WO2001062910A1 - Oligonucleotides immunostimulants - Google Patents

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WO2001062910A1
WO2001062910A1 PCT/FR2001/000350 FR0100350W WO0162910A1 WO 2001062910 A1 WO2001062910 A1 WO 2001062910A1 FR 0100350 W FR0100350 W FR 0100350W WO 0162910 A1 WO0162910 A1 WO 0162910A1
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WO
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oligonucleotide
cells
oligonucleotide according
lymphocytes
human
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Application number
PCT/FR2001/000350
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English (en)
Inventor
Monique Bachy
Régis SODOYER
Emanuelle Trannoy
Original Assignee
Aventis Pasteur
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Publication date
Application filed by Aventis Pasteur filed Critical Aventis Pasteur
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/117—Nucleic acids having immunomodulatory properties, e.g. containing CpG-motifs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55561—CpG containing adjuvants; Oligonucleotide containing adjuvants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/18—Type of nucleic acid acting by a non-sequence specific mechanism

Definitions

  • the present invention relates to the field of immunostimulants. More particularly, the invention relates to oligonucleotides capable of stimulating human cells intervening in the immune system, and to their use as a vaccine adjuvant.
  • application EP 0 468 520 describes immunostimulatory polynucleotides constituted by a single strand of linear DNA comprising from 10 to 100 nucleotides linked together according to a palindromic sequence.
  • the immunostimulatory activity of oligonucleotides is linked to the presence of a dinucleotic sequence 5 'CG 3', in which C is not methylated, the immunostimulatory activity being stronger if the motif CG is preceded in 5 'by the dinucleotide GA and / or followed in 3' by the dinucleotide TC or also TT.
  • the sequence of the oligonucleotide is a palindrome, nor that it comprises the dinucleotide CG; in fact, the 3 nucleotides described in this application for use as a vaccine adjuvant have the following sequences: 5 'GACGTT 3', 5 'GAGCTT 3', as well as 5 * TCCGGA 3 '.
  • the immunostimulatory activity of oligonucleotides is not linked to the nucleotide sequence, but to the nature of the bond between nucleotides, the presence of at least one phosphorothioate bond making it possible to induce a local response. of the immune system.
  • the present invention therefore aims to provide oligonucleotides capable of stimulating cells of the human immune system.
  • the invention relates to an oligonucleotide capable of stimulating human cells of the immune system characterized in that it comprises at least one 5 ′ sequence GCATGA l II i GAGCT 3 ′ in which T is Thymine, A is Adenine, C is Cytosine, and G is Guanine, and in that it is devoid of CG dinucleotide in which Cytosine C would not be methylated.
  • the oligonucleotide comprises from 15 to 100 nucleotides.
  • the oligonucleotide according to the invention is capable of inducing the proliferation of human lymphocytes.
  • the oligonucleotide according to the invention is capable of increasing the expression of the activation markers CD25, CD69 and CD86 on human B lymphocytes.
  • the invention also relates to the use of such an oligonucleotide for the manufacture of a medicament.
  • the subject of the invention is also a vaccine adjuvant, characterized in that it comprises at least one oligonucleotide capable of stimulating human cells of the immune system having at least one sequence 5 'GCATGATTTTGAGCT 3' in which T is Thymine, A is Adenine, C is Cytosine, and G is Guanine, and in that it is devoid of CG dinucleotide in which Cytosine C is not methylated.
  • the subject of the invention is also a vaccine composition for human use comprising at least one vaccine antigen characterized in that it also comprises at least one oligonucleotide capable of stimulating human cells of the immune system having at least one 5 ′ sequence GCATGATTTTGAGCT 3 'in which T is Thymine, A is Adenine, C is Cytosine, and G is Guanine, and in that it is devoid of CG dinucleotide in which Cytosine C is not methylated.
  • FIGS. 1 and 2 illustrate the results obtained during the tests described in examples 1 and 2.
  • oligonucleotide within the meaning of the present invention means a polynucleotide comprising at least 15 nucleotides.
  • the upper limit of the size of the oligonucleotides is not really determined. It may however be noted that the longer the oligonucleotide, the more difficult it will be to purify it during the synthesis steps, and the higher the cost price. On the other hand, it is likely that a very long oligonucleotide will have more difficulty entering cells. Also, for the purposes of the present invention, it is considered that limiting the size of the oligonucleotide to 100 nucleotides is appropriate.
