WO2001052642A1 - Methode de transfert d'adn mitochondrial mutant dans des cellules de reproduction - Google Patents

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WO2001052642A1
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mice
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Jun-Ichi Hayashi
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Institute Of Tsukuba Liaison Co., Ltd.
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N2517/00—Cells related to new breeds of animals
    • C12N2517/04—Cells produced using nuclear transfer

Definitions

  • the present invention relates to a method for introducing a mutant mitochondrial DNA into a germ cell, and a mitochondrial DNA knockout mouse produced by using the method.
  • mtDNA mitochondrial DNA
  • mtDNA knockout mice it will be possible to clarify how the mutant mtDNA is transmitted to offspring, distributed to tissues, and causes various diseases.
  • an ideal experimental system will be provided.
  • no effective method has been developed to introduce the mutated mtDNA into the mitochondria of other cells, and thus no mouse has been successfully produced. Disclosure of the invention
  • the present invention has been made under the above technical background, and an object of the present invention is to provide a means for introducing a mutant mtDNA into a germ cell mitochondria.
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems, and as a result, fused a nucleated cell having a mutant mtDNA with an mtDNA-deficient cell to prepare a cyprid, and after denucleating the cyclid, Mutant by fusion with germ cells They have found that mitochondria having mtDNA can be successfully introduced into germ cells, and have completed the present invention.
  • the present invention provides a mutant comprising nucleating a cell having a mutant mtDNA, fusing the mtDNA-deficient cell with the mtDNA-deficient cell to prepare a hybrid, denucleating the hybrid, and then fusing the hybrid with a germ cell.
  • This is a method for introducing mtDNA into germ cells.
  • the method for introducing a mutant mtDNA into a germ cell comprises the steps of: enucleating a cell having the mutant mtDNA and fusing it with an mtDNA-deficient cell to prepare a cyprid; denucleating the cyprid; It is characterized by the following.
  • Examples of cells having mutant mtDNA include, but are not limited to, the ability to use cells having deletion mutation mtDNA4696.
  • Enucleation of cells having mutant mtDNA should be performed by cytochalasin B treatment and high-speed centrifugation, for example, as described in Hayashi, JI. Et al., J. Biol. Chem 269, 19060-19066 (1994). Can be.
  • Mouse mtDNA-deficient cells ie, mice.
  • the cells for example, p ° C2C12 cells can be used, but are not limited thereto.
  • Mouse / 0 ° cells have been established by the present inventors (for details, see Inoue, K. et al., Isolation of mitochondrial DNA-less mouse cell lines and their application for trapping mouse synaptosomal mitochondrial DNA with deletion mutations. J. Biol. Chem. 272, 15510-15515; Inoue, K. et al., Isolation and characterization of mitochondrial DNA-less lines from various mamma 1 i an cell lines by application of an anticancer drug, ditercal inium. Biochem. Biophys. Res. Commun. 239, 257-260 (1997)).
  • Fusion between the enucleated cell having the mutant mtDNA and the mtDNA-deficient cell is performed, for example, by polyethylene render recall as described in Hayashi, J-1. Et al., J. Biol. Chem 269, 19060-19066 (1944). Can be carried out.
  • Enucleation of the cyprid produced by the above fusion can be performed in the same manner as enucleation of cells having mutant mtDNA.
  • a germ cell for example, a pronuclear stage embryo can be used, but is not limited thereto.
  • the fusion of cyprids with pronuclear stage embryos uses electrofusion.
  • a mouse individual can be prepared.
  • the embryo into which the DNA has been introduced is developed into a 4-cell stage embryo by culturing, and the embryo is transferred to the oviduct of a female mouse (foster parent) to obtain a mouse of the F0 generation.
  • FIG. 1 is a diagram showing the genetic characteristics of AmtDNA4696 in somatic cells and the procedure for preparing an mtDNA knockout mouse.
  • a Gene map of A mtDNA4696. The region indicated by the outwardly offset arc is deleted from the normal mtDNA. Primer pairs used for sequencing and detection of AmtDNA4696 are indicated by outline arrows 1 and 2.
  • ND5 to ND4L correspond to the polypeptides encoded by normal mtDNA, respectively.
  • FIG. 2 is a diagram showing transmission and distribution of ⁇ 4696 in F0 to F3 mice.
  • a A histogram showing the percentage of mtDNA4696 obtained by muscle biopsy from F0 mice.
  • c A diagram showing the distribution of the ratio of AmtDNA4696 for each tissue of the same individual.
  • FIG. 3 is a photograph showing histochemical and morphological abnormalities observed in a normal mouse and a mouse having AmtDNA4696.
  • a and b Results of COX activity staining of cross section of skeletal muscle fiber.
  • a was from a normal male mouse, and b was a muscle biopsy sample from an F2 mouse having AmtDNA4696.
  • c and d Results of C0X activity staining of cross sections of myocardial muscle fibers. c used a muscle biopsy sample from a normal male mouse, and d used a muscle biopsy sample from an F2 mouse having AmtDNA4696.
  • FIG. 4 is a diagram showing a biochemical abnormality in blood of a mouse having AmtDNA4696.
  • a and b Show the effect of AmtDNA4696 ratio on blood pyruvate (a) and lactate (b) levels. Open diamonds and black diamonds correspond to the values before and after glucose administration, respectively.
