WO2001066736A1 - Proteines du type nectine 3 - Google Patents

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WO2001066736A1
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cell
cells
seq
protein
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Yoshimi Takai
Hiroyuki Nakanishi
Keiko Sato
Kenichi Takahashi
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Japan Science And Technology Corporation
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans

Definitions

  • the invention of this application relates to a novel protein Nectin-13 involved in cadherin-mediated cell adhesion binding, and genetic engineering materials for obtaining and using these proteins. It is about.
  • Scenery liffil In a variety of cellular phenomena in animal individuals, such as cell adhesion, cell motility, and cell morphology, the adhesion device formed by transmembrane proteins such as cell adhesion molecules, receptors, and channels plays an important role. Plays. Above all, adhesive bonding of cells
  • nectin-1 ⁇ , -1 ⁇ and nectin-12 ⁇ , -2 ⁇ are new proteins that work with afadin for AJ formation via force-doherin.
  • nectin one 1, 2 is a C a 2 + -independent immunoglobulin-like adhesion molecule, together with Afuadein and ponsin have found to act as a single system to AJ formation (Genes Cells 4: 573-581, 1999: J. Biol. Chem. 275: 613-61 8, 2000).
  • Elucidation of the molecular mechanism of cell adhesion may lead to elucidation of the mechanism of carcinoma invasion and metastasis, for example, diagnosis of malignancy of carcinoma and its application to the development of therapeutic methods and therapeutic agents. Be expected. For such elucidation, it is necessary to clarify the whole picture of the molecules involved in cell adhesion.
  • the invention of this application has been made in view of the circumstances described above, and has as its object to provide a novel protein involved in cell-cell adhesion.
  • Another object of the present invention is to provide a material for producing the protein by genetic engineering.
  • the present application provides a protein Nectin-13 having the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 2, 4, and 6, respectively, in order to solve the above problems.
  • Nectin-13 is a mouse-derived protein and is composed of three types of splicing variants expressed from the genomic gene of Macas. (Thin-1 or Nectin-3 yS, Nectin-1 3r)).
  • This application also provides a polynucleotide encoding the protein Nectin-13 of the invention.
  • This polynucleotide includes genomic DNA, mRNA, cDNA and the like.
  • This application further provides polynucleotides having the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 1, 3, and 5 as cDNAs encoding three types of Nectin-13. Further, this application provides a recombinant vector having any one of the polynucleotides of the above invention).
  • Nectin-13 of the present invention is a protein commonly present in all mammals, like Nectin-11 and Nectin-12, the above-mentioned protein Nectin-13 and poly-encoding these Nucleotides are not limited to those derived from mice.
  • FIG. 1 is a comparison of the amino acid sequences of Nectin-13, 1-2 and 13r.
  • the black background is the consensus sequence for the three variants
  • the gray background is the consensus sequence for Nectin-13 ⁇ and -3r
  • the underline is the signal peptide
  • the double underline is the transmembrane region
  • the asterisk is the glycosyl of asparagine. Indicates the site of formation.
  • Figure 2 shows the results of confirming the trans homo-interaction of Nectin-13.
  • A Is the expression level of Nectin-13 ⁇ . The cell eluate was developed on SDS-PAGE, and subjected to Western blot analysis using an anti-Nectin-13 polyclonal antibody.
  • ⁇ is the cell aggregation activity
  • ⁇ is the parent L cell line
  • ⁇ is the Nectin-13 expressing L cell line.
  • C is a cell aggregation activity
  • C1 is a parent cell line
  • C2 is a cell line expressing nectin-12 ⁇ . The bar indicates 100 m.
  • FIG. 3 shows the result of confirming the formation of cis homo-dimer of Nectin-13.
  • Nectin-13 expressing cells were incubated in the presence or absence of BS3, each cell eluate was developed on SDS-PAGE, and subjected to easterblot analysis using an anti-Nectin-13 ⁇ polyclonal antibody. .
  • FIG. 4 shows the results of examining the mixed cell aggregation activity.
  • a 1 -A3 is a cell line expressing and not labeling Nectin-1 and a cell line expressing Nectin-12 or not;
  • B "! — B3 is a labeling Nectin-3 expressing L cell line and unlabeled Nectin C1-C3 is labeled Nectin13-expressing L cell line and unlabeled Nectin-12 ⁇ -expressing cell line;
  • A1, B1C1 is interference contrast microscope image;
  • a A, B3 and C3 are the results of statistical analysis, and B is 40 m.
  • FIG. 5 is an immunofluorescence microscopy image of a co-culture of two L cell lines.
  • the bar indicates m.
  • Fig. 6 shows the results of confirming the affinity of trans hetero-interaction.
  • the composition of 2-cell aggregation (labeled cells and positively labeled cells) was quantitatively analyzed.
  • A is a cell line that expresses labeled Nectin-1 1 'and expresses unlabeled Nectin-12;
  • B is a cell line that expresses labeled Nectin-13a and expresses unlabeled Nectin-11;
  • C is a cell line that expresses labeled Nectin-13a and a cell line that expresses unlabeled Nectin-12.
  • Figure 1 shows the results of examining the formation of cis hetero-dimer between Nectin-1 or Nectin-1 "1 ⁇ or 1-2.
  • A is a comparison of cis dimer formation.
  • A1 is Nectin-1 expression.
  • A2 is a cell line expressing nectin-2 ⁇ (lane 1) and L cell line expressing 1 2 ⁇ 3 ⁇ (lane 2).
  • ⁇ is the result of immunoprecipitation
  • ⁇ 1 is Nectin-1-3 expressing L cell line
  • ⁇ 2 is Nectin1-2 expressing L cell line
  • Lane 1 is cell extract
  • Lane 2 is supernatant
  • Lane 3 is sediment.
  • the arrow is monomer and the arrowhead is dimer.
  • FIG. 8 shows the results of examining the tissue distribution of Nectin-13.
  • ⁇ is the result of Northern plot analysis of Nectin-11, 12, and 13.
  • A1 is Nectin-1;
  • A2 is Nectin-12;
  • A3 is Nectin-13.
  • B is the result of Northern blot analysis of Nectin-3, 13 and 13r,
  • B1 is Nectin-13,
  • B2 is Nectin-13 ⁇ , and ⁇ 3 is Nectin-13r.
  • Lane 1 is heart, lane 2 is brain, lane 3 is spleen, lane 4 is lung, lane 5 is liver, lane 6 is skeletal muscle, lane 7 is kidney, and lane 8 is testis.
  • FIG. 9 shows the result of examining the subcellular localization of nectin-13 in the mouse small intestinal absorptive epithelium.
  • A is Nectin-13a;
  • B is Nectin-12;
  • C is a combination.
  • the asterisk indicates the internal space of the small intestine.
  • the size is 10 jum.
  • FIG. 10 shows the results obtained by examining the direct binding of afaadein to nectin-13 ⁇ .
  • the arrow indicates the fusion protein GST-nectin-3-CP, and the arrowhead indicates the fusion protein MBP-afadin-PDZ.
  • Nectin-13 ⁇ is a protein encoded by a 1650 bp cDNA whose nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 1, and has a 549 amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • the entire cDNA of Nectin-13 has the nucleotide sequence of 2178 bp shown in SEQ ID NO :.
  • Nectin-13; 3 is a protein encoded by a 1533 bp cDNA whose nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 3, and has a 510 amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4.
