WO2001064857A1 - Nitrilase aus rhodococcus rhodochrous ncimb 11216 - Google Patents

Nitrilase aus rhodococcus rhodochrous ncimb 11216 Download PDF

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WO2001064857A1
WO2001064857A1 PCT/EP2001/002191 EP0102191W WO0164857A1 WO 2001064857 A1 WO2001064857 A1 WO 2001064857A1 EP 0102191 W EP0102191 W EP 0102191W WO 0164857 A1 WO0164857 A1 WO 0164857A1
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WO
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nucleic acid
acid sequence
substituted
unsubstituted
alkyl
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PCT/EP2001/002191
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Inventor
Marion Ress-Löschke
Bernhard Hauer
Ralf Mattes
Dirk Engels
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Basf Aktiengesellschaft
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
    • C12P41/006—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by reactions involving C-N bonds, e.g. nitriles, amides, hydantoins, carbamates, lactames, transamination reactions, or keto group formation from racemic mixtures
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P41/00—Drugs used in surgical methods, e.g. surgery adjuvants for preventing adhesion or for vitreum substitution
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)

Definitions

  • the invention relates to nucleic acid sequences which code for a polypeptide with nitrilase activity, nucleic acid constructs containing the nucleic acid sequences and vectors containing the nucleic acid sequences or the nucleic acid constructs.
  • the invention further relates to amino acid sequences which are encoded by the nucleic acid sequences and to microorganisms containing the nucleic acid sequences, the nucleic acid constructs or vectors containing the nucleic acid sequences or the nucleic acid constructs.
  • the invention also relates to an enzymatic process for the production of carboxylic acids from the corresponding nitriles.
  • Aliphatic, aromatic and heteroaromatic carboxylic acids are sought compounds for organic synthetic chemistry. They are the starting products for a large number of active pharmaceutical ingredients or active ingredients for crop protection.
  • EP-A-0 666 320 or WO 97/32030 The biotechnological synthesis of achiral carboxylic acids with microorganisms is described, for example, in EP-A-0 187 680, EP-A-0 229 042, WO 89/00193, JP 08173152, JP06153968, FR 2694571, EP-A0 502 476, EP-A -0 444 640 or EP-A-0 319 344.
  • a further disadvantage is that the enzymes which are present in the microorganisms used to synthesize the achiral or chiral carboxylic acids generally have only a limited substrate spectrum, ie only certain aliphatic, aromatic or heteroaromatic nitriles are Organism implemented.
  • aromatic and heteroaromatic nitriles such as, for example, cyanothiophenes or benzonitrile are poorly or not at all converted to the corresponding carboxylic acids.
  • the object was therefore to develop further enzymes for the production of achiral and / or chiral carboxylic acids which can be used in a process for the production of achiral and / or chiral carboxylic acids which does not have the disadvantages mentioned above and in particular aromatic and / or makes heteroaromatic carboxylic acids accessible from the corresponding nitriles.
  • nucleic acid sequence according to the invention which codes for a polypeptide with nitrilase activity, selected from the group:
  • nucleic acid sequences which are derived as a result of the degenerate genetic code from the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 1,
  • nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 which code for polypeptides with the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 2 and have at least 95% homology at the amino acid level, without the enzymatic action of the polypeptides being significantly reduced.
  • homologs of the nucleic acid sequence of the invention having the sequence SEQ ID NO: 1, allelic variants, for example, are to ver ⁇ at least 95% homology on the deduced amino ⁇ acid level, advantageously at least 97% homology, preferably at least 98%, most preferably at least 99% homology across the entire sequence range.
  • the homologies can advantageously be higher over partial regions of the sequences.
  • the amino acid sequence derived from SEQ ID NO: 1 can be found in SEQ ID NO: 2.
  • Allelic variants include, in particular, functional variants which can be obtained by deleting, inserting or substituting nucleotides from the sequence shown in SEQ ID NO: 1, but the enzymatic activity of the derived synthesized proteins for the introduction of one or more genes into an organism is, however, not essentially preserved should be reduced. Not significantly reduced enzymatic activity is to be understood as an enzymatic activity which advantageously has at least 10%, preferably 30%, particularly preferably 50%, very particularly preferably 70% of the enzymatic activity of the enzyme shown under SEQ ID NO: 2.
  • the invention thus also relates to amino acid sequences which are encoded by the group of nucleic acid sequences shown above.
  • the invention advantageously relates to amino acid sequences which are encoded by the sequence SEQ ID NO: 1.
  • Homologs of SEQ ID NO: 1 are furthermore to be understood, for example, as fungal or bacterial homologs, shortened sequences, single-stranded DNA or RNA of the coding and non-coding DNA sequence.
  • Homologs of SEQ ID NO: 1 have a homology of at least 60%, preferably at least 70%, particularly preferably at least 80%, very particularly preferably at least 90% over the entire DNA specified in SEQ ID NO: 1 at the DNA level -Area.
  • homologs of SEQ ID NO: 1 are to be understood as derivatives such as promoter variants.
  • the promoters which precede the specified nucleotide sequences can be changed by one or more nucleotide exchanges, by insertion (s) and / or deletion (s), but without the functionality or effectiveness of the promoters being impaired.
  • the effectiveness of the promoters can be increased by changing their sequence, or completely replaced by more effective promoters, including organisms of other species.
  • Derivatives are also to be understood as variants whose nucleotide sequence changes in the range from -1 to -200 before the start codon or 0 to 1000 base pairs after the stop codon were that the gene expression and / or the protein expression changed, is preferably increased.
  • SEQ ID NO: 1 or its homologues can advantageously be derived from bacteria, advantageously from gram-positive bacteria, preferably from bacteria of the genera Nocardia, Rhodococcus, Streptomyces, Mycobacterium, Corynebacterium, Micrococcus, Proactinomyces or Bacillus, particularly preferably from bacteria of the genus Rhodo ⁇ isolate coccus, Mycobacterium or Nocardia, very particularly preferably from the genus and species Rhodococcus sp., Rhodococcus rhodochrous, Nocardia rhodochrous or Mycobacterium rhodochrous, using methods known to those skilled in the art.
  • SEQ ID No: 1 or its homologs or parts of these sequences can be isolated from other fungi or bacteria using conventional hybridization methods or the PCR technique, for example. These DNA sequences hybridize under standard conditions with the sequences according to the invention. For hybridization, short oligonucleotides of the conserved areas, for example from the active center, which can be determined by comparisons with other nitrilases or nitrile hydratases in a manner known to the person skilled in the art, are advantageously used. However, longer fragments of the nucleic acids according to the invention or the complete sequences can also be used for the hybridization.
  • DNA hybrids are approx. 10 ° C lower than those of DNA: RNA hybrids of the same length.
  • DNA hybrids are advantageously 0.1 ⁇ SSC and temperatures between approximately 20 ° C. to 45 ° C., preferably between approximately 30 ° C. to 45 ° C.
  • the hybridization conditions are advantageously 0.1 ⁇ SSC and temperatures between approximately 30 ° C. to 55 ° C., preferably between approximately 45 ° C.
  • the gram-positive promoters amy and SP02 in the yeast or fungal promoters ADC1, MF ⁇ , AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH.
  • the promoters of pyruvate decarboxylase and methanol oxidase from, for example, Hansenula are also advantageous. Artificial promoters for regulation can also be used.
  • the nucleic acid construct is advantageously inserted into a vector such as, for example, a plasmid, a phage or other DNA, which enables optimal expression of the genes in the host.
  • a vector such as, for example, a plasmid, a phage or other DNA, which enables optimal expression of the genes in the host.
  • plasmids mentioned represent a small selection of the possible plasmids. Further plasmids are well known to the person skilled in the art and can be found, for example, in the book Cloning Vectors (Eds. Pouwels PH et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018 ) can be removed.
  • the nucleic acid construct for the expression of the further genes contained additionally contains 3 'and / or 5' terminal regulatory sequences for increasing expression, which are selected depending on the host organism selected and gene or genes for optimal expression.
  • regulatory sequences are intended to enable targeted expression of the genes and protein expression. Depending on the host organism, this can mean, for example, that the gene is only expressed or overexpressed after induction, or that it is expressed and / or overexpressed immediately.
  • the regulatory sequences or factors can preferably influence the gene expression of the introduced genes positively and thereby increase.
  • the regulatory elements can advantageously be strengthened at the transcription level by using strong transcription signals such as promoters and / or "enhancers".
  • an increase in translation is also possible, for example, by improving the stability of the mRNA.
  • the vector containing the nucleic acid construct according to the invention or the nucleic acid according to the invention can also advantageously be introduced into the microorganisms in the form of a linear DNA and integrated into the genome of the host organism via heterologous or homologous recombination.
  • This linear DNA can consist of a linearized vector such as a plasmid or only of the nucleic acid construct or the nucleic acid.
  • prokaryotic or eukaryotic organisms are suitable as host organisms for the nucleic acid according to the invention or the nucleic acid construct.
  • Microorganisms such as bacteria, fungi or yeasts are advantageously used as host organisms.
  • Gram-positive or gram-negative bacteria preferably bacteria of the family Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Streptomycetaceae, Mycobacteriaceae or Nocardiaceae, particularly preferably bacteria of the genera Escherichia, Pseudomonas, Nocardia, Mycobacterium, Streptomyces or Rhodococcus are advantageously used.
  • the genus and species Escherichia coli, Rhodococcus rhodochrous, Nocardia rhodochrous, Mycobacterium rhodochrous or Streptomyces lividans are very particularly preferred.
  • the host organism according to the invention preferably contains at least one protein agent for folding the polypeptides it has synthesized and in particular the nucleic acid sequences described in this invention with nitrilase activity and / or the genes coding for this agent, this agent being present in an amount which is greater than that which corresponds to the basic quantity of the microorganism under consideration.
  • the genes coding for this agent are contained in the chromosome or in extrachromosomal elements such as plasmids.
  • An advantageous embodiment of the process is the conversion of chiral or achiral aliphatic nitriles to the corresponding carboxylic acids.
  • Another preferred embodiment of the process is a process for the preparation of chiral or achiral carboxylic acids, characterized in that nitriles of the general formula I
  • nucleic acids according to the invention in the presence of an amino acid sequence encoded by the nucleic acids according to the invention or a growing, dormant or digested microorganism which contains either a nucleic acid sequence according to the invention, a nucleic acid construct according to the invention which contains a nucleic acid according to the invention linked to one or more regulation signals, or a vector according to the invention, to carboxylic acids of the general formula II
  • A, B, D and E are independently CH, N or CR 3
  • two adjacent variables A, B, D, E or H together can form a further substituted or unsubstituted aromatic, saturated or partially saturated ring with 5 to 8 atoms in the ring, which may contain one or more heteroatoms such as 0, N or S and where no more than three of the variables A, B, D, E or H are heteroatoms,
  • R 1 is hydrogen, substituted or unsubstituted, branched or unbranched C 1 -C 1 -alkyl or C 1 -C 1 -alkoxy, substituted or unsubstituted aryl or hetaryl, hydroxy, halogen, C 1 -C 1 -alkylamino or amino,
  • R 2 is hydrogen, substituted or unsubstituted, branched or unbranched C ⁇ -C ⁇ o-alkyl or C ⁇ -C ⁇ o-alkoxy, substituted or unsubstituted aryl or hetaryl, hydroxy, Ci-Cio-alkylamino or amino,
  • R 3 is hydrogen, substituted or unsubstituted, branched or unbranched C ⁇ -C ⁇ o-alkyl-, or C ⁇ -C ⁇ o-alkoxy-, substituted or unsubstituted aryl, hetaryl, hydroxy, halogen, C ⁇ -C ⁇ o-alkylamino or amino .
  • R 4 is hydrogen, substituted or unsubstituted, branched or unbranched Ci-Cirj-alkyl-.
  • R 1 denotes hydrogen, substituted or unsubstituted, branched or unbranched C 1 -C 1 -alkyl or C 1 -C 1 alkoxy, substituted or unsubstituted aryl or hetaryl, hydroxyl, halogen or fluorine , Chlorine or bromine, Ci-Cirj-alkylamino or amino--
  • Ci-Cirj-alkyl chains such as methyl, ethyl, n-propyl, 1-methylethyl, n-butyl, 1-methylpropyl-, 2-methylpropyl, 1, 1-dimethylethyl, n -Pentyl, 1-methylbutyl, 2-methylbutyl, 3-methylbutyl, 2,2-dimethylpropyl, 1-ethylpropyl, n-hexyl, 1, 1-dimethylpropyl, 1, 2-dimethylpropyl, 1-methylpentyl, 2-methylpentyl, 3 -Methylpentyl, 4-methylpentyl, 1, 1-dimethylbutyl, 1,2-dimethylbutyl, 1, 3-dimethylbutyl, 2, 2-dimethylbutyl, 2,3-dimethylbutyl, 3, 3-dimethylbutyl, 1-ethylbutyl, 2
  • Suitable alkoxy radicals are substituted or unsubstituted, branched or unbranched ver ⁇ C ⁇ -C ⁇ 0 -Alkoxyketten such as methoxy, ethoxy, propoxy, 1-methylethoxy, butoxy, 1-methylpropoxy, 2-methylpropoxy, 1, 1-dimethylethoxy, pentoxy, 1-methylbutoxy, 2-methylbutoxy, 3-methylbutoxy, 1, 1-dimethylpropoxy,
  • aryl groups which contain 6 to 20 carbon atoms in the ring or ring system may be mentioned as aryl groups. These may be aromatic rings fused to one another or aromatic rings which are bridged via alkyl, alkylcarbonyl, alkenyl or alkenylcarbonyl chains, carbonyl, oxygen or nitrogen.
  • the aryl radicals can optionally be bonded to the basic structure via a C ⁇ -C ⁇ o-alkyl, C 3 -Cs-alkenyl, C 3 -Cg-alkynyl or C 3 -C 8 -cycloalkyl chain. Phenyl or naphthyl are preferred.
  • Substituted or unsubstituted, simple or fused aromatic ring systems with one or more heteroaromatic 3- to 7-membered rings, which may contain one or more heteroatoms such as N, 0 or S and optionally via a C 1 -C 8 -alkyl, C 3, are substituted or unsubstituted as hetaryl -Cg-alkenyl or C 3 -C 8 ⁇ cycloalkyl chain may be bound to the backbone.
  • hetaryl radicals examples include pyrazole, imidazole, oxazole, isooxazole, thiazole, triazole, pyridine, quinoline, isoquinoline, acridine, pyrimidine, pyridazine, pyrazine, phenazine, purine or pteridine.
  • the hetaryl radicals can be bonded to the basic structure via the heteroatoms or via the various carbon atoms in the ring or ring system or via the substituents. Pyridine, imidazole, pyrimidine, purine, pyrazine or quinoline are preferred.
  • Substituted or unsubstituted branched or unbranched C 1 -C 6 -alkylamino chains such as, for example, methylamines, ethylamino, n-propylamino, 1-methylethylamino, n-butylamino, 1-methylpropylaminoamino-, 2-methylpropylamino, 1, 1-dimethylethylamino, n-pentylamino, 1-methylbutylamino, 2-methylbutylamino, 3-methylbutylamino, 2, 2-dimethylpropylamino, 1-ethylpropylamino, 1-hexylamino , 1-Dimethylpropylamino, 1, 2-Dimethylpropylamino, 1-Methylpentylamino, 2-Methylpentylamino, 3-Methylpentylamino, 4-Methylpentylamino, 1, 1-Dimethylbutylamin
  • Substituents of the radicals mentioned for R 1 include, for example, one or more substituents such as halogen, such as fluorine, chlorine or bromine, thio, cyano, nitro, amino, hydroxyl, alkyl, alkoxy, alkenyl, alkenyloxy, alkynyl or further aromatic or further saturated or unsaturated not aromatic rings or ring systems in question.
  • Alkyl radicals such as Ci-Cg-alkyl such as methyl, ethyl, propyl or butyl, aryl such as phenyl, halogen such as chlorine, fluorine or bromine, hydroxy or amino are preferred.
