WO2001079478A1 - Facteurs participant a la degranulation des basophiles, adns codant ces facteurs, inhibiteurs de ces facteurs, et procedes de recherche systematique de ces inhibiteurs - Google Patents

Facteurs participant a la degranulation des basophiles, adns codant ces facteurs, inhibiteurs de ces facteurs, et procedes de recherche systematique de ces inhibiteurs Download PDF

Info

Publication number
WO2001079478A1
WO2001079478A1 PCT/JP2001/003268 JP0103268W WO0179478A1 WO 2001079478 A1 WO2001079478 A1 WO 2001079478A1 JP 0103268 W JP0103268 W JP 0103268W WO 0179478 A1 WO0179478 A1 WO 0179478A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
protein
dna
sequence
amino acid
degranulation
Prior art date
Application number
PCT/JP2001/003268
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Tsuyoshi Yamada
Motoharu Ido
Original Assignee
Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd. filed Critical Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority to EP01919971A priority Critical patent/EP1279729A4/en
Priority to US10/258,107 priority patent/US7108987B2/en
Publication of WO2001079478A1 publication Critical patent/WO2001079478A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D307/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom
    • C07D307/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings
    • C07D307/34—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D307/38—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with substituted hydrocarbon radicals attached to ring carbon atoms
    • C07D307/54—Radicals substituted by carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/16—Otologicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D277/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings
    • C07D277/02—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings not condensed with other rings
    • C07D277/20—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D277/32—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D277/38—Nitrogen atoms
    • C07D277/50—Nitrogen atoms bound to hetero atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D307/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom
    • C07D307/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings
    • C07D307/34—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D307/38—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with substituted hydrocarbon radicals attached to ring carbon atoms
    • C07D307/52—Radicals substituted by nitrogen atoms not forming part of a nitro radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D307/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom
    • C07D307/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings
    • C07D307/34—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D307/56—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D307/70—Nitro radicals
    • C07D307/71—Nitro radicals attached in position 5
    • C07D307/72—Nitro radicals attached in position 5 with hydrocarbon radicals, substituted by nitrogen-containing radicals, attached in position 2
    • C07D307/74—Nitro radicals attached in position 5 with hydrocarbon radicals, substituted by nitrogen-containing radicals, attached in position 2 by hydrazino or hydrazono or such substituted radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D307/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom
    • C07D307/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings
    • C07D307/34—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D307/56—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D307/70—Nitro radicals
    • C07D307/71—Nitro radicals attached in position 5
    • C07D307/72—Nitro radicals attached in position 5 with hydrocarbon radicals, substituted by nitrogen-containing radicals, attached in position 2
    • C07D307/74—Nitro radicals attached in position 5 with hydrocarbon radicals, substituted by nitrogen-containing radicals, attached in position 2 by hydrazino or hydrazono or such substituted radicals
    • C07D307/75—Nitro radicals attached in position 5 with hydrocarbon radicals, substituted by nitrogen-containing radicals, attached in position 2 by hydrazino or hydrazono or such substituted radicals having carboxylic acyl radicals or their thio or nitrogen analogues directly attached to the hydrazino or hydrazono radical, e.g. hydrazides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention provides a novel factor involved in mast cell degranulation reaction, a DNA encoding the same, an antibody against the factor, a method for measuring the factor in a sample using the antibody, and a screening method for an inhibitor against the factor.
  • the present invention relates to an Ining method and the inhibitor containing a compound obtained by the method as an active ingredient.
  • the present invention also relates to a therapeutic agent for diseases associated with degranulation in mast cells, particularly allergic diseases, comprising as an active ingredient an inhibitor against these novel factors involved in degranulation.
  • mast cells also called mast cells. Stimulation of IgE antibody binding to the IgE receptor triggered the release of chemical mediators such as histamine, serotonin, platelet activating factor (PAF), and heparin contained in granules in mast cells. Released outside the cell.
  • chemical mediators such as histamine, serotonin, platelet activating factor (PAF), and heparin contained in granules in mast cells. Released outside the cell.
  • Mast cells not only cause allergic symptoms due to various chemical mediators released by antigen stimulation, but also chronic allergic inflammation due to the release of cytokines produced secondarily in mast cells. Involvement (MK Church & JP Caulfield, Chapter 5, Section 5.12, Allergy, edited by ST Holgate et al., Gower Medical Publishin, London, UK, 1993).
  • anti-allergic agents drugs that suppress the action of chemical mediators released from mast cells, Or, it is an agent that suppresses mast cell degranulation.
  • corticosteroids which are typical antiallergic agents to suppress the action of chemical mediators, are effective, but have side effects due to long-term administration, development of non-steroidal antiallergic agents Is desired.
  • Non-steroidal anti-allergic agents such as anti-histamines, anti-leukotrienes, anti-PAFs, and anti-histamines that block the action of chemical mediators released from mast cells and basophils activated by IgE antibodies synthase inhibitor or unloading evening agonist like the combo xanthine a 2 is in commercial or development.
  • an object of the present invention is to provide a novel means for developing a drug capable of fundamentally suppressing the degranulation reaction in mast cells, and to suppress the degranulation reaction using the means. It is to provide a new antiallergic agent. Disclosure of the invention
  • the present inventors have established the following basic concept regarding the degranulation phenomenon of mast cells, which is a fundamental cause of the onset of unpleasant symptoms associated with allergic inflammation and the like.
  • the degranulation phenomenon is a reaction based on intracellular vesicle transport, and is provided by a specific factor which should be called a “vesicle transport controlling factor”.
  • an object of the present invention is more specifically to provide a vesicle transport control factor involved in degranulation of mast cells and a conjugating factor thereof, and a cell capable of interacting with each of these factors.
  • a method for screening for a substance that controls or inhibits the function of these factors by constructing a system or a cell-free Atsey system. You. It is a further object of the present invention to provide a therapeutic agent for an allergic disease associated with enhanced degranulation in mast cells using these methods.
  • the present inventors have focused on the Rab protein belonging to the G protein, which has a function related to the regulation of membrane transport in animal cells, as a factor controlling the degranulation reaction in mast cells based on the above concept.
  • G proteins also called GTP-binding proteins
  • G proteins are involved in the transport of intracellular substances to the membrane
  • G proteins are known to be involved in the process of translating and transmitting the information of ligands bound to receptors on the cell surface into cells.
  • the content of receptor information transmitted into cells via G proteins seems to depend on the type of G proteins involved in the transmission, particularly on the structure of the subunits (DA Kennerly & PA Duffy, ed.
  • Rab proteins Proteins belonging to the Rab family (sometimes simply called Rab proteins) have been used as proteins that regulate the transport of intracellular vesicles, which transport substances from one specific organelle to another. More than one type has been reported.
  • the Rab3A protein is involved in the transport of synaptic vesicles containing neurotransmitters (M. Matteoli et al., J. Cell Biol., 115, 3, 625-633, 1991), Rabll protein (0. Ullrich et al., J. Cell Biol. 135 Vol. 4, pp. 913-924 (1996) control endosome recycling and the Rab5 protein controls endocytosis (V. Rybin et al., Nature, 383 vol. 6597). Pp. 266-269, 1996).
  • Rab proteins are suggested to be involved in specific functions. Furthermore, these three types of Rab proteins are called rabphilin-3A (H. Shirataki et al., Mol. Cell Biol., Vol. 13, No. 4, pp. 2061-2068, 1993), rabphilin-11 (A. Ma thigh). oto et al., J. Biol. Chem., 274, 36, 25517-25524, 1999) or rabaptin 5 (V. Rybin et al. Nature, 383, 6597, 266-269, 1996) Has been reported to bind to Rab protein and to be involved in the expression of the activity of each Rab protein.
  • Incyte has developed Rab A, Rab B, Rab C, Rab D (International Patent Application Publication WO 98/18942), SRAB (International Patent Application Publication W0 98/42839), Hidden-1, RABP- 2 (International Patent Application Publication WO99 / 09182).
  • Axys Pharmaceuticals searched human EST database for EST clones having a homology with a known Rab gene, and determined the full length of those not reported as Rabs (International Patent Application Publication W0 No. 00/58464).
  • the G protein (particularly the Rab protein) or its gene, which is known to actually control the degranulation reaction in mast cells, is not yet known, and the existence of a coupling factor is not known at all. Did not.
  • the present inventors have prepared primers based on sequences characteristic of known Rab proteins in order to identify Rab proteins that actually control degranulation in mast cells, As a result of RT-PCR using RNA prepared from cultured mast cells derived from mouse bone marrow cells as type III, we successfully cloned cDNAs encoding two types of novel Rab proteins. Similarly, the corresponding human Rab protein gene was cloned from human cDNA using oligonucleotides corresponding to the partial nucleotide sequences of these mouse cDNAs as primers.
  • the present inventors have proposed a cDNA encoding a novel coupling factor interacting with these Rab proteins by a two-hybrid method using a yeast strain (Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 88, No. 21, pages 9578-9582, 1991). Furthermore, it was confirmed that recombinant Rab proteins obtained from cells transformed with expression vectors containing these cDNAs and their coupling factors each affect the degranulation reaction in mast cells. We demonstrated that these factors are regulators involved in the degranulation reaction.
  • the present inventors contacted a yeast strain into which a Rab protein gene and a gene for its coupling factor were introduced by a two-hybrid method with a candidate substance that inhibits the action of these degranulation regulators, By investigating the influence on the interaction, a method for screening the degranulation regulator inhibitor was established. In addition, a cell-free Atssey system was established which can screen for an interaction between the Rab protein and its coupling factor or a substance that inhibits the GTP binding ability of the Rab protein. Further, the inventors have demonstrated that a useful antiallergic agent can be created by these screening methods, and have completed the present invention.
  • amino acid sequence of (a) above one or several amino acids are composed of an amino acid sequence in which substitution, deletion, insertion, addition, or That can control degranulation in mast cells by interacting with conjugate factors
  • one or several amino acids consist of a substituted, deleted, inserted, added or modified T-amino acid sequence, and can be used alone or with one or more conjugating factors. Protein that can control degranulation in mast cells by its action
  • Interaction with protein [1] can regulate degranulation in mast cells (c) a protein fragment which is a fragment of the protein of the above (a) and which can control the degranulation reaction in mast cells alone or by interaction with the protein of the above [1].
  • [1] A method for producing a protein according to the above [16], wherein the protein according to any one of the above [1] to [7] is collected from a culture obtained by culturing the transformant.
  • An expression vector comprising the DNA of the above-mentioned [8] (or [9]) in a form to be expressed as a fusion protein with a partial sequence of a protein that controls the expression of a repo overnight gene in a host cell. And above [10 :! (12) (or [13]) in a form expressed as a fusion protein with another partial sequence of the protein (provided that the two partial sequences are Only when the fusion protein interacts, restores the function of controlling the expression of the repo allele) to the host cell.
  • a transformant obtained by the transfer method in particular, the two partial sequences are a DNA binding domain and an activation domain of a transcription factor.
  • a method for screening a substance capable of inhibiting a degranulation reaction in mast cells comprising performing the following steps in the presence and absence of a test substance.
  • R 1 is a hydrogen atom or a linear or branched alkyl group having 1 to 4 carbon atoms
  • X is a hydrogen atom, a linear or branched alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, a hydroxy group, Represents a phenyl group.
  • R 2 represents a hydrogen atom or a nitro group
  • Y represents a halogen atom, a linear or branched alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, or a hydroxy group.
  • a therapeutic agent for an allergic disease associated with enhanced degranulation in mast cells comprising the inhibitor of the above-mentioned [25] as an active ingredient.
  • the present invention provides two novel Rab proteins capable of controlling the degranulation reaction in mast cells.
  • Each of these Rab proteins can interact with specific coupling factors described below to control degranulation in mast cells.
  • exogenous Rab proteins alone can suppressively regulate degranulation in mast cells.
  • the first Rab protein of the present invention is preferably a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in Sequence Listing, but is isolated from mast cells by an interaction alone or with one or more conjugating factors. As long as the granule reaction can be controlled, one or more amino acids in the amino acid sequence are substituted, deleted, inserted, added or modified, or a protein comprising the amino acid sequence. It may be a fragment.
  • the second Rab protein of the present invention is preferably a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 in the Sequence Listing, but may be used alone or by interaction with one or more conjugating factors. As long as the degranulation reaction can be controlled, the amino acid sequence has one or several amino acids substituted, deleted, inserted, added or modified in the amino acid sequence, or a protein comprising the amino acid sequence. May be a fragment.
  • Proteins are usually folded compactly, and the partial amino acid sequence in the protein often plays an important role in binding proteins. Also in the present invention, SEQ ID NO: 1 or 4 as long as it has an activity of binding to a conjugating factor, that is, as long as it can control the degranulation reaction in mast cells by interacting with one or more than one conjugating factor It is not necessary to include the entire amino acid sequence shown in the above, and a fragment of the protein may be used.
  • the Rab protein fragment of the present invention that is, a fragment having a binding activity to a conjugating factor is, for example, a peptide of Rab protein degraded by endopeptidase. It can be obtained by purifying the fragment and examining the inhibitory effect on the binding between the Rab protein and the coupling factor.
  • the mutation-introduced site A fragment having binding activity to a conjugating factor can be obtained from a fragment containing a substituted amino acid residue, a deleted amino acid (sequence), an amino acid sequence destroyed by insertion, and the like.
  • proteins are considered to have a hydrophilic region exposed on the molecular surface.
  • D. Eisenberg et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 81, pp. 140-144) 1984
  • it is possible to obtain a fragment having the binding activity by deducing the hydrophilic and hydrophobic regions from the amino acid sequence.
  • Rab proteins of the present invention therefore its origin is not particularly limited c as long as it has the above characteristics, other of the biological origin that naturally occurring mutants of natural or artificial, or heterologous (i.e., foreign) Rab protein All those derived from a transformant obtained by introducing a gene encoding the gene into a host are also included.
  • Preferable examples include Rab proteins derived from mammals such as humans, sea lions, bushes, pomas, monkeys, sheep, goats, dogs, cats, rabbits, mice, rats, and guinea pigs. Particularly preferred are those derived from humans or mice.
  • the amino acids represented by amino acid numbers 45, 115, 138, 165, and 167 in SEQ ID NO: 1 are Val, Met, respectively. , Leu, His and Ala
  • the amino acid number 45, 115, 1338 in SEQ ID NO: 1 , 165 and 167 include, but are not limited to, those having the sequences Ala, Val Met, Arg and Pro, respectively.
  • amino acids represented by amino acid numbers 113, 185, 192, 200 and 203 in SEQ ID NO: 4 are represented by Ser.
  • the amino acid numbers 113, 185, 1 in SEQ ID NO: 4 92 but not limited to those having a sequence in which the amino acids indicated by 200, 200 and 203 are Thr, Leu, ies Pro. And Val, respectively.
  • the Rab protein of the present invention may have a sugar chain added thereto.
  • a sugar chain may be added (Z. Khalkhall & RD Marshall, Biochem. J., Vol. 146, pp. 299-307, 1975).
  • the Rab protein of the present invention may have a different molecular weight depending on its amino acid composition or glycosylation, but preferably, the first Rab protein is about 21 1 as a nonglycosylated polypeptide chain. 5 kDa, the second Rab protein having a molecular weight of about 23.8 kDa (each theoretical value).
  • the Rab protein of the present invention can be expressed by (1) a method of extracting and purifying the protein or tissue using the raw material as a raw material, (2) a chemical synthesis method, or (3) a gene recombination technique. It can be obtained by appropriately using a method of purifying from cells that have been manipulated to perform the above.
  • Mast cells are cells in tissues corresponding to basophils in the blood, and are present around blood vessels of all tissues in the body, but are particularly widely distributed just below the epidermis, in the respiratory tract, and in the digestive tract mucosa. Mast cells that play a major role in inducing allergic reactions are mucosal mast cells.
  • a method for differentiating mast cells from mouse bone marrow cells has been reported (T. Nakano et al., J. Exp. Med. ⁇ 162, 1025-1043, 1987), and a large amount of mucosal mast cells can be prepared. The method has been established.
  • Cultured mast cells differentiated from mammalian, for example, bone marrow cells of humans, mice, rats, etc., or hematopoietic stem cells derived from umbilical cord blood by the above-mentioned method are homogenized in an appropriate extraction buffer, and subjected to sonication and detergent.
  • a cell extract can be obtained by treatment or the like, and purified therefrom by appropriately combining separation techniques commonly used for separation and purification of proteins.
  • Such separation techniques include, for example, methods utilizing differences in solubility such as salting out and solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, non-denaturing polyacrylamide electrophoresis (PAGE), sodium dodecyl sulfate —Specific affinities such as methods utilizing molecular weight differences such as polyacrylamide electrophoresis (SDS-PAGE), methods using charge such as ion-exchange chromatography, hydroxyapatite chromatography, and affinity chromatography A method utilizing the difference in hydrophobicity such as reversed-phase high performance liquid chromatography, and a method utilizing the difference in isoelectric points such as isoelectric point electrophoresis.
  • the Rab protein is produced by chemical synthesis, for example, by synthesizing all or part of the sequence using a peptide synthesizer based on the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 4 in the Sequence Listing, and obtaining the resulting polypeptide. It can be carried out by regenerating under appropriate regenerating conditions.
  • the Rab protein of the present invention is preferably produced by cloning a DNA encoding the protein and isolating and purifying it from a culture of a transformant containing the expression vector carrying the DNA. can do.
  • Cloning of a gene is usually performed by the following method.
  • the protein is completely or partially purified from cells or tissues that produce the desired protein by the above-mentioned means, and the N-terminal amino acid sequence is determined by the Edman method.
  • the protein is partially degraded with a protease ⁇ chemical substance that cleaves the peptide in a sequence-specific manner.
  • the amino acid sequence of the obtained oligopeptide is determined by the Edman method.
  • An oligonucleotide having a base sequence corresponding to the determined partial amino acid sequence is synthesized, and this is used as a probe to produce the protein. From a cDNA or genomic DNA library prepared from cells or tissues, a DNA encoding the protein is cloned by a colony (or plaque) hybridization method.
  • cDNA encoding the protein is specifically determined by performing RT-PCR using the above oligonucleotide as a primer and using RNA prepared from cells or tissues producing the protein as type II. Can be amplified. When a partial sequence is obtained, a full-length cDNA can be cloned by performing colony (or plaque) hybridization in the same manner as described above using the amplified fragment as a probe.
  • a highly conserved sequence is found from a homologous comparison of a known gene group, and a probe based on the sequence is found.
  • an oligonucleotide used as a primer can be synthesized.
  • an antibody against the protein is prepared by using a whole or a part of the completely or partially purified protein as an antigen according to a conventional method, and the antibody is prepared from a cDNA or genomic DNA library prepared from a cell or tissue producing the protein.
  • the DNA encoding the protein can also be cloned by a screening method.
  • an EST clone which is a cDNA fragment encoding the desired Rab protein, is found by homology search with the nucleotide sequences of various Rab proteins derived from mammals such as humans, mice, and rats. be able to.
  • the RACE (Rapid Amplification of cDNA End) method (MA Frohman et al. Proc. Natl, acad. Sci. USA, 85, 8998-9002, 1988 ) Can be used. That is, EST clones corresponding to a part of the Rab protein gene are extracted as described above, and oligonucleotides homologous to the partial nucleotide sequences of the sense strand and antisense strand of the EST clone are deduced.
  • each oligonucleotide and an appropriate adapter primer are subjected to 5 'and 3' RACE reactions as a pair of PCR primers, and each amplified fragment is subjected to a method such as using restriction enzymes and ligase. By ligating, a full-length cDNA clone can be obtained.
  • the nucleotide sequence of DNA can be determined using a known sequence technique such as the Maxam-Gilbert method ⁇ the Didoxy-Minethion method.
  • the DNA encoding the first Rab protein of the present invention is preferably an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, wherein one or several amino acids are deleted, substituted, inserted, added or added to the amino acid sequence.
  • a modified amino acid sequence or a fragment of the amino acid sequence (provided that the protein comprising the mutated amino acid sequence or the fragment is degranulated in mast cells by interacting with one or more than one conjugating factor) which has a physiological activity capable of controlling the reaction).
  • the DNA encoding the first Rab protein of the present invention is a DNA comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 3 in the Sequence Listing, wherein one or several nucleotides are missing in the nucleotide sequence.
  • the DNA encoding the second Rab protein of the present invention preferably has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing, and one or several amino acids in the amino acid sequence are deleted, substituted, inserted, or added.
  • a modified amino acid sequence or a fragment of the amino acid sequence (provided that the protein comprising the mutated amino acid sequence or the fragment alone or interacts with one or more conjugating factors to remove the amino acid sequence in mast cells). Which has a physiological activity capable of controlling the granule reaction).
  • the DNA encoding the second Rab protein of the present invention is a DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5 or 6 in the sequence listing, wherein one or several nucleotides are missing in the nucleotide sequence.
  • DNA containing the lost, substituted, inserted or added nucleotide sequence, or a fragment of DNA consisting of the nucleotide sequence may be singly or one or more conjugated It has a biological activity that can interact with sexual factors to control the degranulation reaction in mast cells).
  • the DNA encoding the first Rab protein of the present invention can be obtained, for example, by the method of YAOvchinnikov et al. (Gene, Vol. 31, pp. 65-78, 1984) based on the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 3. Correspondingly, total synthesis can also be performed chemically.
  • the DNA encoding the second Rab protein of the present invention can also be chemically chemically synthesized based on the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 or 6.
  • the present invention also provides a coupling factor capable of interacting with the above two Rab proteins of the present invention to control the degranulation reaction in mast cells.
  • the first coupling factor capable of specifically interacting with the first Rab protein of the present invention is preferably a protein having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 in the Sequence Listing.
  • one or more amino acids in the amino acid sequence consist of an amino acid sequence with substitution, deletion, insertion, addition or modification, or It may be a fragment of a protein comprising an amino acid sequence.
  • the second conjugating factor capable of specifically interacting with the first Rab protein of the present invention is preferably a protein comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 in Sequence Listing, Alternatively, as long as the degranulation reaction in mast cells can be controlled by interaction with the Rab protein, one or more amino acids in the amino acid sequence are substituted, deleted, inserted, added or modified. Or a protein fragment comprising the amino acid sequence.
  • the third coupling factor capable of specifically interacting with the first Rab protein of the present invention is preferably a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11 in the Sequence Listing.
  • An amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted, added or modified, as long as the degranulation reaction in mast cells can be controlled by the interaction with It may be a protein fragment comprising the amino acid sequence.
  • the coupling factor capable of specifically interacting with the second Rab protein of the present invention is preferably a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13 in the Sequence Listing, but alone or interacting with the Rab protein. As long as the action can control the degranulation reaction in mast cells, one or more amino acids in the amino acid sequence are substituted, deleted, inserted, added or modified, or May be a fragment of the protein.
  • proteins are usually folded compactly, and the partial amino acid sequence in the protein often plays an important role in binding proteins.
  • SEQ ID NOs: 7, 9, 11, or 13 as long as they have an activity of binding to the Rab protein, that is, as long as they can control the degranulation reaction in mast cells alone or by interacting with the Rab protein. It is not necessary to include the entire amino acid sequence, and a fragment of the protein may be used.
  • the fragment of the coupling factor of the present invention can be obtained using the same strategy as described above for the method for obtaining the Rab protein fragment.
  • the origin of the coupling factor of the present invention is not particularly limited as long as it has the above characteristics. Therefore, in addition to naturally occurring biological sources, natural or artificial mutants, or heterologous (ie, exogenous) Rab proteins All those derived from a transformant obtained by introducing a gene encoding the gene into a host are also included. Preferable examples include mammalian-derived conjugation factors such as human, red sea lion, plum, poma, monkey, sheep, goat, dog, cat, rabbit, rabbit, mouse, rat, and guinea pig. Particularly preferred are those derived from humans or mice.
  • the coupling factor capable of specifically interacting with the first Rab protein of the present invention may have a different molecular weight due to a difference in its amino acid composition or glycosylation, but is preferably glycosylated.
  • the first conjugation factor is about 3.2 kDa
  • the second conjugation factor is about 1.9 kDa
  • the third conjugation factor is about 47.
  • Those having a molecular weight of D a are mentioned.
  • the conjugating factor capable of specifically interacting with the second Rab protein of the present invention may have a different molecular weight due to a difference in its amino acid composition or glycosylation. Polypeptide chains that do not have a molecular weight of about 28.5 kDa (theoretical).
  • the coupling factor capable of specifically interacting with the Rab protein of the present invention includes, as described in detail in the above Rab protein, (1) a method of extracting and purifying the tissue or cell producing the protein as a raw material, (2) Chemical synthesis or (3) Genetic recombination technology
  • the protein can be obtained by appropriately using a method of purifying from a cell that has been manipulated to express the protein.
  • the conjugating factor is obtained by cloning the cDNA encoding it by using a method called a two-hybrid system, utilizing the interaction property with the corresponding Rab protein, and obtaining the obtained cDNA. Culturing the transformed host cells in an expression vector containing the clone allows isolation and purification from the resulting culture.
  • the DNA encoding the corresponding Rab protein is transferred to a repo overnight gene (eg, a gene encoding B-galactosidase, ⁇ -glucuronidase, luciferase, etc.), kanamycin, or hygroglobin in a host cell.
  • a repo overnight gene eg, a gene encoding B-galactosidase, ⁇ -glucuronidase, luciferase, etc.
  • a tissue vector or a tissue or cell producing a conjugating factor for example, cultured mast cells differentiated from bone marrow cells of human, mouse, rat, etc. or cord blood-derived hematopoietic stem cells as described above.
  • a tissue vector or a tissue or cell producing a conjugating factor for example, cultured mast cells differentiated from bone marrow cells of human, mouse, rat, etc. or cord blood-derived hematopoietic stem cells as described above
  • An expression vector that is contained in a form expressed as white matter (however, the two partial sequences have a function of controlling the expression of the repo overnight gene only when the two obtained fusion proteins interact with each other.
  • the partial sequence of the expression control protein preferably includes a combination of a DNA binding domain and an activation domain of a transcription factor.
  • yeast when yeast is used as a host cell, the: DNA binding domain and activation domain of yeast-derived GAL4 protein can be used.
  • the interaction of the Rab protein region and the coupling factor region of the expressed fusion protein completes GAL4 activity. And binds to the upstream activating sequence (UAS) of the host yeast cell to express the repo overnight gene.
  • UAS upstream activating sequence
  • histidine synthase When histidine synthase is used as a reporter gene, for example, by culturing the yeast cells in a histidine-free medium, only clones carrying cDNA encoding one of the vector-containing conjugating factors can be obtained. One can form.
  • E. coli-derived LexA protein can be used as the DNA binding domain
  • E. coli acid blob domain B42 can be used as the activation domain.
  • a plasmid carrying DNA encoding a conjugative factor was prepared from the colonies obtained in this manner by a conventional method, and the nucleotide sequence of the incorporated cDNA was determined by the Max-Gilbert method or the dideoxy-initiation method. Can be determined using a known sequence technique.
  • the DNA encoding the first coupling factor capable of specifically interacting with the first Rab protein of the present invention is preferably an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 in the sequence listing, Alternatively, an amino acid sequence in which several amino acids have been deleted, substituted, inserted, added or modified, or a fragment of the amino acid sequence (provided that the protein comprising the altered amino acid sequence or the fragment alone or the Rab Which has a physiological activity capable of controlling degranulation in mast cells by interacting with proteins).
  • the DNA encoding the first conjugating factor capable of specifically interacting with the first Rab protein of the present invention is a DNA encoding the base sequence shown in SEQ ID NO: 8 DNA consisting of the base sequence represented by 18 to 104, DNA containing the base sequence in which one or several bases are deleted, substituted, inserted or added in the base sequence, or the base sequence (Provided that the protein encoded by the mutant base sequence or the fragment alone or interacts with the Rab protein has a physiological activity capable of controlling the degranulation reaction in mast cells) It is.
  • the DNA encoding the second coupling factor capable of specifically interacting with the first Rab protein of the present invention is preferably an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 in the sequence listing, An amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted, inserted, added or modified, or a fragment of the amino acid sequence (provided that the protein consisting of the variant amino acid sequence or the fragment can be used alone or as the Rab Which has a physiological activity capable of controlling degranulation in mast cells by interacting with proteins). More preferably, the DNA encoding the second coupling factor capable of specifically interacting with the first Rab protein of the present invention is a nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 10 in the Sequence Listing.
  • DNA consisting of the base sequence represented by base numbers 18 to 68, DNA containing the base sequence in which one or several bases are deleted, substituted, inserted or added in the base sequence, or the base sequence DNA fragment (provided that the protein encoded by the mutant base sequence or the fragment alone or has a biological activity capable of interacting with the Rab protein to control the degranulation reaction in mast cells) It is.
  • the DNA encoding the third coupling factor capable of specifically interacting with the first Rab protein of the present invention is preferably an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 in the Sequence Listing, or 1 or 2 in the amino acid sequence.
  • the DNA encoding the third coupling factor capable of specifically interacting with the first Rab protein of the present invention is a nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 12 in the Sequence Listing.
  • DNA consisting of the base sequence represented by base numbers 18 to 1334, DNA containing a base sequence in which one or several bases are deleted, substituted, inserted or added in the base sequence, or the base sequence
  • a DNA fragment consisting of the mutated nucleotide sequence or the fragment This protein has a biological activity that can control the decondylar reaction in mast cells by itself or interacting with the Rab protein).
  • the DNA encoding a coupling factor capable of specifically interacting with the second Rab protein of the present invention is preferably an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 in the Sequence Listing or one or several amino acid sequences in the amino acid sequence. Amino acid deleted, substituted, inserted, added or modified amino acid sequence, or a fragment of the amino acid sequence (provided that the mutated amino acid sequence or the protein consisting of the fragment interacts alone or with the Rab protein) And has a physiological activity capable of controlling the degranulation reaction in mast cells).
  • the DNA encoding the conjugating factor capable of specifically interacting with the second Rab protein of the present invention is a DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 14 in the Sequence Listing, Alternatively, a base sequence in which several bases are deleted, substituted, inserted or added, or a fragment of DNA comprising the base sequence (provided that the mutant base sequence or the protein encoded by the fragment is the single or the Hab protein). And has a biological activity that can control the degranulation reaction in mast cells).
  • the DNAs encoding the first to third coupling factors capable of specifically interacting with the first Rab protein of the present invention are based on the base sequences shown in SEQ ID NOS: 8, 10 and 12, respectively. Then, for example, it can be chemically synthesized according to the method of YAOvchinnikov et al. (Gene, Vol. 31, pp. 65-78, 1984).
  • the DNA encoding a coupling factor capable of specifically interacting with the second Rab protein of the present invention is also chemically and totally synthesized based on the base sequence shown in SEQ ID NO: 14. be able to.
