diminue très significativement le % de cellules apoptotiques
(~20%), tandis que la suppression de l'expression de la caspase 9 n'a pas d'effet significatif sur l'apoptose. Des résultats similaires ont été obtenus avec la lignée NCI-H292. Il apparaît donc que le PoIy(I :C) induit l'apoptose des lignées de cancer du poumon analysées, et que cette apoptose survient par activation de la voie extrinsèque de l'apoptose.
Le PoIy(LC) a un effet synergique avec de nombreux agents de chimiothérapie
La comparaison de I1C50 du PoIy(I :C) utilisé seul ou en combinaison avec différentes molécules représentant les quatre classes principales d'agents de chimiothérapie permet de calculer un index de combinaison (CI) qui selon sa valeur renseigne une synergie (CI<1), une additivité (CI~1) ou un antagonisme (CI>1). Les valeurs des CI calculés pour les différents agents de chimiothérapie, présentées dans le Tableau 1 ci-après, montrent une forte synergie sur les lignées NCI-H 1703 et NCI-H292 avec les agents alkylants dérivés du platine (cisplatine et oxaliplatine) et les inhibiteurs de la topoisomérase 2 (étoposide et doxorubicine). En ce qui concerne le 5- fluorouracile, le paclitaxel et le docetaxel, on observe une synergie modérée. Pour la gemcitabine, les résultats montrent une additivité sans synergie pour NCI-H1703, et un antagonisme pour NCI-H292. Tableau 1
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Tableau 1 (suite)
Figure imgf000024_0001
L'analyse par isobologramme illustre la synergie de la combinaison du PoIy(LC) avec le cisplatine et l'étoposide sur la lignée NCI-H292H-1703 Les IC50 du cisplatine, de l'étoposide et du PoIy(I :C) utilisés seuls avec les cellules de la lignée NCI-H292 sont respectivement de 3,4 uM (+/- 0,8 uM), 18,67 uM (+/- 6,96 uM) et 14,3 μg/ml (+/- 2,09 μg/ml) (Tableau 1). Les isobologrammes, qui représentent la moyenne de 6 expériences réalisées indépendamment, montrent que l'on diminue de 50% le nombre de cellules NCI-H292 vivantes en fin de culture en combinant le cisplatine à la concentration de ~0,5mM avec le PoIy(I :C) à la concentration de ~0,5μg/ml (Figure 3A), ou l'étoposide à la concentration de ~8mM avec le PoIy(I :C) à la concentration de ~2μg/ml (Figure 3B). Les isobologrammes illustrent l'action synergique de PoIy(I :C) avec le cisplatine et l'étoposide. Des résultats semblables ont été obtenus pour la lignée NCI-H 1703.
Les activités pro-apoptotiques du PoIy(I :C) et du cisplatine ou de l'étoposide sur les lignées de NSCLC s'additionnent
Le PoIy(I :C) induit l'apoptose des lignées de NSCLC NCIH-1703 et NCIH-292. Pour savoir si l'accentuation de la diminution du nombre de cellules vivantes après traitement avec la combinaison PoIy(I :C) et cisplatine ou étoposide résultait au moins partiellement d'une augmentation de l'apoptose, les cellules ont été marquées avec l'Annexin V après 24h de culture comme renseigné dans le matériel et Méthodes. Les concentrations de PoIy(I :C) et des agents de chimiothérapie ont été ajustées pour correspondre aux IC50 de chaque lignée. On observe pour les 2 lignées qu'une brève (2h) exposition des cellules au cisplatine avant l'addition du ligand de TLR3 augmente le pourcentage de cellules apoptotiques, mais cette augmentation n'est statistiquement significative que pour la lignée NCIH-292 (Figure 4A). Concernant l'étoposide, un effet additif significatif est observé pour les 2 lignées (Figure 4B). Il apparaît donc que l'addition des effets pro- apoptotiques des agents de chimiothérapie et du PoIy(I :C) après 24h participe à la forte synergie observée quant aux nombre de cellules vivantes après 72h fin de culture.
