JP2020025519A - 細胞凝集塊の観察方法 - Google Patents

Abstract

【課題】細胞凝集塊の良好な観察結果を取得する。【解決手段】細胞凝集塊１００の観察方法は、ナノダイヤモンド５４を含む細胞凝集塊１００を作製するステップＳ１０と、細胞凝集塊１００に対して、互いに異なる２以上の方向から励起光である分岐レーザＬ１、Ｌ２を照射し、分岐レーザＬ１、Ｌ２の照射の結果として発生する蛍光を蛍光検出部７によって取得することにより得られるスライス画像を複数取得するステップＳ２０と、複数のスライス画像を利用して、細胞凝集塊１００の三次元像を再構築するステップＳ３０と、を有する。【選択図】図１

Description

本発明は、細胞凝集塊の観察方法に関する。

非特許文献１は、蛍光顕微鏡を用いて細胞を観察する技術を開示する。この文献に開示された観察技術では、まず、細胞凝集塊の切片を作製する。そして、当該切片に対して免疫組織学的な染色処理を施す。非特許文献２も、細胞を観察する技術を開示する。この文献に開示された技術では、ナノダイヤモンドを用いる。ナノダイヤモンドを取り込ませた細胞を二次元培養させながら、当該ナノダイヤモンドをマーカーとして用いる。

フランチェスコパンパローニ、 ナリマン アンサリ、エルンストエイチ・ケー・シュテルツァ（Francesco Pampaloni & Nariman Ansari & Ernst H. K. Stelzer）、"ライトシート蛍光顕微鏡による生細胞スフェロイドの高分解能深部イメージング蛍光顕微鏡"（High-resolution deep imaging of live cellular spheroids with light-sheet-based fluorescence microscopy）、セルアンド ティシュー リサーチ（Cell and Tissue Research）、平成２５年２月２７日（27 February 2013）、352号、pp161-pp177。 エス．アール．ヘメラール他（S. R.Hemelaar et.al,）、"顕微鏡用多目的ラベルとしてのナノダイヤモンド"（Nanodiamonds as multi-purpose labels for microscopy） [online]、平成２９年４月７日（07 April2017）、サイエンティフィック レポート（ScientificReports）、[平成30年7月5日検索]、インターネット〈https://www.nature.com/articles/s41598-017-00797-2〉。

従来、再生医療分野などでは、平面培養よって得られたいわゆる二次元培養細胞が用いられていた。近年は、オルガノイド（ミニ組織）およびスフェロイド（細胞凝集塊）が注目されている。これらの組織及び細胞凝集塊は、二次元培養細胞と生体組織との中間的な性質を有する。そして、各種の細胞を基に、マイクロメートルオーダーのミニ組織及び細胞凝集塊が作出されている。これらのミニ組織及び細胞凝集塊は、より臨床検体に近い試料として、創薬分野及び医療分野への利用が期待されている。

細胞凝集塊を利用する場合には、細胞凝集塊の深部に位置する細胞の状態を観察することもある。細胞の観察には、例えば、非特許文献１、２が開示するような技術が利用される。例えば、非特許文献２のように、励起光の照射に起因する蛍光を利用して、蛍光像を得る。つまり、細胞を観察する際には、細胞凝集塊に対して複数回の励起光の照射が行われる。

しかし、励起光の照射回数が増加すると、蛍光色素の退色が生じる。したがって、励起光の照射を重ねるごとに蛍光強度が弱まる。その結果、良好な細胞凝集塊の像を得ることが難しくなる。

そこで、本発明は、細胞凝集塊に与える影響を抑制しつつ、良好な観察結果を得ることが可能な細胞凝集塊の観察方法を提供することを目的とする。

本発明の一形態である細胞凝集塊の観察方法は、ナノダイヤモンドを第１蛍光物質として含む細胞凝集塊を作製する第１工程と、細胞凝集塊に対して、励起光を照射し、励起光の照射の結果として発生する蛍光を光検出部によって取得することにより得られるスライス画像を複数取得する第２工程と、複数のスライス画像を利用して、細胞凝集塊の三次元像を再構築する第３工程と、を含む。

この方法では、細胞凝集塊が蛍光プローブとしてのナノダイヤモンドを取り込んでいる。ナノダイヤモンドは、細胞凝集塊を構成する細胞に対して毒性を示さない。従って、細胞凝集塊に与える影響を抑制できる。そして、スライス画像を得るステップでは、複数回の励起光の照射が行われる。ここで、ナノダイヤモンドは、一般に使用される蛍光色素が示す褪色性を有しない。つまり、複数回の励起光の照射を行っても、蛍光強度が有意に低下することがない。従って、良好な輝度を有する複数枚のスライス画像を得ることができる。従って、細胞凝集塊に与える影響を抑制しつつ、良好な観察結果を得ることができる。

一形態において、第１工程は、複数の培養細胞を得る工程と、複数の培養細胞にナノダイヤモンドを取り込ませる工程と、ナノダイヤモンドを取り込ませた培養細胞を利用して、細胞凝集塊を作製する工程と、を含んでもよい。この工程によれば、ナノダイヤモンドを取り込んだ細胞によって、細胞凝集塊の表面及び内部を構成することが可能である。従って、内部にも確実にナノダイヤモンドを取り込ませた細胞凝集塊を得ることができる。

一形態において、培養細胞を得る工程では、培地を収容した容器の表面に培養細胞が接触した状態で培養細胞を平面培養し、ナノダイヤモンドを取り込ませる工程では、容器の表面に培養細胞が接触した状態で、培地にナノダイヤモンドを添加してもよい。この工程によっても、内部にナノダイヤモンドを確実に取り込ませた細胞凝集塊を得ることができる。

一形態において、培養細胞を得る工程では、培地を収容した容器の表面に培養細胞が接触した状態で培養細胞を平面培養し、ナノダイヤモンドを取り込ませる工程では、容器の表面から培養細胞を離間させることにより、培養細胞を含む細胞懸濁液を得た後に、細胞懸濁液にナノダイヤモンドを添加してもよい。この工程によっても、内部にナノダイヤモンドを確実に取り込ませた細胞凝集塊を得ることができる。

一形態において、第１工程は、第２蛍光物質を培養細胞に取り込ませる工程をさらに含み、第２蛍光物質の励起光の波長又は蛍光の波長はナノダイヤモンドの励起光の波長又は蛍光の波長と重複し、第２工程は、マイクロ波を第１蛍光物質及び第２蛍光物質を含む細胞凝集塊に照射した状態で、第１スライス画像を得る工程と、マイクロ波の照射を停止した状態で、第２スライス画像を得る工程と、第１スライス画像と第２スライス画像の差分を得る工程と、をさらに含んでもよい。これらの工程によれば、第１スライス画像が含む第２蛍光物質に起因する蛍光の強度は、第２スライス画像が含む第２蛍光物質に起因する蛍光の強度と同じになる。一方、第１スライス画像が含むナノダイヤモンドに起因する蛍光の強度と、第２スライス画像が含むナノダイヤモンドに起因する蛍光の強度と、を異ならせることができる。従って、第１スライス画像と第２スライス画像との差分を得ることにより、第２蛍光物質に起因する蛍光がキャンセルされ、ナノダイヤモンドに起因する蛍光のみを検出することができる。したがって、第１及び第２蛍光物質を含む細胞凝集塊の観察を同時に行うことができる。