  • the present invention also provides a recombinant vector comprising a DNA encoding the Rab protein of the present invention or a coupling factor capable of specifically interacting therewith.
  • the recombination vector of the present invention is not particularly limited as long as it can replicate and maintain or autonomously propagate in various prokaryotic or eukaryotic host cells, and includes plasmid vectors and virus vectors.
  • Said recombinant vector is simply a known recombinant vector available in the art.
  • the DNA can be prepared by ligating each of the above-mentioned DNAs to an appropriate cloning vector or expression vector using an appropriate restriction enzyme and ligase, or, if necessary, a linker or adapter DNA. Is in such a vector, as plasmid derived from E. coli, for example pBR322, pBR325, pUC18, pUC19 etc.
  • viruses include pacteriophages such as ⁇ phage, SV40, papovaviruses such as sipapi oral virus (BPV), retroviruses such as Moroni murine leukemia virus (MoMuLV), adenovirus (AdV), and adeno-associated virus ( Examples include animal and insect viruses such as AAV), puccinia virus, and baculovirus.
  • pacteriophages such as ⁇ phage, SV40
  • papovaviruses such as sipapi oral virus (BPV)
  • retroviruses such as Moroni murine leukemia virus (MoMuLV), adenovirus (AdV), and adeno-associated virus
  • Examples include animal and insect viruses such as AAV), puccinia virus, and baculovirus.
  • the present invention provides an expression vector in which a DNA encoding a Rab protein or its coupling factor is placed under the control of a functional promoter in a host cell of interest.
  • the vector to be used includes a promoter region which functions in various host cells of prokaryotic or eukaryotic cells and can regulate the transcription of a gene located downstream thereof (for example, t. If the host is Bacillus subtilis, such as rp promoter, lac promoter, lecA promoter, etc. SP01 promoter, SP02 promoter, penP promoter, etc.
  • the host is yeast, PH05 promoter
  • the host is a mammalian cell, such as ichikichi, PGK promoter, GAP promo, ADH promoter, etc.
  • virus promoters such as SV40-derived initial promoter, MoMuLV-derived long promoter, minal repeat, adenovirus-derived initial promoter, etc. Evening--) and a transcription termination signal of the gene, i.e., the evening / mine / night region, wherein the promoter / night region is at least one of
  • Li-I gene tetracycline, ampicillin, kanamycin, etc. (A gene that confers resistance to a drug, a gene that complements an auxotrophic mutation, etc.).
  • the DNA encoding the inserted Rab protein or co-factor does not contain an initiation codon and a termination codon
  • the initiation codon (ATG) and the termination codon (TAG, TGA, TAA) may be replaced by a promoter.
  • Bek-yu-ichi which is located downstream of the evening-one area and upstream of the evening-minute area, is preferably used.
  • the expression vector When a bacterium is used as a host cell, the expression vector generally needs to include a replicable unit capable of autonomous replication in the host cell in addition to the promoter region and the promoter region described above. Also, the Promo Overnight region includes the Opera Yuichi and Shine-Dalgarno (SD) sequences near the Promo Overnight region.
  • SD Shine-Dalgarno
  • the expression vector may be an enhancer sequence, a 5'- and 3'-untranslated region of Rab protein or its conjugating factor, a polyadenylation site, etc. It is preferable to further include
  • the present invention also provides a transformant obtained by transforming a host cell with the above-mentioned expression vector.
  • the host cell used in the present invention is not particularly limited as long as it is compatible with the above-mentioned expression vector and can be transformed, and natural cells or artificial cells commonly used in the technical field of the present invention are used.
  • Various cells such as established mutant cells or recombinant cells [eg, bacteria (Escherichia coli, Bacillus subtilis, lactic acid bacteria, etc.), yeasts (Saccharomyces, Pichia, Kleberomyces, etc.), animal cells (eg, mammals) Cells, especially human, monkey, mouse, rat, hamster and other cells, specifically, mouse-derived cells such as COP, L, C127, Sp2 / 0, NS-1, NIH3 T3, rat-derived cells, BHK : Cells derived from Hamus Yuichi such as CHO, cells derived from monkeys such as C0S1, COS3s COS7 CV1, Vero, and cells derived from humans such as cells derived from HeLa, diploid fibroblasts, myeloma cells, and Namalwa Cells) Other insect cells, etc.] are exemplified.
  • bacteria Esscherichia coli, Bacillus subtilis, lactic acid bacteria, etc.
  • yeasts
  • the expression vector can be introduced into a host cell using a conventionally known method.
  • C for bacteria, for example, the method of Cohen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)) The protoplast method (Mol. Gen. Genet., 168, 111 (1979)), the combined method (J. Mol. Biol., 56, 209 (1971)), and the like. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1927 (1978)), the lithium method (J.
  • the Rab protein or its coupling factor of the present invention is produced by culturing a transformant containing the expression vector prepared as described above in a medium and recovering the protein from the resulting culture. can do.
  • the medium used preferably contains a carbon source, an inorganic nitrogen source or an organic nitrogen source necessary for the growth of the host cell (transformant).
  • carbon sources include glucose, dextran, soluble starch, and sucrose
  • inorganic or organic nitrogen sources include ammonium salts, nitrates, amino acids, corn chips, liqueur, peptone, casein, and meat extract. , Soybean meal, potato extract, etc.
  • other nutrients eg, inorganic salts (eg, calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, magnesium chloride), vitamins, antibiotics (eg, tetracycline, neomycin, ampicillin, kanamycin, etc.) are contained. Is also good.
  • the culturing is performed by a method known in the art. Specific culture media and culturing conditions used according to the host cell are described below, but the culturing conditions in the present invention are not limited to these.
  • a liquid medium containing the above-mentioned nutrient source is suitable.
  • the medium has a pH of 5 to 8.
  • Host In the case of Escherichia coli, preferred mediums include LB medium and M9 medium (Miller. J., Exp. Mol. Genet., P. 431, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1972)).
  • the cultivation can be carried out usually at 14 to 43 ° C for about 3 to 24 hours with aeration and stirring as needed.
  • the reaction can be carried out usually at 30 to 40 ° C for about 16 to 96 hours with aeration and stirring as necessary.
  • the medium include Burkholder minimal medium (Bostian. KL et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4505 (1980)), where 11 is 5 to 8. Is desirable.
  • the cultivation is usually performed at about 20 to 35 ° C for about 14 to 144 hours, and if necessary, aeration and stirring can be performed.
  • the minimum essential medium containing about 5 to 20% of fetal bovine serum (Science, 122, 501 (1952)), Dulbecco's modified minimum essential medium (DMEM) (Virology, 8, 396 (1959)), RPMI 1640 medium (J. Am. Med. Assoc., 199, 519 (1967)), 199 medium (Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 73, 1) (1950))
  • MEM minimum essential medium
  • DMEM Dulbecco's modified minimum essential medium
  • RPMI 1640 medium J. Am. Med. Assoc., 199, 519 (1967)
  • 199 medium Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 73, 1 (1950)
  • the pH of the medium is preferably about 6 to 8, and the culture is usually carried out at about 30 to 40 ° C for about 15 to 72 hours, and if necessary, aeration and stirring may be performed.
  • the medium may be, for example, Grace's medium (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 8404 (1985)) containing fetal bovine serum, and its pH is about 5 to 8 It is preferred that The cultivation is usually performed at about 20 to 40 ° C for 15 to 100 hours, and if necessary, aeration and stirring can be performed.
  • Rab protein or its conjugation factor involves harvesting the cells by centrifuging or filtering the culture and suspending the cells in a suitable buffer, e.g., sonication, lysozyme treatment, freeze-thaw, osmotic shock, and / or Alternatively, cells and organelle membranes are disrupted (dissolved) by treatment with a surfactant such as Triton-XI00, and then debris is removed by centrifugation or filtration to obtain a soluble fraction. It can be isolated and purified by treating in the same manner as described above.
  • a surfactant such as Triton-XI00
  • an amino acid sequence capable of adsorbing to a metal ion chelate is provided at a certain position (preferably, C-terminal) of the protein coding sequence.
  • a DNA sequence encoding a basic amino acid sequence is added by genetic manipulation and expressed in a host cell, and the metal ion chelate is immobilized from a culture of the cell.
  • a preferred example is a method of separating and recovering a desired recombinant protein by affinity with a carrier obtained.
  • a DNA sequence encoding an amino acid sequence that can be adsorbed to a metal ion chelate is, for example, converted into a nucleotide sequence encoding the C-terminal amino acid sequence of the protein during the process of cloning the DNA encoding the protein.
  • PCR amplification is carried out using a hybridized primer to which the DNA sequence is linked, or the DNA encoding the desired protein is read in frame with the expression vector containing the DNA sequence before the stop codon (see FIG. That is, it can be introduced into the protein coding sequence by in-frame insertion.
  • the metal ion chelate adsorbent used for the purification may be a transition metal, for example, a divalent ion of cobalt, copper, nickel, or iron, or a trivalent ion of iron or aluminum, preferably cobalt or nickel.
  • a solution containing divalent ions is brought into contact with a matrix, to which a ligand, for example, an iminodiacetic acid (IDA) group, a tri-triacetate (NTA) group, a tris (carboxymethyl) ethylenediamine (TED) group, is attached, and binds to the ligand. It is prepared by allowing
  • the matrix portion of the chelate adsorbent is not particularly limited as long as it is a usual insoluble carrier.
  • the DNA encoding the Rab protein or its coupling factor is prepared so as to be expressed as a fusion protein with a known protein that can be purified by utilizing specific affinity with a known affinity column.
  • a known protein that can be purified by utilizing specific affinity with a known affinity column.
  • a recombinant protein can be obtained quickly and easily.
  • a method of expressing the protein of the present invention as a fusion protein with transferase (GST) and subjecting it to affinity chromatography using a glucanthione-matrix adsorbent for example, glucanthione-cephalo-scalar
  • GST transferase
  • a glucanthione-matrix adsorbent for example, glucanthione-cephalo-scalar
  • the present invention also provides an antibody having specific affinity for the Rab protein of the present invention or a conjugating factor thereof.
  • the antibody may be either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, and can be prepared by a well-known immunological technique.
  • a polyclonal antibody is a complex cross-linked to a carrier protein such as Rab protein or its conjugating factor, or a fragment thereof (if necessary, serum serum albumin, KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin)).
  • a carrier protein such as Rab protein or its conjugating factor, or a fragment thereof (if necessary, serum serum albumin, KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin)).
  • a commercially available adjuvant for example, complete or incomplete Freund's adjuvant
  • the antibody titer of the serum thus obtained is measured by a known antigen-antibody reaction, and the increase is confirmed beforehand.
  • Animals to which the antigen is administered include mammals such as rats, mice, rabbits, goats, guinea pigs, and Hamichi Yuichi.
  • Monoclonal antibodies can be obtained using the cell fusion method (for example, Takeshi Watanabe, Principle of Cell Fusion Method and Preparation of Monoclonal Antibodies, page 2-14, Monoclonal Antibodies and Cancer, Basic and Clinical, Akira Taniuchi, Toshitada Takahashi, eds. Sanence Forum Publishing, 1985).
  • the factor is subcutaneously or intraperitoneally administered to mice 2 to 4 times with a commercially available adjuvant, and 3 days after the final administration, the spleen or lymph node is collected, and leukocytes are collected.
  • the leukocytes and myeloma cells are fused to obtain a hybridoma producing a monoclonal antibody against the factor.
  • Cell fusion can be performed by the PEG method (RDLane, J. Immunol. Methods. 81: 2, 223-228, 1985), or by the voltage pulse method (U. Karsten et al., Hybridoma, 7 Vol. 6, pp. 627-633, 1988).
  • the hybridoma producing the desired monoclonal antibody can be selected by detecting an antibody that specifically binds to the antigen from the culture supernatant using the well-known EIA or RIA method or the like.
  • Monoclonal antibody-producing hybridomas can be cultured in vitro or in vivo, such as in mice or rats, and preferably in mouse ascites. Can be obtained from ascites.
  • the present invention also provides a method for measuring the Rab protein of the present invention or a conjugate factor thereof in a sample using the antibody obtained as described above, and a measuring reagent therefor.
  • the measurement method may use any known principle as long as it utilizes a specific antigen-antibody reaction with the antibody of the present invention.
  • the polyclonal antibody or monoclonal antibody obtained as described above is immobilized by a conventional method, and a sample is brought into contact with the immobilized antibody to form an antigen-antibody complex.
  • the antigen measurement reagent of the present invention is not particularly limited as long as it contains the antibody of the present invention against the antigen to be measured.
  • the Rab protein of the present invention and its conjugating factor have a physiological activity of interacting to control the degranulation reaction in mast cells.
  • both factors when both factors are exogenously supplied to mast cells, each of them can independently suppress the degranulation reaction.
  • the Rab protein is a GTP-binding protein, it is considered to have GTP / GDP binding ability and to exert its physiological activity by linking to its own GTPase activity conversion reaction.
  • a substance capable of inhibiting the expression of the Rab protein of the present invention and / or a conjugating factor thereof in mast cells (2) a substance capable of inhibiting the GTP binding ability of the Rab protein, (3) a GTP-bound Rab protein Substances that can inhibit GTPase activity of Rab and (4) substances that can inhibit the specific interaction (ie, binding) of Rab protein with its conjugating factor can result in degranulation in mast cells.
  • a substance capable of inhibiting the expression of the Rab protein of the present invention and / or a conjugating factor thereof in mast cells (2) a substance capable of inhibiting the GTP binding ability of the Rab protein, (3) a GTP-bound Rab protein Substances that can inhibit GTPase activity of Rab and (4) substances that can inhibit the specific interaction (ie, binding) of Rab protein with its conjugating factor can result in degranulation in mast cells.
  • it is useful as a therapeutic agent for various diseases associated with the degranulation reaction, in particular, allergic rhinitis, allergic conjunctivitis, allergic asthma,
  • Examples of the inhibitor of the above-mentioned (1) type include, for example, a nucleotide having a nucleotide sequence complementary to a part or all of mRNA encoding the Rab protein of the present invention or a conjugating factor thereof, that is, an antisense nucleotide, or a nucleotide thereof.
  • Examples include, but are not limited to, expression vectors genetically engineered to express such antisense RNA.
  • Examples of the above-mentioned (2) type inhibitor include, but are not limited to, exogenously supplied Rab protein of the present invention or an antibody having specific affinity for Rab protein. Known or new low molecular weight compounds may be used.
  • Examples of the inhibitor of the type (4) include the exogenously supplied Rab protein or the coupling factor of the present invention itself, or an antibody having a specific affinity for the Rab protein or the coupling factor.
  • the present invention is not limited thereto, and may be a known or novel low molecular weight compound.
  • the present invention also provides a method for screening a substance capable of inhibiting the interaction between the Rab protein of the present invention and its conjugating factor, that is, a substance of the above (4) type capable of inhibiting the degranulation reaction in mast cells. provide.
  • the screening method involves the use of a two-hybrid transformant prepared in one preferred embodiment for cloning cDNA encoding the coupling factor of the present invention. That is, the method comprises an expression vector comprising a DNA encoding the Rab protein of the present invention in a form expressed as a fusion protein with a partial sequence of a protein that controls the expression of a repo overnight gene in a host cell.
  • an expression vector containing the corresponding DNA encoding the coupling factor of the present invention in a form expressed as a fusion protein with another partial sequence of the protein (provided that the two partial sequences are , Got Only when the two fusion proteins interact with each other, the function of controlling the expression of the repo overnight gene is restored) into a host cell, and the transformant obtained in the presence of the test substance and Cultivating each in a medium in the absence of the cells and comparing the expression of the reporter gene in the cells.
  • the repo overnight gene, each partial sequence of the expression regulating protein, the host cell, and the like used are the same as described above.
  • test substance has the activity of inhibiting the interaction between the Rab protein and its conjugating factor
  • expression of the reporter gene is significantly inhibited in the presence of the test substance as compared to the absence thereof.
  • histidine synthase is used as the repo overnight gene
  • a substance that inhibits the interaction between the Rab protein and its coupling factor significantly inhibits the growth of the transformant in a histidine-free medium.
  • the present invention also provides a substance that can inhibit the interaction between the Rab protein of the present invention and its conjugating factor, that is, a substance that can inhibit the degranulation reaction in mast cells, obtained by the above screening method.
  • a substance that can inhibit the interaction between the Rab protein of the present invention and its conjugating factor that is, a substance that can inhibit the degranulation reaction in mast cells, obtained by the above screening method.
  • An example of such an inhibitor is a compound represented by the general formula represented by the formula [I] or the formula [II].
  • R 1 is a hydrogen atom or a linear or branched alkyl group having 1 to 4 carbon atoms
  • X is a hydrogen atom, a linear or branched alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, a hydroxy group, Represents a phenyl group.
  • R 2 represents a hydrogen atom or a nitro group
  • Y represents a halogen atom, a linear or branched alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, or a hydroxy group.
  • the substance capable of inhibiting the interaction between the Rab protein of the present invention and its conjugating factor is acetone-4- (4-phenyl) phenyl-1,3-thiazolyl-2-yl-hydrazone.
  • the present invention also provides an antiallergic agent comprising the compound as an active ingredient.
  • the anti-allergic agent of the present invention can be obtained by converting the inhibitory substance obtained by the above-mentioned screening method into a solution such as a tablet, a capsule or the like orally or with a pharmaceutically acceptable liquid, or a suspension. It can be administered parenterally in the form of injections, inhalants, eye drops or liniments.
  • a formulation for oral administration can be prepared by mixing the compound with a pharmaceutically acceptable carrier, flavor, excipient, stabilizer and the like. This The preparation obtained as described above can be administered to mammals including humans, for example.
  • the dosage varies depending on the patient's body weight, age, drug receptivity, and the type and progress of the disease. For example, in the case of oral administration, the dosage is about 0.01 to 100 mg / day, preferably about 0.1 to 50 mg / day for an adult.
  • the present invention also provides a method for screening a substance capable of inhibiting the GTP binding ability of the Rab protein of the present invention, that is, a substance of the above-mentioned type (2) capable of inhibiting the degranulation reaction in mast cells. .
  • the specific embodiment of the method is not particularly limited as long as it is characterized by binding GTP to the Rab protein in the presence and absence of a test substance.
  • a test substance is added to a reaction system in which the GTP binds to the Rab protein, and a decrease in the amount of the label bound to the Rab protein is examined.
  • the present invention also relates to a substance capable of inhibiting the GTP-binding ability of the Rab protein of the present invention and the interaction between the Rab protein and the Rab protein and its conjugating factor, that is, capable of inhibiting the degranulation reaction in mast cells.
  • a method for screening a substance of the above (2) or (4) type is provided.
  • the method involves the following steps in the presence and absence of the test substance:
  • the specific mode is not particularly limited as long as it is characterized by performing the following.
  • the conjugating factor is immobilized using a well-known method (eg, specific binding of piotin-avidin, etc.), and the corresponding Rab protein is contacted with labeled GTP to form a complex.
  • the test substance is added to the reaction system in which the complex is made of the GTP-Rab protein-immobilized conjugating factor by contacting C
  • the present invention also provides a GTP-binding ability of the Rab protein of the present invention and / or an interaction between the Rab protein and a conjugating factor obtained by the above-described screening method.
  • the present invention also provides an antiallergic agent comprising the compound as an active ingredient.
  • the antiallergic agent of the present invention containing an inhibitor obtained by the screening method using the cell-free system as an active ingredient is the same as the antiallergic agent obtained by the screening method using a two-hybrid system. And can be administered to mammals including humans by the same method.
  • Mast cells derived from mouse bone marrow were prepared according to the method reported by T. Nakano et al. (J. Exp. Med. 162, 1025-1043, 1987). Bone marrow cells are collected from the femur of a BALB / c mouse, and a certain number of cells are cultured in a culture dish using RPMI culture containing 10% fetal calf serum (referred to as 10% FBS-RPM). The WEHI-3 cell culture supernatant was added at a concentration of 10 to 20%, and the cells were cultured at 37 ° C. in air containing 5% carbon dioxide.
  • BMMC mouse bone marrow
  • RNA preparation reagent IS0GEN manufactured by Futtsubon Gene Co., Ltd.
  • CDNA was prepared from the total RNA prepared in (1) using a cDNA synthesis reagent kit (Pharmacia Biotech). The cDNA was used as type I DNA, and the target gene was amplified and isolated by PCR using the following two types of DNA as primers.
  • the PCR method was performed under the following reaction conditions using a reagent attached to Takara Taq (manufactured by TAKARA) and GeneAmp PCR system 9600 (manufactured by Perkin Elmer).
  • the RT-PCR product obtained in (2) was subjected to 2% agarose electrophoresis, and a DNA fragment of about 15 Ob p was recovered using GeneElute AGAROSE SPIN COLUMN (Pharmacia Biotech). This DNA fragment was subjected to TA cloning of plasmid vector pT7BlueT (manufactured by Fiovagen) using a DNA ligation kit (manufactured by TAKARA). Inserted and incorporated into the site.
  • Plasmid DNAs of about 50 clones were prepared using the QIAGEN plasmid kit (manufactured by QIAGEN) out of the several hundred clones selected above.
  • the obtained plasmid DNA was used as type III, and the sequence reaction using ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit (Perkin Elmer) using M13 primer M4 and RV (manufactured by TAKARA) as primers was performed according to the package insert.
  • GeneAmp PCR system 9600 Perkin Elmer
  • the reaction product was analyzed with ABI PRISM 377 DNA sequencer (Perkin Elmer).
  • RNAs derived from each organ were prepared using IS0GEN (Futsubane Gene). The obtained total RNA was subjected to agarose gel electrophoresis according to a conventional method (Literature: Current Protocols in Molecular biology, Vol. 1, 2.5, edited by FM Ausubel et al., Edited by Wiley Interscience), and applied to a nylon membrane (BioRad). Transferred. mG # A-DNA, mG # B-DNA, and a partial gene sequence of about 150 bp of rab5C were labeled with 32 P using a BcaBEST Labeling kit (TAKARA) and used as a probe.
  • TAKARA BcaBEST Labeling kit
  • RNAs from each organ fixed on a nylon membrane and 32 P-labeled probe were lmM EDTA, 7% 303 and 0.05mg / ml Salmon sperm DNA Hybridized at 65 ° C in phosphate buffer (pH 7.2) containing 65 ° C, 1 mM EDTA and 5% After washing twice with 4 OmM phosphate buffer (pH 7.2) containing SDS at 65 ° C, and further: 65 mM in 4 OmM phosphate buffer pH 7.2 containing L mM EDTA and 1% SDS After washing twice at ° C, it was dried. It was detected by RNA 32 P-labeled probe bound to the directly imaging X glands film 10 days (Fuji Fi Lum Company) O one Toraji O photography one on film.
  • MRNA was prepared from mouse B MMC using an mRNA preparation reagent kit (QuickPrep RNA Purification kit; manufactured by Pharmacia Biotech). From this mRNA, cDNA to which an EcoRI adapter was added was synthesized using a cDNA synthesis reagent kit (TimeSaver cDNA Synthesis kit: manufactured by Pharmacia Biotech). This cDNA was inserted into the EcoRI site of lambda phage vector-1 Xgtll using a DNA ligation kit (TAKARA). Using the in vitro packaging kit (GIGAPACK II; manufactured by STRATAGENE), the cDNA incorporated in the kit was converted into phage particles to prepare a mast cell-derived lambda phage library.
  • GAPACK II in vitro packaging kit
  • mG # A- DNA and And the full-length DNAs corresponding to mG # B-DNA were named mG # 101-DNA (SEQ ID NO: 2) and mG # 102-DNA (SEQ ID NO: 5), respectively.
  • SEQ ID NO: 2 Cloning of human-derived Rab protein cDNA
  • a mouse B MMC cDNA library for Two-Hybrid System was prepared by ligating the cDNA with EcoM adapter prepared from mouse BMMC in the same manner as in Example 1 to PACT2.
  • Saccharomyces' Celevische CG1945 a yeast strain for the Two-Hybrid System, was simultaneously transformed with a plasmid for plasmid expression and a plasmid library, and grown on a histidine-deficient medium in an mG # 101 or mG # 102-dependent manner. Possible transformants were isolated.
  • MA # 1014 SEQ ID NO: 8
  • mA # 1015 SEQ ID NO: 10
  • mA # 1016 SEQ ID NO: 12
  • mA inserted into pACT2 vector by recovering plasmid from isolated transformants
  • the cDNA of # 10283 (SEQ ID NO: 14) was obtained.
  • the gene sequence of the obtained clone was determined in the same manner as in Example 1.
  • Example 4 Preparation of recombinant mouse) protein
  • Plasmid vector of GST Gene Fusion System (Pharmacia Biotech) Incorporate the cDNA of mG # 101 or mG # 102 cut out with EcoRI from the byte expression plasmid prepared in Example 3 into the EcoRI site of PGEX4T1 As a result, a plasmid expressing a fusion protein with GST was obtained.
  • Escherichia coli JM109 strain was transformed with the expression plasmid to obtain recombinant Escherichia coli.
  • the obtained recombinant Escherichia coli was cultured in 2YT medium (1 Og / L yeast extract, 16 g / L tryptone, 5 g / L NaC1), and recombined with 0.1 mM I PTG in the late logarithmic growth phase. Protein expression was induced. After induction of expression, culturing was continued for 4 hours to accumulate the recombinant protein in the cells, and the recombinant Escherichia coli was collected by centrifugation.
  • the harvested recombinant Escherichia coli was suspended in phosphate buffered saline (PBS), and the suspension was crushed by an ultrasonic crusher (manufactured by TOMY). This crushed solution was separated into a soluble supernatant and an insoluble precipitate by centrifugation, and the supernatant was suspended in glutathione sepharose of GST Gene Fusion System (Pharmacia Biotech) and allowed to stand. Gluythione sepharose was recovered from the suspension by centrifugation and washed with PBS.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the washed glutathione sepharose is suspended in a thrombin solution (recognizing and cleaving the specific amino acid sequence introduced into the fusion site of Rab protein and GST), and left as a GST fusion protein.
  • the Rab protein of interest bound to the was excised from the GST portion and released from glutathione sepharose.
  • the glutathione sepharose and the target Rab protein solution were separated by centrifugation, and the target Rab protein solution was further passed through a heparin column to remove thrombin.
  • MG # 101 protein (SEQ ID NO: 1; however, amino acids 45, 115, and 138 , 165 and 167 are Ala, Val, Met, Arg and Pro, respectively, and mG # 102 protein (SEQ ID NO: 4; The amino acids 185, 192, 200 and 203 are Thr, Leu, Ile, Pro and Val, respectively.
  • Example 5 Characterization of recombinant Rab protein
  • This example was performed basically according to the method of Kaibuchi et al. (Methods in Enzymology, Vol. 257, pp. 67-68, 1995). That is, mG # 101 or mG # 102 recombinant protein and GTP [ ⁇ 35 S] were mixed in the presence or absence of unlabeled GTP and allowed to stand for 2 hours. This mixed solution was separated by dot plotting on a nitrocell orifice membrane using a dot plotter (manufactured by BioRad). The membrane was measured using a Matrix96 (manufactured by Packard) on a overnight line counter to confirm that the mG # 101 or mG # 102 recombinant protein specifically binds to GTP.
  • BMMC was washed twice with a buffer having the following composition to make a suspension of 2 ⁇ 10 6 cells / ml, and dispensed into a 96-well U-bottom plate in 0.05 ml Zells. Next, mG # 101 or mG # 102 recombinant protein (0.05 ml / well) was added. In addition, 4.5 ⁇ digitonin was added at 0.05 ml / well and left at room temperature for 5 minutes. Thereafter, 4 mM CaCl 2 was added in 0.05 ml / well and left at room temperature for 10 minutes. After standing, the concentration of histamine released in the supernatant was measured using a histamine RIA kit (Eiken).
  • the cDNA of mA # 10283 on the pACT2 vector obtained in Example 3 was cut out with EcoRI and inserted into the EcoRI site of the plasmid vector PGEX4T1 of the GST Gene Fusion System (manufactured by Pharmacia Biotech). 10283 fusion protein expression vectors were obtained.
  • the expression vector was transformed into E. coli JM109 to obtain a recombinant E. coli.
  • the obtained recombinant Escherichia coli was cultured in a 2YT medium, and expression of the recombinant protein was induced with IPTG in the late logarithmic growth phase. After induction of expression, culture was continued, and Escherichia coli having the recombinant protein accumulated in the cells was collected by centrifugation.
  • the harvested recombinant Escherichia coli was suspended in PBS, and the suspension was subjected to an ultrasonic disrupter to disrupt the recombinant Escherichia coli.
  • This crushed liquid was separated into a soluble supernatant and an insoluble precipitate by centrifugation, and the supernatant was left suspended in glutathione sepharose.
  • the glutathione sepharose was recovered from the suspension by centrifugation and washed with PBS.
  • the washed glutathione sepharose was suspended in a reduced glutathione solution to elute the fusion protein of GST and mA # 10283 (SEQ ID NO: 13) bound to the glutathione sepharose.
  • the eluate was dialyzed to remove glutathione from the target protein.
  • Example 7 System for measuring the effect of a test substance on the interaction between mG # 102 and mA # 10283 (I)
  • Recombinant yeast strain # 102 obtained by introducing two expression vectors in which mG # 102 was added to PAS2-1 vector and mA # 10283 was added to pACT2 vector into S. cerevisiae strain CG1945 (Example 3 As a control, a recombinant yeast VT strain into which a plasmid (pVA3-1, pTD1-1) for positive control of the MATCHMAKER Two-Hybrid System 2 was introduced was prepared as a control. The culture solution of # 102 and VT strains that reached saturation after overnight shaking culture at 30 ° C in histidine-added SD medium was treated with a new histidine-deficient SD medium (containing ImM3-AT).
  • the mixture was diluted 200-fold and dispensed into a 96-well plate in an amount of 0.09 ml.
  • the PBS solution of the compound whose effect is to be examined in each well, the PBS for the 100% control well, and the PBS solution containing 1 M 3-AT in the 0% control well, 0,01 ml / well The mixture was added in a volume and mixed with a premixer and a MicroMixer E-36 (TAITEC).
  • TITEC MicroMixer E-36
  • the culture solution was suspended in a plate shaker, and turbidity was measured using a 96-well plate absorbance meter, Multiskan BICHROMATIC (Labsystems). (Absorbance at 590 nm) was measured.
  • the measured turbidity was evaluated by converting it to a% control based on the turbidity data of the 100% and 0% controls.
  • a common effect appeared between the # 102 strain and the VT strain, it was considered as a nonspecific effect on the two-hybrid system, not on the interaction between mG # 102 and mA # 10283.
  • each recombinant yeast strain is a histidine synthase inhibitor (3--) that grows in a histidine-deficient SD medium in a repo overnight (histidine synthase) -dependent manner.
  • the concentration of amino-1,2,4-triazole: 3-AT ranged from 1 to L OmM, and neither recombinant yeast strain was able to grow with 10 OmM 3-AT.
  • Example 8 System for measuring the effect of a test substance on the interaction between mG # 102 and mA # 10283 (II)
  • the N-terminus of the recombinant mA # 10283 protein prepared in Example 6 was biotinylated using the biotin labeling reagent EZ-Link-Sulfo-NHS-LC-Biotin (Pierce) according to the package insert of the reagent.
  • recombinant mG # 102 and GTP prepared in Example 4 [Y 35 S] were mixed so that it it 0. 02 mgZm 1 and 30 nM, recombinant mG # by standing for 2 hours 102 was activated and radiolabeled (RI).
  • RI radiolabeled
  • 0.1 ml of this RI-labeled mG # 102 protein, 0.1 ml of 0.02 mg / ml biotin-labeled mA # 10283 protein, and 0.02 ml of a buffer solution containing the compound whose effect is to be examined are mixed together. Left for hours.
  • the above mixed solution was transferred to a streptavidin-coated flash plate (manufactured by NEN) at 0.1 ml / ⁇ l and left for 1 hour. After standing, the mixed solution was removed from the flash plate, and each well was washed once with a washing buffer, and the radioactivity bound with a plate scintillation counter (TopCount: manufactured by Packard) was measured. It was measured.
  • the 0% control used a well containing biotin-labeled GST instead of biotin-labeled mA # 10283, and the 100% control used a well containing buffer instead of the compound solution.
  • composition of buffer for base is Composition of buffer for base:
  • washing buffer 20mM HEPES-NaOH (pH 7.5)
  • Example 9 mG # 102 and mA # using the system shown in Screening Example 7 of a compound that inhibits the interaction of 10283, 96 well plates # 102 strain yeast or controls the VT Add 0.09 ml of the yeast strain to each well, and add 0.01 ml of a PBS solution of a specific compound that is not known to affect the interaction between mG # 102 and mA # 10283.
  • the cells were cultured at 30 ° C for 18 to 20 hours. Thereafter, the culture solution was suspended with a plate and the turbidity (absorbance at 590 nm) was measured with a 96-well plate absorbance meter.
  • the turbidity of the gel to which the PBS solution containing no compound was added was used as the 100% control, and the turbidity of the gel to which the PBS solution containing 3-AT (final concentration 100 mM) was added instead of the compound was used as the 0% control.
  • the effects of the compounds were evaluated in terms of%. As shown in Table 1, acetone-4- (4-phenyl) phenyl-1,3-thiazolyl-2-yl-hydrazone (formula [III]) and 5-nitro-12-furaldehyde-2 Brombenzoylhydrazone (Formula [IV]) specifically inhibited strain # 1022 in a dose-dependent manner.
  • BMMC prepared by the method described in Example 1 was suspended in RPMI containing 10% FBS at a concentration of 3 ⁇ 1 O s / ml.
  • a mouse monoclonal anti-DNPI gE antibody (YAMASA) was added at 3 pg / ml, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 30 minutes.
  • the BMMC were I gE antibodies processing buffer one A (133mM N a C 1, 5mM KC 1, 0. 9 mM NaH 2 P0 4, 8 mM glucose, lmg / ml BSA, 0. 0 ImM CaCl 2, 20 mM HEPES, pH 7.
  • BMMC suspension (0.1 ml / well) was added to a 96-well multiplate, and the compound solution (0.05 ml / well) to be examined and a DNP-HSA (Sigma) solution (40 ngZml, (0.05 ml / ⁇ ⁇ ) was added and left at room temperature for 30 minutes, followed by centrifugation at 1000 rpm for 5 minutes, and the supernatant was collected at 0.05 ml / ⁇ in a 96-well multiplate.
  • DNP-HSA Sigma
  • a solution of 4-methylumberiferyl-2-acetoamide-12-dexy ⁇ -D-dalcoviranoside (Funakoshi), a substrate for hexosaminase (ImM; 0.2M citrate), is added to the supernatant.
  • the screening system of the present invention using a transformant carrying the Rab protein of the present invention and its specific conjugating factor, or a DNA encoding the same, inhibits the interaction between the two factors. It is useful for selecting substances that can suppress the degranulation reaction in cells. Such a substance can be used as a therapeutic agent for various allergic diseases caused by or accompanied by enhanced degranulation in mast cells.
  • Sequence number 1 Ala or Val.
  • SEQ ID NO: 4 Thr or Ser.
  • SEQ ID NO: 15 oligonucleotide designed to act as a primer for amplifying cDNA encoding mouse Rab protein.
  • SEQ ID NO: 16 Oligonucleotide designed to act as a primer for amplifying cDNA encoding mouse Rab protein.
  • SEQ ID NO: 17 Oligonucleotide designed to act as a primer for amplifying cDNA encoding human Rab protein.
  • SEQ ID NO: 18 oligonucleotide designed to act as a primer for amplifying cDNA encoding human Rab protein.
  • SEQ ID NO: 19 oligonucleotide designed to act as primer for amplifying cDNA encoding human Rab protein.
  • SEQ ID NO: 20 Oligonucleotide designed to act as a primer for amplifying cDNA encoding human Rab protein.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