  • R 2 denotes hydrogen, substituted or unsubstituted, branched or unbranched C 1 -C 1 -alkyl or C 1 -C 2 alkoxy, substituted or unsubstituted aryl or hetaryl, hydroxy, C 1 -C 1 -C 1 Alkyl- amino- or amino---
  • alkyl radicals are substituted or unsubstituted branched or unbranched C ⁇ -C ⁇ o-alkyl chains such as methyl, ethyl, n-propyl, 1-methylethyl, n-butyl, 1-methylpropyl, 2-methylpropyl, 1, 1-dimethylethyl, n-pentyl , 1-methylbutyl, 2-methylbutyl, 3-methylbutyl, 2, 2-dimethylpropyl, 1-ethylpropyl, n-hexyl, 1, 1-dimethylpropyl, 1, 2-dimethylpropyl, 1-methylpentyl, 2-methylpentyl, 3-methylpentyl , 4-methylpentyl, 1, 1-dimethylbutyl, 1, 2-dimethylbutyl, 1,3-dimethylbutyl, 2, 2-dimethylbutyl, 2, 3-dimethylbutyl, 3, 3-dimethylbutyl, 1-ethylbutyl, 2-eth
  • alkoxy radicals are substituted or unsubstituted, branched or unbranched C 1 -C ⁇ alkoxy chains such as methoxy, ethoxy, propoxy, 1-methylethoxy, butoxy, 1-methylprop. oxy, 2-methylpropoxy, 1, 1-dimethylethoxy, pentoxy, 1-methylbutoxy, 2-methylbutoxy, 3-methylbutoxy, 1, 1-dimethylpropoxy, 1,2-dimethylpropoxy, 2, 2-dimethylpropoxy, 1-ethylpropoxy, Hexoxy, 1-methylpentoxy, 2-methylpentoxy, 3-methylpentoxy, 4-methylpentoxy, 1, 1-dimethylbutoxy, 1, 2-dimethylbutoxy, 1, 3-dimethylbutoxy, 2, 2-dimethylbutoxy, 2, 3-dimethylbutoxy, 3, 3-dimethylbutoxy, 1-ethylbutoxy, 2-ethylbutoxy, 1, 1, 2-trimethylpropoxy, 1,2,2-triethylpropoxy, 1-ethyl-l-methylpropoxy, l
  • aryl radicals which contain 6 to 20 carbon atoms in the ring or ring system may be mentioned as aryl. These may be aromatic rings fused to one another or aromatic rings which are bridged via alkyl, alkylcarbonyl, alkenyl or alkenylcarbonyl chains, carbonyl, oxygen or nitrogen.
  • the aryl radicals can optionally also be bonded to the basic structure via a C 1 -C 8 alkyl, C 3 -C 8 alkenyl, C 3 -C 6 alkynyl or C 3 -Cs cycloalkyl chain. Phenyl or naphthyl are preferred.
  • hetaryl radicals examples include pyrazole, imidazole, oxazole, isooxazole, thiazole, triazole, pyridine, quinoline, isoquinoline, acridine, pyrimidine, pyridazine, pyrazine, phenazine,
  • hetaryl radicals can be bonded to the basic structure via the heteroatoms or via the various carbon atoms in the ring or ring system or via the substituents.
  • Pyridine, imidazole, pyrimidine, purine, pyrazine or quinoline are preferred.
  • Substituted or unsubstituted branched or unbranched C 1 -C 8 -alkylamino chains such as, for example, methylamino, ethylamino, n-propylamino, 1-methylethylamino, n-butylamino, 1-methylpropylaminoamino, 2-methylpropylamino, 1, 1-dimethylethylamino, n-be as alkylamino radicals , 1-methylbutylamino, 2-methylbutylamino, 3-methylbutylamino, 2, 2-dimethylpropylamino, 1-ethylpropylamino, n-hexylamino, 1, 1-dimethylpropylamino, 1, 2-dimethylpropylamino, 1-methylpentylamino, 2-methylpentylamino -Methylpentylamino, 4-methylpentylamino, 1, 1-dimethylbutylamino, 1,
  • substituents for the radicals mentioned of R 2 include one or more substituents such as halogen, such as fluorine, chlorine or bromine, thio, nitro, amino, hydroxy, alkyl, alkoxy, alkenyl, alkenyloxy, alkynyl or other aromatic or further saturated or unsaturated non-aromatic Rings or ring systems in question.
  • Alkyl radicals such as C 1 -C 6 alkyl such as methyl, ethyl, propyl or butyl, aryl such as phenyl, halogen such as chlorine, fluorine or bromine, hydroxy or amino are preferred.
  • R 3 in the compounds of the formulas I and II denotes hydrogen, substituted or unsubstituted, branched or unbranched C ⁇ -C ⁇ o-alkyl or Ci-Cirj-alkoxy, substituted or unsubstituted aryl or hetaryl, hydroxy, halogen or fluorine , Chlorine or bromine, -CC-alkylamino or amino--
  • alkyl radicals are substituted or unsubstituted branched or unbranched -CC-alkyl chains such as methyl, ethyl, n-propyl, 1-methylethyl, n-butyl, 1-methylpropyl, 2-methylpropyl, 1, 1-dimethylethyl, n-pentyl , 1-methylbutyl, 2-methylbutyl, 3-methylbutyl, 2, 2-dimethylpropyl, 1-ethylpropyl, n-hexyl, 1, 1-dimethylpropyl, 1, 2-dimethylpropyl, 1-methylpentyl, 2-methylpentyl, 3-methylpentyl , 4-methylpentyl, 1, 1-dimethylbutyl, 1, 2-dimethylbutyl, 1, 3-dimethylbutyl, 2, 2-dimethylbutyl, 2, 3-dimethylbutyl, 3, 3-dimethylbutyl, 1-ethylbutyl, 2-ethylbuty
  • alkoxy radicals are substituted or unsubstituted, branched or unbranched Ci-Cirj-alkoxy chains such as methoxy, ethoxy, propoxy, 1-methylethoxy, butoxy, 1-methylpropoxy, 2-methylpropoxy, 1, 1-dimethylethoxy, pentoxy, 1-methyl - Butoxy, 2-methylbutoxy, 3-methylbutoxy, 1, 1-dimethylpropoxy, 1, 2-dimethylpropoxy, 2, 2-dimethylpropoxy, 1-ethylpropoxy, hexoxy, 1-methylpentoxy, 2-methylpentoxy, 3-methylpentoxy, 4-methylpent oxy, 1, 1-dimethylbutoxy, 1, 2-dimethylbutoxy, 1, 3-dimethylbutoxy, 2, 2-dimethylbutoxy, 2, 3-dimethylbutoxy, 3, 3-dimethylbutoxy,
  • aryl radicals which contain 6 to 20 carbon atoms in the ring or ring system may be mentioned as aryl. These may be aromatic rings fused to one another or aromatic rings which are bridged via alkyl, alkylcarbonyl, alkenyl or alkenylcarbonyl chains, carbonyl, oxygen or nitrogen.
  • the aryl radicals can optionally be bonded to the basic structure via a C 1 -C 8 alkyl, C 3 -Cs alkenyl, C 3 -C 6 alkynyl or C 3 -Cs cycloalkyl chain. Phenyl or naphthyl are preferred.
  • heteroatoms such as N, 0 or S and optionally via a C 1 -C 8 -alkyl, C 3 -C 8 alkenyl or C 3 -C 8 cycloalkyl chain
  • hetaryl radicals are pyrazole,
  • the hetaryl radicals can be bonded to the basic structure via the heteroatoms or via the various carbon atoms in the ring or ring system or via the substituents. Pyridine, imidazole, pyrimidine, purine, pyrazine or quinoline are preferred.
  • Substituted or unsubstituted branched or unbranched C 1 -C 10 -alkylamino chains such as, for example, methylamino, ethylamino, n-propylamino, 1-methylethylamino, n-butylamino, 1-methylpropylaminoamino-, 2-methylpropylamino, 1, 1-dimethylethylamino, may be used as alkylamino radicals Pentylamino, 1-methylbutylamino, 2-methylbutylamino, 3-methylbutylamino, 2, 2-dimethylpropylamino, 1-ethylpropylamino, n-hexylamino, 1, 1-dimethylpropylamino,
  • Methylamino, ethylamino, n-propylamino, n-butylamino, i-propylamino or i-butylamino are preferred.
  • substituents of the said radicals from R 3 example ⁇ come, one or more substituents such as halogen such as fluorine, chlorine or bromine, thio, nitro, amino, hydroxy, alkyl, alkoxy, alkenyl, alkenyloxy, alkynyl or other aromatic or other saturated or unsaturated non aromatic rings or
  • Alkyl groups such as Ci-C ß alkyl such as methyl, ethyl, propyl or butyl, aryl such as phenyl, halogen such as chlorine, fluorine or bromine, hydroxy or amino are preferred.
  • R 4 in the compounds of the formulas I and II denotes hydrogen or substituted or unsubstituted, branched or unbranched C ⁇ -C ⁇ o-alkyl--
  • Substituted or unsubstituted branched or unbranched Czwe-C ⁇ o-alkyl chains such as methyl, ethyl, n-propyl, 1-methylethyl, n-butyl, 1-methylpropyl, 2-methylpropyl, 1, 1-dimethylethyl, n -Pentyl, 1-methylbutyl, 2-methylbutyl, 3-methylbutyl, 2, 2-dimethylpropyl, 1-ethylpropyl, n-hexyl, 1, 1-dimethylpropyl, 1, 2-dimethylpropyl, 1-methylpentyl, 2-methylpentyl, 3 -Methylpentyl, 4-methylpentyl, 1, 1-dimethylbutyl, 1, 2-dimethylbutyl, 1, 3-dimethylbutyl, 2, 2-dimethylbutyl, 2, 3-dimethylbutyl, 3, 3-dimethylbutyl, 1-ethylbutyl, 2
  • substituents of the radicals mentioned of R 4 are one or more substituents such as halogen, such as fluorine, chlorine or bromine, thio, nitro, amino, hydroxy, alkyl, alkoxy, alkenyl, alkenyloxy, alkynyl or other aromatic or further saturated or unsaturated non-aromatic Rings or ring systems in question.
  • Alkyl radicals such as Ci-Cg-alkyl such as methyl, ethyl, propyl or butyl, aryl such as phenyl, halogen such as chlorine, fluorine or bromine, hydroxy or amino are preferred.
  • Aromatic or aliphatic saturated or unsaturated dinitriles can also be advantageously implemented in the process according to the invention.
  • the process according to the invention is advantageously carried out at a pH of 4 to 11, preferably 4 to 9.
  • nitrile is advantageously used in the process.
  • different amounts of nitrile can be used in the reaction.
  • the reaction is advantageously carried out with continuous addition of the nitrile.
  • the product can be isolated after the end of the reaction or can be removed continuously in a bypass.
  • the process according to the invention is advantageously carried out at a temperature between 0 ° C. to 80 ° C., preferably between 10 ° C. to 60 ° C., particularly preferably between 15 ° C. to 50 ° C.
  • Aromatic or heteroaromatic nitriles such as 2-phenyl-propionitrile, 2-hydroxy-phenylacetonitrile, 2-amino-2-phenyl-acetonitrile, benzonitrile, phenylacetonitrile, trans-cinnamic acid nitrile, 3-cyanothiophene or 3-cyanomethyl- called thiophene.
  • Chiral nitriles in the process according to the invention are to be understood as nitriles which consist of a 50:50 mixture of the two enantiomers or of any other mixture with an enrichment of one of the two enantiomers in the mixture.
  • nitriles are 2-phenyl-propionitrile, 2-hydroxy-phenylacetonitrile, 2-amino-2-phenyl-acetonitrile, 2-chloropropionitrile or 2-hydroxypropionitrile.
  • Chiral carboxylic acids are to be understood in the process according to the invention which show enantiomeric enrichment.
  • the process according to the invention enables a large number of chiral or achiral nitriles to be converted into the corresponding chiral or achiral carboxylic acids.
  • at least 25 mmol nitrile / hx mg protein or at least 25 mmol nitrile / hxg dry weight of the microorganisms can be converted, preferably at least 30 mmol nitrile / hx mg protein or at least 30 mmol nitrile / hxg dry weight, especially before adds at least 40 mmol nitrile / hx mg protein or at least 40 mmol nitrile / hxg dry weight, very particularly preferably at least 50 mmol nitrile / hxg protein or at least 50 mmol nitrile / hxg dry weight.
  • Dormant or disrupted cells can also be used.
  • Disrupted cells are understood to mean, for example, cells which have been made permeable by treatment with, for example, solvents, or cells which have been broken up by means of enzyme treatment, by means of mechanical treatment (for example French press or ultrasound) or by some other method ,
  • the crude extracts obtained in this way are advantageously suitable for the process according to the invention.
  • Purified or purified enzymes can also be used for the process. Immobilized microorganisms or enzymes, which can advantageously be used in the reaction, are also suitable.
  • the chiral or achiral carboxylic acids prepared in the process according to the invention can advantageously be obtained from the aqueous reaction solution by extraction or crystallization or by extraction and crystallization.
  • the aqueous reaction solution is acidified with an acid such as a mineral acid (e.g. HC1 or H S0) or an organic acid, advantageously to pH values below 2 and then extracted with an organic solvent.
  • the extraction can be repeated several times to increase the yield.
  • all solvents which show a phase boundary with water if appropriate after the addition of salts, can be used as the organic solvent.
  • solvents such as toluene, benzene, hexane, methyl tert-butyl ether or ethyl acetate.
  • the products can also be cleaned advantageously by binding to an ion exchanger and then eluting with a mineral acid or carboxylic acid such as HCL, HSO, formic acid or acetic acid.
  • the products can generally be obtained in good chemical purities, that is to say greater than 90% chemical purity.
  • the organic phase with the product can also be only partially concentrated and the product crystallized out.
  • the solution is advantageously cooled to a temperature of 0 ° C to 10 ° C. Crystallization can also take place directly from the organic solution.
  • the crystallized product can again in the same or in a different solvent for recrystallization and recrystallized. The subsequent at least one crystallization can further increase the enantiomeric purity of the product, depending on the position of the eutectic.
  • the chiral or achiral carboxylic acids can also be crystallized from the aqueous reaction solution directly after acidification with an acid to a pH advantageously below 2.
  • the aqueous solution is advantageously concentrated with heating and its volume is reduced by 10 to 90%, preferably 20 to 80%, particularly preferably 30 to 70%.
  • the crystallization is preferably carried out with cooling. Temperatures between 0 ° C to 10 ° C are preferred for crystallization. Direct crystallization from the aqueous solution is preferred for reasons of cost. Working up of the chiral carboxylic acids by extraction and optionally subsequent crystallization is also preferred.
  • the product of the process according to the invention can be isolated in yields of 60 to 100%, preferably 80 to 100%, particularly preferably 90 to 100%, based on the nitrile used for the reaction.
  • the isolated product is characterized by a high chemical purity of> 90%, preferably> 95%, particularly preferably> 98%.
  • the products in chiral nitriles or chiral carboxylic acids are distinguished by a high enantiomeric purity, which can be further increased by the crystallization.
  • the products obtained in this way are suitable as starting materials for organic syntheses for the production of pharmaceuticals or agrochemicals or for resolving racemates.
  • Example 1 Isolation of the niCA gene from Rhodococcus rhodochrous NCIMB 11216
  • the chromosomal DNA band was removed under UV light, dialyzed for 2 h against TE 10.1 (10 mM Tris / HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) and 3 times with phenol solution (saturated with 10 mM Tris / HCl, pH 8) ) extracted. Finally, the DNA was dialyzed 3 times against TE 10.01 (10 mM Tris / HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0) and stored at 4 ° C. About 1.5 ml of DNA solution with a concentration of about 500 ⁇ g / ml was obtained.
  • the phage ⁇ ⁇ RESIII was used as the vector for the gene bank: this substitution vector contains the lux operon as a replacement fragment, which enables the background to be detected visually by bioluminescence, and integrated res ("resolution") sites Tnl722 and the replication functions of pTW601-l, so that the vector in a strain with the appropriate transposase can be converted into an autonomously replicating plasmid (Altenbuchner, 1993, A new ⁇ RES vector with a built-in Tn2721-encoded, excision system, Gene 123, 63-68).