本発明によれば、細胞凝集塊の良好な観察結果を取得可能な細胞凝集塊の観察方法が提供される。

図１は、第１実施形態に係る細胞凝集塊の観察方法の主な工程を示すフロー図である。 図２の（ａ）部、（ｂ）部および（ｃ）部は、細胞凝集塊を準備する主要な工程を示す図である。 図３の（ａ）部、（ｂ）部および（ｃ）部は、細胞凝集塊を準備する図２に続く主要な工程を示す図である。 図４の（ａ）部および（ｂ）部は、図１に示す工程によって得られた細胞凝集塊の例示である。 図５は、第１実施形態に係る細胞凝集塊の観察方法に用いる二光子顕微鏡の構成を示す図である。 図６の（ａ）部、（ｂ）部、（ｃ）部及び（ｄ）部は、二光子顕微鏡の動作を示す図である。 図７は、細胞凝集塊へ分岐レーザを照射する様子を示す斜視図である。 図８は、三次元画像を形成する動作を示す図である。 図９は、第２実施形態に係る細胞凝集塊の観察方法の主な工程を示すフロー図である。 図１０の（ａ）部、（ｂ）部および（ｃ）部は、細胞凝集塊を準備する工程の変形例を示す図である。

＜第１実施形態＞
以下、添付図面を参照しながら本発明を実施するための形態を詳細に説明する。図面の説明において同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省略する。

図１に示すように、まず、細胞凝集塊１００（図３の（ｃ）部参照）を準備する（ステップＳ１０：第１工程）。細胞凝集塊１００は、スフェロイドとも呼ばれる。細胞凝集塊１００は、例えば、大きさが１ｍｍ程度であり、細胞が密集した構造を有する。細胞凝集塊１００は、二次元的に培養される細胞と比較して、増殖の速度が遅い。

また、本実施形態に係る細胞凝集塊１００は、観察のための蛍光色素として、ナノダイヤモンド５４（第１蛍光物質、図２の（ｂ）部参照）を含んでいる。ナノダイヤモンド５４は、直径がナノメートルオーダーの微小な粒子である。ナノダイヤモンド５４は、いくつかの種類があるが、実施形態で用いるナノダイヤモンド５４は、いわゆる蛍光ナノダイヤモンドである。ダイヤモンドは、不純物としての窒素（Ｎ）を含有し、当該窒素に起因する空孔（Ｖ）を含み得る。例えば、窒素は、ダイヤモンド格子における炭素原子の置換位置に入ることがある。これらの窒素と空乏とにより構成される欠陥は、ＮＶ欠陥と呼ばれる。ＮＶ欠陥を有するナノダイヤモンド５４は、赤及び近赤外蛍光、つまり赤色の蛍光を生じさせる。このようなナノダイヤモンド５４は、ＮＶ中心（窒素・空孔複合体）のナノダイヤモンド５４とも呼ぶ。ＮＶ中心のナノダイヤモンド５４の励起光波長は、４９０ｎｍ以上５６０ｎｍ以下程度である。ＮＶ中心のナノダイヤモンド５４の蛍光波長は、６３７ｎｍ以上８００ｎｍ以下程度である。また、ナノダイヤモンド５４の量子効率は０．７以上０．８以下であり、蛍光寿命は２５ナノ秒程度である。

細胞凝集塊１００を準備する工程は、主に、３つのステップＳ１１、Ｓ１３、Ｓ１５を有する。

はじめに、培養細胞５３を得る（ステップＳ１１、図２の（ａ）部参照）。培養細胞５３は、二次元培養又は平面培養とよばれる方法によって得られる単層の細胞である。図２の（ａ）部に示すように、二次元培養においては、培養細胞５３は、容器５１の表面５１ａに接触しながら、増殖する。なお、培養細胞５３を得るための培養方法には、特に制限はなく、細胞の種類に応じた適切な培養方法を用いてよい。

次に、培養細胞５３にナノダイヤモンド５４を取り込ませる（ステップＳ１３、図２の（ｂ）部参照）。実施形態に係る細胞凝集塊１００は、ナノダイヤモンド５４を含むものであることはすでに述べた。このナノダイヤモンド５４は、単層の細胞としての中間生成物であるときに、取り込ませてもよい。例えば、図２の（ｂ）部に示すように、ナノダイヤモンド５４を取り込ませるために、培養細胞５３が平面培養されている培地５２内に、ナノダイヤモンド５４を添加する。このとき、培養細胞５３は、容器５１の表面５１ａに張り付いたままである。ナノダイヤモンド５４は、いわゆるエンドサイトーシスの作用によって、培養細胞５３に取り込まれる。添加するナノダイヤモンド５４として、例えば、直径が１００ｎｍ又は１０ｎｍのものが挙げられる。そして、添加した状態を数時間放置する。放置時間は、例えば６時間である。時間の経過と共に、ナノダイヤモンド５４は、培養細胞５３の表面から取り込まれ、その後に細胞質に拡散する（図２の（ｃ）部参照）。その結果、ナノダイヤモンド５４を含む培養細胞５３Ａが得られる。

次に、細胞凝集塊１００を作製する（ステップＳ１５）。このステップＳ１５は、ステップＳ１１、Ｓ１３によって得たナノダイヤモンド５４を含有する培養細胞５３Ａを用いて、細胞凝集塊１００を作製する。まず、培養細胞５３Ａを容器５１の表面５１ａからはがす（図３の（ａ）部参照）。例えば、培養細胞５３Ａは、トリプシン等の酵素を用いた処理により表面５１ａからはがすと共に、個々の培養細胞５３Ａごとに分離する。ナノダイヤモンド５４を含有する培養細胞５３Ａから、スフェロイドである細胞凝集塊１００を得る処理は、細胞の種類や特性に応じて、適当な処理方法を選択してよい。例えば、細胞低吸着処理を行ったウェル５６を用いてもよい（図３の（ｂ）部参照）。このウェル５６に培養細胞５３Ａを保持することにより、細胞凝集塊１００を形成することができる。図３の（ｂ）部に示すように、培養細胞５３Ａを含む細胞懸濁液をウェル５６へ移す。その後、所定時間だけ放置する。図３の（ｃ）部に示すように、時間の経過と共に培養細胞５３Ａが凝集するので、培養細胞５３Ａから細胞凝集塊１００が形成される。

以上のステップＳ１１、Ｓ１３、Ｓ１５により、ナノダイヤモンド５４を含有した細胞凝集塊１００が得られる。

図４の（ａ）部および（ｂ）部は、上述したステップＳ１１、Ｓ１３、Ｓ１５により作製した細胞凝集塊の一例を示す顕微鏡写真である。（ａ）部は、直径が１００ｎｍであるナノダイヤモンドを取り込ませた細胞凝集塊の写真である。（ｂ）部は、直径が１０ｎｍであるナノダイヤモンドを取り込ませた細胞凝集塊の写真である。まず、ステップＳ１１では、いわゆるＭＣＦ−７細胞を二次元培養した。この培養により、３．０×１０^４個程度の培養細胞を得た。次にステップＳ１３において、ある培養細胞には、直径が１００ｎｍであるナノダイヤモンドを取り込ませた。また、別の培養細胞には、直径が１０ｎｍであるナノダイヤモンドを取り込ませた。添加したナノダイヤモンドの量は、それぞれ１０μｇである。また、使用したナノダイヤモンドは、Adamas Nanotechnologies社製品の型番ＮＤＮＶ１００ｎｍ、および型番ＮＤＮＶ１０ｎｍのものである。そして、添加後、６時間放置した。６時間経過したのちに、培養された細胞をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）を用いて洗浄した。次に、ステップＳ１５において、ウェルを有する培養容器を用いてスフェロイド（細胞凝集塊）を作製した。例えば、１個のウェルには、１．０×１０^４個の細胞を配置した。そして、所定時間（数時間）放置した。その結果、図４の（ａ）部及び（ｂ）部に示す細胞凝集塊を得た。