  • the cultured cells (NI H3T3 cells) from which the nuclei had been removed were fused with mouse mtDNA-deficient cells (that is, ⁇ ) cells) by polyethylene dalicol (PEG) treatment to obtain 26 cyprid clones.
  • mouse mtDNA-deficient cells that is, ⁇
  • PEG polyethylene dalicol
  • PCR PCR conditions: 60 cycles at 94 ° C, 60 seconds at 45 ° C, 120 seconds at 45 ° C, 30 cycles
  • PCR was performed using the following primer set. went.
  • Reverse primer 5'-tatgttggaaggagggattggggta-3 '(SEQ ID NO: 2: Corresponds to the base sequence of normal mtDNA 13666-13642)
  • AmtDNA4696 contained in this cybrid clone Cy4696 has a deletion of 4696 bp corresponding to the 12454th position from the 4459th position of the normal type mtDNA from the analysis of the base sequence of the PCR product.
  • the deletion contained six tRNA genes and seven structural genes (Fig. La shows the genetic map of AmtDNA4696).
  • This AmtDNA4696 differs from the other reported mouse AmtDNA in that there is no direct repeat around the deletion region (the base sequence around the deletion region in the L chain of AmtDNA4696 is shown in Figure lb).
  • the percentage of AmtDNA4696 contained in the Cy4696 hybrid increased from 30% to 83% while the cells were cultured at 37 ° C for 30 months, with no further increase. This behavior was similar to that observed in human cyprids transfected with AmtDNA, which is responsible for Kearns-Sayre syndrome, a mitochondrial disease. AmtDNA is likely to be advantageous for replication due to its small size, and has swept normal mtDNA during long-term culture.
  • Cy4696 rhino Brit strain five (each with AmtDNA4696 56, 67, 82, 84 , 85%), a mouse / o G cells and B82 cells (parent strain) was digested with restriction enzymes Xho l, obtained The fragments were detected by Southern blotting. The results are shown in Figure Id.
  • [35S] methionine was incorporated into the mitochondrial translation products of the same five Cy4696 cybrid strains, mouse p ° cells and B82 cells, and the mitochondrial fraction was separated.
  • BAS2000 its activity in the mitochondrial translation system was analyzed. The results are shown in FIG.
  • the nucleus was removed from Cy4696 hybrid by cytochalasin B treatment and high-speed centrifugation to obtain several cytoplasts.
  • mice were allowed to live with fertile B6D2F1 male mice. Fifteen to eighteen hours after injection of hCG, the oviducts of female mice were broken to collect pronuclear stage embryos. The collected embryos were transferred into a CZB medium, and left in the CZB medium containing hyaluronidase (SIGMA) to remove cumulus cells.
  • SIGMA hyaluronidase
  • pulsed stimulation (000 or 3500 V / cm, lO ⁇ sec) was applied in the presence of an AC electric field (before and after fusion, 100 V / cm, 2 MHz, 30 sec) to fuse the cytoplast with the embryo. .
  • the AC electric field before and after the fusion is the electric field for dielectrophoresis to keep the cells adhered.
  • Example 2 Using the embryo having AmtDNA4696 prepared in Example 1, a mtDNA knockout mouse was prepared.
  • pseudopregnancy was performed using 1 142 4-cell stage embryos (containing AmtDNA4696) obtained in Example 1. Implanted into oviducts of ICR female mice (8-12 weeks old) (foster parent) on day 1 after treatment (Day 1 after treatment was performed after mating with vasectomized male mice (pseudopregnancy) Day).
  • FIG. If shows an outline of a series of operations from Step 1 in Example 1 (transfer of Cy4696 cyprid into mouse pronuclear embryos).
  • Reverse primer 5'-CTATTATCAGGCCTAGTTGGC-3 '(SEQ ID NO: 4: Normal
  • F2 females were produced from F1 females and F3 females were produced from F2 females.
  • the ratio of transmitted AmtDNA4696 was compared between the F0-F3 generation mouse individuals (maternal and offspring mice) obtained in (3). Using tibialis anterior muscle biopsy samples, the proportion of AmtDNA4696 was compared between individuals of the F0 and Fl, F1 and F2, and F2 and F3 generations. Five female mice of F0, four of F1, and seven of F2 were used as mother mice for producing the next generation, respectively. Five F0 individuals had 5.7, 6.1, 10.8, 11.2, and 13.0% of AmtDNA4696, respectively. The results are shown in FIG. 2b.
  • a ⁇ ⁇ section prepared from the soleus muscle of a mouse having 84.8% AmtDNA4696 was used as a reaction solution (DAB 60 mg, 0.1 M acetate buffer (pH 5.6) 27 ml, 1% MnCl 2 (pH 5.5) 3 ml, 0.1% C0X staining was performed by incubating at 37 ° C for 30 minutes in 0.3 ml of 0.2% H 2 O 2 ) .Based on this staining result, fine C0X non-staining and C0X staining fibers were cut from a 20 ⁇ section. The cytoplasm is excised and the proportion of AmtDNA 46% in each cytoplasm is reduced to the following three primers:
  • Primer 1 5'—ACCAGGGTTATTCTATGGCC—3 '(SEQ ID NO: 5: mouse
  • Primer 2 5'—CCGCATCGGAGACATCGGATT—3 '(SEQ ID NO: 6: mouse
  • 1st PCR 30 cycles of 94 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 1 minute,
  • 2nd PCR 10 cycles of 1 minute at 94 ° C, 1 minute at 48 ° C, 3 minutes at 72 ° C,
  • Mutant mtDNA (Z mtDNA4696) was detected as a 210 bp fragment, and normal mtDNA was detected as a 220 bp fragment.