  • Cellular nucleic acids 5 were digested by adding DNase and RNase (1 ⁇ g / ml each) for 30 min at room temperature with stirring. Then 29.2 g of NaCl were added to each batch, dissolved, centrifuged at 8300 g for 10 min and the supernatants were mixed with 10% PEG 6000. For the subsequent phage precipitation, the batches were overnight at 4 ° C.
  • the ⁇ ⁇ RESIII arm fragments were first prepared by digesting ⁇ ⁇ RESIII-DNA in a volume of 100 ⁇ l 2 ⁇ g with 20 U BamHI for 5 h at 37 ° C. After extraction with phenol (saturated with 10 mM Tris / HCl, pH 8) / chloroform (50/50 v / v), isopropanol precipitation and washing with 70% or 100% ethanol (pre-cooled to 5-20 ° C.) the DNA dissolved in TE 10.01 and post-treated with 20 U Sall (5 h at 37 ° C). Again phenol / chloroform extraction, isopropanol precipitation, washing and solution in TE 10.01.
  • genomic DNA fragments 10 ⁇ g of genomic DNA were partially digested in a 100 ⁇ l batch for 5 min with 0.5 U Sau3AI after recording time kinetics for the enzyme batch used. After electrophoretic separation using a 0.8% low-melting-point agarose gel, the fragment region from 8 to 14 kb was isolated and eluted from the 5 gel according to Parker & Seed (1980). The genomic DNA fragments were ligated to the ⁇ + RESIII arms at 16 ° C. overnight. The ligation batches were finally packaged in vitro with phage extracts which had previously been obtained from the "packaging extract donor" E.
  • the strain E. coli TAP 90 (Patterson & Dean, 1987) was infected to determine the titer of the phage gene bank produced. For this, logarithmically growing cells (cultivated in LBo, 10 mM MgCl, 0.5% maltose) with 100 ⁇ l different dilutions of the packaging or phage lysate in SM buffer were added for 30 min
  • the titer of the gene bank produced was approximately 4 ⁇ 10 5 pfu / ml.
  • the recombinant ⁇ ⁇ RESIII phages obtained were in the strain E. coli HB 101 F '[:: Tnl 7391ac], which carries the transposon Tnl735 with the resolvase gene under the control of the tac promoter (Altenbuchner, 1993, see above) , into an autonomously replicating plasmid
  • This strain was grown for infection in 5 ml LBo with 10 mM MgCl 2 and 0.5% maltose up to an OD 6 oo of 0.6 to 0.8 and 100 ⁇ l thereof with a suitable amount of phage lysate for 30 min infected at room temperature.
  • the mixture was rolled in 5 ml prewarmed dYT, 1 mM isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside 0 (IPTG) for 1 h at 37 ° C., centrifuged, resuspended, and the cells were plated on dYT agar plates with 100 ⁇ g / ml kanamycin and overnight incubated at 37 ° C.
  • Recombinant ⁇ ⁇ RESIII phages, the chromosomal DNA fragments with the nitrilase gene from R. rhodochrous NCIMB 11216 were obtained by hybridizing the phage plaques with the oligo nucleotide probe
  • Nitrilase from Rhodococcus rhodochrous Jl Nitrilase from Rhodococcus rhodochrous Jl.
  • Nitrilase in biosynthesis of the plant hormone indole-3-acetic 20 acid from indole-3-acetonitrile Cloning of the Alcaligenes gene and site -directed mutagenesis of cysteine residues.
  • the sequence of the oligo nucleotide was derived from a conserved amino acid sequence region with the putative one
  • the membranes were preincubated with 50 ml hybridization buffer for 2 h at 37 ° C. and then hybridized overnight in 45 12 ml hybridization buffer at 37 ° C. with 10 pmol 32 P-labeled oligo nucleotide.
  • the oligo nucleotide was in a 30 ul approach with 80 uCi ( ⁇ - 32 P) -ATP by 10 U T4 polynucleotide labeled kinase and separated from excess ( ⁇ - 32 P) ATP by a dropping column gel filtration with Sephadex G-25.
  • the nylon membranes were treated with 0.5 g / 1 NaCl, 8.8 g / 1 Na citrate (2 x SSC), 0.1% SDS and 2 x 15 min at 32 ° C for 1 5 min at room temperature 0.125 g / 1 NaCl, 2.2 g / 1 Na citrate (0.5 x SSC), 0.1% SDS washed and exposed to X-ray film in a film cassette with intensifying film for 5 days.
  • the DNA sequence determined for the 1.5 kb Pvul fragment is shown in SEQ ID NO: 1.
  • the deduced amino acid sequence can be found in SEQ ID NO: 2.
  • 2 Heterologous expression of the nitA gene from R. rhodochrous NCIMB 11216 in E. coli and purification of the recombinant nitrilase protein
  • nitA gene from R. rhodochrous NCIMB 11216 amplified from the translation start to the translation stop codon.
  • ni -PCR fragment was purified, digested with Ndel / HindiII, integrated into analog digested vector molecules pJOE 2702 (Volff et al., Mol. Microbiol., 21, 1996: 1037-1047) and the resulting plasmid with pDHE 17 (Fig. 2: pDHE 17 with nitA in the L-rhamnose-inducible expression vector pJOE 2702)
  • the nitA gene in the plasmid pDHE 17 is under transcriptional control of the promoter rha p contained in pJOE 2702, which is derived from the L-rhamnose operon rhaBAD in E. coli (Egan & Schleif, Mol. Biol. 243, 1994: 821-829).
  • the transcription termination 5 of the nitA gene and the translation initiation of the transcripts also take place via vector sequences (Volff et al., 1996).
  • transformation of pDHE 17 into E. coli JM 109 is the nitA gene from R. rhodochrous NCIMB 11216 inducible by adding L-rhamnose.
  • the nitA gene was also fused to a 3 'sequence for a C-terminal His 6 ⁇ motif by amplification of the nitA gene, which was carried out under the conditions mentioned above , in addition to the 5 'primer "nitiVdel" (upper), a modified 3' primer without stop codon with the sequence 5 '-CGAGGGTGGCTGTCGCCCG-3' was used and the resultant
  • PCR fragment was integrated into a modified pJOE 2702 vector which contained the sequence [CATJ ⁇ TGA behind the BamHI site. After BamHI digestion, Klenow treatment and IVdel digestion of the vector, the iVdel-trimmed ni A-Pwo amplificate was fused to the His 6 motif sequence by ligation at the 3 'end by "blunt ends" in reading frame and the plasmid obtained is designated pDHE 18.
  • JM 109 (pDHE 17) was inoculated 1: 200 from a 37 ° C. overnight culture in 50 ml complete dYT medium (Sambrook et al., 1989) with 0.2% L-rhamnose and the culture was inoculated for 8 h cultivated at 30 ° C in a shaking water bath under induction. Subsequently, the cells were washed once in 50 mM Tris / HCl, pH 7.5, corresponding to a ODgoo 10 i n resuspended DEM same buffer and disrupted by ultrasonic treatment. The same procedure was followed with JM 109 (pDHE 18).
  • the protein pattern of the crude extracts obtained by ultrasound treatment and clarified by centrifugation in comparison to the non-induced control was determined by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis; According to the induction conditions mentioned, the nitrilase portion of the total protein for JM 109 (pDHE 17) and JM 109 (pDHE 18) was about 30% each.
  • the cells were washed in 50 mM Tris / HCl, pH 7.5, resuspended correspondingly about 50 ODgoo l and extracts with a French press (2 x at 20,000 psi ) manufactured. After clarification of the extracts by centrifugation at 15000 g for 30 min, the purification was carried out using QIAexpress-Ni 2+ -NTA (QIAGEN). 1 ml of matrix was used per ml of crude extract, which was equilibrated with 20 mM Tris / HCl, pH 7.5.
  • the raw extracts were converted by 2 U / mg for the conversion of 2-benzonitrile to benzoic acid and for the nitrilase with His 6 motif purified by QIAexpress-Ni 2+ -NTA at an enzyme concentration of 50 ⁇ g / ml by 11 U / mg determined.
  • 1 unit corresponds to the production of 1 ⁇ mol benzoic acid at an initial benzonitrile concentration of 10 mM, 30 ° C and pH 7.5.
  • Various nitriles were converted with the E. coli strains JM 109 (pDHE 17 or pDHE 18).
  • the cells are harvested by centrifugation (20 min, 4 ° C, 5000 rpm).
  • the cells were then resuspended in 10 mM phosphate buffer, pH 7.2, so that the concentration of dry biomass (BTM) was 2 g BTM / 1.
  • 150 ⁇ l of the cell suspension were pipetted into a microtiter plate per well. The plate was then centrifuged.
  • the supernatant was suctioned off and the cell pellets were washed twice with Na2HP04 (1.42 g / 1 in Finnaqua, pH 7.2). After another centrifugation step, the cell pellets are resuspended in the respective substrate solution (150 ⁇ l). A substrate was added to each 12-row of the microtiter plate. As a control, a row with the substrate solution without cells was taken (blank blank). The microtiter plates were incubated at 30 ° C. and 200 rpm for 1 h in a shaking incubator. The cells were then centrifuged off and the amount of NH4 ions formed in the supernatant was determined using the Biomek device.

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Abstract

Die Erfindung betrifft Nukleisäuresequenzen, die für ein Polypeptid mit Nitrilaseaktivität codieren, Nukleinsäurekonstrukte enthaltend die Nukleinsäuresequenzen sowie Vectoren enthaltend die Nukleinsäuresequenzen oder die Nukleinsäurekonstrukte. Die Erfindung betrifft weiterhin Aminosäuresequenzen, die durch die Nukleinsäuresequenzen codiert werden und Mikroorganismen enthaltend die Nukleinsäuresequenzen, die Nukleinsäurekonstrukte oder Vectoren enthaltend die Nukleinsäuresequenzen oder die Nukleinsäurekonstrukte. Außerdem betrifft die Erfindung ein enzymatisches Verfahren zur Herstellung von Carbonsäuren aus den entsprechenden Nitrilen.

Description

Nitrilase aus Rhodococcus rhodochrous NCIMB 11216
Beschreibung
Die Erfindung betrifft Nukleinsauresequenzen, die für ein Poly- peptid mit Nitrilaseaktivität codieren, Nukleinsaurekonstrukte enthaltend die Nukleinsauresequenzen sowie Vectoren enthaltend die Nukleinsauresequenzen oder die Nukleinsaurekonstrukte. Die Erfindung betrifft weiterhin Aminosäuresequenzen, die durch die Nukleinsauresequenzen codiert werden und Mikroorganismen enthaltend die Nukleinsauresequenzen, die Nukleinsaurekonstrukte oder Vectoren enthaltend die Nukleinsauresequenzen oder die Nukleinsaurekonstrukte .
Außerdem betrifft die Erfindung ein enzymatisch.es Verfahren zur Herstellung von Carbonsäuren aus den entsprechenden Nitrilen.
Aliphatische, aromatische und heteroaromatische Carbonsäuren sind gesuchte Verbindungen für die organischen Synthesechemie. Sie sind Ausgangsprodukte für eine Vielzahl von pharmazeutischen Wirkstoffen oder Wirkstoffen für den Pflanzenschutz.
Aus der Literatur sind eine Reihe verschiedener enzymatischer Synthesezugänge zu achiralen oder chiralen Carbonsäuren bekannt . So werden beispielsweise optisch aktive Aminosäuren technisch über fermentative Verfahren gewonnen. Von Nachteil dabei ist, daß für jede Aminosäure ein eigenes Verfahren entwickelt werden muß. Um eine möglichst breite Palette verschiedener Verbindungen her- stellen zu können, werden deshalb chemische oder enzymatische
Verfahren verwendet. Nachteilig bei den chemischen Verfahren ist, daß das Stereozentrum in der Regel in mehrstufigen, nicht breit anwendbaren Synthese umständlich aufgebaut werden muß.
Die enzymatische Synthese chiraler Carbonsäuren sind einer Reihe von Patenten oder Patentanmeldungen zu entnehmen. W092/ 05275 beschreibt die Synthese enantiomerer α-Hydroxy-α-alkyl- oder α-Alkylcarbonsäuren in Gegenwart biologischen Materials. Weitere Synthesen zu optisch aktiven α-substituierten organischen Säuren mit Mikroorganismen werden in EP-B-0 348 901, EP-B-0 332 379,
EP-A-0 348 901 oder seinem US-Äquivalent US 5,283,193,
EP-A-0 449 648, EP-B-0 473 328, EP-B-0 527 553 oder seinem
US-Äquivalent US 5,296,373, EP-A-0 610 048, EP-A-0 610 049,
EP-A-0 666 320 oder WO 97/32030 beschrieben. Die biotechnologische Synthese achiraler Carbonsäuren mit Mikro¬ organismen wird beispielsweise in EP-A-0 187 680, EP-A-0 229 042, WO 89/00193, JP 08173152, JP06153968, FR 2694571, EP-A0 502 476, EP-A-0 444 640 oder EP-A-0 319 344 beschrieben.
Von Nachteil bei diesen Prozessen ist, daß sie häufig nur zu Produkten mit einer geringen optischen Reinheit führen und/oder daß sie nur mit geringen Raum-Zeit-Ausbeuten ablaufen. Dies führt zu wirtschaftlich unattraktiven Prozessen. Von Nachteil ist außerdem, daß die Enzyme, die in den zur Synthese der achiralen oder chiralen Carbonsäuren verwendeten Mikroorganismen vorhanden sind, in der Regel nur ein eingeschränktes Substratspektrum haben, das heißt es werden immer nur bestimmte aliphatische, aromatische oder heteroaromatische Nitrile durch einen Mikro- Organismus umgesetzt. Speziell aromatische und heteroaromatische Nitrile wie beispielsweise Cyanothiophene oder Benzonitril werden schlecht oder gar nicht zu den entsprechenden Carbonsäuren umgesetzt .
Es bestand daher die Aufgabe, weitere Enzyme zur Herstellung von achiralen und/oder chiralen Carbonsäuren zu entwickeln, die in einem Verfahren zur Herstellung von achiralen und/oder chiralen Carbonsäuren verwendet werden können, das die oben genannten Nachteile nicht aufweist und speziell aromatische und/oder heteroaromatische Carbonsäuren aus den entsprechenden Nitrilen zugänglich macht.
Diese Aufgabe wurde durch die erfindungsgemäße isolierte Nuklein- säuresequenz gelöst, die für ein Polypeptid mit Nitrilase- aktivität codiert, ausgewählt aus der Gruppe:
a) einer Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Sequenz,
b) Nukleinsauresequenzen, die sich als Ergebnis des degenerierten genetischen Codes von der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Nukleinsäuresequenz ableiten,
c) Derivate der in SEQ ID NO : 1 dargestellten Nukleinsäure- Sequenz, die für Polypeptide mit der in SEQ ID NO: 2 dargestellten Aminosäuresequenzen codieren und mindestens 95 % Homologie auf Aminosäureebene aufweisen, ohne daß die enzymatische Wirkung der Polypeptide wesentlich reduziert ist . Unter Homologe der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz mit der Sequenz SEQ ID NO : 1 sind beispielsweise Allelvarianten zu ver¬ stehen, die mindestens 95 % Homologie auf der abgeleiteten Amino¬ säureebene, vorteilhaft mindestens 97 % Homologie, bevorzugt min- destens 98 %, ganz besonders bevorzugt mindestens 99 % Homologie über den gesamten Sequenzbereich aufweisen. Über Teilbereiche der Sequenzen können die Homologien vorteilhaft höher liegen. Die von SEQ ID NO: 1 abgeleitete Aminosäuresequenz ist SEQ ID NO : 2 zu entnehmen. Allelvarianten umfassen insbesondere funktioneile Varianten, die durch Deletion, Insertion oder Substitution von Nukleotiden aus der in SEQ ID NO : 1 dargestellten Sequenz erhältlich sind, wobei die enzymatische Aktivität der abgeleiteten synthetisierten Proteine für das Einbringen eines oder mehrerer Gene in einen Organismus jedoch erhalten nicht wesentlich reduziert sein sollte. Unter nicht wesentlich reduzierter enzymatische Aktivität ist eine enzymatische Aktivität zu verstehen, die vorteilhaft mindestens 10 %, bevorzugt 30 %, besonders bevorzugt 50 %, ganz besonders bevorzugt 70 % der enzymatischen Aktivität des unter SEQ ID NO: 2 wiedergegebenen Enzyms aufweist. Die Erfindung betrifft damit auch Aminosäuresequenzen, die durch die oben dargestellte Gruppe von Nukleinsauresequenzen kodiert werden. Vorteilhaft betrifft die Erfindung Aminosäuresequenzen, die durch die Sequenz SEQ ID NO: 1 kodiert werden .