次に、ナノダイヤモンド５４を含有した細胞凝集塊１００のスライス画像を得る（ステップＳ２０：第２工程）。このステップＳ２０は、図５に示す二光子顕微鏡１を用いる。二光子顕微鏡１は、励起光を細胞凝集塊１００に照射する。細胞凝集塊１００には、蛍光プローブとしてのナノダイヤモンド５４が取り込まれている。その結果、励起光を照射すると、ナノダイヤモンド５４に起因して細胞凝集塊１００が蛍光を発する。当該蛍光を検出することにより、細胞凝集塊１００の画像が得られる。二光子顕微鏡１は、光学系として、光源２と、レーザ走査部３（走査部）と、レーザ分岐部４（分岐部）と、レーザ照射部６（照射部）と、蛍光検出部７と、を有する。また、二光子顕微鏡１は、制御系としてコントローラ８を有する。さらに、二光子顕微鏡１は、処理系としてコンピュータ９を有する。二光子顕微鏡１の詳細については、後述する。

まず、走査平面Ｃ１、Ｃ２を設定する（ステップＳ２１）。図６の（ａ）部に示すように、軸線Ｓ１には、基準点ＴＣが設定されている。基準点ＴＣは、対物レンズ２８の焦点と、対物レンズ３２の焦点と、が一致する点である。対物レンズ２８の同焦点距離Ｍ１と対物レンズ３２の同焦点距離Ｍ２とが互いに等しいならば、基準点ＴＣは、対物レンズ２８、３２の軸線Ｓ１上における中点である。細胞凝集塊１００は、軸線Ｓ１上において基準点ＴＣを含むように設定されている。

コントローラ８は、走査平面Ｃ１、Ｃ２の初期位置を設定する。コントローラ８は、焦点調整部２９に制御信号φ２を提供するとともに、焦点調整部３３に制御信号φ３を提供する。これら制御信号φ２、φ３によって、軸線Ｓ１方向における走査平面Ｃ１、Ｃ２の位置が設定される。細胞凝集塊１００の一方側（ここでは上側）に配置された走査平面Ｃ１は、基準点ＴＣから距離Ｄ１ａだけ離間した位置に設定される。細胞凝集塊１００の他方側（ここでは下側）に配置された走査平面Ｃ２も同様に、基準点ＴＣから距離Ｄ２ａだけ離間した位置に設定される。なお、距離Ｄ１ａは、距離Ｄ２ａと等しい（Ｄ１＝Ｄ２）。

次に、コントローラ８は、初期位置に設定された走査平面Ｃ１、Ｃ２に向けて励起光である分岐レーザＬ１、Ｌ２の照射を開始する（ステップＳ２３）。具体的には、コントローラ８は、レーザ走査部３に対して制御信号φ１を提供し、走査平面Ｃ１、Ｃ２における励起光の走査を開始する。ここで、図５に示すように、レーザ走査部３は、レーザ分岐部４よりも上流側に配置されている。換言すると、走査状態において、レーザ分岐部４に入射するレーザＬの進行方向は、連続的に変化している。そして、進行方向が変化しているレーザＬが、レーザ分岐部４によって分岐される。その結果、分岐レーザＬ１、Ｌ２の動きは、互いに同期している。従って、図７に示すように、軸線Ｓ１の方向から走査平面Ｃ１、Ｃ２を見た場合に、走査平面Ｃ１における分岐レーザＬ１の照射位置Ｔ１は、走査平面Ｃ２における分岐レーザＬ２の照射位置Ｔ２と常に重複する。

これら分岐レーザＬ１、Ｌ２の走査中において、センサ４１、４１Ａ（図５参照）によって二次元画像を取得する（ステップＳ２５）。走査平面Ｃ１、Ｃ２における走査が完了した後、次に、コントローラ８は、レーザ走査部３に対して制御信号φ１を提供し、走査を停止する。

次に、コントローラ８は、走査平面Ｃ１に関する設定動作を再び行う（ステップＳ２１）。再設定動作とは、基準点ＴＣから軸線Ｓ１に沿った走査平面Ｃ１の位置を変更する動作をいう。より詳細には、分岐レーザＬ１の軸線Ｓ１に沿った集光位置を変更する動作をいう。

ここで、本実施形態の二光子顕微鏡１は、照射ユニット２４、２６のそれぞれについて焦点調整部２９、３３を設けた。換言すると、一方の分岐レーザＬ１に焦点可変レンズ３４が設けられ、他方の分岐レーザＬ２にも焦点可変レンズ３４が設けられた。そして、焦点調整部２９、３３の動作は、互いに独立している。つまり、分岐レーザＬ１、Ｌ２は、深さ方向における焦点位置を互いに独立して制御可能である。ここでいう深さ方向とは、図６の（ａ）部において、基準点ＴＣを原点とした軸線Ｓ１に沿った距離（距離Ｄ１ａ、Ｄ２ａ）である。換言すると、分岐レーザＬ１の走査平面Ｃ１の位置と、分岐レーザＬ２の走査平面Ｃ２の位置と、は、互いに独立に制御することができる。例えば、走査平面Ｃ１、Ｃ２のいずれか一方のみを移動させてもよい。なお、走査平面Ｃ１、Ｃ２の両方を移動させてもよい。

図６の（ｂ）部に示すように、コントローラ８は、一方の焦点調整部２９に制御信号φ２を提供する。その結果、分岐レーザＬ１の集光位置は、変化する。具体的には、集光位置は、基準点ＴＣから距離Ｄ１ａだけ離間した位置から、基準点ＴＣから距離Ｄ１ｂだけ離れた位置に変化する。なお、距離Ｄ１ｂは、距離Ｄ１ａより短い。集光位置は、軸線Ｓ１における走査平面Ｃ１の一部である。従って、分岐レーザＬ１が基準点ＴＣから距離Ｄ１ｂだけ離れた位置に集光されるということは、換言すると、分岐レーザＬ１の走査平面Ｃ１が基準点ＴＣから距離Ｄ１ｂだけ離れた位置に設定されたことになる。なお、他方の焦点調整部３３は、走査平面Ｃ２の位置を維持する。

次に、コントローラ８は、走査平面Ｃ１における走査を再び行う（ステップＳ２３）。具体的には、コントローラ８は、レーザ走査部３に制御信号φ１を提供して、走査を行う。当該走査と同時に、二次元画像の取得を行う。

以下、走査平面Ｃ１に関する再設定動作と、走査と、二次元画像の取得と、を繰り返す。このとき、コントローラ８は、再設定動作を繰り返すごとに、走査平面Ｃ１から基準点ＴＣまでの距離が小さくなるように走査平面Ｃ１を設定する。換言すると、再設定ごとに、走査平面Ｃ１は、基準点ＴＣに近づいていく。そして、図６の（ｃ）部に示すように、走査平面Ｃ１から基準点ＴＣまでの距離がゼロとなったとき、走査平面Ｃ１に関する再設定動作と、走査と、を終了する。

