WO2001081927A1 - Procede de detection du streptococcus sobrinus et anticorps contre ce dernier - Google Patents

Procede de detection du streptococcus sobrinus et anticorps contre ce dernier Download PDF

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WO2001081927A1
WO2001081927A1 PCT/JP2001/003502 JP0103502W WO0181927A1 WO 2001081927 A1 WO2001081927 A1 WO 2001081927A1 JP 0103502 W JP0103502 W JP 0103502W WO 0181927 A1 WO0181927 A1 WO 0181927A1
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streptococcus
antibody
sobrinus
mutans
binding ability
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PCT/JP2001/003502
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Kouichirou Hirata
Fumio Ukaji
Koji Matsushige
Naohiro Hanyu
Kazuo Fukushima
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Tokuyama Dental Corporation
Nihon University School Juridical Person
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G01N33/56944—Streptococcus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1267—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria
    • C07K16/1275—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria from Streptococcus (G)

Definitions

  • the present invention relates to a method for immunological measurement of Streptococcus' sobrinus (Streptococcus sob-rinus) (hereinafter, Streptococcus may be abbreviated as S.), and a method of measuring the risk of dental caries by the measurement. It relates to diagnostic methods, as well as antibodies and means that can be used in these methods.
  • mutans streptococci In general, a group of lactic acid-fermenting bacteria called mutans streptococci is known to be deeply involved in the development of dental caries. The risk of dental caries is determined by examining the abundance of mutans streptococci in the human oral cavity, and measurement kits for this purpose are commercially available. When the concentration in the saliva of the mutans streptococci is 105 to 106 pieces Z m 1 is the risk of caries, in the case of 106 Zm 1 or more are said to especially Ru dangerous der.
  • Streptococcus crycetas S. cricetus, serotype a
  • Streptococcus rattus S. rattus, serotype b
  • Streptococcus' mutans . Mutans, serum types c, e). , F
  • Streptococcus' fels (. Ferus, serotype c)
  • Streptococcus' ma force (.ma caca serotype c)
  • Streptococcus' sobrinus . S0 brinus, serotype d, g
  • streptococcus As downy serotype h
  • Streptococcus mutans causes dental caries in hollows and fissures on the tooth surface.
  • Sobrinus causes caries on smooth surfaces as well as depressions and fissures on the tooth surface (Ma dison, KMJ Dent. Res. 70: 38—43, 1991., Hirose, H. Caries Res. 27 : 292—297, 1993.)
  • Streptococcus 'sobrinus has a higher adsorption capacity to the tooth surface than Streptococcus mutans' (van de r Me i, HC. Eta 1. Car i es Re s.
  • Streptococcus sobrinus is more potent at inducing dental caries than Streptococcus mutans, which suggests that the risk of dental caries can be determined more reliably.
  • the Mutan It is important to know not only the concentration of whole streptococci, but also the presence or absence of Streptococcus sobrinus in the human oral cavity.
  • the conventional diagnosis of caries risk is based on the concentration of whole mutans streptococci, and there is no known example of measuring the concentration of Streptococcus' soprinus for use as an indicator of caries risk.
  • Streptococcus ′ by an immunological assay using a monoclonal antibody or a polyclonal antibody that specifically binds to Streptococcus sobrinus.
  • Some examples of measuring Sobrinus have been reported. These methods are methods for measuring Streptococcus sobrinus separated through complicated operations such as culture and colony separation ((1) to (3) below), or In the case of a method in which measurement is performed directly from a sample solution without performing such a culture operation, a method in which a special detection method that requires complicated operations in order to perform high-sensitivity measurement must be employed (see (1) below) ) Or a method that cannot perform highly sensitive measurements ((1) below). It cannot be said that it is suitable as a general-purpose measurement method for disconnecting.
  • MSB medium Michis-Salivarius medium
  • a biochemical method such as a sugar fermentation test
  • an immunological method using a serotype-specific antibody.
  • Absorption treatment of the polyclonal antibody with another bacterium is required for the binding selectivity to the target antigen (or also referred to as the multiplication factor: binding ability to the target antigen). ) And the ratio of the ability to bind to other antigens).
  • F. eta 1. the polyclonal strain specific to the S. serovar d and g strains is used. Monoclonal antibodies are obtained, and the ratio of the binding ability to Streptococcus mutans to the binding ability to Streptococcus sobrinus is increased by absorption treatment with Streptococcus mutans. .
  • the ratio of the above binding abilities of all polyclonal antibodies was about 18 to 26 times the binding ability of Streptococcus mutans bacteria used in the absorption treatment, and the ratio of all Streptococcus mu It is about 15 to 19 times the average binding ability of C. tans.
  • the polyclonal antibody is absorbed by an antibody obtained by immunizing an animal with a standard strain of Streptococcus ⁇ sobrinus serotype d by an serotype a bacterium (ie, Streptococcus crycetas). Although treated, the ability to bind to Streptococcus sobrinus and other mutans streptococci has not been specifically studied.
  • an antigen when an antigen is measured in a test solution using a polyclonal antibody obtained by immunizing an animal with a bacterium as an antigen as an antibody, since the bacterium generally has strong antigenicity, its binding is The force is generally high, and it is considered relatively easy to detect bacteria in a sample liquid having a bacterial concentration of, for example, about 10 5 cells / m 1 .
  • a method similar to that used in the method is considered. Examples of detecting the 10 five Z m 1 bacteria even in a latex agglutination method using a polyclonal antibody sufficient sensitivity is not obtained by the above method for spite Streptococcus sobrinus was known many.
  • the present invention provides a method for preparing Streptococcus' sobrinus, which can contain Streptococcus mutans and Streptococcus sobrinus directly prepared from saliva and plaque collected from the oral cavity, in a test solution, which involves complicated procedures such as culture operations. It is an object of the present invention to provide a method for measuring quickly, easily, and with high sensitivity without performing complicated operations.
  • the present inventors believe that one of the causes of the low detection sensitivity I is the influence of foreign substances such as oral streptococci present in the test solution, and among the various types of oral streptococci present in particular, We focused on Streptococcus mutans and examined its effects. Specifically, antibodies having different ratios of the reactivity to Streptococcus sobrinus and the reactivity to Streptococcus mutans were prepared, and various studies were conducted on the reactivity ratio and the detection sensitivity. Was.
  • the present invention provides a method for detecting Streptococcus sobrinus in a sample fluid suspected of containing Streptococcus 'sobrinus and Streptococcus' mutans,
  • a method comprising:
  • the present invention provides a method for diagnosing the risk of dental caries in a subject. hand,
  • step (c) contacting the sample liquid prepared in step (a) with the antibody prepared in step (b) to form an immune complex
  • a diagnostic method comprising:
  • step (c) is carried out in the presence of an antibody (M antibody) that specifically binds to Streptococcus mutans in addition to the antibody (S antibody).
  • an antibody M antibody
  • S antibody specifically binds to Streptococcus mutans
  • step (c) the same procedure as in step (c) is performed except that the S antibody is replaced with the M antibody, and the immune complex derived from the M antibody thus formed is also measured.
  • a method is also provided for evaluating the amount of the complex as an indicator of the presence or absence of dental caries.
  • an antibody having a binding ability to Streptococcus * sobrinus of 100 or more times the binding ability to Streptococcus mutans, and further, if necessary, to Streptococcus mutans.
  • An immunoassay kit comprising an antibody that specifically binds, or an antibody (MS antibody) that specifically binds to Streptococcus mutans and Streptococcus sobrinus, or for diagnosing the risk of dental caries in a subject Kits are also provided.
  • a sample pad for temporarily absorbing and retaining an analyte solution, a conjugate pad for temporarily retaining a labeled antibody, and an antibody for detection are immobilized.
  • the analyte liquid temporarily absorbed and retained in the sample pad and the developing membrane on which the labeled antibody that has flowed out of the conjugate pad accompanying the analyte liquid are developed are joined in this order.
  • Free In the epidemichromatographic strip, the binding ability to Streptococcus sobrinus as the detection antibody is determined by the binding ability to Streptococcus mutans.
  • an immunochromatographic strip characterized by using an antibody having a factor of 100 or more.
  • a polyclonal antibody having a binding ability to Streptococcus 'sobrinus of 100 times or more the binding ability to Streptococcus' murine.
  • the amount of Streptococcus sobrinus and the amount of Streptococcus mutans in the test solution can be simultaneously measured by using an antibody that specifically binds to Streptococcus mutans in combination.
  • the amount of Streptococcus sobrinus in the test solution and the amount of Streptococcus mutans and Streptococcus sobrinus in the test solution can be determined by using an antibody that specifically binds to Streptococcus mutans and Streptococcus soplinus. The total amount can be measured simultaneously.
  • the kit or strip of the present invention may optionally include an antibody that specifically binds to Streptococcus mutans, or an antibody that specifically binds to Streptococcus mutans and Streptococcus sobrinus.
  • these kits or strips can simultaneously measure the amount of Streptococcus' sobrinus and the amount of Streptococcus mutans or the total amount of Streptococcus, mutans and Streptococcus sobrinus.
  • FIG. 1 shows a schematic diagram of each member of a strip used in the immunochromatography method of the present invention. It is something.
  • 2 is a sample pad
  • 3 is a conjugation pad
  • 4 is a deployment membrane
  • 5 is an absorption pad
  • 6 is a detection line
  • 7 is a control judgment line.
  • FIG. 2 is a side view of the strip shown in FIG. 1 above.
  • FIGS. 3 and 4 are schematic diagrams of each member of a strip combined with an M antibody or an MS antibody used in the immunochromatography method of the present invention.
  • the numbers in the figure correspond to those in Figure 1.
  • Streptococcus sobrinus contained in a sample solution suspected of containing Streptococcus 'sobrinus and Streptococcus' mutans can be measured.
  • a test liquid may be any of natural and artificial liquids, but is usually a liquid sample prepared from saliva or plaque by dissolving, diluting or concentrating as necessary.
  • Streptococcus sobrinus means one or both of mutans streptococci whose serotypes are classified into d-type and gli according to the structure of the cell surface polysaccharide antigen.
  • Examples of the standard strains having serotype g such as 176 and serotype g include strains such as 6715 and OMZ65.
  • Streptococcus mutans refers to strains of mutans streptococci whose serotypes are classified into c, e, and f.
  • Standard strains such as Ingbritt and MT6R as serotype c strains, strains such as LM7 and P4 as serotype standard strains, and SE11 as serotype f standard strains as serotype standard strains OMZ
  • Ingbritt is a serotype c standard strain
  • P4 is for a serotype e standard strain
  • OMZ175 is a serotype f standard strain
  • Streptococcus' sobrinus B13 as a standard strain of type d 13 715 can be suitably used as a standard strain of serotype g.
  • These standard strains can be relatively easily obtained, for example, from public institutions described in Ota, F. eta 1 above.
  • Streptococcus' sobrinus concentration is possible 1 0 5 / m 1 or more test solution Nitsu, detection of Streptococcus sobrinus Te.
  • the concentration of Streptococcus sobrinus in the test solution (unit of concentration: number of cells / "m 1") can be measured by counting Streptococcus sobrinus according to a conventionally known bacteriological technique such as a culture method.
  • the concentration is measured by a culture method, the suspension obtained by appropriately diluting the test solution is subjected to a dispersion treatment of bacterial cells such as ultrasonic treatment, and then subjected to Brain Heart Infusion (hereinafter referred to as “Brain Heart Infusion”).
  • Streptococcus mutans concentration of the test solution used in the method of the present invention is not particularly limited, 0-1 0 8 from the viewpoint of detection sensitivity of Streptococcus' sobrinus Bruno 111 1, in particular 1 0 5-1 0 7
  • the number is pcs / ml.
  • the concentration can be measured in the same manner as the concentration of Streptococcus' sobrinus.
  • the test liquid used in the method of the present invention is particularly preferably a test liquid containing saliva or plaque as a target for diagnosing the risk of dental caries.
  • a test subject fluid directly prepared from saliva or plaque without performing a culture operation can be particularly preferably used. Saliva and plaque may be contained alone or in a mixture in the test body fluid.
  • a test solution containing only plaque may be prepared by using plaque collected after washing the oral cavity with L, etc. to remove saliva components.
  • Plaque can be collected by a conventionally known method using a toothpick, a cotton swab, a spatula, or the like, at a specific site in the oral cavity, or can be randomly collected from the oral cavity.
  • the plaque collected in this manner may be suspended in a liquid and used as a test liquid.
  • the liquid is not particularly limited as long as it is an aqueous liquid, and for example, purified water, physiological saline, or conventionally known buffers can be used. It is particularly preferable to use a buffer solution.
  • a conventionally known buffer having a buffering ability at pH 6.0 to pH 8.0 can be used without any limitation.
  • phosphate buffers, Tris buffers, and good buffers such as HEPES can be used.
  • Buffers, borate buffers and the like can be used.
  • the amount of liquid can be evenly suspended by using 0.1 to 10 ml of liquid per 1 mg of plaque. Streptococcus in plaque and saliva when diagnosed.
  • each concentration is 1 0 5 (number Zm g Shimehaaka) and 1 0 5 et whether it is (number Zm 1 saliva), caries risk
  • it is most preferable to use 1 ml of liquid per 1 mg of plaque considering the correspondence with the case where saliva is used as the subject liquid as it is.
  • the test solution containing plaque can be used as it is, conventionally known treatments such as ultrasonic treatment for dispersing plaque, mixing with a crushing agent such as glass beads, and stirring, etc., are used. It is preferred that the performed liquid be the test liquid.
  • a test solution containing only saliva can be prepared using saliva collected by a conventionally known method such as a spot or a pipet.
  • the saliva collected is as it is
  • the test liquid may be appropriately diluted with the above aqueous liquid. From the point of measurement sensitivity, it is preferable to use the collected saliva as it is as the sample liquid.
  • the plaque or saliva taken from a person having the risk of caries usually, 1 0 5-1 0 7 (number Zm g Shimehaaka) or 1 0 5-1 0 7 (co Zm l saliva) streptavidin Includes Coccus Sobrinus.
  • the ratio of the binding ability of Streptococcus' sobrinus to the Streptococcus' sobrinus and the binding ability to Streptococcus' mutans is 100 or more, and the immunocomplex with Streptococcus sobrinus is sufficiently stable for normal immunological measurement. It is measured by an immunological measurement method using an antibody having a binding ability capable of maintaining the property.
  • the antibody is not limited to the globulin class of the antibody, and includes any currently known globulin class. Further, not only ordinary antibody molecules, but also partial structures in which partial degradation products of the antibody (Fab, Fab ', Fab'2, etc.) and active fragments of the antibody (antigen recognition sites of the antibody) are present. Etc. are also included.
  • the S / M binding selectivity of an antibody of 100 or more is defined as a known immunoassay (hereinafter sometimes abbreviated as “ELISA”) or a radioimmunoassay.
  • the S / M binding selectivity of the antibody is as follows when an antigen-antibody reaction is performed using Streptococcus' sobrinus and Streptococcus mutans of the same bacterial mass as antigens. It can be determined by dividing the reaction value detected when Streptococcus sobrinus is used as an antigen by the reaction value detected when Streptococcus mutans is used as an antigen. For example, by radioimmunoassay
  • Streptococcus sobrinus and Streptococcus mutans are used as antigens
  • Streptomyces cock Kas 'sobrinus and Streptococcus' mutans as an antigen by ELISA is detected when the time of performing the detection of the immune complex was used 1 0 six Roh m 1 Streptococcus sobrinus as antigen that the measured value is 1.0, 1 0 8 Zm if the measured value detected when the streptomycin Lactococcus' mutans was used as an antigen l is 0. 9, SZM binding selectivity 1 0 0 or more.
  • the binding ability (also called reactivity) of the antibody to each bacterial cell is measured using a suspension of a standard strain of phosphate buffered saline (pH 7.4) (hereinafter sometimes abbreviated as “PBS”). It can be suitably measured by an ELISA method used as a sample liquid.
  • the standard strains include, for example, B13 and 6715, respectively, as strains of serotypes d and g of Streptococcus' sobrinus, and strains of serotypes c, e, and f of Streptococcus mutans.
  • Ingbritt, P4, and OMZ175 can be used, respectively.
  • a PBS suspension of a standard strain at a specific concentration was added to each plate of a 96-well imino plate and adsorbed, blocking was performed, and then an antibody against Streptococcus sobrinus was immobilized on the immi plate.
  • a secondary antibody labeled with an enzyme is added, and the binding activity of the antibody to each cell can be evaluated by measuring the enzyme activity.
  • the binding ability is evaluated using the competitive ELISA method, the same A PBS solution of a standard strain of Streptococcus sobrinus was added to each well of a 96-well immobilized plate and adsorbed, and then blocking was performed.
  • a standard strain of Coccus sobrinus or Streptococcus mutans for example, adding an enzyme-labeled secondary antibody solution and measuring the enzyme activity, it is possible to evaluate antibody reactivity. I can do it.
  • the SZM binding of S antibody is considered from the viewpoint that the incidence of false positives is low when the measurement result of the corresponding immune complex is used as an indicator of caries risk
  • the selectivity is preferably at least 500, particularly preferably at least 100.
  • the S antibody used in the present invention is not particularly limited as long as its SZM reactivity is 100 or more, but it is preferably a polyclonal antibody from the viewpoint of easy antibody acquisition. .
  • the S antibody detects the total amount of Streptococcus sobrinus in the sample fluid, For quantification, it is preferable that the binding ability to Streptococcus sobrinus serotype d and g strains is equivalent.
  • the ability to bind to serotype d and g strains of Streptococcus sobrinus is equivalent to each other means that Streptococcus serotype d and g strains having the same amount of bacterial cells are identical by a conventionally known immunological measurement method.
  • 'It means that when the antigen-antibody reaction is detected using sobrinus as an antigen, the binding ability ratio detected from both is within 2 times, preferably within 1.5 times of each other.
  • the S antibody needs to have a binding ability such that an immune complex with Streptococcus' sobrinus can maintain sufficient stability for performing ordinary immunological measurement.
  • “the binding ability of an immunocomplex with Streptococcus sobrinus to maintain sufficient stability for performing a normal immunoassay” refers to a specific immunological assay among general immunoassays. It is said that when measuring Streptococcus sobrinus by the immunoassay described in (1), it is usually possible to detect similar antigens (for example, Streptococcus mutans ⁇ other streptococci) in the assay. It means the binding ability of an antibody that makes it possible to detect Streptococcus sobrinus at a given cell concentration.
  • the Streptococcus' sobrinus by immunochromatography using a gold colloid as a labeling substance, it means the binding ability of an antibody that can detect a 1 0 5 cells / 111 1 or more concentrations of Streptococcus sobrinus .
  • Such binding ability can also be expressed using the standard cells of Streptococcus sobrinus, or as the cell concentration at the lower detection limit in the direct ELISA method.
  • the IgG concentration of the antibody to be evaluated was 1.0 ⁇ g / m 1 Diluted with PBS (pH 7.4) containing 1% BSA and 0.05% Tween20, and added to each plate of Immunobrate at 50 ° C, 1 at 37 ° C. After leaving for a period of time, remove the solution from the immunoplate and wash.
  • a secondary antibody labeled with alkaline phosphatase If the primary antibody is egosa IgG, an anti-egg IgG polyclonal antibody (power tag number: 59652) made by Rappelner's earth, which can be used as a primary antibody Diluted to 10 / zgZml with PBS (pH 7.4) containing 1% 88-8 and 0.05% cho 6 en20, add 1 to each plate of the immunoplate, 37 ° C, 1 After leaving for a while, remove the solution from the imino plate and wash.
  • power tag number power tag number: 59652
  • PBS pH 7.4
  • the S antibody has an SZM reactivity fold of 100 or more, and a binding ability ratio of Streptococcus sobrinus to serotype d and g strains within 2 times each other, particularly within 1.5 times.
  • Sutorebu Tokokkasu-reactivity to sobrinus 1 0 6 / m 1 or more monoclonal antibodies or polyclonal one monoclonal antibody is particularly 2 X 1 0 5 or Zm l or more, in terms of cell concentration of the detection limit It is particularly preferable to use a polyclonal antibody having such characteristics in consideration of the ease of obtaining the antibody.
  • the S antibody is used to immunize an immunized animal with whole cells of Streptococcus sobrinus or an antigen extract obtained from the whole cells to obtain a polyclonal antibody against Streptococcus' sobrinus. And then removing the polyclonal antibody having cross-reactivity with Streptococcus' mutans from the obtained polyclonal antibody.
  • the S antibody is a monoclonal antibody, antibody-producing cells such as splenocytes / lymphocytes of a mammal immunized with the above-mentioned antigen are sorted, and the sorted antibody-producing cells and myeloma cells are separated.
  • a recombinant antibody prepared by culturing a recombinant into which all or part of the antibody gene of the hybridoma has been introduced is also included in the monoclonal antibody.
  • antigens for immunization include whole cells of a serotype d strain or a serotype g strain of Streptococcus' sobrinus, antigens extracted from these whole cells, or these antigens. And the like can be used.
  • dead cells that have been subjected to formalin treatment, heat treatment, or the like, or cells that have been frozen and preserved can be used.
  • a specific protein present in a cell-derived protein (Okahas i, N. Microbiol. Immunol. 30: 35—47, 1986. Hamad a, SJ Gen. Mi c robio l. 135: 335-344, 1989.).
  • a recombinant protein prepared by culturing a recombinant into which all or a part of a gene encoding a specific protein of a bacterial cell has been introduced, and synthesized based on the amino acid sequence of the specific protein Synthetic peptides and the like can also be used as antigens.
  • antigen extracts and the like can be used as they are as antigens, or can be used in combination with an immunological carrier.
  • Carriers include keyhole limpet hemocyanin (KLH), human serum albumin (BSA :), human serum albumin (HSA), chicken serum albumin, poly-L-lysine, polyalanyl lysine, dipanolemicyl lysine, and tetanus toxoid.
  • KLH keyhole limpet hemocyanin
  • BSA human serum albumin
  • HSA human serum albumin
  • chicken serum albumin poly-L-lysine
  • polyalanyl lysine polyalanyl lysine
  • dipanolemicyl lysine dipanolemicyl lysine
  • tetanus toxoid Alternatively, conventionally known carriers such as polysaccharides can be suitably used.
  • the antigen used for preparing the S antibody composed of the polyclonal antibody used in the present invention it is preferable to use the cells directly or the extract of the polysaccharide antigen as it is because of the ease of operation. In addition, it is particularly preferable to directly immunize all the cells of Streptococcus sobrinus because of the high titer of the obtained antibody. Animals commonly used for obtaining antibodies can be used as the animals immunized with the antigens described above, but the use of mammals such as mice, goats, rabbits, and guinea pigs is preferred. .
  • the cells or cell extract may be directly immunized, or Immunization may be performed by adding and mixing a adjuvant.
  • a cell suspension obtained after culturing Streptococcus sobrinus in a BHI liquid medium or the like can be used as it is.
  • the adjuvant conventionally known adjuvants such as Freund's complete adjuvant, Freund's incomplete adjuvant, aluminum hydroxide adjuvant, and Hydrate adjuvant can be suitably used.
  • anti-serum a liquid containing a polyclonal antibody against Streptococcus sobrinus
  • the obtained antiserum can be used for immunoassay as it is as long as the S / M binding selectivity of the polyclonal antibody contained in the antiserum is 100 or more.
  • other antibodies and proteins other than antibodies such as albumin are contained in the antibody. Is subjected to a salting-out method, a gel filtration method, an ion-exchange chromatography method, an affinity chromatography method, an electrophoresis method or the like, to thereby fractionate a polyclonal antibody fraction.
  • immunization of egrets with Streptococcus sobrinus cells as antigens gives antisera about 4 weeks later.
  • the polyclonal antibody fraction (IgG) was obtained by affinity chromatography using protein A. Fraction) is obtained.
  • the S / M binding selectivity of the polyclonal antibody obtained in this way is determined, and if the value is 100 or more, it can be used as it is in the method of the present invention as an S antibody.
  • the obtained polyclonal antibody (hereinafter also referred to as “raw antibody”) has a polyclonal having cross-reactivity with Streptococcus mutans.
  • the antibody (hereinafter, also referred to as “cross-reactive antibody”) may be removed.
  • a polyclonal antibody is a mixture of various antibodies, and among the polyclonal antibodies obtained as described above, antibodies that also react with Streptococcus mutans are present at the same time. M bond selectivity decreases It is thought that it is. Therefore, the cross-reactive antibody should be selectively separated and removed from the starting antibody until the overall SZM binding selectivity becomes 100 or less i.
  • cross-reactive antibodies include antibodies with various avidities, such as those with high affinity constants for Streptococcus mutans and those with low to high affinity constants. In order to achieve a selectivity of 100 or more, it is necessary to remove not only antibodies having a high affinity constant against Streptococcus mutans but also antibodies having a low affinity constant.
  • SZM binding is performed by adding Streptococcus and mutans cells at a high ratio of 40 (OD 600 ) or more to 1 mg of the starting antibody and performing absorption treatment.
  • SZM binding selectivity was about 50 and 90 in the same manner.
  • SZM binding selectivity 1 It can be seen that in order to obtain 0 or more antibodies, it is necessary to use a significantly larger amount of cells than those usually required for the raw antibody.
  • the method for removing the cross-reactive antibody from the starting antibody is not particularly limited, but it is preferable to employ an affinity purification method.
  • the cross-reactive antibody is separated by affinity purification, the raw antibody is brought into contact with the Streptococcus mutans cells immobilized on an insoluble carrier or the cell surface antigen derived from the cells.