Weiterhin sind unter Homologe der SEQ ID NO: 1 beispielsweise pilzliche oder bakterielle Homologe, verkürzte Sequenzen, Einzel- strang-DNA oder RNA der codierenden und nichtcodierenden DNA- Sequenz zu verstehen. Homologe der SEQ ID NO: 1 besitzen auf DNA-Ebene eine Homologie von mindestens 60 %, bevorzugt von mindestens 70 %, besonders bevorzugt von mindestens 80 % , ganz besonders bevorzugt von mindestens 90 % über den gesamten in SEQ ID NO: 1 angegebenen DNA-Bereich.
Außerdem sind unter Homologe der SEQ ID NO : 1 Derivate wie beispielsweise Promotorvarianten zu verstehen. Die Promotoren, die den angegebenen Nukleotidsequenzen vorgeschalten sind, können durch ein oder mehrere Nukleotidaustausche, durch Insertion (en) und/oder Deletion (en) verändert sein, ohne daß aber die Funktionalität bzw. Wirksamkeit der Promotoren beeinträchtigt sind. Des weiteren können die Promotoren durch Veränderung ihrer Sequenz in ihrer Wirksamkeit erhöht oder komplett durch wirksamere Promotoren auch artfremder Organismen ausgetauscht werden.
Unter Derivaten sind auch Varianten zu verstehen, deren Nukleotidsequenz im Bereich von -1 bis -200 vor dem Startkodon oder 0 bis 1000 Basenpaare nach dem Stopkodon so verändert wurden, daß die Genexpression und/oder die Proteinexpression verändert, bevorzugt erhöht wird.
Vorteilhaft läßt sich die SEQ ID NO: 1 oder seine Homologen aus Bakterien, vorteilhaft aus gram-positiven Bakterien, bevorzugt aus Bakterien der Gattungen Nocardia, Rhodococcus, Streptomyces , Mycobacterium, Corynebacterium, Micrococcus, Proactinomyces oder Bacillus , besonders bevorzugt aus Bakterien der Gattung Rhodo¬ coccus, Mycobacterium oder Nocardia, ganz besonders bevorzugt aus der Gattung und Art Rhodococcus sp., Rhodococcus rhodochrous , Nocardia rhodochrous oder Mycobacterium rhodochrous über dem Fachmann bekannte Methoden isolieren.
SEQ ID No: 1 oder seine Homologen oder Teile dieser Sequenzen lassen sich beispielsweise mit üblichen Hybridisierungsverfahren oder der PCR-Technik aus anderen Pilzen oder Bakterien isolieren. Diese DNA-Sequenzen hybridisieren unter Standardbedingungen mit den erfindungsgemäßen Sequenzen. Zur Hybrisierung werden vorteilhaft kurze Oligonukleotide der konservierten Bereiche beispiels- weise aus dem aktiven Zentrum, die über Vergleiche mit anderen Nitrilasen oder Nitrilhydratasen in dem Fachmann bekannter Weise ermittelt werden können, verwendet. Es können aber auch längere Fragmente der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder die vollständigen Sequenzen für die Hybridisierung verwendet werden. Je nach der verwendeten Nukleinsäure Oligonukleotid, längeres Fragment oder vollständige Sequenz oder je nachdem welche Nukleinsäureart DNA oder RNA für die Hybridisierung verwendet werden, variieren diese Standardbedingungen. So liegen beispielsweise die Schmelztemperaturen für DNA: DNA-Hybride ca 10°C niedriger als die von DNA:RNA-Hybriden gleicher Länge.
Unter Standardbedingungen sind beispielsweise je nach Nukleinsäure Temperaturen zwischen 42 und 58°C in einer wäßrigen Pufferlösung mit einer Konzentration zwischen 0,1 bis 5 x SSC (1 X SSC = 0,15 M NaCl, 15 mM Natriumeitrat, pH 7,2) oder zusätzlich in Gegenwart von 50 % Formamid wie beispielsweise 42°C in 5 x SSC, 50 % Formamid zu verstehen. Vorteilhafterweise liegen die Hybridisierungsbedingungen für DNA: DNA-Hybride bei 0,1 x SSC und Temperaturen zwischen etwa 20°C bis 45°C, bevorzugt zwischen etwa 30°C bis 45°C. Für DNA:RNA-Hybride liegen die Hybridisierungsbedingungen vorteilhaft bei 0 , 1 x SSC und Temperaturen zwischen etwa 30°C bis 55°C, bevorzugt zwischen etwa 45°C bis 55°C. Diese angegebenen Temperaturen für die Hybridisierung sind beispielhaft kalkulierte Schmelztemperaturwerte für eine Nukleinsäure mit einer Länge von ca. 100 Nukleotiden und einem G + C-Gehalt von 50 % in Abwesenheit von Formamid. Die experimentellen Bedingungen für die DNA-Hybridisierung sind in einschlägigen Lehrbüchern der Genetik wie beispielsweise Sambrook et al . , "Molecular Cloning" , « o
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den gram-positiven Promotoren amy und SP02 , in den Hefe- oder Pilzpromotoren ADC1, MFα, AC , P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH. In diesem Zusammenhang sind auch die Promotoren der Pyruvat- decarboxylase und der Methanoloxidase aus beispielsweise Hansenula vorteilhaft. Es können auch künstliche Promotoren für die Regulation verwendet werden.
Das Nukleinsäurekonstrukt wird zur Expression in einem Wirtsorganismus vorteilhafterweise in einen Vektor wie beispielsweise einem Plasmid, einem Phagen oder sonstiger DNA inseriert, das eine optimale Expression der Gene im Wirt ermöglicht. Diese Vektoren stellen eine weitere Ausgestaltung der Erfindung dar. Geeignete Plasmide sind beispielsweise in E. coli pLG338, pA- CYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4 , pHSl, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III113-Bl, λgtll oder pBdCI, in Streptomyces pIJlOl, pIJ364, pIJ702 oder pIJ361, in Bacillus pUBHO, pC194 oder pBD214, in Corynebacterium pSA77 oder pAJ667, in Pilzen pALSl, pIL2 oder pBB116, in Hefen 2μM, pAG-1, YEp6, YEpl3 oder pEMBLYe23 oder in Pflanzen pLGV23, pGHlac+, pBIN19, pAK2004 oder pDH51. Die genannten Plasmide stellen eine kleine Auswahl der möglichen Plasmide dar. Weitere Plasmide sind dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise aus dem Buch Cloning Vectors (Eds. Pouwels P. H. et al . Elsevier, Amsterdam- New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018) entnommen werden.
Vorteilhafterweise enthält das Nukleinsäurekonstrukt zur Expression der weiteren enthaltenen Gene zusätzlich noch 3' und/oder 5' Terminale regulatorische Sequenzen zur Steigerung der Expression, die je nach ausgewähltem Wirtorganismus und Gen oder Gene für eine optimale Expression ausgewählt werden.
Diese regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Expression der Gene und der Proteinexpression ermöglichen. Dies kann beispielsweise je nach Wirtsorganismus bedeuten, daß das Gen erst nach Induktion exprimiert oder überexprimiert wird, oder daß es sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird.
Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei vorzugsweise die Genexpression der eingeführten Gene positiv beeinflussen und dadurch erhöhen. So kann eine Verstärkung der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/oder "Enhancer" verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird. In einer weiteren Ausgestaltungsform des Vektors kann der das erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt oder die erfindungsgemäße Nukleinsäure enthaltende Vektor auch vorteilhafterweise in Form einer linearen DNA in die Mikroorganismen eingeführt werden und über heterologe oder homologe Rekombination in das Genom des WirtsOrganismus integriert werden. Diese lineare DNA kann aus einem linearisierten Vektor wie einem Plasmid oder nur aus dem Nukleinsäurekonstrukt oder der Nukleinsäure bestehen.
Für eine optimale Expression heterologer Gene in Organismen ist es vorteilhaft die Nukleinsauresequenzen entsprechend des im Organismus verwendeten spezifischen "codon usage" zu verändern. Der "codon usage" läßt sich anhand von Computerauswertungen anderer, bekannter Gene des betreffenden Organismus leicht ermitteln.
Als Wirtsorganismen für die erfindungsgemäße Nukleinsäure oder dem Nukleinsäurekonstrukt kommen prinzipiell alle prokaryonti- schen oder eukaryontisehen Organismen in Frage. Vorteilhafter- weise werden als Wirtsorganismen Mikroorganismen wie Bakterien, Pilze oder Hefen verwendet. Vorteilhaft werden gram-positive oder gram-negative Bakterien, bevorzugt Bakterien der Familie Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Streptomycetaceae, Myco- bacteriaceae oder Nocardiaceae, besonders bevorzugt Bakterien der Gattungen Escherichia, Pseudomonas, Nocardia, Mycobacterium, Streptomyces oder Rhodococcus verwendet . Ganz besonders bevorzugt sind die Gattung und Art Escherichia coli, Rhodococcus rhodochrous, Nocardia rhodochrous, Mycobacterium rhodochrous oder Streptomyces lividans.
Der Wirtsorganismus gemäß der Erfindung enthält dabei vorzugsweise mindestens ein proteinisches Agenz zur Faltung der von ihm synthetisierten Polypeptide und insbesondere der in dieser Erfindung beschriebenen Nukleinsauresequenzen mit Nitrilase- aktivität und/oder die dieses Agenz codierenden Gene, wobei dieses Agenz in einer Menge vorliegt, die größer ist als die, die der Grundmenge des betrachteten Mikroorganismus entspricht . Die für dieses Agenz codierenden Gene sind im Chromosom oder in extrachromosomalen Elementen wie zum Beispiel Plasmiden enthalten.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von chiralen oder achiralen Carbonsäuren, dadurch gekennzeichnet, daß man Nitrile in Gegenwart einer durch die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren kodierten Aminosäuresequenz oder einem wachsenden, ruhenden oder aufgeschlossenen oben genannten Mikroorganismus (= Wirtsorganismus) , der entweder eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz, ein erfindungsgemäßes Nukleinsäurekonstrukt, das eine erfindungsgemäße Nukleinsäure mit einem oder mehreren Regulationssignalen verknüpft enthält, oder einen erfindungsgemäßen Vector enthält, zu den chiralen oder achiralen Carbonsäuren umsetzt.
Ein vorteilhafte Ausführungsform des Verfahrens ist die Umsetzung chiraler oder achiraler aliphatischer Nitrile zu den entsprechenden Carbonsäuren.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform des Verfahrens ist ein Verfahren zur Herstellung von chiralen oder achiralen Carbonsäuren, dadurch gekennzeichnet, daß man Nitrile der allgemeinen Formel I
Figure imgf000009_0001
in Gegenwart einer durch die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren kodierten Aminosäuresequenz oder einem wachsenden, ruhenden oder aufgeschlossenen oben genannten Mikroorganismus, der entweder eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz, ein erfindungsgemäßes Nukleinsäurekonstrukt, das eine erfindungsgemäße Nukleinsäure mit einem oder mehreren Regulationssignalen verknüpft enthält, oder einen erfindungsgemäßen Vector enthält, zu Carbonsäuren der allgemeinen Formel II
Figure imgf000009_0002
umsetzt,
wobei die Substituenten und Variablen in den Formeln I und II folgende Bedeutung haben:
n 0 oder 1
m = 0, 1, 2 oder 3, wobei bei m > 2 zwischen zwei benachbarten Kohlenstoffatomen eine oder keine Doppelbindung vorhanden ist, p = 0 oder 1
A, B, D und E unabhängig voneinander CH, N oder CR3
H = 0, S, NR4, CH oder CR3 , wenn n = 0, oder CH, N oder CR3 , wenn n = 1 ,
wobei zwei benachbarte Variablen A, B, D, E oder H zusammen einen weiteren substituierten oder unsubstituierten aromatischen, gesättigten oder teilweise gesättigten Ring mit 5 bis 8 Atomen im Ring bilden können, der ein oder mehrere Heteroatome wie 0, N oder S enthalten kann und wobei nicht mehr als drei der Variablen A, B, D, E oder H ein Heteroatom sind,
R1 Wasserstoff, substituiertes oder unsubstituiertes , verzweigtes oder unverzweigtes Cι-Cιo-Alkyl- oder Cι-Cιrj-Alkoxy- , substituiertes oder unsubstituiertes Aryl- oder Hetaryl-, Hydroxy- , Halogen- , Cι-Cιo-Alkylamino- oder Amino- ,
R2 Wasserstoff, substituiertes oder unsubstituiertes, verzweigtes oder unverzweigtes Cι-Cιo-Alkyl- oder Cχ-Cιo-Alkoxy- , substituiertes oder unsubstituiertes Aryl- oder Hetaryl-, Hydroxy-, Ci-Cio-Alkylamino- oder Amino-,
R3 Wasserstoff, substituiertes oder unsubstituiertes, verzweigtes oder unverzweigtes Cι-Cιo-Alkyl-, oder Cι-Cιo-Alkoxy-, substituiertes oder unsubstituiertes Aryl-, Hetaryl-, Hydroxy-, Halogen-, Cι-Cιo-Alkylamino- oder Amino-,
R4 Wasserstoff, substituiertes oder unsubstituiertes, verzweigtes oder unverzweigtes Ci-Cirj-Alkyl-.
R1 bezeichnet in den Verbindungen der Formeln I und II Wasserstoff, substituiertes oder unsubstituiertes, verzweigtes oder unverzweigtes Cι-Cιo-Alkyl- oder Cι-Cιo-Alkoxy- , substituiertes oder unsubstituiertes Aryl- oder Hetaryl-, Hydroxy-, Halogen- wie Fluor, Chlor oder Brom, Ci-Cirj-Alkylamino- oder Amino--
Als Alkylreste seien substituierte oder unsubstituierte ver- zweigte oder unverzweigte Ci-Cirj-Alkylketten wie beispielsweise Methyl, Ethyl , n-Propyl, 1-Methylethyl, n-Butyl, 1-Methylpropyl- , 2-Methylpropyl, 1, 1-Dimethylethyl, n-Pentyl, 1-Methylbutyl, 2-Methylbutyl , 3-Methylbutyl , 2,2-Dirnethylpropyl , 1-Ethylpropyl , n-Hexyl, 1, 1-Dimethylpropyl , 1, 2-Dimethylpropyl , 1-Methylpentyl , 2-Methylpentyl, 3-Methylpentyl, 4-Methylpentyl , 1, 1-Dimethyl- butyl, 1,2-Dirnethylbutyl, 1, 3-Dimethylbutyl , 2 , 2-Dimethylbutyl , 2,3-Dimethylbutyl, 3 , 3-Dimethylbutyl , 1-Ethylbutyl , 2-Ethylbutyl, 1,1,2-Trimethylpropyl, 1, 2 , 2-Trimethylpropyl, 1-Ethyl-l-methyl- propyl, l-Ethyl-2-methylpropyl, n-Heptyl, n-Octyl, n-Nonyl oder n-Decyl genannt. Bevorzugt sind Methyl, Ethyl , n-Propyl, n-Butyl, i-Propyl oder i-Butyl.