  • Nectin-13r is a protein encoded by a 1317 bp cDNA whose nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 5, and has a 438 amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6.
  • These protein Nectin-13 can be isolated from a mouse or other mammalian tissues by a known method, a method for preparing a peptide by chemical synthesis based on the amino acid sequence provided by the present invention, or an invention. Can be obtained by a method of producing the recombinant DNA technology using the polynucleotide provided by the company.
  • RNA is prepared by in vitro transcription from a vector having a polynucleotide encoding Nectin-13, and this is used as a template for in vitro translation. It can be expressed in vitro. If each polynucleotide is recombined into an appropriate expression vector by a known method, a large amount of Nectin-13 encoded by the polynucleotide can be expressed in Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast, animal and plant cells, and the like.
  • Nectin-13 of the present invention When expressing the protein Nectin-13 of the present invention in a microorganism such as Escherichia coli, an expression vector having an origin, a promoter, a ribosome binding site, a DNA cloning site, a terminator, and the like capable of replicating in microorganisms may be used.
  • a recombinant expression vector is prepared by inserting and binding the polynucleotide of the present invention, host cells are transformed with this expression vector, and the resulting transformant is cultured.
  • Nectin-13 can be mass-produced in microorganisms. Alternatively, it can be expressed as a fusion protein with another protein.
  • the polynucleotide of the present invention is converted into an animal cell expression vector having a promoter for animal cells, a splicing region, a poly (A) addition site, and the like. Recombinant, introduced into animal cells, The light protein Nectin-13 can be expressed in animal cells.
  • the mouse protein Nectin-13 obtained by the method as described above can be used, for example, as an antigen for preparing an antibody that specifically recognizes this protein.
  • Protein Nectin-13 also includes a peptide fragment (5 or more amino acid residues) containing any partial amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 4, or 6. These peptide fragments can also be used as antigens for producing antibodies.
  • the polynucleotide of the present invention is a mammalian genomic gene encoding the protein nectin-13 ⁇ , y8 and r, and is, for example, a polynucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 3 or 5. Alternatively, it can be isolated from an existing genomic library or the like using a partial sequence thereof as a probe.
  • the polynucleotide of the present invention is also a cDNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, 3, or 5, and encodes the aforementioned Nectin-13,; 8 and r, respectively. I have.
  • the polynucleotides of the present invention can be obtained by screening a mouse or other mammalian cDNA library using an oligonucleotide probe synthesized based on the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 3 or 5. Clones can be easily obtained. Alternatively, the target polynucleotide can be synthesized using the polymerase chain reaction (PCR) method using these -oligonucleotides as primers.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the present invention also includes a polynucleotide in which one or more nucleotides are added, deleted, and substituted with a nucleotide or another nucleotide in SEQ ID NO: 1, 3, or 5.
  • proteins in which one or more amino acid residues have been added, deleted, and substituted with Z or another amino acid residue resulting from these changes As long as it has the activity of the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 4, or 6, it is included in the present invention.
  • the polynucleotide of the present invention also includes a DNA fragment (10 bp or more) containing any partial nucleotide sequence of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, 3, or 5, or a polynucleotide comprising an antisense strand thereof.
  • the antibody of the present invention can be obtained as a polyclonal antibody or a monoclonal antibody by a known method using the protein Nectin-13 itself or a partial peptide thereof as an antigen.
  • Nectin-3 of the present invention the structures of Nectin-3 of the present invention and the results of experiments conducted to confirm its function are shown.
  • PCAGIPuro-FLAG was prepared by subcloning the prepro-trypsin signal peptide and the FLAG epitope of pFLAG-CMV1 (Eastman Kodak Co.) into pCAGIPuro.
  • L-cells (obtained from Kyoto University) were cultured in a DMEM medium containing 10% of serum from infants to prepare transformed L-cells.
  • L cell line (nectin-3-L cells) expressing full-length mouse 'Nectin-13' was created using recombinant vector pCAGIPuro-nectin-3 "or FLAG- A cell line that co-expresses Nectin-13 ⁇ (nectin-1 ⁇ / 3-L cells) or a cell line that co-expresses Nectin-12 and FLAG-Nectin-13 (nectin-2 ⁇ / 3 ⁇ - cells) were transfected with pCAGIPuro-FLAG-nectin-3 using the cell lines (nectin-1 -L cells and nectin-2 ⁇ -L cells) (Lipofectamine reagent (GIBCO BRL)), respectively. After culturing for one day, the medium was changed and the cells were selected with 5 ⁇ g / ml puromycin (Sigma Chemical Co.). 1.4 Preparation of antibody
  • Egret antiserum (polyclonal antibody) against Nectin-13 was prepared using -CP such as GST-nectin-3 as an antigen.
  • a rat monoclonal antibody against Nectin-13 was prepared using a fusion protein of the extracellular region of Nectin-13 and IgG Fc as an antigen.
  • Egret Anti-nectin-11 polyclonal antibody was prepared by the method described in the literature (above, Cell Biol. 145: 539-549, 1999).
  • a heron anti-Nectin-1 ⁇ polyclonal antibody was prepared using the synthetic peptide corresponding to amino acid positions 450-468 of Nectin-11 as an antigen by the method described in the literature ( ⁇ Cell Biol. 145: 539-549, 1999).
  • rat anti-nectin-2 monoclonal antibody was prepared by the method described in the literature ( ⁇ Cell Biol. 145: 539-549, 1999, Exp. Cell Res. 235: 374-384, 1997), and mouse monoclonal ⁇
  • a heron-polyclonal anti-I-fafadin antibody was prepared by the method described in the literature ( ⁇ Cell Biol. 139: 517-528, 1997; Oncogene 18: 1609-1618, 1999).
  • Rat anti-E-force doherin monoclonal antibody was provided by Dr. Takeichi (Kyoto University).
  • Mouse anti-FLAG monoclonal antibody was purchased from Eastman Codak.
  • Protein concentration was measured using maggot serum albumin as a control, as described in the literature (Anal. Biochem. 72: 248-254, 1976). The method was carried out as follows. SDS-PAGE was performed as described in the literature (Nature 227: 680-685, 1970).
  • Affinity chromatography was performed as follows.
  • the MBP fusion protein of the afadin PDZ domain was immobilized on amylose resin beads (New England Biolabs Inc.).
  • GST-nectin-3 -CP and GST-nectin-3a-CP-AC were respectively immobilized on affinity beads. These beads were thoroughly washed with PBS (containing 0.1% Triton X-100), and then eluted with PBS (containing 20 mM maltose, 0.1% Triton X-100). 2. Result
  • the cDNA clone obtained from the mouse cDNA library has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7, and a protein consisting of a 647 amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) in the 1647 bp translated region (SEQ ID NO: 1). Molecular weight 60,580). This clone also contained all of the EST clones. This protein was designated as Nectin-13.
  • Nectin-13 ⁇ had a terminal hydrophobic signal peptide (positions 1-55 of SEQ ID NO: 2) and a transmembrane region (positions 405-421 of SEQ ID NO: 2). ⁇ -linked glycosylation was found at positions 73, 83, 125, 186, 222 and 331.