Combinaison d'un inhibiteur de PI3Kavec un ligand de TLR3
De manière analogue, une étude a été menée pour déterminer la viabilité cellulaire des cellules de la lignée de cancer pulmonaire épidermoïde humain NCI-H 1703 cultivées pendant 24h en présence d'un ligand de TLR3 (PoIy(I :C), lOOμg/ml) avec différentes concentrations (O, 0,1 et l,0μM) Wortmannin, inhibiteur spécifique de la PI3 Kinase. Les résultats sont présentés Figure 5A. De même, une étude a été menée pour déterminer le pourcentage des cellules de la lignée de cancer pulmonaire épidermoïde humain NCI-H1703 en apoptose (analyse au FACS après marquage avec l'annexine V-FUC et le PI) après culture pendant 24h en présence d'un ligand de TLR3 (PoIy(I :C), lOOμg/ml) avec différentes concentrations (0, 0,1 et l,0μM) de l'inhibiteur spécifique de la PI3 Kinase (Wortmannin - WM). Les résultats sont présentés Figure 5B. Il apparaît que la combinaison du PoIy(I :C) avec la Wortmannin augmente, de manière synergique, l'activité pro-apoptotique sur des cellules cancéreuses, en comparaison à chacun des produits utilisés séparément. De plus, la synergie est puissante : avec la wortmannin seule lμM, on observe 6% de cellules vivantes en moins après 24h, avec le PoIy(I :C) seul lOOμg/ml, 26% de cellules vivantes en moins après 24h, alors qu'avec les 2 molécules aux mêmes concentrations, on observe 71% de cellules vivantes en moins après 24h.

Claims

REVENDICATIONS
1 - Médicament comprenant séparément ou ensemble (i) un ligand de TLR3 et (ii) un agent de chimiothérapie agissant sur la voie intrinsèque de l'apoptose, pour une administration, simultanée ou étalée dans le temps dans le traitement du cancer, l'agent de chimiothérapie étant choisi parmi les inhibiteurs de la topoisomérase 2, les agents alkylants dérivés du platine et les inhibiteurs de PI3 kinase.
2 - Médicament selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il est destiné à une administration successive (i) d'un agent agissant sur la voie intrinsèque de l'apoptose (ii) puis d'un ligand de TLR3 dans le traitement du cancer.
3 - Médicament selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce qu'il est destiné au traitement du cancer pulmonaire épidermoïde, de l'adénocarcinome du colon, du mésothéliome, du gliome, de l'adénocarcinome du sein, du mélanome, du cancer du rein à cellules claires, du cancer de la prostate, de l'hépatocarcinome ou du myélome multiple.
4 - Médicament selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que l'agent de chimiothérapie est un agent alkylant dérivé du platine.
5 - Médicament selon la revendication 4 caractérisé en ce que l'agent alkylant dérivé du platine est choisi parmi le cisplatine et l'oxaliplatine. 6 - Médicament l'une des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que l'agent de chimiothérapie est un inhibiteur de la topoisomérase 2.
7 - Médicament selon la revendication 6 caractérisé en ce que l'inhibiteur de la topoisomérase 2 est choisi parmi l'étoposide et la doxorubicine.
8 - Médicament l'une des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que l'agent de chimiothérapie est un inhibiteur de la PI3 kinase.
9 - Médicament selon la revendication 8 caractérisé en ce que l'inhibiteur de la PI3 kinase est choisi parmi la wortmannin, le LY294002, le PIK- 90/BAY2-47, le XL765, le XL147, le SFl 126, le NVP-BEZ235, le NVP-BGT226, le GDC-0941, le CAL-101 et le GSK1059615. 10 - Médicament selon l'une des revendications 1 à 9 caractérisé en ce qu'il se présente sous la forme d'une composition pharmaceutique unique combinant, dans une même formulation, (i) un ligaπd de TLR3 et (ii) un agent de chimiothérapie agissant sur la voie intrinsèque de l'apoptose.
11 - Médicament selon l'une des revendications 1 à 10 caractérisé en ce que le ligand de TLR3 est un ARN synthétique double brin. 12 - Médicament selon l'une des revendications 1 à 11 caractérisé en ce que le ligand de TLR3 est un agoniste de TLR3.
13 - Médicament selon l'une des revendications 1 à 12 caractérisé en ce que le ligand de TLR3 est le poly(I:C).
14 - Médicament selon l'une des revendications 1 à 12 caractérisé en ce que le ligand de TLR3 est un ligand spécifique de TLR3, tel que le poly(A :U).
15 - Utilisation d'un ligand de TLR3 et d'un agent agissant sur la voie intrinsèque de l'apoptose pour la préparation d'un médicament selon l'une des revendications 1 à 14.
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