Als Alkoxyreste seien substituierte oder unsubstituierte, ver¬ zweigte oder unverzweigte Cι-Cι0-Alkoxyketten wie beispielsweise Methoxy, Ethoxy, Propoxy, 1-Methylethoxy, Butoxy, 1-Methyl- propoxy, 2-Methylpropoxy, 1, 1-Dimethylethoxy, Pentoxy, 1-Methyl- butoxy, 2-Methylbutoxy, 3-Methylbutoxy, 1, 1-Dimethylpropoxy,
1, 2-Dimethylpropoxy, 2 , 2-Dimethylpropoxy, 1-Ethylpropoxy, Hexoxy, 1-Methylpentoxy, 2-Methylpentoxy, 3-Methylpentoxy, 4-Methyl- pentoxy, 1 , 1-Dimethylbutoxy, 1, 2-Dimethylbutoxy, 1, 3-Dimethyl- butoxy, 2 , 2-Dimethylbutoxy, 2 , 3-Dimethylbutoxy, 3 , 3-Dimethyl- butoxy, 1-Ethylbutoxy, 2-Ethylbutoxy, 1, 1, 2-Trimethylpropoxy, 1, 2 , 2-Trimethylpropoxy, 1-Ethyl-l-methylpropoxy, l-Ethyl-2- methylpropoxy, Hexyloxy, Heptyloxy, Octyloxy, Nonyloxy oder Decyloxy und deren verzweigtkettige Homologen genannt .
Als Aryl- seien substituiertes und unsubstituiertes Arylreste, die 6 bis 20 Kohlenstoffato e im Ring oder Ringsystem enthalten genannt. Dabei kann es sich um aneinander kondensierte aromatische Ringe handeln oder um aromatische Ringe, die über Alkyl-, Alkylcarbonyl-, Alkenyl- oder Alkenylcarbonylketten, Carbonyl, Sauerstoff oder Stickstoff verbrückt sind. Die Arylreste können gegebenenfalls noch über eine Cχ-Cιo-Alkyl- , C3-Cs-Alkenyl- , C3-Cg-Alkinyl- oder C3-C8-Cycloalkylkette an das Grundgerüst gebunden sein. Bevorzugt sind Phenyl oder Naphthyl .
Als Hetaryl- seien substituierte oder unsubstituierte, einfache oder kondensierte aromatische Ringsysteme mit einem oder mehreren heteroaromatischen 3- bis 7gliedrigen Ringen, die ein oder mehrere Heteroatome wie N, 0 oder S enthalten können und gegebenenfalls über eine Cι-Cιo-Alkyl- , C3-Cg-Alkenyl- oder C3-C8~Cycloalkylkette an das Grundgerüst gebunden sein können, genannt. Beispiele für derartige Hetarylreste sind Pyrazol, Imidazol, Oxazol, Isooxazol, Thiazol, Triazol, Pyridin, Chinolin, Isochinolin, Acridin, Pyrimidin, Pyridazin, Pyrazin, Phenazin, Purin oder Pteridin. Die Hetarylreste können über die Heteroatome oder über die verschiedenen Kohlenstoffatome im Ring oder Ringsystem oder über die Substituenten an das Grundgerüst gebunden sein. Bevorzugt sind Pyridin, Imidazol, Pyrimidin, Purin, Pyrazin oder Chinolin.
Als Alkylaminoreste seien substituierte oder unsubstituierte verzweigte oder unverzweigte Cι-Cχo-Alkylaminoketten wie beispielsweise Methylamine Ethylamino, n-Propylamino, 1-Methylethylamino, n-Butylamino , 1-Methylpropylaminoamino- , 2-Methylpropylamino, 1, 1-Dimethylethylamino, n-Pentylamino, 1-Methylbutylamino, 2-Methylbutylamino, 3-Methylbutylamino, 2 , 2-Dimethylpropylamino, 1-Ethylpropylamino, n-Hexylamino, 1, 1-Dimethylpropylamino, 1, 2-Dimethylpropylamino, 1-Methylpentylamino, 2-Methylpentyl- amino, 3-Methylpentylamino, 4-Methylpentylamino , 1, 1-Dimethyl- butylamino , 1 , 2-Dimethylbutylamino , 1,3-Dimethylbutyla ino , 2 , 2-Dimethylbutylamino, 2 , 3-Dimethylbutylamino, 3 , 3-Dimethyl- butylamino, 1-Ethylbutylamino, 2-Ethylbutylamino, 1,1,2-Tri- methylpropylamino, 1, 2 , 2-Trimethylpropylamino, 1-Ethyl-l-methyl- propylamino, l-Ethyl-2-methylpropylamino, n-Heptylamino , n-Octyl- amino, n-Nonylamino oder n-Decylamino genannt. Bevorzugt sind Methylamine Ethylamino, n-Propylamino, n-Butylamino, i-Propyl- amino oder i-Butylamino .
Als Substituenten der genannten Reste von R1 kommen beispielsweise ein oder mehrere Substituenten wie Halogen wie Fluor, Chlor oder Brom, Thio, Cyano, Nitro, Amino, Hydroxy, Alkyl, Alkoxy, Alkenyl , Alkenyloxy, Alkinyl oder weitere aromatischen oder weitere gesättigte oder ungesättigte nicht aromatische Ringen oder Ringsystemen in Frage. Bevorzugt sind Alkylreste wie Ci-Cg- Alkyl wie Methyl, Ethyl, Propyl oder Butyl, Aryl wie Phenyl, Halogen wie Chlor, Fluor oder Brom, Hydroxy oder Amino.
R2 bezeichnet in den Verbindungen der Formeln I und II Wasserstoff, substituiertes oder unsubstituiertes, verzweigtes oder unverzweigtes Cι-Cιo-Alkyl- oder Cι-Cιo-Alkoxy- , substituiertes oder unsubstituiertes Aryl- oder Hetaryl-, Hydroxy-, Cι-Cιo-Alkyl- amino- oder Amino--
Als Alkylreste seien substituierte oder unsubstituierte verzweigte oder unverzweigte Cχ-Cιo-Alkylketten wie beispielsweise Methyl, Ethyl, n-Propyl, 1-Methylethyl, n-Butyl, 1-Methylpropyl- , 2-Methylpropyl, 1, 1-Dimethylethyl, n-Pentyl, 1-Methylbutyl, 2-Methylbutyl, 3-Methylbutyl , 2 , 2-Dimethylpropyl, 1-Ethylpropyl, n-Hexyl , 1 , 1-Dimethylpropyl , 1 , 2-Dimethylpropyl , 1-Methylpentyl , 2-Methylpentyl , 3-Methylpentyl, 4-Methylpentyl , 1, 1-Dimethyl- butyl , 1 , 2-Dirnethylbutyl , 1,3-Dirnethylbutyl , 2 , 2-Dimethylbutyl , 2, 3-Dimethylbutyl, 3 , 3-Dimethylbutyl , 1-Ethylbutyl, 2-Ethylbutyl, 1, 1,2-Trimethylpropyl, 1, 2 , 2-Trimethylpropyl, 1-Ethyl-l-methyl- propyl, l-Ethyl-2-methylpropyl, n-Heptyl , n-Octyl, n-Nonyl oder n-Decyl genannt. Bevorzugt sind Methyl, Ethyl, n-Propyl, n-Butyl, i-Propyl oder i-Butyl.
Als Alkoxyreste seien substituierte oder unsubstituierte, verzweigte oder unverzweigte Cι-Cιo~Alkoxyketten wie beispielsweise Methoxy, Ethoxy, Propoxy, 1-Methylethoxy, Butoxy, 1-Methylprop- oxy, 2-Methylpropoxy, 1, 1-Dimethylethoxy, Pentoxy, 1-Methyl- butoxy, 2-Methylbutoxy, 3-Methylbutoxy, 1, 1-Dimethylpropoxy, 1,2-Dimethylpropoxy, 2 , 2-Dimethylpropoxy, 1-Ethylpropoxy, Hexoxy, 1-Methylpentoxy, 2-Methylpentoxy, 3-Methylpentoxy, 4-Methylpent- oxy, 1, 1-Dimethylbutoxy, 1, 2-Dimethylbutoxy, 1, 3-Dimethylbutoxy, 2, 2-Dimethylbutoxy, 2 , 3-Dimethylbutoxy, 3 , 3-Dimethylbutoxy, 1-Ethylbutoxy, 2-Ethylbutoxy, 1, 1, 2-Trimethylpropoxy, 1,2,2-Tri- ethylpropoxy, 1-Ethyl-l-methylpropoxy, l-Ethyl-2-methylpropoxy, Hexyloxy, Heptyloxy, Octyloxy, Nonyloxy oder Decyloxy und deren verzweigtkettige Homologen genannt .
Als Aryl- seien substituiertes und unsubstituiertes Arylreste, die 6 bis 20 Kohlenstoffatome im Ring oder Ringsystem enthalten genannt. Dabei kann es sich um aneinander kondensierte aromatische Ringe handeln oder um aromatische Ringe, die über Alkyl-, Alkylcarbonyl-, Alkenyl- oder Alkenylcarbonylketten, Carbonyl, Sauerstoff oder Stickstoff verbrückt sind. Die Arylreste können gegebenenfalls noch über eine Cι-Cιo-Alkyl- , C3-C8-Alkenyl- , C3-C6-Alkinyl- oder C3-Cs-Cycloalkylkette an das Grundgerüst gebunden sein. Bevorzugt sind Phenyl oder Naphthyl .
Als Hetaryl- seien substituierte oder unsubstituierte, einfache oder kondensierte aromatische Ringsysteme mit einem oder mehreren heteroaromatischen 3- bis 7gliedrigen Ringen, die ein oder mehrere Heteroatome wie N, 0 oder S enthalten können und gegebenenfalls über eine Ci-Cirj-Alkyl- , C3-Cs-Alkenyl- oder C -C8-Cycloalkylkette an das Grundgerüst gebunden sein können, genannt. Beispiele für derartige Hetarylreste sind Pyrazol, Imidazol, Oxazol, Isooxazol, Thiazol, Triazol, Pyridin, Chinolin, Isochinolin, Acridin, Pyrimidin, Pyridazin, Pyrazin, Phenazin,
Purin oder Pteridin. Die Hetarylreste können über die Heteroatome oder über die verschiedenen Kohlenstoffatome im Ring oder Ringsystem oder über die Substituenten an das Grundgerüst gebunden sein. Bevorzugt sind Pyridin, Imidazol, Pyrimidin, Purin, Pyrazin oder Chinolin.
Als Alkylaminoreste seien substituierte oder unsubstituierte verzweigte oder unverzweigte Cι-Cιo-Alkylaminoketten wie beispielsweise Methylamino, Ethylamino, n-Propylamino, 1-Methylethylamino, n-Butylamino, 1-Methylpropylaminoamino- , 2-Methylpropylamino, 1, 1-Dimethylethylamino, n-Pentylamino, 1-Methylbutylamino, 2-Methylbutylamino, 3-Methylbutylamino, 2 , 2-Dimethylpropylamino, 1-Ethylpropylamino, n-Hexylamino, 1, 1-Dimethylpropylamino, 1, 2-Dimethylpropylamino, 1-Methylpentylamino, 2-Methylpentyl- amino, 3-Methylpentylamino, 4-Methylpentylamino, 1, 1-Dimethyl- butylamino, 1, 2-Dimethylbutylamino, 1, 3 -Dimethylbutylamino, 2 , 2-Dimethylbutylamino, 2 , 3-Dimethylbutylamino, 3 , 3-Dimethyl- butyla ino, 1-Ethylbutylamino, 2-Ethylbutylamino, 1,1,2-Tri- methylpropylamino,- 1 , 2 , 2-Trimethylpropylamino, 1-Ethyl-l-methyl- propylamino, l-Ethyl-2-methylpropylamino, n-Heptylamino, n-Octyl- a ino, n-Nonylamino oder n-Decylamino genannt. Bevorzugt sind Methylamino, Ethylamino, n-Propylamino, n-Butylamino, i-Propyl- amino oder i-Butylamino.
Als Substituenten der genannten Reste von R2 kommen beispielsweise ein oder mehrere Substituenten wie Halogen wie Fluor, Chlor oder Brom, Thio, Nitro, Amino, Hydroxy, Alkyl , Alkoxy, Alkenyl, Alkenyloxy, Alkinyl oder weitere aromatischen oder weitere gesättigte oder ungesättigte nicht aromatische Ringen oder Ringsystemen in Frage. Bevorzugt sind Alkylreste wie Cι-C6-Alkyl wie Methyl, Ethyl, Propyl oder Butyl, Aryl wie Phenyl , Halogen wie Chlor, Fluor oder Brom, Hydroxy oder Amino.
R3 bezeichnet in den Verbindungen der Formeln I und II Wasserstoff, substituiertes oder unsubstituiertes, verzweigtes oder unverzweigtes Cχ-Cιo-Alkyl- oder Ci-Cirj-Alkoxy- , substituiertes oder unsubstituiertes Aryl- oder Hetaryl-, Hydroxy-, Halogen- wie Fluor, Chlor oder Brom, Cι-Cιo-Alkylamino- oder Amino--
Als Alkylreste seien substituierte oder unsubstituierte verzweigte oder unverzweigte Cι-Cιo-Alkylketten wie beispielsweise Methyl, Ethyl, n-Propyl, 1-Methylethyl, n-Butyl, 1-Methylpropyl- , 2-Methylpropyl, 1, 1-Dimethylethyl, n-Pentyl, 1-Methylbutyl, 2-Methylbutyl, 3-Methylbutyl, 2 , 2-Dimethylpropyl , 1-Ethylpropyl , n-Hexyl , 1 , 1-Dimethylpropyl , 1 , 2-Dimethylpropyl , 1-Methylpentyl , 2-Methylpentyl, 3-Methylpentyl, 4-Methylpentyl , 1, 1-Dimethyl- butyl, 1, 2-Dimethylbutyl, 1, 3-Dimethylbutyl, 2 , 2-Dimethylbutyl , 2 , 3-Dimethylbutyl , 3 , 3-Dimethylbutyl , 1-Ethylbutyl , 2-Ethylbutyl , 1, 1, 2-Trimethylpropyl, 1, 2 , 2-Trimethylpropyl, 1-Ethyl-l-methyl- propyl, l-Ethyl-2-methylpropyl, n-Heptyl, n-Octyl, n-Nonyl oder n-Decyl genannt. Bevorzugt sind Methyl, Ethyl, n-Propyl, n-Butyl, i-Propyl oder i-Butyl.
Als Alkoxyreste seien substituierte oder unsubstituierte, verzweigte oder unverzweigte Ci-Cirj-Alkoxyketten wie beispielsweise Methoxy, Ethoxy, Propoxy, 1-Methylethoxy, Butoxy, 1-Methylpro- poxy, 2-Methylpropoxy, 1 , 1-Dimethylethoxy, Pentoxy, 1-Methyl- butoxy, 2-Methylbutoxy, 3-Methylbutoxy, 1, 1-Dimethylpropoxy, 1, 2-Dimethylpropoxy, 2 , 2-Dimethylpropoxy, 1-Ethylpropoxy, Hexoxy, 1-Methylpentoxy, 2-Methylpentoxy, 3-Methylpentoxy, 4-Methylpent- oxy, 1, 1-Dimethylbutoxy, 1, 2-Dimethylbutoxy, 1, 3-Dimethylbutoxy, 2 , 2-Dimethylbutoxy, 2 , 3-Dimethylbutoxy, 3 , 3-Dimethylbutoxy,
1-Ethylbutoxy, 2-Ethylbutoxy, 1, 1, 2-Trimethylpropoxy, 1,2,2-Tri- methylpropoxy, 1-Ethyl-l-methylpropoxy, l-Ethyl-2-methylpropoxy, Hexyloxy, Heptyloxy, Octyloxy, Nonyloxy oder Decyloxy und deren verzweigtkettige Homologen genannt .
Als Aryl- seien substituiertes und unsubstituiertes Arylreste, die 6 bis 20 Kohlenstoffatome im Ring oder Ringsystem enthalten genannt. Dabei kann es sich um aneinander kondensierte aromatische Ringe handeln oder um aromatische Ringe, die über Alkyl-, Alkylcarbonyl-, Alkenyl- oder Alkenylcarbonylketten, Carbonyl , Sauerstoff oder Stickstoff verbrückt sind. Die Arylreste können gegebenenfalls noch über eine Cι-Cιo-Alkyl-, C3-Cs-Alkenyl- , C3-C6-Alkinyl- oder C3-Cs-Cycloalkylkette an das Grundgerüst gebunden sein. Bevorzugt sind Phenyl oder Naphthyl .