  • -Nectin-13 also contained three lg-like domains in the extracellular domain and a C-terminal conserved motif in the cytoplasmic domain (Table 1). table 1 '
  • Nectin-1a S F S K K E W Y V
  • Nectin-3a S V S R R E W Y V
  • nectin one 1 a, one 1 ⁇ is similar to the one 2 of and single 2 S. Although the degree of homology varies depending on the region, the amino acid sequence of the extracellular region of Nectin-13a was 35.9% and 30.7% identical to Nectin-11 and Nectin-12, respectively.
  • Nectin-13 cDNA (translation region) has a 1533 bp nucleotide sequence (SEQ ID NO: 3) and encodes a protein (estimated molecular weight 55,808) consisting of 510 amino acid sequences (SEQ ID NO: 4). This nectin one 3 of the extracellular region (position of SEQ ID NO: 4 "!
  • One 357) is identical to that of nectin-one 3 a, (position of SEQ ID NO: 4 358-510) film ⁇ region and cytoplasmic region of nectin Nectin-13, however, had a C-terminal conserved motif (Table 1).
  • Nectin-13r cDNA (translation region) has a 1317 bp nucleotide sequence (SEQ ID NO: 5) and encodes a protein (estimated molecular weight 47,259) consisting of 438 amino acid sequences (SEQ ID NO: 6).
  • the extracellular, transmembrane and cytoplasmic regions of Nectin-13r are identical to Nectin-13, but Nectin-13r lacks the C-terminal conserved motif. (Table 1).
  • FIG. 1 is a comparison diagram of the above amino acid sequences of Nectin-13, 13 and 13r (single-letter code).
  • Nectin-1 and Nectin-1 and Nectin-1 and Nectin-1 cells were studied by trans-Homo-Interaction and cic Homo-dimer Formation nectin-1 a-L cells and nectin-2 and L-cells. Demonstrates adhesive activity (trans Homo-Interaction). ( ⁇ Cell Biol. 145: 539-549, 1999, ⁇ Biol. Chem. 275: 613-618, 2000). Therefore, it was first examined whether or not Nectin-13 had the same activity.
  • the anti-Nectin-3 polyclonal antibody recognized two protein bands with a molecular weight of about 100 kDa in the expression product of the cell line nectin-3 o; -shi cells (Fig.
  • Nectin-13 ⁇ showed cell aggregation activity over time (FIG. 2B, C1, C2). Since this activity was not affected by the addition of EDTA (data not shown), it was confirmed that the cell-cell adhesion activity of nectin-13 was Ca 2+ -independent. From the above results, Nectin-13 ⁇ is similar to Nectin-11 ⁇ , 1-2 and 12S ⁇ Cell Biol. 145: 539-549, 1999, Exp. Cell Res. 235: 374-384, 1997 , Blood 92: 4602- 4611, 1998 , J. Biol Chem 275:.. 613-618, to be a C a 2 + -independent Homofiritsu click CAM 2000) (cell adhesion molecules) was confirmed.
  • Nectin-1 ⁇ and N-1 ⁇ are known to form cis homo-dimers ( ⁇ Biol. Chem. 275: 613-618, 2000), Nectin-13 ⁇ is similarly active. I checked. The cell line nectin-3a-seed cells were separated into single cells, incubated with cell surface crosslinker-BS3, and subjected to estanblot analysis using an anti-nectin-13 ⁇ polyclonal antibody. As a result, a band having a molecular weight of about 200 to 220 kDa corresponding to the dimer was confirmed (FIG. 3). Higher molecular weight bands were also detected. Since this cross-linking was performed in a single cell suspension, the dimers and oligomers are more likely to be cis homo-interactions than trans homo-interactions.
  • nectin-1 When cell surface cross-linking is performed on the cell line nectin-1 ⁇ / 3 ⁇ -cells, followed by immunoprecipitation using an anti-FLAG monoclonal antibody, nectin-1 is recovered in the supernatant. It did not co-immunoprecipitate with FLAG-nectin-13 ⁇ (Fig. 1). Similar results were obtained with the cell line nectin-2 / 3-None cells (FIG. 7B2). From the above results, it was confirmed that Nectin-13 ⁇ does not form a cis hetero-dimer with Nectin-11 or Nectin-12.
  • Nectin-13 ⁇ shows mRNA bands of about 5.2-kb, 3.8-kb, 3.3-kb and 2.7-kb, which are significantly expressed in testis and other tissues (heart, brain, lung, liver and kidney) Was slightly expressed (FIG. 8B1).
  • Nectin-13 showed approximately 5.2-kb and 3.3-kb mRNA bands, which were expressed in testis (FIG. 8B2).
  • Nectin-13r showed an approximately 3.3-kb mRNA band in testis, and a 2.1-kb mRNA band in lung, liver and kidney (FIG. 8B3).
  • Nectin-13 ⁇ coexisted with Nectin-12 in the adhesion complex region of the mouse small intestinal absorptive epithelium (Fig. 9). These results suggest that, similar to Nectin-12 ( ⁇ Cell Biol. 145: 539-549, 1999), Nectin-13 ⁇ is also localized to the cadherin-cell-cell AJs. Was.
  • Affinity chromatography was performed to determine whether nectin-13 binds directly to afaadein.
  • GST fusion protein (GST-nectin-3-CP) in the cytoplasmic region of Nectin-13 bound to MBP-afadin-PDZ (MBP fusion protein with the PDZ region of afaadin) immobilized on amylose resin beads.
  • Figure 10 The stoichiometry of binding of Nectin-13 ⁇ to afaadein was approximately 1: 1.
  • a GST fusion protein with Nectin-13 lacking the C-terminal 4 amino acid residues in the cytoplasmic region did not bind.
  • the GST fusion protein with the cytoplasmic region of Nectin-13r lacking the motif also did not bind to affinity beads.
  • INDUSTRIAL APPLICABILITY As described in detail above, the invention of this application provides a novel protein Nectin-13 belonging to the same protein family as Nectin-11 and Nectin-12. This protein not only provides important information for elucidating the entire molecular mechanism of cell binding, but may also lead to elucidation of the mechanism of invasion and metastasis of carcinoma, for example, diagnosis of malignancy of carcinoma and It is useful for the development of prophylactic and therapeutic methods, therapeutic drugs, etc.