明 細 書
マスト細胞脱顆粒反応に関与する因子およびそれらをコードする D NA、
並びに該因子に対する阻害剤のスクリ一ニング法および該阻害剤 技術分野
本発明は、 マスト細胞の脱顆粒反応に関与する新規因子およびそれらをコード する D NA、 該因子に対する抗体、 該抗体を用いた検体中の該因子の測定方法、 並びに該因子に対する阻害物質のスクリ一ニング法および該方法により得られる 化合物を有効成分として含有する該阻害剤に関する。 本発明はまた、 これら脱顆 粒反応に関与する新規因子に対する阻害物質を有効成分とする、 マスト細胞での 脱顆粒反応が関与する疾患、 特にァレルギ一疾患の治療剤に関する。 背景技術
生体が、 抗原としての異物に暴露された結果、 その抗原に特異的な IgE 抗体 が体内で作られ、 再び同じ抗原が侵入してくるとマスト細胞 （肥満細胞とも呼ば れる） の表面に形成された IgE 受容体への IgE抗体の結合の刺激がきっかけと なり、 マスト細胞内の顆粒中に含まれるヒスタミン、 セロトニン、 血小板活性化 因子 （PAF) 、 へパリンなどの化学伝達物質 （chemical mediators) が細胞外に 放出される。 その結果として、 毛細血管透過性亢進、 気管支平滑筋収縮、 外分泌 腺刺激による分泌物の増加などが誘発され、 アナフィラキシーショック、 気管支 喘息、 アレルギー性鼻炎、 尊麻疹、 アトピー性皮膚炎、 薬物アレルギ一などのァ レルギ一性炎症が発症する。
マスト細胞は、 抗原の刺激により放出する種々の化学伝達物質によるアレルギ —症状等の発症のみならず、 マスト細胞内で二次的に産生されるサイトカイン類 の放出による慢性的なアレルギー性炎症にも関与する （M.K. Church & J.P. Caulfield、 第 5 章、 5.卜5.12 頁、 Allergy、 S. T. Holgate ら編、 Gower Medical Publishin 出版、 London, UK, 1993年） 。
さらに、 マスト細胞からの化学伝達物質の放出は、 IgE 受容体を介した作用に より惹起されるだけではなく、 種々の物質 （IgG、 補体、 神経ペプチド、 カルシ ゥムィオノホア、 ホルボールエステル等） が誘因となる。 マスト細胞から化学伝 達物質が細胞外に放出される現象 （脱顆粒反応） には、 環状 AMP (cAMP) 、 カル シゥムイオン、 ナトリウムイオン、 phosphoinositide代謝、 プロテインキナー ゼ ホスホリパーゼ A2、 膜電位の変化などの多様な要素が関わる現象であると 考えられているが、 その詳細は解明されていない （D. A. Kennerly & P. A. Duffy、 第 4章、 4.1-4.14頁、 Allergy、 S. T. Holgate ら編、 Gower Medical Publishing出版、 London, UK, 1993年） 。
これらの化学伝達物質により誘発されるアレルギー性炎症等に対する治療剤 (以下、 抗アレルギー剤という） として現在使用されているのは、 マスト細胞か ら放出された化学伝達物質の作用を抑制する薬剤、 またはマスト細胞の脱顆粒反 応を抑制する薬剤のいずれかである。
化学伝達物質の作用を抑制する夕ィプの典型的な抗アレルギー剤である副腎皮 質ステロイド薬は有効ではあるが、 長期投与による副作用があるため、 非ステロ ィド系の抗アレルギー剤の開発が望まれている。
非ステロイド系の抗アレルギー剤として、 IgE抗体により活性化されたマスト 細胞や好塩基球等から放出される化学伝達物質の作用をブロックする抗ヒスタミ ン剤、 抗ロイコトリエン剤、 抗 PAF剤、 ト口ンボキサンチン A2の合成酵素阻害 剤またはアン夕ゴニスト等が市販もしくは開発中である。
一方、 マスト細胞における脱顆粒反応を根本的に抑制する薬剤を創製すること は、 極めて難しい状況にある。 IgE抗体の刺激を受けたマスト細胞が化学伝達物 質を放出する過程は非常に複雑であり、 上述のように脱顆粒反応の機序が明確に 解明されていないためである。 現在、 脱顆粒抑制作用を有するとされる薬剤が抗 ヒスタミン作用を有しない抗アレルギー剤医薬品として認可され、 臨床治療に使 用されてはいるが、 その作用機序は不明確であり、 かつその脱顆粒抑制作用は弱 く、 優れた治療効果を挙げるに至っていないのが現状である。
したがって、 本発明の目的は、 マスト細胞における脱顆粒反応を根本的に抑制 し得る薬剤を開発するための新規な手段を提供することであり、 また、 当該手段 を用いて脱顆粒反応を抑制する新規抗アレルギー剤を提供することである。 発明の開示
本発明者らは、 アレルギー性炎症等に伴う不快な症状の発症の根本的な原因で あるマスト細胞の脱顆粒現象について、 以下の基本的な概念を構築した。
( 1 ) 脱顆粒現象は細胞内の小胞輸送に基づく反応であり、 「小胞輸送制御因 子」 と称すべき特定の因子が闋与する。
(2 ) その特定の小胞輸送制御因子の機能発現には特異的な 「共役性因子」 と称 すべき別の因子の共同的な作用が密接に関与している。 従って、
( 3 ) この作用機序に関わる特定の因子の作用を制御または阻害する物質は、 不 快な症状を惹起する根本的な病因を的確に制御する治療剤として臨床的に応用で きる。 言い換えれば、
(4) この作用機序に関わる特定の因子 （すなわち、 小胞輸送制御因子およびそ の共役性因子） を同定して、 その作用を制御または阻害する物質をスクリ一ニン グすることにより、 脱顆粒反応を根本的に抑制する抗アレルギー性物質を見出す ことができる。
したがって、 本発明の目的は、 より具体的には、 マスト細胞の脱顆粒反応に関 わる小胞輸送制御因子およびその共役性因子を提供することであり、 これらの各 因子が相互作用し得る細胞系または無細胞アツセィ系を構築して、 これらの因子 の機能を制御または阻害する物質をスクリーニングする方法を提供することであ る。 本発明のさらなる目的は、 それらの方法を用いて、 マスト細胞での脱顆粒反 応の亢進が関与するアレルギー疾患の治療剤を提供することである。
本発明者らは、 上記概念に基づき、 マスト細胞内での脱顆粒反応を制御する因 子として、 動物細胞における膜輸送の制御に関わる機能を有する G蛋白に属する Rab蛋白に注目した。
一般論として、 細胞内物質の膜への輸送には、 G蛋白 （G T P結合性タンパク 質とも呼ばれる） が関与していると考えられている （P. Charvrier ら、 Mol. Cell. Biol.ヽ 10卷 12号、 6578 - 6585頁、 1990年； P. Charvrierら、 Cellヽ 62 卷、 317-329 頁、 1990年） 。 例えば、 G蛋白は、 細胞表面上の受容体に結合し たリガンドの情報を細胞内に翻訳して伝達される過程に関与することが知られて いる。 また、 受容体の情報が G蛋白を介して細胞内に伝達される内容は、 その伝 達に関与する G蛋白の種類、 特にそのひサブュニットの構造に依存するらしい (D. A. Kennerly & P. A. Duffy, 第 4 章、 4.1-4.14 頁、 Allergy、 S. T. Holgate ら編、 Go雷 Medical Publishing出版、 London, UK, 1993年） 。 しか しながら、 具体的に G蛋白が膜輸送にどのように関与しているのか、 その全容は 未だ不明であるし、 IgE受容体によるマスト細胞の活性化の現象に関しては、 ど のような G蛋白が関与するかということはおろか、 実際に G蛋白が関与している のか否かすら全く具体的に報告されていない。
Rabフアミリーに属するタンパク質類 （単に Rab蛋白ということもある） は、 細胞内の特定の小器官から別の小器官に物質が輸送される細胞内小胞輸送を制御 する蛋白質として、 これまでに 30種類以上報告されている。 例えば、 Rab3A蛋 白は神経伝達物質を含むシナプス小胞の輸送に関与し （M. Matteoli ら、 J. Cell Biol., 115卷 3号、 625-633頁、 1991年） 、 Rabll蛋白 （0. Ullrichら、 J. Cell Biol. 135卷 4号、 913-924頁、 1996年） はエンドゾームのリサイク リングを制御し、 Rab5 蛋白はエンドサイ トーシスを制御する （V. Rybin ら、 Nature, 383卷 6597号、 266- 269頁、 1996年） ことが報告されており、 それそ れの Rab蛋白は特定の機能に関与することが示唆される。 さらに、 これらの 3 種類の Rab 蛋白は、 それそれ rabphilin-3A (H. Shirataki ら、 Mol . Cell Biol.、 13巻 4号、 2061- 2068頁、 1993年) 、 rabphilin-11 (A. Ma腿 otoら、 J. Biol. Chem.、 274卷 36号、 25517-25524頁、 1999年） または rabaptin 5 (V. Rybinらヽ Nature, 383巻 6597号、 266-269頁、 1996年） と特異的に結合し、 それぞれの Rab蛋白の活性発現に共役的に関与することが報告されている。
P. Chavrierら (Gene、 112卷、 261- 264頁、 1992年） は、 マウス腎臓由来の c D NAライブラリ一から Rab蛋白または Rho蛋白に分類される新規蛋白質を コードする遺伝子を徹底的に追及して 12種類の遺伝子を報告し、 かっこれら以 外の新規の Rab蛋白または Rho蛋白を見出せる可能性はないと報告した。
しかしながら、 近年のゲノミクス技術の著しい進歩により、 さらに新しい Rab 遺伝子が見出されつつある。 例えば、 Incyte社は、 Rab A， Rab B, Rab C, Rab D (国際特許出願公開 WO 98/18942 号公報） 、 SRAB (国際特許出願公開 W0 98/42839号公報） 、 匿- 1, RABP-2 (国際特許出願公開 W0 99/09182号公報） 等の Rab遺伝子を報告している。 また、 Axys Pharmaceuticals社は、 ヒト E S Tデータペースから、 公知の Rab遺伝子とホモロジ一を有する E S Tクローン を検索し、 その中から Rab として未報告のものについてその完全長を決定した (国際特許出願公開 W0 00/58464号公報） 。
さらに、 E. S. Masudaら (FEBS Lett. , 470卷， 61 - 64頁, 2000年） は、 マウ スマスト細胞株由来の c D N Aライブラリ一から分泌顆粒局在性の GTPase とし て Rab37の c D NAを単離したことを報告している。
しかしながら、 実際にマスト細胞内での脱顆粒反応を制御することが明らかな G蛋白 （特に Rab蛋白） もしくはその遺伝子は未だに知られておらず、 また、 共役性因子の存在についても全く知られていなかった。
本発明者らは、 マスト細胞内における脱顆粒反応を実際に制御する Rab蛋白 を同定すべく、 既知の Rab蛋白に特徴的な配列を基にしてプライマーを作製し、 マウス骨髄細胞由来の培養マスト細胞から調製した R N Aを錶型として R T— P C Rを行った結果、 2種類の新規 Rab蛋白をコードする c D N Aをクロ一ニン グすることに成功した。 また、 これらのマウス c D NAの部分塩基配列に相当す るオリゴヌクレオチドをプライマ一として、 同様に対応のヒト Rab蛋白遺伝子 をヒト c D N Aからクローニングした。 一方で、 本発明者らは、 これらの Rab 蛋白と相互作用する新規な共役性因子をコードする c D N Aを、 酵母菌株を用い た two- hybrid法 （ Chien ら， Proc. Natl. Acad. Sci. USAヽ 88卷 21号、 9578-9582 頁、 1991 年） によりそれそれクローニングすることにも成功した。 さらに、 これらの c D NAを含む発現べクタ一で形質転換された細胞から得られ た組換え Rab蛋白およびそれらの共役性因子が、 それそれマスト細胞における 脱顆粒反応に影響を及ぼすことを確認して、 これらの因子が脱顆粒反応に関与す る制御因子であることを実証した。
次に、 本発明者らは、 Rab 蛋白遺伝子とその共役性因子の遺伝子を two - hybrid法により導入した酵母菌株に、 これらの脱顆粒制御因子の作用を阻害す る候補物質を接触させて、 その相互作用への影響を調べることにより、 該脱顆粒 制御因子阻害物質をスクリーニングする方法を確立した。 また、 該 Rab蛋白と その共役性因子との相互作用もしくは該 Rab蛋白の G T P結合能を阻害する物 質をスクリーニングし得る無細胞アツセィ系を確立した。 さらに、 これらのスク リ一ニング方法により有用な抗ァレルギ一剤を創製できることを実証して本発明 を完成するに至った。
すなわち、 本発明は以下に述べるものである。
[ 1 ] 以下の )、 （b)または (c)の蛋白質。
(a) 配列表配列番号 1に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質
(b) 上記 (a)のアミノ酸配列において、 1もしくは数個のアミノ酸が置換、 欠失、 挿入、 付加もしくは ί多飾されたアミノ酸配列からなり、 且つ単独もしくは 1以上 の共役性因子との相互作用によりマスト細胞における脱顆粒反応を制御し得る蛋 白質
(c ) 上記 (a)の蛋白質のフラグメントであって、 且つ単独もしくは 1以上の共役 性因子との相互作用によりマスト細胞における脱顆粒反応を制御し得る蛋白質
[ 2 ] 以下の )、 （b)または (c)の蛋白質。
( a ) 配列表配列番号 4に示されるァミノ酸配列からなる蛋白質
(b) 上記 (a)のアミノ酸配列において、 1もしくは数個のアミノ酸が置換、 欠失、 挿入、 付加もしくは修飾された Tミノ酸配列からなり、 且つ単独もしくは 1以上 の共役性因子との相互作用によりマスト細胞における脱顆粒反応を制御し得る蛋 白質
(c ) 上記 (a)の蛋白質のフラグメントであって、 且つ単独もしくは 1以上の共役 性因子との相互作用によりマスト細胞における脱顆粒反応を制御し得る蛋白質
[ 3 ] 以下の (a)、 （b)または (c)の蛋白質。
( a ) 配列表配列番号 7に示されるァミノ酸配列からなる蛋白質
(b) 上記 (a)のアミノ酸配列において、 1もしくは数個のアミノ酸が置換、 欠失、 挿入、 付加もしくは修飾されたアミノ酸配列からなり、 且つ単独もしくは上記
[ 1 ] の蛋白質との相互作用によりマスト細胞における脱顆粒反応を制御し得る
(c ) 上記 (a)の蛋白質のフラグメントであって、 且つ単独もしくは上記 [ 1 ] の 蛋白質との相互作用によりマスト細胞における脱顆粒反応を制御し得る蛋白質
[ 4 ] 以下の (a)、 （b)または (c)の蛋白質。
(a) 配列表配列番号 9に示されるァミノ酸配列からなる蛋白質
(b) 上記 (a)のアミノ酸配列において、 1もしくは数個のアミノ酸が置換、 欠失、 挿入、 付加もしくは修飾されたアミノ酸配列からなり、 且つ単独もしくは上記
[ 1 ] の蛋白質との相互作用によりマスト細胞における脱顆粒反応を制御し得る (c) 上記 (a)の蛋白質のフラグメントであって、 且つ単独もしくは上記 [1] の 蛋白質との相互作用によりマスト細胞における脱顆粒反応を制御し得る蛋白質
[5] 以下の (a)、 （b)または (c)の蛋白質。
(a) 配列表配列番号 11に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質
(b) 上記 (a)のアミノ酸配列において、 1もしくは数個のアミノ酸が置換、 欠失、 挿入、 付加もしくは修飾されたアミノ酸配列からなり、 且つ単独もしくは上記
[1] の蛋白質との相互作用によりマスト細胞における脱顆粒反応を制御し得る
(c) 上記 (a)の蛋白質のフラグメントであって、 且つ単独もしくは上記 [1] の 蛋白質との相互作用によりマスト細胞における脱顆粒反応を制御し得る蛋白質
[6] 以下の (a)、 (b)または (c)の蛋白質。
(a) 配列表配列番号 13に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質
(b) 上記 (a)のアミノ酸配列において、 1もしくは数個のアミノ酸が置換、 欠失、 挿入、 付加もしくは修飾されたアミノ酸配列からなり、 且つ単独もしくは上記
[2] の蛋白質との相互作用によりマスト細胞における脱顆粒反応を制御し得る
(c) 上記 (a)の蛋白質のフラグメントであって、 且つ単独もしくは上記 [2] の 蛋白質との相互作用によりマスト細胞における脱顆粒反応を制御し得る蛋白質
[7] 哺乳動物、 特にヒトまたはマウス由来である上記 [1] 〜 [6] のいずれ かの蛋白質。
[8] 上記 [1] の蛋白質をコードする DNA、 特に、 以下の（a)、 （b)または (c)で特定される該 DNA。
(a) 配列表配列番号 2または 3に示される塩基配列からなる D N A
(b) 上記 (a)の塩基配列において、 1もしくは数個の塩基が置換、 欠失、 挿入、 もしくは付加された塩基配列を含む D N A
(c) 上記 (a)の塩基配列からなる DNAのフラグメント [9] 上記 [2] の蛋白質をコードする DNA、 特に、 以下の（a)、 （b)または (c)で特定される該 DNA。
(a) 配列表配列番号 5または 6に示される塩基配列からなる D N A
(b) 上記 (a)の塩基配列において、 1もしくは数個の塩基が置換、 欠失、 挿入、 もしくは付加された塩基配列を含む D N A
( c ) 上記 ( a )の塩基配列からなる D N Aのフラグメント
[10] 上記 [3] の蛋白質をコードする DNA、 特に、 以下の (a)、 （b)また は (c)で特定される該 DNA。
(a) 配列表配列番号 8に示される塩基配列配列中、 塩基番号 18〜104で示 される塩基配列からなる D N A
(b) 上記 (a)の塩基配列において、 1もしくは数個の塩基が置換、 欠失、 挿入、 もしくは付加された塩基配列を含む D N A
(c) 上記 (a)の塩基配列からなる DN Aのフラグメント
[ 1 1] 上記 [4] の蛋白質をコードする DNA、 特に、 以下の（a)、 （b)また は（c)で特定される該 DNA。
(a) 配列表配列番号 10に示される塩基配列配列中、 塩基番号 18〜68で示 される塩基配列からなる D N A
(b) 上記 (a)の塩基配列において、 1もしくは数個の塩基が置換、 欠失、 挿入、 もしくは付加された塩基配列を含む D N A
(c) 上記 (a)の塩基配列からなる DN Aのフラグメント
[12] 上記 [5] の蛋白質をコードする DNA、 特に、 以下の (a)、 （b)また は (c)で特定される該 DNA。
(a) 配列表配列番号 12に示される塩基配列配列中、 塩基番号 18〜 1334 で示される塩基配列からなる DN A
(b) 上記 (a)の塩基配列において、 1もしくは数個の塩基が置換、 欠失、 挿入、 もしくは付加された塩基配列を含む D N A (c)上記 (a)の塩基配列からなる DNAのフラグメント
[13]上記 [6] の蛋白質をコードする DNA、 特に、 以下の (a)、 （b)また は（c)で特定される該 DNA。
(a)配列表配列番号 14に示される塩基配列からなる DNA
(b) 上記 (a)の塩基配列において、 1もしくは数個の塩基が置換、 欠失、 挿入、 もしくは付加された塩基配列を含む DN A
(c)上記 (a)の塩基配列からなる DNAのフラグメント
[14]哺乳動物、 特にヒトまたはマウス由来である上記 [8]〜 [13] のい ずれかに記載の DNA。
[15]上記 [8：]〜 [14]のいずれかの DN Aを含む組換えべクタ一。
[16]上記 [15] の組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換 体。
[1 ]上記 [16] の形質転換体を培養して得られる培養物から上記 [1]〜 [7]のいずれかの蛋白質を採取することを特徴とする該蛋白質の製造方法。
[ 18 ]上記 [ 1 ]〜 [ 7 ]のいずれかの蛋白質に特異的親和性を有する抗体。
[19]上記 [18] の抗体を含む、 検体中の上記 [1；] 〜 [7]のいずれかの 蛋白質測定用試薬。
[20]上記 [18] の抗体との抗原抗体反応に基づく、 検体中の上記 [1；]〜 [7]のいずれかの蛋白質の測定方法。
[21]上記 [8] (または [9] ) の DNAを、 宿主細胞内のレポ一夕一遺伝 子の発現を制御する蛋白質の部分配列との融合蛋白質として発現される形態で含 む発現ベクターと、 上記 [10：！ 〜 [12] (または [13] ) の DNAを、 該 蛋白質の他の部分配列との融合蛋白質として発現される形態で含む発現べクタ一 (但し、 該 2つの部分配列は、 得られる 2つの融合蛋白質が相互作用する場合に のみ、 該レポ一夕一遺伝子の発現を制御する機能を回復する） とを宿主細胞に導 入して得られる形質転換体、 特に、 該 2つの部分配列が転写因子の DN A結合ド メィンおよび活性化ドメインである該形質転換体。
[22] マスト細胞における脱顆粒反応を阻害し得る物質のスクリーニング法で あって、
(1) 上記 [2 1] の形質転換体を、 試験物質の存在下および非存在下に培地中 でそれそれ培養し、
(2) レポーター遺伝子の発現を比較する
ことを含む方法。
[23] マスト細胞における脱顆粒反応を阻害し得る物質のスクリーニング法で あって、
(1) 試験物質の存在下および非存在下に上記 [1] または [2] の蛋白質と G TPを接触させ、
(2) 該蛋白質に対する G TPの結合を比較する
ことを含む方法。
[24] マスト細胞における脱顆粒反応を阻害し得る物質のスクリーニング法で あって、 試験物質の存在下および非存在下に以下の工程を実施することを特徴と する方法。
(1) 上記 [ 1 ] (または [2] ) の蛋白質と上記 [3] 〜 [5] のいずれか (または [6] ) の蛋白質とを接触させて複合体を形成させる工程
(2) 上記 [1] (または [2] ) の蛋白質に GTPを結合させる工程 （工程（1) および (2)の順序は逆であってもよいし、 同時であってもよい）
(3) GTPを結合した上記 [ 1] (または [2] ) の蛋白質と上記 [3] 〜 [5] のいずれか （または [6] ) の蛋白質との複合体を測定する工程 （但し、 上記 [1] (または [2] ) の蛋白質、 上記 [3：！ 〜 [5] のいずれか （または [6] ) の蛋白質および GTPからなる群より選択されるいずれかの成分は標識 されている） [25]上記 [22：] 〜 [24] のいずれかの方法により得られうる、 マスト細 胞における脱顆粒反応の阻害物質、 特に、 式 [I] または式 [II] で表される 当該阻害物質。
Figure imgf000013_0001
(式中、 R1は水素原子または炭素数 1〜 4の直鎖もしくは分枝鎖アルキル基を、 Xは水素原子、 炭素数 1〜 4の直鎖もしくは分枝鎖アルキル基、 ヒドロキシ基ま たはフエ二ル基を表す。 ）
Figure imgf000013_0002
(式中、 R2は水素原子またはニトロ基を、 Yはハロゲン原子、 炭素数 1〜4の 直鎖もしくは分枝鎖アルキル基またはヒドロキシ基を表す。 ）
[26]上記 [25] の阻害物質を有効成分として含有するマスト細胞における 脱顆粒反応の阻害剤。
[27]上記 [25] の阻害物質を有効成分とする、 マスト細胞における脱顆粒 反応の亢進が関与するアレルギー疾患の治療剤。 発明を実施するための最良の形態
本発明は、 マスト細胞における脱顆粒反応を制御し得る 2種の新規 Rab蛋白 を提供する。 これらの Rab蛋白は、 それそれ後述の特定の共役性因子と相互作 用してマスト細胞での脱顆粒反応を制御することができる。 しかしながら、 外因 性の Rab蛋白は、 単独でマスト細胞での脱顆粒反応を抑制的に制御し得る。