  • the ratio of the mutant and normal mtDNA fragments contained in each fiber was quantified using FM-BI0 Image Analyzer-1 (HITACHI).
  • FIGS. 3a and 3c show the findings obtained from normal 21-week-old male mice (ICR) (comparative control).
  • FIG. 3d shows the findings obtained for the myocardium of a mouse having 84.8% of AmtDNA4696.
  • Figure 3f shows a kidney from a normal male mouse (left) of the same age as this mouse (right).
  • the surface of the kidney of the mouse having ⁇ mtDNA (FIG. 3f right) was granular and had 88.2% ⁇ mtDNA4696.
  • FIG. 3h the findings of the renal tissue of a 24-week-old male mouse having 94.0% AmtDNA4696 are shown in FIG. 3h, and the kidney of a normal male mouse of the same age is shown in FIG. 3g.
  • FIG. 3g the kidney of a normal male mouse of the same age is shown in FIG. 3g.
  • Peripheral blood was collected from the tail of 12 12-week-old male mice having mtDNA4696, and blood pyruvate levels (mg / dL) and lactate levels before and after oral administration of 1.5 g / kg body weight glucose. (MgZdL) was measured, and the relationship between the change in the level and the percentage of AmtDNA4696 was examined. Blood pyruvate and lactate levels were measured by the change in concentration between NAD and NADH. The results are shown in FIGS. 4a and b.
  • peripheral blood was collected from 5 21-week-old F2 male mice having the same 47.3, 70.0, 79.0, 82.8, and 84.8% of AmtDNA4696 as in 6 in the same manner as described above. Blood urea nitrogen levels and creatine levels measured by Fuj i Film) were compared to normal mtDNA Were compared with the values obtained for the peripheral blood of the mice with. The results are shown in FIG. 4c. (result)
  • mice with a higher proportion of AmtDNA4696 in muscle tissue had higher lactate levels in peripheral blood (in the figure, diamonds (white) are before glucose administration, diamonds (black) are after administration). Is shown).
  • mice having AmtDNA4696 can be used as a mitochondrial disease model.
  • mice with high levels of AmtDNA4696 had very high levels of blood urea nitrogen and creatinine as compared to mice with normal mtDNA.
  • Muscle fibers containing less than 85% of AmtDNA4696 exhibit normal mitochondrial respiratory function because mitochondria containing normal mtDNA in fertilized eggs that became the receptor for AmtDNA4696 This can be explained well in consideration of the fact that there is an interaction between the mitochondrial having the obtained AmtDNA4696. In other words, it supports the idea previously proposed by the present inventors that mammalian mitochondria are functionally single and can exchange their contents as a result of mutual interaction.
  • the toxicity of the mouse AmtDNA4696 provided by the present invention is less than that of the human deletion mutant mtDNA, and appears to be comparable to that of the human point mutant mtDNA.
  • the difference between the transmission to the offspring and the distribution status to the tissues observed between the mouse and human AmtDNA of the present invention is due to the fact that the mouse AmtDNA4696 of the present invention has low toxicity in all humans. Or because the cells of the mouse are resistant to energy deficiencies, they can survive the high levels of AmtDNA4696 in mouse eggs, embryos, and meristems, and ultimately the maternal nature of the mouse AmtDNA4696. This may be the result of the large distribution of genetics and meristems.
  • the present invention it has become possible to provide an effective method for introducing a mutant mtDNA into cells.