  • a cross-reactive antibody may be adsorbed to the insoluble carrier (also referred to as “M antigen-immobilized carrier”) and separated together with the insoluble carrier.
  • Streptococcus mutans cells can be used as they are without using an insoluble carrier, contacted with a starting antibody, and adsorbed to the cells by a cross-reactive antibody to be separated together with the cells.
  • an antibody having low or no binding ability to Streptococcus mutans is not adsorbed on the M antigen-immobilized carrier or the Streptococcus mutans cells, and thus the antibody or the cells are not adsorbed.
  • the SZM binding selectivity of the antibody separated therefrom is increased.
  • the insoluble carrier includes, without limitation, conventionally known carriers such as agarose, dextran, cellulose, polyacrylamide, polystyrene, vinyl chloride, glass, silicone rubber, or porous silica beads. Can be used.
  • a chemical bonding method such as a cyanogen bromide activation method, or a physicochemical adsorption method is used.
  • the method using the property can be used without any restrictions.
  • the method of using Streptococcus mutans cells as it is is easy to use and can simultaneously remove multiple antibodies that react with multiple antigens present on the surface of Streptococcus mutans cells. Therefore, it is more preferable.
  • the cells to be used can be easily prepared, for example, by culturing a standard strain of Streptococcus' mutans in a BHI liquid medium.
  • live cells can be used as they are, or dead cells prepared by heat treatment, formalin treatment, etc. can also be used.
  • any of serotypes c, e, and f can be used, and a mixture thereof can also be used, but serotype c or e is preferably used. is there.
  • serotype c or e is preferably used. is there.
  • in order to make the SZM binding selectivity of the starting antibody 100 or more preferably 100 or more, not only antibodies having a high affinity constant but also antibodies having a low affinity constant are sufficiently removed.
  • any of a so-called batch method and a chromatographic method can be used. It is also possible to combine both methods.
  • the reaction can be carried out by mixing a liquid in which the M-antigen-immobilized carrier is suspended with the starting antibody, allowing the antigen-antibody reaction to sufficiently proceed, and then collecting the supernatant, for example, by centrifugation.
  • Raw antibody when using Streptococcus mutans cells as they are The contact and separation methods are the same as for the batch method described above.
  • the cell suspension is mixed with the raw material antibody, and the antigen-antibody reaction is sufficiently performed, and then the supernatant is recovered, for example, by centrifugation. Can be implemented.
  • polyclonal antibodies having a binding selectivity of at least 100% a polyclonal antibody derived from a egret, 6715, ⁇ B13, and 67 Acquired 1 5-B 1 3
  • an insoluble carrier hereinafter, referred to as an “S antigen-immobilized carrier” on which a cell surface antigen specific to Streptococcus' sobrinus has been immobilized.
  • S antigen-immobilized carrier on which a cell surface antigen specific to Streptococcus' sobrinus has been immobilized.
  • the starting antibody contacting the antibody with high binding ability to Streptococcus sobrinus, and releasing the adsorbed antibody by a conventionally known method such as changing pH, ionic strength or dielectric constant.
  • a conventionally known method such as changing pH, ionic strength or dielectric constant.
  • an antibody having an SZM binding selectivity of 100 or more can be obtained.
  • either the batch method or the mouth chromatography method can be suitably used.
  • the polyclonal antibody from which the cross-reactive antibody has been removed may contain components derived from bacterial cells, it is preferable to purify the antibody into an antibody fraction.
  • purification methods such as salting out, gel filtration, ion-exchange chromatography, affinity chromatography, and electrophoresis can be used without limitation. It is particularly preferable to employ an affinity chromatography method using protein A because the antibody component can be specifically recovered.
  • the various S antibodies obtained as described above can be used alone, or antibodies having different properties can be mixed and used.
  • an antibody that is more than twice as reactive to serotype d strain as Streptococcus sobrinus and more than twice as reactive as serotype d strain to serotype d strain It is also possible to mix the antibodies as appropriate and use the reactivity against serotype d and g strains as equivalent.
  • the amount of Streptococcus sobrinus and the amount of Streptococcus in the test solution are combined with an antibody that specifically binds to S antibody and Streptococcus mutans (hereinafter, also referred to as “M antibody”).
  • M antibody an antibody that specifically binds to S antibody and Streptococcus mutans
  • ⁇ Mutance amount Can also be measured simultaneously.
  • an antibody (M antibody) that specifically binds to Streptococcus mutans refers to Streptococcus ′ mutans, which has a high binding ability, and contains other oral bacteria, especially Streptococcus sobrinus. It refers to an antibody that shows only a binding ability at or below background against oral streptococci.
  • the globulin class of the antibody is not particularly limited, and includes any currently known globulin class.
  • the partial degradation product of the antibody Fab, Fab ′, Fab′2, etc.
  • the partial structure where the active fragment of the antibody (antigen recognition site of the antibody) exists Etc. are also included.
  • Such antibodies are known, and specific examples thereof include the monoclonal antibody described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 10-3640000. However, any antibody that satisfies the above-mentioned properties is particularly limited. Instead, polyclonal antibodies and monoclonal antibodies prepared by known methods can be used without any limitation.
  • the immunized animal is immunized with whole cells of Streptococcus mutans or an antigen extract obtained from the whole cells to obtain a polyclonal antibody against Streptococcus ′ Then, a polyclonal antibody having cross-reactivity with another oral bacterium is removed from the obtained polyclonal antibody, whereby the antibody can be suitably obtained.
  • the method for removing polyclonal antibodies having cross-reactivity and properties is the same as the affinity purification method in the above-mentioned method for obtaining S antibodies, except that cells other than Streptococcus mutans are used as antigens for adsorption. It can be implemented by the same method.
  • the test solution can be prepared by using the S antibody in combination with an antibody that specifically binds to Streptococcus mutans and Streptococcus' sobrinus (hereinafter, also referred to as “MS antibody”).
  • MS antibody an antibody that specifically binds to Streptococcus mutans and Streptococcus' sobrinus
  • the amount of Streptococcus sobrinus and the total amount of Streptococcus mutans and Streptococcus sobrinus in the medium can be measured simultaneously.
  • an antibody that specifically binds to Streptococcus mutans and Streptococcus sobrinus is defined as Streptococcus mutans.
  • Antibodies that are high-t, immunoreactive with S. cerevisiae and Streptococcus sobrinus, and that show less than background immunoreactivity with other oral bacteria.
  • the binding ability of the antibody to Streptococcus mutans and Streptococcus sobrinus be equivalent.
  • the term “equivalent immunoreactivity (or also binding ability or simply reactivity) for Streptococcus mutans and Streptococcus sobrinus” means that Streptococcus with the same bacterial mass is obtained by a conventionally known immunological measurement method. * Mutant and Streptococcus sobrinus as antigens, when detecting immune complexes, the ratio of detected values from both should be within 2 times each other, preferably within 1.5 times Point to.
  • any antibody that satisfies the above-mentioned properties can be used without any limitation, including a polyclonal antibody and a monoclonal antibody produced by a conventionally known method. Also, antibodies having different properties can be mixed and used. For example, it is also possible to appropriately mix the above-mentioned M antibody and S antibody and use the same reactivity for Streptococcus, Myutans and Streptococcus sobrinus.
  • the amount of Streptococcus sobrinus in the test solution and, if necessary, Streptococcus mutans by the immunoassay using the thus obtained S antibody and, if necessary, M antibody or MS antibody together, are used.
  • the method for measuring the amount or the total amount of Streptococcus mitans and Streptococcus' sobrinus is not particularly limited, and immunoagglutination, optical immunoassay, and labeled immunity, which are known as methods for measuring an antigen via an antigen-antibody reaction, are known. Conventionally known immunological measurement methods such as a measurement method and a combination thereof can be used.
  • these immunological measurements can be suitably performed using an immunological measurement reagent containing the S antibody and, if necessary, the M antibody or the MS antibody.
  • the form of the immunoassay reagent is not particularly limited as long as it is an immunoassay reagent containing an S antibody and, if necessary, an M antibody or an MS antibody. ); A solution containing the antibody used immobilized on an insoluble carrier such as particles or a membrane, or a suspension of these; Substances, enzymes, various dyes, colloids, various particles, etc. combined with various labeling substances, or solutions or suspensions thereof; or such labeled antibodies used are insoluble carriers such as particles and membranes. It can take various forms, such as one fixed to a suspension or a suspension thereof; and a combination thereof.
  • This method is a method for detecting and quantifying Streptococcus sobrinus in a test solution using an agglutination reaction of an insoluble carrier based on an antigen-antibody reaction.
  • the semi-quantitative methods include latex agglutination method and microtiter method, and the quantitative measurement methods include latex quantitative method.
  • antibody-sensitized particles in which S antibodies are immobilized on latex beads also referred to as S antibody-sensitized particles.
  • the test reagent is mixed with the test liquid, and the degree of aggregation of the sensitized particles after the antigen-antibody reaction is measured by visual observation or by optical measurement. I can do it.
  • a measurement reagent consisting of antibody-sensitized particles having M antibody or MS antibody immobilized on the latex beads (also referred to as M antibody-sensitized particles and MS antibody-sensitized particles, respectively) was separately prepared.
  • the suspension of the sensitized particles and the suspension of the M antibody-sensitized particles or the MS antibody-sensitized particles are placed in separate test tubes, and a test solution derived from the same test solution is added to these test tubes and mixed.
  • the degree of agglutination of each sensitized particle after the antigen-antibody reaction was determined by visual or optical measurement, etc., to determine the amount of Streptococcus mutans or Streptococcus in the same sample solution. The total amount of Myutans and Streptococcus sobrinus. It can be measured together.
  • the method includes a method of detecting a change in turbidity of aggregates resulting from an antigen-antibody reaction when an antigen-antibody reaction is performed by bringing an S antibody into contact with a test solution; A method of contacting a test solution with a measurement reagent immobilized on a support, and detecting a change in transmittance due to the reaction of particulate bacterial cells on the transparent support as a result of the antigen-antibody reaction, Or A test solution is brought into contact with a thin layer (hereinafter, also referred to as an antibody layer) on which the S antibody has been immobilized, and changes in the refractive index of the antibody layer resulting from the antigen-antibody reaction are transmitted light or surface plasmon waves. It is a method of optically detecting the presence or absence of an antigen-antibody reaction, such as the method of detecting as a change.
  • a measuring reagent containing a labeled antibody obtained by reacting S antibody with various labeling substances such as radioactive substances, enzymes, various dyes, colloids, and various particles, and a test solution are brought into contact with each other to form an antigen.
  • the amount of the labeled substance reacted with Streptococcus sobrinus in the test liquid that is, the radioactivity, enzyme activity, fluorescence intensity, coloration, etc., derived from the label substance is measured to determine the test liquid. It can detect and quantify Streptococcus' sobrinus.
  • the antigen-antibody reaction is carried out by contacting the test solution with a measurement reagent comprising an insoluble carrier (particles, membrane, ELISA plate, etc.) on which the S antibody is immobilized, the S antibody is labeled with a labeling substance.
  • a measurement reagent comprising an insoluble carrier (particles, membrane, ELISA plate, etc.) on which the S antibody is immobilized
  • the S antibody is labeled with a labeling substance.
  • the amount of the labeling substance is measured, or the cells or cells of Streptococcus sobrinus labeled with the test substance and the labeling substance
  • the analyte liquid is measured. It can detect and quantify Streptococcus sobrinus.
  • the labeling substance examples include radioactive metals and radioactive carbons as radioactive substances; peroxidases, lipophosphatases, galactosidases and the like as enzymes; fluorescein isothiocynate, and various pigments. Fluorescent dyes such as tetramethylrhodamine; colloids such as gold colloid and carbon colloid; and colored particles such as colored latex particles can be used.
  • methods such as labeling directly by a covalent reaction between a thionole group and a maleimide group, or an amino group and an aldehyde group, or labeling via a biotin-avidin complex can be used.
  • the enzyme lipophosphatase and peroxidase are used as labeling enzymes, and in the case of the former enzyme, a chemiluminescent substance such as a dioxetane derivative is used.
  • a chemiluminescent substance such as a luminol derivative
  • the luminescence of the substrate can also be detected.
  • a radioimmunoassay using a radioactive substance as a label an enzyme immunoassay using an enzyme as a label
  • a fluorescent immunoassay using a dye, particularly a fluorescent dye, as a label a chemiluminescent substance used as a substrate for an enzyme as a label.
  • flow-through immunoassay, immunochromatography, and immunofiltration using colloids or various particles as labels; and latex agglutination are characterized by simple operations.
  • the latex assay and the enzyme immunoassay can be used to process a large number of sample liquids using an automated analyzer. It is suitable.
  • flow-through immunoassay, immunochromatography, and latex agglutination are simple and can be performed quickly without requiring special knowledge or equipment, and can be performed in dental clinics and homes. Since it is possible, it is suitable as a general-purpose inspection method.
  • Streptococcus sobrinus can be produced by using a substance that can react with the antibody used in the present invention, such as a secondary antibody labeled with each of the above-mentioned labeling substances and protein A. Detection can also be used for quantification. Further, if necessary, a plurality of antibodies can be combined and used for detection and quantification of Streptococcus sobrinus. For example, in an immunological assay based on the principle of the sandwich method, a monoclonal antibody can be used as an antibody immobilized on a solid phase, and a polyclonal antibody can be used as a labeled antibody.
  • the S antibody is immobilized on a porous membrane as a Streptococcus sobrinus capture antibody to obtain a measurement reagent, Next, the porous membrane surface After the sample solution was brought into contact with the sample, the sample solution was passed through the porous membrane surface in the vertical direction, and Streptococcus' sobrinus in the sample solution was captured on the porous membrane by an antigen-antibody reaction, and further labeled.
  • the amount of Streptococcus sobrinus, the amount of Streptococcus mutans, or the amount of Streptococcus mutans or Streptococcus mutans and Streptococcus mutans in the test solution are determined by using a measurement reagent containing S antibody, M antibody or MS antibody.
  • the total amount with Tococcus sobrinus can be measured simultaneously.
  • almost the entire amount of mutans streptococci present in the oral cavity can be known as well, and it is possible to confirm the correspondence with the conventional method. Become.
  • the above-described measurement using the measurement reagent containing the S antibody and the M antibody or the MS antibody is performed by using a measurement reagent containing a labeled antibody obtained by reacting the S antibody and the M antibody or the MS antibody with different labeling substances.
  • the antigen-antibody reaction is performed by contacting the sample solution with the sample solution, the amount of the labeling substance reacted with Streptococcus 'sobrinus in the sample solution, and the amount or the labeling substance reacted with Streptococcus' mutans in the sample solution.
  • the amount of labeling substance that has reacted with both Streptococcus mutans and Streptococcus sobrinus can be measured simultaneously while distinguishing the amount.
  • an assay antibody in which S antibody and M antibody or MS antibody are immobilized at different positions on the same insoluble carrier (membrane, ELISA plate, etc.)
  • another measurement reagent consisting of a labeled S antibody and a labeled M antibody or a labeled MS antibody obtained by reacting an S antibody and an M antibody or an MS antibody with a labeling substance, and further performing an antigen-antibody reaction
  • the amount of the labeling substance that has reacted with the insoluble carrier can also be measured.
  • test solution is mixed with a Streptococcus sobrinus cell or cell surface antigen labeled with a labeling substance, and a Streptococcus mutans cell or cell surface antigen labeled with a labeling substance.
  • Immobilize antibody or MS antibody It is possible to carry out the antigen-antibody reaction by bringing it into contact with a measurement reagent composed of the immobilized insoluble carrier, and then simultaneously measure the amount of the labeling substance reacted with the S antibody and the M antibody or the MS antibody. In this case, it is possible to use insoluble carriers in which each antibody is separately immobilized, or to use the insoluble carriers in which the antibodies are immobilized at different positions on the same insoluble carrier. You can also.
  • the amount of Streptococcus sobrinus and the amount of Streptococcus mutans in the sample solution are measured by simultaneously passing the porous membrane surface in the vertical direction and simultaneously measuring the presence or absence or the amount of the labeled antibody on each distinct position on the porous membrane. The amount can be measured simultaneously, quickly and easily. Further, the amount of Streptococcus sobrinus and the total amount of Streptococcus myutans and Streptococcus sobrinus can be simultaneously measured by a similar operation using a reagent containing the S antibody and the MS antibody.
  • the immunochromatography method is a method that can be performed even in a dental clinic or at home.
  • the present inventors have determined that the immunochromatography method strip (also simply referred to as a strip) generally used in the method.
  • the detection limit was raised by using S-antibody as a measurement reagent called “), and we succeeded in measuring Streptococcus' sobrinus in a sample solution with high sensitivity.
  • the immunochromatography method using the strip using the S antibody hereinafter, also referred to as the immunochromatography method of the present invention
  • the immunochromatography method of the present invention can be an excellent general-purpose method for determining the risk of caries risk. Therefore, referring to the figure below, The method will be described in detail.
  • FIG. 2 shows the structure of a typical strip 1 which can be suitably used in the immunochromatography method of the present invention
  • FIG. 1 shows a schematic view of each member of the strip 1.
  • the strip 1 is composed of a porous support for each purpose, that is, a sample pad 2 for temporarily absorbing and holding the analyte liquid and a labeled antibody.
  • a structure in which a conjugation pad 3 for holding, a development membrane 4 on which a detection antibody is immobilized, and an absorption pad 5 for absorbing the analyte liquid developed from the sample pad 2 are joined in this order.
  • Consists of The conjugate pad 3 in the strip 1 is provided with an antibody for labeling Streptococcus sobrinus in the test solution (hereinafter referred to as a “labeled antibody”.
  • the labeled antibody is, for example, a labeling substance such as colloidal gold or the like.
  • the labeled S antibody can be used.
  • Is retained by coating and drying, and the detection line 6 on the developed membrane 4 is used for detection of Streptococcus' sobrinus in the sample solution.
  • S antibody is immobilized as an antibody.
  • Each dimension (length) shown in FIGS. 1 and 2 is merely a measure of the size, and the size of the strip used in the immunochromatography method of the present invention is shown in these figures. However, the value is not limited to this.
  • the material used for the porous support constituting each of the members is not particularly limited, and is appropriately selected from a hygroscopic material, a porous material, a fibrous material, and the like according to the purpose of each member.
  • a filter paper, a blotting paper or the like as the sample pad 2
  • a glass fiber cloth, a polypropylene nonwoven fabric, a glass filter or the like as the conjugate pad 3.
  • nitrocellulose or nitrocellulose containing cellulose acetate as the developing membrane 4
  • filter paper, blotting paper or the like as the absorbent pad 5.
  • the method for immobilizing the detection antibody and the control antibody on the developing membrane 4 is not particularly limited, and any conventionally known physical adsorption method or covalent reaction method can be used without any limitation. Can also be fixed.
  • the developed membrane after immobilizing the antibody is subjected to a known method. It can also be subjected to a blocking treatment with proteins, lipids, polymers and the like.
  • the protein and the like used for the blocking treatment are not particularly limited, but BSA, skim milk and the like, which are used for the purpose of suppressing a non-specific reaction in a general immunological assay, are preferred.
  • the surface of the deployable membrane can be coated or impregnated with a hydrophilic polymer or a surfactant to adjust the water absorption of the deployable membrane so that the analyte liquid spreads the deployable membrane uniformly.
  • the conjugate pad 3 is made of a water-soluble polymer or saccharose so that the complex of Streptococcus sobrinus and the labeled antibody is easily detached from this part when the test solution is added.
  • the labeled antibody After pre-blocking with saccharides, etc., add the labeled antibody and then dry, or mix the labeled antibodies with a water-soluble polymer or saccharose, etc., in advance and apply to a conjugate pad and dry.
  • a water-soluble polymer examples include polyvinylpyrrolidone, polyvinyl alcohol, polyethylene glycol, cellulose ether (methylcellulose, ethylcellulose, carboxymethylcellulose, carboxyethylcellulose, oxicetylcellulose, cyanethylcellulose, etc.). ), Gelatin and the like can be used.
  • a labeling substance for preparing a labeled antibody a labeling substance such as colloidal gold, carbon colloid, or colored latex that can be visually confirmed can be used, and a radioactive substance or a fluorescent substance can also be used.
  • an enzyme it is possible to use an enzyme as a labeling substance, add a substrate after the antigen-antibody reaction, and detect a compound generated by the enzyme reaction.
  • the labeling of the antibody is not particularly limited, and can be performed by a method generally used in the past.
  • the test solution is added to the sample pad 2 located in the vicinity of the conjugate pad 3 of the strip 1, and left at room temperature for 1 to 30 minutes to label together with the test solution.
  • the antibody is developed to detection line 6, and based on the principle of the sandwich method, Streptococcus soplinus that has reacted with the labeled antibody in the developing solution is captured on detection line 6 with the detection antibody, and the captured streptococcal is captured.
  • the strain in the subject It is possible to measure the presence or absence or the amount of Putococcus sobrinus. At this time, the fact that the labeled antibody was normally developed together with the test solution was confirmed by the above detection line.
  • An antibody that reacts with the labeled antibody is immobilized on the control line judging line 7 upstream of 6, and it can be confirmed by detecting the labeled antibody at this position.
  • the position, order, shape, number, and the like of the detection line 6 and the control determination line 7 on the deployment membrane 4 shown in FIG. 1 are merely examples, and are not particularly limited.
  • the immunochromatography method using a strip on which a labeled antibody has been previously applied and dried has been described. After the labeled antibody is mixed with a test solution in advance and an antigen-antibody reaction is performed, the mixed solution is used. The measurement can also be performed by adding the detection antibody to one end of the immobilized porous support.
  • an S antibody labeled S antibody
  • an M antibody labeled M antibody
  • a labeling substance such as colloidal gold as a labeled antibody on the conjugate pad 3 as shown in FIG. Is retained by coating and drying.
  • a labeling substance such as colloidal gold
  • the amounts of Streptococcus' sobrinus and Streptococcus mutans in a test solution can be simultaneously measured.
  • the detection line 6a and the detection line 6b are connected in series in a line (band) such that the distance from the downstream end of the developing membrane 4 where the analyte liquid is developed is different in the developing direction.
  • the immobilization position of each detection antibody, and the size and shape of the immobilized portion are not particularly limited.
  • the S antibody and the M antibody are placed at the position of the detection line 6 on the developing membrane 4 at the same distance in the developing direction from the downstream end of the developing membrane 4 where the analyte solution is developed. It may be fixed in parallel, circularly or in a spot shape so that
  • the portion where both antibodies are immobilized does not need to be completely separated, and can have any shape and positional relationship that can be easily identified visually, such as alternately crossed shapes.
  • the MS antibody was used instead of the M antibody used as the detection antibody and the labeled antibody.
  • the amount of Streptococcus sobrinus existing in the oral cavity of the subject can be quickly and easily determined by performing the measurement according to the following procedure, and the risk of dental caries can be determined. A diagnosis can be determined.
  • plaque or saliva is collected from the oral cavity (plaque is collected with a spatula or a cotton swab, or saliva is collected with a spot), and, if the collected material is saliva, Suspension in the sample diluent, or if the sample is plaque, suspend it in the sample diluent and subject it to plaque dispersion treatment, such as by applying ultrasonic waves as necessary.
  • a sample liquid for example, 100 to 200 ⁇ 1 is sampled, added to the sample pad of the strip, and allowed to stand for a predetermined time (for example,! To 30 minutes)
  • the presence or absence of Streptococcus soplinus, or the amount thereof, can be determined by judging the presence or absence of coloring of the strip detection line 6 and the control port determination line 7 based on the state of the strip.
  • the gold concentration of the detection line 6 depends on the concentration of Streptococcus * sobrinus in the test sample liquid.
  • the degree of coloration caused by the caries changes as shown in Table 1, so that the risk of dental caries can be diagnosed according to the criteria in Table 2.
  • Table 2 shows an example based on the bacterial cell concentration of the test solution prepared at a specific dilution ratio.However, the bacterial concentration per unit amount of plaque or saliva was determined from the dilution ratio at the time of preparing the test solution. Of course, and this may be used as a criterion.
  • Streptococcus sobrinus which is particularly important as a cariogenic bacterium, and, if necessary, Streptococcus mu.
  • the amount of lance or the total amount of Streptococcus 'mutans and Streptococcus' sobrinus can be measured quickly and easily, and the caries risk of the subject can be diagnosed and determined.
  • the cell sample suspension was diluted appropriately, added to a BHI medium plate, the number of colonies formed was counted, and then multiplied by the dilution factor of the cell sample suspension.
  • the cell concentration of the cell sample suspension was determined, it was about 1 ⁇ 10 9 Zm 1.
  • B13 Streptococcus' sobrinus, serotype d
  • Ingbritt Streptococcus mutans, serotype c
  • P4 Streptococcus mutans, serotype e
  • OMZ 175 Streptococcus myutans, serotype f
  • ATCC 10556 Streptococcus sanguis
  • IFO 14252 Streptococcus, Salvarius
  • ATC C49456 Streptococcus' miteisu
  • ATCC35037 Streptococcus olaris
  • C harris A cell sample suspension of 1) was prepared.
  • 6715, B13, Ingbritt, Charis, etc. indicate the name of the standard strain
  • ATCC10556, IF014252, etc. indicate the deposit number of the standard strain.
  • each 1 ml of each suspension of the bacterial antigen was injected into the auricular vein three times a day into the egret within one week.
  • the same immunization operation was performed a total of six times in the second and third weeks.
  • Change 0.5 ml of the bacterial antigen suspension was mixed with an equal volume of adjuvant, and injected twice subcutaneously into the egret.