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Description

明細書 蛋白質ネクチン一 3 技術分野 この出願の発明は、 カ ドヘリン （cadherin) を介した細胞接着結合に関与する新規 な蛋白質ネクチン一 3と、 これらの蛋白質を取得、 利用するための遺伝子工学材料 等に関するものである。
景 liffil 動物個体における様々な細胞現象、 例えば 細胞接着、 細胞運動および細胞の形 状決定等においては、 細胞接着分子、 受容体およびチャンネル等の膜貫通蛋白質に よって形成される接着装置が重要な役割を果たしている。 なかでも細胞の接着結合
(adherens junction: AJ)は、 組織の整合性を維持するのに欠く ことのできない役割を 担っている。 このような機構的役割に加えて、 A Jは細胞増殖や組織の形態形成の コントロールに関わっているという証拠が増えてきている。 また、 多くの F -ァクチ ン結合タンパク質がァクチン細胞骨格を接着分子に連結するリンカーの役目を果た していることが明らかにされてきている。 しかしながら AJ の分子的な理解は不十分 であり、 どのような分子がァクチン細胞骨格を細胞膜に結合させているかは明らか ではなかった。 この点を明らかにするため、 この出願の発明者等は、 ラッ トの脳から幾つかの新 規な F—ァクチン結合蛋白質を単離し、 特に神経細胞に特異的で、 シナプスに多く 存在する蛋白質の構造を解析し、 「ニューラビン」 （neurabin) と命名して既に特許 出願している （特開平 10-276784 号公報） 。 さらにこの出願の発明者等は、 新規の F—ァクチン結合タンパク質 レアファディン （afadin) と、 この I-ァフアデインと結 合する蛋白質ポンシンをそれぞれ単離し、 特許出願している （I-ァフアデイン： 特開 平 1 1 -89572号公報、 ポンシン ： 特願平 1 1 -174687号） 。 そしてさらに、 この出願の 発明者等は、 力 ドヘリンを介した AJ 形成に対してァフアディンとともに機能する新 規な蛋白質としてネクチン （nectin ) — 1 α、 - 1 βおよびネクチン一 2 α、 - 2 δ を特定している （丄 Cell Biol. 145:539-549, 1 999) 。 これらのネクチン一 1 、 2は、 C a 2 +非依存性の免疫グロブリン様接着分子であり、 ァフアデインおよびポンシンと ともに、 AJ 形成に 1 つの系と して作用することを見出している （Genes Cells 4:573-581 , 1999： J . Biol. Chem. 275:613-61 8, 2000) 。 細胞接着の分子機構を解明することは、 例えば、 癌腫の浸潤、 転移のメカニズム の解明につながる可能性があり、 癌腫の悪性度の診断やその治療法、 治療薬等の開 発への応用も期待される。 そして、 そのなような解明のためには、 細胞接着に関与 する分子の全貌を明らかにする必要がある。 この出願の発明は、 以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、 細胞一 細胞間接着結合に関与する新規な蛋白質を提供することを課題としている。 また、 この発明は、 この蛋白質を遺伝子工学的に生産するための材料を提供する ことも課題としている。
発明の開示 この出願は、 上記の課題を解決するものとして、 配列番号 2、 4および 6のそれ ぞれのアミノ酸配列を有する蛋白質ネクチン一 3を提供する。
この蛋白質ネクチン一 3は、 マウス由来の蛋白質であって、 マカスのゲノム遺伝 子から発現される 3種類のスプライシングバリアントである （以下、 それぞれネク チン一3 or、 ネクチン一 3 yS、 ネクチン一 3 rと記載する） 。 この出願は、 また、 前記発明の蛋白質ネクチン一 3をコードするポリヌク レオチ ドを提供する。 このポリヌクレオチドには、 ゲノム DNA、 mRNA、 cDNA 等が含ま れる。 この出願は、 さらに、 3種類のネクチン一 3をコードする cDNA として、 配列番 号 1 、 3および 5のそれぞれの塩基配列を有するポリヌクレオチドを提供する。 さらにこの出願は、 前記発明）のいずれかのポリヌクレオチドを保有する組換えべ クタ一を提供する。 またこの出願は、 前記の 3種類の蛋白質ネクチン一 3のいずれかに対する抗体を提 供する。 なお、 この発明のネクチン一 3は、 ネクチン一 1 およびネクチン一 2と同様に、 全ての哺乳動物に共通して存在する蛋白質であることから、 前記の蛋白質ネクチン 一 3、 およびこれらをコードするポリヌクレオチドはマウス由来のものに限定され るものではない。
図面の簡単な説明 図 1 は、 ネクチン一 3 、 一 2 および一 3 rのアミノ酸配列の比較図である。 背景黒領域は 3つのバリアントでの共通配列、 背景灰色領域はネクチン一 3 β と— 3 rでの共通配列、 下線はシグナルペプチド、 2重下線は膜貫通領域、 星印はァス パラギンのグリコシル化部位を示す。一
図 2は、 ネクチン一3 の trans homo-interaction を確認した結果である。 （A ) はネクチン一 3 αの発現レベルであり、 細胞の溶出物を SDS-PAGE に展開し、 抗ネ クチン一 3なポリクロ一ナル抗体を用いてウェスタンプロッ ト分析した。 （Β) は 細胞凝集活性であり、 〇は親 L細胞株、 ·はネクチン一 3な発現 L細胞株である。 (C) は細胞凝集活性であり、 C 1は親し細胞株、 C 2はネクチン一 2 α発現し細 胞株である。 バ一は 100 mを示す。
図 3は、 ネクチン一 3な の cis homo-dimer形成を確認した結果である。 ネクチン 一 3 発現細胞を B S 3の存在下または非存在下でィンキュベ一トし、 各細胞溶出 物を SDS-PAGE に展開し、 抗ネクチン一 3 αポリクロ一ナル抗体を用いてゥエスタ ンブロッ ト分析した。 矢印は単量体、 矢頭は 2量体を示す。
図 4は、 混合細胞凝集活性を調べた結果である。 A 1 —A3は標識化ネクチン一 1 な発現し細胞株と非標識化ネクチン一 2なは発現し細胞株； B "！ — B 3は標識化 ネクチンー3な発現 L細胞株と非標識化ネクチン一 1 発現 L細胞株； C 1 一 C 3 は標識化ネクチン一 3な発現 L細胞株と非標識化ネクチン一 2 α発現し細胞株 ； A 1、 B 1 C 1 は干渉コントラスト顕微鏡画像； A 2、 B 2、 C 2は蛍光顕微鏡画 像； A3、 B3、 C 3は統計分析の結果である。 バ一は 40 mを示す。
図 5は、 2種類の L細胞株の共培養の免疫蛍光顕微鏡画像である。 1 — 八 3は ネクチン— 1 α発現し細胞株と一 2 α発現し細胞株 ； Β 1 — Β 3はネクチン一 3 α 発現し細胞株と一 1 α発現し細胞株 C I —C3はネクチン一 3 α発現 L細胞株と - 2 α発現し細胞株 ； Α 1、 Β 2はネクチンー 1 ； A 2、 C 2はネクチン一 2 な ； Β 1 はネクチン一 3 （モノクローナル抗体） ； C 1 はネクチン一 3 α (ポリ - クロ一ナル抗体） ； A3、 B3、 C 3は併用染色である。 バ一は mを示す。
図 6は、 trans hetero-interactionの親和性を確認した結果であり、 2細胞凝集の組 成 （標識化細胞と陽標識化細胞） を定量的に分析した。 Aは標識化ネクチン一 1'な 発現し細胞株と非標識化ネクチン一 2な発現 L細胞株； Bは標識化ネクチン一 3 a 発現し細胞株と非標識化ネクチン一 1 発現し細胞株； Cは標識化ネクチン一 3 a 発現し細胞株と非標識化ネクチン一 2な発現し細胞株である。