  • AmtDNA4696 as a mutant mtDNA

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Description

明 现 曞 倉異型ミ トコンドリア MAの生殖现胞ぞの導入方法 技術分野
本発明は、 倉異型ミ トコンドリア DNAの生殖现胞ぞの導入方法、 および該方法 を利甚しお䜜補されたミ トコンドリア DNAノックァゥトマりスに関する。 背景技術
突然倉異ミ トコンドリア DNAは、 ミ トコンドリア病、 老化、 そしお様々な老化 関連疟患ず深い関係にあるこずが瀺唆されおきたWallace, D. Mitochondrial diseases in man and mouse. Science 283, 1482-1488(1999)  Larsson, N. -G. & Clayton, D. A. Molecular genetic aspects of human mitochondrial disorders. Annu. Rev. Genet. 29, 15卜 178(1995)) が、 䞡者の因果関係を説明できる確かな蚌 拠は未だ芋぀かっおいない。
ミ トコンドリア DNA (以䞋、 「mtDNA」 ず蚘茉するノックアりトマりスを䜜補で きれば、 突然倉異 mtDNAがどのように子孫に䌝わり、 組織に分配されそこで様々 な病気を発症するかを明らかにしおいく䞊で理想的な実隓系が提䟛されるこずに なる。 しかし、 珟圚のずころ、 突然倉異を誘発させた mtDNAを他の现胞のミ トコ ンドリア内に導入するのに有効な方法は開発されおいないため、 䞊蚘マりスの䜜 補に成功した䟋はない。 発明の開瀺
本発明は、 以䞊のような技術的背景のもずに為されたものであり、 その目的は 倉異型 mtDNAを生殖现胞のミ トコンドリァ内に導入する手段を提䟛するこずにあ る。
そこで、 本発明者らは䞊蚘課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、 倉異型 mtDNAを有する脱栞した现胞を mtDNA欠損现胞ず融合させおサむプリッドを䜜補 し、 該サむブリツ ドを脱栞した埌に生殖现胞ず融合させるこずにより、 倉異型 mtDNA をも぀ミ トコンドリアを生殖现胞内にうたく導入できるこずを芋出し、 本 発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、 倉異型 mtDNAを有する现胞を脱栞しお mtDNA欠損现胞ず融 合させおサむブリツドを䜜補し、 該サむブリツドを脱栞した埌、 生殖现胞ず融合 させるこずを特城ずする、 倉異型 mtDNAの生殖现胞ぞの導入方法である。
以䞋、 本発明を詳现に説明する。
本発明の倉異型 mtDNAの生殖现胞ぞの導入方法は、 倉異型 mtDNAを有する现胞 を脱栞しお mtDNA欠損现胞ず融合させおサむプリッドを䜜補し、 該サむプリッド を脱栞した埌、 生殖现胞ず融合させるこずを特城ずするものである。
倉異型 mtDNAを有する现胞ずしおは、 䟋えば、 欠倱突然倉異 mtDNA4696を有す る现胞を䜿甚するこずができる力、 これに限定されない。
欠倱突然倉異 mtDNA4696を有する现胞は本発明者らにより暹立された。
倉異型 mtDNA を有する现胞の脱栞は、 䟋えば Hayashi, J-I.ら、 J.Biol.Chem 269 19060-19066(1994)の蚘茉に埓っお、サむトカラシン B凊理ず高速遠心操䜜す るこずにより実斜するこずができる。
マりス mtDNA欠損现胞、 すなわちマりス 。现胞ずしおは、 䟋えば p°C2C12现 胞を䜿甚するこずができるが、 これに限定されない。 マりス /0 °现胞は本発明者ら によリ暹立されおいる詳现に぀いおは、 Inoue,K.ら、 Isolation of mitochondrial DNA-less mouse cell lines and their application for trapping mouse synaptosomal mitochondrial DNA with deletion mutations. J.Biol.Chem. 272, 15510-15515; Inoue, K.ら、 Isolation and characterization of mitochondrial DNA-less lines from various mamma 1 i an cell lines by application of an anticancer drug, ditercal inium. Biochem. Biophys. Res. Commun. 239, 257- 260(1997)参照。
倉異型 mtDNA を有する脱栞した现胞ず mtDNA 欠損现胞ずの融合は、 䟋えば、 Hayashi, J - 1.ら、 J.Biol.Chem 269, 19060-19066(1944)の蚘茉に埓っお、 ポリェチ レンダリコヌル凊理するこずにより実斜するこずができる。