次に、コントローラ８は、走査平面Ｃ２に関する再設定動作と、走査と、を行う。これらの動作も、上述した走査平面Ｃ１に関する再設定動作及び走査と同様である。そして、そして、図６の（ｄ）部に示すように、走査平面Ｃ２から基準点ＴＣまでの距離がゼロとなったとき、走査平面Ｃ２に関する再設定動作と、走査と、を終了する。

上述したように、スライス画像を得るステップＳ２０では、複数回の励起光の照射が行われる。ここで、ナノダイヤモンド５４は、一般に使用される蛍光色素が示す褪色性を有しない。つまり、複数回の励起光の照射を行っても、蛍光強度が有意に低下することがない。従って、良好な輝度を有する複数枚のスライス画像を得ることができる。

次に、合成三次元画像を得る（ステップＳ３０：第３工程）。画像を合成する動作は、処理装置であるコンピュータ９によって行われる。上述した走査によれば、複数枚のスライス画像が得られる。例えば、図８におけるスライス画像ＧＮ（ａ）（ａ：１、２、３、４、５、６）は、走査平面Ｃ１（ａ）（ａ：１、２、３、４、５、６）に関する走査によって得られた画像の例示である。スライス画像ＧＭ（ａ）（ａ：１、２、３、４、５、６）は、走査平面Ｃ２（ａ）（ａ：１、２、３、４、５、６）に関する走査によって得られた画像の例示である。ここで、走査平面Ｃ１（６）及び走査平面Ｃ２（６）は、それぞれ基準点ＴＣを含む。つまり、走査平面Ｃ１（６）及び走査平面Ｃ２（６）は、実質的には、同一である。

コンピュータ９は、スライス画像ＧＮ（ａ）（ａ：１、２、３、４、５、６）を用いて細胞凝集塊１００の三次元画像ＴＤ１を再構築する（ステップＳ３１）。再構築には、所望の画像処理プログラムを用いてよい。三次元画像ＴＤ１は、基準点ＴＣを含む基準平面と照射ユニット２４との間に存在する細胞凝集塊１００の領域を示す。例えば、三次元画像ＴＤ１が示す部分は、細胞凝集塊１００の上側半分であるともいえる。同様に、コンピュータ９は、スライス画像ＧＭ（ａ）（ａ：１、２、３、４、５、６）を用いて細胞凝集塊１００の三次元画像ＴＤ２を再構築する（ステップＳ３１）。三次元画像ＴＤ２は、基準点ＴＣを含む基準平面と照射ユニット２６との間に存在する細胞凝集塊１００の領域を示す。例えば、三次元画像ＴＤ２が示す部分は、細胞凝集塊１００の下側半分であるともいえる。つまり、三次元画像ＴＤ２が示す細胞凝集塊１００の領域は、三次元画像ＴＤ１と異なる。そこで、三次元画像ＴＤ１、ＴＤ２を合成して一つの三次元画像ＴＤ３を生成する（ステップＳ３３）。

ところで、図６等を用いて説明したように、分岐レーザＬ１、Ｌ２の照射位置Ｔ１、Ｔ２は、軸線Ｓ２の方向から見て互いに重複している。二光子顕微鏡１では、レーザ走査部３を経たレーザＬをレーザ分岐部４で分岐しているので、この重複は、走査状態においても成り立つ。そうすると、検出ユニット３６によって得られるスライス画像ＧＮ（ａ）におけるＸＹ座標は、検出ユニット３７によって得られるスライス画像ＧＭ（ａ）のＸＹ座標と一致する。従って、スライス画像ＧＮ（ａ）及びスライス画像ＧＭ（ａ）の対応関係が明確であるので、スライス画像ＧＮ（ａ）による三次元画像ＴＤ１と、スライス画像ＧＭ（ａ）による三次元画像ＴＤ２と、を精度よく且つ容易に合成することができる。

ここで、上述のステップＳ２０で用いた二光子顕微鏡１について詳細に説明する。以下の説明において、入力、出力、入出力との用語を用いることがある。入力は、レーザを受け入れる仮想的な点を意味し、出力は、レーザを出射する仮想的な点を意味し、入出力はレーザを受け入れ及び出射する仮想的な点を意味する。入力、出力、入出力は、説明の便宜上用いる用語であり、実際の装置において、物理的な存在を要することはない。要するに、入力、出力、入出力との用語は、各構成要素においてレーザの出射及び受け入れを単に説明するものである。

光源２は、励起光としてのレーザＬを発生させる。光源２は、レーザ装置２ｓを含む。レーザ装置２ｓが出射するレーザＬは、パルスレーザであり、より詳細には、フェムト秒レーザである。なお、レーザＬは、励起の態様に応じて、適宜所望の特性を有するものを利用してよい。例えば、パルス幅は、所望の値に設定してよい。光源２が出射したレーザＬは、レーザ走査部３に入射する。つまり、光源２の出力２ａは、レーザ走査部３の入力３ａに対して光学的に接続されている。なお、光源２の出力２ａからレーザ走査部３の入力３ａに至る光路Ｐ１には、必要に応じて補助光学部１１を配置してもよい。補助光学部１１としては、例えば、一対のコリメータレンズ１２があげられる。

スキャンブロックであるレーザ走査部３は、ミラー１３Ａ、１３Ｂと、レンズ１５と、を含む。レーザ走査部３は、入力３ａからレーザＬを受け入れる。次に、レーザ走査部３は、細胞凝集塊１００に対するレーザＬの照射位置が二次元平面内において移動するように、レーザＬの進行方向を変化させる。そして、レーザ走査部３は、レンズ１５を介して出力３ｂからレーザＬを出射する。レンズ１５は、例えば両凸レンズ（biconvex lens）である。従って、レーザＬは、入力３ａ、ミラー１３Ａ、１３Ｂ、レンズ１５及び出力３ｂの順に通過する。レーザ走査部３は、いわゆるスキャナである。レーザＬの進行方向を変化させる構成は、特に制限はない。例えば、当該構成は、一対のミラー１３Ａ、１３Ｂとしてもよい。入力３ａから受け入れたレーザＬに対するミラー１３Ａ、１３Ｂの角度を適宜制御することにより、出力３ｂから出射されるレーザＬの進行方向が所望の方向に設定される。ミラー１３Ａ、１３Ｂの動作は、コントローラ８から提供される制御信号φ１によって制御される。レーザ走査部３は、一対のミラー１３Ａ、１３Ｂを有するので、照射位置を二次元状に移動させることができる。

レーザ走査部３が出射したレーザＬは、レーザ分岐部４に入射する。つまり、レーザ走査部３の出力３ｂは、レーザ分岐部４の入力４ａに対して光学的に接続されている。なお、レーザ走査部３の出力３ｂからレーザ分岐部４の入力に至る光路Ｐ２にも、補助光学部１４が配置されている。補助光学部１４は、結像レンズ１６を有する。

レーザ分岐部４は、レーザ走査部３から受け入れたレーザＬを分岐する。例えば、レーザ分岐部４は、ハーフミラー１７を有する。ハーフミラー１７は、入力４ａから受け入れたレーザＬの一部を反射するとともに別の一部を透過する。反射したレーザは、分岐レーザＬ１（第１分岐レーザ）である。透過したレーザは、分岐レーザＬ２（第２分岐レーザ）である。分岐レーザＬ１は、出力４ｂから出射され、分岐レーザＬ２は、出力４ｃから出射される。