Als Hetaryl- seien substituierte oder unsubstituierte, ein- fache oder kondensierte aromatische Ringsysteme mit einem oder mehreren heteroaromatischen 3- bis 7gliedrigen Ringen, die ein oder mehrere Heteroatome wie N, 0 oder S enthalten können und gegebenenfalls über eine Cι-Cιo-Alkyl- , C3-C8-Alkenyl- oder C3-C8-Cycloalkylkette an das Grundgerüst gebunden sein können, genannt. Beispiele für derartige Hetarylreste sind Pyrazol,
Imidazol, Oxazol, Isooxazol, Thiazol, Triazol, Pyridin, Chinolin, Isochinolin, Acridin, Pyrimidin, Pyridazin, Pyrazin, Phenazin, Purin oder Pteridin. Die Hetarylreste können über die Heteroatome oder über die verschiedenen Kohlenstoffatome im Ring oder Ring- System oder über die Substituenten an das Grundgerüst gebunden sein. Bevorzugt sind Pyridin, Imidazol, Pyrimidin, Purin, Pyrazin oder Chinolin.
Als Alkylaminoreste seien substituierte oder unsubstituierte ver- zweigte oder unverzweigte Cι-Cιo-Alkylaminoketten wie beispielsweise Methylamino, Ethylamino, n-Propylamino, 1-Methylethylamino, n-Butylamino, 1-Methylpropylaminoamino-, 2-Methylpropylamino, 1, 1-Dimethylethylamino, n-Pentylamino, 1-Methylbutylamino, 2-Methylbutylamino, 3-Methylbutylamino, 2 , 2-Dimethylpropylamino , 1-Ethylpropylamino, n-Hexylamino, 1, 1-Dimethylpropylamino,
1, 2-Dimethylpropylamino, 1-Methylpentylamino, 2-Methylpentyl- amino, 3-Methyipentylamino, 4-Methylpentylamino, 1, 1-Dimethyl- butylamino , 1,2-Dimethylbutylamino , 1,3-Dimethylbutylamino , 2 , 2-Dimethylbutylamino, 2, 3-Dimethylbutylamino, 3 , 3-Dimethyl- butylamino, 1-Ethylbutylamino, 2-Ethylbutylamino, 1,1,2-Tri- methylpropylamino, 1, 2, 2-Trimethylpropylamino, 1-Ethyl-1-methyl- propylamino, l-Ethyl-2-methylpropylamino, n-Heptylamino, n-Octyl- amino, n-Nonylamino oder n-Decylamino genannt. Bevorzugt sind Methylamino, Ethylamino, n-Propylamino, n-Butylamino, i-Propyl- amino oder i-Butylamino . Als Substituenten der genannten Reste von R3 kommen beispiels¬ weise ein oder mehrere Substituenten wie Halogen wie Fluor, Chlor oder Brom, Thio, Nitro, Amino, Hydroxy, Alkyl, Alkoxy, Alkenyl , Alkenyloxy, Alkinyl oder weitere aromatischen oder weitere gesättigte oder ungesättigte nicht aromatische Ringen oder
Ringsystemen in Frage. Bevorzugt sind Alkylreste wie Ci-Cß-Alkyl wie Methyl, Ethyl, Propyl oder Butyl, Aryl wie Phenyl , Halogen wie Chlor, Fluor oder Brom, Hydroxy oder Amino.
R4 bezeichnet in den Verbindungen der Formeln I und II Wasserstoff oder substituiertes oder unsubstituiertes, verzweigtes oder unverzweigtes Cχ-Cιo-Alkyl--
Als Alkylreste seien substituierte oder unsubstituierte ver- zweigte oder unverzweigte Cχ-Cιo-Alkylketten wie beispielsweise Methyl, Ethyl, n-Propyl, 1-Methylethyl , n-Butyl, 1-Methylpropyl- , 2-Methylpropyl , 1, 1-Dimethylethyl, n-Pentyl, 1-Methylbutyl , 2-Methylbutyl, 3-Methylbutyl , 2 , 2-Dimethylpropyl , 1-Ethylpropyl , n-Hexyl, 1, 1-Dimethylpropyl , 1, 2-Dimethylpropyl , 1-Methylpentyl , 2-Methylpentyl, 3-Methylpentyl, 4-Methylpentyl , 1, 1-Dimethyl- butyl, 1, 2-Dimethylbutyl, 1 , 3-Dimethylbutyl, 2 , 2-Dimethylbutyl , 2, 3-Dimethylbutyl, 3 , 3-Dimethylbutyl , 1-Ethylbutyl , 2-Ethylbutyl, 1, 1, 2-Trimethylpropyl, 1, 2 , 2-Trimethylpropyl, 1-Ethyl-l-methyl- propyl, l-Ethyl-2-methylpropyl, n-Heptyl, n-Octyl, n-Nonyl oder n-Decyl genannt. Bevorzugt sind Methyl, Ethyl, n-Propyl, n-Butyl, i-Propyl oder i-Butyl.
Als Substituenten der genannten Reste von R4 kommen beispielsweise ein oder mehrere Substituenten wie Halogen wie Fluor, Chlor oder Brom, Thio, Nitro, Amino, Hydroxy, Alkyl, Alkoxy, Alkenyl, Alkenyloxy, Alkinyl oder weitere aromatischen oder weitere gesättigte oder ungesättigte nicht aromatische Ringen oder Ringsystemen in Frage. Bevorzugt sind Alkylreste wie Ci-Cg-Alkyl wie Methyl, Ethyl, Propyl oder Butyl, Aryl wie Phenyl, Halogen wie Chlor, Fluor oder Brom, Hydroxy oder Amino.
Auch aromatische oder aliphatische gesätttigte oder ungesättigte Dinitrile lassen sich im erfindungsgemäßen Verfahren vorteilhaft umsetzen.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird vorteilhaft bei einem pH-Wert von 4 bis 11, bevorzugt von 4 bis 9 durchgeführt.
Weiterhin werden im Verfahren vorteilhaft von 0,01 bis 10 Gew.-%, bevorzugt 0,1 bis 10 Gew.-%, besonders bevorzugt 0,5 bis 5 Gew.-% Nitril verwendet. Je nach Nitril können unterschiedliche Mengen an Nitril in der Reaktion verwendet werden. Die geringsten Mengen an Nitril werden vorteilhaft bei Nitrilen (Cyanhydrine) verwendet (= Mengen zwischen 0,01 bis 5 Gew.-%), die im Gleichgewicht mit den entsprechenden Aldehyden und Blausäure stehen. Da der Aldehyd für die Mikroorganismen oder Enzyme in der Regel toxisch ist. Nitrile, die leicht flüchtig sind, werden ebenfalls vorteilhaft in Mengen zwischen 0,01 bis 5 Gew.-% eingesetzt. Bei höheren Cyanhydrin- bzw. Nitrilmengen läuft die Reaktion verzögert ab. Bei Nitrilen, die nur geringe oder nahezu keine Lösungsmitteleigenschaften haben oder Nitrilen, die sich nur in sehr geringen Mengen in wäßrigen Medium lösen, können vorteilhaft auch größere als die oben angegebenen Mengen eingesetzt werden. Zur Erhöhung des Umsatzes und der Ausbeute wird die Reaktion vorteilhafterweise unter kontinuierlicher Zugabe des Nitrils durchgeführt. Das Produkt kann nach Ende der Reaktion isoliert werden oder aber in einem Bypass kontinuierlich entfernt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird vorteilhaft bei einer Temperatur zwischen 0°C bis 80°C, bevorzugt zwischen 10°C bis 60°C, besonders bevorzugt zwischen 15°C bis 50°C durchgeführt
Vorteilhaft werden im erfindungsgemäßen Verfahren aromatische oder heteroaromatische Nitrile wie 2-Phenyl-propionitril , 2-Hydroxy-phenylessigsäurenitril, 2-Amino-2-phenyl-acetonitril , Benzonitril, Phenylacetonitril , trans-Zimtsäurenitril , 3-Cyan- thiophen oder 3-Cyanomethyl-thiophen genannt.
Unter chiralen Nitrilen im erfindungsgemäßen Verfahren sind Nitrile zu verstehen, die aus einem 50:50 Gemisch der beiden Enantiomere oder aus einem beliebigen anderen Gemisch mit einer Anreicherung eines der beiden Enantiomere im Gemisch bestehen. Beispielhaft seien für derartige Nitrile 2-Phenyl-propionitril , 2-Hydroxy-phenylessigsäurenitril , 2-Amino-2-phenyl-acetonitril , 2-Chlor-propionitril oder 2-Hydroxy-propionitril genannt.
Unter chiralen Carbonsäuren sind im erfindungsgemäßen Verfahren zu verstehen, die eine Enantiomerenanreicherung zeigen. Bevorzugt werden im Verfahren Enantiomerenreinheiten von mindestens 90 %ee, bevorzugt von min. 95 %ee, besonders bevorzugt von min. 98 %ee, ganz besonders bevorzugt min. 99 %ee erreicht.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die Umsetzung einer großen Vielzahl von chiralen oder achiralen Nitrilen zu den entsprechenden chiralen oder achiralen Carbonsäuren. Im Verfahren lassen sich mindestens 25 mmol Nitril/h x mg Protein oder min- destens 25 mmol Nitril/h x g Trockengewicht der Mikroorganismen umsetzen, bevorzugt mindestens 30 mmol Nitril/h x mg Protein oder mindestens 30 mmol Nitril/h x g Trockengewicht, besonders bevor- zugt mindestens 40 mmol Nitril/h x mg Protein oder mindestens 40 mmol Nitril/h x g Trockengewicht, ganz besonders bevorzugt mindestens 50 mmol Nitril/h x mg Protein oder mindestens 50 mmol Nitril/h x g Trockengewicht.
Für das erfindungsgemäße Verfahren können wachsende Zellen ver¬ wendet werden, die die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, Nuklein¬ saurekonstrukte oder Vektoren enthalten. Auch ruhende oder aufgeschlossene Zellen können verwendet werden. Unter auf- geschlossenen Zellen sind beispielsweise Zellen zu verstehen, die über eine Behandlung mit beispielsweise Lösungsmitteln durchlässig gemacht worden sind, oder Zellen die über eine Enzymbehandlung, über eine mechanische Behandlung (z.B. French Press oder Ultraschall) oder über eine sonstige Methode auf- gebrochen wurden. Die so erhaltenen Rohextrakte sind für das erfindungsgemäße Verfahren vorteilhaft geeignet . Auch gereinigte oder angereinigte Enzyme können für das Verfahren verwendet werden. Ebenfalls geeignet sind immobilisierte Mikroorganismen oder Enzyme, die vorteilhaft in der Reaktion Anwendung finden können.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten chiralen oder achiralen Carbonsäuren lassen sich vorteilhaft aus der wäßrigen Reaktionslösung über Extraktion oder Kristallisation oder über Extraktion und Kristallisation gewinnen. Hierzu wird die wäßrige Reaktionslösung mit einer Säure wie einer Mineralsäure (z.B. HC1 oder H S0 ) oder einer organischen Säure angesäuert vorteilhaft auf pH-Werte unter 2 und anschließend mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert . Die Extraktion kann zur Erhöhung der Ausbeute mehrfach wiederholt werden. Als organische Lösungsmittel können prinzipiell alle Lösungsmittel verwendet werden, die mit Wasser gegebenenfalls nach Zugabe von Salzen eine Phasengrenze zeigen. Vorteilhafte Lösungsmittel sind Lösungsmittel wie Toluol, Benzol, Hexan, Methyltertiärbutylether oder Essigester. Auch eine Reinigung der Produkte kann auch vorteilhaft über Bindung an einen Ionentauscher und anschließendes eluieren mit einer Mineralsäure oder Carbonsäure wie HCL, HS0 , Ameisensäure oder Essigsäure erfolgen.
Nach Einengen der wässrigen oder organischen Phase können die Produkte in der Regel in guten chemischen Reinheiten, das heißt größer 90 % chemische Reinheit, gewonnen werden. Nach Extraktion kann die organische Phase mit dem Produkt aber auch nur zum Teil eingeengt werden und das Produkt auskristallisiert werden. Dazu wird die Lösung vorteilhaft auf eine Temperatur von 0°C bis 10°C abgekühlt. Die Kristallisation kann auch direkt aus der organischen Lösung erfolgen. Das auskristallisierte Produkt kann nochmals in im gleichen oder in einem anderen Lösungsmittel zur erneuten Kristallisation aufgenommen werden und nochmals kristallisiert werden. Durch die anschließende mindestens einmalige Kristallisation kann die Enantiomerenreinheit des Produktes je nach Lage des Eutektikum weiter gesteigert werden.
Die chiralen oder achiralen Carbonsäuren können jedoch auch direkt nach Ansäuern mit einer Säure auf einen pH-Wert vorteilhaft unter 2 aus der wäßrigen Reaktionslösung auskristallisiert werden. Vorteilhaft wird dazu die wäßrige Lösung unter Erwärmen eingeengt und in ihrem Volumen um 10 bis 90 %, bevorzugt 20 bis 80 %, besonders bevorzugt 30 bis 70 % reduziert. Vorzugsweise wird die Kristallisation unter Kühlung durchgeführt. Temperaturen zwischen 0°C bis 10°C sind für die Kristallisation bevorzugt. Aus kostengründen ist die direkte Kristallisation aus der wäßrigen Lösung bevorzugt. Ebenfalls bevorzugt wird eine Aufarbeitung der chiralen Carbonsäuren über ein Extraktion und gegebenenfalls anschließender Kristallisation.
Bei diesen bevorzugten Aufarbeitungsarten läßt sich das Produkt des erfindungsgemäßen Verfahrens in Ausbeuten von 60 bis 100 %, bevorzugt von 80 bis 100 %, besonders bevorzugt von 90 bis 100 % bezogen auf das für die Reaktion eingesetzte Nitril isolieren. Das isoliert Produkt zeichnet sich durch eine hohe chemische Reinheit von > 90 %, bevorzugt > 95 % besonders bevorzugt von > 98 % aus. Weiterhin zeichnen sich die Produkt bei chiralen Nitrilen bzw. chiralen Carbonsäuren durch eine hohe Enantiomerenreinheit, die durch die Kristallisation weiter gesteigert werden kann.
Die so gewonnenen Produkte eignen sich als Ausgangsmaterial für organischen Synthesen zur Herstellung von Pharmaka oder Agro- chemikalien oder zur Racematspaltung.
Beispiele:
Isolierung und heterologe Expression des nitA-Gens aus Rhodococcus rhodochrous NCIMB 11216
Beispiel 1: Isolierung des niCA-Gens aus Rhodococcus rhodochrous NCIMB 11216
Zur Isolierung des nitA-Gens aus Rhodococcus rhodochrous NCIMB 11216 wurde zelleigene DNA isoliert, eine Phagen-Genbank angelegt und diese mit einer Oligo-Nukleotid-Sonde durchsucht. 1.1 Isolierung von DNA aus R . rhodochrous NCIMB 11216
Zur Präparation genomischer DNA aus Rhodococcus rhodochrous NCIMB 11216 nach Sa brook et al . , 1989, wurden 2 x 100 ml Über- nacht-Kultur (in dYT-Medium, Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. , 1989, Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York.) abzentrifugiert und die Pellets in 8 ml 25 mM Tris/ HC1, 25 mM EDTA, 10 % Saccharose (w/v) , pH 8,0 resuspendiert. Nach Lysozymbehandlung der vereinigten Kulturen für 15 min bei
37°C (Zugabe von 2 ml Lysozym, 100 mg/ml in 10 mM Tris/HCl, 0 , 1 mM EDTA, pH 8,0) wurden 2 ml 10 % (w/v) Na-Lauroylsarcosinat zuge¬ geben und bei mehrmaliger Durchmischung 15 min bei 65°C inkubiert. Anschließend wurde CsCl in einer Endkonzentration von 1 g/ml hin- zugegeben, bei 65°C gelöst und nach .Zugabe von Ethidiumbromid in einer Endkonzentration von 0,4 mg/ml eine Ultrazentrifugation im Festwinkelrotor (Sorvall T1270, 83500 g, 48 h, 17°C) durchgeführt. Die chromosomale DNA-Bande wurde unter UV-Licht abgezogen, 2 h gegen TE 10.1 (10 mM Tris/HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) dialysiert und 3 mal mit Phenollösung (gesättigt mit 10 mM Tris/HCl, pH 8) extrahiert. Schließlich wurde die DNA noch 3 mal gegen TE 10.01 (10 mM Tris/HCl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0), dialysiert und bei 4°C gelagert. So wurden etwa 1,5 ml DNA-Lösung mit einer Konzentration von etwa 500 μg/ml gewonnen.