䞊蚘融合により䜜補したサむプリッドの脱栞は、 倉異型 mtDNAを有する现胞の 脱栞ず同様に行なうこずができる。 生殖现胞ずしおは、 䟋えば前栞期の胚を䜿甚するこずができるが、 これに限定 されない。
サむプリッドず前栞期の胚ずの融合は、 電気融合を甚いる。
以䞊のようにしお䜜補された倉異型 mtDNAを導入された生殖现胞を利甚しお、 マりス個䜓を䜜補するこずができる。
この堎合、 該 DNAを導入した胚を培逊により 4现胞期胚にたで発生させ、 こ れを雌マりス仮芪の茞卵管に移怍しお F0䞖代のマりスを埗る。
mtDNAは完党な母性遺䌝をするこずから、 これらの F0䞖代の雌ず正垞な mtDNA を有する雄マりスずを亀配するこずにより子孫マりスを䜜補するこずができる。 本明现曞は、 本願の優先暩の基瀎である日本囜特蚱出願 2000幎第 9194号の明 现曞に蚘茉される内容を包含する。 図面の簡単な説明
図 1は、 䜓现胞における A mtDNA4696の遺䌝的特城ず mtDNAノックアりトマり スの䜜補手順を瀺す図である。
a A mtDNA4696の遺䌝子地図。 倖偎にずれた円匧で瀺される領域が正垞型 mtDNA から欠倱しおいる。 A mtDNA4696 の配列決定や怜出に甚いたプラむマヌ察は癜抜 きの矢印 1 2で瀺す。
b : A mtDNA4696の L鎖における欠倱領域付近の塩基配列。䞋段に瀺す塩基番号 7759 から 12454の配列が、 4696bpからなる欠倱郚分である。
c A mtDNA4696の割合ず C0X掻性ずの盞関を瀺す図である。
d制限酵玠で消化しお埗た Cy4696断片のサザンブロット法による怜出を瀺す図 である。 図䞭、 16. 3-ず 1 1 . 6-kb におけるバンドはそれぞれ正垞型 mtDNA ず Δ mtDNA4696を瀺す。
e : Cy4696サむプリット株のミ トコンドリアぞの [35S]メチォニン取り蟌みを瀺す 図である。 図䞭、 ND5〜ND4Lはそれぞれ正垞型 mtDNAにコヌドされるポリべプチ ドに察応しおいる。
f 正垞型 mtDNA ず Cy4696サむブリッド株由来の A mtDNA4696 をぞテロプラズミ —に有するマりスを䜜補するための実隓蚈画。 正垞型 mtDNAを有するマりスずミ トコンドリアに぀いおは )で衚し、 AmtDNA4696 を有するそれらは國で衚し た。 AmtDNA4696 を少量だけ有するヘテロプラズミヌマりスは )、 倧量に有す るマりスは )で衚した。
図 2は、 F0〜F3マりスにおける ΔπιΐΜΑ4696の䌝達ず分垃を瀺す図である。 a F0マりスから筋生怜により埗られた△ mtDNA4696の割合をヒストグラムで衚し た図である。
b:F0〜F3においお䌝達された AmtDNA4696の割合を、 母芪ずその仔マりスずにお いお比范した図である。 F0の 5個䜓、 F1の 4個䜓、 F2の 7個䜓の雌を、 F1(A)、 F2(#), F3(4)の子䟛の母芪ずしおそれぞれ甚いた。 図の +印は AmtDNA4696 の 平均レベルを瀺す。
c 同䞀個䜓の組織ごずの AmtDNA4696割合の分垃を瀺す図である。
図 3は、 正垞マりスおよび AmtDNA4696 を有するマりスで芳察された組織化孊 的、 圢態的な異垞を瀺す写真である。
aおよび b 骚栌筋の筋線維暪断切片の COX掻性染色の結果。 aは正垞雄マりス由 来、 bは AmtDNA4696を有する F2マりス由来の筋生怜サンプルを䜿甚した。
cおよび d心筋の筋線維暪断切片の C0X掻性染色の結果。 cは正垞雄マりス由来、 dは AmtDNA4696を有する F2マりス由来の筋生怜サンプルを䜿甚した。
e F1雄マりスの倖芋的特城。
f  Δ mtDNAを有するマりス右ず正垞マりス巊由来の腎臓。
gおよび h AmtDNAを有するマりスh)ず正垞マりスg)由来の腎臓の腎皮質。 図 4は、 AmtDNA4696 を有するマりスの血液における生化孊的異垞を瀺す図で ある。
aおよび b血䞭ピルビン酞a)ず乳酞b)のレベルに及がす AmtDNA4696の割合の 圱響を瀺す。 癜抜きの菱圢ず黒菱圢はグルコヌス投䞎の前ず埌の倀にそれぞれ䞀 臎しおいる。
c:正垞型の mtDNAを有するマりスず AmtDNA4696を有するマりスの血枅䞭の尿玠 窒玠癜抜きの棒グラフずクレアチン黒棒グラフのレベルの比范を瀺す。 発明を実斜するための最良の圢態
以䞋、 実斜䟋により本発明をさらに具䜓的に説明するが、 本発明はこれらに限 定されるものではない。
〔実斜䟋 1〕 欠倱突然倉異 mtDNAの前栞期の胚ぞの導入
( 1 ) 欠倱突然倉異 mtDNA (以䞋、 「AmtDNA」 ず蚘茉するを有するサむプリッド の調補
① AmtDNAの mtDNA欠損现胞/0。现胞ぞの導入
栞を陀いた培逊现胞N I H3T3现胞を、 マりスの mtDNA欠損现胞すなわち ρ ϋ现 胞ずポリ゚チレンダリコヌルPEG)凊理により融合し、 2 6個のサむプリッドク 口䞀ンを埗た。
② AmtDNAを有するサむブリッドの遞択