レーザ分岐部４が出射した分岐レーザＬ１、Ｌ２は、光学系１８、１９を介してレーザ照射部６に入射する。具体的には、レーザ分岐部４の出力４ｂは、光学系１８によってレーザ照射部６に対して光学的に接続されている。同様に、レーザ分岐部４の出力４ｃは、光学系１９によってレーザ照射部６に対して光学的に接続されている。例えば、一方の光学系１８は、ミラー２１を有する。出力４ｂから出射された分岐レーザＬ１は、光学系１８の入力１８ａに受け入れられる。受け入れられた分岐レーザＬ１は、ミラー２１によって反射される。そして、反射された分岐レーザＬ１は、出力１８ｂからレーザ照射部６の入力２４ａに導かれる。また、他方の光学系１９は、ミラー２２、２３を有する。レーザ分岐部４の出力４ｃから出射された分岐レーザＬ２は、光学系１９の入力１９ａに受け入れられる。受け入れられた分岐レーザＬ２は、ミラー２２、２３によって反射される。反射された分岐レーザＬ２は、出力１９ｂからレーザ照射部６の入力２６ａに導かれる。

ここで、光路Ｐ３、Ｐ４を規定する。光路Ｐ３は、光学系１８によって形成される。より厳密には、光路Ｐ３は、ハーフミラー１７から入力２４ａまでの経路である。光路Ｐ４は、光学系１９によって形成される。より厳密には、光路Ｐ４は、ハーフミラー１７から入力２６ａまでの経路である。そして、光路Ｐ３の光路長は、光路Ｐ４の光路長と等しい。実施形態に例示される構成では、光路Ｐ３の光路長は固定されている。一方、光路Ｐ４の光路長は、調整が可能である。例えば、光学系１９のミラー２２、２３のいずれか一方の位置および角度を制御することにより、光路Ｐ４の光路長を調整できる。

レーザ照射部６は、分岐レーザＬ１、Ｌ２を細胞凝集塊１００に照射する。レーザ照射部６は、一対の照射ユニット２４、２６を有する。照射ユニット２４、２６は、互いに同様の構成を有する。一方の照射ユニット２４は、一方の分岐レーザＬ１のためのものであり、他方の照射ユニット２６は、他方の分岐レーザＬ２のためのものである。一方の照射ユニット２４は、他方の照射ユニット２６に対して向き合うように配置されている。そして、一方の照射ユニット２４が分岐レーザＬ１を照射する方向は、他方の照射ユニット２６が分岐レーザＬ２を照射する方向と逆方向である。この「逆方向」とは、例えば、同一の仮想線上において、正の方向と負の方向との関係のような厳密な関係に限定されない。また、一対の照射ユニット２４、２６が向き合う方向は、特に限定されない。例えば、照射ユニット２４、２６を上下方向に配置してもよい。つまり、照射ユニット２４を上側、照射ユニット２６を下側に配置してもよい。また、例えば、照射ユニット２４、２６を左右方向に配置してもよい。さらに、照射ユニット２４、２６を配置する方向は、鉛直方向または水平方向に対して斜めでもよい。

なお、本実施形態では、分岐レーザＬ１、Ｌ２の両方を励起光として利用する。例えば、一方の分岐レーザＬ１を励起光として利用し、他方の分岐レーザＬ２を別の目的に利用してもよい。例えば、分岐レーザＬ２を刺激光として用いてもよい。

照射ユニット２４は、ダイクロイックミラー２７と、対物レンズ２８（第１対物レンズ）と、を有する。レーザ照射部６の入力２４ａから入出力２４ｂに至る光路Ｐ５において、入力２４ａ側から順にダイクロイックミラー２７、後述する焦点調整部２９、対物レンズ２８の順に配置されている。つまり、入力２４ａから受け入れられた分岐レーザＬ１は、まず、ダイクロイックミラー２７に入射し、次に、焦点調整部２９を通過し、次に、対物レンズ２８を通過して、最後に入出力２４ｂから出射される。同様に、照射ユニット２６も、ダイクロイックミラー３１と、対物レンズ３２（第２対物レンズ）と、を有する。レーザ照射部６の入力２６ａから入出力２６ｂに至る光路Ｐ６において、入力２６ａの側から順にダイクロイックミラー３１、焦点調整部３３及び対物レンズ３２の順に配置されている。

ダイクロイックミラー２７、３１は、分岐レーザＬ１、Ｌ２を全反射するとともに、後述する蛍光Ｆ１、Ｆ２を全透過する。ダイクロイックミラー２７、３１は、分岐レーザＬ１、Ｌ２の進行方向が対物レンズ２８、３２の光軸にそれぞれ沿うように、設けられている。

ここで、照射ユニット２４、２６は、互いに向き合っていること、および、分岐レーザＬ１、Ｌ２の出射方向が互いに逆向きであることはすでに述べた。これらの点は、例えば、対物レンズ２８、３２の位置関係を用いて説明してもよい。

図５に示すように、まず、基準となる軸線Ｓ１を定義する。観察時において細胞凝集塊１００は、軸線Ｓ１上に配置される。そして、対物レンズ２８、３２もそれぞれ軸線Ｓ１上に配置される。より詳細には、対物レンズ２８、３２は、軸線Ｓ１上において互いに離間して配置される。さらに、対物レンズ２８の光軸は軸線Ｓ１と重複する。同様に、対物レンズ３２の光軸も軸線Ｓ１と重複する。細胞凝集塊１００は、対物レンズ２８、３２の間に配置される。

一方の対物レンズ２８は、照射位置Ｔ１に分岐レーザＬ１を集光する。照射位置Ｔ１は、走査平面Ｃ１（第１走査平面）に含まれる。走査平面Ｃ１は、軸線Ｓ１上に配置された細胞凝集塊１００と交差する。他方の対物レンズ３２は、照射位置Ｔ２に分岐レーザＬ２を集光する。照射位置Ｔ２は、別の走査平面Ｃ２（第２走査平面）に含まれる。別の走査平面Ｃ２は、細胞凝集塊１００と交差すると共に走査平面Ｃ１に対して平行に離間する。

再び図５を参照する。照射ユニット２４、２６は、蛍光Ｆ１、Ｆ２を検出ユニット３６（第１検出部）、検出ユニット３７（第２検出部）に導く光路である。具体的には、細胞凝集塊１００において生じた蛍光Ｆ１は、入出力２４ｂから照射ユニット２４へ入射する。次に、蛍光Ｆ１は、対物レンズ２８、焦点調整部２９及びダイクロイックミラー２７を介して出力２４ｃから出射される。そして、出射された蛍光Ｆ１は、蛍光検出部７の入力３６ａに入射する。また、蛍光Ｆ２も同様の経路を経て、蛍光検出部７の入力３７ａに入射する。

焦点調整部２９、３３は、細胞凝集塊１００に対する焦点位置を制御する。焦点調整部２９は、レーザ走査部３から対物レンズ２８に至る光路Ｐ２、Ｐ３、Ｐ５上に設けられていればよい。同様に、焦点調整部３３は、レーザ走査部３から対物レンズ２８に至る光路Ｐ２、Ｐ４、Ｐ６上に設けられていればよい。本実施形態において、焦点調整部２９、３３は、レーザ照射部６に設けられている。より詳細には、焦点調整部２９は、照射ユニット２４において、ダイクロイックミラー２７と対物レンズ２８との間に配置されている。焦点調整部３３は、照射ユニット２６において、ダイクロイックミラー３１と対物レンズ３２との間に配置されている。