  • blood was collected according to a standard method to obtain an antiserum against Streptococcus soplinus.
  • ngb ritt Streptococcus mutans, serotype c
  • P4 Streptococcus mutans, serotype e
  • OMZ175 Streptococcus mutans, serotype f
  • the supernatant sample was added to a column packed with 1 ml of protein A-Sepharose (Pharmacia) pre-equilibrated with PBS. After washing the column with 88, the column was eluted with 5 ml of 0.1 M glycine monohydrochloride buffer (pH 3.0), and immediately adjusted to pH 7.4 by adding 100 mM Tris monohydrochloride (pH 9.0). Elution fractions I gG was confirmed by measuring the A 280. About 4 mg of IgG was recovered from 0.5 ml of antiserum.
  • 6715 was diluted with 1% BSA—0.05% Tween20-PBS (pH 7.4) to a concentration of 1.0 ⁇ g / ml, and 50 1 was added to each of the imino plate pellets.
  • C. After leaving for 1 hour, remove the solution from the immunoplate and wash three times with 300/1 0.05% Tween20-PBS (pH 7.4) o
  • an alkaline phosphatase-labeled anti-Egret IgG (Fc) polyclonal antibody (goat) (Kappel) was adjusted to 1 OzgZml with 1% BSA—0.05% Tween20-PBS (pH 7.4). Dilute, add 50 ⁇ 1 to each well of the immunoplate, leave at 37 ° C for 1 hour, remove the solution from the immunoplate, and add 300/1 0.05% Tween 20—PBS (pH 7. Washed three times in 4).
  • the reactivity between 6715 and each cell was also evaluated by the following competitive ELISA method.
  • each Ueru of Imunopureto, «a 6715 include 1. O / ⁇ gZml, further Streptococcus mutans, or 1% BSA-O to the cells of Streptococcus sobrinus comprising 10 5 to 10 9 1. 05% Twe Add 50 ⁇ 1 of en20-PBS (pH7.4) solution, leave it at 37 ° C for 1 hour, remove the solution from the immunoplate, and add 300 ⁇ 1 of 0.05% Tween20-PBS (pH7.4) Was washed three times.
  • the same reaction is detected as the reaction detected when 5 ⁇ 10 7 Z-pound Streptococcus ′ mutans is used as an antigen.
  • the amount of antigen of Streptococcus sobrinus is 5 ⁇ 10 4 p / p or less. It can be seen that the reactivity of 6715 with Streptococcus sobrinus is 1000 times or more that of Streptococcus mutans.
  • the inhibitory reaction detected when 5 ⁇ 10 7 per ⁇ l of Streptococcus mutans was added was equivalent to the inhibitory reaction detected when 5 ⁇ 10 5 or less Nowell Streptococcus sobrinus was added. It can be seen that the reactivity to Streptococcus mutans is 100 times or more that of Streptococcus mutans.
  • the obtained colloidal gold fraction (hereinafter sometimes referred to as “colloidal gold label 6715”) was stored at 4 ° C.
  • the antibody-immobilized membrane was shaken in a 1% skim milk-0.01% TritonXlOO aqueous solution at room temperature for 5 minutes. Next, the membrane was shaken in a 1 OmM phosphate buffer (pH 7.4) at room temperature for 10 minutes, taken out, and dried in a desiccator for 60 minutes while suctioning with a vacuum pump.
  • conjugate pad 3 (MILLI PORE, 7.5 mm x 6 mm) was shaken in 0.5% PVA_0.5% sucrose aqueous solution for 1 minute, taken out, and desiccated for 60 minutes while sucking with a vacuum pump. Dried all night long.
  • 25 ⁇ 1 of gold colloid-labeled ⁇ 6715 adjusted to A 520 1.0 was added and dried in a desiccator for 60 minutes while suctioning with a vacuum pump.
  • sample pad 2 (MILLI PORE, 17 mm ⁇ 6 mm) was shaken in a 0.05% Tween20-PBS aqueous solution for 1 minute, taken out, and dried in a desiccator for 60 minutes while sucking a bow I with a vacuum pump.
  • the absorbent pad 5 (MILLI PORE, 20 mm x 6 mm) was used without any treatment.
  • Each component of the immunochromatography strip thus prepared as shown in FIG. 1 was placed on a plastic support, and an immunochromatography strip as shown in FIG. 2 was assembled.
  • Table 10 shows that the reactivity of the unpurified polyclonal antibody against Streptococcus sobrinus is less than 10 times that of Streptococcus mutans. Also, from Table 11, when immunochromatographic strips using unpurified polyclonal antibodies were used, Streptococcus. Reaction was detected, and Streptococcus sobrinus could not be specifically detected.
  • plaque was collected using a spatula. After plaque was weighed, it was suspended in PBS so as to have a lmg wet weight of Zml, and ultrasonically treated at 60 W for 20 seconds to obtain a test solution containing plaque.
  • Streptococcus sobrinus and Streptococcus mutans on MSB and BHI medium is based on the morphological classification of colonies, and for colonies that are morphologically indistinguishable, after pure culture of the colonies. Mutant strains of Streptococcus 'Sobrinus and Streptococcus' were identified by immunoassay using a serotype-specific antibody of S. mutans streptococci and biochemical methods such as a sugar fermentation test.
  • a cell sample suspension of Inngritt (Streptococcus' mutans, serotype c) was prepared.
  • B13 (Streptococcus' sobrinus, serotype d), 6715 (Streptococcus' sobrinus, serotype g), P4 (Streptococcus mitans, serotype e), OMZ175 (Streptococcus' mutant, serotype) f), ATCC10556 (Streptococcus 'Sangis), IF014252 (Streptococcus' Salivarius), ATCC49456
  • a suspension of 10 mg of wet bacterial cell of Ingbritt was prepared.
  • the bacterial cell suspension is diluted twice with 0.5% formalin-PBS to give a 5 mg wet bacterial Zml to obtain a bacterial antigen suspension, and immunize a heron according to the method of Production Example 1 (2).
  • the cell sample suspension obtained by the above method (1) was diluted with 0.1 M carbonate buffer (pH 9.0) to lxl0 5 to 10 9 Zml. , 50 ⁇ l each was added to each cell of a 96-well immunoplate (Nunc, Maxisor ⁇ ), and left at 4 ° C. for 12 hours to be fixed. The cell suspension was removed from the immunoplate and washed three times with 300 ml of PBS.
  • Ingbritt was diluted with 1% BSA-0.05% Tween 20-PBS (pH 7.4) to 1.0 ⁇ g Zml, and 50 1 was added to each well of the immunoplate. After leaving at ° C for 1 hour, the solution was removed from the immunoplate, and the plate was washed three times with 300% 0.05% Tween20-PBS (pH 7.4).
  • alkaline phosphatase-labeled anti-heron IgG (Fc) polyclonal antibody (goat) (Kappel) was added to 1% BSA—0.05% Tween20-PBS (pH 7.4) for 10 ⁇ g. / ml, add 50 ⁇ 1 to each well of the immunoplate, leave for 1 hour at 37, remove the solution from the immunoplate, and add 300 ⁇ 1 of 0.05% Tween 20— The plate was washed three times with PBS (pH 7.4).
  • Example 1 a colloidal gold-labeled product of Ingb ritt (hereinafter sometimes referred to as “colloidal gold-labeled Ingbrit”) was prepared and stored at 4 ° C.
  • nitrocellulose membrane (MILLI PORE, Hi-F1ow Membrane, 25mm x 6mm)
  • lmgZm 1 and 6715, ⁇ Ingbr ittl ⁇ l respectively spotted in parallel to the direction
  • the antibody was immobilized.
  • the antibody-immobilized membrane was shaken for 5 minutes at room temperature in a 1% aqueous 0.1% Triton X100 aqueous solution.
  • the membrane was shaken in a 10 mM phosphate buffer (pH 7.4) at room temperature for 10 minutes, taken out, and dried in a desiccator for 60 minutes while suctioning with a vacuum pump.
  • conjugate pad 3 (MILL I PORE, 7.5 mm x 6 mm) was shaken in 0.5% PVA-0.5% sucrose aqueous solution for 1 minute, removed, and sucked with a vacuum pump. Dry in desiccator for 60 minutes.
  • sample pad 2 (MILLI PORE, 17 mm x 6 mm) was shaken in l% Tween 20-PBS aqueous solution for 1 minute, taken out, and dried in a desiccator for 60 minutes while sucking with a vacuum pump. did.
  • Absorbing pad 5 (MILL I PORE, 20mmx
  • Each component of the immunochromatography strip thus prepared as shown in FIG. 4 was placed on a plastic support, and an immunochromatography strip as shown in FIG. 2 was assembled.
  • the detection sensitivity of Streptococcus Miyutansu the detection sensitivity as well as 10 5 Zml of Streptococcus' sobrinus may Taking more reactive high have antibodies for.
  • the reactivity of such an antibody is such that a reaction above the background is detected when 5 ⁇ 10 3 wells of Streptococcus mutans are analyzed by the direct ELISA method of Production Example 2 (4).
  • An antibody having the following reactivity is required.
  • Example 4 Simultaneous measurement of Streptococcus 'sobrinus and Streptococcus' munes in test fluid containing plaque by immunochromatography strip Same as in Example 2 Simultaneous measurement of the amount of Streptococcus sobrinus and the amount of Streptococcus mutans was performed using the immunochromatographic strip prepared in the same manner as in (3) of Example 3. The spot color intensity after 10 minutes on the immunochromatography strip was classified into 4 levels (+++: strong positive, ++: positive, +: weak positive,-: negative) and obtained by the culture method. The numbers of the Streptococcus' sobrinus and Streptococcus mutans were compared. Table 15 shows the results. Table 15
  • the concentration of the test solution 10 5 Zm 1 than on Streptococcus' sobrinus comprising Streptococcus sobrinus and Streptococcus Miyutansu 10 on 5 / m 1 or more concentrations
  • 7x10 5 Streptococcus mutans of Zml or more can be specifically detected simultaneously.
  • I ngbritt—6715 A mixture of the 1 Omg Nob Ingbritt prepared in Production Example 2 and the lmg 6715 prepared in Production Example 1 was mixed, and a polyclonal antibody that reacts with Streptococcus mutans and Streptococcus' sobrinus (hereinafter referred to as “I ngbritt—6715 ”).
  • I ngbritt—6715 a polyclonal antibody that reacts with Streptococcus mutans and Streptococcus' sobrinus
  • Streptococcus mutans were detected when antigen-antibody reaction was detected using Streptococcus mutans and Streptococcus sobrinus of the same bacterial amount as antigens.
  • the response detected from Streptococcus mutans and Streptococcus sobrinus was within 1.5-fold, indicating that the reactivity of Alngbritt-16715 to Streptococcus mutans and Streptococcus sobrinus was equivalent.
  • Example 5 Preparation and evaluation of immunochromatographic strip for simultaneous measurement of total amount of Streptococcus sobrinus and total amount of Streptococcus mitans and Streptococcus sobrinus
  • Example 1 a gold colloidal label of algbritt-6715 (hereinafter sometimes referred to as “colloidal gold-labeled aIngbritt-6715”) was prepared and heated to 4 ° C. And saved.
  • Table 17 shows that when detecting the total amount of Streptococcus sobrinus and Streptococcus myutans and Streptococcus sobrinus in the sample solution, 1 x 1 0 5 / m 1 from 1 X 1 0 of the test solution at 9 / m 1 ranging Sutorebu Tokokkasu sobrinus it is seen to be specifically detected.
  • Streptomyces aureus mutans and spot for total detection of Streptococcus sobrinus LXL 0 7 cells / m 1 or 1 X 1 0 6 or Zm 1 from 1 x 1 0 9 or Zm l Streptococcus mutans or the Streptococcus sobrinus and positive response is obtained in including test solution, since the subject solution containing other oral streptococci LXL 0 9 or Zm 1 is negative, Streptomyces cock in test solution It can be seen that Cass mutans and Streptococcus' sobrinus are specifically detected.
  • Example 6 Simultaneous measurement of the amount of Streptococcus sobrinus and the total amount of Streptococcus mutans and Streptococcus sobrinus in a test solution containing plaque by immunochromatography strip
  • the spot color intensity was found to correlate with the concentration of Streptococcus and Sobrinus in the spot for detection of Streptococcus' sobrinus regardless of the concentration of Streptococcus mutans obtained by the culture method. Further, the detection spot of the stress Putokokkasu 'mutans and Streptococcus' sobrinus total, said total amount in the case of more than 10 6 ZML, specific response was detected. Simultaneous measurement immune click port Mato method strip of the present invention, the total amount of Streptococcus source Burinusu amount and Streptococcus.
  • the total amount of Putokokkasu mutans and Streptococcus sobrinus has been made possible simultaneous detection of specific reaction to 1 0 6 Zm 1 more ⁇ .
  • Streptococcus sobrinus can be measured directly and with high sensitivity from a test solution containing saliva or plaque mixed with Streptococcus mutans, without using a culture method or the like.