図ァは、 ネクチン一 3 orとネクチン一 " 1 αまたは一 2なとの cis hetero-dimer形成 を調べた結果である。 Aは cis dimer形成の比較である。 A 1はネクチン一 1 な発現 L細胞株 （レーン 1 ) と一 1 αノ 3 な発現し細胞株 （レーン 2 ) ； A 2はネクチン - 2 α発現し細胞株 （レーン 1 ) と一 2 α 3 α発現 L細胞株 （レーン 2 ) である。 Βは免疫沈降の結果であり、 Β 1 はネクチン一 1 ノ 3 発現 L細胞株、 Β 2はネ クチン一 2 な 3 な発現 L細胞株、 レーン 1 は細胞抽出物、 レーン 2は上清、 レー ン 3は沈殿物である。 矢印は単量体、 矢頭は 2量体である。
図 8は、 ネクチン一 3の組織分布を調べた結果である。 Αはネクチン一 1 、 一 2 および一 3のノーザンプロッ ト分析の結果であり、 A 1 はネクチン— 1 ； A 2はネ クチン一 2 ； A 3はネクチン一 3である。 Bはネクチンー 3 な、 一 3 および一 3 rのノーザンブロッ ト分析の結果であり、 B 1 はネクチン一 3 な、 B 2はネクチン 一 3 β、 Β 3はネクチン一 3 rである。 レーン 1 は心臓、 レーン 2は脳、 レーン 3 は脾臓、 レーン 4は肺、 レーン 5は肝臓、 レーン 6は骨格筋、 レーン 7は腎臓、 レ —ン 8は精巣である。
図 9は、 マウス小腸吸収上皮におけるネクチン一 3 の細胞内局在を調べた結果 である。 Aはネクチン一 3 a ； Bはネクチン一 2 ； Cは併用である。 星印は小腸の 内部空間を示す。 バ一は 10 ju mである。
図 1 0は、 ァフアデインとネクチン一 3 αとの直接的な結合を調べた結果である。 矢印は融合蛋白質 GST-nectin-3な - CP、 矢頭は融合蛋白質 MBP-afadin-PDZを示す。
発明を実施するための最良の形態 マウス蛋白質ネクチン一 3 αは、 配列番号 1 に塩基配列を示した 1650bp の cDNA にコードされた蛋白質であり、 配列番号 2に示した 549 のアミノ酸配列を有してい る。 また、 このネクチン一 3 の全 cDNAは、 配列番号フに示した 2178bpの塩基配 列を有している。 ネクチン一 3；3は、 配列番号 3に塩基配列を示した 1533bpの cDNAにコ一ドされ た蛋白質であリ、 配列番号 4に示した 510のアミノ酸配列を有している。 ネクチン一 3 rは、 配列番号 5に塩基配列を示した 1317bpの cDNAにコ一ドされ た蛋白質であり、 配列番号 6に示した 438のアミノ酸配列を有している。 これらの蛋白質ネクチン一 3は公知の方法によリ、 マウスやその他の哺乳動物組 織から単離する方法、 この発明によって提供されるアミノ酸配列に基づき化学合成 によってぺプチドを調製する方法、 あるいは発明によって提供されるポリヌクレオ チドを用いて組換え DNA 技術で生産する方法などにより取得することができる。 例 えば、 組換え DNA 技術によってネクチン一 3を取得する場合には、 ネクチン一 3を コードするポリヌクレオチドを有するベクタ一からインビトロ転写によって RNA を 調製し、 これを錶型としてインビトロ翻訳を行なうことによりインビトロで発現で きる。 また各ポリヌクレオチドを公知の方法により適当な発現べクタ一に組換えれ ば、 大腸菌、 枯草菌、 酵母、 動植物細胞等で、 ポリヌクレオチドがコードするネク チン一 3を大量に発現させることができる。 この発明の蛋白質ネクチン一 3を大腸菌などの微生物で発現させる場合には、 微 生物中で複製可能なオリジン、 プロモータ一、 リボソーム結合部位、 DNA クロー二 ング部位、 ターミネータ一等を有する発現ベクターに、 この発明のポリヌクレオチ ドを揷入結合して組換えた発現べクタ一を作成し、 この発現ベクターで宿主細胞を 形質転換したのち、 得られた形質転換体を培養すれば、 ポリヌクレオチドがコード しているネクチン一 3を微生物内で大量生産することができる。 あるいは、 他の蛋 白質との融合蛋白質として発現させることもできる。 得られた融合蛋白質を適当な プロテアーゼで切断することによって、 ポリヌクレオチドがコードする蛋白質部分 のみを取得することもできる。 この発明の蛋白質ネクチン一 3を動物細胞で発現させる場合には、 この発明のポ リヌク レオチドを、 動物細胞用プロモータ一、 スプライシング領域、 ポリ（A)付加部 位等を有する動物細胞用発現ベクターに組換え、 動物細胞内に導入すれば、 この発 明の蛋白質ネクチン一 3を動物細胞内で発現できる。 以上のとおり方法によって得られるマウス蛋白質ネクチン一 3は、 例えば、 この 蛋白質を特異的に認識する抗体を作成するための抗原として使用することができる。 蛋白質ネクチン一 3には、 配列番号 2、 4または 6で表されるアミノ酸配列のい かなる部分アミノ酸配列を含むペプチド断片 （5アミノ酸残基以上） も含まれる。 これらのペプチド断片もまた抗体を作製するための抗原として用いることができる。 この発明のポリヌクレオチドは、 前記の蛋白質ネクチン一 3 α、 y8および rをコ —ドする哺乳動物のゲノム遺伝子であって、 例えば、 配列番号 1 、 3または 5の塩 基配列を有するポリヌクレオチ ドまたはその一部配列をプローブとして、 既存のゲ ノムライブラリー等から単離することができる。 この発明のポリヌクレオチドはまた、 配列番号 1 、 3または 5で表される塩基配 列を有することを特徴とする cDNA であり、 前記ネクチン一 3 、 ；8および rをそ れぞれコードしている。 これらのポリヌクレオチドは、 配列番号 1 、 3または 5の 塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドプローブを用いて、 マウスやその 他の哺乳動物 cDNA ライブラリ一をスクリーニングすることにより、 この発明のポ リヌク レオチ ドと同一のクローンを容易に得ることができる。 あるいは、 これらの -オリゴヌクレオチドをプライマーとして、 ポリメラ一ゼ連鎖反応 （PCR) 法を用い て、 目的ポリヌクレオチドを合成することもできる。 一般に哺乳動物の遺伝子は個体差による多型が頻繁に認められる。 従って配列番 号 1 、 3または 5において、 1 または複数個のヌク レオチドの付加、 欠失およびノ または他のヌクレオチドによる置換がなされているポリヌクレオチドもこの発明に 含まれる。 同様に、 これらの変更によって生じる 1 または複数個のアミノ酸残基の 付加、 欠失および Zまたは他のアミノ酸残基による置換がなされている蛋白質も、 配列番号 2、 4または 6で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質の活性を有する限 リ、 この発明に含まれる。 この発明のポリヌクレオチドには、 配列番号 1 、 3または 5で表される塩基配列 のいかなる部分塩基配列を含む DNA 断片 （10bp 以上） 、 あるいはそれらのアンチ センス鎖からなるポリヌクレオチドも含まれる。 この発明の抗体は、 蛋白質ネクチン一 3それ自体、 またはその部分ペプチ ドを抗 原として、 公知の方法により、 ポリクロ一ナル抗体またはモノクローナル抗体とし て得ることができる。 以下、 実施例として、 この発明のネクチンー 3の構造とその機能確認について行 つた実験結果を示す。
実施例
1 . 方法
1 . 1 マウス ' ネクチン一 3 cDNAの分子クロ一ニング
EST データベースから、 ネクチン一 1 および一 2に類似しているが、 同一ではな い 3種類のマウス EST クローン （AM428160, AA492633, AA497887) をマウス脳 cDNA (Clontech社） から PCR増幅した。 これら cDNA混合物をプローブとして用 いてマウス cDNA ライブラリ一 （Stratagene 社） をスクリーニングし、 全長 cDNA を得た。 塩基配列の決定は、 DNA sequencer (ABI 373) を用いて行った。