1.2 Herstellung einer Phagen-Genbank aus der DNA von R . rhodochrous NCIMB 11216
Als Vektor für die Genbank wurde der Phage λ±RESIII verwendet: Dieser Substitutionsvektor enthält das lux-Operon als Replace- ment-Fragment , was eine visuelle Erfassung des Hintergrundes durch Bioluminiszenz ermöglicht, sowie integrierte res ("reso- lution") -sites aus Tnl722 und die Replikationsfunktionen von pTW601-l, so daß der Vektor in einem Stamm mit entsprechender Transposase in ein autonom replizierendes Plasmid umgewandelt werden kann (Altenbuchner , 1993, A new λ RES vector with a built- in Tn2721-encoded, excision System, Gene 123, 63-68).
1.2.1 Isolierung von λ±RESIII-DNA (nach Sambrook et al . , 1989)
Aus einer Übernachtkultur von E. coli TAP 90 (LBo, Sambrook et al . , 1989, mit 10 mM MgS04, 0,2 % Maltose (w/v)) wurden 1010 Zellen abzentrifugiert und das Pellet in 3 ml SM-Phagenpuffer (50 mM Tris/HCl, 100 mMNaCl, 8 M MgS04, 0,01 % (w/v) Gelatine) resuspendiert. Nach Infektion mit 1,5 x 108 - 1,5 x 109 plaque forming units (pfu) λ RESIII-Phagenlysat für 20 min bei 37°C wurde der Ansatz im 2 1 Erlenmeyer-Kolben zu 500 ml LBQ , 10 mM MgS0 , 0,2 % Maltose gegeben. Insgesamt 4 solcher Ansätze wurden 9 bis 12 h bei 37°C gerührt, bis die Zellyse erkennbar wurde. Zur vollständigen Lyse wurde jeder Kolben mit 10 ml Chloroform versetzt, weitere 30 min bei 37°C gerührt. Zelluläre Nukleinsäuren 5 wurden durch Zugabe von DNase und RNase (je 1 μg/ml) 30 min bei Raumtemperatur unter Rühren verdaut. Dann wurden zu jedem Ansatz 29,2 g NaCl zugegeben, gelöst, 10 min bei 8300 g zentrifugiert und die Überstande mit 10 % PEG 6000 versetzt. Zur anschließenden Phagenpräzipitation wurden die Ansätze über Nacht bei 4°C ge-
10 rührt und anschließend 15 min bei 14000 g abzentrifugiert. Nach Trocknen der Pellets wurden diese in jeweils 5 ml SM-Puffer aufgenommen, mit 5 ml Chloroform versetzt und 15 min bei 3000 g zentrifugiert. Die wässrigen Phasen mit den Phagen wurden vereinigt, mit 0,75 g/ml CsCl versetzt und nach vollständiger Lösung
15 24 h zentrifugiert (Festwinkelrotor Sorvall T1270, 98400 g, 48 h, 17°C) . Die sichtbare Phagenbande wurde abgezogen und 2 x gegen 50 mM Tris/HCl, 10 mM NaCl, 10 mM MgCl2, pH 8 , 0 dialysiert. Nach Zugabe von 20 mM EDTA, 50 μg/ml Proteinase K und 0,5 % SDS erfolgte eine Inkubation für 1 h bei 65°C. Anschließend wurde je 1 x
20 mit Phenol (gesättigt mit 10 mM Tris/HCl, pH 8 ) , l x mit Phenol (gesättigt mit 10 mM Tris/HCl, pH 8) / Chloroform (50/50 v/v) und 1 x mit Chloroform extrahiert. Schließlich wurde die DNA 3 x gegen TE 10.1 und 1 x gegen TE 10.01 dialysiert, der Titer auf E. coli TAP 90 bestimmt (siehe 1.2.3) und die λ±RESIII-DNA bei 4°C
25 gelagert.
1.2.2 Klonierung genomischer DNA in λ±RESIII-Vektoren
Für die Klonierung genomischer R . rhodochrous NCIMB 11216 DNA- 30 Fragmente wurden zuerst die λ±RESIII-Armfragmente präpariert, indem λ±RESIII-DNA in einem Volumen von 100 μl 2 μg mit 20 U BamHI 5 h bei 37°C verdaut wurden. Nach Extraktion mit Phenol (gesättigt mit 10 mM Tris/HCl, pH 8) / Chloroform (50/50 v/v), Isopropanol- Fällung und Waschen mit 70 % bzw. 100 % Äthanol (vorgekühlt auf 5 -20°C) wurde die DNA in TE 10.01 gelöst und mit 20 U Sall nachbehandelt (5 h bei 37°C) . Erneut erfolgten Phenol / Chloroform- Extraktion, Isopropanol-Fällung, Waschen und Lösung in TE 10.01.
Zur Herstellung der genomischen DNA-Fragmente wurden - nach Auf- 0 nähme einer Zeitkinetik für die verwendete Enzymcharge - 10 μg genomische DNA in einem 100 μl-Ansatz für 5 min mit 0,5 U Sau3AI partial verdaut. Nach elektrophoretischer Auftrennung über ein 0,8 %iges Low-melting-point-Agarosegel wurde der Fragmentbereich von 8 bis 14 kb isoliert und nach Parker & Seed (1980) aus dem 5 Gel eluiert . Die genomischen DNA-Fragmente wurden über Nacht bei 16°C mit den λ+RESIII-Armen ligiert. Die Ligationsansätze wurden schließlich in vi tro mit Phagenex- trakten verpackt, .die zuvor aus dem "packaging extract donor" E. coli BHB 2688 ("freeze thaw lysate", FTL, Sambrook et al . , 1989) und dem "prehead donor" E. coli BHB 2690 ("sonicated 5 extract", SE, Sambrook et al., 1989) präpariert worden waren. Für die Verpackung wurden 5 μl Ligationsansatz , 7 μl Puffer A (20 mM Tris/HCl, 3 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 0,05 % ß-Mercaptoäthanol, pH 8,0), 7 μl Puffer Ml ( 6 , 7 mM Tris/HCl, 33 mM Spermidin, 100 mM Putrescin, 17,8 mM ATP, 0,2 % ß-Mercaptoäthanol, 20 mM MgCl2, pH 10 8) , 15 μl SE und 10 μl FTL gemischt und 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden 500 μl SM-Puffer und 1 Tropfen Chloroform zugegeben, gemischt, die Ansätze abzentrifugiert und bei 4°C gelagert.
15 Zur TiterbeStimmung der hergestellten Phagengenbank wurde der Stamm E. coli TAP 90 (Patterson & Dean, 1987) infiziert. Hierzu wurden logarithmisch wachsende Zellen (Anzucht in LBo, 10 mM MgCl , 0,5 % Maltose) mit 100 μl verschiedener Verdünnungen des Verpackungs- oder Phagenlysats in SM-Puffer für 30 min bei
20 37°C inkubiert. Die Ansätze wurden dann mit je 3 ml auf 42°C temperierten Top-Agar (0,8 % Bacto-Agar, 10 mM MgCl , 0,5 % Maltose) versetzt, kurz gemischt und auf LBrj-Agarplatten mit 10 mM MgCl (auf 37°C vorgewärmt) aufgeschichtet. Nach 12-16 h Inkubation bei 37°C wurden die Plaques zur Titerbestimmung aus-
25 gezählt. Der Titer der hergestellten Genbank betrug etwa 4 x 105 pfu/ml .
1.2.3 Umwandlung der rekombinanten λ±RESIII-Phagen in ein Plasmid
30
Die erhaltenen rekombinanten λ±RESIII-Phagen wurden in dem Stamm E. coli HB 101 F' [ : : Tnl 7391ac] , der das Transposon Tnl735 mit dem Resolvasegen unter Kontrolle des tac-Promotors trägt (Altenbuch- ner, 1993, siehe oben), in ein autonom replizierendes Plasmid
35 umgewandelt. Dieser Stamm wurde zur Infektion in 5 ml LBo mit 10 mM MgCl2 und 0,5 % Maltose bis zu einer OD6oo von 0,6 bis 0,8 angezogen und 100 μl davon mit einer geeigneten Menge an Phagen- lysat für 30 min bei Raumtemperatur infiziert. Der Ansatz wurde in 5 ml vorgewärmtem dYT, 1 mM Isopropyl-ß-thiogalactopyranosid 0 (IPTG) 1 h bei 37°C gerollert, abzentrifugiert, im Rücklauf resuspendiert, und die Zellen auf dYT Agarplatten mit 100 μg/ml Kanamycin plattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert.
Zur Visualisierung von Zellen, deren umgewandeltes λ±RESIII- 5 Molekül noch das ursprüngliche Replacement-Fragment mit dem lux-Operon und somit kein genomisches Insert enthält (Genbankhintergrund) , wurden die Platten 3 h bei 30°C induziert und die bioluminiszierenden Zellen im Dunkeln ausgezählt. Der Genbankhintergrund betrug dem Anteil leuchtender Zellen zufolge 13 %.
1.3. Screening des Nitrilasegens ni tA aus R . rhodochrous 5 NCIMB 11216
Rekombinante λ±RESIII-Phagen, die chromosomale DNA-Fragmente mit dem Nitrilasegen aus R . rhodochrous NCIMB 11216 enthalten, wurden durch Hybridisierung der Phagenplaques mit der Oligo-Nukleotid- 10 Sonde
"nitllower", mit der Sequenz: 5 ' -TGGAA (AG) TG (CT) TCCCA (AG) CA-3 ' ,
Kobayashi, M. , Komeda, H., Yanaka, N. , Nagasawa, T. and 15 Yamada, H. (1992)
Nitrilase from Rhodococcus rhodochrous Jl .
Kobayashi, M. , Izui, H., Nagasawa, T. and Yamada, H. (1993) Nitrilase in biosynthesis of the plant hormone indole-3-acetic 20 acid from indole-3-acetonitrile : Cloning of the Alcaligenes gene and site-directed mutagenesis of cysteine residues .
identifiziert. Die Sequenz des Oligo-Nukleotids wurde aus einem konservierten Aminosäuresequenzbereich mit dem mutmaßlichen
25 katalytischen Cystein-Rest (Kobayashi et al . , J. Biol . Chem. 267, 1992, 20746-20751 und Proc . Natl . Acad. Sei. USA, 90, 1993, 247-251) . Dieses Motif konnte auch in den bereits bekannten DNA- Sequenzen der Nitrilasegene aus den Stämmen Rhodococcus rhodochrous Jl (GenBank Acc. # D11425) und R . rhodochrous K22 (GenBank
30 Acc. # D12583) gefunden werden.
1.3.1 Transfer von DNA und Hybridisierung
Auf 5 Agarplatten mit insgesamt 2500 Plaques , die wie für die 35 Titerbestimmung in 1.2.3 beschrieben hergestellt wurden, wurden Nylon-Rundmembranen für 1 min aufgelegt . Die Membranen wurden 2 x 5 min mit der Plaque-Seite nach oben auf Filterpapier mit Denaturierungslösung (1,5 M NaCl, 0,5 M NaOH) und dann 2 x 5 min auf Filterpapier mit Neutralisierungslösung (0,5 M Tris/HCl, 40 1,5 M NaCl, pH 7,5) gelegt. Anschließend wurden sie kurz in 50 M NaCl gewaschen, getrocknet und die DNA über 30 min bei 120°C fixiert .
Zur Hybridisierung wurden die Membranen mit 50 ml Hybridisie- rungspuffer für 2 h bei 37°C präinkubiert und dann über Nacht in 45 12 ml Hybridisierungspuffer bei 37°C mit 10 pmol 32P-markiertem Oligo-Nukleotid hybridisiert. Das Oligo-Nukleotid wurde in einem 30 μl-Ansatz mit 80 μCi (γ-32P)-ATP durch 10 U T4-Polynukleotid- kinase markiert und über eine Tropfsäulen-Gelfiltration mit Sephadex G-25 von überschüssigem (γ-32P)-ATP getrennt.
Nach der Hybridisierung wurden die Nylonmembranen 1 5 min bei Raumtemperatur mit 0,5 g/1 NaCl, 8,8 g/1 Na-Citrat (2 x SSC), 0,1 % SDS und 2 x 15 min bei 32°C mit 0,125 g/1 NaCl, 2,2 g/1 Na-Citrat (0,5 x SSC), 0,1 % SDS gewaschen und für 5 Tage in einer Filmkassette mit Verstärkerfolie mit einem Röntgenfilm exponiert .
1.3.2 Identifizierung und Sequenzierung des nitA-Gens
Es wurden insgesamt 3 positive Klone identifiziert, von denen zwei ein unvollständiges nitA-Genfragment und einer das voll- ständige nitA-Gen trug. Die positiven Plaques wurden ausgestochen, 2 h bei Raumtemperatur in je 0,5 ml SM-Puffer inkubiert und nach Zugabe von 2 Tropfen Chloroform bei 4°C gelagert. Das nach Umwandlung des rekombinanten λ±RESIIIPhagen mit dem vollständigen nitA-Gen resultierende Plasmid (siehe 1.2.3) wurde mit pDHE 6 bezeichnet (Fig. 1 gibt pDHE 6 mit 12 kb genomischen
Genbankfragment von Rhodococcus rhodochrous NCIMB 11216 wieder) und die Umgebung des nitA-Gens mit Hilfe von Southern-Hybridi- sierungen mit der Oligo-Nukleotid-Sonde "nitllower" restriktions- kartiert. Ein 1,5 kb Pvul-Fragment mit dem gesamten nitA-Gen wurde mit Klenow-Fragment behandelt und in EcoRV behandelten pBluescriptSK+ subkloniert (pDHE 7 mit dem 1,5 kb Pvul-Fragment aus dem genomischen 12 kb Genbankfragment von Rhodococcus rhodochrous NCIMB 11216 in pDHE 6, Fig. 2) . Nach weiterer Subklonierung der überlappenden pDHE 7-Fragmente Hindlll (Vektor) /EcoRI, Kpnl /Xhol , EcoRV/BamHI und Apal /EcόRI (Vektor) in jeweils entsprechend verdauten pBluescriptSK+ wurde das Pvul-Fragment nach der Methode von Sanger et al . (Proc. Natl . Acad. Sei. USA 74, 1977, 5463-5467) mit Hilfe eines automatischen Sequenziergerätes doppelsträngig sequenziert. Die Sequenzierreaktion wurde mit einem kommerziell erhältlichen Sequenzierkit mit den ebenfalls kommerziell erhältlichen "universal"- und "reverse"-Primern (Vieira & Messing, Gene, 19, 1982: 259 - 268) durchgeführt. Die für das 1,5 kb Pvul-Fragment ermittelte DNA-Sequenz ist in SEQ ID NO: 1 wiedergegeben. Die abgeleitete Aminosäuresequenz ist SEQ ID NO: 2 zu entnehmen. 2 Heterologe Expression des nitA-Gens aus R . rhodochrous NCIMB 11216 in E. coli und Reinigung des rekombinanten Nitrilase-Proteins
5 Zur Klonierung in einen Expressionsvektor wurde das nitA-Gen aus R . rhodochrous NCIMB 11216 vom Translations-Start- bis zum Translations-Stop-Codon amplifiziert . Hierzu wurden die Primer "nit Ndel " (upper) mit der Sequenz:
10 5 ' -TATATATCATATGGTCGAATACACAAACA-3 '
und
"nit HindiII" (lower) mit der Sequenz:
15
5 ' -TAATTAAGCTTCAGAGGGTGGCTGTCGC-3 '
verwendet, in denen an das 5'-nitA-Ende eine mit dem Translationsstart überlappende Wdel-Schnittstelle und an das 3'-nitA-
20 Ende eine mit dem Stopcodon überlappende Hindlll-Schnittstelle angefügt ist. Mit diesem Primerpaar wurde das nitA-Gen aus pDHE 7 mit der Pwo-Polymerase in 40 μl Reaktionsvolumen mit je 8 pmol Primer, 100 pg pDHE 7-Template und 2,5 Units Pwo in 10 mM Tris- HC1, pH 8.85, 25 M KC1, 5 mM (NH4)S04, 2 mM MgS0 , 0,2 mM dATP,
25 0,2 mM dTTP, 0 , 2 mM dGTP und 0 , 2 mM dCTP unter den folgenden Bedingungen amplifiziert :
Denaturierung für 3' bei 94°C;
30 25 Zyklen mit Denaturierung für l'bei 93°C, Primeranlagerung für 1' 30'' bei 48°C und Polymerisation für 1' 30'' bei 72°;
Abschluß-Polymerisation für 5' bei 72°C.