本発明の第 1の Rab蛋白は、 好ましくは、 配列表配列番号 1に示されるアミ ノ酸配列からなる蛋白質であるが、 単独もしくは 1以上の共役性因子との相互作 用によりマスト細胞における脱顆粒反応を制御し得る限り、 該アミノ酸配列にお いて、 1もしくは数個のアミノ酸が置換、 欠失、 挿入、 付加もしくは修飾された ァミノ酸配列からなるもの、 または該ァミノ酸配列からなる蛋白質のフラグメン トであってもよい。
本発明の第 2の Rab蛋白は、 好ましくは、 配列表配列番号 4に示されるアミ ノ酸配列からなる蛋白質であるが、 単独もしくは 1以上の共役性因子との相互作 用によりマス.ト細胞における脱顆粒反応を制御し得る限り、 該ァミノ酸配列にお いて、 1もしくは数個のアミノ酸が置換、 欠失、 挿入、 付加もしくは修飾された アミノ酸配列からなるもの、 または該アミノ酸配列からなる蛋白質のフラグメン トであってもよい。
蛋白質は通常コンパクトに折り畳まれていて、 蛋白質同士の結合には蛋白質内 の部分的アミノ酸配列が重要な役割を担うことが多い。 本発明においても、 共役 性因子と結合する活性を有する限り、 すなわち、 単独もしくは 1以上の共役性因 子との相互作用によりマスト細胞における脱顆粒反応を制御し得る限り、 配列番 号 1または 4に示されるァミノ酸配列全体を含む必要はなく、 該蛋白質のフラグ メントを使用してもよい。
本発明の Rab 蛋白フラグメント、 すなわち、 共役性因子との結合活性を有す るフラグメントは、 例えばエンドべプチダ一ゼで分解した Rab 蛋白のペプチド フラグメントを精製して、 Rab蛋白と共役性因子の結合に対する阻害作用を調べ ることにより得ることができる。 また、 例えば、 本発明の Rab 蛋白について遺 伝子操作によるアミノ酸の置換、 欠失または挿入を行った際に、 該変異 Rab蛋 白が共役性因子に対する結合活性を失う場合、 その変異導入部位 （置換されたァ ミノ酸残基、 欠失したアミノ酸 （配列） および挿入により破壊されたアミノ酸配 列等） を含むフラグメントの中から共役性因子との結合活性を有するフラグメン トを得ることができる。 また、 一般的に、 蛋白質は親水性領域を分子表面に露出 していると考えられるので、 例えば、 D. Eisenberg らの方法 （Proc. Natl . Acad. Sci. USA, 81卷、 140-144頁、 1984年） により、 親水性および疎水性の 領域をアミノ酸配列から推定することで、 該結合活性を有するフラグメントを得 ることもできる。
本発明の Rab 蛋白は、 上記の特徴を有する限りその由来は特に限定されない c したがって、 天然に存在する生物起源のものの他、 自然もしくは人工の突然変異 体、 あるいは異種 （すなわち、 外来の） Rab蛋白をコードする遺伝子を宿主に導 入して得られる形質転換体由来のものもすベて包含される。 好ましくは、 ヒト、 ゥシ、 ブ夕、 ゥマ、 サル、 ヒヅジ、 ャギ、 ィヌ、 ネコ、 ゥサギ、 マウス、 ラヅト、 モルモット等の哺乳動物由来の Rab 蛋白が例示される。 特に好ましくは、 ヒト またはマウス由来のものである。
ヒト由来の第 1の Rab 蛋白として、 好ましくは、 配列番号 1において、 アミ ノ酸番号 4 5、 1 1 5、 1 3 8、 1 6 5および 1 6 7で示されるアミノ酸がそれ それ Val、 Met, Leu, Hisおよび Alaである配列を有するものが挙げられ、 また、 マウス由来の第 1の Rab 蛋白として、 好ましくは、 配列番号 1において、 アミ ノ酸番号 4 5、 1 1 5、 1 3 8、 1 6 5および 1 6 7で示されるアミノ酸がそれ それ Ala、 Val Met, Argおよび Proである配列を有するものが挙げられるが、 それらに限定されない。 ヒト由来の第 2の Rab蛋白として、 好ましくは、 配列番号 4において、 アミ ノ酸番号 1 1 3、 1 8 5、 1 9 2、 2 0 0および 2 0 3で示されるアミノ酸がそ れそれ Ser、 Met、 Val、 Thrおよび Alaである配列を有するものが挙げられ、 ま た、 マウス由来の第 2の Rab蛋白として、 好ましくは、 配列番号 4において、 アミノ酸番号 1 1 3、 1 8 5、 1 9 2、 2 0 0および 2 0 3で示されるアミノ酸 がそれそれ Thr、 Leu, l ies Pro.および Valである配列を有するものが挙げられ るが、 それらに限定されない。
本発明の Rab蛋白は糖鎖が付加されたものであってもよい。 例えば、 そのァ ミノ酸配列において Asn-X-Thr(Ser) (X は任意の 1アミノ酸を表す） が存在す る場合は糖鎖が付加されている場合もある （Z. Khalkhall & R.D. Marshall, Biochem. J.、 146卷、 299- 307頁、 1975年） 。
本発明の Rab蛋白は、 そのアミノ酸組成や糖鎖付加の相違により異なる分子 量を有してもよいが、 好ましくは、 糖鎖付加されていないポリペプチド鎖として 第 1の Rab蛋白が約 2 1 . 5 k D a、 第 2の Rab蛋白が約 2 3 . 8 k D a (そ れそれ理論値） の分子量を有するものが挙げられる。
本発明の Rab 蛋白は、 （ 1 ) 該蛋白質を産生する組織または細胞を原料とし て抽出精製する方法、 （2 ) 化学的に合成する方法または （3 ) 遺伝子組換え技 術により該蛋白質を発現するように操作された細胞から精製する方法等を適宜用 いることによって取得することができる。
マスト細胞は血中の好塩基球に相当する組織内の細胞であり、 体内のあらゆる 組織の血管周囲に存在するが、 特に、 表皮直下、 気道、 消化管粘膜等に多く分布 する。 アレルギー反応の惹起に主たる役割を担うマスト細胞は粘膜型マスト細胞 である。 近年、 マウス骨髄細胞よりマスト細胞を分化させる方法が報告され （T. Nakano ら、 J. Exp. Med.ヽ 162卷、 1025-1043頁、 1987年） 、 多量の粘膜型マ スト細胞を調製できる方法が確立された。 また、 最近ではヒト骨髄細胞あるいは 臍帯血由来の造血幹細胞よりマスト細胞を分化させる方法も報告されている （H . Saito ら、 Int. Arch. Allergy Immunol . , 107 卷、 卜 3 号、 63-65 頁、 1995 年） 。 したがって、 天然の Rab蛋白産生組織からの該蛋白質の単離精製は、 例 えば、 以下のようにして行うことができる。
哺乳動物、 例えば、 ヒト、 マウス、 ラット等の骨髄細胞あるいは臍帯血由来の 造血幹細胞より前述の方法により分化させた培養マスト細胞を適当な抽出緩衝液 中でホモジナイズし、 ¾音波処理や界面活性剤処理等により細胞抽出液を得、 そ こから蛋白質の分離精製に常套的に利用される分離技 を適宜組み合わせること により精製することができる。 このような分離技術としては、 例えば、 塩析、 溶 媒沈澱法等の溶解度の差を利用する方法、 透析、 限外濾過、 ゲル濾過、 非変性ポ リアクリルアミド電気泳動 （P A G E ) 、 ドデシル硫酸ナトリウム—ポリアクリ ルアミド電気泳動 （S D S— P A G E ) 等の分子量の差を利用する方法、 イオン 交換クロマトグラフィ一、 ヒドロキシァパタイトクロマトグラフィー等の荷電を 利用する方法、 ァフィ二ティ一クロマトグラフィ一等の特異的親和性を利用する 方法、 逆相高速液体クロマトグラフィー等の疎水性の差を利用する方法、 等電点 電気泳動等の等電点の差を利用する方法などが挙げられる。
化学合成による Rab蛋白の製造は、 例えば、 配列表配列番号 1または 4に示 されるアミノ酸配列を基にして、 配列の全部または一部をペプチド合成機を用い て合成し、 得られるポリペプチドを適当な再生条件下で再生 （renaturation) させることにより行うことができる。
本発明の Rab 蛋白は、 好ましくは、 該蛋白質をコードする D N Aをクロ一二 ングし、 該 D N Aを担持する発現べク夕一を含む形質転換体の培養物から単離精 製することにより製造することができる。
遺伝子のクロ一ニングは、 通常、 以下の方法により行われる。 まず、 所望の蛋 白質を産生する細胞または組織より、 上記のような手段により該蛋白質を完全ま たは部分精製し、 その N末端アミノ酸配列をエドマン法を用いて決定する。 また、 ペプチドを配列特異的に切断するプロテアーゼゃ化学物質で該蛋白質を部分分解 して得られるオリゴぺプチドのアミノ酸配列を同様にェドマン法により決定する 決定された部分ァミノ酸配列に対応する塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを 合成し、 これをプローブとして用いて、 該蛋白質を産生する細胞または組織より 調製された cDNAまたはゲノミック DNAライブラリ一から、 コロニー （もし くはプラーク） ハイブリダィゼ一シヨン法によって該蛋白質をコードする DNA をクローニングする。
あるいは、 上記オリゴヌクレオチドをプライマ一として用い、 該蛋白質を産生 する細胞または組織より調製された RN Aを錶型として RT— PCRを行うこと によって該蛋白質をコードする cDNAの全部または一部を特異的に増幅するこ とができる。 部分配列が得られる場合は、 増幅断片をプローブとして上記と同様 にコロニ一 （もしくはプラーク） ハイブリダィゼ一シヨン法を行うことによって 完全長の cDNAをクロ一ニングすることができる。
本発明の Rab蛋白のように、 同じスーパーフアミリーに属する遺伝子が数多 く知られている場合は、 公知の遺伝子群のホモロジ一比較から保存性の高い配列 を見出して、 その配列を基にプローブもしくはプライマ一として用いるオリゴヌ クレオチドを合成することもできる。
あるいは、 完全または部分精製された蛋白質の全部または一部を抗原として該 蛋白質に対する抗体を常法にしたがって作製し、 該蛋白質を産生する細胞または 組織より調製された cDNAまたはゲノミヅク DNAライブラリーから、 抗体ス クリーニング法によって該蛋白質をコードする DN Aをクローニングすることも できる。
目的の蛋白質と類似の生理機能を有する蛋白質の遺伝子が公知である場合、 E MB Lや G e nB an k等の一般に利用可能なデ一夕ベース上に登録されたヒト、 マウス、 ラッ ト等の哺乳動物の EST (Expressed Sequence Tag) クローンの 中から、 該公知遺伝子の塩基配列と相同性を有するクローンを検索し、 抽出され た E STクローンの塩基配列を基にして、 上記のようにプローブを作製し、 コロ 二一 （もしくはプラーク） ハイブリダィゼ一シヨン法によって該蛋白質をコード する DNAをクローニングすることができる。 本発明の Rab蛋白の場合、 ヒト、 マウス、 ラット等の哺乳動物由来各種 Rab蛋白の塩基配列とのホモロジ一検索 により、 目的の Rab蛋白をコ一ドする cDNAの断片である E STクローンを 見出すことができる。
あるいは、 より迅速かつ簡便に cDNAクロ一ンを得る方法として、 RACE (Rapid Amplification of cDNA End) 法 (M.A. Frohman らヽ Proc. Natl, acad. Sci. USA、 85卷、 8998- 9002頁、 1988年） を用いることができる。 すな わち、 上記のようにして Rab蛋白遺伝子の一部に相当する ESTクロ一ンを抽 出し、 該 E STクローンのセンス鎖およびアンチセンス鎖の部分塩基配列に相同 なオリゴヌクレオチドをそれそれ合成して、 各オリゴヌクレオチドと適当なァダ プ夕ープライマ一とを一対の P CRプライマ一として 5'および 3 'RACE反応 を行い、 各増幅断片を制限酵素とリガ一ゼを用いる等の方法で連結することによ り、 完全長の cDNAクローンを得ることができる。
上記のようにして得られた： DNAの塩基配列は、 マキサム ·ギルバート法ゃジ デォキシ夕ーミネ一シヨン法等の公知のシークェンス技術を用いて決定すること ができる。
本発明の第 1の Rab蛋白をコードする DNAは、 好ましくは、 配列表配列番 号 1に示されるアミノ酸配列、 該アミノ酸配列において 1もしくは数個のァミノ 酸が欠失、 置換、 挿入、 付加もしくは修飾されたアミノ酸配列、 または該ァミノ 酸配列のフラグメント （但し、 該変異アミノ酸配列または該フラグメントからな る蛋白質は、 単独もしくは 1つ以上の共役性因子と相互作用してマスト細胞にお ける脱顆粒反応を制御し得る生理活性を有する） をコードする DNAである。 よ り好ましくは、 本発明の第 1の Rab蛋白をコードする DNAは、 配列表配列番 号 2または 3に示される塩基配列からなる D N A、 該塩基配列において 1もしく は数個の塩基が欠失、 置換、 挿入もしくは付加された塩基配列を含む DNA、 ま たは該塩基配列からなる D NAのフラグメント （但し、 該変異塩基配列または該 フラグメントによってコードされる蛋白質は、 単独もしくは 1つ以上の共役性因 子と相互作用してマスト細胞における脱顆粒反応を制御し得る生理活性を有す る） である。
本発明の第 2の Rab蛋白をコードする D N Aは、 好ましくは、 配列表配列番 号 4に示されるアミノ酸配列、 該ァミノ酸配列において 1もしくは数個のァミノ 酸が欠失、 置換、 挿入、 付加もしくは修飾されたアミノ酸配列、 または該ァミノ 酸配列のフラグメント （但し、 該変異アミノ酸配列または該フラグメントからな る蛋白質は、 単独もしくは 1つ以上の共役性因子と相互作用してマスト細胞にお ける脱顆粒反応を制御し得る生理活性を有する） をコードする D NAである。 よ り好ましくは、 本発明の第 2の Rab蛋白をコードする D N Aは、 配列表配列番 号 5または 6に示される塩基配列からなる D N A、 該塩基配列において 1もしく は数個の塩基が欠失、 置換、 挿入もしくは付加された塩基配列を含む D N A、 ま たは該塩基配列からなる D N Aのフラグメント （但し、 該変異塩基配列または該 フラグメントによってコードされる蛋白質は、 単独もしくは 1つ以上の共役性因 子と相互作用してマスト細胞における脱顆粒反応を制御し得る生理活性を有す る） である。
本発明の第 1の Rab蛋白をコードする D N Aは、 配列番号 2または 3に示さ れる塩基配列を基にして、 例えば Y.A.Ovchinnikovらの方法 （Gene、 31卷、 65- 78頁、 1984年） に準じて、 化学的に全合成することもできる。 また、 本発明の 第 2の Rab蛋白をコードする D NAは、 配列番号 5または 6に示される塩基配 列を基にして、 同様に化学的に全合成することができる。
本発明はまた、 上記 2種の本発明の Rab蛋白と相互作用してマスト細胞での 脱顆粒反応を制御し得る共役性因子を提供する。 これらの共役性因子は、 外因的 にマスト細胞に供給される場合には、 単独で脱顆粒反応を抑制的に制御し得る。 本発明の第 1の Rab蛋白と特異的に相互作用し得る第 1の共役性因子は、 好 ましくは、 配列表配列番号 7に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質であるが、 該 Rab蛋白との相互作用によりマスト細胞における脱顆粒反応を制御し得る限 り、 該アミノ酸配列において、 1もしくは数個のアミノ酸が置換、 欠失、 挿入、 付加もしくは修飾されたァミノ酸配列からなるもの、 または該ァミノ酸配列から なる蛋白質のフラグメントであってもよい。
本発明の第 1の Rab蛋 |¾と特異的に相互作用し得る第 2の共役性因子は、 好 ましくは、 配列表配列番号 9に示されるァミノ酸配列からなる蛋白質であるが、 単独もしくは該 Rab蛋白との相互作用によりマスト細胞における脱顆粒反応を 制御し得る限り、 該アミノ酸配列において、 1もしくは数個のアミノ酸が置換、 欠失、 挿入、 付加もしくは修飾されたアミノ酸配列からなるもの、 または該アミ ノ酸配列からなる蛋白質のフラグメントであってもよい。
本発明の第 1の Rab蛋白と特異的に相互作用し得る第 3の共役性因子は、 好 ましくは、 配列表配列番号 1 1に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質であるが、 該 Rab蛋白との相互作用によりマスト細胞における脱顆粒反応を制御し得る限 り、 該アミノ酸配列において、 1もしくは数個のアミノ酸が置換、 欠失、 挿入、 付加もしくは修飾されたァミノ酸配列からなるもの、 または該ァミノ酸配列から なる蛋白質のフラグメントであってもよい。
本発明の第 2の Rab蛋白と特異的に相互作用し得る共役性因子は、 好ましく は、 配列表配列番号 1 3に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質であるが、 単独 もしくは該 Rab 蛋白との相互作用によりマスト細胞における脱顆粒反応を制御 し得る限り、 該アミノ酸配列において、 1もしくは数個のアミノ酸が置換、 欠失、 挿入、 付加もしくは修飾されたアミノ酸配列からなるもの、 または該アミノ酸配 列からなる蛋白質のフラグメントであってもよい。
上述のように、 蛋白質は通常コンパクトに折り畳まれていて、 蛋白質同士の結 合には蛋白質内の部分的アミノ酸配列が重要な役割を担うことが多い。 本発明に おいても、 Rab蛋白と結合する活性を有する限り、 すなわち、 単独もしくは Rab 蛋白との相互作用によりマスト細胞における脱顆粒反応を制御し得る限り、 配列 番号 7、 9、 1 1または 1 3に示されるアミノ酸配列全体を含む必要はなく、 該 蛋白質のフラグメントを使用してもよい。
本発明の共役性因子のフラグメントは、 Rab蛋白のフラグメントの取得方法に ついて上記したのと同様のストラテジーを用いて得ることができる。
本発明の共役性因子は、 上記の特徴を有する限りその由来は特に限定されない したがって、 天然に存在する生物起源のものの他、 自然もしくは人工の突然変異 体、 あるいは異種 （すなわち、 外来の） Rab蛋白をコードする遺伝子を宿主に導 入して得られる形質転換体由来のものもすベて包含される。 好ましくは、 ヒト、 ゥシ、 プ夕、 ゥマ、 サル、 ヒヅジ、 ャギ、 ィヌ、 ネコ、 ゥサギ、 マウス、 ラヅ ト、 モルモッ ト等の哺乳動物由来の共役性因子が例示される。 特に好ましくは、 ヒト またはマウス由来のものである。
本発明の第 1の Rab蛋白と特異的に相互作用し得る共役性因子は、 そのアミ ノ酸組成や糖鎖付加の相違により異なる分子量を有してもよいが、 好ましくは、 糖鎖付加されていないポリぺプチド鎖として第 1の共役性因子が約 3 . 2 k D a、 第 2の共役性因子が約 1 . 9 k D aおよび第 3の共役性因子が約 4 7 . O k D a (それそれ理論値） の分子量を有するものが挙げられる。
本発明の第 2の Rab蛋白と特異的に相互作用し得る共役性因子は、 そのアミ ノ酸組成や糖鎖付加の相違により異なる分子量を有してもよいが、 好ましくは、 糖鎖付加されていないポリペプチド鎖として約 2 8 . 5 k D a (理論値） の分子 量を有するものが挙げられる。
本発明の Rab蛋白と特異的に相互作用し得る共役性因子は、 上記 Rab蛋白で 詳述したのと同様に、 （1 ) 該蛋白質を産生する組織または細胞を原料として抽 出精製する方法、 （2 ) 化学的に合成する方法または （3 ) 遺伝子組換え技術に より該蛋白質を発現するように操作された細胞から精製する方法等を適宜用いる ことによって取得することができる。
しかしながら、 好ましくは、 該共役性因子は、 対応する Rab 蛋白との相互作 用特性を利用して、 two- hybrid システムと呼ばれる手法により、 それをコード する c D N Aをクローニングし、 得られた c D N Aクローンを含む発現べクタ一 で形質転換した宿主細胞を培養することにより、 得られる培養物から単離精製さ!しる ο
すなわち、 対応する Rab 蛋白をコードする D NAを、 宿主細胞内のレポ一夕 —遺伝子 （例えば、 B—ガラクトシダ一ゼ、 Β—グルクロニダ一ゼ、 ルシフェラ —ゼ等をコードする遺伝子、 並びにカナマイシン、 ハイグロマイシン、 ビアラフ ォス等の薬剤に対する耐性を付与するか、 あるいはヒスチジン合成酵素、 口イシ ン合成酵素等のアミノ酸栄養要求性を相補する遺伝子） の発現を制御する蛋白質 の部分配列との融合蛋白質として発現される形態で含む発現べクタ一と、 共役性 因子を産生する組織または細胞 （例えば、 上述のようにヒト、 マウス、 ラット等 の骨髄細胞あるいは臍帯血由来造血幹細胞から分化させた培養マスト細胞） から 調製した c D Ν Αライブラリ一の各クローンを、 該発現調節蛋白質の他の部分配 列との融合蛋白質として発現される形態で含む発現べクタ一 （但し、 該 2つの部 分配列は、 得られる 2つの融合蛋白質が相互作用する場合にのみ、 該レポ一夕一 遺伝子の発現を制御する機能を回復する） とを宿主細胞に導入して形質転換細胞 を得、 該細胞内で該レポ一夕一遺伝子を高発現する細胞をスクリーニングして、 該細胞に導入された c D N Aクローンを選抜することにより、 所望の共役性因子 をコードする c D NAを得ることができる。 該発現調節蛋白質の部分配列として、 好ましくは転写因子の D N A結合ドメインと活性化ドメインの組み合わせが挙げ られる。 例えば、 宿主細胞として酵母を使用する場合、 酵母由来 GA L 4蛋白質 の: D NA結合ドメインと活性化ドメインを用いることができる。 発現した融合蛋 白質の Rab蛋白領域と共役性因子領域が相互作用すると G A L 4の活性が完全 に回復し、 宿主酵母細胞の上流活性化配列 （U A S ) に結合してレポ一夕一遺伝 子が発現する。 レポーター遺伝子として、 例えばヒスチジン合成酵素を使用した 場合、 ヒスチジン無添加培地で該酵母細胞を培養することにより、 一方のベクタ —が共役性因子をコ一ドする c D N Aを担持するクローンのみがコロ二一を形成 することができる。
D NA結合ドメインとして大腸菌由来の L e x A蛋白質を、 活性化ドメインと して大腸菌の acid blob ドメイン B 4 2を用いることもできる。
このようにして得られたコロニーより共役性因子をコードする D N Aを担持す るプラスミ ドを常法によって調製し、 組み込まれた c D NAの塩基配列をマキサ ム ·ギルバート法やジデォキシ夕一ミネーシヨン法等の公知のシークェンス技術 を用いて決定することができる。
本発明の第 1の Rab蛋白と特異的に相互作用し得る第 1の共役性因子をコー ドする D N Aは、 好ましくは、 配列表配列番号 7に示されるアミノ酸配列、 該ァ ミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、 置換、 挿入、 付加もしく は修飾されたアミノ酸配列、 または該アミノ酸配列のフラグメント （但し、 該変 異ァミノ酸配列または該フラグメントからなる蛋白質は、 単独もしくは該 Rab 蛋白と相互作用してマスト細胞における脱顆粒反応を制御し得る生理活性を有す る） をコードする D N Aである。 より好ましくは、 本発明の第 1の Rab蛋白と 特異的に相互作用し得る第 1の共役性因子をコ一ドする D N Aは、 配列表配列番 号 8に示される塩基配列配列中、 塩基番号 1 8〜 1 0 4で示される塩基配列から なる D NA、 該塩基配列において 1もしくは数個の塩基が欠失、 置換、 掙入もし くは付加された塩基配列を含む D N A、 または該塩基配列からなる D N Aのフラ グメント （但し、 該変異塩基配列または該フラグメントによってコードされる蛋 白質は、 単独もしくは該 Rab蛋白と相互作用してマスト細胞における脱顆粒反 応を制御し得る生理活性を有する） である。 本発明の第 1の Rab蛋白と特異的に相互作用し得る第 2の共役性因子をコ一 ドする D N Aは、 好ましくは、 配列表配列番号 9に示されるアミノ酸配列、 該ァ ミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、 置換、 挿入、 付加もしく は修飾されたアミノ酸配列、 または該アミノ酸配列のフラグメント （但し、 該変 異アミノ酸配列または該フラグメントからなる蛋白質は、 単独もしくは該 Rab 蛋白と相互作用してマスト細胞における脱顆粒反応を制御し得る生理活性を有す る） をコードする D N Aである。 より好ましくは、 本発明の第 1の Rab蛋白と 特異的に相互作用し得る第 2の共役性因子をコ一ドする D NAは、 配列表配列番 号 1 0に示される塩基配列配列中、 塩基番号 1 8〜6 8で示される塩基配列から なる D N A、 該塩基配列において 1もしくは数個の塩基が欠失、 置換、 挿入もし くは付加された塩基配列を含む D N A、 または該塩基配列からなる D NAのフラ グメント （但し、 該変異塩基配列または該フラグメントによってコードされる蛋 白質は、 単独もしくは該 Rab蛋白と相互作用してマスト細胞における脱顆粒反 応を制御し得る生理活性を有する） である。