  • This oligonucleotide is preferably a single stranded oligonucleotide; it can be an oligodeoxy ⁇ bonucleotide or an oligoribonucleotide. Particularly good results have been obtained using an oligodeoxyribonucleotide.
  • the oligonucleotides suitable for the purposes of the invention may be in the form of phosphodiester or, in order to be more stable, in the form of phosphorothioates or of phosphodiester / phosphorothioate hybrids.
  • the phosphorothioate oligonucleotides are those preferred.
  • the oligonucleotide according to the invention is capable of stimulating human cells of the immune system, such as B lymphocytes, T lymphocytes, monocytes and dendritic cells. This stimulation is appreciated in particular by lymphoproliferation or by the expression of activation markers, such as CD25, CD69 and CD86 markers on B lymphocytes. It is possible to select the oligonucleotides of interest by means of tests different from those proposed in the present application, provided however that these are tests evaluating the stimulation capacity of human cells, and not as in most documents of the prior art, tests evaluating the stimulation capacity of murine cells.
  • the oligonucleotide comprises at least one nucleotide sequence 5 'GCATGATTTTGAGCT 3' in which T signifies
  • Thymine C Cytosine, G Guanine, and A Adenine.
  • This sequence can be 5 'terminal, 3' terminal or be surrounded by other nucleotides. It can be unique or repeated several times identically within the same oligonucleotide
  • the oligonucleotide does not necessarily contain a palindromic sequence. Despite this absence of palindromic sequence, such an oligonucleotide is capable of stimulating human cells of the immune system.
  • the oligonucleotide according to the invention is devoid of CG dinucleotide in which the Cytosine is not methylated.
  • the capacity of the oligonucleotides of the prior art to be immunostimulants has almost always been interpreted as linked to the presence of unmethylated CpG motifs (cf. in particular the article by Krieg et al in Nature of April 1995 cited above), this interpretation being consistent with the observation that the frequency of this dinucleotide was about 4 times larger in the genome of bacteria than in that of vertebrates.
  • oligonucleotides entirely devoid of this dinucleotide motif are however perfectly capable of stimulating cells of the human immune system.
  • the oligonucleotide according to the invention is devoid or depleted in nucleotide sequence capable of inhibiting cells of the human immune system.
  • inhibiting or neutralizing motifs such as, for example, those described in application WO 98/52 581 are present, their effect must be suppressed or reduced, thanks to the presence of a sequence with a more pronounced immunostimulatory effect, or thanks to the presence of a greater number of sequences according to the invention.
  • the present invention also relates to a vaccine adjuvant comprising at least one immunostimulatory oligonucleotide having at least one motif
  • vaccine adjuvant is meant a product which makes it possible to increase or modify the response of the immune system of an organism with regard to the administration of an antigen. In particular, it may be an increase in the humoral response or the cellular response.
  • the action of a vaccine adjuvant can also be, not an increase in the response which would occur in the absence of an adjuvant, but a different orientation from the response produced: for example, orientation towards a cellular response rather than humoral response, production of certain cytokines rather than others, production of certain types or subtypes of antibodies rather than others, stimulation of certain cells rather than others, etc.
  • the immunostimulatory oligonucleotide of the present invention can be used as a vaccine adjuvant regardless of the nature of the antigen administered and regardless of the number of valences used. It can be the only adjuvant used or, on the contrary, be an element of an adjuvant combination.
  • the adjuvant action of the oligonucleotide according to the invention can be obtained, either when it is combined with the antigen or antigens during their administration, ie when they form part of the same vaccine composition, either when administered separately from the antigen or antigens. However, it is preferred to use it in the same vaccine composition as the antigen or antigens to be administered.
  • oligonucleotide according to the invention can advantageously be administered by any route capable of being used for a vaccine composition: mucosal route or systemic route.
  • One of the objects of the invention is a vaccine composition
  • a vaccine composition comprising at least one immunostimulatory oligonucleotide having a sequence 5 ′ GCATGATTTTGAGCT 3 ′ as described above.