1 . 2 ネクチン一 3発現べクタ一の構築 ―
ベクタ一 pCAGIPuro (J. Biol. Chem. 275:613-618, 2000) 、 pCAGIPuro-FLAGs pGEX-KG (Anal. Biochem. 192:262-267, 1991 ) 、 pMal-C2 ( New England Biolabs Inc.) および pFastBac1-Msp-Fc (J. Cell Biol. 145:539-549, 1999) を用しヽて以下の ネクチン一 3発現べクタ一を構築した。 なお、 pCAGIPuro-FLAG は、 prepro-trypsin シグナルペプチ ドと pFLAG-CMV1 ( Eastman Kodak Co. ) の FLAG ェピト一プを pCAGIPuroにサブクロ一ニングすることによって作成した。
(a) pCAGIPuro-nectin-3 a ：配列番号 2の 1 - 549 (全長)
(b) pCAG!Puro-FLAG-nectin-3 a ：配列番号 2の 56—549
(c) GST-nectin-3 a -CP：配列番号 2の 433— 549 (細胞質領域)
(d)GST-nectin-3 a -CP-A C：配列番号 2の 433— 545 ( C端 4アミノ酸残基の欠'失）
(e) GST-nectin-3 r -CP：配列番号 6の 397- 438 (細胞質領域)
(f) pFastBac1-Msp-Fc-nactin-3 a -EX： 配列番号 2の 56— 400 (細胞外領域）
1 . 3 形質転換体細胞の構築
L細胞 （京都大学より入手） を 10%ゥシ眙児血清含有の D M E M培地で培養し、 形質転換 L細胞を作成した。 全長ヒ ト ■ ネクチン一 1 ο;を発現する し細胞株 ( nectin-1 な -し cells ) または全長マウス · ネクチン一 2 aを発現する L細胞株 (nectin-2な-し cells) は、 それぞれ文献 (J. Cell Biol. 145:539-549, 1999、 J. Biol. Chem. 275:613-618, 2000) に記載の方法で作成した。 全長マウス 'ネクチン一 3 な を発現する L細胞株 （nectin-3な- L cells) は、 組換え体べクタ一 pCAGIPuro-nectin-3 " orを用いて作成した。 ネクチン一 1 なと FLAG—ネクチン一 3 αを共に発現する細胞 株 （nectin-1 α /3な- L cells) 、 またはネクチン一 2 と FLAG—ネクチン一 3 を共 に発現する細胞株 （ nectin-2 α /3 α -し cells) は、 それぞれ、 細胞株 （nectin-1 な -L cellsおよび nectin-2 α -L cells) (こ、 Lipofectamine reagent (GIBCO BRL) を用し、て、 pCAGIPuro-FLAG-nectin-3 をトランスフエクシヨンすることによって作成した。 各 細胞株は、 1 日培養後、 培地を交換し、 5 ;u g/ml の puromycin ( Sigma Chemical Co.) によって選択した。 一 1 . 4 抗体の作成
ネクチン一 3 に対するゥサギ抗血清 （ポリクローナル抗体） を、 GST-nectin-3な -CPを抗原として作成した。 ネクチン一 3に対するラッ トモノクローナル抗体は、 ネ クチン一 3 の細胞外領域と IgG Fc との融合蛋白質を抗原として作成した。 ゥサギ 抗ネクチン一 1 ポリク口一ナル抗体は文献 （上 Cell Biol. 145:539-549, 1999) に記 載の方法で作成した。 また、 ネクチン一 1 のアミノ酸位置 450— 468に対応する合 成ペプチドを抗原としてゥサギ抗ネクチン一 1 αポリクローナル抗体を文献 （丄 Cell Biol. 145:539-549, 1999) に記載の方法により作成した。 さらに、 ラッ ト抗ネクチン — 2モノクローナル抗体を文献 （丄 Cell Biol. 145:539-549, 1999、 Exp. Cell Res. 235:374-384, 1997) に記載の方法で、 また、 マウス ■ モノクローナルおよ ゥサ ギ - ポリクロ一ナル抗 I-ァフアディン抗体を文献 （丄 Cell Biol. 139:517-528, 1997、 Oncogene 18:1609-1618, 1999) に記載の方法で作成した。 ラッ ト抗 E-力 ドヘリン モノクローナル抗体は竹市博士 （京都大学） から供与された。 マウス抗 FLAG モノ クロ一ナル抗体は Eastman Codakより購入した。
1 - 5 その他の方法
細胞凝集アツセィ （Cell Aggregation Assay) は、 文献 （丄 Cell Biol. 145:539-549, 1999、 J. Biol. Chem. 275:613-618, 2000) (こ言 5載の方法 (こ従って ラつた。 また、 2 種類のし細胞株間での混合細胞凝集アツセィは、 文献 （丄 Cell Biol. 103:171-187, 1986) の記載に従い、 一方のし細胞株を Dil (Molecular Probe Inc.USA) によって事 ―前標識して行った。
化学的交叉結合 (Chemical Cross-linking) は、 文献 (Blood 92:4602-461 1 , 1998, J. Biol. Chem. 275:613-618, 2000 ) に記載の方法に従って行った。 免疫沈'降 ( Immunoprecipitation) は、 文献 （丄 Cell Biol. 145:539-549, 1999、 J. Biol. Chem. 275:613-618 , 2000) に記載の方法に従って行った。 培養細胞の免疫蛍光顕微鏡観察 は、 文献 （丄 Cell Biol. 139:517-528、 J. Cell Biol. 145:539-549, 1999、 丄 Biol. Chem. 275:613-618, 2000) に記載の方法に従って行った。 蛋白質濃度の測定は、 文献 (Anal. Biochem. 72:248-254, 1976) の記載に従って、 ウジ血清アルブミンを対照と する方法により行った。 SDS-PAGE は文献 （Nature 227:680-685, 1970) の記載に 従って行った。
また、 ァフィニ亍ィ一クロマ トグラフィーは以下のとおりに行った。 ァフアディ ン PDZ ドメインの MBP融合蛋白質は amylose resin beads ( New England Biolabs Inc.) に固定化した。 GST-nectin-3な- CPおよび GST-nectin-3 a -CP- A C はそれぞれ ァフィ二ティービーズに固定化した。 これらのビーズを PBS (0.1 % Triton X-100含 有） で十分に洗浄した後、 PBS (20 mM maltose, 0.1 % Triton X-100含有） により溶 '出した。 2 . 結果
2 . 1 ネクチン一 3 CDNAのクロ一ニングとその特徴
マウス cDNA ライブラリ一から得られた cDNA クローンは、 配列番号 7の塩基配 列を有しており、 1647bpからなる翻訳領域 （配列番号 1 ) に 549 アミノ酸配列 （配 列番号 2 ) からなる蛋白質 （推定分子量 60,580) をコードしていた。 また、 このク ローンは前記 EST クローンを全て含んでいた。 この蛋白質をネクチン一 3 と命名 した。