△mtDNA がうたく導入されたサむブリツドを遞択するため、 䞋蚘のプラむマヌ セットを甚いお PCR(PCR条件 94°Cで 60秒、 45°Cで 60秒、 45°Cで 120秒を 30 サむクルを行った。
(プラむマ䞀セット
方向プラむマ䞀  5' - aagaaaggaaggaatcgaaccccct - 3' (配列番号 1 正垞型 mtDNAの塩基配列 6871 - 6895に盞圓
逆方向プラむマ䞀  5' - tatgttggaaggagggattggggta- 3' (配列番号 2 正垞型 mtDNAの塩基配列 13666 - 13642に盞圓
2 6個のサむブリツドクロヌンのうち 8個のクロヌンに PCRで増幅されるシグ ナルを認めたので、 これら 8個のクロヌンの AmtDNA 量をサザンブロット法によ リ定量した。
この䞭のほずんどのクロヌンはサザンブロット法で怜出できるだけの AmtDNA を含んでいなか぀たが、 クロヌン Cy4696だけが 30 %の AmtDNAを有しおいた。 こ の倉異はマりスの培逊现胞由来のものであった。
このサむブリツドクロヌン Cy4696の有する AmtDNA (以䞋、 「AmtDNA 4696」 ず 蚘茉するは、 PCR産物の塩基配列の解析から、 正垞型 mtDNAの 4459番から 12454 番目に盞圓する 4696bpを欠倱しおおり、 その欠倱郚分には 6぀の tRNA遺䌝子ず 7぀の構造遺䌝子が含たれおいたAmtDNA4696の遺䌝子地図を図 l aに瀺す。 こ の AmtDNA4696 は、 他に報告されおいるマりスの AmtDNA ず異なり、 欠倱を起こ した領域の呚蟺にダむレクトリピヌトは存圚しないAmtDNA4696の L鎖における 欠倱領域呚蟺の塩基配列を図 lbに瀺す。
Cy4696サむブリッドに含たれる AmtDNA4696の割合は、 この现胞を 37°Cで 30 月培逊しおいる間に 30%から 83%にたで増加し、その埌それ以䞊の増加は芋られな かった。 この挙動は、 ミ トコンドリア病のひず぀である Kearns- Sayre症候矀の原 因ずされおいる AmtDNA を導入したヒトのサむプリッドで認められたそれず類䌌 しおいた。 おそらく AmtDNA はサむズが小さいため耇補の際有利であり、 長期の 培逊の間に正垞型 mtDNAを垭巻したものず思われる。
③ AmtDNA4696の病原性の確認
次に、 AmtDNA4696の病原性を以䞋の方法により確認した。
たず、皮々の割合50〜90% )で AmtDNA4696を有するサむブリッド Cy4696クロ —ンに぀いお、 その呌吞掻性すなわちチトクロヌム c ォキシダヌれC0X)掻性 を還元型チトクロム cのシアン化合物感受性酞化の割合)ずしお宮林らによる 手法Mi yabayash iS. ら、 1984) Brain Dev. 6 362- 372)に埓っお枬定し、 △ mtDNA4696の割合が COX掻性に及がす圱響に぀いお分析した。結果を図 lcに瀺す。
たた、 5個の Cy4696サむブリット株それぞれ、 AmtDNA4696を 56、 67、 82、 84、 85%有する、 マりス/ o G现胞および B82现胞 现胞芪株を制限酵玠 Xho l で消化し、 埗られた断片をサザンプロット法により怜出した。 結果を図 Id に瀺 す。
さらに、 䞊蚘ず同じ 5個の Cy4696サむブリツド株、 マりス p °现胞および B82 现胞それぞれのミ トコンドリア内翻蚳産物に [35S]メチォニンを取り蟌たせお暙 識し、 ミ トコンドリア画分を分離し、 SDS電気泳動パタヌンを BAS2000で解析す るこずによりそのミ トコンドリア内翻蚳系掻性を分析した。結果を図 leに瀺す。
(結果
図 1 c〜eを比范するこずよリ、 AmtDNA4696の割合の倚いサむプリッドでは C0X 掻性ずミ トコンドリア内翻蚳系の掻性が共に䜎䞋するこずがわかリ、 AmtDNA4696 の病原性が立蚌された。
詊隓したすべおのサむプリッドは芪株である o Q现胞ず同じ栞のバックグラり ンドを持っおいるこずから、 ミ トコンドリア内翻蚳系党䜓の掻性䜎䞋ずその結果 生じる呌吞C0X)掻性の䜎䞋は、 6 ぀の tRNA 遺䌝子を欠倱しおいる AmtDNA4696 の蓄積が原因であるず考えられる。
④ Cy4696サむブリツドのマりス前栞期胚ぞの導入
Cy4696サむブリツドからサむ トカラシン B凊理および高速遠心凊理により栞を 陀き、 サむトプラスト数個を埗た。
8〜10週霢の雑皮 F1雌マりス B6D2F 1 ) 300個䜓に、 48時間の間隔をおいお劊 銬血枅性生殖腺刺激ホルモンPMSG) 5 I U ずヒ ト絚毛膜性生殖腺刺激ホルモン (hCG) 5 IUずを続けお腹腔内泚射するこずにより、 過排卵を誘発した。
それらの雌マりスを、 生殖胜力のある B6D2F 1雄マりスずヌ晚同居させた。 hCGの泚射 15〜18時間埌に、 雌マりスの卵管を砎っお前栞期の胚を採集した。 採集した胚を CZB培地内に移し、 ヒアルロニダヌれS I GMA) を含む該 CZB培地䞭 で静眮するこずによリ卵䞘现胞を取り陀いた。