  • a vaccine composition according to the invention can be intended for immunization against a single disease, or intended for immunization against several diseases. It can be a liquid or lyophilized vaccine composition. It can comprise, in addition to the antigens, all or part of the components usually present in a vaccine: buffers, stabilizers, preservatives, etc. It can also comprise one or more adjuvant (s) other than those which are the subject of the present invention .
  • adjuvants which are the subject of the present invention, constituted either by oligonucleotides all having the same 5 'motif GCATGATTTTGAGCT 3' but differentiating by nucleotides in 5 'and / or 3', or by oligonucleotides having motifs 5 'GCATGATTTTGAGCT 3' different, whose sequences in 5 'and 3' are identical or different.
  • the vaccine composition according to the invention may be intended for prophylactic administration or for therapeutic administration.
  • the vaccine composition according to the invention can be formulated so as to optimize the adjuvant action of the oligonucleotide which is the subject of the invention.
  • the oligonucleotide can be coupled to a lipid, such as cholesterol; it can be integrated into an oil / water type emulsion or formulated in the form of liposomes.
  • lipid such as cholesterol
  • oligonucleotide is prepared, the sequence of which is as follows:
  • an A15 (S) oligonucleotide which comprises only A and which is phosphorothioate over its entire length is likewise prepared.
  • This oligonucleotide is a negative control because it does not cause proliferation or increase in the expression of activation markers on B lymphocytes.
  • oligonucleotide 1d (S) is also prepared, the sequence of which is identified in patent application WO96 / 02555 and is as follows: ⁇ GCATGACGTTGAGCT 3 * ; this oligonucleotide has phosphorothioate bonds over its entire length and is used as a positive control.
  • Lymphocytes are isolated from the peripheral blood of a donor, by centrifugation on a Ficoll gradient. These lymphocytes are adjusted to 4.10 6 cells / ml in AIMV culture medium supplemented with Glutamine, Streptomycin and Penicillin. The cells are distributed in 96-well plates (round bottom) under 100 ⁇ l, or 2.10 5 cells per well.
  • oligonucleotides to be tested produced in Example 1 100 ⁇ l of a 4 ⁇ M solution (or of an O. ⁇ M solution, or also of a 0.16 ⁇ M solution) of the oligonucleotides to be tested produced in Example 1 are then added (1 single type of oligonucleotide per well) in order to d '' obtain a final concentration of either 2 ⁇ M, or 0.4 ⁇ M, or O.O ⁇ M.
  • tritiated thymidine (Amersham TRK 120) is added previously diluted in culture medium, at a rate of 1 ⁇ Ci per well under 50 ⁇ l. .
  • the plates can be frozen at -80 ° C and processed later.
  • FIG. 1 The results obtained for each of the oligonucleotides tested are represented in FIG. 1, which indicates, for each oligonucleotide tested the stimulation index IS.
  • This IS index is calculated as follows:
  • the test is carried out using lymphocytes isolated from a donor as described in the previous example, and adjusted to 2.10 6 cells / ml in the same culture medium.
  • lymphocytes are then incubated in 14 ml polypropylene tubes at a rate of 2 ml / tube.
  • a quantity of oligonucleotides to be tested prepared in Example 1 (1 oligonucleotide / tube) sufficient to obtain a concentration of oligonucleotide 2 ⁇ M is added to each well.
  • the cells are divided into 3 micronic tubes at the rate of 10 6 cells per tube.
  • the cells are resuspended in 100 ⁇ l of IF buffer (ImmunoFluorescence) composed of PBS 0.1% BSA 0.01% Sodium azide.
  • IF buffer ImmunoFluorescence
  • the cells are then labeled by adding 5 ⁇ l of each of the following fluorescent antibodies: tube 1: CD20 PE / CD69 FITC tube 2: CD20 PE / CD25 FITC tube 3: CD20 PE / CD86 FITC CD20 is a marker for B lymphocytes .
  • CD69 is a marker for early activation of B and T lymphocytes.
  • CD25 is an Interleukin 2 receptor.
  • CD86 is a B7-2 costimulation molecule.
  • the cells After an hour of incubation at 4 ° C; the cells are washed and resuspended in IF buffer supplemented with 0.5% formalin. The cells are analyzed on a cytofluorimeter (FACScan) in double labeling, with a window of study on 5000 CD20 + cells (B lymphocytes).