このネクチン一 3 αのアミノ酸配列は、 Ν端疎水性シグナルペプチ ド （配列番号 2の位置 1—55) および膜貫通領域 （配列番号 2の位置 405— 421 ) を有していた。 また、 Ν結合型グリコシル化は位置 73、 83、 125、 186、 222および 331 に見られた。 - また、 このネクチン一 3は、 細胞外領域に 3つの lg 様ドメィンを含んでおり、 細胞 質領域には C端保存モチーフを有していた （表 1 ) 。 表 1 '
C-Terminai sequences of the neciin family
members
Nectin-1a S F S K K E W Y V
Nectin-ΐβ V R T T E P R G E C
Nectin-2 S し S R R A V Y V
Nectin-26 D E F V S R A M Y V
Nectin-3a S V S R R E W Y V
Nectin-3P し Y N P R E H Y V
Nectin-3Y G Q V R A D
以上のとおりのネクチン一3 の構造的な特徴は、 ネクチン一 1 a、 一 1 ^、 一 2なおよび一 2 Sと類似している。 ホモロジ一の程度は領域によって異なるが、 ネ クチン一 3 aの細胞'外領域のアミノ酸配列は、 ネクチン一 1 およびネクチン一 2と それぞれ 35.9%および 30.7%同一であった。
また、 ネクチン一 3なを単離する過程で、 2つのスプライシングバリアント （ネ クチン一 3 ^および一 3 r) が見出された。 ネクチン一 3 の cDNA (翻訳領域） は 1533bp の塩基配列 （配列番号 3) を有しており、 510 のアミノ酸配列 （配列番号 4) からなる蛋白質 （推定分子量 55,808) をコードしている。 このネクチン一 3 の細胞外領域 （配列番号 4の位置"！一 357) はネクチン一 3 aのそれと同一であるが、 膜霣通領域および細胞質領域 （配列番号 4の位置 358—510) はネクチン一 3 aどは 異なっている。 しかし、 ネクチン一 3 は C端保存モチーフを有していた （表 1 ) 。
ネクチン一 3 rの cDNA (翻訳領域） は 1317bpの塩基配列 （配列番号 5) を有し ており、 438 のアミノ酸配列 （配列番号 6) からなる蛋白質 （推定分子量 47,259) をコードしている。 このネクチン一 3 rの細胞外領域、 膜貫通領域および細胞質領 域はネクチン一 3 と同一であるが、 ネクチン一 3 rは C端保存モチーフを欠失し ている （表 1 ) 。
図 1 は、 以上のネクチン一 3 、 一 3 および一 3 rのァミノ酸配列 （ 1 文字記 号） の比較図である。
なお、 以下の実験では主としてネクチン一 3 αを対象とする。 その理由は、 様々 な組織を対象としたノーザンプロッ ト分析の結果、 ネクチン一 3 αが主要なスプラ イシングバリアントであることが確認されたからである （図 8、 Β 1— Β 3参照） 。
2 . 2 ネクチン一 3 なの trans Homo-Interactionと cic Homo-dimer Formation nectin-1 a -L cellsおよび nectin-2な- L cells を用いた研究により、 ネクチン一 1 およびネクチン一 2 なが細胞一細胞接着活性 （trans Homo-Interaction) を示すこと 力《確言忍されてしゝる （丄 Cell Biol. 145:539-549, 1999、 丄 Biol. Chem. 275:613-618, 2000) 。 そこで ¾ず、 ネクチン一 3 なが同様の活性を有するか否かを調べた。 抗ネ クチン— 3ポリクロ一ナル抗体は、 細胞株 nectin-3 o; -し cells の発現産物について、 分子量約 100 kDa の 2つの蛋白質バンドを認識した （図 2 A、 図 3 ) 。 これらは、 グリコシル化等の翻訳後修飾の違いによるものと考えられる。 また、 これらの分子 量は、 アミノ酸配列から推定される分子量とも異なるが、 これもまたグリコシル化 の相違によるものと考えられる。 さらに、 各細胞株におけるネクチン一 1 な、 - αおよび一 3 αの発現レベルは同等であった （データ示さず） 。
次に、 細胞株 nectin-3 o; -し cellsを用いてネクチン— 3 αの細胞凝集活性を調べた。 その結果、 ネクチン一 3 αは経時的に細胞凝集活性を示した （図 2 B、 C 1、 C 2 ) 。 この活性は EDTA 添加によって影響されないことから （データ示さず） 、 ネ クチン一 3 なの細胞一細胞接着活性は C a 2 +非依存性であることが確認された。 以 上の結果から、 ネクチン一 3 αは、 ネクチン一 1 α、 一 2 および一 2 Sと同様 〈丄 Cell Biol. 145:539-549, 1999、 Exp. Cell Res. 235:374-384, 1997、 Blood 92:4602- 4611 , 1998、 J. Biol. Chem. 275:613-618, 2000) の C a 2 +非依存性のホモフィリツ ク CAM (細胞接着分子） であることが確認された。
ネクチン一 1 αおよび一 2 αは cis homo-dimer を形成することが知られているの で （丄 Biol. Chem. 275:613-618, 2000) 、 ネクチン一 3 αについても同様に活性につ いて調べた。 細胞株 nectin-3 a -し cells を単一細胞に分離し、 細胞表面クロスリンカ -BS3 と共にインキュベートし、 抗ネクチン一 3 αポリクロ一ナル抗体を用いてゥ エスタンブロッ ト分析を行った。 その結果、 2量体に対応する分子量約 200〜 220 kDa のバンドが確認された （図 3 ) 。 また、 より高分子量のバンドも検出された。 この交叉結合は単一細胞懸濁により行ったので、 このダイマーやオリゴマーは trans homo-interactionよりも cis homo-interaction (こよるものである可能性か卨し、。
2 . 3 ネクチン一 3 orとネクチン一 1 α;または一 2なとの trans Hetero-interaction ネクチンファ ミ リーの各メ ンパーがヘテロフイ リ ックな細胞一細胞接着活性 (trans hetero-iteraction) を示すか否かを調べるため、 混合細胞凝集アツセィを行つ た。 Dil 標識された細胞株 nectin-1 な - L-cells が非標識 nectin-2 -レ cells と混合され た場合には、 常に、 標識細胞だけか、 または非標識細胞だけが凝集し （図 4 A 1 — A 3 ) 、 両方のし細胞株からなる凝集塊はほとんど検出されなかった。 一方、 Dii 標 識された細胞株 nectin-3 -し- cellsが非標識細胞株 nectin-1 a -L-cells と混合された場 合には、 標識細胞と非標識細胞とからなる凝集塊が観察された （図 4 B 1 — B 3 ) 。 このことは、 ネクチン一 3ながネクチン一 1 と trans hetero-interactionを形成する ことを示している。 また、 同様の結果が、 ネクチン一 3 αとネクチン一 2なについ ても得られた （図 4 .C 1 — C 3 ) 。