  • the measurement method of the present invention using an immunochromatography method, a latex agglutination method, or a flow-through immunoassay method, it is possible to quickly and easily measure Streptococcus' sobrinus in a dental clinic or at home.
  • the latex assay and the ELISA assay it is possible to quickly measure Streptococcus sobrinus from many sample solutions.
  • the present invention it is possible to simultaneously measure the amount of Streptococcus 'sobrinus and the amount of Streptococcus * mutans (or the total amount of Streptococcus' mutans and Streptococcus sobrinus) in the test solution.
  • the present invention also makes it possible to construct a new caries risk diagnostic system.
  • the present invention can be used in the diagnostic medical field, and in the manufacturing industry of reagents and devices used in the medical field.

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Description

明 細 書 ストレプトコッカス 'ソブリヌスの検出方法及びそのための抗体 技術分野
本発明は、 ストレプトコッカス 'ソブリヌス (St r ep t ococc us sob— r i n u s ) (以下、 St rep tococcusを S.と略記する場 合あり） の免疫学的な測定方法、 該測定による齲蝕の危険度の診断方法、 並びに これらの方法に使用できる抗体及び手段に関する。
背景技術
一般に、 ミュータンスレンサ球菌 (mut ans s t rep tococc i) と呼ばれる一群の乳酸発酵性細菌が、 齲蝕発症に深く関わっていることが知られ ている。 そして、 人の口腔内におけるミュータンスレンサ球菌の存在量を調べる ことにより齲蝕危険度の判定を行なうことが行われておりそのための測定キット も市販されている。 ミュータンスレンサ球菌の唾液中の濃度が 105〜106個 Z m 1の場合には、 齲蝕の危険があり、 106個 Zm 1以上の場合は特に危険であ ると言われている。
これらミュータンスレンサ球菌群は、 ストレプトコッカス ·クリセタス （S. c r i c e t u s、 血清型 a)、 ストレプトコッカス ·ラッタス （S. r a t t u s、 血清型 b)、 ストレプトコッカス ' ミュ一タンス（ . mu t a n s、 血 清型 c、 e、 f ) 、 ストレプトコッカス 'フェルス（ . f e r us,血清型 c) 、 ストレプトコッカス 'マ力力 （ . ma c a c a 血清型 c)、 ストレプト コッカス 'ソブリヌス（ . s 0 b r i n u s、 血清型 d、 g)、 ストレプトコッ カス . ドウネィ （ . downey,血清型 h) として、 血清学的、 遺伝学的に 異なる 7種の型に分類されている。
ところで、 これらミュータンスレンサ球菌の中でヒトの口腔に存在するのは主 にストレプトコッカス · ミュータンスとストレプトコッカス ·ソプリヌスの 2菌 種であることが明らかとなったことからこれら 2種の菌がヒトの齲蝕原性ブラ一 クを形成するミュータンスレンサ球菌として注目され、 これら両菌の齲蝕に与え る影響を比較する研究が行なわれるようになつている。 その結果、 （i)ストレブ トコッカス · ミュータンスはヒトロ腔から高頻度に分離されるのに対し、 ストレ プトコッカス ·ソブリヌスは 1〜3割程度のヒトロ腔から分離され、 両菌種の口 腔内での存在比率が大きく異なること （浜田茂幸. 医学細菌学. .4 : 271— 3 14， 1984. ：) 、 （ii)ストレプトコッカス ' ミュータンスは歯面のくぼみや 割れ目に齲蝕を生じるのに対しストレプトコッカス ·ソブリヌスは歯面のくぼみ や割れ目とともに平滑な面にも齲蝕を生じること （Ma d i s on， K. M. J. Dent. Res. 70 : 38— 43, 1991. 、 Hi ros e, H. Car i e s Re s. 27 : 292— 297， 1993. ) 、 （iii)ストレプトコッ カス 'ソブリヌスはストレプトコッカス ' ミュータンスと比較して歯表面への吸 着能が高いこと （van de r Me i, HC. e t a 1. Car i es Re s. 25： 415-423, 1991. )、 (iv)ストレプトコッカス ·ソブ リヌスの酸産生能はストレプトコッカス · ミュータンスよりも強いこと （de Soe t， J. J. ， e t a 1. Car i es Re s. 25： 116— 12 2， 1991. ) 等が明らかとなっている。
また、 ストレプトコッカス ' ミュ一タンスとストレプトコッカス ·ソブリヌス の分布と齲蝕罹患の相関を調べた疫学研究の結果、 ストレプトコッカス ·ソブリ ヌスとストレプトコッカス' ミュータンスの両菌種を保有している人は、 ストレ プトコッカス ' ミュータンスのみを保有している人よりも齲蝕罹患率が有意に高 いことを示す報告もなされている （Ok a d a, T. , e t a 1. J. Den t. Re s. 74 : 501, 1995. 、 Kohl e r， B. ， e t a 1. C o mm un i ty Dent. Ora l Ep i demi o l. 15 : 332— 335, 1987. 、 Hi ros e， H. , e t a 1. Car i e s Res. 27： 292-297, 1993. ：) 。
上記のような報告例は、 、ずれもストレプトコッカス ·ソブリヌスの齲蝕誘発 能はストレプトコッカス · ミユータンスよりも強いことを示唆するものであり、 このことから、 齲触危険度の判定をより信頼性高く行なうためには、 ミュータン スレンサ球菌全体の濃度だけでなく、 人の口腔内におけるストレプトコッカス · ソブリヌスの存否、 及び多寡を知ることが重要と考えられる。 しかしながら、 従 来の齲蝕危険度の診断はミュータンスレンサ球菌全体の濃度に基づくものであり、 齲蝕危険性の指標として使用する目的でストレプトコッカス 'ソプリヌスの濃度 を測定した例は知られていない。
また、 ストレプトコッカス，ソブリヌス自体を測定することに関しては、 下記 ①〜⑤に示すようにストレプトコッカス ·ソブリヌスに特異的に結合するモノク 口一ナル抗体又はポリクローナル抗体を用いた免疫学的測定方法によりストレブ トコッカス ' ソブリヌスを測定した例が幾つか報告されているが、 これら方法は 培養、 コロニー分離等の煩雑な操作を経て分離されたストレプトコッカス ·ソブ リヌスを測定する方法 （下記①〜③） であるか、 又はこのような培養操作を経ず に被検体液から直接測定する方法である場合には、 高感度の測定を行なうために 煩雑な操作を要する特殊な検出方法を採用しなければならない方法 （下記④） で あるか或いは高感度の測定ができない方法 （下記⑤） であるかであり、 齲蝕危険 度を診断するための汎用的な測定方法として適しているとは言えない。
①ノ シトラシンを入れたミチス ·サリバリウス培地 (MSB培地） を用 t、た培 養により得られたコロニ一について、糖発酵試験等の生化学的方法、 血清型特異 的抗体を用いる免疫学的方法等によりコロニーを同定することでストレプトコッ カス ·ソブリヌスを個別に測定する方法 （Okada, T. , e t a 1. J. Dent. Re s. 74 : 501, 1995. 、 Koh l e r， B. , e t a 1. Co mm un i ty Dent. Ora l Ep i demi o l. 15 : 332— 335， 1987. 、 Hi ros e, H. ， e t a 1. C r i e s
Re s. 27： 292-297, 1993. ) 。 なお、 該方法はストレプトコッ カス ·ソブリヌスと齲蝕との関係を調べる疫学研究において最も一般に採用され る方法である。
②ストレプトコッカス ·ソプリヌスに特異的なポリク口一ナル抗体を他のミュ —タンスレンサ球菌で吸収処理することによりストレプトコッカス .ソブリヌス に対する結合選択性を高めたポリクロ一ナノレ抗体を用いる各種標準菌株 （r e f e rence s t ra in)や臨床分離株 （唾液や歯垢から培養法により分離 された単一の菌） の測定方法 （例えば 0 t a, F. e t a l.， Zb l. Ba k t. Hy g. A265 : 330— 339， 1987. および B r a t t h a 1 1, D. ， Odon t. Re vy. 23 : 181 - 196， 1972. ) 。 なお、 ポリクローナル抗体を他の菌で吸収処理することは、 目的とする抗原に対する結 合選択性 （または反応性倍率とも称されている：目的とする抗原に対する結合能 (b ind i ng ab i l i ty) と他の抗原に対する結合能の割合） を高め るための手段であり、 上記 0 t a, F. e t a 1.の方法では、 ストレプトコッ - カス ·ソブリヌス血清型 d及び g株に特異的なポリクロ一ナル抗体をそれぞれ取 得し、 ストレプトコッカス ' ミュータンスで吸収処理することによりストレプト コッカス · ミユータンスに対する結合能とストレプトコッカス ·ソブリヌスに対 する結合能の比が高められたポリクロ一ナル抗体が得られている。 しかし、 いず れのポリク口一ナル抗体においても上記結合能の比は吸収処理に用いたス卜レブ トコッカス ' ミュータンス菌の結合能に対して約 18〜 26倍、 全ストレプトコッ カス · ミュータンス菌の平均結合能に対して 15〜19倍程度である。 また、 前 記 Bra t tha l 1の方法では、 ポリクローナル抗体はストレプトコッカス♦ ソブリヌス血清型 dの標準菌を動物に免疫して得られた抗体に、 血清型 aの菌 (即ちストレプトコッカス ·クリセタス） による吸収処理を施しているが、 スト レプトコッカス ·ソブリヌスと他のミュータンスレンサ球菌に対する結合能につ いては特に検討されていない。
③ストレプトコッカス ·ソブリヌスのモノクローナル抗体を使用して唾液や歯 垢中のストレプトコッカス. ·ソブリヌスについて一旦培養し菌体濃度を高くして から測定する方法 （de Soe t， J. J. ， J. C l i n. Mi c rob i o 1. 28： 2467-2472, 1990. ) 。 なお、 該文献には、 上記モノ クローナル抗体結合能が弱く蛍光抗体法により歯垢中のストレプトコッカス ·ソ ブリヌスを直接検出できないことが記載されている。
④ポリクロ一ナル抗体を使用した蛍光抗体法によりストレプトコッカス .ソブ リヌスを測定する方法 （Wa 1 t e r, J. ， J. Den t. Res. 55 : A 87 - A93, 1976. . Babaahmady, K. G. , Car i e s Res. 32 : 51— 58， 1998. ) 。 該方法は培養操作を必要としないも のの、 蛍光顕微鏡といった特別な装置を用い目視でストレプトコッカス ' ミュー タンスに結合したものとストレプトコッカス，ソブリヌスに結合したものとを 光の強弱で判別するという煩雑な手技を必要とするものである。
⑤ストレプトコッカス♦ソブリヌスに対するポリクロ一ナル抗体を利用したラ テックス凝集法により唾液や歯垢から直接ストレプトコッカス♦ソブリヌスを測 定する方法 （武井勉. 阪大医学雑誌. 35 : 93— 109， 1990. 、 Tak e i， T. Archs. or a l. B i o l. 37 : 99— 104, 1992. ヽ 特開平 1— 250067. ) 。 該方法における検出下限は lx 106個ノ ml以 上であり測定感度が不十分である。 なお、 一般に抗体として、 動物に抗原として 細菌を免疫することによって得られるポリクローナル抗体を用いて被検体液中の 抗原钾菌を測定する場合には、 細菌の抗原性が一般に強いことから、 その結合力 は一般に高く、 例えば 105個/ m 1程度の細菌濃度を有する被検体液中の細菌 を検出することは比較的容易であると考えられ、 例えば該方法で採用しているの と同様なポリクローナル抗体を利用したラテックス凝集法においても 105個 Z m 1の細菌を検出した例は多く知られていたにもかかわらずストレプトコッカス ソブリヌスに関する上記方法では充分な感度が得られていない。 これは、 培養、 コロニー分離等の操作により他の菌を除去していないため、 用いたポリクロ一ナ ル抗体が他のミュータンスレンサ球菌との交差反応を起こしてしまい、 ラテック ス凝集法に適用する抗体量を多くできなかった （使用する抗体量を増加すると、 ストレプトコッカス · ミュータンスに対する反応が検出されてしまう） のが原因 ではないかと考えられる。
齲蝕の危険度の存否を診断するための汎用的な測定方法としては、 唾液又は歯 垢から直接調製した臨床検体がそのまま使用でき、 しかも簡便な操作で、 例えば 105個 m 1レベルの濃度のストレプトコッカス .ソブリヌスを検出すること ができる程度に高感度な測定が行なえることが重要と考えられるが、 上述したよ うにこのような要求を満足するストレプトコッカス ·ソブリヌスの測定方法は知 られていないのが現状である。
そこで、 本発明は、 口腔内から採取された唾液や歯垢から直接調製されたスト レプトコッカス · ミュ一タンス及びストレプトコッカス ·ソブリヌスを含み得る 被検体液中のストレプトコッカス 'ソブリヌスを、 培養操作等の煩雑な操作を行 なうことなく、 迅速且つ簡便にしかも高感度で測定する方法を提供することを目 的とする。
発明の開示
本発明者らは、 検出感度があがらな I、原因の一つに被検体液中に存在する口腔 内レンサ球菌等の夾雑物の影響があると考え、 多種存在する口腔内レンサ球菌の 中でも特にストレプトコッカス ' ミュータンスに着目し、 その影響について検討 を行なった。 具体的には、 ストレプトコッカス ·ソブリヌスに対する反応性とス トレプトコッカス · ミュ一タンスに対する反応性との比が異なる抗体を作製し、 該反応性の比と検出感度につ 、て種々検討を行なつた。
この検討を通して、 本発明者等によって始めて取得されたストレプトコッカス · ソブリヌスに対する結合能がストレプトコッカス · ミュータンスに対する結合能 の 1 0 0倍以上である高感度な抗体を用いた場合には、 被検体液中に存在するス トレプトコッカス ·ソブリヌスの濃度が 1 05個/ m 1程度でもストレプトコッ カス ·ソブリヌスを検出、 定量することが可能であることを見出し、 本発明を完 成するに至った。
従って、 本発明として、 ストレプトコッカス 'ソブリヌス及びストレプトコッ カス ' ミュータンスを含むことが疑われる被検体液中のストレプトコッカス .ソ ブリヌスの検出方法であつて、
(A) ストレプトコッカス 'ソブリヌスに対する結合能がストレプトコッカス . ミュー夕ンスに対する結合能の 1 0 0倍以上である抗体を用意すること、
(B) 該抗体を被検体液と接触させて免疫複合体を形成すること、 並びに (C) 該免疫複合体を測定すること、
を含んでなる方法、 が提供される。
また、 別の態様の本発明として、被験者における齲蝕の危険度の診断方法であつ て、
( a ) 被験者からの唾液及び Z又は歯垢に由来する被検体液を調製すること、
(b) ストレプトコッカス ·ソブリヌスに対する結合能がストレプトコッカ ス ' ミュータンスに対する結合能の 1 0 0倍以上である抗体 （S抗体） を用意す ること、
( c ) 段階 （a ) で調製した被検体液と段階 （b ) で用意した抗体とを接触 させて免疫複合体を形成すること、 並びに
(d) 該免疫複合体を測定し、 その多寡を齲蝕の危険度の存否の指標として 評価すること、
を含んでなる診断方法、 も提供される。
また、 さらなる態様の本発明として、 上記診断方法において、 段階 （c ) を該 抗体 （S抗体） の他にストレプトコッカス ' ミュータンスに対して特異的に結合 する抗体 （M抗体） の共存下に実施するか、 或いは段階 （c ) に加え、 S抗体を M抗体に代えて実施すること以外は段階 （c ) と同様の操作を実施し、 こうして 形成される M抗体に由来する免疫複合体も測定し、 該複合体の多寡も齲蝕の危険 度の存否の旨標として評価する方法も提供される。
また、 さらなる別の態様の本発明として、 ストレプトコッカス *ソブリヌスに 対する結合能がストレプトコッカス · ミュ一タンスに対する結合能の 1 0 0倍以 上である抗体、 さらに必要により、 ストレプトコッカス · ミュ一タンスに対して 特異的に結合する抗体、 又はストレプトコッカス · ミュータンス及びストレプト コッカス ·ソブリヌスに対して特異的に結合する抗体 （MS抗体） を含んでなる 免疫学的測定用キット又は被験者における齲蝕の危険度の診断用キット、 も提供 さ 31る。
また、 さらなる別の態様の本発明として、 被検体液を一時的に吸収しそして保 持するためのサンプルパッド、 標識抗体を一時的に保持するためのコンジユゲー トパッ ド、 並びに検出用抗体が固定化され、 前記サンプルパッ ドに一時的に吸収 しそして保持された被検体液および該被検体液に随伴して前記コンジュゲ一トパッ ドより流出した標識抗体が展開される展開メンブレンがこの順番で接合された免 疫クロマトストリップにおいて、 前記検出用抗体としてストレプトコッカス ·ソ ブリヌスに対する結合能がストレプトコッカス · ミュータンスに対する結合能の
1 0 0倍以上である抗体を用いることを特徴とする免疫クロマトストリップも提 供される。
また、 さらなる別の態様の本発明として、 ストレプトコッカス 'ソブリヌスに 対する結合能がストレプトコッカス ' ミュー夕ンスに対する結合能の 1 0 0倍以 上であるポリクロ一ナル抗体も提供される。
上記本発明に従う方法によれば、 後述する実施例で示されるように、 免疫学的 測定方法により唾液や歯垢中のストレプトコッカス ·ソブリヌスを培養すること 無しに直接測定することが可能となる。 このような測定が可能となったのは、 本 発明者等によって高感度測定に要求される抗体の特性が明らかにされ、 該特性を 満足する新規な抗体が見出されたことによる。
本発明の方法においては、 ストレプトコッカス · ミュータンスに対して特異的 に結合する抗体を併用することにより、 被検体液中のストレプトコッカス ·ソブ リヌス量とストレプトコッカス · ミュータンス量とを同時に測定することが可能 となり、 また、 ストレプトコッカス · ミユータンス及びストレプトコッカス .ソ プリヌスに対して特異的に結合する抗体を併用することにより、 被検体液中のス トレプトコッカス ·ソブリヌス量とストレプトコッカス · ミュータンスとストレ プトコッカス ·ソブリヌスの総量とを同時に測定することが可能となる。
上記本発明のキット又はストリップにおいて、 場合によって、 ストレプトコッ カス ' ミュータンスに対して特異的に結合する抗体、 又はストレプトコッカス . ミュータンス及びストレプトコッカス 'ソブリヌスに対して特異的に結合する抗 体を含めることができ、 こうすることにより、 これらのキット又はストリップは ストレプトコッカス 'ソブリヌス量と、 ストレプトコッカス · ミュータンス量又 はストレプトコッカス， ミュータンス及びストレプトコッカス ·ソブリヌス総量 とを同時に測定することが可能となる。
図面の簡単な説明
図 1は、 本発明の免疫クロマト法で使用するストリップの各部材の概略図を示 すものである。 図中、 2はサンプルパッドを、 3はコンジユゲートパッ ドを、 4 は展開メンブレンを、 5は吸収パッドを、 6は検出ラインを、 そして 7は、 コン トロール判定ラインを表す。
図 2は、 上記図 1に示すストリップの側面図である。
図 3及び 4は、 本発明の免疫クロマト法で使用する M抗体又は MS抗体を併用 したストリップの各部材の概略図である。 図中の数字は、 図 1のものに準ずる。 発明を実施するための最良の形態
本発明の方法では、 ストレプトコッカス 'ソブリヌス及びストレプトコッカス ' ミュータンスを含むことが疑われる被検体液に含まれるストレプトコッカス ·ソ ブリヌスが測定できる。 かような被検体液は、 天然及び人工のいかなるものであつ てもよいが、 通常、 唾液又は歯垢から、 必要により、 溶解又は希釈もしくは濃縮 して調製された液状試料である。
ここで、 ストレプトコッカス ·ソブリヌスとは、 ミュータンスレンサ球菌群の 内で、 菌体表層多糖抗原の構造により血清型が d型及び g犁に分類される菌のい ずれか又は両者を意味する。 血清型が d型の標準菌株としては、 B13、 OMZ
176等の菌株が、 血清型が g型の標準菌株としては、 6715、 OMZ65等 の菌株が例示される。
また、 ストレプトコッカス · ミュータンスとは、 ミュータンスレンサ球菌群の 内で血清型が c、 e、 及び f型に分類される菌を意味する。 血清型が c型の標準 菌株として I n g b r i t t、 MT 6 R等の菌株が、 血清型が e型の標準菌株と して LM7、 P4等の菌株が、 血清型が f型の標準菌株として SE11、 OMZ
175等の菌株がそれぞれ例示される。
本明細書に記載される標準菌株は、 それぞれ一般的な標準菌株として従来より 広く認識され、 広範に且つ汎用的に使用されていることから （例えば、 Ono， T. e t a l.， J. Med. Mi c rob i o l. 41 : 231— 235，
1994. および Pe rch, B. ， Ac t a. path, mi c rob i o l. s c an d. 82 : 357— 370, 1974. および B r a t t h a 1 1，
D. ， Odon t. Re vy. 21 : 143— 152， 1970. ) 、 ストレブ トコッカス ' ミュータンスについては血清型 cの標準菌株として I n g b r i t tが、 血清型 eの標準菌株として P 4が、 血清型 f の標準菌株として OM Z 1 7 5が、 また、 ストレプトコッカス 'ソブリヌスについては血清型 dの標準菌株と して B 1 3力 血清型 gの標準菌株として 6 7 1 5が好適に使用できる。 これら の標準菌株は、 例えば、 上記 O t a , F . e t a 1 .に記載されている公的機 関等から比較的容易に入手できる。
本発明の検出方法によれば、 ストレプトコッカス 'ソブリヌス濃度が 1 05個 /m 1以上の被検体液につ 、てストレプトコッカス ·ソブリヌスの検出が可能で ある。 なお、 被検体液中のストレプトコッカス 'ソブリヌス濃度（濃度の単位： 個 /"m 1 ) は、 培養法等の従来公知の細菌学的手法に従 、、 ストレプトコッカス ソブリヌスを計数することによって測定出来る。 例えば、 培養法により濃度測定 をする場合には、 被検体液を適宜希釈して得た懸濁液に超音波処理等の菌体の分 散処理を施した後、 ブレインハートインフユ一ジョン （以下、 「B H I」 と表記 することもある） 培地プレート上に塗布し生じるストレプトコッカス ·ソブリヌ スのコロニ一数を計数し、 被検体液の希釈倍率を乗じることにより、 被検体液中 のストレプトコッカス ·ソブリヌス濃度 （濃度の単位：個// m 1 ) を測定するこ とが出来る。 但し、 このとき、 被検体液中に、 ストレプトコッカス ·ソブリヌス 以外にもストレプトコッカス · ミュータンス、 或いは他の口腔内細菌が含まれる 場合には、 培地プレー 上に生じたコロニーはストレプトコッカス ·ソブリヌス のコロニーとストレプトコッカス ·ソブリヌス以外のコロニーに精確に分類され、 ストレプトコッカス 'ソブリヌスだけを正確に計数する必要がある。 コロニーの 分類は、 培地プレート上に生じたコロニーについて、 糖発酵試験等の生化学的手 法、 特異的抗体を利用した免疫学的手法、 D N Aプローブを利用した遺伝学的手 法により行なうことができる。
本発明の方法で使用する被検体液中のストレプトコッカス · ミュータンス濃度 は特に限定されないが、 ストレプトコッカス 'ソブリヌスの検出感度の観点から 0〜1 08個ノ111 1、 特に 1 05〜1 07個/ m lであるのが好適である。 該濃度 は、 ストレプトコッカス 'ソブリヌスの濃度と同様にして測定することができる。 本発明の方法で使用する被検体液は、 特に、 齲蝕の危険度を診断するための対 象としては、 唾液又は歯垢を含む被検体液が特に好適に使用される。 また、被検 体液の調製が容易であるという観点から、培養操作を行なわずに唾液又は歯垢か ら直接調製した被検体液が特に好適に使用できる。 なお、 唾液及び歯垢は、被検 体液中にそれぞれ単独で含まれていてもよいし、混合物として含まれていてもよ い。
例えば歯垢のみを含む被検体液は、 口腔内をうが L、等により洗浄し唾液成分を 除去した後に採取した歯垢を用いて調製すればよい。歯垢の採取は、 口腔内の特 定部位の歯垢をつまようじ、綿棒、 スパチュラ等の従来公知の方法で採取するこ とも出来るし、 口腔内より無作為に採取することも出来る。 このように採取され た歯垢を液体に懸濁し被検体液とすればよい。該液体としては、水性液体であれ ば特に限定されず、例えば精製水、生理食塩水、又は従来公知の各緩衝液が使用 可能であるが、抗原抗体反応を一定の条件下で最適に行うために緩衝液を使用す ることが特に好ましい。緩衝液としては、 p H 6. 0から p H 8. 0に緩衝能を 有する従来公知の緩衝液が何ら制限無く使用可能であり、 例えばリン酸緩衝液、 トリス緩衝液、 H E P E S等のグッドの緩衝液類、或いはホウ酸緩衝液等が使用 可能である。 また、液体の量としては、 歯垢 l m gに対して 0. l〜1 0 m lの 液体を用いれば歯垢を均一に懸濁することが出来るが、一般に「寧蝕の危険性あ り」 と診断される場合の歯垢中及び唾液中のストレプトコッカス .ソブリヌス濃 度はそれぞれ 1 05 (個 Zm g湿歯垢） 及び 1 05 (個 Zm 1唾液） であることか ら、齲蝕危険度の診断を行なう場合には唾液をそのまま被検体液として用いた時 との対応を考慮すると、歯垢 l m gに対して l m lの液体を用いるのが最も好適 である。歯垢を含む被検体液はそのままでも使用可能であるが、歯垢を分散させ る目的で超音波処理を施す、 ガラスビーズ等の破砕剤と混合し撹拌する等の、従 来公知の処理を行つたものを被検体液とすることが好適である。
また、唾液のみを含む被検体液は、 スポィト、 ピぺット等の従来公知の方法で 採取された唾液を用いて調製することが出来る。 採取された唾液は、 そのまま或 いは、上記水性液体で適宜希釈して被検体液とすればよい。 測定感度の点からは 採取した唾液をそのまま被検体液とするのが好適である。