  • FACScan cytofluorimeter
  • FIG. 2 indicates, for each oligonucleotide tested, the% age of B lymphocytes expressing one of the markers tested. It is found that the oligonucleotide according to the invention not containing a CG motif is capable of inducing an increase in the expression of certain activation markers (CD25, CD69, CD86) identical to that measured for B lymphocytes. the oligonucleotide of the prior art comprising such a CG dinucleotide. Indeed, the percentage of B lymphocytes expressing such markers is of the same order in the 2 cases. In contrast, the 15 A sequence has a significantly lower percentage of activated B cells.

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Abstract

L'invention concerne un oligonucléotide capable de stimuler des cellules humaines du système immunitaire, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une séquence nucléotidique ayant la formule suivant 5' GCATGATTTTGAGCT3', dans laquelle T signifie Thymine, A Adénine, C Cytosine, et G Guanine, et en ce qu'il est dépourvu de dinucléotide CG dans lequel la Cytosine C n'est pas méthylée. Un tel oligonucléotide trouve une application particulièrement intéressante comme adjuvant vaccinal.

Description

OLIGONUCLEOTIDES IMMUNOSTIMULANTS
La présente invention est relative au domaine des immunostimulants. Plus particulièrement, l'invention concerne des oligonucléotides capables de stimuler des cellules humaines intervenant dans le système immunitaire, et à leur utilisation comme adjuvant vaccinal.
Un grand nombre d'oligonucléotides ont déjà été décrits dans l'art antérieur, en relation avec leurs propriétés immunostimulantes. Ainsi, la demande EP 0 468 520 décrit des polynucleotides immunostimulants constitués par un simple brin d'ADN linéaire comprenant de 10 à 100 nucléotides s'enchaînant selon une séquence palindromique.
Selon la demande WO 96/02 555, l'activité immunostimulatrice d'oligonucléotides est liée à la présence d'une séquence dinucléotique 5' CG 3', dans laquelle C n'est pas méthylée, l'activité immunostimulante étant plus forte si le motif CG est précédé en 5' du dinucleotide GA et / ou suivi en 3' du dinucleotide TC ou encore TT.
Au contraire, selon la demande de brevet WO 98/52 962, il n'est pas nécessaire que la séquence de l'oligonucleotide soit un palindrome, ni qu'elle comprenne le dinucleotide CG ; en effet, les 3 nucléotides décrits dans cette demande pour une utilisation en tant qu'adjuvant vaccinal ont les séquences suivantes : 5' GACGTT 3', 5' GAGCTT 3', ainsi que 5* TCCGGA 3'.
Selon le brevet US 5,663,153, l'activité immunostimulante d'oligonucléotides n'est pas liée à la séquence des nucléotides, mais à la nature de la liaison entre nucléotides, la présence d'au moins une liaison phosphorothioate permettant d'induire une réponse locale du système immunitaire.
La plupart des tests de l'art antérieur pour évaluer l'activité immunostimulante des oligonucléotides proposés, sont effectués soit in vitro sur des cellules animales (essentiellement des cellules murines), soit in vivo sur des souris. Cependant, les différences existant entre le système immunitaire de la souris et celui de l'être humain, ont conduit à des différences entre les résultats obtenus sur des cellules murines et ceux obtenus sur des cellules humaines.
Or l'industrie pharmaceutique a un grand besoin d'immunostimulants pouvant être administrés à l'homme, notamment dans le domaine des vaccins.
La présente invention a donc pour but de proposer des oligonucléotides capables de stimuler des cellules du système immunitaire de l'être humain.
Pour atteindre ce but, l'invention a pour objet un oligonucleotide capable de stimuler des cellules humaines du système immunitaire caractérisé en ce qu'il comprend au moins une séquence 5' GCATGA l I I i GAGCT 3' dans laquelle T est la Thymine, A est l'Adénine, C est la Cytosine, et G la Guanine, et en ce qu'il est dépourvu de dinucleotide CG dans lequel la Cytosine C ne serait pas méthylée.
Selon une caractéristique de l'invention, l'oligonucleotide comprend de 15 à 100 nucléotides.
Selon une autre caractéristique, l'oligonucleotide selon l'invention est capable d'induire la prolifération des lymphocytes humains.