本発明の第 1の Rab蛋白と特異的に相互作用し得る第 3の共役性因子をコー ドする D N Aは、 好ましくは、 配列表配列番号 1 1に示されるアミノ酸配列、 該 アミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、 置換、 挿入、 付加もし くは修飾されたアミノ酸配列、 または該アミノ酸配列のフラグメント （但し、 該 変異アミノ酸配列または該フラグメントからなる蛋白質は、 単独もしくは該 Rab 蛋白と相互作用してマスト細胞における脱顆粒反応を制御し得る生理活性を有す る） をコードする D N Aである。 より好ましくは、 本発明の第 1の Rab蛋白と 特異的に相互作用し得る第 3の共役性因子をコ一ドする D NAは、 配列表配列番 号 1 2に示される塩基配列配列中、 塩基番号 1 8〜 1 3 3 4で示される塩基配列 からなる D N A、 該塩基配列において 1もしくは数個の塩基が欠失、 置換、 挿入 もしくは付加された塩基配列を含む D NA、 または該塩基配列からなる D NAの フラグメント （但し、 該変異塩基配列または該フラグメントによってコードされ る蛋白質は、 単独もしくは該 Rab蛋白と相互作用してマスト細胞における脱顆 粒反応を制御し得る生理活性を有する） である。
本発明の第 2の Rab蛋白と特異的に相互作用し得る共役性因子をコードする D N Aは、 好ましくは、 配列表配列番号 1 3に示されるアミノ酸配列、 該ァミノ 酸配列において 1もしくは数個のァミノ酸が欠失、 置換、 挿入、 付加もしくは修 飾されたアミノ酸配列、 または該アミノ酸配列のフラグメント （但し、 該変異ァ ミノ酸配列または該フラグメントからなる蛋白質は、 単独もしくは該 Rab蛋白 と相互作用してマスト細胞における脱顆粒反応を制御し得る生理活性を有する） をコードする D N Aである。 より好ましくは、 本発明の第 2の Rab 蛋白と特異 的に相互作用し得る共役性因子をコードする D N Aは、 配列表配列番号 1 4に示 される塩基配列からなる D N A、 該塩基配列において 1もしくは数個の塩基が欠 失、 置換、 挿入もしくは付加された塩基配列、 または該塩基配列からなる D N A のフラグメント （但し、 該変異塩基配列または該フラグメントによってコードさ れる蛋白質は、 単独もしくは該 Hab蛋白と相互作用してマスト細胞における脱 顆粒反応を制御し得る生理活性を有する） である。
本発明の第 1の Rab蛋白と特異的に相互作用し得る第 1〜第 3の共役性因子 をコードする D N Aは、 それそれ配列番号 8、 1 0および 1 2に示される塩基配 列を基にして、 例えば Y.A.Ovchinnikov らの方法 （Gene、 31 卷、 65-78 頁、 1984年） に準じて、 化学的に全合成することもできる。 また、 本発明の第 2の Rab蛋白と特異的に相互作用し得る共役性因子をコードする D NAは、 配列番号 1 4に示される塩基配列を基にして、 同様に化学的に全合成することができる。 本発明はまた、 本発明の Rab蛋白またはそれと特異的に相互作用し得る共役 性因子をコードする D N Aを含む組換えべクタ一を提供する。 本発明の組換えべ ク夕一は原核または真核細胞の各種宿主細胞内で複製保持または自律増殖できる ものであれば特に限定されず、 プラスミドベクターやウィルスベクター等が包含 される。 当該組換えべクタ一は、 簡便には当該技術分野において入手可能な公知 のクローニングベクタ一または発現べクタ一に、 上記の各 DN Aを適当な制限酵 素およびリガーゼ、 あるいは必要に応じてさらにリンカーもしくはアダプター D N Aを用いて連結することにより調製することができる。 このようなベクターと しては、 大腸菌由来のプラスミ ドとして、 例えば pBR322, pBR325, pUC18, pUC19など、 酵母由来プラスミ ドとして、 例えば pSH19, PSH15など、 枯草菌由 来プラスミ ドとして、 例えば pUBllO, pTP5, pC194などが挙げられる。 また、 ウィルスとして、 λファージなどのパクテリオファージゃ、 SV40、 ゥシパピ 口一マウィルス （BPV)等のパポバウィルス、 モロニ一マウス白血病ウィルス (MoMuLV) 等のレトロウイルス、 アデノウイルス （AdV)、 アデノ随伴 ウィルス （AAV)、 ヮクシニヤウィルス、 バキュロウィルスなどの動物および 昆虫のウィルスが例示される。
特に、 本発明は、 目的の宿主細胞内で機能的なプロモー夕一の制御下に Rab 蛋白またはその共役性因子をコードする DN Aが配置された発現べクタ一を提供 する。 使用されるべクタ一としては、 原核または真核細胞の各種宿主細胞内で機 能して、 その下流に配置された遺伝子の転写を制御し得るプロモーター領域 （例 えば宿主が大腸菌の場合、 t rpプロモーター、 lacプロモ一夕一、 lecA プロモ—夕—等、 宿主が枯草菌の場合、 SP01プロモ一夕一、 SP02プロモ 一夕一、 penPプロモー夕一等、 宿主が酵母の場合、 PH05プロモ一夕一、 PGKプロモーター、 GAPプロモ一夕一、 ADHプロモーター等、 宿主が哺乳 動物細胞の場合、 SV40由来初期プロモー夕一、 MoMuLV由来ロング夕一 ミナルリピート、 アデノウイルス由来初期プロモー夕一等のウィルスプロモー夕 ―) と、 該遺伝子の転写終結シグナル、 すなわち夕一ミネ一夕一領域を含有し、 該プロモ一夕一領域と該夕ーミネ一夕一領域とが、 少なくとも 1つの制限酵素認 識部位、 好ましくは該ベクタ一をその箇所のみで切断するユニークな制限部位を 含む配列を介して連結されたものであれば特に制限はないが、 形質転換体選択の ための選択マ一力一遺伝子 （テトラサイクリン、 アンピシリン、 カナマイシン等 の薬剤に対する抵抗性を付与する遺伝子、 栄養要求性変異を相補する遺伝子等） をさらに含有していることが好ましい。 さらに、 挿入される Rab蛋白または共 役性因子をコードする DNAが開始コドンおよび終止コドンを含まない場合には、 開始コドン （ATG)および終止コドン （TAG、 TGA、 TAA) を、 それそ れプロモ一夕一領域の下流および夕一ミネー夕一領域の上流に含むベク夕一が好 ましく使用される。
宿主細胞として細菌を用いる場合、 一般に発現べクタ一は上記のプロモー夕一 領域および夕一ミネ一ター領域に加えて、 宿主細胞内で自律複製し得る複製可能 単位を含む必要がある。 また、 プロモ一夕一領域は、 プロモ一夕一の近傍にオペ レー夕一および Shine- Dalgarno (SD) 配列を包含する。
宿主として酵母、 動物細胞または昆虫細胞を用いる場合、 発現ベクターは、 ェ ンハンサ一配列、 Rab蛋白またはその共役性因子の 5'側および 3'側の非翻訳領 域、 ポリアデ二レ一シヨン部位等をさらに含むことが好ましい。
本発明はまた、 上記の発現べクタ一で宿主細胞を形質転換して得られる形質転 換体を提供する。 本発明で用いられる宿主細胞としては、 前記の発現ベクターに 適合し、 形質転換され得るものであれば特に限定されず、 本発明の技術分野にお いて通常使用される天然の細胞あるいは人工的に樹立された変異細胞または組換 え細胞など種々の細胞 [例えば、 細菌 （大腸菌、 枯草菌、 乳酸菌等） 、 酵母 （サ ッカロマイセス属、 ピキア属、 クリベロマイセス属等） 、 動物細胞 （例えば、 哺 乳動物細胞、 特にヒト、 サル、 マウス、 ラット、 ハムスター等の細胞、 具体的に は、 COP、 L、 C 127、 Sp2/0、 NS— 1、 N I H3 T3等のマウス 由来細胞、 ラット由来細胞、 BHK：、 CHO等のハムス夕一由来細胞、 C0S 1、 COS 3s COS 7 CV1、 Ve r o等のサル由来細胞、 および HeLa、 2 倍体線維芽細胞由来の細胞、 ミエローマ細胞、 Nama lwa等のヒト由来細 胞） または昆虫細胞など] が例示される。 発現ベクターの宿主細胞への導入は従来公知の方法を用いて行うことができる c 例えば、 細菌の場合は、 Cohen らの方法 （Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69， 2110 (1972)) 、 プロ トプラスト法 （Mol. Gen. Genet.， 168, 111 (1979))、 コンビテント法 （J. Mol. Biol., 56, 209 (1971)) 等によって、 酵母の場合は、 Hinnen らの方法 （Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1927 (1978)) 、 リチウ ム法 （J. BacterioL, 153, 163 (1983)) 等によって、 動物細胞の場合は、 Grahamの方法 （Virology, 52， 456 (1973)) 等によって、 また昆虫細胞の場合 は、 Summers らの方法 (Mol. Cell. Biol., 3， 2156-2165 (1983)) 等によって、 それそれ形質転換することができる。
本発明の Rab蛋白またはその共役性因子は、 上記のようにして調製される発 現べクタ—を含む形質転換体を培地中で培養し、 得られる培養物から該蛋白質を 回収することによって製造することができる。
使用される培地は、 宿主細胞 （形質転換体） の生育に必要な炭素源， 無機窒素 源もしくは有機窒素源を含んでいることが好ましい。 炭素源としては、 例えばグ ルコース， デキストラン， 可溶性デンプン， ショ糖などが、 無機窒素源もしくは 有機窒素源としては、 例えばアンモニゥム塩類， 硝酸塩類， アミノ酸， コーンス チープ ' リカ一， ペプトン， カゼイン， 肉エキス， 大豆粕， バレイショ抽出液な どが例示される。 また所望により他の栄養素 〔例えば、 無機塩 （例えば塩化カル シゥム， リン酸二水素ナトリウム， 塩化マグネシウム） ， ビタミン類， 抗生物質 (例えばテトラサイクリン， ネオマイシン， アンピシリン， カナマイシン等） な ど〕 を含んでいてもよい。
培養は当分野において知られている方法により行われる。 下記に宿主細胞に応 じて用いられる具体的な培地および培養条件を例示するが、 本発明における培養 条件はこれらに何ら限定されるものではない。
宿主が細菌， 放線菌， 酵母， 糸状菌等である場合、 例えば上記栄養源を含有す る液体培地が適当である。 好ましくは、 pHが 5〜8である培地である。 宿主が 大腸菌の場合、 好ましい培地として LB培地， M9培地 （Miller. J., Exp. Mol. Genet., p.431, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1972)) 等 が例示される。 培養は、 必要により通気 '攪袢をしながら、 通常 14〜43°Cで 約 3~24時間行うことができる。 宿主が枯草菌の場合、 必要により通気 '攪拌 をしながら、 通常 30〜40°Cで約 16〜96時間行うことができる。 宿主が酵 母の場合、 培地として、 例えば Burkholder最少培地 （Bostian. K.L. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4505 (1980)) が挙げられ、 11は5〜8で あることが望ましい。 培養は通常約 20〜35°Cで約 14〜144時間行なわれ、 必要により通気や攪拌を行うこともできる。
宿主が動物細胞の場合、 培地として、 例えば約 5〜 20 %のゥシ胎仔血清を含 む最少必須培地 （MEM) (Science, 122， 501 (1952)) 、 ダルベッコ改変最 少必須培地 （DMEM) (Virology, 8, 396 (1959))、 RPMI 1640培地 (J. Am. Med. Assoc., 199， 519 (1967)) 、 19 9培地 （Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 73, 1 (1950)) 等を用いることができる。 培地の pHは約 6~8 であるのが好ましく、 培養は通常約 30〜40°Cで約 15~72時間行なわれ、 必要により通気や攪拌を行うこともできる。
宿主が昆虫細胞の場合、 培地として、 例えばゥシ胎仔血清を含む Grace's培 地 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 8404 (1985))等が挙げられ、 その pH は約 5〜8であるのが好ましい。 培養は通常約 20〜40°Cで 15〜100時間 行なわれ、 必要により通気や攪拌を行うこともできる。
Rab蛋白またはその共役性因子の精製は、 培養物を遠心または濾過して細胞を 集め、 これを適当な緩衝液に懸濁し、 例えば超音波処理、 リゾチーム処理、 凍結 融解、 浸透圧ショック、 および/またはトライトン— XI 00等の界面活性剤処 理などにより、 細胞およびオルガネラ膜を破砕 （溶解） した後、 遠心分離や濾過 などによりデブリスを除去して可溶性画分を得、 該可溶性画分を、 上記と同様の 方法で処理することにより単離精製することができる。 組換え蛋白質を迅速且つ簡便に取得する手段として、 該蛋白質のコ一ド配列の ある部分 （好ましくは C末端） に、 金属イオンキレートに吸着し得るアミノ酸配 列 （例えば、 ヒスチジン、 アルギニン、 リジン等の塩基性アミノ酸からなる配列、 好ましくはヒスチジンからなる配列） をコードする D NA配列を、 遺伝子操作に より付加して宿主細胞で発現させ、 該細胞の培養物から、 該金属イオンキレート を固定化した担体とのァフィ二ティ一により所望の組換え蛋白質を分離回収する 方法が好ましく例示される。 金属イオンキレートに吸着し得るアミノ酸配列をコ —ドする D N A配列は、 例えば、 該蛋白質をコードする D NAをクロ一ニングす る過程で、 該蛋白質の C末端アミノ酸配列をコードする塩基配列に該 D N A配列 を連結したハイブリヅドプライマ一を用いて P C R増幅を行ったり、 あるいは該 D NA配列を終止コドンの前に含む発現ベクターに所望の蛋白質をコ一ドする D N Aを読み枠を合わせて （すなわち in frame で） 揷入することにより、 該蛋白 質コード配列に導入することができる。 また、 精製に使用される金属イオンキレ —ト吸着体は、 遷移金属、 例えばコバルト、 銅、 ニッケル、 鉄の二価イオン、 あ るいは鉄、 アルミニウムの三価イオン等、 好ましくはコバルトまたは二ヅケルの 二価イオン含有溶液を、 リガンド、 例えばイミノジ酢酸 （I D A) 基、 二トリ口 トリ酢酸 （N T A) 基、 トリス （カルボキシメチル） エチレンジァミン （T E D ) 基等を付着したマトリヅクスと接触させて該リガンドに結合させることによ り調製される。 キレート吸着体のマトリックス部は通常の不溶性担体であれば特 に限定されない。
あるいは、 Rab 蛋白またはその共役性因子をコードする D NAを、 公知のァフ ィニティーカラムとの特異的親和性を利用して精製することができる公知蛋白質 との融合蛋白質として発現されように調製した発現べクタ一を構築し、 該べク夕 一を導入した形質転換体を培養して該融合蛋白質を産生させ、 適当なァフィニテ ィ一カラムを用いたクロマトグラフィーに付すことによつても、 組換え蛋白質を 迅速且つ簡便に取得することができる。 好ましくは、 例えば、 グル夕チオン Sト ランスフェラーゼ （G S T ) との融合蛋白質として本発明の蛋白質を発現させ、 グル夕チオン一マトリックス吸着体 （例えば、 グル夕チオン一セファロ一スカラ ム） を用いたァフィ二ティ一クロマトグラフィーに付す方法が挙げられる。 この ような G S T融合蛋白質を容易に得ることができるベクターとして、 市販の pGEX4Tl (Pharmacia社製） 等を使用することができる。
本発明はまた、 本発明の Rab 蛋白またはその共役性因子に特異的親和性を有 する抗体を提供する。 該抗体は、 ポリクロ一ナル抗体、 モノクロ一ナル抗体のい ずれであってもよく、 周知の免疫学的手法により作製することができる。
例えば、 ポリクロ一ナル抗体は、 Rab蛋白またはその共役性因子、 あるいはそ れらの断片 （必要に応じて、 ゥシ血清アルブミン、 K L H (Keyhole Limpet Hemocyanin) 等のキャリア蛋白質に架橋した複合体とすることもできる） を抗 原として、 市販のアジュバント （例えば、 完全または不完全フロイントアジュバ ント） とともに、 動物の皮下あるいは腹腔内に 2〜3週間おきに 2〜4回程度投 与し （部分採血した血清の抗体価を公知の抗原抗体反応により測定し、 その上昇 を確認しておく） 、 最終免疫から約 3〜1 0日後に全血を採取して抗血清を精製 することにより取得できる。 抗原を投与する動物としては、 ラット、 マウス、 ゥ サギ、 ャギ、 モルモット、 ハムス夕一などの哺乳動物が挙げられる。
また、 モノクローナル抗体は、 細胞融合法 （例えば、 渡邊武、 細胞融合法の原 理とモノクローナル抗体の作成、 2-14 頁、 モノクローナル抗体とがん一基礎と 臨床一、 谷内昭、 高橋利忠編、 サンエンスフォーラム出版、 1985 年） により作 成することができる。 例えば、 マウスに該因子を市販のアジュバントと共に 2〜 4回皮下あるいは腹腔内に投与し、 最終投与の 3日後に脾臓あるいはリンパ節を 採取し、 白血球を採取する。 この白血球と骨髄腫細胞 （例えば、 NS-1， P3X63Ag8 など） を細胞融合して該因子に対するモノクローナル抗体を産生する ハイプリ ドーマを得る。 細胞融合は P E G法 （R.D.Lane、 J. Immunol. Methods. 81巻 2号、 223-228頁、 1985年) でも電圧パルス法 （U.Karstenら、 Hybridoma, 7卷 6号、 627- 633頁、 1988年） であってもよい。 所望のモノクローナル抗体を 産生するハイプリドーマは、 周知の E I Aまたは R I A法等を用いて抗原と特異 的に結合する抗体を、 培養上清中から検出することにより選択できる。 モノクロ —ナル抗体を産生するハイプリドーマの培養は、 インビトロ、 またはマウスもし くはラヅト、 このましくはマウス腹水中等のインビボで行うことができ、 抗体は それそれハイプリドーマの培養上清および動物の腹水から取得することができる。 本発明はまた、 上記のようにして得られる抗体を用いた、 検体中の本発明の Rab蛋白またはその共役因子の測定方法、 並びにそのための測定用試薬を提供す る。 当該測定方法は、 本発明の抗体との特異的な抗原抗体反応を利用したもので ある限り、 公知のいかなる原理を使用したものであってもよい。例えば、 上記の ようにして得られるポリクローナル抗体またはモノク口一ナル抗体を常法により 固相化し、 これに検体を接触させて抗原抗体複合体を形成させ、 液相を分離した 後、 酵素、 蛍光物質、 放射性同位元素等で標識した第二の抗体をさらに接触させ てサンドィツチ複合体を形成させ、 該固相上の標識量を測定する方法等が挙げら れる。 本発明の抗原測定試薬は、 測定対象抗原に対する本発明の抗体を含有して なるものであれば特に制限はない。
本発明の Rab蛋白とその共役性因子は、 相互作用してマスト細胞における脱 顆粒反応を制御する生理活性を有する。 また、 両因子は、 外因的にマスト細胞に 供給されると、 それそれ単独で脱顆粒反応を抑制的に制御し得る。 さらに、 Rab 蛋白質は G T P結合性蛋白質であるから、 G T P/G D P結合能を有し、 自らの G T P a s e活性による変換反応とリンクしてその生理活性を発揮していると考 えられる。 したがって、 （ 1 ) マスト細胞における本発明の Rab蛋白および/ またはその共役性因子の発現を阻害し得る物質、 （2 ) Rab蛋白の G T P結合能 を阻害し得る物質、 （3 ) G T P結合 Rab蛋白の G T P a s e活性を阻害し得 る物質および （4 ) Rab蛋白とその共役性因子との特異的相互作用 （すなわち結 合） を阻害し得る物質は、 結果的にマスト細胞での脱顆粒反応を阻害することが でき、 ひいては、 該脱顆粒反応が関与する各種疾患、 特に、 アレルギー性鼻炎、 アレルギー性結膜炎、 アレルギー性喘息、 アトピー性皮膚炎、 即時型食物アレル ギーなどに対する治療薬として有用である。
上記 （ 1 ) 型の阻害物質として、 例えば、 本発明の Rab 蛋白またはその共役 性因子をコードする mR N Aの一部または全部に相補的な塩基配列を有するヌク レオチド、 すなわちアンチセンスヌクレオチド、 あるいはそのようなアンチセン ス R N Aを発現するように遺伝子操作された発現ベクターが例示されるが、 それ らに限定されない。
上記 （2 ) 型の阻害物質としては、 例えば、 外因的に供給される本発明の Rab 蛋白あるいは Rab蛋白に特異的親和性.を有する抗体などが考えられるが、 それ らに限定されず、 自体公知または新規な低分子化合物などであっても差し支えな い。
上記 （4 ) 型の阻害物質としては、 例えば、 外因的に供給される本発明の Rab 蛋白または共役性因子自体、 あるいは Rab蛋白または共役性因子に特異的親和 性を有する抗体などが考えられるが、 それらに限定されず、 自体公知または新規 な低分子化合物などであっても差し支えない。
本発明はまた、 本発明の Rab蛋白とその共役性因子との相互作用を阻害し得 る物質、 すなわち、 マスト細胞での脱顆粒反応を阻害し得る上記 （4 ) 型の物質 のスクリーニング法を提供する。
当該スクリーニング法は、 本発明の共役性因子をコードする c D N Aをクロー ニングする好ましい一実施態様において調製された、 two-hybrid法を用いた形 質転換体の使用を含む。 すなわち、 当該方法は、 本発明の Rab蛋白をコードす る D NAを、 宿主細胞内のレポ一夕一遺伝子の発現を制御する蛋白質の部分配列 との融合蛋白質として発現される形態で含む発現ベクターと、 それに対応する本 発明の共役性因子をコードする D NAを、 該蛋白質の他の部分配列との融合蛋白 質として発現される形態で含む発現べクタ一 （但し、 該 2つの部分配列は、 得ら れる 2つの融合蛋白質が相互作用する場合にのみ、 該レポ一夕一遺伝子の発現を 制御する機能を回復する） とを宿主細胞に導入して得られる形質転換体を、 試験 物質の存在下および非存在下に培地中でそれそれ培養し、 該細胞内での該レポー 夕一遺伝子の発現を比較することを含む。 用いられるレポ一夕一遺伝子、 発現調 節蛋白質の各部分配列、 宿主細胞等は、 上記と同様である。 試験物質が Rab蛋 白とその共役性因子との相互作用を阻害する活性を有していれば、 試験物質の存 在下では非存在下に比べてレポーター遺伝子の発現が有意に阻害される。 例えば、 レポ一夕一遺伝子としてヒスチジン合成酵素を用いた場合、 Rab蛋白とその共役 性因子との相互作用を阻害する物質は、 ヒスチジン無添加培地での該形質転換体 の増殖を有意に阻害する。