35 Das erhaltene ni -PCR-Fragment wurde gereinigt, mit Ndel/HindiII verdaut, in analog verdaute Vektormoleküle pJOE 2702 (Volff et al., Mol. Microbiol . , 21, 1996: 1037 - 1047) integriert und das resultierende Plasmid mit pDHE 17 (Fig. 2: pDHE 17 mit nitA in dem L-Rhamnose-induzierbaren Expressionsvektor pJOE 2702)
40 bezeichnet. Durch die Integration über Ndel/Hindlll steht das nitA-Gen in dem Plasmid pDHE 17 unter Transskriptionskontrolle des in pJOE 2702 enthaltenen Promotors rhap, der aus dem L-Rhamnose-Operon rhaBAD in E. coli (Egan & Schleif, Mol. Biol . 243, 1994: 821 - 829) stammt. Die Transkriptions-Termination 5 des nitA-Gens und die Translations-Initiation der Transkripte erfolgen ebenfalls über Vektorsequenzen (Volff et al . , 1996) . Nach Transformation von pDHE 17 in E. coli JM 109 ist das nitA-Gen aus R. rhodochrous NCIMB 11216 durch Zugabe von L-Rhamnose induzierbar .
Zur Reinigung des rekombinanten Nitrilase-Proteins über Imidazol- Affinitätschromatographie wurde das nitA-Gen außerdem mit einer 3 ' -Sequenz für ein C-terminales His6~Motiv fusioniert, indem für die Amplifikation des nitA-Gens, die unter den oben genannten Bedingungen erfolgte, neben dem 5 ' -Primer "nitiVdel" (upper) ein modifizierter 3 ' -Primer ohne Stop-Codon mit der Sequenz 5 ' -CGAGGGTGGCTGTCGCCCG-3 ' verwendet wurde und das erhaltene
PCR-Fragment in einen modifizierten pJOE 2702-Vektor integriert wurde, der hinter der BamHI-Schnittstelle die Sequenz [CATJδTGA enthielt. Nach BamHI-Verdau, Klenow-Behandlung und IVdel-Verdau des Vektors wurde das iVdel-nachgeschnittene ni A-Pwo-Amplifikat so durch Ligation am 3 ' -Ende durch "blunt ends" im Leserahmen mit der His6-Motiv-Sequenz fusioniert und das erhaltene Plasmid mit pDHE 18 bezeichnet.
Zur heterologen Expression im Labormaßstab wurde JM 109 (pDHE 17) aus einer 37°C Übernachtkultur 1:200 in 50 ml dYT-Vollmedium (Sambrook et al . , 1989) mit 0,2 % L-Rhamnose angeimpft und die Kultur für 8 h bei 30°C im Schüttelwasserbad unter Induktion kultiviert. Anschließend wurden die Zellen einmal in 50 mM Tris/ HCl, pH 7,5 gewaschen, entsprechend einer ODgoo von 10 in dem- selben Puffer resuspendiert und durch Ultraschall-Behandlung aufgeschlossen. Mit JM 109 (pDHE 18) wurde in analoger Weise verfahren. Das Proteinmuster der durch Ultraschallbehandlung erhaltenen, über Zentrifugation geklärten Rohextrakte im Vergleich zur nicht-induzierten Kontrolle wurde durch SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese ermittelt; nach den genannten Induktionsbedingungen betrug der Nitrilase-Anteil am Gesamtprotein für JM 109 (pDHE 17) und JM 109 (pDHE 18) je etwa 30 %.
Zur Reinigung der Nitrilase mit Hisg-Motiv aus JM 109 (pDHE 18) wurden die Zellen in 50 mM Tris/HCl, pH 7 , 5 gewaschen, entsprechend etwa 50 ODgoo l resuspendiert und Extrakte mit einer French-Press (2 x bei 20000 psi) hergestellt. Nach Klärung der Extrakte durch Zentrifugation für 30 min bei 15000 g erfolgte die Reinigung über QIAexpress-Ni2+-NTA (QIAGEN) . Pro ml Rohextrakt wurde 1 ml Matrix verwendet, die mit 20 mM Tris/HCl, pH 7 , 5 äquilibriert wurde. Nach dem Beladen der Säule wurde mit 5 Säulenvolumina 20 mM Tris/HCl, 300 M NaCl, 40 mM Imidazol, pH 7,0 gewaschen und mit 20 mM Tris/HCl, 300 mM NaCl, 300 mM Imidazol, pH 7 , 5 eluiert. Die gelelektrophoretische Reinheit des so gewonnenen Nitrilaseproteins war > 90 %. Nach zweimaliger Dialyse gegen 50 mM Tris/HCl, 0 , 1 mM DTT, 0,5 M (NH4)2S04, pH 7 , 5 konnte die gereinigte Nitrilase bei -20°C gelagert werden.
Für die Rohextrakte wurden für den Umsatz von 2-Benzonitril zu Benzoesäure jeweils um 2 U/mg und für die über QIAexpress-Ni2+-NTA gereinigte Nitrilase mit His6-Motiv bei einer Enzymkonzentration von 50 μg/ml um 11 U/mg ermittelt. 1 Unit entspricht dabei der Produktion von 1 μmol Benzoesäure bei einer anfänglichen Benzo- nitrilkonzentration von 10 mM, 30°C und pH 7,5. Die Umsätze von 2-Benzonitril zu Benzoesäure durch den Nitrilase-Rohextrakt erfolgten in 50 mM Tris/HCl, pH 7,5, die Umsätze mit gereinigter Nitrilase in 50 mM Tris/HCl, pH 7 , 5 , 0 , 1 mM DTT. Die Benzoesäure- Bildung wurde mittels HPLC (Säule RP18, 250 x 4, Laufmittel 47 % Methanol, 0,3 % H3P04,) bestimmt.
Analog dem oben beschriebenen Beispiel wurden eine Reihe von Nitrilen umgesetzt und die erzielten Umsätze bestimmt.
Mit den E. coli-Stämmen JM 109 (pDHE 17 bzw. pDHE 18) wurden verschiedene Nitrile umgesetzt. Die Zellen wurden dazu in 250 ml LB/Amp-Medium + 2 g/1 Rhamnose bei 30°C und 200 upm für 9 Stunden (= h) angezogen. Die Zellernte erfolgt durch Zentrigfugation (20 min, 4°C, 5000 rpm) . Die Zellen wurden anschließend in 10 mM Phosphatpuffer, pH 7,2 resuspendiert, so daß die Konzentration an Biotrockenmasse (BTM) bei 2 g BTM/1 lag. Je 150 μl der Zellsuspension wurden pro well in eine Mikrotiterplatte pipettiert. Die Platte wurde anschließend zentrifugiert. Der Überstand wurde abgesaugt und die Zellpellets zweimal mit Na2HP04 (1,42 g/1 in Finnaqua, pH 7,2) gewaschen. Nach erneutem Zentrifugations- schritt, werden die Zellpellets in der jeweiligen Substratlösung (150 μl) resuspendiert. Je eine 12-er Reihe der Mikrotiterplatte wurde mit einem Substrat versetzt. Als Kontrolle wurde eine Reihe mit der Substratlösung ohne Zellen genommen (Leerwert-Blank) . Die Mikrotiterplatten wurden bei 30°C und 200 rpm für 1 h im Schüttel- inkubator inkubiert. Danach wurden die Zellen abzentrifugiert und im Überstand die entstandene Menge an NH4-Ionen mit Hilfe des Biomek-Geräts bestimmt Die Messung erfolgte bei 620 nm gegen eine Eichkurve, die mit verschiedenen NH4OH-Lösungen erstellt worden war. Als Substrate wurden in Experiment 1 (siehe Figur 3, Tabelle 1) folgende Substrate eingesetzt: Benzonitril (=1), 3-Hydroxypropionitril (=2), 2-Methylglutaronitril (=3), 4-Chlor-3-hydroxybutyronitril (=4), Malonodinitril (=5), Crotono- nitril (=6), Geranonitril (=7), Octandisäuredinitril (=8), Pivalonitril (=9), Aminocapronitril (=10), 3 , 4-Dihydroxybenzo- nitril (=11), 3 , 5-Dibrom-4-hydroxybenzonitril ( =12), 3-Cyan- pyridin (=13), 4-Brombenzylcyanid (=14), 4-Chlorbenzylcyanid (=15), 2-Phenylbutyronitril (=16), 2-Chlorbenzylcyanid (=17), 2-Pyridylacetonitril (=18) , 4-Fluorbenzylcyanid (=19) , 4-Methyl- benzonitril (=20) , Benzylcyanid (=21) . In Experimet 2 (siehe Figur 4, Tabelle 2) , das analog zu Experimet 1 durchgeführt wurde, wurden folgende Substrate verwendet: 2-Phenylpropionitril (=1), Mandelonitril (=2), 2-Amino-2-phenylacetonitril (=3), 2-Hydroxypropionitril (=4), 3 , 3-Dimethoxypropionitril (=5), 3-Cyanthiophen (=6), 3-Cyanmethylthiophen (=7), Benzonitril (=8), Propionitril (=9) , trans-Zimtsäurenitril (=10) , 2-Hydroxy-4- phenylbutyronitril (=11), 3-Phenylglutarsäuredinitril (=12), Fumaronitril (=13), Glutaronitril (=14) Valeronitril (=15).
Tabelle 1
Figure imgf000028_0001
Tabelle 2
Figure imgf000029_0001

Claims

Patentansprüche
1. Isolierte Nukleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid mit Nitrilaseaktivität codiert, ausgewählt aus der Gruppe:
a) einer Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Sequenz,
b) Nukleinsauresequenzen, die sich als Ergebnis des degenerierten genetischen Codes von der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Nukleinsäuresequenz ableiten,
c) Derivate der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Nukleinsäure- sequenz, die für Polypeptide mit der in SEQ ID NO: 2 dargestellten Aminosäuresequenzen codieren und mindestens 95 % Homologie auf Aminosäureebene aufweisen, ohne daß die enzymatische Wirkung der Polypeptide wesentlich reduziert ist.
2. Aminosäuresequenz codiert durch eine Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1.
3. Aminosäuresequenz nach Anspruch 2, codiert durch die in SEQ ID NO: 1 dargestellte Sequenz.
4. Nukleinsäurekonstrukt enthaltend eine Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1, wobei die Nukleinsäuresequenz mit einem oder mehreren Regulationssignalen verknüpft ist.
5. Vector enthaltend eine Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1 oder ein Nukleinsäurekonstrukt gemäß Anspruch 4.
6. Rekombinanten Mikroorganismus enthaltend eine Nukleinsäure- sequenz gemäß Anspruch 1, ein Nukleinsäurekonstrukt gemäß
Anspruch 4 oder einen Vector gemäß Anspruch 5.
7. Rekombinanten Mikroorganismus nach Anspruch 6, wobei es sich bei dem Mikroorganismus um ein Bakterium der Gattungen Escherichia, Rhodococcus, Nocardia, Streptomyces oder Mycobacterium handelt.
8. Verfahren zur Herstellung von chiralen oder achiralen Carbonsäuren, dadurch gekennzeichnet, daß man Nitrile in Gegenwart einer Aminosäuresequenz gemäß Anspruch 2 oder 3 oder einem wachsenden, ruhenden oder aufgeschlossenen Mikroorganismus gemäß Anspruch 6 oder 7 zu den chiralen oder achiralen Carbonsäuren umsetzt.
9. Verfahren zur Herstellung von chiralen oder achiralen Carbonsäuren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man Nitrile der allgemeinen Formel I
Figure imgf000031_0001
in Gegenwart einer Aminosäuresequenz gemäß Anspruch 2 oder 3 oder einem wachsenden, ruhenden oder aufgeschlossenen Mikroorganismus gemäß Anspruch 6 oder 7 zu Carbonsäuren der allgemeinen Formel II
Figure imgf000031_0002
umsetzt,
wobei die Substituenten und Variablen in den Formeln I und II folgende Bedeutung haben:
n = 0 oder 1
m = 0, 1, 2 oder 3, wobei bei m > 2 zwischen zwei benach- barten Kohlenstoffatomen eine oder keine Doppelbindung vorhanden ist,
p = 0 oder 1
A, B, D und E unabhängig voneinander CH, N oder CR3
H = 0, S, NR4, CH oder CR3 , wenn n = 0, oder CH, N oder CR3 , wenn n = 1 , wobei zwei benachbarte Variablen A, B, D, E oder H zusammen einen weiteren substituierten oder unsubstituierten aromatischen, gesättigten oder teilweise gesättigten Ring mit 5 bis 8 Atomen im Ring bilden können, der ein oder mehrere Hetero- atome wie 0, N oder S enthalten kann und wobei nicht mehr als drei der Variablen A, B, D, E oder H ein Heteroatom sind,
R1 Wasserstoff, substituiertes oder unsubstituiertes, 5 verzweigtes oder unverzweigtes Cι-Cιo-Alkyl- oder
Cι-Cιo-Alkoxy- , substituiertes oder unsubstituiertes Aryl- oder Hetaryl-, Hydroxy-, Halogen-, Cι-C10-Alkyl- amino- oder Amino- ,
10 R2 Wasserstoff, substituiertes oder unsubstituiertes, verzweigtes oder unverzweigtes Cι-Cιo-Alkyl- oder Cι-Cιrj-Alkoxy- , substituiertes oder unsubstituiertes Aryl- oder Hetaryl-, Hydroxy-, Cι-Cιo-Alkylamino- oder Amino- ,
15
R3 Wasserstoff, substituiertes oder unsubstituiertes, verzweigtes oder unverzweigtes Cχ-Cιo-Alkyl-, oder Cι-Cιo-Alkoxy-, substituiertes oder unsubstituiertes Aryl-, Hetaryl-, Hydroxy-, Halogen-, Cι-Cιo_Alkylamino-
20 oder Amino-,
R4 Wasserstoff, substituiertes oder unsubstituiertes, verzweigtes oder unverzweigtes Ci-Cirj-Alkyl-.
25 10. Verfahren nach den Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren in wäßriger Reaktionslösung bei einem pH zwischen 4 bis 11 durchgeführt wird.
11. Verfahren nach den Ansprüchen 8 bis 10, dadurch gekenn-
30 zeichnet, daß im Verfahren 0,01 bis 10 Gew-% Nitril umgesetzt werden .
12. Verfahren nach den Ansprüchen 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren bei einer Temperatur zwischen
35 0°C bis 80°C durchgeführt wird.
13. Verfahren nach den Ansprüchen 8 bis 12 , dadurch gekennzeichnet, daß die achirale oder chirale Carbonsäure über Extraktion oder Kristallisation oder Extraktion und 40 Kristallisation in Ausbeuten von 60 bis 100 % aus der Reaktionslösung gewonnen wird.
45
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