ピ゚ゟ駆動のマむクロマニピュレヌタヌを甚い、䞊蚘で埗た玄 10個のサむ トプ ラストを、 卵䞘现胞を取り陀いた胚の囲卵腔に泚入した。
次いで、 亀流電堎 融合前 ·埌ずもに 100V/cm 2MHz, 30sec) の存圚䞋で、 パ ルス刺激 3000 or 3500V/cm lO ^ sec) を䞎え、 サむトプラストず胚ずを融合さ せた。 泚融合前埌の亀流電堎は、 现胞同士を接着させおおくための誘電泳動甚 の電堎である
(結果
ほずんどの 95 %以䞊 胚が電気融合埌も生存し、 Cy4696由来のサむトプラス トず融合した前栞期の胚をシャヌレで培逊したずころ、 1 142個の胚が 24時間の 培逊で 2现胞期胚、 48時間の培逊で 4现胞期胚にたで発生した。
〔実斜䟋 2〕 mtDNAノックアりトマりスの䜜補
実斜䟋 1で調補した AmtDNA4696を有する胚を甚いお、 mtDNAノックアりトマり スを䜜補した。
① F0䞖代マりスの䜜補
たず、 実斜䟋 1で埗た 1 142個の 4现胞期胚AmtDNA4696を有するを、 停劊嚠 凊理埌 1 日目の I CR雌マりス8〜12週霢 仮芪 の茞卵管に移怍した 凊理埌 1 日目ずは、 粟管結玮した雄マりスず亀配停劊嚠させた次の日を指す。
停劊嚠凊理埌 2 0日目に、 仮芪雌マりスの子宮を垝王切開しお怜査し、 生存し おいる仔マりスF0 䞖代は授乳胜力のある I CR 雌マりス里芪に育おさせた。 実斜䟋 1の操䜜④Cy4696 サむプリッドのマりス前栞期胚ぞの導入からの䞀連 の操䜜の抂略を図 I f に瀺す。
仮芪マりスより取り出した 1 1 1個䜓の新生マりスのうち、 98個䜓が成䜓たで発 育した。 これらのマりスの尟から抜出した DNA を甚いお、 AmtDNA4696の有無を PCR法で調べたずころ、 98個䜓䞭 31個䜓がその䜓现胞䞭に AmtDNA4696を有する こずがわかった。 PCRで䜿甚したプラむマ䞀察および条件は以䞋の通リである。
(プラむマヌ察
順方向プラむマヌ 5'— AACAGTAACATCAAACCGACCAGG—3' (配列番号 3 
正垞型 mtDNAの塩基配列 7558— 7581に盞圓
逆方向プラむマヌ 5' - CTATTATCAGGCCTAGTTGGC - 3' (配列番号 4 正垞
型 mtDNAの塩基配列 12678— 12658に盞圓
PCR条件 94°Cで 1分、 45°Cで 1分、 72°Cで 1分を 30サむクル
そこで、 AmtDNA4696 を有する 31 個䜓の F0 マりスの前脛骚筋M. t i b i a l i s ante r i o r)の筋生怜を行い、 サザンブロット法で A mtDNA4696の割合を枬定したず ころ、 24個䜓が 5. 7〜41. 8%の AmtDNA4696 を有しおいるこずが瀺された結果を 図 2aに瀺す。
③ AmtDNA4696を有する子孫マりスの䜜出
mtDNAは完党に母性遺䌝するこずから、 これらの F0䞖代の䞭から AmtDNA4696 をそれぞれ 5. 7、 6. 1、 10. 8、 1 1. 2、 13. 0 %有する雌マりス 5個䜓を母芪に遞び、 雄BDF1 )ず亀配しお F1䞖代のマりスを産出させた。
同様にしお、 F 1䞖代の雌から F2䞖代を、 さらに F2䞖代の雌から F3䞖代の個 䜓を産出させた。
④ AmtDNA4696の䞖代䌝達割合およびその組織間分垃
③で埗られた F0〜F3䞖代のマりス個䜓間母芪ず仔マりスにおいお、䌝達され た A mtDNA4696の割合を比范した。 tibialis anteriorの筋生怜サンプルを甚いお、 F0 ず Fl、 F1 ず F2、 F2 ず F3 䞖代の個䜓間で AmtDNA4696の割合の比范を行った。 F0の 5個䜓、 F1の 4個䜓、 F2の 7個䜓の雌マりスを、 次の䞖代を䜜出するための母芪マりスずしおそれぞれ 甚いた。 F0の 5個䜓はそれぞれ、 AmtDNA4696 を 5.7、 6.1、 10.8、 11.2、 13.0% 有しおいた。 結果を図 2bに瀺す。
(結果
F1の 4個䜓は AmtDNA4696を 27.4、 38.0、 47.0、 48.7%有しおいた。 F2の 7個 䜓は AmtDNA4696を 19.6、 39.1、 41.3、 63.9、 73.2、 73.5、 74.8%有しおいた。 このこずから、 AmtDNA4696は F0の母芪マりスから雌の生殖现胞系列を経お次 の䞖代ぞず䌝わるこずが瀺された。 尚、 筋肉䞭に AmtDNA4696を 90%以䞊有するマ ゥスが埗られなかったのは、 それらが臎死であ぀たためず思われる。
たた、 継代を重ねるこずにより、 AmtDNA4696 を倚く含有する個䜓を埗るこず ができた。
â‘€ 同䞀個䜓の各組織間における AmtDNA4696量の比范
次に、 5個䜓の雄マりス5週霢の F1が 2個䜓、 17週霢の F2が 1個䜓、 21週 霢の F2が 2個䜓 を甚いお、 同䞀個䜓の組織ごずの AmtDNA4696の割合を比范し た。 比范に甚いた組織は脳、 肺、 心臓、 肝臓、 脟臓、 脬臓、 腎臓、 粟巣、 骚栌筋 および血液の 10皮類である。 結果を図 2cのヒストグラムで瀺す。