本発明はまた、 上記のスクリーニング法により得られる、 本発明の Rab蛋白 とその共役性因子との相互作用を阻害し得る物質、 すなわち、 マスト細胞での脱 顆粒反応を阻害し得る物質を提供する。 このような阻害物質の一例としては、 式 [ I ] もしくは式 [II] に示される一般式で示される化合物が挙げられる。
Figure imgf000035_0001
(式中、 R1は水素原子または炭素数 1〜 4の直鎖もしくは分枝鎖アルキル基を、 Xは水素原子、 炭素数 1〜4の直鎖もしくは分枝鎖アルキル基、 ヒドロキシ基ま たはフエ二ル基を表す。 ）
Figure imgf000036_0001
(式中、 R2は水素原子またはニトロ基を、 Yはハロゲン原子、 炭素数 1〜4の 直鎖もしくは分枝鎖アルキル基またはヒドロキシ基を表す。 ）
好ましくは、 本発明の Rab 蛋白とその共役性因子との相互作用を阻害し得る 物質として、 アセトン- 4- (4-フエニル）フエニル- 1, 3-チアゾ一ル- 2-ィル-ヒド ラゾン、 4-メチルペン夕ノン- 4-フエニル- 1, 3-チアゾ一ル- 2-ィル -ヒドラゾン、 2—ブ夕ノン- 4-フエニル -1, 3-チアゾール -2-ィル -ヒドラゾン、 5—二トロ一 2—フルアルデヒド一 2—ブロムペンゾィルヒドラゾン等が挙げられるが、 それ らに限定されるものではなく、 上記スクリーニング法により得られる限りいかな る物質であってもよい。
これらの化合物は、 マスト細胞における脱顆粒反応が関与する各種疾患、 特に、 アレルギー性鼻炎、 アレルギー性結膜炎、 アレルギー性喘息、 ァ小ピ一性皮膚炎、 即時型食物アレルギーなどに対する治療薬として使用することができる。 したが つて、 本発明はまた、 該化合物を有効成分とする抗アレルギー剤を提供する。
本発明の抗アレルギ一剤は、 上記のスクリーニング法により得られる阻害物質 を、 錠剤、 カプセル剤などの剤形で経口的に、 あるいは薬学的に許容できる液と の溶液、 または懸濁液剤などの注射剤、 吸入剤、 点眼剤あるいは塗布剤の形で非 経口的に投与され得る。 例えば、 該化合物と医薬上許容される担体、 香味料、 賦 形剤、 安定剤などを混和することにより経口投与用製剤とすることができる。 こ のようにして得られる製剤は、 例えばヒトをはじめとする哺乳動物に対して投与 することができる。 投与量は、 患者の体重、 年齢、 薬剤受容性、 および病気の種 類、 進行度等によって異なるが、 例えば経口投与の場合、 成人 1日あたり約 0.01-lOOmgs 好ましくは約 0.1-50mgである。
本発明はまた、 本発明の Rab蛋白の G T P結合能を阻害し得る物質、 すなわ ち、 マスト細胞における脱顆粒反応を阻害し得る、 上記 （2 ) 型の物質のスクリ —ニング法を提供する。
当該方法は、 試験物質の存在下および非存在下に、 該 Rab蛋白に G T Pを結 合させることを特徴とする限り、 その具体的な態様は特に限定されない。 例えば、 該 Rab蛋白を標識した G T Pと接触させ、 Rab蛋白に G T Pが結合する反応系に 試験物質を添加して、 Rab蛋白に結合した標識量の減少を調べる方法が挙げられ る。
本発明はまた、 本発明の Rab蛋白の G T P結合能およびノまたは該 Rab蛋白 とその共役性因子との相互作用を阻害し得る物質、 すなわち、 マスト細胞におけ る脱顆粒反応を阻害し得る、 上記 （2 ) または （4 ) 型の物質のスクリーニング 法を提供する。
当該方法は、 試験物質の存在下および非存在下に以下の工程：
( 1 ) 本発明の Rab蛋白とそれに対応する共役性因子とを接触させて複合体を形 成させる工程
(2) 該 Rab蛋白に G T Pを結合させる工程 （工程（1 )および (2)の順序は逆であ つてもよいし、 同時であってもよい）
(3) G T Pを結合した該 Rab蛋白と該共役性因子との複合体を測定する工程 (但し、 Rab蛋白、 共役性因子または G T Pのいずれかの成分は酵素、 蛍光物質、 発光物質、 放射性同位元素等で標識されている）
を実施することを特徴とする限り、 その具体的な態様は特に限定されない。 例えば、 共役性因子を周知の方法 （例えば、 ピオチン一アビジンの特異的結合 等） を用いて固相化し、 一方で対応する Rab 蛋白を標識した G T Pと接触させ て複合体を形成させ、 該複合体を該共役性因子を結合した固相に接触させて標識 化 G T P—Rab蛋白一固相化共役性因子からなる複合体を形成させる反応系に、 試験物質を添加して固相上に捕捉される標識量の減少を調べる方法が挙げられる c 本発明はまた、 上記のスクリーニング法により得られる、 本発明の Rab 蛋白 の G T P結合能および/または該 Rab蛋白とその共役性因子との相互作用を阻 害し得る物質、 すなわち、 マスト細胞での脱顆粒反応を阻害し得る物質を提供す る。 このような物質は、 マスト細胞における脱顆粒反応が関与する各種疾患、 特 に、 アレルギー性鼻炎、 アレルギー性結膜炎、 アレルギー性喘息、 アトピー性皮 膚炎、 即時型食物アレルギーなどに対する治療薬として使用することができる。 したがって、 本発明はまた、 該化合物を有効成分とする抗アレルギー剤を提供す る。
上記め無細胞系を用いたスクリーニング法により得られる阻害物質を有効成分 とする本発明の抗アレルギー剤は、 two- hybrid システムを用いたスクリ一ニン グ法により得られる上記抗ァレルギ一剤と同様の方法により製剤化され、 同様の 方法によってヒトをはじめとする哺乳動物に投与することができる。
以下に実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、 これらは単なる例示で あって、 本発明の範囲を何ら限定するものではない。 実施例 1 マウス由来 Rab蛋白 c D NAのクローニング
( 1 ) マウス骨髄由来マスト細胞からの全 R N Aの調製
T. Nakanoら （J. Exp. Med. 162卷、 1025-1043頁、 1987年） により報告さ れた方法に準じてマウス骨髄由来マスト細胞 （B MM C ) を調製した。 BALB/c マウスの大腿骨より骨髄細胞を採取し、 一定数の細胞を培養ブラスティックディ ッシュを用い、 1 0 %牛胎児血清を含む R P M I培養液 （10%FBS- RPMI という） 中に浮遊させ、 更に WEHI- 3細胞の培養上清液を 10〜20%濃度で添加して、 5%濃度の炭酸ガスを含む空気中、 37°Cにて培養を行った。 1 週間毎に新鮮な 培養液に入れ替え、 細胞濃度を一定に調整して培養を継続することにより、 培養 4週目以降にはほぼ均一な B MM Cが得られた。 この B MM Cから R N A調製用 試薬 IS0GEN (二ツボンジーン社製品） を用い、 添付のプロトコ一ルに従い、 全 RNAを調製した。
(2) RT-P C
(1) で調製した全 RNAから cDNA合成試薬キヅト （Pharmacia Biotech 社製） を用いて cDNAを作製した。 この cDNAを錶型 DNAとし、 以下の I および II の二種類の DNAをプライマ一とした PCR法により目的の遺伝子を 増幅し、 単離した。
I ： 5， -GGG(G/A)(G/A)(G/C)AGC(G/A)(G/A)CGTGGG(G/C)AA(G/A)(A/T)C-3'
(配列番号 15 )
11 : 5， -TTC(T/C)TGICC(A/T)GCIGT(G/A)TCCCA-3' (配列番号 16 )
(但し、 Iはイノシンを示す）
P CR法は Takara Taq (TAKARA社製） に添付の試薬を用い、 GeneAmp PCR system 9600 (Perkin Elmer社製） を用いて、 下記の反応条件で行った。
変性： 94°C、 1分間
ァニ一リング： 50°C；、 2分間
伸長： 72°C、 0. 5分間
30サイクル
(3) クローニング
(2) で得られた RT— PC R産物を 2%ァガロース電気泳動し、 約 15 Ob pの DNA断片を GeneElute AGAROSE SPIN COLUMN (Pharmacia Biotech社製） を用いて回収した。 この DNA断片を DNAライゲ一シヨンキット （TAKARA社 製） を用いてプラスミドベクター pT7BlueT (fiovagen社製） の T Aクローニング サイ トに挿入して組み込んだ。 この組換え産物を大腸菌 JM109株 （TAKMA社 製） に導入後、 アンピシリン含有 L B寒天培地で培養を行い、 アンピシリン耐性 の形質転換株の数百クローンを一次選択として単離した。
( 4 ) 遺伝子配列決定
上記の一次選択した数百クローンの中から約 5 0クローンのプラスミド D NA を QIAGEN plasmid kit (QIAGEN社製） を用いて調製した。 得られたプラスミド D N Aを錡型とし、 M13 primer M4および RV (TAKARA社製） をプライマ一とし て ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit (Perkin Elmer 社製） を用いたシークェンス反応を、 添付文書に従って GeneAmp PCR system 9600 (Perkin Elmer社製） で行った後、 この反応産物を ABI PRISM 377 DNA sequencer (Perkin Elmer社製） で分析した。得られた塩基配列を遺伝子情 報処理ソフト GENETYX (ソフトウヱァ開発社製） で解析した結果、 新規の塩基配 列を有する 1 2 0 b pの二種類の D N A (mG#A-DNAおよび mG#B-DNA) が得られ た。 なお、 既知の Hab 蛋白または低分子 G蛋白質をコードする D N A ( 8種 類） も検出された。
( 5 ) ノザンプロヅ トによる発現解析
( 4 ) で得られた mG#A- MAおよび mG#B-DNA、 並びに既知の rab5Cの約 1 5 0 b pの遺伝子配列をプローブに使用して、 ノザンプロヅトによってマウスの各種 臓器 （脳、 腎臓、 脾臓、 肝臓、 B MM C ) での mR N Aの発現を調べた。
各臓器由来の全 R NAは IS0GEN (二ツボンジーン社製） を用いて調製した。 得られた全 R N Aは常法 （文献： Current Protocols in Molecular biology、 1 卷、 2.5、 F. M. Ausubel ら編、 Wiley Interscience 出版） に従って、 2 Ομ ^ をァガロース電気泳動し、 ナイロン膜 （BioRad社製） にトランスファ一した。 mG#A-DNAおよび mG#B-DNA、 並びに rab5C の約 1 5 0 b pの部分遺伝子配列を BcaBEST Labeling kit (TAKARA社製） を用いて 32Pで標識し、 プローブとして 用いた。 ナイロン膜上に固定した各臓器由来の全 R NAと 32P標識プローブを、 lmM EDTA、 7% 303ぉょび0. 05mg/ml サケ精子 DN Aを含 む 250πιΜ リン酸緩衝液（pH 7. 2)中にて、 65 °Cでハイブリダィズさせ、 1 mM ED T Aおよび 5% SDSを含む 4 OmM リン酸緩衝液 （pH7. 2) にて 65 °Cで 2回洗浄後、 さらに： L mM E D T Aおよび 1 % S D Sを含 む 4 OmM リン酸緩衝液 pH 7. 2にて 65 °Cで 2回洗浄した後、 乾燥させた。 膜上の RNAと結合した 32P標識プローブを直接撮影用 X腺フィルム （富士フィ ルム社製品） で 10日間ォ一トラジォグラフィ一することにより検出した。
その結果、 rab5Cの mRN Aは全ての臓器で発現が検出されたのに対して、 mG#A-DNAおよび mG#B-MAの配列を含む mR N Aはマスト細胞にのみ特異的に発 現されていた。
(6)全長 cDNAのクロ一ニング
マウス B MM Cから mR NA調整用試薬キッ ト （ QuickPrep RNA Purification kit； Pharmacia Biotech社製） を用いて mRN Aを調製した。 この mRNAから cDNA合成試薬キッ ト （TimeSaver cDNA Synthesis kit： Pharmacia Biotech社製） を用いて EcoRIアダプタ一が付加された c D N Aを合成した。 この cDNAを DNAライゲ一シヨンキット （TAKARA社製） を 用いて、 ラムダファージベクタ一 Xgtllの EcoRIサイトに組み込んだ。 このぺク 夕一に組み込んだ cDN Aを in vitroパヅケ一ジングキヅト （GIGAPACK II； STRATAGENE社製） を用いてファージ粒子とし、 マスト細胞由来のラムダファ一 ジライブラリ一を作成した。 このライブラリ一から上記の mG#A-DNAおよび mG#B-DNAの部分配列をプロ一ブにして常法 （文献： Current Protocols in Molecular biology^ 1卷、 6.1-6.3S F. M. Ausubelら編、 iley Interscience 出版） に従ってプラークハイプリダイゼーシヨンを行い、 得られた mG#A- DNAお よび mG#B-DNAの全長 c D NAを含むファージクロ一ンを得た。 得られたクロー ンを pUC18の EcoRIサイ トに組み込み、 その塩基配列を決定した。 mG#A- DNAお よび mG#B-DNAに相当する全長の DNAを、 それそれ mG#101- DNA (配列番号 2) および mG#102-DNA (配列番号 5) と命名した.。 実施例 2 ： ヒト由来 Rab蛋白 cDNAのクロ一ニング
( 1) PCR
ヒト小腸由来 cDNA (Clontech社製品） をテンプレートに使用し、 mG#101 および mG#102 の cDNAをもとに設計した合成 DNA (以下に配列を示す） を ブラィマーに使用して： C Rを行った。
#101pl： 5， -GCGMTTCATGCTTCTTGGAGACTCGGGCGTCGG-3' (配列番号 1 Ί )
#101p2： 5' -GCGAATTCTCACACAAAGGAGCAGCAGCTGGAGCG-35 (配列番号 18 )
#102pl： 5， -GCGAATTCATGCAGACACCTCACAAGGAGCACCT-3' (配列番号 19 )
#102p2： 5' -GCGAATTCCTAGGATTTGGCACAGCCAGAGCAGCT-3' (配列番号 20 ) なお、 PCRは Takara Taq (TAKARA社製） に添付の試薬を用い、 GeneAmp PCR system 9600 (Perkin Elmer社製） で以下の条件にて行った。
変性： 94°C 30秒
ァニ一リング： 50°C 15秒
伸長： 72°C 40秒
35サイクル
(2) サブクロ一ニング
( 1) で得られた PC R産物を制限酵素 EcoRI で消化後、 目的のバンドをァ ガロース電気泳動により精製し、 DNAライゲ一シヨンキット （TAKARA社製） を使用してプラスミドベクタ一 pUC18 にサブクローニングした。 得られたクロ一 ンの遺伝子塩基配列は実施例 1と同様に決定し、 mG#101 に対して hG#101 (配列 番号 3)、 mG#102に対して hG#102 (配列番号 6) の塩基配列を得た。 実施例 3 ：マウス由来 Rab蛋白に特異的な共役性因子 （標的分子） のクロー二 ング
本実施例は、 基本的に Clontech社の添付文書の手順に従って実験を行った。
(1) Two-Hybrid System用プラスミドライブラリーの作製
MATCHMAKER Two-Hybrid System 2 (Clontech社製） のプラスミ ドベクタ一
PACT2に、 実施例 1と同様にしてマウス BMMCから作製した EcoMアダプター 付 cDNAをライゲ一シヨンすることによって、 Two- Hybrid System用マウス B MMC cDNAライブラリ一を作製した。
(2)バイト発現用プラスミ ドの作製
MATCHMAKER Two-Hybrid System 2 (Clontech社製） のプラスミ ドベクタ一
PAS2-1の EcoRI サイ卜に、 実施例 2で使用したプライマ一を用いた P CRによ つて、 両端に EcoRIサイトを付加した mG#101あるいは mG#102の全長 cDNA を組み込むことにより、 バイ ト （bait) 発現用プラスミ ド （それに結合する蛋 白質を探したい蛋白質をコードする遺伝子を組み込んだプラスミド） を作製した (3)共役性因子のクロ一ニング
Two-Hybrid System用の酵母株であるサッカロマイセス 'セレヴイシェ CG1945株に対し、 バイ 卜発現用プラスミ ドとプラスミドライブラリーを同時に 形質転換して、 mG#101または mG#102依存的にヒスチジン欠損培地で生育可能な 形質転換体を単離した。 単離した形質転換体からプラスミ ドを回収することで pACT2 ベクタ一に挿入された mA#1014 (配列番号 8) 、 mA#1015 (配列番号 1 0)、 mA#1016 (配列番号 12)および mA#10283 (配列番号 14)の cDNAを 得た。得られたクローンの遺伝子配列は実施例 1と同様にして決定した。 実施例 4：組換えマウス )蛋白の調製
本実施例は、 基本的に Pharmacia Biotech社の添付文書の手順に従って実験 を TTつた。 (1)発現べクタ一の構築
GST Gene Fusion System (Pharmacia Biotech社製） のプラスミ ドベクタ一 PGEX4T1 の EcoRI サイ トに実施例 3で作製したバイ ト発現用プラスミ ドから EcoRIで切り出した mG#101あるいは mG#102の c DNAを組込むことにより、 G STとの融合蛋白質を発現するプラスミドを得た。
(2)大腸菌での発現
大腸菌 JM109株に発現プラスミドを形質転換して組換え大腸菌を得た。 得ら れた組換え大腸菌を 2YT培地 （1 Og/L 酵母エキス、 16 g/L トリプ トン、 5 g/L NaC 1) で培養し、 対数増殖期後期に 0. 1 mM I PTG で組換え蛋白質を発現誘導した。 発現誘導後 4時間培養を継続して菌体内に組換 え蛋白質を蓄積させた後、 組換え大腸菌を遠心分離によって集菌した。
(3)組換え蛋白質の精製
集菌した組換え大腸菌をリン酸緩衝生理食塩液 （PBS) で懸濁し、 この懸濁 液を超音波破砕装置 （T0MY社製） にかけて組換え大腸菌を破砕した。 遠心分離 によってこの破砕液を可溶性の上清と不溶性の沈殿に分離し、 上清を GST Gene Fusion System (Pharmacia Biotech社製） のグル夕チオンセファロ一スと懸濁 し放置した。 遠心分離によって懸濁液からグル夕チオンセファロ一スを回収し P B Sで洗浄した。 洗浄したグル夕チオンセファロ一スをトロンビン溶液 （Rab蛋 白と G S Tの融合部位に導入された特異的ァミノ酸配列を認識切断する） で懸濁 放置することで、 GST融合蛋白質としてグルタチオンセファロ一スに結合して いた目的 Rab蛋白を GS T部分から切除し、 グル夕チオンセファロースから遊 離させた。 遠心分離によってグル夕チオンセファロ一スと目的 Rab蛋白溶液を 分離し、 さらに目的 Rab蛋白溶液をへパリンカラムにかけてトロンビンを除去 し、 mG#101蛋白質 （配列番号 1 ；但し、 アミノ酸番号 45、 115、 138、 165および 167で示されるアミノ酸は、 それそれ Ala、 Val、 Met, Argおよ び Proである） および mG#102蛋白質 （配列番号 4；但し、 アミノ酸番号 113、 185、 192、 200および 203で示されるアミノ酸は、 それそれ Thr、 Leu、 Ile、 Proおよび Valである） を得た。 実施例 5 組換え Rab蛋白の特性解析
(1) GTP結合能
本実施例は、 基本的に貝淵ら （Methods in Enzymology、 257卷， 67- 68頁、 1995年） の方法で行った。 すなわち、 mG#101あるいは mG#102組換え蛋白質と、 G T P [γ35 S ]とを、 非標識 G T Pの存在または非存在下で混合して 2時間放置 した。 この混合液をドットプロッタ一 （BioRad社製） を用いてニトロセル口一 ス膜にドットプロットすることで 分離した。 この膜をべ一夕線カウン夕一 Matrix96 (Packard社製） で測定することで mG#101あるいは mG#102組換え蛋白 質が G T Pを特異的に結合することを確認した。
( 2 )脱顆粒反応への影響
組換え蛋白質を BMMCのジギトニン脱顆粒反応系に添加して影響を調べた。 B MM Cを以下の組成のバヅファーで 2回洗い、 2x106細胞/ mlの懸濁状 態にして、 96穴 U底プレートに 0. 05mlZゥエルずつ分注した。 次に、 mG#101あるいは mG#102組換え蛋白質 （0. 05ml/ゥエル） を添加した。 さ らに、 4. 5μΜ ジギトニンを 0. 05ml/ゥエルずつ加え、 室温で 5分間 放置した。 その後 4mM CaCl2を 0. 05 m 1 ゥエルずつ加えて、 室温で 10分間放置した。 放置後、 上清に遊離したヒスタミン濃度をヒスタミン RI A キット （栄研） で測定した。
バヅファー組成：
2 OmM HEPE S-NaOH (pH7. 0)
133mM NaC 1
5 mM K C 1
0. 9mM NaH2P04 8 mM グルコ一ス
0 . 1 % B S A (脱イオン処理済）
その結果、 mG#101および mG#102組換え蛋白質は、 いずれも濃度依存的に脱顆 粒反応を阻害した。 実施例 6 ： mA#10283組換え蛋白質の調製および特性解析
( 1 ) 発現べクタ一の構築
GST Gene Fusion System (Pharmacia Biotech社製） のプラスミ ドベクタ一 PGEX4T1の EcoRIサイトに、 実施例 3で得た pACT2ベクタ一上の mA#10283の c D N Aを EcoRIで切り出して組込むことにより、 G S Tと mA#10283の融合蛋白 質発現べクタ一を得た。
( 2 ) 大腸菌での発現
大腸菌 JM109 に発現べクタ一を形質転換して組み換え大腸菌を得た。 得られ た組換え大腸菌を 2 Y T培地で培養し、 対数増殖期後期に I P T Gで組換え蛋白 質を発現誘導した。 発現誘導後培養を継続し、 菌体内に組み換え蛋白質を蓄積し た大腸菌を遠心分離によって集菌した。
( 3 ) 組換え蛋白質の精製
集菌した組換え大腸菌を P B Sで懸濁し、 この懸濁液を超音波破砕装置にかけ て組換え大腸菌を破砕した。 遠心分離によってこの破砕液を可溶性の上清と不溶 性の沈殿に分離し、 上清をグル夕チオンセファロ一スと懸濁放置した。 遠心分離 によって懸濁液からグル夕チオンセファロ一スを回収し P B Sで洗浄した。 洗浄 したグル夕チオンセファロ一スを還元型グル夕チオン溶液で懸濁放置し、 グル夕 チオンセファロースに結合していた、 G S Tと mA#10283 (配列番号 1 3 ) の融 合蛋白質を溶出した。 溶出液を透析することで目的蛋白質からグル夕チオンを除 去した。
( 4 ) 組換え蛋白質の脱顆粒反応への影響 組換え蛋白質をジギトニン脱顆粒反応系 （実施例 5参照） に添加して影響を調 ベたところ、 G S T融合 mA#10283組換え蛋白質は濃度依存的に脱顆粒反応を阻 害した。 実施例 7 ： mG#102と mA#10283の相互作用に与える試験物質の影響を測定する系 ( I )