齲蝕の危険を有する人から採取した歯垢または唾液中には、 通常、 1 05〜1 07 (個 Zm g湿歯垢） または 1 05〜1 07 (個 Zm l唾液） のストレプトコッ カス ·ソブリヌスが含まれている。
本発明の方法では、 上記のような被検体液中のストレプトコッカス 'ソブリヌ スを、 ストレプトコッカス 'ソブリヌスに対する結合能とストレプトコッカス ' ミユータンスに対する結合能の比率 （ストレプトコッカス ·ソブリヌスに対する 結合能をストレプトコッカス · ミュータンスに対する結合能で除した値。 以下、 「SZM結合選択性」 ともいう。 ） が 1 0 0以上であり、 且つストレプトコッカ ス ·ソブリヌスとの免疫複合体が通常の免疫学的測定を行う上で充分な安定性を 保持できる結合能を有する抗体を用いて免疫学的測定方法により測定する。
ここで、 抗体とは、 抗体のグロブリンクラスは限定されず、 現在知られている どのようなグロブリンクラスのものも含まれる。 また、 通常の抗体分子のみなら ず、 該抗体の部分分解物 （F a b、 F a b' 、 F a b' 2等） 、 及び該抗体の活 性フラグメント （抗体の抗原認識部位） が存在する部分構造等も含まれる。 . また、 抗体の S/M結合選択性が 1 0 0以上であるとは、 酵素免疫測定法 （以 下、 「E L I S A法」 と略すこともある） 、放射免疫測定法等の従来公知の定量 性の高 、免疫学的測定方法により、 ストレプトコッカス ·ソブリヌスとストレブ トコッカス . ミュータンスを抗原とし、 抗原抗体反応の検出を行った際に、 スト レプトコッカス ·ソブリヌスを抗原として使用した場合に検出される結合能が、 ストレプトコッカス . ミュ一タンスを抗原として使用した場合に検出される結合 能の 1 0 0倍以上あることを指す。 結合能の指標は、 上記免疫学的測定法により 抗原抗体反応により形成される免疫複合体の検出を行った際の測定値 （または反 応値ともいう） を用いてもよいし、 抗原抗体反応に関与する抗原量すなわち菌体 量を用いてもよい。
• 抗体の S /M結合選択性は、 同一菌体量のストレプトコッカス 'ソブリヌス及 びストレプトコッカス · ミュータンスを抗原とし、 抗原抗体反応を行った場合に、 ストレプトコッカス ·ソブリヌスを抗原として使用した場合に検出される反応値 をストレプトコッカス · ミュータンスを抗原として使用した場合に検出される反 応値で除することにより求めることが出来る。 例えば、 放射免疫測定法により各
1 07個/ m 1のストレプトコッカス'ソブリヌスとストレプトコッカス ' ミュ 一タンスを抗原とし、 免疫複合体の検出を行った際に、 ストレプトコッカス *ソ ブリヌスを抗原として使用した場合に検出される反応値が 1 0 0であり、 ストレ プトコッカス · ミュータンスを抗原として使用した場合に検出される反応値が 1 である場合、 S ZM結合選択性は 1 0 0である。
或いは、 ストレプトコッカス ·ソブリヌス及びストレプトコッカス · ミュ一タ ンスを抗原として使用した場合に、 同一の反応値が検出される抗原量 （菌体量） を比較して求めることも可能である。 例えば、 E L I S A法によりストレプトコッ カス 'ソブリヌスとストレプトコッカス ' ミュータンスを抗原とし、 免疫複合体 の検出を行った際に、 1 06個ノ m 1のストレプトコッカス ·ソブリヌスを抗原 として使用した場合に検出される測定値が 1. 0であり、 1 08個 Zm lのスト レプトコッカス ' ミュータンスを抗原として使用した場合に検出される測定値が 0. 9である場合、 SZM結合選択性は 1 0 0以上である。
抗体の各菌体に対する結合能 （または反応性ともいう） は、 標準菌株のリン酸 生理食塩緩衝液 （p H 7. 4) (以下、 「P B S」 と略すこともある） 懸濁液を 被検体液として使用する E L I S A法により好適に測定することができる。 この とき標準菌株としては、 ストレプトコッカス 'ソブリヌスの血清型 d及び gの菌 として、 それぞれ例えば B 1 3及び 6 7 1 5が、 また、 ストレプトコッカス · ミュ —タンスの血清型 c、 e、 及び fの菌として、 それぞれ例えば I n g b r i t t、 P 4、 及び OMZ 1 7 5が使用可能である。 具体的手順としては、 まず、 特定濃 度の標準菌株の P B S懸濁液を 9 6穴ィムノプレートの各ゥヱルに添加し吸着し た後、 ブロッキングを行い、 次いで、 ィムノプレートにストレプトコッカス ·ソ ブリヌスに対する抗体を添加後、 例えば酵素標識した二次抗体を添加し、 酵素活 性を測定することにより抗体の各菌体に対する結合能を評価することが出来る。 また、 競合 E L I S A法を用いて結合能を評価する場合には、 それぞれ同一濃 度のストレプトコッカス ·ソブリヌス標準菌株の P B S溶液を 9 6穴ィムノブレ —卜の各ゥエルに添加し吸着した後、 ブロッキングを行い、 次いで、 ィムノブレ 一トにストレプトコッカス ·ソブリヌスに対する抗体と、 それぞれ一定量のスト レプトコッカス ·ソブリヌス或いはストレプトコッカス . ミュータンスの標準菌 株を混合して添加後、 例えば酵素標識した二次抗体溶液を添加し、酵素活性を測 定することで、'抗体の反応性を評価することが出来る。
SZM結合選択性が 1 0 0未満の抗体を用いた場合には、 高感度な測定ができ ない。 例えば SZM結合選択性が 1 0の抗体を用いた場合に、 1 07個 Zm 1の ストレプトコッカス ·ソブリヌスを抗原として免疫複合体の検出を行った際の測 定値を； 1 0 0とすると、 1 06個 Zm lのストレプトコッカス ·ソブリヌスを抗 原として検出される測定値は 1 0であるが、 1 07個 Zm 1のストレプトコッカ ス * ミュータンスを抗原として検出される測定値も 1 0である。 すなわち、 スト レプトコッカスソブリヌスの存在量が 0であっても 1 07個/ m 1のストレプト コッカス · ミュータンスが存在する場合にはストレプトコッカス 'ソブリヌスが 1 06個 Zm 1あると判定してしまうことになる。
一般に、 ストレプトコッカス 'ソブリヌスの唾液中の濃度が 1 05個ノ m 1以 上の場合には 「齲蝕の危険あり」 と判断できることから、 ストレプトコッカス . ソブリヌス濃度が 1 05個 Zm l以上を 「齲蝕危険度陽性」 と定義すると、 上記 のような SZM結合選択性が 1 0 0未満の抗体を用いた場合には、 その測定結果 により偽陽性と判断される被検体数が多くなりすぎ、 齲蝕危険度の診断を目的と した測定には適用できない。 口腔内に存在し得るストレプトコッカス · ミュ一タ ンスを勘案し、 相当する免疫複合体の測定結果を齲蝕危険度の指標としたときに 偽陽性の発生率が小さいという観点から、 S抗体の SZM結合選択性は 5 0 0以 上、 特に 1 0 0 0以上であるのが好適である。
本発明で使用する S抗体は、 その S ZM反応性倍率が 1 0 0以上であるもので あれば特に限定されないが、 抗体取得の容易さの観点からポリクロ一ナル抗体で あるのが好適である。
また、 S抗体は、 被検体液中のストレプトコッカス ·ソブリヌスの全量を検出、 定量するためには、 ストレプトコッカス ·ソブリヌスの血清型 d及び g株に対す る結合能が同等であることが好ましい。 ここで、 ストレプトコッカス 'ソブリヌ スの血清型 d及び g株との結合能が相互に同等であるとは、 従来公知の免疫学的 測定方法により、 同一菌体量の血清型 d及び g株のストレプトコッカス 'ソブリ ヌスを抗原とし、 抗原抗体反応の検出を行った際に、 両者から検出される結合能 比が相互に 2倍以内、 好ましくは 1. 5倍以内であることを指す。
さらに、 S抗体は、 ストレプトコッカス 'ソブリヌスとの免疫複合体が通常の 免疫学的測定を行う上で充分な安定性を保持できる結合能を有する必要がある。 ここで、 「ストレプトコッカス ·ソブリヌスとの免疫複合体が通常の免疫学的測 定を行う上で充分な安定性を保持できる結合能」 とは、 一般的な免疫学的測定法 の中のある特定の免疫学的測定法によりストレプトコッカス ·ソブリヌスを測定 する場合に、 その測定方法においての類似した抗原 （この場合、 例えばストレブ トコッカス · ミュータンスゃ他のレンサ球菌） について通常検出可能であると言 われている菌体濃度のストレプトコッカス ·ソブリヌスを検出することが可能と なるような抗体の結合能のことを意味する。 例えば、 金コロイドを標識物質とし て用いた免疫クロマト法によりストレプトコッカス 'ソブリヌスを測定する場合 において、 1 05個/111 1以上の濃度のストレプトコッカス ·ソブリヌスを検出 可能とする抗体の結合能を意味する。
このような、 結合能は、 ストレプトコッカス 'ソブリヌスの標準菌体を用 、た 直接 E L I S A法における検出下限の菌体濃度として表すこともでき、 ストレブ トコッカス ·ソブリヌスの標準菌体の懸濁液 5 0 1を試料とし、 9 6穴ィムノ プレートの各ゥヱルに菌体を固定ィヒ後、 5 0 n ゥエルの抗体を用いて直接 Ε L I S A法により測定を行なったときの検出下限の菌体濃度が 1 06個 Zm l以 上 （5 X I 04個/ゥエル） 、 特に 2 x 1 05個/ m l以上 （1 04個ノウエル） 、 である時には、 ストレプトコッカス 'ソブリヌスとの免疫複合体が通常の免疫学 的測定を行う上で充分な安定性を保持できる結合能を有すると言える。
なお、上記直接 E L I S A法における検出下限の菌体濃度とは、 具体的には次 のようにして決定される。 即ち、 BH I液体培地中で 6715 (ストレプトコッカス ·ソブリヌス、 血清 型 g)及び B13 (ストレプトコッカス 'ソブリヌス、 血清型 d)を 37°C、 嫌 気条件下で培養した後、 培養液を遠心処理し上清の培地成分を除去し菌体沈殿を 回収し、 次いで、 菌体沈殿を PBSにて洗浄後、 PBSに再懸濁し、 40wで 2 0秒超音波処理を施した後、 PBSにて A600=l. 0に調整し、 約 lxlO9個 ノ m 1の菌体濃度の標準菌体懸濁液を得る。 なお、 この標準菌体懸濁液の菌体濃 度は、 適宜希釈した後に BH I培地プレート上に添加し、 生じたコロニー数を計 数し、 希釈倍率を乗じて求めた値である。 次いで、 このようにして得た標準菌体 懸濁液 （A6()()=l. 0)を、 0. 1M炭酸緩衝液 （pH9. 0) にて l〜lx 105倍に希釈して 10倍希釈系列を調製し、 96穴ィムノプレートの各ゥエル に 50 1ずつ添加し、 4°C、 12時間放置し固定する。 次いで、 ィムノプレー 卜から菌体懸濁液を除去し、 PBSにて各ゥエルを洗浄後、 ブロッキングを行つ た後、 評価する抗体 （一次抗体） の I gG濃度が 1. 0 β g/m 1となるように 1%の BSA及び 0. 05%の Twe en20を含む PBS (pH7. 4) を用 いて希釈してからィムノブレ一トの各ゥヱルに 50^ 1づっ添加し、 37°C、 1 時間放置した後、 ィムノプレートから溶液を除去し洗浄する。 その後、 アルカリ ホスファタ一ゼで標識した二次抗体 綱えば一次抗体がゥサギ I gGの場合は、 力ッペルネ土製アル力リホスファタ一ゼ標識抗ゥサギ I g Gポリクローナル抗体 （力 タログ番号： 59652) } を、 1%の88八及び0. 05%の丁 6 en20 を含む PBS (pH7. 4) にて 10/zgZmlとなるように希釈したものをィ ムノプレートの各ゥヱルに 1添加し、 37°C、 1時間放置した後、 ィムノ プレートから溶液を除去し洗浄する。 そして最後に、 発色基質溶液である p—二 トロフエ二ルリン酸の 2—エタノールァミン水溶液 {例えば B I OR AD社製発 色基質溶液 （カタログ番号： 172-1063) } を各ゥヱルに 50〃 1ずつ添 加し、 25° (、 20分反応させた後に、 0. 4MのNaOHを各ゥヱルに50 ^ 1ずつ添加し反応を停止し、 各ゥエルの 405 n mの吸光度及びバックグラゥン ドの吸光度を測定し、 バックダランドと同等の吸光度を示すゥエルに固定された 菌体濃度を検出下限の菌体濃度とすることにより求めることができる。 本発明において、 S抗体としては、 SZM反応性倍率が 1 0 0 0以上であり、 ストレプトコッカス ·ソブリヌスの血清型 d及び g株に対する結合能比が相互に 2倍以内、 特に 1. 5倍以内であり、 上記検出下限の菌体濃度で表したストレブ トコッカス ·ソブリヌスに対する反応性が 1 06個/ m 1以上、 特に 2 X 1 0 5個 Zm l以上であるモノクローナル抗体又はポリクロ一ナル抗体を用いるのが特に 好適であり、 抗体取得の容易性を勘案すれば、 この様な特性を有するポリクロ一 ナル抗体を用いるのが最も好適である。
S抗体は、 該抗体がポリクローナル抗体である場合には、 免疫動物にストレブ トコッカス ·ソブリヌスの全菌体または該全菌体より得られる抗原抽出物を免疫 してストレプトコッカス 'ソブリヌスに対するポリクロ一ナル抗体を得、 次いで 得られた該ポリクローナル抗体からストレプトコッカス ' ミユータンスとの交差 反応性を有するポリクロ一ナル抗体を除去することにより好適に得る事ができる。 また、 S抗体がモノクローナル抗体である場合には、 上記のような抗原で免疫 した哺乳動物の脾細胞ゃリンパ細胞等の抗体産生細胞を分取し、 分取した抗体産 生細胞とミエローマ細胞を融合して得たハイブリ ドーマにつ 、て S 反応性倍 率が 1 0 0以上の抗体を産生するハイプリ ドーマを選択し、 選択されたハイプリ ドーマの培養上清として製造する方法、 或いは該ハイプリ ドーマを動物の腹腔内 に移植して増殖させて腹水を回収することにより得ることができる。 なお、 ここ で、該ハイプリ ドーマの抗体遺伝子の全部または一部を導入した組換え体を培養 して調製された組換え抗体もモノク口一ナル抗体に含まれる。
以下、 これら抗体の中でも取得が容易なポリクローナル抗体からなる S抗体の 取得方法について詳細に説明する。
ポリクローナル抗体からなる S抗体を取得する場合の免疫用の抗原としては、 ストレプトコッカス 'ソブリヌスの血清型 d株、 或いは血清型 g株の全菌体、 こ れら全菌体からの抽出抗原、 又はこれらの混合物等が使用出来る。
全菌体としては生菌の他、 ホルマリン処理、 或いは加熱処理等された死菌、 凍 結保存された菌体が使用可能である。
全菌体からの抗原の抽出は、 抗原が多糖抗原である場合は、 菌体懸濁液を加熱 処理する方法 （Rant s, L. A. , St anf ord. Med. Bul l. 13： 290— 291， 1955. ) . 亜硝酸により抽出する方法 （武井勉. 阪 大医学雑誌. 35 : 93— 109， 1990. ) 等の従来公知の方法により行な うことができる。 抽出された多糖抗原は、 そのままで抗原として使用することも 可能であるし、 更に精製して使用することも出来る。 また、 抗原がタンパク抗原 である場合には、 アルカリ、 塩、 キレート剤、 カオトロピックイオン、 界面活性 剤を使用して抽出する （武井勉. P反大医学雑誌. 35 : 93— 109， 1990. ) 、 或いは菌体由来のタンパク質中に存在するする特定のタンパク質を精製する (Okahas i, N. Mi c rob i o l. Immuno l. 30 : 35— 4 7, 1986. Hamad a, S. J. Gen. Mi c rob io l. 135 ： 335-344, 1989. ) ことにより得ることができる。 また、 菌体の特 定のタンパク質をコ一ドする遺伝子の全部または一部を導入した組換え体を培養 して調製された組換えタンパク質、 特定のタンパク質のァミノ酸配列を基に合成 された合成べプチド等も抗原として使用できる。
これらの抗原抽出物等は、 抗原としてそのまま使用することも可能であるし、 免疫用担体と結合させて使用することも可能である。 担体としては、 スカシガイ のへモシァニン （KLH)、 ゥシ血清アルブミン （BSA：) 、 ヒ ト血清アルブミ ン （HSA)、 ニヮトリ血清アルブミン、 ポリ一 L—リジン、 ポリアラニルリジ ン、 ジパノレミチルリジン、 破傷風トキソィド又は多糖類等の従来公知の担体が好 適に使用可能である。
本発明で使用するポリクロ一ナル抗体からなる S抗体を作製するために用いる 抗原としては、 操作性の簡便さから、 菌体を直接、 或いは多糖抗原の抽出物をそ のまま使用するのが好適であり、 更に、 得られる抗体の力価が高いことから、 ス トレプトコッカス ·ソブリヌスの全菌体を直接免疫するのが特に好適である。 上記のような抗原を免疫する動物としては、 抗体取得のために一般的に使用さ れる動物が使用可能であるが、 マウス、 ャギ、 ゥサギ、 モルモット等の哺乳動物 を用いるの力好適である。 これら動物に抗原を免疫する方法としては、 従来公知 の方法が制限なく採用でき、 菌体または菌体抽出物を直接免疫してもよいし、 ァ ジュバントを添加混合して免疫してもよい。 例えば、 菌体を直接免疫する場合に は、 ストレプトコッカス ·ソブリヌスを B H I液体培地等で培養後に得られる菌 体の懸濁液をそのまま使用することも可能である。 また、 アジュバントとしては、 フロイントの完全アジュバント、 フロイントの不完全アジュバント、 水酸化アル ミニゥムアジュバント又は百曰咳菌アジュバント等の従来公知のアジュバン卜が 好適に使用可能である。
これら動物に抗原を免疫後、 採血し血清を調製することで、 ストレプトコッカ ス ·ソブリヌスに対するポリクロ一ナル抗体を含む液体 （以下、 該液体を 「抗血 清」 と表記する場合もある。 ） が得られる。
得られた抗血清は該抗血清中に含まれるポリクロ一ナル抗体の S/M結合選択 性が 1 0 0以上であればそのままでも免疫学的測定方法に使用可能であるが、 通 常抗血清中にはストレプトコッカス 'ソブリヌスに特異的な抗体以外に他の抗体、 及びアルブミン等の抗体以外のタンパク質が含まれているため、 高感度且つ特異 的な測定を行なうためには、 得られた抗血清を塩析法、 ゲル濾過法、 イオン交換 クロマトグラフィー法、 ァフィ二ティ一クロマトグラフィー法、 電気泳動法等の 方法により処理することでポリクロ一ナル抗体画分を分取することが好ましい。 例えば抗原としてストレプトコッカス ·ソブリヌスの菌体をゥサギに免疫すると、 約 4週間後以降に抗血清が得られ、 例えばプロティン Aを用いたァフィ二ティー クロマトグラフィー法によりポリクロ一ナル抗体画分 （I g G画分） が得られる。 この様にして得られたポリクローナル抗体について S/M結合選択性を決定し、 その値が 1 0 0以上であれば、 そのまま S抗体として本発明の方法に使用できる。 また、 S/M結合選択性が 1 0 0未満である場合には、 得られたポリクローナル 抗体 （以下、 「原料抗体」 ともいう。 ） からストレプトコッカス · ミュータンス との交差反応性を有するポリクロ一ナル抗体 （以下、 「交差反応性抗体」 ともい う。 ） を除去すればよい。
一般に、 ポリク口一ナル抗体は多種の抗体の混合物であり、 前記のようにして 取得したポリクローナル抗体の中には、 ストレプトコッカス · ミュータンスにも 反応する抗体が同時に存在し、 そのため全体としての S "M結合選択性が低下し ていると考えられる。 したがって、 全体としての SZM結合選択性が 1 0 0以 i となるまで原料抗体から交差反応性抗体を選択的に分離除去すればよ ヽ。
但し、 交差反応性抗体の中には、 ストレプトコッカス · ミュータンスに対する 親和定数の高 L、ものから低 (、ものまで様々な結合力を有す抗体が含まれており、 原料抗体の S/M結合選択性を 1 0 0以上とするためにはストレプトコッカス ' ミュータンスに対する親和定数の高い抗体のみならず親和定数の低い抗体も除去 することが必要である。 本発明者らは、 ストレプトコッカス · ミュータンス菌体 をそのまま用いて交差反応性抗体を除去する方法において、 l m gの原料抗体に 対し 4 0 (O D600) 以上という高い割合でストレプトコッカス， ミュータンス 菌体を添加して吸収処理を行なうことにより SZM結合選択性を 1 0 0以上とす ることに成功したものである。 本発明者等の検討によれば、 同様の方法で SZM 結合選択性が 5 0及び 9 0程度の抗体を得ようとする場合には、 それぞれ l m g の原料抗体に対し約 1 (O D 600) 及び約 4 (O D60o) の菌体を添加すればよい ことが分かっており、 SZM結合選択性が 1 0 0以上の抗体を得るためには、 原 料抗体に対して通常必要とされる菌体よりも著しく多量の菌体を使用しなければ ならないことが分かる。
原料抗体から交差反応性抗体を除去する方法は、 特に限定されないが、 ァフィ ニティ一精製法を採用するのが好適である。 ァフィ二ティ一精製法により交差反 応性抗体を分離する場合には、 不溶性担体に固定化されたストレプトコッカス · ミュ一タンスの菌体または菌体由来の菌体表面抗原と、 原料抗体とを接触させ、 該不溶性担体 (「M抗原固定化担体」 ともいう。 ） に交差反応性抗体を吸着させ て該不溶性担体と共に分離すればよい。 あるいは、 ストレプトコッカス · ミュー タンスの菌体を、 不溶性担体を使用せずそのまま使用し原料抗体と接触させ、 菌 体に交差反応性抗体を吸着させて該菌体と共に分離することもできる。 これらの 方法により、 ストレプトコッカス ' ミュータンスに対する結合能が低い或いは結 合能を有さない抗体は、 M抗原固定化担体あるいはストレプトコッカス · ミュー タンスの菌体に吸着されないので、 該担体あるいは該菌体と接触後、 これと分離 された抗体の S ZM結合選択性は高くなる。 不溶性担体を使用する場合の、 不溶性担体としては、 ァガロース、 デキストラ ン、 セルロース、 ポリアクリルァミ ド、 ポリスチレン、塩化ビニル、 ガラス、 シ リコーンラバ一、 又は多孔性シリ力ビーズ等の従来公知の担体が何ら制限無く使 用可能である。 また、 これら担体にストレプトコッカス ' ミュータンスの菌体あ るいは菌体由来の菌体表面抗原を固定ィ匕する方法としては、 臭化シアン活性化法 等の化学的結合法や、 物理化学的吸着性を利用した方法が何ら制限無く使用可能 である。
ストレプトコッカス · ミュータンスの菌体をそのまま使用する方法は、 操作が 簡便であり、 またストレプトコッカス ' ミュータンスの菌体表面に存在する複数 種の抗原と反応する複数種の抗体を同時に除去することが可能であるということ から、 より好適である。 この時、 使用する菌体は、 例えばストレプトコッカス ' ミユータンスの標準菌株を B H I液体培地で培養することにより容易に調製でき る。 菌体としては生菌をそのまま使用することも出来るし、 加熱処理、 ホルマリ ン処理等により調製した死菌も同様に使用可能である。 また、 ストレプトコッカ ス ' ミュータンスの標準菌株としては、 血清型 c、 e、 f のいずれも使用可能で あり、 これらの混合物も使用可能であるが、 血清型 c又は eを使用するのが好適 である。 この場合において、 前記したように原料抗体の SZM結合選択性を 1 0 0以上、 好ましくは 1 0 0 0以上にするには、 親和定数の高い抗体のみならず、 親和定数の低い抗体も充分除去する必要があり、 そのためには、 上述したように、 l m gの原料抗体に、 4 O O Deoo以上の菌体を添加するのが好適である。
ァフィ二ティ一精製法における前記 M抗原固定化担体と原料抗体の接触および 分離法としては所謂バッチ法およびクロマトダラフィ一法の何れの方法も使用可 能である。 また、 両方法を組み合わせて実施することも可能である。
クロマトグラフィー法では、 M抗原固定化担体をカラムに充填後、 原料抗体を カラムに添加し、 保持されず溶出する画分を分取すればよい。 また、 バッチ法に おいては、 M抗原固定化担体を懸濁した液と原料抗体を混合し、 抗原抗体反応を 十分行わせた後に、 例えば遠心処理により上清を回収することで実施できる。 ストレプトコッカス ' ミュ一タンスの菌体をそのまま使用する場合の原料抗体 との接触および分離法は、 上記バッチ法と同様であり、 菌体懸濁液と原料抗体を 混合し、 抗原抗体反応を十分行わせた後に、 例えば遠心処理により上清を回収す ることで実施できる。
本発明者らはこの様な方法により、 8ノ]\1結合選択性1 0 0以上のポリクロ一 ナル抗体として、 ゥサギ由来のポリクローナル抗体である 6 7 1 5、 《B 1 3、 及び 6 7 1 5 - B 1 3を取得した。
また、 ァフィ二ティ一精製法により交差反応性抗体を分離する別の方法として、 ストレプトコッカス 'ソブリヌスに特異的な菌体表面抗原を固定化した不溶性担 体 （以下、 「S抗原固定化担体」 ともいう。 ） と原料抗体とを接触させ、 ストレ プトコッカス ·ソブリヌス対する結合能の高い抗体を吸着させ、 吸着された抗体 を p H、 イオン強度又は誘電率を変化させる等従来公知の方法で遊離することに より、 SZM結合選択性 1 0 0以上の抗体を得ることもできる。 この場合も、 バッ チ法またはク口マトグラフィ一法のどちらも好適に使用することが出来る。
交差反応性抗体を除去した後のポリクロ一ナル抗体中には、 菌体由来の成分が 混入している場合があるため、 抗体画分に精製することが好ましい。 精製方法と しては塩析法、 ゲル濾過法、 ィォン交換ク口マトグラフィー、 ァフィ二ティ一ク 口マトグラフィ一、電気泳動法等の公知の方法が制限なく使用できるが、 操作の 簡便性および抗体函分を特異的に回収出来ることからプロテイン Aを用いたァフィ 二ティークロマトグラフィー法を採用するのが特に好適である。
上記のようにして取得した各種 S抗体は、 それぞれ単独で使用することもでき るが、性質の異なる抗体を混合して使用する事もできる。 例えば、 ストレプトコッ カス ·ソブリヌスの血清型 d株に対する反応性が血清型 g株に対する反応性の 2 倍以上の抗体と、 血清型 g株に対する反応性が血清型 d株に対する反応性の 2倍 以上の抗体を適宜混合して、 血清型 d及び g株に対する反応性を同等として用い ることも可能である。
本発明の測定方法では、 S抗体とストレプトコッカス · ミュータンスに対して 特異的に結合する抗体 （以下、 「M抗体」 ともいう。 ) を併用して、 被検体液中 のストレプトコッカス ·ソブリヌス量及びストレプトコッカス · ミュータンス量 を同時に測定することもできる。
ここで、 ストレプトコッカス . ミュータンスに対して特異的に結合する抗体 （M 抗体） とは、 ストレプトコッカス ' ミュータンスに対して高い結合能を示し、 他 の口腔内細菌、 特にストレプトコッカス ·ソブリヌスを含む他の口腔内レンサ球 菌に対してはバックグラウンド以下の結合能しか示さない抗体を指す。 なお、 該 抗体におけるグロプリンクラスは特に限定されず、 現在知られているどのような グロブリンクラスのものも含まれる。 更に、 通常の抗体分子のみならず、 該抗体 の部分分解物 （F a b、 F a b ' 、 F a b ' 2等） 、 及び該抗体の活性フラグメ ント （抗体の抗原認識部位） が存在する部分構造等も含まれる。