Selon une autre caractéristique, l'oligonucleotide selon l'invention est capable d'accroître l'expression des marqueurs d'activation CD25, CD69 et CD86 sur les lymphocytes B humains.
L'invention concerne également l'utilisation d'un tel oligonucleotide pour la fabrication d'un médicament.
L'invention a également pour objet un adjuvant vaccinal caractérisé en ce qu'il comprend au moins un oligonucleotide capable de stimuler des cellules humaines du système immunitaire possédant au moins une séquence 5' GCATGATTTTGAGCT 3' dans laquelle T est la Thymine, A est l'Adénine, C est la Cytosine, et G la Guanine, et en ce qu'il est dépourvu de dinucleotide CG dans lequel la Cytosine C ne serait pas méthylée.
L'invention a également pour objet une composition vaccinale à usage humain comprenant au moins un antigène vaccinal caractérisée en ce qu'elle comprend en outre au moins un oligonucleotide capable de stimuler des cellules humaines du système immunitaire possédant au moins une séquence 5' GCATGATTTTGAGCT 3' dans laquelle T est la Thymine, A est l'Adénine, C est la Cytosine, et G la Guanine, et en ce qu'il est dépourvu de dinucleotide CG dans lequel la Cytosine C ne serait pas méthylée .
La présente invention sera mieux comprise à la lecture de la description qui va suivre, en référence aux figures 1 et 2 qui illustrent les résultats obtenus lors des tests décrits aux exemples 1 et 2.
Par oligonucleotide au sens de la présente invention, on entend un polynucléotide comprenant au moins 15 nucléotides. La limite supérieure de la taille des oligonucléotides n'est pas vraiment déterminée. On peut cependant noter que, plus l'oligonucleotide sera long, plus sa purification sera difficile à effectuer lors des étapes de synthèse , et plus le prix de revient en sera élevé. D'autre part, il est probable qu'un oligonucleotide de grande longueur aura plus de difficultés à pénétrer dans les cellules. Aussi, pour les besoins de la présente invention, on considère qu'une limitation de la taille de l'oligonucleotide à 100 nucléotides est appropriée. Cet oligonucleotide est de préférence un oligonucleotide simple brin; il peut s'agir d'un oligodésoxyήbonucléotide ou d'un oligoribonucléotide. On a obtenu de particulièrement bons résultats en utilisant un oligodésoxyribonucléotide. Les oligonucléotides convenant aux fins de l'invention peuvent se présenter sous forme de phosphodiester ou, afin d'être plus stables, sous forme de phosphorothioates ou d'hybrides phosphodiester / phosphorothioates. Les oligonucléotides phosphorothioates sont ceux préférés. L'oligonucléotide selon l'invention est capable de stimuler des cellules humaines du système immunitaire, telles que les lymphocytes B, les lymphocytes T, les monocytes et les cellules dendritiques. Cette stimulation est appréciée notamment par la lymphoprolifération ou par l'expression de marqueurs d'activation, tels que les marqueurs CD25 , CD69 et CD86 sur les lymphocytes B. Il est possible de sélectionner les oligonucléotides d'intérêt au moyen de tests différents de ceux proposés dans la présente demande, à condition cependant qu'il s'agisse de tests évaluant la capacité de stimulation de cellules humaines, et non pas comme dans la plupart des documents de l'art antérieur, de tests évaluant la capacité de la stimulation de cellules murines. Il serait notamment possible de tester l'expression d'autres marqueurs d'activation des lymphocytes, ou l'expression de marqueurs de prolifération tels que le marqueur KI67; des tests relatifs à l'augmentation des marqueurs d'activation et de maturation des cellules dendritiques pourraient également être utilisés. De même, des tests permettant l'appréciation de l'augmentation de production de certaines cytokines peuvent également être utilisés.
Selon une caractéristique de l'invention, l'oligonucleotide comprend au moins une séquence nucléotidique 5' GCATGATTTTGAGCT 3' dans laquelle T signifie
Thymine, C Cytosine, G Guanine, et A Adenine. Cette séquence peut être 5' terminale, 3' terminale ou être entourée par d'autres nucléotides. Elle peut être unique ou répétée plusieurs fois à l'identique à l'intérieur d'un même oligonucleotide
Selon l'invention, l'oligonucleotide ne comporte pas forcément de séquence palindromique. Malgré cette absence de séquence palindromique, un tel oligonucleotide est capable de stimuler des cellules humaines du système immunitaire.