焦点調整部２９、３３は、例えば、液体レンズである焦点可変レンズ３４（第１焦点可変レンズ、第２焦点可変レンズ）を含む。焦点調整部２９、３３は、例えば、外部から提供される制御信号φ２、φ３に応じて焦点可変レンズ３４の屈折率を変化させる。この動作によって、焦点位置を変更することができる。ここでいう焦点位置とは、入出力２４ｂから出射される分岐レーザＬ１の方向に沿った位置である。また、焦点位置とは、入出力２６ｂから出射される分岐レーザＬ２の方向に沿った位置であるとも言える。換言すると、焦点位置とは、細胞凝集塊１００の表面からの深さ位置であると言ってもよい。つまり、焦点調整部２９、３３は、軸線Ｓ１に沿った走査平面Ｃ１、Ｃ２の位置を制御する。なお、走査平面Ｃ１、Ｃ２の面内における照射位置の制御は、レーザ走査部３によりなされる。

蛍光検出部７は、分岐レーザＬ１、Ｌ２に起因して細胞凝集塊１００から出射された蛍光Ｆ１（第１被計測光）及び蛍光Ｆ２（第２被計測光）を検出する。具体的には、蛍光検出部７は、一対の検出ユニット３６、３７を有する。検出ユニット３６は、一方の蛍光Ｆ１を検出する。検出ユニット３７は、他方の蛍光Ｆ２を検出する。

検出ユニット３６は、一方の照射ユニット２４に対応する。具体的には、検出ユニット３６は、照射ユニット２４の出力２４ｃに対して光学的に接続される。つまり、照射ユニット２４の出力２４ｃから出射された蛍光Ｆ１は、検出ユニット３６の入力３６ａに入射する。検出ユニット３６は、フィルタ３８（第１フィルタ）、レンズ３９と、センサ４１（第１受光部）と、を有する。入力３６ａから受け入れられた蛍光Ｆ１は、フィルタ３８、レンズ３９の順に通過し、最後にセンサ４１に入射する。フィルタ３８は、ノイズとなり得るレーザＬの入射を抑制する。レンズ３９は、センサ４１の受光部に蛍光Ｆ１を集光する。センサ４１は、受け入れた蛍光Ｆ１の強度に応じた電気信号を生成する。当該電気信号は、出力３６ｂを介して、コンピュータ９に送信される。

他方の検出ユニット３７は、他方の照射ユニット２６に対応する。具体的には、検出ユニット３７の入力３７ａは、照射ユニット２６の出力２６ｃに対して光学的に接続される。検出ユニット３７は、フィルタ３８Ａ（第２フィルタ）、レンズ３９Ａと、センサ４１Ａ（第２受光部）と、を有する。なお、他方の検出ユニット３７の構成部品は、検出ユニット３６と同様であるので、重複する説明は省略する。

なお、二光子励起の場合、例えば１０５０ナノメートルである近赤外波長のレーザを用いて、その半分の波長によって蛍光粒子を励起する。光電子増倍管は、当該励起波長に感度を有しない。従って、レーザＬはノイズとはならない。一方、アバランシェフォトダイオード（avalanche photodiode：APD）又はマルチピクセルフォトンカウンター（Multi-Pixel Photon Counter：MPPC）といった半導体光検出器を用いる場合には、レーザカットフィルタによりノイズとなり得るレーザを遮断する。

コントローラ８は、上述したようにレーザ走査部３に対して制御信号φ１を提供する。レーザ走査部３への制御信号φ１の提供によって、走査平面Ｃ１、Ｃ２上における照射位置の移動が行われる。さらに、コントローラ８は、一方の焦点調整部２９に対して制御信号φ２を提供すると共に、他方の焦点調整部３３に対して制御信号φ３を提供する。焦点調整部２９、３３への制御信号φ２、φ３の提供によって、細胞凝集塊１００に対する走査平面Ｃ１、Ｃ２の深さ位置が変更される。つまり、コントローラ８は、走査平面Ｃ１、Ｃ２の位置と走査平面Ｃ１、Ｃ２上における照射位置と、を制御することにより、三次元的な走査を実現する。なお、レーザ走査部３のためのコントローラは、焦点調整部２９、３３のためのコントローラといに別の装置であってもよい。つまり、二光子顕微鏡１は、レーザ走査部３のための第１コントローラと、焦点調整部２９、３３のための第１コントローラとは別の第２コントローラを有してもよい。

コンピュータ９は、センサ４１、４１Ａから受け入れた電気信号を利用して、蛍光像を得る。この蛍光像は、細胞凝集塊１００の二次元像または三次元像である。

上記の観察方法では、蛍光プローブとしてナノダイヤモンド５４を細胞凝集塊１００に取り込ませている（ステップＳ１３）。ナノダイヤモンド５４は、細胞凝集塊１００を構成する培養細胞５３Ａに対して毒性を示さない。従って、細胞凝集塊１００に与える影響を抑制できる。そして、スライス画像を得るステップＳ２０では、複数回の励起光である分岐レーザＬ１、Ｌ２の照射が行われる。ここで、ナノダイヤモンド５４は、一般に使用される蛍光色素が示す褪色性を有しない。つまり、複数回の分岐レーザＬ１、Ｌ２の照射を行っても、蛍光強度が有意に低下することがない。従って、良好な輝度を有する複数枚のスライス画像を得ることができる。従って、細胞凝集塊１００に与える影響を抑制しつつ、良好な観察結果を得ることができる。

また、ナノダイヤモンド５４は、観察試料である細胞凝集塊１００を構成する培養細胞５３Ａに対して毒性を有しない。つまり、ナノダイヤモンド５４は、細胞毒性がない。従って、培養細胞５３Ａを生かした状態で、細胞凝集塊１００を観察することが可能になる。

ところで、汎用顕微鏡を用いて、非染色又は蛍光色素染色を施した細胞を用いた細胞凝集塊を観察したと想定する。この観察では、細胞凝集塊の内部に位置する細胞まで観察光又は励起光を十分に供給することが困難である。なぜならば、例えば、細胞凝集塊の内部では、光の散乱が生じやすいためである。このような理由に起因して、光を十分に供給できない場合には、スライス画像の輝度が小さくなる。つまり、スライス画像が暗くなる。さらに、蛍光色素染色は、励起光の照射を繰り返すとともに、退色作用及び明滅作用が生じやすくなる。一方、本実施形態では、ナノダイヤモンド５４を蛍光プローブとして用いる。ナノダイヤモンド５４では、分岐レーザＬ１、Ｌ２の照射に起因する退色作用及び明滅作用が生じない。従って、細胞凝集塊１００の内部まで良好に観察することができる。

また、二次元培養細胞の増殖速度は、三次元培養細胞の増殖速度よりも速い。ここで、所定量のナノダイヤモンド５４を取り込ませた培養細胞５３Ａの集団が増殖を繰り返すことを想定する。培養細胞５３Ａが増殖すると、培養細胞５３Ａの集団の体積又は面積が増える。一方、取り込ませたナノダイヤモンド５４の量は、一定量であり、培養細胞５３Ａの増殖に伴って増えることはない。そうすると、培養細胞５３Ａの集団において、単位体積（又は単位面積）あたりに含まれるナノダイヤモンド５４の量は、増殖が繰り返されるごとに減少する。つまり、増殖速度が速い場合には、単位体積あたりに含まれるナノダイヤモンド５４の量も早く減少する。その結果、ナノダイヤモンド５４に起因する蛍光強度が減少してしまう。そのうえ、培養細胞５３Ａの分裂周期は細胞ごとに異なっている。従って、培養細胞５３Ａのそれぞれの分裂時期には、ばらつきが生じる。培養細胞５３ＡがいわゆるＭ期に移行し、分裂する度に単位体積当たりに含まれるナノダイヤモンド５４の量が減少する。つまり、分裂が盛んな場所においては、急激に蛍光強度が減少し、分裂が緩やかな場所においては、蛍光強度が維持される傾向にある。つまり、一つの観察試料である細胞凝集塊１００において、蛍光強度のばらつきも生じ得る。上述の理由によって、細胞分裂を伴う長時間観察のための蛍光プローブとして、ナノダイヤモンド５４は適さないと考えられていた。