PAS2-1ベクターに mG#102、 pACT2ベクタ一に mA#10283を組み込んだ 2つの発 現ベクターを、 S . セレヴイシェ CG1945株に導入して得られた組換え酵母 # 1 0 2株 （実施例 3参照） 、 さらに対照用に MATCHMAKER Two-Hybrid System 2の ポジティブコント口一ル用プラスミ ド （pVA3-l,pTDl- 1) を導入した組換え酵母 V T株を作製した。 ヒスチジン添加 S D培地で 3 0 °C振とう培養を一晩行うこと で飽和状態に達した # 1 0 2株および V T株の培養液を新たなヒスチジン欠損 S D培地 （ I mM 3—A T含有） で 2 0 0倍に希釈し、 9 6穴プレートに 0 . 0 9 m lノウヱルずつ分注した。 各ゥエルに影響を調べたい化合物の P B S溶液を、 1 0 0 %コントロールのゥエルには P B Sを、 0 %コントロールのゥエルには 1 M 3— A T含有 P B S溶液をそれそれ 0 . 0 1 m l /ゥエル容量で加え、 プレ 一トシエ一力一 MicroMixer E-36 (TAITEC社製） で混合した。 次に、 3 0 °Cにて 静置培養を 1 8〜2 0時間行った後、 プレートシヱ一カーで培養液を懸濁し、 9 6穴プレート用吸光度計 Multiskan BICHROMATIC (Labsystems 社製） で濁度 ( 5 9 0 nmでの吸光度） を測定した。 測定した濁度のデ一夕は 1 0 0 %および 0 %コントロールの濁度データをもとに％コントロールに換算して評価した。 ま た # 1 0 2株と V T株で共通した影響が現れた場合は、 mG#102と mA#10283の相 互作用に対する影響ではなく、 two-hybrid システムに対する非特異的影響と見 なした。
その結果、 それぞれの組換え酵母株がヒスチジン欠損 S D培地でレポ一夕一遺 伝子 （ヒスチジン合成酵素） 依存的に増殖するヒスチジン合成酵素阻害薬 （3— ァミノ— 1, 2, 4—トリァゾ一ル： 3—AT) の濃度は 1〜； L OmMの範囲で あり、 10 OmM 3— ATではどちらの組換え酵母株も増殖できなかった。 実施例 8 ： mG#102と mA#10283の相互作用に与える試験物質の影響を測定する系 (II)
実施例 6で作製した組換え mA#10283蛋白質の N末端を、 ビォチン標識試薬 EZ-Link-Sulfo-NHS-LC-Biotin (Pierce社製） を用いて試薬の添付文書通りに ピオチン化した。
次に、 実施例 4で作製した組換え mG#102と GTP[Y 35S]をそれそれ 0. 02 mgZm 1と 30 nMとなるように混合し、 2時間放置することで組換え mG#102 を活性化および放射性同位元素 （RI)標識した。 この RI標識 mG#102 蛋白 0. 1mlと 0. 02mg/mlのビォチン標識 mA#10283蛋白 0. lml、 さらに、 影響を調べたい化合物のァヅセィ用バッファ一溶液 0. 02mlとを混 合して 2時間放置した。 次に上記混合液をストレプトアビジンコートフラッシュ プレート （NEN社製） に 0. 1ml/ゥヱルで移し、 1時間放置した。 放置後、 フラッシュプレートから混合液を除去し、 洗浄用バッファ一で各ゥエルを 1回洗 浄した後、 プレート用シンチレ一シヨンカウン夕一 （トップカウント ：パッカ一 ド社製） で結合した放射活性を測定した。 0%コントロールはビォチン標識 mA#10283の代わりにピオチン標識 G S Tを加えたゥエル、 100%コント口一 ルは化合物溶液の代わりにバッファーを加えたゥヱルをそれそれ用いた。
ァヅセィ用バッファ一組成：
2 OmM HEPE S-NaOH (pH7. 5)
5mM MgC 12
ImM DTT
0. 1% BSA
洗浄用バッファ一組成： 20mM HEPES-NaOH (pH7. 5)
2 OmM MgC 12 実施例 9： mG#102と mA#10283の相互作用を阻害する化合物のスクリーニング 実施例 7で示した系を用いて、 96穴プレートに # 102株酵母菌あるいはコ ントロールの VT株酵母菌を 0. 09 mlずつ各ゥエルに入れ、 更に mG#102 と mA#10283の相互作用に影響を与えるか否か未知である特定の化合物の P B S溶 液を 0. 01mlずつ添加し、 18〜20時間 30°Cにて培養した。 その後、 プ レートシヱ一力一で培養液を懸濁し、 96穴プレート用吸光度計で濁度 （590 nmでの吸光度） を測定した。 化合物を含まない PB S溶液を添加したゥヱルの 濁度を 100%コントロールとし、 化合物の代わりに 3— AT (最終濃度 100 mM) を含む PB S溶液を添加したゥヱルの濁度を 0%コントロールとして、 化 合物の効果を％換算で評価した。 表 1 に示すように、 アセトン- 4-(4-フヱニル） フエニル -1, 3-チアゾ一ル- 2-ィル-ヒドラゾン （式 [III] ) および 5—ニトロ 一 2—フルアルデヒド— 2—ブロムベンゾィルヒドラゾン （式 [IV] ) は用量 依存的に # 1022株を特異的に抑制した。
表 1
化合物の #102株増殖抑制活性
Figure imgf000050_0002
Figure imgf000050_0001
Br、
N一 NH [IV] 実施例 10 mG#102と mA#10283の相互作用を阻害する化合物のスクリーニング により得られた化合物のマスト細胞脱顆粒反応の抑制作用
実施例 1で示した方法にて調製した BMMCを 3x1 Os/ml濃度で 10% FB S含有 RPMIに浮遊させた。 この BMMCにマウスモノクローナル抗 DN P I gE抗体 （YAMASA社製） を 3pg/mlで添加し、 30分間室温にて静置 した。 次に、 I gE抗体処理した BMMCをバッファ一 A ( 133mM N a C 1、 5mM KC 1、 0. 9 mM NaH2P04、 8 mM グルコース、 lmg/ ml BSA、 0. 0 ImM CaCl2、 20 mM HEPES、 pH7. 4) で 洗浄し、 ImM CaC 12を含むバッファ一 Aに 3x106/ml濃度で浮遊させ た。 この BMMC浮遊液 （0. 1ml/ゥエル） を 96穴マルチプレートに添加 し、 さらに、 検討する化合物溶液 （0. 05 ml/ゥエル） および抗原として D NP— HSA (シグマ社製） 溶液 （40ngZml、 0. 05ml/ゥヱル） を 添加して室温にて 30分間静置した後、 1000 rpmで 5分間遠心して上清を 96穴マルチプレートに 0. 05 ml/ゥエル採取した。 この上清にへキソサミ ナ一ゼの基質である 4—メチルゥンベリフェリル— 2—ァセトアミド一2—デォ キシー β—D—ダルコビラノシド （フナコシ社製） 溶液（ImM ; 0. 2M クェ ン酸バッファ一 （pH4. 5) 中）を 0. 05mlノウエル添加し、 37°Cにて 90分間静置した後、 1M トリス溶液を 0. 15ml添加して反応を停止させ、 各ゥヱルの蛍光量をフルォロスキャン （ラボシステムズ社製） にて測定した。 B MM Cの脱顆粒反応に対する化合物の抑制効果は化合物を添加しないコント口一 ル群の蛍光量を 100%として計算した。 また、 コントロール化合物としてトラ 二ラストを用いた。 表 2に示すように、 アセトン一 4— (4一フエニル） フエ二 ルー 1, 3 _チアゾールー 2—ィルーヒドラゾンは用量依存的にマスト細胞の脱 顆粒反応を抑制した。 表 2
アセトン一 4一 （4一フエニル） フエニル一 1 , 3—チアゾ一ルー 2—ィルーヒ ドラゾン （式 [III] ) のマスト細胞脱顆粒反応抑制効果
Figure imgf000052_0001
産業上の利用可能性
本発明の Rab 蛋白およびその特異的な共役性因子、 あるいはそれらをコード する D N Aを担持する形質転換体を用いた本発明のスクリーニング系は、 該両因 子の相互作用を阻害することにより、 マスト細胞における脱顆粒反応を抑制し得 る物質の選別に有用である。 そのような物質は、 マスト細胞における脱顆粒反応 の亢進に起因するか、 それを伴う各種アレルギ一疾患の治療薬として利用するこ とが可能である。 配列表のフリーテキスト
配列番号 1 ： Alaまたは Val。
Valまたは Met。
Metまたは Leu。
Argまたは His。
Proまたは Ala。
配列番号 4 : Thrまたは Ser。
Leuまたは Met。 lieまたは Val。
Proまたは Thr。
Valまたは Ala。
配列番号 15 ：マウス Rab蛋白をコードする cDNAを増幅するためのプライ マ一として作用すべく設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号 16 ：マウス Rab蛋白をコードする cDN Aを増幅するためのプライ マーとして作用すベく設計されたォリゴヌクレオチド。
配列番号 17 ：ヒト Rab蛋白をコードする cDNAを増幅するためのプライマ —として作用すベく設計されたォリゴヌクレオチド。
配列番号 18 ：ヒト Rab蛋白をコードする cDNAを増幅するためのプライマ —として作用すべく設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号 19 ：ヒト Rab蛋白をコードする cDNAを増幅するためのプライマ —として作用すべく設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号 20 ： ヒト Rab蛋白をコードする cDNAを増幅するためのプライマ —として作用すベく設計されたォリゴヌクレオチド。 本出願は日本で出願された特願 2000 - 118408を基礎としており、 そ の内容は本明細書にすべて包含されるものである。
また、 本明細書において引用された特許および特許出願を含む文献は、 弓 (用し たことによってその内容のすべてが開示されたと同程度に本明細書中に組み込ま れるものである。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 以下の (a)、 (b)または (c)の蛋白質。
(a) 配列表配列番号 1に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質
(b) 上記（a)のアミノ酸配列において、 1もしくは数個のアミノ酸が置換、 欠失、 挿入、 付加もしくは修飾されたアミノ酸配列からなり、 且つ単独もしくは 1以上 の共役性因子との相互作用によりマスト細胞における脱顆粒反応を制御し得る蛋 白質
(c ) 上記（a)の蛋白質のフラグメントであって、 且つ単独もしくは 1以上の共役 性因子との相互作用によりマスト細胞における脱顆粒反応を制御し得る蛋白質 2 . 以下の (a)、 （b)または (c)の蛋白質。
(a) 配列表配列番号 4に示されるァミノ酸配列からなる蛋白質
(b) 上記 (a)のアミノ酸配列において、 1もしくは数個のアミノ酸が置換、 欠失、 挿入、 付加もしくは修飾されたアミノ酸配列からなり、 且つ単独もしくは 1以上 の共役性因子との相互作用によりマスト細胞における脱顆粒反応を制御し得る蛋 白質
(c ) 上記（a)の蛋白質のフラグメントであって、 且つ単独もしくは 1以上の共役 性因子との相互作用によりマスト細胞における脱顆粒反応を制御し得る蛋白質
3 . 以下の (a)、 （b)または (c)の蛋白質。
(a) 配列表配列番号 7に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質
(b) 上記（a)のアミノ酸配列において、 1もしくは数個のアミノ酸が置換、 欠失、 挿入、 付加もしくは修飾されたアミノ酸配列からなり、 且つ単独もしくは請求の 範囲 1記載の蛋白質との相互作用によりマスト細胞における脱顆粒反応を制御し 得る蛋白質
(c ) 上記（a)の蛋白質のフラグメントであって、 且つ単独もしくは請求の範囲 1 記載の蛋白質との相互作用によりマスト細胞における脱顆粒反応を制御し得る蛋
4 . 以下の (a)、 （b)または (c)の蛋白質。
(a)配列表配列番号 9に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質
(b) 上記 (a)のアミノ酸配列において、 1もしくは数個のアミノ酸が置換、 欠失、 挿入、 付加もしくは修飾されたアミノ酸配列からなり、 且つ単独もしくは請求の 範囲 1記載の蛋白質との相互作用によりマスト細胞における脱顆粒反応を制御し 得る蛋白質
(c) 上記 (a)の蛋白質のフラグメントであって、 且つ単独もしくは請求の範囲 1 記載の蛋白質との相互作用によりマスト細胞における脱顆粒反応を制御し得る蛋
5 . 以下の (a)、 （b)または (c)の蛋白質。
(a) 配列表配列番号 1 1に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質
(b) 上記 (a)のアミノ酸配列において、 1もしくは数個のアミノ酸が置換、 欠失、 挿入、 付加もしくは修飾されたアミノ酸配列からなり、 且つ単独もしくは請求の 範囲 1記載の蛋白質との相互作用によりマスト細胞における脱顆粒反応を制御し 得る蛋白質
(c ) 上記（a)の蛋白質のフラグメントであって、 且つ単独もしくは請求の範囲 1 記載の蛋白質との相互作用によりマスト細胞における脱顆粒反応を制御し得る蛋
6 . 以下の (a)、 （b)または (c)の蛋白質。
(a) 配列表配列番号 1 3に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質
(b) 上記（a)のアミノ酸配列において、 1もしくは数個のアミノ酸が置換、 欠失、 挿入、 付加もしくは修飾されたアミノ酸配列からなり、 且つ単独もしくは請求の 範囲 2記載の蛋白質との相互作用によりマスト細胞における脱顆粒反応を制御し 得る蛋白質 (c) 上記 (a)の蛋白質のフラグメントであって、 且つ単独もしくは請求の範囲 2 記載の蛋白質との相互作用によりマスト細胞における脱顆粒反応を制御し得る蛋 白質
7. 哺乳動物由来である請求の範囲 1〜 6のいずれかに記載の蛋白質。
8. ヒトまたはマウス由来である請求の範囲 7記載の蛋白質。
9. 請求の範囲 1記載の蛋白質をコードする DNA。
10. 以下の（a)、 （b)または（c)で特定される請求の範囲 9記載の DNA。
(a) 配列表配列番号 2に示される塩基配列からなる DNA
(b) 上記 (a)の塩基配列において、 1もしくは数個の塩基が置換、 欠失、 揷入、 もしくは付加された塩基配列を含む DN A
(c) 上記 (a)の塩基配列からなる DNAのフラグメント
11. 以下の )、 （b)または (c)で特定される請求の範囲 9記載の DNA―。
(a) 配列表配列番号 3に示される塩基配列からなる DNA
(b) 上記 (a)の塩基配列において、 1もしくは数個の塩基が置換、 欠失、 挿入、 もしくは付加された塩基配列を含む D N A
(c) 上記 (a)の塩基配列からなる DNAのフラグメント
12. 請求の範囲 2記載の蛋白質をコードする DNA。
13. 以下の（a)、 （b)または（c)で特定される請求の範囲 12記載の DNA。 (a) 配列表配列番号 5に示される塩基配列からなる DNA
(b) 上記 (a)の塩基配列において、 1もしくは数個の塩基が置換、 欠失、 挿入、 もしくは付加された塩基配列を含む DN A
(c) 上記 (a)の塩基配列からなる DNAのフラグメント
1 . 以下の（a)、 （b)または (c)で特定される請求の範囲 12記載の DNA。 (a) 配列表配列番号 6に示される塩基配列からなる DNA
(b) 上記 (a)の塩基配列において、 1もしくは数個の塩基が置換、 欠失、 挿入、 もしくは付加された塩基配列を含む D N A (c)上記 (a)の塩基配列からなる DN Aのフラグメント
15. 請求の範囲 3記載の蛋白質をコードする DNA。
16. 以下の (a)、 （b)または（c)で特定される請求の範囲 15記載の DNA。
(a)配列表配列番号 8に示される塩基配列からなる D N A
(b)上記 (a)の塩基配列において、 1もしくは数個の塩基が置換、 欠失、 挿入、 もしくは付加された塩基配列を含む D N A
(c)上記 (a)の塩基配列からなる DNAのフラグメント
17. 請求の範囲 4記載の蛋白質をコードする DNA。
18. 以下の (a)、 （b)または (c)で特定される請求の範囲 17記載の DNA。 (a) 配列表配列番号 10に示される塩基配列中、 塩基番号 18〜 104で示さ れる塩基配列からなる D N A
(b) 上記 (a)の塩基配列において、 1もしくは数個の塩基が置換、 欠失、 挿入、 もしくは付加された塩基配列を含む D N A
(c)上記 (a)の塩基配列からなる DNAのフラグメント
19. 請求の範囲 5記載の蛋白質をコードする DNA。
20. 以下の )、 （b)または（c)で特定される請求の範囲 19記載の DNA。
(a) 配列表配列番号 12に示される塩基配列配列中、 塩基番号 18〜68で示 される塩基配列からなる DN A
(b) 上記 (a)の塩基配列において、 1もしくは数個の塩基が置換、 欠失、 挿入、 もしくは付加された塩基配列を含む DN A
(c)上記 (a)の塩基配列からなる DNAのフラグメント
21. 請求の範囲 6記載の蛋白質をコードする DNA。
22. 以下の (a)、 （b)または（c)で特定される請求の範囲 21記載の DNA。 (a) 配列表配列番号 14に示される塩基配列配列中、 塩基番号 18〜 1334 で示される塩基配列からなる DN A (b) 上記 (a)の塩基配列において、 1もしくは数個の塩基が置換、 欠失、 挿入、 もしくは付加された塩基配列を含む D N A
(c) 上記 (a)の塩基配列からなる DN Aのフラグメント
23. 哺乳動物由来である請求の範囲 9〜22のいずれかに記載の DNA。
24. ヒトまたはマウス由来である請求の範囲 23記載の DNA。
25. 請求の範囲 9~24のいずれかに記載の DNAを含む組換えベクター。
' 26. 請求の範囲 25記載の組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質 転換体。
27. 請求の範囲 26記載の形質転換体を培養して得られる培養物から請求の範 囲 1〜 8のいずれかに記載の蛋白質を採取することを特徴とする該蛋白質の製造 方法。
28. 請求の範囲 1〜 8のいずれかに記載の蛋白質に特異的親和性を有する抗体 c
29. 請求の範囲 28記載の抗体を含む、 検体中の請求の範囲 1〜8のいずれか に記載の蛋白質の測定用試薬。
30. 請求の範囲 28記載の抗体との抗原抗体反応に基づく検体中の請求の範囲 1〜 8のいずれかに記載の蛋白質の測定方法。 '
31. 請求の範囲 9〜1 1のいずれかに記載の DN Aを、 宿主細胞内のレポ一夕 —遺伝子の発現を制御する蛋白質の部分配列との融合蛋白質として発現される形. 態で含む発現べクタ一と、 請求の範囲 15〜20のいずれかに記載の DN Aを、 該蛋白質の他の部分配列との融合蛋白質として発現される形態で含む発現べクタ ― (但し、 該 2つの部分配列は、 得られる 2つの融合蛋白質が相互作用する場合 にのみ、 該レポ一夕一遺伝子の発現を制御する機能を回復する） とを宿主細胞に 導入して得られる形質転換体。
32. 請求の範囲 12〜14のいずれかに記載の DNAを、 宿主細胞内のレポ一 夕一遺伝子の発現を制御する蛋白質の部分配列との融合蛋百質として発現される 形態で含む発現べクタ一と、 請求の範囲 21または 22記載の DNAを、 該蛋白 質の他の部分配列との融合蛋白質として発現される形態で含む発現ぺク夕一 （但 し、 該 2つの部分配列は、 得られる 2つの融合蛋白質が相互作用する場合にのみ、 該レポーター遺伝子の発現を制御する機能を回復する） とを宿主細胞に導入して 得られる形質転換体。
33. 該 2つの部分配列が転写因子の DNA結合ドメインおよび活性化ドメイン である請求の範囲 31または 32記載の形質転換体。
34. マスト細胞における脱顆粒反応を阻害し得る物質のスクリ一ニング法であ つて、
(1) 請求の範囲 31〜33のいずれかに記載の形質転換体を、 試験物質の存在 下および非存在下に培地中でそれそれ培養し、
(2) レポ一夕一遺伝子の発現を比較する
ことを含む方法。
35. マスト細胞における脱顆粒反応を阻害し得る物質のスクリーニング法であ つて、
(1) 試験物質の存在下および非存在下に請求の範囲 1または 2記載の蛋白質と GTPを接触させ、
(2) 該蛋白質に対する GTPの結合を比較する
ことを含む方法。
36. マスト細胞における脱顆粒反応を阻害し得る物質のスクリーニング法であ つて、 試験物質の存在下および非存在下に以下の工程を実施することを特徴とす る方法。
(1) 請求の範囲 1記載の蛋白質と請求の範囲 3〜 5のいずれかに記載の蛋白質、 または請求の範囲 2記載の蛋白質と請求の範囲 6記載の蛋白質とを接触させて複 合体を形成させる工程
(2) 請求の範囲 1または 2記載の蛋白質に GTPを結合させる工程 （工程（1)お よび (2)の順序は逆であってもよいし、 同時であってもよい） (3) GTPを結合した請求の範囲 1記載の蛋白質と請求の範囲 3〜 5のいずれ かに記載の蛋白質との複合体、 または G T Pを結合した請求の範囲 2記載の蛋白 質と請求の範囲 6記載の蛋白質との複合体を測定する工程
(但し、 請求の範囲 1もしくは 2記載の蛋白質、 請求の範囲 3〜6のいずれかに 記載の蛋白質および G TPからなる群より選択されるいずれかの成分は標識され ている）
37. 請求の範囲 34〜36のいずれかに記載の方法により得られうる、 マスト 細胞における脱顆粒反応の阻害物質。
38. 式 [I] で表される、 請求の範囲 37記載のマスト細胞における脱顆粒反 応の阻害物質。
Figure imgf000060_0001
(式中、 R1は水素原子または炭素数 1 ~ 4の直鎖もしくは分枝鎖アルキル基を、 Xは水素原子、 炭素数 1〜4の直鎖もしくは分枝鎖アルキル基、 ヒドロキシ基ま たはフエ二ル基を表す。 ）
39. 式 [II] で表される、 請求の範囲 37記載のマスト細胞における脱顆粒 反応の阻害物質。
Figure imgf000061_0001
(式中、 R2は水素原子またはニトロ基を、 Yはハロゲン原子、 炭素数 1〜4の 直鎖もしくは分枝鎖アルキル基またはヒドロキシ基を表す。 ）
4 0 . 請求の範囲 3 7〜3 9のいずれかに記載の阻害物質を有効成分として含有 するマスト細胞における脱顆粒反応の阻害剤。
4 1 . 請求の範囲 3 7〜3 9のいずれかに記載の阻害物質を有効成分とする、 マ スト細胞における脱顆粒反応の亢進が関与するアレルギー疾患の治療剤。
PCT/JP2001/003268 2000-04-19 2001-04-16 Facteurs participant a la degranulation des basophiles, adns codant ces facteurs, inhibiteurs de ces facteurs, et procedes de recherche systematique de ces inhibiteurs WO2001079478A1 (fr)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP01919971A EP1279729A4 (en) 2000-04-19 2001-04-16 FACTORS INVOLVED IN THE DEGRANULATION OF MAST CELLS, DNAS, WHICH CODE FOR THESE, SCREENING METHODS FOR INHIBITORS OF THESE FACTORS AND INHIBITORS (01.11.01)
US10/258,107 US7108987B2 (en) 2000-04-19 2001-04-16 Factors participating in degranulation of mast cells, DNAs encoding the same, method of screening of these factors and the inhibitors