さらにこの結果を確認するため、 免疫蛍光顕微鏡観察を行った。 細胞株 nectin-l a -レ cells と細胞株 nectin-2 a -L-cellsとを共培養した場合には、 ネクチン一 1 なとネク - チン一 2 なは、 それぞれのし細胞株の細胞一細胞接触部位に局在していた （図 5 A 1 - A 3 ) が、 ネクチン一 1 なおよびネクチン一 2なは 2つのし細胞株同士の接触 部位には検出されなかった。 一方、 細胞株 nectin-3 a -し- cells と細胞株 nectin-1 c -レ cells とを共培養した場合には、 ネクチン一 3 なとネクチン一 1 なは、 2つのし細胞 .株同士の接触部位に共存していた （図 5 B 1 — B 3 ) 。 同様の結果は、 細胞株 nectin-3 a -L-cells と細胞株 nectin-2な- L-cells とを共培養した場合にも観察された (図 5 C 1 — C 3 ) 。 これらの結果から、 ネクチン一 ·3 αはネクチン一 1 なおよび — 2 αと trans hetero-interactionを形成するが、 ネクチン一 1 なと一 2 αはそのよう な相互作用を示さないことが確認された。
次に、 ネクチンファミリ一の各メンバーが、 trans homo-interactionを形成するか、 あるいは trans hetero- interactionを形成するかを調べるため、 混合細胞凝集アツセィ を用いて 2種類の細胞凝集を分析した。 4細咆凝集の結果と同様に、 細胞株 nectin-1 α -L-cells と細胞株 nectin-2な-レ cellsとを混合した場合には、 ホモ型の 2細胞凝集が 形成された （図 6 A ) 。 これに対して、 細胞株 nectin-1 α -L-cells と細胞株 nectin-3 α -し cells とを混合した場合にはへテロ型の 2細胞凝集が形成され、 ホモ型の細胞凝 集はほとんど観察されなかった （図 6 B ) 。 同様の結果は、 細胞株 nectin-3 a -し- cells と細胞株 nectin-2 o; -し- cells とを混合した場合にも観察された （図 6 C ) 。 以上 の結果から、 ネクチン一 3 α とネクチン一 1 なまたは一 2 αとの trans hetero- interaction の親和性は、 ネクチン一 "I な 、 一 2 αまたは一 3 な の trans homo- interactionの親和性より明らかに強いことが確認された。
2 . 4 ネクチン一 3 αとネクチン一 1 αまたは一 2 な との cis hetero-dimer形成 ネクチン一3 αがネクチン一 1 αまたは一 2 αと cis hetero-dimerを形成するか否 かを調べるため、 細胞株 nectin-1 α /3な-し cells および細胞株 nectin-2 α /3な-し cells を用いて、 FLAG-ネクチン一 3 αをそれぞれ細胞株 nectin-1 α -し ce!ls および細胞株 nectin-2 -L cells で発現させた。 その結果、 Fし AG—ネクチン一 3 なは、 ネクチン一 1 なまたは一 2 なの cis dimerのサイズを変えなかった （図フ A 1 および A 2 ) 。 細 胞株 nectin-1 α /3 α -し cells に細胞表面交叉結合を行い、 次いで抗 FLAG モノクロ一 - ナル抗体を用いて免疫沈降を行うと、 ネクチン一 1 なは上清中に回収され、 FLAG— ネクチン一 3 α とは共免疫沈降しなかった （図フ Β 1 ) 。 同様の結果は細胞株 nectin-2 /3な -し cellsにおいても得られた （図 7 B 2 ) 。 以上の結果から、 ネクチン 一 3 αは、 ネクチン一 1 なまたは一 2 な とは cis hetero-dimerを形成しないことが確 認された。
2 . 5 ネクチン一 3 αの組織分布および細胞内局在
以前の報告 ( J. Virol. 66:2807-2813, 1992、 Gene 155:261-265, 1995、 Gene 159:267-272, 1995) と同様に、 ノーザンブロッ ト分析の結果からは、 ネクチン一 1 は脳で優性に発現しており、 ネクチン一 2は全身性に発現していた （図 8 A 1 およ び A 2 ) 。 ネクチン一 3の 3種類のスプライシングバリアントに共通な翻訳領域を プローブとして用いたノーザンブロッ ト分析では、 様々な組織において幾つかの mRNA バンドが検出された （図 8 A 3 ) 。 そこで、 各バリアントの組織分布を調べ るために、 各バリアントに特異的な cDNA プローブを用いた。 ネクチン一 3 αは約 5.2- kb、 3.8-kb、 3.3-kb および 2.7-kb の mRNAバンドを示し、 これらは精巣で有意 に発現し、 他の組織 （心臓、 脳、 肺、 肝臓および腎臓） では僅かに発現していた (図 8 B 1 ) 。 ネクチン一 3 は約 5.2-kbおよび 3.3-kbの mRNAバンドを示し、 こ れらは精巣で発現していた （図 8 B 2 ) 。 ネクチン一 3 rは精巣において約 3.3-kb の mRNA バンドを示し、 肺、 肝臓および腎臓において 2.1-kb の mRNA バンドを示 した （図 8 B 3 ) 。
次に、 ネクチン一 3 αの細胞内局在を調べるため、 抗ネクチン一 3 αポリクロ一 ナル抗体を用いて免疫蛍光顕微鏡観察を行った。 ネクチン一 3 は、 マウス小腸吸 収上皮の接着複合体領域にネクチン一 2と共存していた （図 9 ) 。 以上の結果から、 ネクチン一 2と同様に （丄 Cell Biol. 145:539-549, 1999) 、 ネクチン一 3 αもまた力 ドへリン性細胞一細胞 AJsに局在していることが示唆された。
2 . 6 ネクチン一 3とァフアデインとの直接結合
ネクチン一 3 ながァフアデインと直接に結合するか否かを調べるため、 ァフィ二 - ティークロマトグラフィ一を行った。 ネクチン一 3 の細胞質領域の GST 融合蛋白 質 （GST-nectin-3な- CP) は、 amylose resin beadsに固定化された MBP-afadin-PDZ (ァフアディンの PDZ 領域との MBP 融合蛋白質） に結合した （図 1 0 ) 。 ネクチ ン一 3 αのァフアデインへの結合の化学量論は約 1 ： 1 であった。 これに対して、 細胞質領域の C端 4アミノ酸残基を欠失したネクチン一 3 との GST 融合蛋白質 (GST-nectin-3 a -CP- Δ Ο は結合しなかった。 同じく、 C端の保存モチーフを欠失 しているネクチン一 3 rの細胞質領域との GST 融合蛋白質もァフィ二ティ一ビーズ とは結合しなかった。 産業上の利用可能性 以上詳しく説明したとおり、 この出願の発明によって、 ネクチン一 1 および一 2 と同一の蛋白質フアミリーに属する新規蛋白質ネクチン一 3が提供される。 この蛋 白質は、 細胞結合の分子機構の全容を解明するための重要な情報を提供するばかり か、 例えば癌腫の浸潤、 転移のメカニズムの解明につながる可能性もあり、 癌腫の 悪性度の診断やその予防■治療法、 治療薬等の開発に有用である。

Claims

請求の範囲
1 - 配列番号 2のアミノ酸配列を有する蛋白質ネクチン一 3。
2 . 配列番号 4のアミノ酸配列を有する蛋白質ネクチン一 3。
3 . 配列番号 6のアミノ酸配列を有する蛋白質ネクチン一 3。
4 . 請求項 1 から 3のいずれかの蛋白質ネクチン一 3をコードするポリヌクレオ チド。
5 . 配列番号 1 の塩基配列を有する請求項 2のポリヌクレオチド。
6 . 配列番号 3の塩基配列を有する請求項 2のポリヌクレオチド。
7 . 配列番号 5の塩基配列を有する請求項 2のポリヌクレオチド。
8 . 請求項 4から 7のいずれかのポリヌクレオチドを保有する組換えべクタ一。
9 . 請求項 1 から 3のいずれかの蛋白質ネクチン一 3に対する抗体。
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