しかし、本実施形態では、増殖速度が二次元培養細胞よりも遅い、三次元培養細胞の観察にナノダイヤモンド５４を用いている。つまり、増殖速度が小さいために、単位体積あたりに含まれるナノダイヤモンド５４の量の減少も緩やかである。さらに、三次元培養細胞である細胞凝集塊は、ディッシュ上における細胞の動きも小さい。従って、時間が経過しても観察を行うに十分な蛍光強度を維持することができる。従って、良好な観察結果を長時間にわたって得ることができる。

＜第２実施形態＞
次に、第２実施形態に係る細胞凝集塊の観察方法について説明する。

蛍光ナノダイヤモンドは、核磁気共鳴技術を用いて、蛍光の強度を制御することができる。例えば、蛍光ナノダイヤモンドを取り込んだ細胞凝集塊に励起光を照射する。その状態において、さらにマイクロ波を照射する。マイクロ波の波長は、２．８５ＧＨｚ以上２．９２ＧＨｚ以下である。その結果、マイクロ波を照射したときの蛍光強度と、マイクロ波を照射しない蛍光強度と、に差異が生じる。具体的には、マイクロ波を照射したときの蛍光強度は、マイクロ波を照射しないときの蛍光強度よりも小さい。

この現象は、ナノダイヤモンドの励起状態により説明できる。まず、ナノダイヤモンドの電子基底状態は、２個の電子がスピン３重項を形成している。従って、ナノダイヤモンドは、ｍｓ＝０、ｍｓ＝＋１、−１の３個の状態を取り得る。ナノダイヤモンドを励起光によって励起し続けると、ナノダイヤモンドにおける全ての電子がｍｓ＝０の状態となる。そして、ｍｓ＝０に集められた電子に対して、波長が２．８７ＧＨｚであるマイクロ波を照射すると、電子の遷移が生じる。この遷移によって、ｍｓ＝＋１、−１の電子が生じる。ここで、ｍｓ＝＋１、−１の電子が励起されて発生する蛍光強度は、ｍｓ＝０に比べて２〜３割程度弱い。これは、光を発しながらｍｓ＝＋１、−１へ戻る経路だけでなく、光を発することなくｍｓ＝０へ戻る経路が存在するためである。従って、ｍｓ＝＋１、−１とされた場合には、蛍光強度が弱まる。上述した性質を利用することにより、より高度な細胞観察を行うことが可能になる。

例えば、細胞凝集塊に互いに異なる種類の蛍光色素を含ませて、当該色素ごとの観察を行うことができる。具体的には、細胞凝集塊は、第１蛍光物質と、第２蛍光物質とを含む。第１蛍光物質は、ＮＶ中心のナノダイヤモンドである。また、第２蛍光物質は、低分子蛍光色素又は蛍光タンパク質である。そして、ナノダイヤモンドの励起波長と、低分子蛍光色素又は蛍光タンパク質の励起波長とは互いに重複している。

この場合には、励起光の波長が重複するので、励起光を照射すると、ナノダイヤモンドに起因する蛍光と、蛍光タンパク質に起因する蛍光と、が発生する。ここで、励起光の照射中に、さらにマイクロ波を照射してスライス画像を取得し、さらに、マイクロ波の照射を停止してスライス画像を取得する。そして、これらのスライス画像の差分を得る。そうすると、蛍光タンパク質に起因する蛍光は、マイクロ波の照射の有無によらず、強度が一定である。したがって、差分をとると、蛍光タンパク質に起因する蛍光をキャンセルできる。一方、ナノダイヤモンドに起因する傾向は、マイクロ波の照射の有無によって、蛍光の強度が異なる。したがって、差分をとっても、蛍光の成分が残る。その結果、ナノダイヤモンドに起因する蛍光を特定できる。さらに、ナノダイヤモンドに起因する蛍光が特定されれば、蛍光タンパク質に起因する蛍光も特定できる。

また、ナノダイヤモンドの蛍光波長と蛍光タンパク質の蛍光波長とが重複する場合にも、上記の関係は成り立つ。

以下、第２実施形態に係る細胞凝集塊１００の観察方法の各ステップについて、図９のフロー図を参照しつつ説明する。

まず、細胞凝集塊１００を準備する（ステップＳ１０Ａ）。ステップＳ１０Ａは、培養細胞５３を得るステップＳ１１と、培養細胞５３にナノダイヤモンド５４を取り込ませるステップＳ１３と、培養細胞５３Ａに蛍光物質を取り込ませるステップＳ１４と、細胞凝集塊１００を作製するステップＳ１５と、を有する。つまり、第１実施形態のステップＳ１０に対して、培養細胞５３Ａに蛍光物質を取り込ませるステップＳ１４が追加されている。上記のようにナノダイヤモンド５４を取り込ませたのちに、蛍光物質を取り込ませる手順は、例えば、蛍光物質として蛍光色素を選択した場合に用いられてよい。

一方、ステップＳ１３、Ｓ１４の順は、逆でもよい。つまり、培養細胞５３に蛍光物質を取り込ませた後に、培養細胞５３にナノダイヤモンド５４を取り込ませてもよい。ナノダイヤモンド５４よりも先に蛍光物質を取り込ませる手順は、例えば、蛍光物質として蛍光タンパク質を選択した場合に用いられてよい。蛍光タンパク質の場合は、ナノダイヤモンド５４を取り込ませる前の培養細胞５３Ａに蛍光タンパク質遺伝子を導入し、導入と同時に発現させた抗生物質耐性を利用して目的遺伝子のみを発現させた細胞を選抜する。
つまり、蛍光物質として蛍光タンパク質を選択した場合には、予め蛍光タンパク質遺伝子を発現した細胞に対して、ナノダイヤモンドを取り込ませる。

次に、スライス画像を得る（ステップＳ２０Ａ）。ステップＳ２０Ａは、走査平面Ｃ１、Ｃ２の位置を設定するステップＳ２１と、走査平面Ｃ１、Ｃ２に対して励起光を照射するステップＳ２３と、細胞凝集塊１００へのマイクロ波の照射を開始するステップＳ２４と、二次元画像を取得するステップＳ２５と、細胞凝集塊１００へのマイクロ波の照射を停止するステップＳ２６と、二次元画像を得るステップＳ２７と、差分画像を得るステップＳ２８と、を有する。つまり、第１実施形態のステップＳ２０に対して、細胞凝集塊１００へのマイクロ波の照射を開始するステップＳ２４と、細胞凝集塊１００へのマイクロ波の照射を停止するステップＳ２６と、二次元画像を得るステップＳ２７と、差分画像を得るステップＳ２８と、が追加されている。