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2000-118408 2000-04-19
JP2000118408 2000-04-19

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2001079478A1 true WO2001079478A1 (fr) 2001-10-25

Family

ID=18629552

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2001/003268 WO2001079478A1 (fr) 2000-04-19 2001-04-16 Facteurs participant a la degranulation des basophiles, adns codant ces facteurs, inhibiteurs de ces facteurs, et procedes de recherche systematique de ces inhibiteurs

Country Status (3)

Country Link
US (1) US7108987B2 (ja)
EP (1) EP1279729A4 (ja)
WO (1) WO2001079478A1 (ja)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2375357T3 (es) * 2002-05-02 2012-02-29 E-L Management Corp. Procedimiento de mejora de la actividad biológica de extractos de origen vegetal.
WO2011069039A1 (en) * 2009-12-04 2011-06-09 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Hydrazone and diacyl hydrazine compounds and methods of use

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH01501935A (ja) * 1986-04-07 1989-07-06 ジ・アップジョン・カンパニー 駆虫薬アシルヒドラゾン、使用方法および組成物
WO1999042586A2 (en) * 1998-02-23 1999-08-26 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Exo1 and exo2, exocytotic proteins
WO2000058464A2 (en) * 1999-03-25 2000-10-05 Axys Pharmaceuticals, Inc. Rab genes and their uses

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5840569A (en) * 1996-12-12 1998-11-24 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Human GTP-binding proteins
US5843717A (en) * 1997-03-26 1998-12-01 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Rab protein
AU2001238707A1 (en) 2000-02-29 2001-09-12 Millennium Pharmaceuticals, Inc. 32705, 23224, 27423, 32700, 32712, novel human g-proteins

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH01501935A (ja) * 1986-04-07 1989-07-06 ジ・アップジョン・カンパニー 駆虫薬アシルヒドラゾン、使用方法および組成物
WO1999042586A2 (en) * 1998-02-23 1999-08-26 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Exo1 and exo2, exocytotic proteins
WO2000058464A2 (en) * 1999-03-25 2000-10-05 Axys Pharmaceuticals, Inc. Rab genes and their uses

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BELIK A.V.: "The relation between structure and radioprotectant efficacy of thiazole derivatives", RADIATS. BIOL. RADIOEKOL., vol. 33, no. 3, 1993, pages 824 - 830, XP001199648 *
DIRK JAGER: "Serological cloning of a melanocyte reb guanosine 5'-triphosphate-binding protein and a chromosome condensation protein from a melanoma complementry", CANCER RES., vol. 60, 2000, pages 3584 - 3591, XP002985103 *
ESTEBAN S. MASUDA ET AL.: "Rab37 is a novel mast cell specific GTPase localized to secretory granules", FEBS LETTERS, vol. 470, 2000, pages 61 - 64, XP002985102 *
KAZUHITO MIZUKI ET AL.: "Functional modules and expression of mouse p40phox and p67phox, SH3-domain-containing proteins involved in the phagocyte NDAPH oxidase complex", EUR. J. BIOCHEM., vol. 251, 1998, pages 573 - 582, XP002944828 *
See also references of EP1279729A4 *

Also Published As

Publication number Publication date
US20030143633A1 (en) 2003-07-31
US7108987B2 (en) 2006-09-19
EP1279729A4 (en) 2005-03-09
EP1279729A1 (en) 2003-01-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100529270B1 (ko) 혈관신생 및 심혈관형성의 촉진 또는 억제
JP2002518010A (ja) ９４個のヒト分泌タンパク質
JPH11279196A (ja) Ｖａｎｉｌｒｅｐ１ポリペプチドおよびｖａｎｉｌｒｅｐ１ポリヌクレオチ ド
FR2788783A1 (fr) Proteines entrant en interaction avec le recepteur d'igf (iip),acides nucleiques codant pour ces proteines et leur utilisation
US8084578B2 (en) Monoclonal antibody against human scavenger receptor SRCL-P1
KR20040088077A (ko) 혈관신생 및 심혈관형성의 촉진 또는 억제
JP4314386B2 (ja) Ｂｃｌ−２調節因子（ＢＭＦ）配列及びアポトーシスの調節におけるそれらの使用
JPH10509044A (ja) Ｇａｐタンパク質ｓｈ３ドメインに結合可能なペプチド、それをコードするヌクレオチド配列ならびにその製造法および使用
US5723301A (en) Method to screen compounds that affect GAPDH binding to polyglutamine
US7070940B2 (en) Method for determining the ability of a compound to modify the interaction between parkin and the p38 protein
WO2001079478A1 (fr) Facteurs participant a la degranulation des basophiles, adns codant ces facteurs, inhibiteurs de ces facteurs, et procedes de recherche systematique de ces inhibiteurs
JP2003523723A (ja) ヘルマンスキー−パドラック症候群タンパク質相互作用タンパク質およびその使用の方法
JP2002281989A (ja) Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−３ポリペプチドおよびポリヌクレオチド
JP2002517998A (ja) ｐ２７（ＫＩＰ１）のＦＫＢＰ−１２との相互作用
JP2002530073A (ja) ヒト２型グリシン輸送体
WO2001077323A1 (fr) Gene codant pour l'erbin et utilisations diagnostiques et therapeutiques
JP2005505253A (ja) 呼吸系ムチン産生に関連する症状の治療方法と組成物
JPH11243972A (ja) アミノペプチダーゼファミリーのメンバー、ｍｅｔｐｒｏ ０２
JP2002503466A (ja) 網膜芽細胞腫タンパク質複合体および網膜芽細胞腫相互作用タンパク質
AU768824B2 (en) DADD, death activator death domain protein
US20120015400A1 (en) HCL-K1 Polypeptide Which Offers Collectin Activity
KR100734195B1 (ko) 단백질 ｒｉｍ 2
JP2000224993A (ja) ＲｅｌＡ結合性阻害因子、その製造方法およびその用途
JP2005504732A (ja) タニスと血清アミロイドａとの相互作用を変化させる方法及び該方法に有用な物質
JP2002517236A (ja) アポトーシス調節用タンパク質

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): JP US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE TR

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
ENP Entry into the national phase

Ref country code: JP

Ref document number: 2001 577461

Kind code of ref document: A

Format of ref document f/p: F

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2001919971

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 10258107

Country of ref document: US

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2001919971

Country of ref document: EP

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: 2001919971

Country of ref document: EP