Selon une caractéristique, l'oligonucleotide selon l'invention est dépourvu de dinucleotide CG dans lequel la Cytosine ne serait pas méthylée. La capacité des oligonucléotides de l'art antérieur à être immunostimulants a presque toujours été interprétée comme liée à la présence de motifs CpG non méthylés (Cf. notamment l'article de Krieg et al dans Nature d'avril 1995 cité ci-dessus), cette interprétation étant en cohérence avec l'observation selon laquelle la fréquence de ce dinucleotide était environ 4 fois plus importante dans le génome des bactéries que dans celui des vertébrés. De façon surprenante, on a maintenant trouvé que des oligonucléotides entièrement dépourvus de ce motif dinucléotidique étaient cependant parfaitement capables de stimuler les cellules du système immunitaire humain.
Selon une caractéristique particulière, l'oligonucleotide selon l'invention est dépourvu ou appauvri en séquence nucléotidique capable d'inhiber les cellules du système immunitaire humain. En effet, afin d'obtenir un effet global immunostimulant, si des motifs inhibiteurs ou neutralisants tels que, par exemple, ceux décrits dans la demande WO 98/52 581 sont présents, il faut que leur effet soit supprimé ou réduit, grâce à la présence d'une séquence à effet immunostimulant plus prononcé, ou grâce à la présence d'un plus grand nombre de séquences selon l'invention.
La présente invention a également pour objet un adjuvant vaccinal comprenant au moins un oligonucleotide immunostimulant ayant au moins un motif
5' GCATGATTTTGAGCT 3' tel que mentionné ci-dessus. Par adjuvant vaccinal, on entend un produit qui permet d'accroître ou de modifier la réponse du système immunitaire d'un organisme vis à vis de l'administration d'un antigène. En particulier, il peut s'agir d'une augmentation de la réponse humorale ou de la réponse cellulaire. L'action d'un adjuvant vaccinal peut également être, non pas une augmentation de la réponse qui se produirait en l'absence d'adjuvant, mais une orientation différente de la réponse produite : par exemple, orientation vers une réponse cellulaire plutôt qu'une réponse humorale, production de certaines cytokines plutôt que d'autres, production de certains types ou sous-types d'anticorps plutôt que d'autres, stimulation de certaines cellules plutôt que d'autres, etc..
L'oligonucleotide immunostimulant de la présente invention peut être utilisé comme adjuvant vaccinal quelle que soit la nature de l'antigène administré et quel que soit le nombre de valences utilisées. Il peut être le seul adjuvant utilisé ou, au contraire, être un élément d'une combinaison adjuvante.
L'action adjuvante de l'oligonucleotide selon l'invention peut être obtenue, soit lorsqu'il est associé à l'antigène ou aux antigènes lors de leur administration, i.e. lorsqu'ils font partie de la même composition vaccinale, soit lorsqu'il est administré séparément de l'antigène ou des antigènes. On préfère cependant l'utiliser dans la même composition vaccinale que l'antigène ou les antigènes à administrer.
L'oligonucleotide selon l'invention peut avantageusement être administré par toutes les voies susceptibles d'être utilisées pour une composition vaccinale: voie muqueuse ou voie systémique.
L'un des objets de l'invention est une composition vaccinale comprenant au moins un oligonucleotide immunostimulant ayant une séquence 5' GCATGATTTTGAGCT 3' telle que décrite ci-dessus.
Une composition vaccinale selon l'invention peut être destinée à l'immunisation contre une seule maladie, ou destinée à l'immunisation contre plusieurs maladies. Il peut s'agir d'une composition vaccinale liquide ou lyophilisée. Elle peut comprendre, outre les antigènes, tout ou partie des composants habituellement présents dans un vaccin : tampons, stabilisants, conservateurs, ... Elle peut également comprendre un ou plusieurs adjuvant(s) autre(s) que ceux objets de la présente invention. Elle peut également comprendre plusieurs adjuvants objets de la présente invention, constitués soit par des oligonucléotides ayant tous le même motif 5' GCATGATTTTGAGCT 3' mais se différenciant par les nucléotides en 5' et/ou en 3', soit par des oligonucléotides ayant des motifs 5' GCATGATTTTGAGCT 3' différents, dont les séquences en 5' et en 3' sont identiques ou différentes.