このような抗体は公知であり、 具体例として、 特開平 1 0— 3 6 4 0 0号記載 のモノクローナル抗体を例示することができるが、 上記のような性質を満たす抗 体であれば特に限定されず、 公知の方法で作製したポリクローナル抗体及びモノ ク口一ナル抗体が何ら制限なく使用できる。 例えば、 上記抗体がポリクローナル 抗体である場合には、 免疫動物にストレプトコッカス · ミユータンスの全菌体ま たは該全菌体より得られる抗原抽出物を免疫してストレプトコッカス ' ミュー夕 ンスに対するポリクローナル抗体を得、 次いで得られた該ポリクローナル抗体か ら他の口腔内細菌との交差反応性を有するポリクローナル抗体を除去することに より好適に得る事ができる。 尚、 交差反応、性を有するポリクロ一ナル抗体を除去 する方法は、 吸着用抗原としてストレプトコッカス · ミュータンス以外の菌体等 を使用すること以外、 前記 S抗体の取得方法におけるァフィ二ティー精製法と同 様の方法により実施可能である。
また、 本発明の測定方法では、 S抗体とストレプトコッカス · ミュータンス及 びストレプトコッカス 'ソブリヌスに対して特異的に結合する抗体 （以下、 「M S抗体」 ともいう。 ) を併用することにより、 被検体液中のストレプトコッカス · ソブリヌス量及びストレプトコッカス ' ミュータンスとストレプトコッカス ·ソ ブリヌスの総量を同時に測定することもできる。
ここで、 ストレプトコッカス ' ミュータンス及びストレプトコッカス ·ソブリ ヌスに特異的に結合する抗体 （MS抗体） とは、 ストレプトコッカス · ミュー夕 ンス及びストレプトコッカス .ソブリヌスに対して高 t、免疫反応性を示し、 他の 口腔内細菌に対してはバックグラウンド以下の免疫反応性しか示さない抗体を指 す。 被検体液中のストレプトコッカス · ミユータンス及びストレプトコッカス · ソブリヌスの総量を定量するためには、 抗体のストレプトコッカス' ミュータン スとストレプトコッカス ·ソブリヌスに対する結合能が同等であることが好まし い。 ここで、 ストレプトコッカス · ミュータンスとストレプトコッカス ·ソブリ ヌスに対する免疫反応性 （または結合能もしくは単に反応性ともいう） が同等で あるとは、 従来公知の免疫学的測定方法により、 同一菌体量のストレプトコッカ ス * ミュータンスとストレプトコッカス ·ソブリヌスを抗原とし、免疫複合体の 検出を行った際に、 両者からの検出値の割合が、 相互に 2倍以内、好ましぐは 1. 5倍以内であることを指す。
該抗体としては、 上記性質を満たす抗体であれば従来公知の方法で作製したポ リク口一ナル抗体及びモノクローナル抗体が何ら制限なく使用できる。 また、 性 質の異なる抗体を混合して使用する事もできる。 例えば、 前記の M抗体と S抗体 を適宜混合して、 ストレプトコッカス， ミユータンスとストレプトコッカス ·ソ ブリヌスに対する反応性を同等として用いることも可能である。
このようにして得られた S抗体及び必要に応じて、 M抗体又は M S抗体を一緒 に用いて免疫学的測定方法により被検体液中のストレプトコッカス ·ソブリヌス 量、 並びに必要に応じてストレプトコッカス' ミュータンス量又はストレプトコッ カス · ミユータンス及びストレプトコッカス 'ソブリヌスの総量を測定する方法 は特に限定されず、 抗原抗体反応を介して抗原を測定する方法として知られてい る免疫凝集法、 光学免疫測定法、 標識免疫測定法、 およびこれらの組合わせ等の 従来公知の免疫学的測定方法が使用出来る。 なお、 これらの免疫学的測定は、 S 抗体及び必要に応じて、 M抗体又は M S抗体を含む免疫学的測定試薬を用 ヽて好 適に行なうことができる。 これら免疫学的測定試薬は、 S抗体及び必要に応じて、 M抗体又は M S抗体を含む免疫学的測定試薬であればその形態は特に限定されず、 該試薬に使用される上記抗体 （使用抗体） を含む溶液；使用抗体を粒子やメンブ レン等の不溶性担体に固定ィヒしたもの或いはこれらの懸濁液；使用抗体に放射性 物質、 酵素、 各種色素類、 コロイド類、 各種粒子等の各種標識物質を結合させた もの、 或いはその溶液や懸濁液；又はこの様な標識された使用抗体を粒子ゃメン プレン等の不溶性担体に固定ィ匕したもの或いはそれらの懸濁液；及びこれらを組 み合わせたもの等、 様々な形態をとり得る。
以下、 これら免疫学的測定試薬を用いた測定方法について説明する。
〈免疫凝集法〉
該方法は、 抗原抗体反応に基づく不溶性担体の凝集反応を利用して、 被検体液 中のストレプトコッカス ·ソブリヌスを検出、 定量する方法である。 半定量的方 法としてはラテックス凝集法、 マイクロタイター法等が、 定量的測定法としては ラテックス定量法等がある。
例えばラテックス凝集法を利用して被検体液中のストレプトコッカス ·ソブリ ヌスを免疫学的に測定する場合には、 ラテックスビーズに S抗体を固定化した抗 体感作粒子 （S抗体感作粒子ともいう。 ) からなる測定試薬を作製後、 該測定試 薬と被検体液を混合し、 抗原抗体反応後における感作粒子の凝集の度合を、 目視、 或いは光学的測定法等により検出することで測定することが出来る。
このとき、 ラテックスビ一ズに M抗体又は M S抗体を固定化した抗体感作粒子 (それぞれ M抗体感作粒子及び MS抗体感作粒子ともいう。 ） からなる測定試薬 を別途作製し、 上記 S抗体感作粒子の懸濁液と M抗体感作粒子又は M S抗体感作 粒子の懸濁液を別々の試験管に入れ、更にこれら試験管に同一被検体液由来の被 検体液を入れて混合し、 抗原抗体反応後における各感作粒子の凝集度合を、 目視、 或いは光学的測定法等により同一被検体液中のストレプトコッカス · ミュータン ス量又はストレプトコッカス♦ ミユータンスとス卜レプトコッカス ·ソブリヌス との総量を合わせて測定することが出来る。
〈光学免疫測定法〉
該方法は、 S抗体と被検体液とを接触させて抗原抗体反応を行った場合に、 抗 原抗体反応の結果生じる凝集物の濁度の変ィヒを検出する方法、 S抗体を透明な支 持体上に固定ィ匕した測定試薬に被検体液を接触させ、 抗原抗体反応の結果粒子状 の菌体が透明支持体上に反応することによる透過度の変ィヒを検出する方法、 又は S抗体を固定ィ匕した薄層 （以下、 抗体層ともいう。 ） に被検体液を接触させ、 抗 原抗体反応の結果生じる抗体層の屈折率の変ィヒを透過光や表面プラズモン波等の 変ィ匕として検出する方法等、 抗原抗体反応の有無を光学的に検出する方法のこと である。
〈標識免疫測定法〉'
該方法では、 S抗体に放射性物質、 酵素、 各種色素類、 コロイド類、 各種粒子 等の各種標識物質を反応させて得た標識抗体を含む測定試薬と、 被検体液とを接 触させて抗原抗体反応を行った後に、被検体液中のストレプトコッカス ·ソブリ ヌスに反応した標識物質の量、 すなわち標識物質に由来する放射活性、 酵素活性、 蛍光強度、 着色等を測定することによって、 被検体液中のストレプトコッカス' ソブリヌスを検出、 定量することができる。 また、 S抗体を固定化した不溶性担 体 （粒子、 メンブレン、 E L I S Aプレート等） からなる測定試薬と被検体液と を接触させて抗原抗体反応を行つた後に、 S抗体を標識物質で標識した標識抗体 を含む別の測定試薬を接触させて更に抗原抗体反応を行った後に、 標識物質の量 を測定することによって、 又は被検体液と標識物質で標識したストレプトコッカ ス ·ソブリヌスの菌体または菌体表面抗原とを混合し、 S抗体を固定ィヒした不溶 性担体からなる測定試薬に接触させて抗原抗体反応を行った後に、 S抗体に反応 した標識物質の量を測定することによって被検体液中のストレプトコッカス ·ソ ブリヌスを検出、 定量することができる。
標識物質としては、 放射性物質として放射性ョード、 放射性炭素等が；酵素と してペルォキシダ一ゼ、 アル力リホスファタ一ゼ、 ガラクトシダ一ゼ等が；各種 色素類として、 フルォレセインイソチオシァネート、 テトラメチルローダミン等 の蛍光色素類が； コロイドとして金コロイド、 炭素コロイド等が；各種粒子とし ては着色ラテックス粒子等が使用出来る。 なお、 酵素標識を行う場合は、 チォー ノレ基とマレイミ ド基、 ァミノ基とアルデヒド基等の共有反応により直接標識する、 或いはピオチン一アビジン複合体を介し標識する等の方法が使用可能である。 ま た、'標識酵素としてアル力リホスファターゼ及びパーォキシダ一ゼを使用し、 さ らに前者の酵素の場合にはジォキセタン誘導体等の化学発光物質を、 また後者の 酵素の場合にはルミノール誘導体等の化学発光物質を酵素の基質として使用した 場合には、 該基質の発光を検出することも出来る。
該標識免疫測定法では、 用いる標識に応じて従来使用されている方法が特に限 定無く使用できるが、 中でも放射性物質を標識として使用する放射免疫測定法； 酵素を標識として使用する酵素免疫測定法；色素、 特に蛍光色素を標識として利 用する蛍光免疫測定法；酵素の基質としての化学発光物質を標識として利用する ィ匕学発光免疫測定法等は定量性が高 ヽので、 高精度の定量測定を行なう場合には これら測定方法を採用するのが好適である。 また、 コロイドまたは各種粒子を標 識として使用するフロースルー免疫測定法、 免疫クロマト法、 及び免疫濾過法； 並びにラテックス凝集法は、 操作が簡便であるという特徴がある。
これら各種免疫学的測定方法のなかでも、 ラテックス定量法や酵素免疫測定法 は、 自動分析装置を用いて多数の被検体液を処理することが可能であるので、 集 団検診等の検査法として好適である。 また、 フロースルー免疫測定法、 免疫クロ マト法、 およびラテックス凝集法は簡便性に加えて特別な知識や装置を必要とす ることなく迅速な測定が可能であり、 歯科医院や家庭においても実施可能である ため、 汎用的な検査方法として好適である。
これら各種標識免疫測定法における操作、 手順等は一般に採用されているそれ らと特に異ならず、 公知の非競合法や競合法、 サンドイッチ法等に準じることが 出来る。 また、 本発明で使用する前記の抗体と共に、 上記の各標識物質で標識し た二次抗体、 プロテイン A等の本発明で使用する前記抗体に反応可能な物質を使 用してストレプトコッカス ·ソブリヌスの検出 '定量に用いることもできる。 また、 必要に応じて複数の抗体を組み合わせてストレプトコッカス ·ソブリヌ スの検出、 定量に用いることも出来る。 例えば、 サンドイッチ法の原理に基づく 免疫学的測定方法に於いて、 固相に固定化する抗体としてモノクローナル抗体を 使用し、 標識抗体としてポリクロ一ナル抗体を使用することもできる。
例えばフロースルー免疫測定法を利用して被検体液中のストレプトコッカス · ソブリヌスを測定する場合には、 S抗体をストレプトコッカス ·ソブリヌス捕捉 用抗体として多孔性膜上に固定ィヒして測定試薬を得、 次いで、 該多孔性膜膜表面 に被検体液を接触させた後、 多孔性膜表面に垂直方向に被検体液を通過させ、 被 検体液中のストレプトコッカス 'ソブリヌスを多孔性膜に抗原抗体反応により捕 捉し、更に、 標識した S抗体の溶液からなる別の測定試薬を多孔性膜表面に接触 させた後、 多孔性膜表面に垂直方向に通過させ、 多孔性膜上の標識抗体の有無ま たは多寡を測定することで、 被検体液中のストレプトコッカス 'ソブリヌスを迅 速、 簡便に測定することが出来る。
該標識免疫測定法では、 S抗体及び、 M抗体又は MS抗体を含む測定試薬を用 いることにより、 被検体液中のストレプトコッカス ·ソブリヌス量と、 ストレプ トコッカス · ミュータンス量又はストレプトコッカス ' ミュータンスとストレプ トコッカス ·ソブリヌスとの,総量とを同時に測定することもできる。 このことに より、 結果として従来の培養法による測定と同様に口腔内に存在するミュ一タン スレンサ球菌のほぼ全量を併せて知ることができ、 従来法との対応を確認するこ とが可能となる。
上記の S抗体及び、 M抗体又は MS抗体を含む測定試薬を用いた測定は、 S抗 体と M抗体又は M S抗体とをそれぞれ異なる標識物質と反応させて得た標識抗体 を含む測定試薬と、 被検体液とを接触させて抗原抗体反応を行った後に、被検体 液中のストレプトコッカス 'ソブリヌスに反応した標識物質の量、 及び被検体液 中のストレプトコッカス ' ミュータンスに反応した標識物質の量又はストレブト コッカス · ミユータンスとストレプトコッカス ·ソブリヌスとの両方に反応した 標識物質の量を区別して同時に測定すればよい。 また、 S抗体及び M抗体又は M S抗体を同一の不溶性担体 （メンブレン、 E L I S Aプレート等） の異なる位置 に固定化した測定試薬を使用し、 被検体液と接触させて抗原抗体反応を行った後 に、 S抗体と M抗体又は M S抗体とを標識物質と反応させて得た標識 S抗体及び 標識 M抗体又は標識 M S抗体からなる別の測定試薬を接触させて更に抗原抗体反 応を行った後に、 不溶性担体に反応した標識物質の量を測定することもできる。 さらに、 被検体液と標識物質で標識したストレプトコッカス ·ソブリヌスの菌体 または菌体表面抗原、 及び標識物質で標識したストレプトコッカス · ミュータン スの菌体または菌体表面抗原とを混合し、 S抗体及び M抗体又は M S抗体を固定 化した不溶性担体からなる測定試薬に接触させて抗原抗体反応を行つた後に、 S 抗体及び M抗体又は M S抗体に反応した標識物質の量を同時に測定することによつ て実施可能である。 このとき、 それぞれの抗体を別個に固定ィヒした不溶性担体を 並列して使用することも可能であるし、 同一の不溶性担体の異なる位置にそれぞ れの抗体を固定ィヒしたものを使用することもできる。
例えばフロースル一免疫測定法を利用して被検体液中のストレプトロッカス ' ソブリヌス量及びストレプトコッカス · ミユータンス量を同時に測定する場合に は、 S抗体をストレプトコッカス 'ソブリヌス捕捉用抗体として、 また M抗体を ストレプトコッカス ' ミュータンス捕捉用抗体として、 それぞれ多孔性膜上の区 別可能な位置に固定ィヒして測定試薬を得、 次いで、 該多孔性膜膜表面に被検体液 を接触させた後、 多孔性膜表面に垂直方向に被検体液を通過させ、被検体液中の ストレプトコッカス ·ソブリヌス及びストレプトコッカス · ミユータンスを多孔 性膜に抗原抗体反応によりそれぞれ区別される位置に捕捉し、 更に、 それぞれ同 一又は別の標識物質により標識した S抗体及び M抗体の溶液を多孔性膜表面に接 触させた後、 多孔性膜表面に垂直方向に通過させ、 多孔性膜上のそれぞれ区別さ れる位置上の標識抗体の有無または多寡を同時に測定することで、被検体液中の ストレプトコッカス ·ソブリヌス量及びストレプトコッカス · ミュータンス量を 同時に、 且つ迅速、 簡便に測定することが出来る。 また、 S抗体及び M S抗体を 含む試薬を用いて同様の操作によりストレプトコッカス ·ソブリヌス量とストレ プトコッカス · ミユータンスとストレプトコッカス ·ソブリヌスの総量とを同時 に測定することもできる。
前記したように免疫クロマト法は、 歯科医院や家庭においても実施可能な方法 であるが、本発明者らは、 該方法で一般的に使用される免疫クロマト法ストリッ プ （単に、 ストリップとも言う。 ） と呼ばれる測定試薬に S抗体を用いることに よりその検出限界を高め、 被検体液中のストレプトコッカス 'ソブリヌスを高感 度で測定することに成功した。 このことにより、 上記 S抗体を用いたストリップ を使用した免疫クロマト法 （以下、 本発明の免疫クロマト法ともいう。 ） は、 優 れた汎用的な齲蝕危険度の判定検査方法となり得る。 そこで、 以下に図を参照し て該方法について詳しく説明する。
図 2に本発明の免疫クロマト法で好適に使用できる代表的なストリップ 1の構 造を、 又図 1には該ストリップ 1の各部材の該略図を示す。 該ストリップ 1は、 従来のストリップと同様に、 それぞれ目的に応じた多孔性支持体からなる各部材、 すなわち被検体液を一時的に吸収、 保持するためのサンプルパッド 2、 標識抗体 を一時的に保持するためのコンジユゲートパッド 3、 検出用抗体が固定ィ匕される 展開メンブレン 4、 およびサンプルパッド 2より展開された被検体液を吸収する ための吸収パッド 5がこの順番で接合された構造からなる。 ストリップ 1におけ るコンジュゲートパッド 3には、 被検体液中のストレプトコッカス .ソブリヌス を標識するための抗体 （以下、 「標識抗体」 という。 該標識抗体としては、 例え ば金コロイド等の標識物質で標識した S抗体が使用できる。 ） が塗布'乾燥する ことにより保持されており、 また、 上記展開メンブレン 4上の検出ライン 6には、 被検体液中のストレプトコッカス 'ソブリヌスを捕捉するための検出用抗体とし て S抗体が固定化されている。 なお、 図 1及び図 2中に示される各寸法 （長さ） は、 単に大きさの目安を示すものであり、 本発明の免疫クロマト法で使用するス トリップの大きさは、 これら図に示される値に限定されるものではない。
上記各部材を構成する多孔性支持体に用 tヽる材料は特に限定されず、 各部材の 目的に応じて吸湿性材料、 多孔質材料、 繊維質材料等から適宜選択される。 例え ば、 サンプルパッド 2としては、 濾紙、 吸取紙等を用いるのが好適であり、 コン ジュゲ—トパッド 3としてはガラス繊維布、 ポリプロピレン不織布、 ガラスフィ ルター等を用いるのが好適である。 また展開メンブレン 4としてはニトロセル口 ース、 或いは酢酸セルロースを含むニトロセルロース等を用いるのが好適であり、 吸収パッド 5としては濾紙、 吸取紙等を用いるのが好適である。
なお、 検出用抗体及びコントロール抗体の展開メンブレン 4への固定化方法は 特に限定されず、 従来公知の物理的吸着法や共有反応法が何ら制限無く使用出来 るし、 他のタンパク質等と混合して固定化することも出来る。 また、 展開メンブ レンへの被検体液成分の非特異的吸着を抑制する、 或いは展開メンブレンへの被 検体液の湿潤性を向上するため抗体固定化後の展開メンプレンを公知の方法によ りタンパク質、 脂質、 高分子ィ匕合物等によりブロッキング処理することも出来る。 このブロッキング処理に用いるタンパク質等は特に限定されるものではな 、が、 一般的な免疫学的測定法において、 非特異的反応を抑制する目的で使用されてい る B S A、 スキムミルク等が好適である。 また、被検体液が展開メンブレンを均 一に展開するように、 展開メンブレンの吸水性を調整するために、 展開メンブレ ンの表面に親水性重合体や界面活性剤を被覆または含浸させることも出来る。 なお、 コンジュゲートパッド 3については、 被検体液を添加したときに、 スト レプトコッカス ·ソブリヌスと標識抗体との複合体が、 この部分から容易に脱離 するように、 水溶性重合体、 またはサッカロース等の糖類で予めプロッキングし た後標識抗体を添加してから乾燥させる、或いは標識抗体を予め水溶性重合体、 またはサッカロース等の糖類と混合してからコンジユゲートパッドに塗布し乾燥 させるのが好ましい。 上記水溶性重合体としては、 ポリビニルピロリ ドン、 ポリ ビニルアルコール、 ポリエチレングリコール、 セルロースエーテル （メチルセル ロース、 ェチルセルロース、 カルボキシメチルセルロース、 カルボキンェチルセ ルロース、 ォキシェチルセルロース、 シアンェチルセルロース等) 、 ゼラチン等 が使用できる。
また、 標識抗体を調製するための標識物質としては、 金コロイド、炭素コロイ ド、 着色ラテックス等の目視によって確認できる標識物が使用出来る他、 放射性 物質や蛍光物質も使用可能である。 また、 標識物質として酵素を利用し、 抗原抗 体反応の後に基質を添加して、 酵素反応により生じる化合物を検出することも出 来る。 抗体の標識化は特に限定されず、 従来一般的に採用されている方法により 行なうことができる。
本発明の免疫ク口マト法では、 前記ストリップ 1のコンジュゲートパッド 3の 近傍に位置するサンプルパッド 2に被検体液を添加し、 室温で 1〜3 0分間放置 することにより被検体液とともに標識抗体を検出ライン 6まで展開し、 サンドィッ チ法の原理に基づいて、 展開液中の標識抗体と反応したストレプトコッカス ·ソ プリヌスを検出用抗体にて検出ライン 6上に捕捉し、 捕捉されたストレプトコッ カス ·ソブリヌスに反応した標識抗体を検出することにより、 被検体中のストレ プトコッカス ·ソブリヌスの有無またはその多寡を測定することが出来る。 この ときに標識抗体が被検体液と共に正常に展開されていることは、 上記検出ラィン
6の上流のコント口一ル判定ライン 7に標識抗体と反応する抗体を固定ィ匕してお き、 この位置で標識抗体が検出されることにより確認することができる。 なお、 図 1に示される展開メンブレン 4上の検出ライン 6及びコントロール判定ライン 7の位置、 順、 形状、 数等は一例であり特に限定されるものではない。
以上、 標識抗体を予め塗布して乾燥させたストリップを用いた免疫クロマト法 にっ 、て説明したが、 標識抗体を予め被検体液と混合し抗原抗体反応を行わせた 後に、 該混合液を検出用抗体が固定化された多孔性支持体の一端に添加するとい う方法でも測定可能である。
また、 本発明の免疫クロマト法においては、 図 3に示すようなコンジュゲート パッド 3に標識抗体として、 金コロイド等の標識物質で標識した S抗体 （標識 S 抗体） 及び M抗体 （標識 M抗体） が塗布'乾燥することにより保持され、 また、 上記展開メンブレン 4上の検出ライン 6 a及び 6 bに検出用抗体としてそれぞれ S抗体及び M抗体が固定化されたストリップを用いることにより、 上記と同様な 原理により、 被検体液中のストレプトコッカス 'ソブリヌス及びストレプトコッ カス · ミュータンスの量を同時に測定することもできる。 なお、 図 3には検出ラ イン 6 a及び検出ライン 6 bが展開メンブレン 4の被検体液が展開される下流側 の端部から展開方向に異なる距離になるようにライン状 （帯状） に直列的に配置 された態様を示したが、 各検出用抗体の固定化位置、 固定化部分の大きさ、 形状 は特に限定されるものではない。 例えば、 図 4に示されるように展開メンブレン 4上の検出ライン 6の位置に、 S抗体及び M抗体を、 展開メンブレン 4の被検体 液が展開される下流側の端部から展開方向に同じ距離になるように並列に、 円状 或いはスポット状に固定化してもよい。 また、 両抗体が固定化される部分は完全 に分離される必要はなく、 交互に交差した形状等、 目視にて容易に識別可能な任 意の形状、 位置関係とすることが可能である。
また、 上記した図 3及び図 4に示したような展開メンブレン 4を用いた各スト リップにおいて検出用抗体および標識抗体として使用する M抗体に変えて M S抗 体を使用することにより被検体液中のストレプトコッカス ·ソブリヌス量とスト レプトコッカス · ミュータンスとストレプトコッカス ·ソブリヌスとの総量を同 時に測定することもできる。
本免疫クロマト法による測定においては、 例えば以下のような手順で測定を行 なうことにより、 迅速簡便に被験者の口腔内に存在するストレプトコッカス ·ソ ブリヌスの量を知ることができ、齲蝕危険度を診断判定することができる。
即ち、 まず、 ①口腔内より歯垢或いは唾液を採取 （スパチュラ、 又は綿棒で歯 垢を採取、 或いはスポィ卜で唾液を採取） し、 ②採取物が唾液である場合にはそ のまま、 或いは検体希釈液に懸濁させ、 また、 採取物が歯垢である場合には検体 希釈液に懸濁させた後必要に応じて超音波を当てる等の歯垢の分散処理を施して 被検体液を調製し、 ③被検体液 （例えば 1 0 0〜2 0 0 〃 1 ) を分取し、 前記ス トリップのサンプルパッドに添加し、 所定時間 （例えば;!〜 3 0分） 静置した後、 該ストリップの検出ライン 6及びコント口一ノレ判定ライン 7の着色の有無ある L、 はその状態により判定することによりストレプトコッカス 'ソプリヌスが存在す るか否か、 或いはその量を知ることができる。
例えば、 後述する実施例のようにして調製した被検体液について金コロイドを 標識物質として用いて測定を行なった場合には、 被検体液中のストレプトコッカ ス *ソブリヌスの濃度により検出ライン 6の金コロイドによる着色の程度は表 1 に示す様に変化するので、 表 2の基準に従い齲蝕危険度を診断判定することがで きる。 なお、 表 2では特定の稀釈倍率で調製した被検体液の菌体濃度を基準とし た例を示したが、 被検体液調製時の稀釈倍率から歯垢又は唾液の単位量当たりの 菌体濃度を換算し、 これを判定基準としてもよいことは勿論である。
ストレプトコッカス · 1 07 1 06 1 05 < 1 05
ソブリヌス菌数 (個/ ml)
検出ラインの色 濃赤色 赤色 薄赤色 無色
判 定 +++ + + + 表 2
Figure imgf000036_0001
また、 M抗体を併用し、金コロイドを標識物質として用いた図 3に示すような ストリップを用い、上記と同様な手順で測定を行なった場合には、被検体液中の ストレプトコッカス ·ソブリヌス及びストレプトコッカス · ミュータンスの濃度 により、 検出ライン 6 a及び検出ライン 6 bの金コロイドによる着色の程度は表 3に示す様に変化するので、 表 4の基準に従いより高精度の齲蝕危険度を診断判 定することができる。 尚、表 4における齲蝕危険度を示す指標 AAA〜Dは、 そ れぞれ「AAA〜A：危険度が高い」、 「B B〜B：危険度は中程度」、 「C ： 危険度は低い」、 「D：危険度はない」 を意味する。
表 3
ストレプトコッカス，ソブリヌス
ストレプトコッカス · 1 07 1 06 1 05 ぐ 1 05
ソブリヌス菌数 (個/ ml)
検出ラインの色 濃赤色 赤色 薄赤色 無色
判 定 +++ ++ +
ストレプトコッカス ' ミュータンス
ストレプトコッカス · 1 07 1 06 1 05 < 1 05
ミユータンス菌数 (個/ ml)
検出ラインの色 濃赤色 赤色 薄赤色 無色
判 定 +++ ++ + 表 4
Figure imgf000037_0001
また、 MS抗体を併用し、金コロイドを標識物質として用いた図 3に示すよう なストリップを用い、上記と同様な手順で測定を行なった場合には、被検体液中 のストレプトコッカス ·ソブリヌス及びストレプトコッカス， ミュータンスの濃 度により、 検出ライン 6 a及び検出ライン 6 bの金コロイドによる着色の程度は 表 5に示す様に変化するので、表 6の基準に従いより高精度の齲蝕危険度を診断 判定することができる。 尚、 表 6における齲蝕危険度を示す指標 AAA〜Dは、 表 4におけるのと同じである。
このようにして免疫クロマト法により、齲蝕原因菌として特に重要であるスト レプトコッカス ·ソブリヌスの量、 および必要に応じてストレプトコッカス . ミュ
—タンス量、 或いはストレプトコッカス ' ミュータンス量とストレプトコッカス ' ソブリヌスの総量を迅速簡便に測定することができ、被験者の齲蝕危険度を診断 判定することができる。
表 5
Figure imgf000038_0001
表 6
Figure imgf000038_0002
以下、 実施例により本発明を具体的に説明するが、 本発明は以下の実施例によ り限定されるものではない。
製造例 1 ストレプトコッカス ·ソブリヌスに対するポリク口ーナル抗体の作 製、 抗体の反応性評価
(1)菌体試料懸濁液の調製
BHI (DIFCO社） 3. 7 gを 100m 1の超純水に溶解後、 オートクレ ーブ処理し、 BH I液体培地を調製した。 BH I液体培地 2m 1中で 6715 (ス トレプトコッカス .ソブリヌス、 血清型 g)を 37°C、 5時間、 嫌気条件下 （N 2： H2： CO2=80 : 10 : 10)で培養した後、 培養液を 4000 g、 5分 遠心処理し、上清の培地成分を除去し菌体沈殿を回収した。 次いで、沈殿物を 5 mlの PBSに懸濁させて、 同様の遠心分離をする操作を 3回行い、 沈殿物を洗 浄した。 その後得られた菌体沈殿を PBSに懸濁し、 A600=l. 0に調整し菌 体試料懸濁液とした。 なお、 該菌体試料懸濁液を超音波処理後、 適宜希釈した後 に BH I培地プレート上に添加し、生じたコロニー数を計数し菌体試料懸濁液の の希釈倍率を乗じることで該菌体試料懸濁液の菌体濃度を求めたところ、 約 1 X 109個 Zm 1であつた。