ステップＳ２５を実施した結果、第１スライス画像が得られる。第１スライス画像は、ナノダイヤモンド５４に起因する蛍光と、蛍光タンパク質に起因する蛍光とを含む。ステップＳ２７を実施した結果、第２スライス画像が得られる。第２スライス画像も、ナノダイヤモンド５４に起因する蛍光と、蛍光タンパク質に起因する蛍光とを含む。第１スライス画像が含む蛍光タンパク質に起因する蛍光は、第２スライス画像が含む蛍光タンパク質に起因する蛍光と強度が同じである。一方、第１スライス画像が含むナノダイヤモンド５４に起因する蛍光は、第２スライス画像が含むナノダイヤモンド５４に起因する蛍光に対して強度が異なる。具体的には、第１スライス画像が含むナノダイヤモンド５４に起因する蛍光は、第２スライス画像が含むナノダイヤモンド５４に起因する蛍光よりも強度が小さい。

そして、ステップＳ２８において、第１スライス画像と第２スライス画像との差分を得る。具体的には、第１スライス画像を構成する画素が有する輝度値と、第２スライス画像を構成する画素が有する輝度値と、の差分値を得る。その結果、蛍光タンパク質に起因する蛍光を含む画素は、第１スライス画像と第２スライス画像とで輝度値が同じであるので、差分値はゼロである。一方、ナノダイヤモンド５４に起因する蛍光を含む画素は、第１スライス画像と第２スライス画像とで輝度値が異なるので、ゼロではない数値を取り得る。つまり、差分によれば、ナノダイヤモンド５４に起因する蛍光を含む画素を抽出できる。その結果、第１及び第２スライス画像に含まれる蛍光像について、ナノダイヤモンド５４に由来するものであるか、蛍光タンパク質に由来するものであるかを判別できる。例えば、当該判別情報を利用して、ナノダイヤモンド５４に由来する蛍光のみを含むスライス画像と、蛍光タンパク質に由来する蛍光のみを含むスライス画像と、を作製してもよい。

次に、三次元像を再構築する（ステップＳ３０）。

上記のステップＳ１０Ａ、Ｓ２０Ａ、Ｓ３０によっても、細胞凝集塊１００の良好な観察結果を得ることができる。

また、高周波印加の結果として生じるナノダイヤモンド５４の蛍光強度調節効果を利用することができる。この効果の利用によれば、ナノダイヤモンド５４と、励起波長又は蛍光波長がナノダイヤモンド５４と重複する蛍光プローブを含む複数種類の細胞から構成される細胞凝集塊を同時に観察することができる。

以上、本発明の実施形態について説明したが、本発明は上記実施形態に限定されるものではなく、本発明は、その要旨を逸脱しない範囲で様々な変形が可能である。

例えば、培養細胞５３にナノダイヤモンド５４を取り込ませる工程（ステップＳ１３）に変えて、図１０に示すステップＳ１４を行ってもよい。具体的には、培養細胞５３を得た（ステップＳ１１、図１０（ａ）部参照）のちに、ステップＳ１４を行う。ステップＳ１４では、まず、培養細胞５３をトリプシン等の酵素を用いた処理により表面５１ａからはがす（図１０（ｂ）部参照）。このとき、培養細胞５３は、ナノダイヤモンド５４を含まない。この培地５２と、培地５２に浮遊する培養細胞５３とは、いわゆる細胞懸濁液を構成する。細胞懸濁液は、剥離された培養細胞５３と培地５２とが混合されたものであるともいえる。次に、細胞懸濁液にナノダイヤモンド５４を添加する（図１０（ｃ）部参照）。この添加によって、培養細胞５３にナノダイヤモンド５４が取り込まれるので、ナノダイヤモンド５４を含む培養細胞５３Ａが得られる。その後、細胞凝集塊１００を作製する（ステップＳ１５）。

例えば、スライス画像を得る工程（ステップＳ２０）において、二光子顕微鏡とは別の蛍光顕微鏡を用いてもよい。

１…二光子顕微鏡、２…光源、２ｓ…レーザ装置、３…レーザ走査部、４…レーザ分岐部、６…レーザ照射部、７…蛍光検出部、８…コントローラ、９…コンピュータ、１１…補助光学部、１２…コリメータレンズ、１３Ａ，１３Ｂ，２１，２２，２３…ミラー、１４…補助光学部、１５…ｆθレンズ、１６…結像レンズ、１７…ハーフミラー、２７，３１…ダイクロイックミラー、１８，１９…光学系、２４，２６…照射ユニット、２８，３２…対物レンズ、２９，３３…焦点調整部、３４…焦点可変レンズ、３６，３７…検出ユニット、３８，３８Ａ…フィルタ、３９，３９Ａ…レンズ、４１，４１Ａ…センサ、１００…細胞凝集塊、Ｃ１，Ｃ２…走査平面、Ｆ１，Ｆ２…蛍光、ＧＮ，ＧＭ…スライス画像、Ｌ…レーザ、Ｌ１，Ｌ２…分岐レーザ、Ｐ１，Ｐ２，Ｐ３，Ｐ４，Ｐ５，Ｐ６…光路、Ｓ１，Ｓ２…軸線、ＴＣ…基準点、ＴＤ１，ＴＤ２，ＴＤ３…三次元画像、Ｔ１，Ｔ２…照射位置、φ１，φ２，φ３…制御信号。

Claims (5)

1. ナノダイヤモンドを第１蛍光物質として含む細胞凝集塊を作製する第１工程と、
   前記細胞凝集塊に対して、励起光を照射し、前記励起光の照射の結果として発生する蛍光を光検出部によって取得することにより得られるスライス画像を複数取得する第２工程と、
   複数の前記スライス画像を利用して、前記細胞凝集塊の三次元像を再構築する第３工程と、を含む、細胞凝集塊の観察方法。
2. 前記第１工程は、
   複数の培養細胞を得る工程と、
   複数の前記培養細胞に前記ナノダイヤモンドを取り込ませる工程と、
   前記ナノダイヤモンドを取り込ませた前記培養細胞を利用して、前記細胞凝集塊を作製する工程と、を含む、請求項１に記載の細胞凝集塊の観察方法。
3. 前記培養細胞を得る工程では、培地を収容した容器の表面に前記培養細胞が接触した状態で前記培養細胞を平面培養し、
   前記ナノダイヤモンドを取り込ませる工程では、前記容器の表面に前記培養細胞が接触した状態で、前記培地に前記ナノダイヤモンドを添加する、請求項２に記載の細胞凝集塊の観察方法。
4. 前記培養細胞を得る工程では、培地を収容した容器の表面に前記培養細胞が接触した状態で前記培養細胞を平面培養し、
   前記ナノダイヤモンドを取り込ませる工程では、前記容器の表面から前記培養細胞を離間させることにより、前記培養細胞を含む細胞懸濁液を得た後に、前記細胞懸濁液に前記ナノダイヤモンドを添加する、請求項２に記載の細胞凝集塊の観察方法。
5. 前記第１工程は、第２蛍光物質を前記培養細胞に取り込ませる工程をさらに含み、
   前記第２蛍光物質の励起光の波長又は蛍光の波長は前記ナノダイヤモンドの励起光の波長又は蛍光の波長と重複し、
   前記第２工程は、
   マイクロ波を前記第１蛍光物質及び前記第２蛍光物質を含む前記細胞凝集塊に照射した状態で、第１スライス画像を得る工程と、
   前記マイクロ波の照射を停止した状態で、第２スライス画像を得る工程と、
   前記第１スライス画像と前記第２スライス画像との差分を得る工程と、をさらに含む、請求項２〜４のいずれか一項に記載の細胞凝集塊の観察方法。