La composition vaccinale selon l'invention peut être destinée à une administration prophylactique ou à une administration thérapeutique.
La composition vaccinale selon l'invention peut être formulée de manière à optimiser l'action adjuvante de l'oligonucleotide objet de l'invention. Ainsi, l'oligonucleotide peut être couplé à un lipide, tel que le cholestérol ; il peut être intégré dans une émulsion de type huile / eau ou formulé sous forme de liposomes. Les exemples qui suivent illustrent des modes de réalisation particuliers de la présente invention.
Exemple 1 :
Synthèse des oligonucléotides
On prépare un oligonucleotide dont la séquence est la suivante:
5' GCATGATTTTGAGCT 3'. La synthèse est réalisée au moyen d'un automate synthétiseur fourni par Applied Biosystems qui met en œuvre la méthode chimique standard au phosphoramidite et qui comporte à chaque cycle une étape d'oxydation, qui est réalisée au moyen d'une solution tétraéthylthiuram / acétonitrile pour obtenir une liaison phosphorothioate.
On prépare en outre, de la même façon, un oligonucleotide A15(S) qui ne comprend que des A et qui est phosphorothioate sur toute sa longueur. Cet oligonucleotide est un témoin négatif car il n'entraîne ni prolifération ni augmentation de l'expression des marqueurs d'activation sur les lymphocytes B.
On prépare également un oligonucleotide 1d(S) dont la séquence est identifiée dans la demande de brevet WO96/02555 et est la suivante:^ GCATGACGTTGAGCT 3*; cet oligonucleotide comporte des liaisons phosphorothioates sur toute sa longueur et est utilisé comme témoin positif.
Tous les oligonucléotides sont maintenus en solution dans du tampon PBS
Exemple 2 :
Test de Lvmphoprolifération
On isole des lymphocytes à partir du sang périphérique d'un donneur, en procédant à une centrifugation sur un gradient de Ficoll. Ces lymphocytes sont ajustés à 4.106 cellules / ml dans du milieu de culture AIMV additionné de Glutamine, de Streptomycine et de Pénicilline. Les cellules sont distribuées en plaques 96 puits (fond rond) sous 100 μl, soit 2.105 cellules par puits. On ajoute ensuite 100μl d'une solution 4μM (ou d'une solution O.δμM, ou encore d'une solution 0.16μM) des oligonucléotides à tester produits à l'exemple 1 (1 seul type d'oligonucléotide par puits) afin d'obtenir une concentration finale soit de 2 μM, soit de 0.4μM,soit de O.OδμM.
Après incubation 3 jours d'incubation à 37°C en atmosphère humide à 5% de C02,on ajoute de la thymidine tritiée (Amersham TRK 120) préalablement diluée dans du milieu de culture , à raison de 1 μCi par puits sous 50 μl. Après 7 à 8 heures d'incubation à l'étuve (5% C02, 37°C), les plaques peuvent être congelées à -80°C et traitées plus tard.
A l'aide du "Harvester", on récolte le contenu des puits sur des plaques Unifilter GF/C et on réalise 6 lavages en eau distillée puis un lavage en éthanol 70% afin de précipiter l'ADN.
Après séchage des plaques, 25 μl de liquide scintillant (Microscint-40, Packard) sont distribués dans chaque puits et permettent de quantifier la radioactivité (rayonnements émis par le tritium) en mesurant le nombre de coups / minute (cpm) émis par chaque puits sur le compteur Top Count (Packard).