同様の操作により、 B13 (ストレプトコッカス 'ソブリヌス、血清型 d)、 I n gb r i t t (ストレプトコッカス. ミュータンス、血清型 c)、 P 4 (ス トレプトコッカス' ミュータンス、血清型 e)、 OMZ 175 (ストレプトコッ カス · ミユータンス、血清型 f )、 ATCC 10556 (ストレプトコッカス · サンギス） 、 I FO 14252 (ストレプトコッカス，サリバリウス） 、 ATC C49456 (ストレプトコッカス ' ミテイス） 、 ATCC35037 (ストレ プトコッカス ·オラリス） 、 C h a r i s (ストレプトコッカス ·ゴルドニ一） の菌体試料懸濁液を調製した。 なお、 ここで 6715、 B13、 Ingbr i t t、 Ch a r i s等は標準菌株の菌株名を、 ATCC10556、 I F0142 52等は標準菌株の寄託番号を示す。
(2) ストレプトコッカス，ソブリヌスに対する抗血清の作製
ォ一トクレーブ処理した BH I液体培地 100ml中で 6715 (ストレプト コッカス ·ソブリヌス、血清型 g)を 37°C、 5時間、嫌気条件下 （N2： H2： CO2=80 : 10 : 10)で培養した。培養液を 4000 g、 5分遠心処理し、 上清の培地成分を除去し菌体沈殿を回収した。 次いで、沈殿物を 100m 1の P BSに懸濁させて、 同様の遠心分離をする操作を 3回行い、沈殿物を洗浄した。 菌体沈殿を回収、秤量し、 10111§湿菌/1111の 6715の菌体懸濁液を調製し た。該菌体懸濁液を、 5mg湿菌 /mlとなるよう 0. 5%ホルマリン一 PBS で倍希釈し菌体抗原懸濁液とし、 懸濁状態で 4°Cにて保存した。
該菌体抗原懸溺液それぞれ各 1 m 1を、 1週間の内に 1日於きに 3回ゥサギに 対し耳介静脈注射した。 同様の免疫操作を第 2週、 第 3週と、 計 6回行った。更 に菌体抗原懸濁液 0. 5mlを等量のアジュバンドと混合し、 ゥサギの皮下に 2 回注射した。 力価の上昇をスライドグラスを利用した菌体の凝集反応の程度によ り確認後、 最終免疫より 1週間後に、 定法に従い採血しストレプトコッカス ·ソ プリヌスに対する抗血清を得た。
(3) ストレプトコッカス ·ソブリヌスに対するポリクローナル抗体の精製
(1) の方法に従い、 I ngb r i t t (ストレプトコッカス ' ミュータンス、 血清型 c)、 P4 (ストレプトコッカス ' ミュータンス、 血清型 e) 、 及び OM Z175 (ストレプトコッカス ' ミュータンス、 血清型 f) をそれぞれ約 2 x l 01 ° 1含む菌体懸濁液 10mlを調製した。
次いで該菌体懸濁液と、 （2) で得られた抗血清 0. 5mlを混合し 4°C、 6 0分反応した。 混合液を 4000 g、 5分遠心処理後上清を分取し、 0. 22〃 mフィルターで濾過した。
次いで、 あらかじめ PBSで平衡化した lmlのプロテイン A—セファロース (フアルマシア社） を充填したカラムに上清試料を添加し、 51111の？88でカ ラムを洗浄後、 5mlの 0. 1Mグリシン一塩酸緩衝液 （pH3. 0) にて溶出 し、 直ちに l OOmMトリス一塩酸 （pH9. 0) を添加し pH7. 4に調整し た。 I gGの溶出画分は、 A280を測定することで確認した。 0. 5mlの抗血 清より、 約 4mgの I gGを回収した。
(4) 直接 EL I SA法によるストレプトコッカス ·ソブリヌスに対するポリ クローナル抗体の評価
上記 (3) で精製したストレプトコッカス♦ソブリヌスに対するポリクローナ ノレ抗体 （以下「な 6715」 と表記することもある） と、 各菌体との反応性評価 は、 以下の直接 EL I S A法により行った。
すなわち、 先ず、 ±IB (1) の方法で得られた菌体試料懸濁液を、 0. 1M炭 酸緩衝液 （pH9. 0) にて lx l 04〜109個ノ mlとなるよう希釈したもの を、 96穴ィムノプレー卜 （Nun c社、 Max i s 0 r p) の各ゥヱルに 50 / 1ずつ添加し、 4°C、 12時間放置し固定した。 ィムノプレートから菌体懸濁 液を除去し、 30 1の PBSで 3回洗浄した。 次いで、 ィムノプレートの各ゥヱルに、 2%BSA— 0. 1M炭酸緩衝液（p H9. 0)を 300〃 1添加し、 37°C、 2時間放置した後、 ィムノプレートか ら 2%BSA—炭酸緩衝液 （pH9. 0) を除去し、 300 1の0. 05%T we en20-PBS (pH7. 4)で 3回洗浄した。
次いで、 6715を、 1%BSA— 0. 05%Twe en20-PBS (p H7. 4) にて 1. 0〃g/mlとなるよう希釈し、 ィムノプレートの各ゥヱル に 50 1添加し、 37°C、 1時間放置した後、 ィムノプレートから溶液を除去 し、 300 / 1の 0. 05%Twe en20-PBS (pH7. 4)で 3回洗浄 した o
次いで、 アルカリホスファターゼ標識抗ゥサギ I gG (Fc) ポリクローナル 抗体（ャギ） （カッペル社） を、 1%BSA— 0. 05%Twe en20-PB S (pH7. 4) にて 1 O zgZmlとなるよう希釈し、 ィムノプレートの各ゥヱ ルに 50〃 1添加し、 37°C、 1時間放置した後、 ィムノプレートから溶液を除 去し、 300/ 1の 0. 05%Twe e n 20— P B S (p H 7. 4)で 3回洗 浄した。
次いで、発色基質溶液として、 p—ニトロフヱニルリン酸の 2—エタノールァ ミン水溶液（B I ORAD社） を各ゥヱルに 50 1ずつ添加し、室温下 20分 反応した。 反応後、 0. 4Μの NaOHを各ゥヱルに 50〃 1ずつ添加し反応を 停止し、 405 nmの吸光度を測定した。 結果を表 7に示す。
表 7
菌株 菌種 z血清型 菌数 (個/ゥ ル) A4 0 5
B13 ストレプトコッカス ·ソブリヌス /d 5X102 0. 005
B13 ストレプトコッカス ·ソブリヌス/ d 5X103 0. 011
B13 ストレプトコッカス ·ソブリヌス/ d 5X104 0. 062
B13 ストレプトコッカス .ソブリヌス/ d 5X105 0. 640
B13 ストレプトコッカス，ソブリヌス/ d 5X106 1. 635
B13 ストレプトコッカス，ソブリヌス /d 5X107 >2. 000
6715 ストレプトコッカス'ソブリヌス/ g 5X102 0. 004
6715 ストレプトコッカス ·ソブリヌス/ g 5xl03 0. 013
6715 ストレプトコッカス'ソブリヌス/ g 5X104 0. 080
6715 ストレプトコッカス.ソブリヌス/ g 5X105 0. 653
6715 ストレプトコッカス ·ソブリヌス/ g 5X106 1. 682
6715 ストレプトコッカス *ソブリヌス 5X107 >2. 000
Ingbritt ストレプトコッカス ·ミユータンス /c 5X105 0. 005
Ingbritt ストレプトコッカス ·ミユータンス /c 5xl06 0. 004
Ingbritt ストレプトコッカス'ミュータンス /c 5xl07 0. 012
P4 ストレプトコッカス ·ミユータンス /e 5X105 0. 004
P4 ストレプトコッカス ·ミユータンス /e 5X106 0. 003
P4 ストレプトコッカス，ミュ一タンス /e 5X107 0. 010
OMZ175 ストレプトコッカス ·ミュータンス /f 5X105 0. 004
OMZ175 ストレプトコッカス ·ミュータンス /f 5X106 0. 006
OMZ175 ストレプトコッカス ·ミュ一タンス /f 5X107 0. 013
ATCC10556 ストレプトコッカス ·サンギス 5X107 0. 004
I編 252 ストレプトコッカス，サリバリウス 5X107 0. 003
ATCC49456 ストレプトコッカス'ミテイス 5X107 0. 004
ATCC35037 ストレプトコッカス ·オラリス 5X107 0. 006
Charis ストレプトコッカス ·ゴノレドニ一 5X107 0. 007 (5)競合 EL I S A法によるストレプトコッカス ·ソブリヌスに対するポリ クロ一ナル抗体の評価
«6715と、 各菌体との反応性は、 以下の競合 EL I SA法によっても評価 した。
すなわち、 先ず、 上記 (4) と同様にして、 菌体を固定化し、 BSAでブロッ キングしたィムノプレートを作製した。 次いで、 ィムノプレートの各ゥエルに、 «6715を 1. O/^gZml含み、 更にストレプトコッカス · ミュータンス、 或いはストレプトコッカス ·ソブリヌスの菌体を 105〜 109個 1含む 1 % BSA-O. 05%Twe en20-PBS (pH7. 4)溶液 50〃 1を添加 し、 37°C、 1時間放置した後、 ィムノプレートから溶液を除去し、 300〃 1 の 0. 05%Twe en20— PBS (pH7. 4)で 3回洗浄した。
次いで、 上記 （4) と同様にして、 アルカリホスファタ一ゼ標識した抗ゥサギ I gG抗体を添加した後、 発色基質溶液を添加し、 405nmの吸光度を測定し た。 結果を表 8に示す。 表 8
6715固定化量 添加した菌株 菌株の添加量 A 05
(個/ゥエル） (個/ゥエル）
5X105 6715 5X107 0.018
5X105 6715 5X106 0.078
5X105 6715 5X105 0.184
5X105 6715 5X104 0.309
5xl05 6715 5X103 0.325
5xl05 6715 0 0.320
5X105 Ingbritt 5X107 0.293
5X105 Ingbritt 5X106 0.325
5X105 Ingbritt 5X105 0.319
5X105 Ingbritt 5X104 0.321
5X105 Ingbritt 5X103 0.320
5X105 Ingbritt 0 0.319 表 7より、 5xl05個 ゥヱノレから 5x107個/ゥヱルの範囲において、 同 ー菌体量のストレプトコッカス 'ソブリヌスとストレプトコッカス · ミュータン スを抗原とし、 抗原抗体反応の検出を行った際に、 ストレプトコッカス 'ソブリ ヌスを抗原として使用した場合に検出される反応が、 ストレプトコッカス ' ミュ 一夕ンスを抗原として使用した場合に検出される反応の 100倍以上であること が分かる。 さらに、 5X 107個 Zゥヱルのストレプトコッカス ' ミュータンス を抗原として使用した場合に検出される反応と同一の反応が検出されるストレブ トコッカス ·ソブリヌスの抗原量は 5x104個/ゥヱル以下であることから、 6715のストレプトコッカス ·ソブリヌスに対する反応性は、 ストレプトコッ カス， ミュータンスに対する反応性の 1000倍以上であることが分かる。
また、 表 8より、 5x107個/ゥヱルのストレプトコッカス · ミュータンス を添加した場合に検出される阻害反応は、 5x105個ノウエル以下のストレブ トコッカス ·ソブリヌスを添加した場合に検出される阻害反応と同等であり、 ス トレプトコッカス .ソブリヌスに対する反応性が、 ストレプトコッカス . ミュー タンスに対する反応性の 100倍以上であることが分かる。
実施例 1 ストレプトコッカス ·ソブリヌス測定用免疫クロマト法ストリップ の作製、 評価
(1)金コロイド標識されたストレプトコッカス ·ソブリヌスに対するポリク 口一ナル抗体の調製
コ.ロイド粒径が 40 nmの巿販金コロイド溶液 （EY Labora to ry)
10mlに 100mMK2CO3を 88/^1添加し、 pHを 9. 0に調製後、 0. 22〃 mフィルタ一処理した。 金コロイド溶液の 520n mの吸光度を測定した ところ、 A520=l. 0であった。
次いで、 lmgZmlに調整した 6715の21111^ホゥ酸緩衝溶液 (pH9. 0 ) 64〃 1を、 上記金コロイド溶液に撹拌しながら添加し、 室温下 5分放置し た。 次いで、 10%スキムミルク一 2mMホウ酸緩衝液 （pH9. 0) を 1. 1 ml撹拌しながら添加し （スキムミルク終濃度 1%)、 室温下 30分放置した。 次いで、 反応溶液を 10°C、 10000 g、 30分遠心処理し、 上清を除去後、 2mlの 2mMPBS (pH7. 4)を添加し、 下層の金コロイド画分を再懸濁 した。 該再懸濁した画分の 520 nmの吸光度を測定したところ、 A52()=4. 9であった。 得られた金コロイド画分 （以下、 「金コロイド標識 6715」 と 表記することもある） は、 4 °Cにて保存した。
(2)免疫クロマト法ストリップの作製
ニトロセルロースメンブレン （MI LL I PORE社、 H i _F 1 ow Me mbrane、 SN、 25mmx 6mm)からなる展開メンブレン 4上の検出ラ イン 6及びコントロール判定ライン 7上に、 それぞれ lmgノ mlのび 6715 及び抗ゥサギ I gG (H + L) ポリクロ一ナル抗体 1〃 1をスポットし、 インキュ ベータ一内で 37°C、 60分乾燥し抗体を固定化した。 該抗体固定化メンブレン を 1%スキムミルク一 0. 01%Tr i tonXlOO水溶液中で室温下、 5分 振とうした。 次いで、 該メンブレンを 1 OmMリン酸緩衝液 (pH7. 4) 中で 室温下、 10分振とう後取り出し、 真空ポンプで吸引しながら 60分間デシケ一 ター中で乾燥した。
また、 コンジュゲートパッ ド 3 (MILLI PORE社、 7. 5mmx 6mm) を 0. 5%PVA_0. 5%ショ糖水溶液中で 1分間振とう後取り出し、 真空ポ ンプで吸弓 Iしながら 60分間デシケ一夕一中で乾燥した。 該コンジュゲート ッ ドに A520=l. 0に調整した金コロイド標識 α 6715を 25 χ 1添加し、 真 空ポンプで吸引しながら 60分間デシケータ一中で乾燥した。 更に、 サンプルパッ ド 2 (MI LL I PORE社、 17mmx6mm)を 0. 05%Tween20 -PBS水溶液中で 1分間振とう後取り出し、 真空ポンプで吸弓 Iしながら 60分 間デシケーター中で乾燥した。 尚、 吸収パッド 5 (MI LL I PORE社、 20 mm x 6mm) は未処理のまま用いた。
このように調製した、.図 1に示すような免疫クロマト法ストリップの各構成部 分をプラスチックの支持台上に配置し、 図 2に示すような免疫クロマト法ストリツ プを組み立てた。
(3)免疫クロマト法ストリップの特異性、 感度評価
免疫クロマト法ストリップのサンプルパッド 2上に、標準菌体の PBS懸濁液 100^1を添加し、 10分後にスポッ卜の有無を判定した。 判定は、 固定化抗 体スポット上に捕捉された金コロイドの程度を前記表 1に示した基準に基づき 4 段階 （+ + +：強い陽性、 ++：陽性、 +：弱い陽性、 ―：陰性） に目視で識別 し、 感度及び定量性を評価した。 結果を表 9に示す。 表 9
Figure imgf000046_0001
比較例 1 ストレプトコッカス ュ —タンスによる吸収処理をしない、 スト レプトコッカス，ソブリヌスに対するポリク口一ナルの評価
先ず、 製造例 1の （2)で得られたストレプトコッカス 'ソブリヌスに対する 抗血清を、 ストレプトコッカス ' ミュータンスの菌体による吸収処理をしないで、 製造例 1 (3) の操作手順に従い、 プロテイン Aカラム処理のみ行い、 I gG画 分を調製した （以下、 「未精製ポリクローナル抗体」 と表記することもある） 。 次いで、 製造例 1 ( 4) の操作手順に従い、 未精製ポリクローナル抗体と菌体と の反応性を直接 E L I S A法により評価した。 結果を表 1 0に示す。 表 1 0
Figure imgf000047_0001
また、 実施例 1の操作手順に従い金コロイド標識抗体を調製後、 免疫クロマト 法ストリップを作製し、 菌体との反応性を評価した。 結果を表 1 1に示す。 表 1 1
Figure imgf000048_0001
表 1 0力、ら、 未精製ポリクローナノレ抗体のストレプトコッカス ·ソブリヌスに 対する反応性は、 ストレプトコッカス ' ミュータンスに対する反応性の 1 0倍以 下であることが分かる。 また、 表 1 1から、 未精製ポリクローナル抗体を用いた 免疫クロマト法ストリップを用いた場合には、 ストレプトコッカス. ミュータン スに対する反応が検出され、 ストレプトコッカス ·ソブリヌスを特異的に検出す ることは出来なかった。
実施例 2 免疫クロマト法ストリップによる歯垢からのストレプトコッカス ' ソブリヌスの検出
(1)歯垢を含む被検体液の調製
120人より、 口腔内を水で洗浄し唾液成分を除去後、 スパチュラを用いて歯 垢を採取した。 歯垢を秤量後、 lmg湿重量 Zmlとなるよう PBSに懸濁し、 20秒間、 60Wで超音波処理することで歯垢を含む被検体液を得た。
(2)培養法による歯垢試料溶液中のストレプトコッカス ·ソブリヌスの定量 上記 （1)の方法に従い得られた歯垢を含む被検体液を適宜希釈して、 100 1をミチス ·サリバリウス ·バシトラシン （以下、 「MSB」 と表記すること もある。 ） 固体培地上および B HI固体培地上に添加し、 37°C、 嫌気条件下、 24時間培養した。 MS Bおよび B H I固体培地上に生じるコロニ一数を計数し、 被検体液の希釈率から、 ミュータンスレンサ球菌濃度を個ノ mlとして算出した。 MSBおよび BH I培地上のストレプトコッカス ·ソブリヌス及ぴストレプトコッ カス · ミュータンスの識別は、 コロニーの形態学的分類、 及び形態学的に識別不 可能なコロニーに関しては、 該コロニ一を純粋培養後、 ミュータンスレンサ球菌 の血清型特異的な抗体を利用した免疫学的測定方法及び、 糖発酵試験等の生化学 的方法によりストレプトコッカス 'ソブリヌス及びストレプトコッカス ' ミュー タンスの同定を行った。
(3)免疫クロマト法ストリップによる歯垢を含む被検体液中のストレプトコッ カス ·ソブリヌスの測定
上記 (2)の検討により、 ストレプトコッカス ·ソブリヌスが検出された 8検 体、 及びストレプトコッカ ·ソブリヌスが検出されず、 ストレプトコッカス. ミユータンスが検出された 5検体、 及び両者とも検出されない 1検体の被検体液 200 / 1について、 実施例 2の （2) と同様の方法で作製した免疫クロマト法 ストリツプを用ぃストレプトコッカス ·ソブリヌスの測定を実施した。 免疫クロ マト法ストリツプに於ける 10分後のスポット発色強度を前記表 1に示した基準 に基づき識別し、 4段階 （+ + +：強い陽性、 + +：陽性、 +：弱い陽性、 ― 陰性） に識別した結果と、 （2) の培養法により得られたストレプトコッカス ソブリヌス菌数とを比較した。 結果を表 1 2に示す。 表 1 2
Figure imgf000050_0001
表 1 2より、 培養法により得られたストレプトコッカス ·ソブリヌスの濃度と 相関し、 ストレプトコッカス ' ミュー夕ンスの濃度とは相関しないスポット発色 強度が得られた。 本発明の免疫クロマト法ストリップにより、 ストレプトコッカ ス ·ソブリヌスを 1 05個 Zm 1以上の濃度で含む被検体液から、 ストレプトコッ カス ·ソブリヌスをその濃度依存的に、 特異的に検出可能であった。
製造例 2 ストレプトコッカス . ミュータンスに対するポリクローナル抗体の 作製、 抗体の反応性評価
(1)菌体試料懸濁液の調製
製造例 1 (1)の方法に従い、 I ngb r i t t (ストレプトコッカス ' ミュ —タンス、 血清型 c) の菌体試料懸濁液を調製した。 A600=l. 0に調整した 該菌体試料懸濁液の菌体濃度を求めたところ、 約 2 X 109個 Zm 1であつた。 同様の操作により、 B13 (ストレプトコッカス 'ソブリヌス、 血清型 d)、 6715 (ストレプトコッカス 'ソブリヌス、 血清型 g)、 P4 (ストレプトコッ カス · ミユータンス、 血清型 e)、 OMZ 175 (ストレプトコッカス ' ミュー タンス、 血清型 f)、 ATCC10556 (ストレプトコッカス 'サンギス） 、 IF014252 (ストレプトコッカス 'サリバリウス） 、 ATCC49456
(ストレプトコッカス ' ミテイス） 、 ATCC35037 (ストレプトコッカス ' オラリス） 、 C h a r i s (ストレプトコッカス 'ゴルドニ一） の菌体試料懸濁 液を調製した。
(2) ストレプトコッカス ' ミュータンスに対する抗血清の作製
製造例 1 (2)の方法に従い、 10mg湿菌ノ mlの I ngb r i t tの菌体 懸濁液を調製した。 該菌体懸濁液を、 5mg湿菌 Zmlとなるよう 0. 5%ホル マリン一 PBSで倍希釈し菌体抗原懸濁液とし、 製造例 1 (2)の方法に従いゥ サギに免疫することでストレプトコッカス · ミュータンスに対する抗血清を得た。
(3) ストレプトコッカス · ミュータンスに対するポリクロ一ナル抗体の精製 (1)で調製した B13 (ストレプトコッカス ·ソブリヌス、 血清型 d)、 67
15 (ストレプトコッカス ·ソブリヌス、 血清型 g)、 ATCC10556 (ス トレプトコッカス ·サンギス） 、 IF014252 (ストレプトコッカス ·サリ ノ リウス） 、 ATCC49456 (ストレプトコッカス ' ミテイス） 、 ATCC 35037 (ストレプトコッカス 'オラリス） 、 Char i s (ストレプトコッ カス 'ゴルドニ一） をそれぞれ約 2 X 1012個 Zm 1含む菌体懸濁液 20 m 1と、 上記 （2)で得られた抗血清 0. 5mlを混合し 4°C、 60分反応した。 混合液 を 4000g、 5分遠心処理後上清を分取し、 0. 22〃mフィルターで濾過し 次いで、 製造例 1 (3)の方法に従いプロテイン A処理し、 0. 5mlの抗血 清より約 5mgの I gGを回収した。
(4)直接 EL I S A法によるストレプトコッカス ' ミュータンスに対するポ リクローナル抗体の評価
上記 (3) で精製したストレプトコッカス ' ミュータンスに対するポリクロー ナル抗体 （以下「 I ngb r i t t」 と表記することもある） と、 各菌体との 反応性評価は、 以下の直接 EL I S A法により行った。
すなわち、 先ず、上記 （1)の方法で得られた菌体試料懸濁液を、 0. 1M炭 酸緩衝液 （pH9. 0) にて lxl05〜109個 Zmlとなるよう希釈したもの を、 96穴ィムノブレ一ト （Nun c社、 Max i s o r ρ)の各ゥヱルに 50 〃1ずつ添加し、 4°C、 12時間放置し固定した。 ィムノプレートから菌体懸濁 液を除去し、 300〃 1の PBSで 3回洗浄した。
次いで、 ィムノプレートの各ゥエルに、 2%BSA—0. 1M炭酸緩衝液 (p H9. 0) を 300 1添加し、 37°C、 2時間放置した後、 ィムノプレートか ら 2%BSA—炭酸緩衝液 （pH9. 0)を除去し、 30 1の 0. 05%Τ ween20~PBS (pH7. 4)で 3回洗浄した。
次いで、 I ngb r i t tを、 1%BSA— 0. 05%Twe e n 20-P BS (pH7. 4)にて 1. 0〃gZmlとなるよう希釈し、 ィムノプレートの 各ゥヱルに 50 1添加し、 37°C、 1時間放置した後、 ィムノプレートから溶 液を除去し、 300〃 1の 0. 05%Twe en20— PBS (pH7. 4)で 3回洗浄した。
次いで、 アルカリホスファタ一ゼ標識抗ゥサギ I gG (Fc)ポリクローナル 抗体 （ャギ） （カッペル社） を、 1%BSA— 0. 05%Twe en20-PB S (pH7. 4) にて 10〃g/mlとなるよう希釈し、 ィムノプレートの各ゥヱ ルに 50〃 1添加し、 37で、 1時間放置した後、 ィムノプレートから溶液を除 去し、 300〃 1の 0. 05%Twe e n 20— P B S (p H 7. 4)で 3回洗 浄した。
次いで、 発色基質溶液として、 ρ—ニトロフヱニルリン酸の 2—エタノールァ ミン水溶液 ( B I O R A D社） を各ゥヱルに 5 0 1ずつ添加し、室温下 2 0分 反応した。 反応後、 0. 4 Μの N a 0 Ηを各ゥヱルに 5 0 1ずつ添加し反応を 停止し、 4 0 5 n mの吸光度を測定した。 結果を表 1 3に示す。 表 1 3
鹿 ϋ 菌種 血清型 菌数 (個/ゥヱル) A 4 0 5
Ingbritt ストレプトコッカス ·ミュータンス /c 5X103 0. 005
Ingbritt ストレプトコッカス ·ミュータンス /c 5X104 0. 018
Ingbritt ストレプトコッカス ·ミュータンス /c 5X105 0. 092
Ingbritt ストレプトコッカス ·ミユータンス /c 5X106 0. 736
Ingbritt ストレプトコッカス.ミュータンス /c 5X107 1. 824
P4 ストレプトコッカス ·ミュ一タンス /e 5X103 0. 004
P4 ストレプトコッカス'ミユータンス /e 5X104 0. 016
P4 ストレプトコッカス ·ミュータンス /e 5X105 0. 081
P4 ストレプトコッカス.ミユータンス /e 5X106 0. 613
P4 ストレプトコッカス ·ミュ一タンス /e 5X107 1. 475
OMZ175 ストレプトコッカス .ミユータンス /f 5X103 0. 004
OMZ175 ストレプトコッカス 'ミュ一タンス /f 5X104 0. 010
OMZ175 ストレプトコッカス ·ミュータンス /f 5X105 0. 065
OMZ175 ストレプトコッカス.ミュータンス /f 5X106 0. 455
OMZ175 ストレプトコッカス *ミユータンス /f 5X107 1. 103
B13 ストレプトコッカス ·ソブリヌス/ d 5X105 0. 002
B13 ストレプトコッカス ·ソブリヌス/ d 5X106 0. 004
B13 ストレプトコッカス ·ソブリヌス/ d 5X107 0. 010
6715 ストレプトコッカス 'ソブリヌス/ g 5X105 0. 003
6715 ストレプトコッカス.ソブリヌス/ g 5X106 0. 004
6715 ストレプトコッカス♦ソブリヌス/ g 5X107 0. 008
ATCC10556 ストレプトコッカス ·サンギス 5X107 0. 004
IF014252 ストレプトコッカス ·サリバリウス 5X107 0. 003
ATCC49456 ストレプトコッカス.ミテイス 5X107 0. 004
ATCC35037 ストレプトコッカス *ォラリス 5X107 0. 008
Charis ストレプトコッカス ·ゴノレドニ一 5X107 0. 010 表 13より、 5xl05個/ゥヱルのストレプトコッカス ' ミュータンスを抗 原として使用し抗原抗体反応の検出を行った場合に、 5x107個/ゥヱルの他 の口腔内レンサ球菌を抗原として使用した場合よりも高い反応が検出されること から、 I n gb r i t tのストレプトコッカス ' ミュ一タンスに対する反応性 は、 他の口腔内レンサ球菌に対する反応性の 100倍以上であることが分かる。 実施例 3 ストレプトコッカス 'ソブリヌスとストレプトコッカス · ミュータ ンスの同時測定用免疫クロマト法ストリップの作製、 評価