Les résultats obtenus pour chacun des oligonucléotides testés sont représentés sur la figure 1 , qui indique, pour chaque oligonucleotide testé l'indice de stimulation IS. Cet indice IS est calculé de la façon suivante:
IS= (CPM de l'oligonucleotide testé - CPM du contrôle milieu)/ CPM contrôle milieu. On remarque que l'oligonucleotide selon l'invention (1dTT) qui ne comprend pas de dinucleotide CG est capable d'induire une prolifération des lymphocytes humains identique à celle mesurée pour l'oligonucleotide de l'art antérieur (1d) comprenant un dinucleotide CG. Par contre, les résultats du contrôle négatif (A15) sont bien négatifs. Exemple 3 :
Test relatif aux marqueurs d'activation
Le test est effectué à partir de lymphocytes isolés d 'un donneur comme décrit à l'exemple précédent, et ajustés à 2.106 cellules/ml dans le même milieu de culture.
Les lymphocytes sont ensuite incubés dans des tubes en polypropylène de 14ml à raison de 2ml/tube. On ajoute dans chaque puits une quantité d'oligonucléotides à tester préparés à l'exemple 1 (1 oligonucleotide / tube) suffisante pour obtenir une concentration en oligonucleotide 2 μM. Après 3 jours d'incubation, les cellules sont réparties en 3 tubes micronic à raison de 106 cellules par tube. Après centrifugation, les cellules sont remises en suspension dans 100μl de tampon IF (ImmunoFluorescence) composé de PBS 0.1 % BSA 0.01 % Azide de sodium. On procède ensuite au marquage des cellules en ajoutant 5 μl de chacun des anticorps fluorescents suivants: tube 1 : CD20 PE/ CD69 FITC tube 2: CD20 PE/ CD25 FITC tube 3: CD20 PE/ CD86 FITC Le CD20 est un marqueur des lymphocytes B.
Le CD69 est un marqueur d'activation précoce des lymphocytes B et T.
Le CD25 est un récepteur de l'Interleukine 2.
Le CD86 est une molécule de costimulation B7-2.
Après VÏ heure d'incubation à 4°C; les cellules sont lavées et remises en suspension en tampon IF additionné de 0.5% de formol. Les cellules sont analysées sur un cytofluorimètre (FACScan) en double marquage, avec une fenêtre d'étude sur 5000 cellules CD20+ (lymphocytes B).
Les résutats obtenus sont illustrés sur la Figure 2 qui indique, pour chaque oligonucleotide testé, le %age de lymphocytes B exprimant l'un des marqueurs testés. On constate que l'oligonucleotide selon l'invention ne contenant pas de motif CG est capable d'induire une augmentation de l'expression de certains marqueurs d'activation ( CD25, CD69, CD86) sur les lymphoctes B identique à celle mesurée pour l'oligonucléotide de l'art antérieur comprenant un tel dinucleotide CG. En effet, le pourcentage de lymphocytes B exprimant de tels marqueurs est du même ordre dans les 2 cas. Par contre, la séquence composée de 15 A a un pourcentage de lymphocytes B activés nettement plus faible.

Claims

Revendications
1. Oligonucleotide immunostimulant , caractérisé en ce qu'il comprend au moins une séquence nucléotidique ayant la formule suivante
5' GCATGATTTTGAGCT 3', dans laquelle T signifie Thymine, A Adenine, C Cytosine , G Guanine, et en ce qu'il est dépourvu de dinucleotide CG dans lequel la Cytosine C ne serait pas méthylée.
2. Oligonucleotide selon la revendication 1 , caractérisé en ce qu'il comprend de 15 à 100 nucléotides.
3. Oligonucleotide selon une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le motif 5' GCATGATTTTGAGCT 3' est répété au moins 1 fois.
4. Oligonucleotide selon une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est capable d'induire la prolifération des lymphocytes B humains.
5. Oligonucleotide selon une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est capable d'accroître l'expression des marqueurs d'activation CD25 , du marqueur CD86, ou du marqueur CD69 sur les lymphocytes B humains.
6. Utilisation d'un oligonucleotide selon une des revendications précédentes pour la fabrication d'un médicament.
7. Utilisation d'un oligonucleotide selon une des revendications 1 à 5, pour la fabrication d'un immunostimulant humain.
8. Utilisation d'un oligonucleotide selon une des revendications 1 à 5, pour la fabrication d'un adjuvant vaccinal.
9. Utilisation d'un oligonucleotide selon une des revendications 1 à 5, pour la fabrication d'une composition vaccinale.
10. Composition vaccinale à usage humain, comprenant au moins un antigène vaccinal, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre au moins un oligonucleotide selon une des revendications 1 à 5
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