(1)金コロイド標識されたストレプトコッカス ' ミュータンスに対するポリ クロ一ナル抗体の調製
実施例 1 (1) の方法に従い、 I ngb r i t tの金コロイド標識物 （以下、 「金コロイド標識 I ngb r i t t」 と表記することもある） を調製し、 4°C にて保存した。
(2)免疫クロマト法ストリップの作製
ニトロセルロースメンブレン （MI LL I PORE社、 H i— F 1 ow Me mbrane、 25mmx 6mm)からなる展開メンブレン 4上の検出ライン 6 の位置に、 それぞれ lmgZm 1のび 6715、 《Ingbr i t t l〃 lを、 展開方向に対して並列にスポットし、 コントロール判定ライン 7上に lmg/m 1の抗ゥサギ I gG (H + L) ポリクローナル抗体 1〃 1をスポットし、 インキュ ベータ—内で 37で、 60分乾燥し抗体を固定化した。 該抗体固定化メンブレン を 1 %スキムミノレク一 0. l%Tr i tonX100水溶液中で室温下、 5分振 とうした。 次いで、該メンプレンを 10 mMリン酸緩衝液 (pH7. 4) 中で室 温下、 10分振とう後取り出し、 真空ポンプで吸引しながら 60分間デシケータ 一中で乾燥した。
また、 コンジュゲートパッ ド 3 (M ILL I PORE社、 7. 5mmx6mm) を 0. 5%PVA— 0. 5%ショ糖水溶液中で 1分間振とう後取り出し、 真空ポ ンプで吸弓 Iしながら 60分間デシケ一ター中で乾燥した。 該コンジユゲートノ、°ッ ドに A520= 2. 0に調整した金コロイド標識 α6715及び A520=2. 0に調 整した金コロイド標識 I ngb r i t tをそれぞれ 12. 5〃 1添加し、 真空 ポンプで吸引しながら 60分間デシケーター中で乾燥した。 更に、 サンプルパッ ド 2 (MI LL I PORE社、 17mmx 6mm)を l%Twe e n 20-PB S水溶液中で 1分間振とう後取り出し、真空ポンプで吸引しながら 60分間デシ ケ—ター中で乾燥した。 尚、吸収パッド 5 (MILL I PORE社、 20mmx
6mm) は未処理のまま用いた。
このように調製した、 図 4に示すような免疫クロマト法ストリップの各構成部 分をブラスチックの支持台上に配置し、図 2に示すような免疫クロマト法ストリッ プを組み立てた。
(3)免疫クロマト法ストリップの特異性、 感度評価
免疫クロマト法ストリップのサンプルパッド 2上に、標準菌体の PBS懸濁液 100^ 1を添加し、 10分後にスポットの有無を判定した。判定は、 固定化抗 体スポッ卜上に捕捉された金コロイドの程度を 4段階（+ + +：強い陽性、 + + ：陽性、 +：弱い陽性、 -：陰性） に目視で識別し、 感度及び定量性を評価した。 結果を表 14に示す。
表 1 4
被検体液 判定 判定 囷休 囷¾/ M 恢山 td ·フ ^ノノ、 βり aο 恢 fflフっ ノり D
(IB/ml (ス卜！/ブ卜: ι'?¾Χ· ゝ、 I /ブト:—! 1、? / ¾ /ί又 /\ ·
、/プリヌス検出） ミュ-タンス検出）
B13 ストレアトコ カスづブリヌス/ d 109 +++ 一
B13 ストレアトコ 'ノカス'ソプリヌス/ d 108 +++ ―
B13 ストレアトコ カス ·、/ブリヌス/ d 107 +++
B13 ストレアトコ カスづプリヌス/ d 106 ++
B13 ストレアトコ 7カス'ソプリヌス/ d 105 + ―
B13 ストレアトコ カス プリヌス/ d 104 一 一
6715 ストレプト カス ·、ブリヌス/ g 109 +++ ―
6715 ストレアトコ 7カスづプリヌス/ g 108 +++ ―
6715 ストレプトコ カス プリヌス/ g 107 +++ 一
6715 ストレプトコ カス プリヌス/ g 106 ++ ―
6715 ストレプトコ カスづプリヌス/ g 105 + 一
6715 ストレプトコ カスづブリヌス/ g 104 ― 一
Ingbritt ストレプトコッカス'ミュ-タンス /c 109 ― +++
Ingbritt ストレアトコブカス'ミュ-タンス /c 108 ― ++
Ingbritt ストレプトコ カス 'ミュ-夕ンス /c 107 ― +
Ingbritt ストレプトコ'?カス'ミュ-タンス /c 106 ― +
Ingbritt ストレプトコ カス'ミュ-タンス /c 105 ―
P4 ストレブトコ カス 'ミュ-夕ンス /e 109 +++
P4 ストレプトコ カス 'ミュ-タンス /e 10s ++
P4 ストレアトコ カス 'ミ： 1-タンス /e 107 +
P4 ストレブトコ'グカス'ミュ-タンス /e 106 ― +
P4 ストレブトコ カス タンス /e 105 一 一
OMZ175 ストレプトコ'?カス 'ミュ-タンス /f 109 ― +++
OMZ175 ストレブトコ カス'ミュ-タンス /f 108 ++
OMZ175 ストレブトコ カス 'ミュ-夕ンス /f 107 一 +
OMZ175 ストレアトコ カス 'ミュ-タンス /f 106 一 ―
O Z175 ストレブトコ' yカス'ミュ-タンス /f 105 - ―
ATCC10556 ストレプトコ カス'サンギス 109
IF014252 ストレブトコ カス 'サリパリウス 109
ATCC49456 ストレブト]" /カス'ミテイス 109
ATCC35037 ストレブトコ カス'オラリス 109
Charis ストレプトコプカス *ゴルドニ- 109 表 14より、 被検体液中のストレプトコッカス 'ソブリヌス及びストレプトコッ カス . ミュータンスの検出を行った際に、検出ライン 6の位置のストレプトコッ カス ·ソブリヌス検出用スポットでは、 lxl 05個 Zmlから lx 109個 Zm 1の範囲において被検体液中のストレプトコッカス 'ソブリヌスが特異的に検出 されることが分かる。 また、 ストレプトコッカス · ミュータンス検出用スポット では、 I ngb r i t t (血清型 c) 及び P 4 (血清型 e) を分析した場合に 1 ><106個/ 1111から1 109個 1111の範囲にぉぃて、 また OMZ175 (血 清型 f ) を分析した場合に 1x107個 Zm 1から 1 X 109個 Zm 1の範囲にお いて被検体液中のストレプトコッカス ' ミュータンスが特異的に検出されること . が分かる。 ストレプトコッカス · ミユータンスの検出感度をストレプトコッカス ' ソブリヌスの検出感度と同様に 105個 Zmlとするためには、 より反応性の高 い抗体をとれば良い。 そのような抗体の反応性としては、 製造例 2の （4)の直 接 EL I S A法において、 5x103個ノウエルのストレプトコッカス ' ミュー タンスを分析した場合に、 バックグラウンド以上の反応が検出される程度の反応 性を有する抗体が必要である。
実施例 4 免疫クロマト法ストリップによる歯垢を含む被検体液中のストレブ トコッカス 'ソブリヌス量及ぴストレプトコッカス ' ミュー夕ンス量の同時測定 実施例 2と同じ 14検体の被検体液 200〃 1について、 実施例 3の （2) と 同様の方法で作製した免疫クロマト法ストリップを用いストレプトコッカス ·ソ ブリヌス量及びストレプトコッカス ' ミュータンス量の同時測定を実施した。 免 疫クロマト法ストリップに於ける 10分後のスポット発色強度を 4段階 (+ + + ：強い陽性、 ++：陽性、 +：弱い陽性、 ―：陰性） に識別した結果と、培養法 により得られたストレプトコッカス'ソブリヌス及びストレプトコッカス · ミュ —タンス菌数とを比較した。 結果を表 15に示す。 表 15
Figure imgf000058_0001
表 15より、 ストレプトコッカス ·ソブリヌス検出用スポットでは、 培養法に より得られたストレプトコッカス♦ ミユータンスの濃度に関わらずストレプトコッ カス ·ソブリヌスの濃度と相関したスポット発色強度が得られた。 また、 ストレ プトコッカス . ミュータンス検出用スポットでは、 培養法により得られたストレ プトコッカス 'ソブリヌスの濃度に関わらず、 7X105個/ ml以上のストレ プトコッカス · ミユータンスが検出された。 本発明の同時測定用免疫クロマト法 ストリップにより、 ストレプトコッカス ·ソブリヌス及びストレプトコッカス · ミユータンスを 105個/ m 1以上の濃度で含む被検体液から、 105個 Zm 1以 上のストレプトコッカス 'ソブリヌスをその濃度依存的に且つ特異的に、 7x1 05個 Zml以上のストレプトコッカス · ミュータンスを特異的に同時検出可能 であった o
製造例 3 ストレプトコッカス ' ミュータンス及びストレプトコッカス .ソブ リヌスに反応するポリクローナル抗体の作製、 抗体の反応性評価
製造例 2で作製した 1 Omgのび I n gb r i t tと製造例 1で作製した lm gの 6715とを混合し、 ストレプトコッカス · ミュータンス及びストレプト コッカス 'ソブリヌスに反応するポリク口一ナル抗体 （以下「 I n g b r i t t— 6715」 と表記することもある） を作製した。 Ingbr i t t— 67 15と各菌体との反応性評価を、 製造例 2 (4)の方法に従い直接 EL I SA法 により行った。 結果を表 16に示す。
表 1 6
諮: ¾ 菌健/ rfn清型
ΤησΗτΐ†† ストレプ卜コ カス · タンス /c χΐ η3 η (ins
Tncrhfi†† ストレプトコ、ソカス ·ミ --一夕ンス /c 5Χ104 0 0 υ13
Tnphri†† ス卜レプトコ、、'カス ·ミ --一夕ンス /c 5Χ105 0 070
Tn^h i十† ストレプトコッカス ·？ユー々ンス /c 5Χ1 Π6 η 680 丁 n fivri†十 ストレプ卜コヅカス · -—タンス /c 5x1 Π7 .リリリ
PA ズ レ トっ、 カス · ータンス / ςχΐ η3
PA ズ卜レプ Λ · " ―々ソス υ. υ
P4 スヽ レプ ソカス · タンス /e η nfiB
P4 スヽ卜レプトコ、 カス，ミ "^一夕ンス /e 5X106
P4 ストレプトコッカス ·ミュー夕ンス /e 5X107 1 324
0MZ175 ストレプ卜コッカス ·？ユー々ンス /f 5x103 0 004
0MZ175 スヽトレプトコ、ソカス.ミ —夕ンス /f 5x104 0 議
OMZ17 ス卜レプトコッカス ·ミュー z夕ンス /f リ' π 議
0 71 ス卜レフ。トコ、、ノカフ · タンス /f 5X1 f)6
0M71 75 ス卜レゴト f コ、、 カス · 一々 ス f /f u
ストレプトコ、 yカス ·ソフリヌス /d 5X103 η ηη,ς
B13 スヽトレプトコ、ソカス.ソ yフリヌス /d x' 104 η πΐ
ストレプトコ、ソカズ ·ソフ、、リヌス M 5x105 n \J» (ifiR ストレプトコ、、)カス ·ソつ" 1 jヌス /d . ςχΐ ηβ ストレゴト カス *ソブ ' ヌス /d u 1 QQQ υ υ ストレプトコ、、ノカス ·ソっ "リヌスヽ /σ リハ n
Figure imgf000060_0001
6715 ス レプ ソカス ·ソプ ' ス /σ
6715 ストレプト， コッカス ·ソプ 'リヌス /σ 5X1 05
6715 ストレプトコッカス ·ソプリヌス / 5X106 n 641
6715 ストレプトコ、ソカス.ソプリマス /σ 5X107 . リ
ATCC10556 ストレプトコッカス ·サンギス 5X107 0. 004
IF014252 ストレプトコッカス ·サリバリウス 5X107 0. 003
ATCC49456 ストレプトコッカス *ミテイス 5X107 0. 004
ATCC35037 ストレプトコッカス'オラリス 5X107 0. 006
Charis ストレプトコッカス ·ゴルドニ 5X107 0. 007 表 16より、 5xl05個/ゥエルのストレプトコッカス · ミュータンス或い はストレプトコッカス ·ソブリヌスを抗原として使用し抗原抗体反応の検出を行つ た場合に、 5x107個/ゥヱルの他の口腔内レンサ球菌を抗原として使用した 場合よりも高い反応が検出されることから、 Ingbr i t t一 6715のス トレプトコッカス ' ミュータンス或いはストレプトコッカス .ソブリヌスに対す る反応性は、 他の口腔内レンサ球菌に対する反応性の 100倍以上であることが 分かる。 また、 5x 105個/ゥヱルから 5x107個/ゥヱルの範囲において、 同一菌体量のストレプトコッカス · ミユータンスとストレプトコッカス ·ソブリ ヌスを抗原とし、 抗原抗体反応の検出を行った際に、 ストレプトコッカス · ミュ —タンスとストレプトコッカス 'ソブリヌスより検出される反応が 1. 5倍以内 であることから、 a l ngbr i t t一 6715のストレプトコッカス ' ミュ一 タンスとストレプトコッカス ·ソブリヌスに対する反応性が同等であることが分 かる。
実施例 5 ストレプトコッカス ·ソブリヌス量とストレプトコッカス · ミ タンス及びストレプトコッカス 'ソブリヌス総量の同時測定用免疫クロマト法ス トリップの作製、 評価
(1)金コロイド標識されたストレプトコッカス ' ミュータンス及びストレブ トコッカス ·ソブリヌスに反応するポリクローナル抗体の調製
実施例 1 (1) の方法に従い、 a lngbr i t t— 6715の金コロイド標 識物 （以下、 「金コロイド標識 a I ngb r i t t— 6715」 と表記すること もある） を調製し、 4°Cにて保存した。
(2)免疫クロマト法ストリップの作製
ニトロセルロースメンブレン （MI LL I PORE社、 H i—F 1 ow Me mb r a n e、 25mmx 6mm)からなる展開メンブレン 4上の検出ライン 6 の位置に、 それぞれ lmgZmlの α6715、 Ingbr i t t— 6715 1〃 1を、 展開方向に対して並列にスポットし、 コントロール判定ライン 7上に lmgZmlの抗ゥサギ I gG (H+L) ポリクロ一ナル抗体 1〃 1をスポット した。 また、 コンジュゲートパッド 3に A520=2. 0に調整した金コロイド標 識 6715及び A520= 2. 0に調整した金コロイド標識 α I ngb r i t t -6715をそれぞれ 12. 5〃 1添加した。上記以外の操作は実施例 1 (2) の方法に従い、 図 4に示すような免疫クロマト法ストリップの各構成部分を調製 し、該各構成部分をプラスチックの支持台上に配置し、 図 2に示すような免疫ク ロマト法ストリップを組み立てた。
(3)免疫クロマト法ストリップの特異性、感度評価
免疫クロマト法ストリップのサンプルパッド 2上に、標準菌体の PBS懸濁液 100〃 1を添加し、 10分後にスポットの有無を判定した。 判定は、 固定化抗 体スポット上に捕捉された金コロイドの程度を 4段階（+ + +：強い陽性、 + + ：陽性、 +：弱い陽性、一：陰性） に目視で識別し、感度及び定量性を評価した 結果を表 17に示す。
表 1 7
被検体液 判定 判定 困怀 园種 /皿滑 i全 ίίϋίノィ 1 ノR ϋa 全'屮 Rh
(個/ ml) トレプトコッカス · (ミュ -タンス及び ゾプリヌス検出） ソブリヌス総量検出）
B13 ストレプトコッカスづプリヌス/ d 109 +++ +++
B13 ストレプトコッカス プリヌス/ d 108 +++ ++
B13 ストレブト： カス プリヌス/ d 107 +++ +
B13 ストレプトコッカスづプリヌス/ d 106 ++ +
B13 ストレアト： カス プリヌス /d 105 + -
B13 ストレブト： bカス プリヌス/ d 104 一 _
6715 ストレプトコ 7カス プリヌス/ g 109 +++ +++
6715 ストレブトコッカスづプリヌス/ g 108 +++ ++
6715 ストレプトコ' 7カス プリヌス/ g 107 +++ +
6715 ストレブトコプカス プリヌス/ g 106 ++ +
6715 ストレプト カス プリヌス/ g 105 + -
6715 ストレアトコッカスづプリヌス/ g 104 一 -
Ingbritt ストレアトコツカス'ミュ-タンス /c 109 ― +++
Ingbritt ストレアトコッカス *ミュ -タンス /c 108 - ++
Ingbritt ストレアトコッカス'ミュ-タンス /c 107 一 +
Ingbritt ストレアトコッカス'ミュ-タンス 106 一 +
Ingbritt ストレアト： カス'ミュ-タンス /c 105 一 -
P4 ストレアト: カス'ミュ-タンス /e 109 一 +++
P4 ストレアトコ7カス'ミュ-タンス /e 108 - ++
P4 ストレブトコッカス'ミュ-タンス /e 107 一 +
P4 ストレプトコ7カス♦ミュ-タンス /e 106 - +
P4 ストレズトコ'/カス'ミュ-タンス /e 105 一 一
OMZ175 ストレプトコツカス *ミュ -タンス /f 109 一 +++
0MZ175 ストレプトコツカス'ミュ-タンス /f 108 一 ++
OMZ175 ストレブトコツカス'ミュ-タンス /f 107 一 +
OMZ175 ストレブトコッカス'ミュ-タンス /f 106 一 一
OMZ175 ストレプト^カス'ミュ-夕ンス /f 10s 一
ATCC10556 ストレブトコ 7カス'サンギス 109
画 4252 ストレブトコツカス ·サリバリウス - 109
ATCC49456 ストレプト 3ッカス'ミテイス 109
ATCC35037 ストレフ 'トコ-;/カス'オラリス 109
Charis ストレブト カス'ゴル - 109 表 1 7より、 被検体液中のストレプトコッカス ·ソブリヌス及びストレプトコッ カス · ミユータンスとストレプトコッカス ·ソブリヌスの総量の検出を亍つた際 に、 検出ライン 6の位置のストレプトコッカス ·ソブリヌス検出用スポットでは、 1 x 1 05個/ m 1から 1 X 1 09個/ m 1の範囲において被検体液中のストレブ トコッカス ·ソブリヌスが特異的に検出されることが分かる。 また、 ストレプト コッカス · ミュータンスとストレプトコッカス ·ソブリヌスの総量検出用スポッ トでは、 l x l 07個/ m 1或いは 1 X 1 06個 Zm 1から 1 x 1 09個 Zm lの ストレプトコッカス · ミュータンス或いはストレプトコッカス ·ソブリヌスを含 む被検体液において陽性反応が得られており、 l x l 09個 Zm 1の他の口腔内 レンサ球菌を含む被検体液が陰性であることから、被検体液中のストレプトコッ カス · ミュータンス及びストレプトコッカス 'ソブリヌスが特異的に検出される ことが分かる。
実施例 6 免疫クロマト法ストリップによる歯垢を含む被検体液中のストレブ トコッカス ·ソブリヌス量及びストレプトコッカス · ミュータンスとストレプト コッカス ·ソブリヌス総量の同時測定
実施例 2と同じ 1 4検体の被検体液 2 0 0 1について、 実施例 5の （2) と 同様の方法で作製した免疫クロマト法ストリップを用いストレプトコッカス ·ソ ブリヌス量及びストレプトコッカス ' ミュータンスとストレプトコッカス ·ソブ リヌス総量の同時測定を実施した。 免疫クロマト法ストリップに於ける 1 0分後 のスポット発色強度を 4段階 （+ + +：強い陽性、 + +：陽性、 +：弱い陽性、 一：陰性） に識別した結果と、培養法により得られたストレプトコッカス ·ソブ リヌス及ぴストレプトコッカス · ミュータンス菌数とを比較した。 結果を表 1 8 に示す。 表 18
Figure imgf000065_0001
表 18より、 ストレプトコッカス 'ソブリヌス検出用スポットでは、 培養法に より得られたストレプトコッカス · ミユータンスの濃度に関わらずストレプトコッ カス，ソブリヌスの濃度と相関したスポット発色強度が得られた。 また、 ストレ プトコッカス ' ミュータンスとストレプトコッカス 'ソブリヌス総量の検出用ス ポットでは、 該総量が 106個 Zml以上の場合に、 特異的な反応が検出された。 本発明の同時測定用免疫ク口マト法ストリップにより、 ストレプトコッカス ·ソ ブリヌス量及びストレプトコッカス . ミュータンスとストレプトコッカス ·ソブ リヌスの総量を 105個/ m 1以上の濃度で含む被検体液から、 105個/ m 1以 上のストレプトコッカス 'ソブリヌスをその濃度依存的に且つ特異的に、 ストレ プトコッカス · ミュータンスとストレプトコッカス ·ソブリヌスの総量が 1 06 個 Zm 1以上の塌合に特異的な反応を同時検出可能であつた。
産業上の利用可能性
本発明によれば、 ストレプトコッカス ' ミユータンスが混在する唾液又は歯垢 を含む被検体液から培養法等を介さずに直接高感度でストレプトコッカス ·ソブ リヌスを測定することが出来る。 特に免疫クロマト法、 ラテックス凝集法、 フロ 一スルー免疫測定法を用いた本発明の測定方法によれば、 歯科医院や家庭で迅速、 且つ簡便にストレプトコッカス 'ソブリヌスの測定を行うことが可能となる。 ま た、 ラテックス定量法、 E L I S A法を用いることで、 迅速に多くの被検体液か らストレプトコッカス ·ソブリヌスを測定することも可能となる。 更に本発明に よれば、 被検体液中のストレプトコッカス 'ソブリヌス量及びストレプトコッカ ス * ミュータンス量 （或いはストレプトコッカス ' ミュータンスとストレプトコッ カス ·ソブリヌスの総量） を同時に測定することが出来きる。 このように、 本発 明により、 新たな齲蝕危険度の診断システムを構築することも可能となる。
従って、 本発明は、 診断医療分野、 並びに該医療分野で用いる試薬及びデバィ スの製造業等において利用可能である。

Claims

請 求 の 範 囲
1. ストレプトコッカス ·ソブリヌス及びストレプトコッカス · ミュータンス を含むことが疑われる被検体液中のストレプトコッカス 'ソブリヌスの検出方法 であって、
(A) ストレプトコッカス 'ソブリヌスに対する結合能がストレプトコッカス · ミュ一タンスに対する結合能の 1 0 0倍以上である抗体を用意すること、
(B) 該抗体を被検体液と接触させて免疫複合体を形成すること、 並びに
(C) 該免疫複合体を測定すること、
を含んでなる方法。
2. ストレプトコッカス ·ソブリヌスに対する結合能がストレプトコッカス · ミュータンスに対する結合能の 1 0 0倍以上である抗体がポリクローナル抗体で ある請求項 1記載の方法。
3. ストレプトコッカス ·ソブリヌスに対する結合能が、 該細菌種の血清型 d 及び g株に対するものであり、 かっ血清型 d及び g株に対する結合能が相互に 2 倍以内である請求項 2記載の方法。
4. ストレプトコッカス ·ソブリヌス及びストレプトコッカス · ミユータンス を含むことが疑われる被検体液が、 1 05〜 1 07個/ m 1の濃度でストレプトコッ カス ·ソブリヌスを含んでなる請求項 1記載の方法。
5. 免疫複合体の測定が免疫クロマト法により実施される請求項 1〜4のいず れか一つに記載の方法。
6. 被験者における齲蝕の危険度の診断方法であって、
( a ) 被験者からの唾液及び/又は歯垢に由来する被検体液を調製すること、 ( b ) ストレプトコッカス ·ソブリヌスに対する結合能がストレプトコッカ ス · ミュ一タンスに対する結合能の 1 0 0倍以上である抗体を用意すること、
( c ) 段階 （a ) で調製した被検体液と段階 （b) で用意した抗体とを接触 させて免疫複合体を形成すること、 並びに
(d ) 該免疫複合体を測定し、 その多寡を齲蝕の危険度の存否の指標として 評価すること、
を含んでなる診断方法。
7. ストレプトコッカス ·ソブリヌスに対する結合能がストレプトコッカス · ミュータンスに対する結合能の 1 0 0倍以上である抗体がポリク口一ナル抗体で ある請求項 6記載の診断方法。
8. ストレプトコッカス ·ソブリヌスに対する結合能が、 該細菌種の血清型 d 及び g株に対するものであり、 かっ血清型 d及び g株に対する結合能が相互に 2 倍以内である請求項 7記載の診断方法。
9. 被検体液が、 1 05〜1 07個 /m lの濃度でストレプトコッカス 'ソブリ ヌスを含んでなる請求項 6記載の診断方法。
1 0. 段階 （c ) を該抗体 （S抗体） の他にストレプトコッカス · ミュータン スに対して特異的に結合する抗体 （M抗体） の共存下に実施するか、 或いは段階
( c ) に加え、 S抗体を M抗体に代えて実施すること以外は段階 （c ) と同様の 操作を実施し、 こうして形成される M抗体に由来する免疫複合体も測定し、 該複 合体の多寡も齲蝕の危険度の存否の指標として評価する請求項 6〜9のいずれか 一つに記載の診断方法。
1 1. M抗体に代えてストレプトコッカス · ミュ一タンス及びストレプトコッ カス 'ソブリヌスに対して特異的に結合する抗体 （M S抗体） を使用する請求項 1 0記載の診断方法。
1 2. 1種又は 2種以上の免疫複合体の測定が免疫クロマト法により実施され る請求項 6〜 1 1のいずれか一つに記載の診断方法。
1 3. 被検体液が未処理の唾液である請求項 6〜 1 2のいずれか一つに記載の 診断方法。
1 4. ストレプトコッカス *ソブリヌスに対する結合能がストレプトコッカス ミュータンスに対する結合能の 1 0 0倍以上である抗体、 さらに必要により、 ス トレプトコッカス · ミュータンスに対して特異的に結合する抗体、 又はストレブ トコッカス . ミュ一タンス及びストレプトコッカス ·ソブリヌスに対して特異的 に結合する抗体を含んでなる免疫学的測定用キット又は被験者における齲蝕の危 険度の診断用キット。
1 5. 被検体液を一時的に吸収しそして保持するためのサンプルパッ ド、 標識 抗体を一時的に保持するためのコンジユゲートパッド、 並びに検出用抗体が固定 化され、 前記サンプルパッドに一時的に吸収しそして保持された被検体液および 該被検体液に随伴して前記コンジユゲートパッドより流出した標識抗体が展開さ れる展開メンブレンがこの順番で接合された免疫クロマトストリップにおいて、 前記検出用抗体としてストレプトコッカス 'ソブリヌスに対する結合能がストレ プトコッカス · ミュータンスに対する結合能の 1 0 0倍以上である抗体を用いる ことを特徴とする免疫クロマトストリップ。
1 6. 展開メンブレンに固定化される検出用抗体として、 ストレプトコッカス ミュータンスに対して特異的に結合する抗体、 又はストレプトコッカス · ミュー タンス及びストレプトコッカス ·ソブリヌスに対して特異的に結合する抗体を併 用することを特徴とする請求項 1 5に記載の免疫クロマトスリップ。
1 7. ストレプトコッカス ·ソブリヌスに対する結合能がストレプトコッカス ミュータンスに対する結合能の 1 0 0倍以上でるポリクローナル抗体。
1 8. ストレプトコッカス ·ソブリヌスに対する結合能が該細菌種の血清型 d 及び g株に対するものであり、 かっ血清型 d及び g株に対する結合能が相互に 2 倍以内である請求項 1 7記載のポリクローナル抗体。
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