(結果
同䞀個䜓の組織間における Δ mtDNA4696の分垃に有意差は認められなかった。
⑥ 単䞀筋繊維における AmtDNA4696の割合ず C0X掻性ずの関係
F2䞖代の䞭から、 筋生怜により 47.3、 70.0、 79.0、 82.8、 84.8%の AmtDNA4696 を持぀ 21週霢の雄マりス 5個䜓を遞び、各マりスの骚栌筋ヒラメ筋M.soleus)) からの二枚の連続凍結切片ΙΟΌπι 20 ^ 111の厚さを䜜補しお、 C0X掻性の䜎䞋ず △ mtDNA4696の割合ずの間に関連があるかどうかを調べた。
たず、 84.8%の AmtDNA4696 を持぀マりスのヒラメ筋から䜜補した ΙΟΌπιの切 片を反応液DAB 60mg、 0.1M 酢酞緩衝液pH5.6) 27ml, 1% MnCl2(pH5.5) 3ml、 0.1% H202 0.3ml)äž­ 37°Cで 30分間むンキュベヌトするこずにより C0X染色を行 レ、、 この染色結果を元に、 20Όπιの切片から C0X非染性繊維ず C0X染性繊維の现 胞質を切り出し、 それぞれの现胞質に含たれる AmtDNA46% の割合を以䞋の 3個 のプラむマ䞀
プラむマヌ 1  5'— ACCAGGGTTATTCTATGGCC— 3' (配列番号 5 マりス
正垞型 mtDNAの 7576〜7595に盞圓、
プラむマ䞀 2  5'—CCGCATCGGAGACATCGGATT— 3' (配列番号 6 マり
ス正垞型 mtDNAの 12260〜12280に盞圓、
プラむマ䞀 3  5' -GTGTAGTAGTGCTGAAACTGG-3' (配列番号 7 マり
ス正垞型 mtDNAの 12479〜 12459に盞圓。 FAMで暙識され おいる、
を甚いお定量 PCR分析した。
PCR条件は、
1st PCR 94°Cで 30秒、 55°Cで 30秒、 72°Cで 1分を 30サむクル、
2nd PCR 94°Cで 1分、 48°Cで 1分、 72°Cで 3分を 10サむクル、
であった。
倉異型 mtDNA(Z mtDNA4696)は 210bp、 正垞型 mtDNAは 220bpの断片ずしおそれ ぞれ怜出された。 次に、 それぞれの繊維に含たれる倉異型 ·正垞型 mtDNA断片の 割合を、 FM-BI0むメヌゞ アナラむザ䞀HITACHI) を甚いお定量した。
芳察された組織孊的、 圢態孊的な異垞を図 3に瀺す。 尚、 図 3aおよび cは正 垞な 21週霢の雄マりスICR)に぀いお埗られた所芋である比范察照。
(結果
AmtDNA4696を 47.3%および 70.0%有するマりスの骚栌筋では C0X掻性のない 筋線維を認めなかったが、 AmtDNA4696を 79.0%、 82.8%および 84.8%有するマ りスの骚栌筋では C0X掻性の有るすなわち C0X染性ず無いC0X非染性線維が モザむク状に分垃しおいた。 図 3bに AmtDNA4696を 84.8%有するマりスの骚栌 筋に぀いお埗られた所芋を瀺す。 図 3b 䞭の番号を付した繊維 1〜7 はそれぞれ 95.6、 90.0, 86.5、 81.9、 82.2、 83.2、 77.3%の AmtDNA4696を有しおおり、 C0X 非染性の繊維123)の AmtDNA4696の含有平均倀は 90.7±3.8%、 䞀方 C0X染性 の繊維4 5 6 7)の平均倀は 81.2±2.3%であった。 
さらに、 骚栌筋においお C0X非染性の繊維が認められたマりスでは、 その心筋 組織においおも COX掻性の有る现胞ず無い现胞がモザむク状に分垃しおいた。 図 3dに AmtDNA4696を 84. 8%有するマりスの心筋に぀いお埗られた所芋を瀺す。 これらの結果より、 C0X掻性の䜎䞋ず△ mtDNA4696の割合の間には良い盞関関係 が芋られるこずがわかる すなわち、 85%以䞊の割合で AmtDNA4696を含む筋線維 のすベおは C0X掻性が無く、 それ以䞋の筋線維では C0X掻性が認められる。
たた、 AmtDNA4696を倚く有する F1〜F2䞖代のマりスの倚くは衰匱の結果死亡 した。 このようなマりスの肉県的䞻芁所芋は、 貧血ず腎の粒状肥倧である。 図 3e に瀺す 38週霢の F 1の雄マりスは、 耳ず尟郚の蒌癜色の色調から深刻な貧血症で あるこずがわかる。 このマりスは 7週霢時の筋生怜サンプルにおいお 58. 7%の厶 mtDNA4696を有しおいたが、 撮圱の次の日に腎䞍党により死亡した。
図 3f にはこのマりス右ず同じ週霢の正垞雄マりス巊由来の腎臓を瀺す。△ mtDNA を有するマりスの腎臓の衚面図 3f 右は顆粒状を呈し、 88. 2%の△ mtDNA4696を有しおいた。他の F 1〜F3マりスは筋生怜サンプルにおいお倧量に△ mtDNA4696を有し64. 0±10. 4%、 n=5)、 21週霢から 38週霢間に腎䞍党で死亡した。 死亡時におけるこれらのマりスの腎組織は、 80 %以䞊85. 4 ± 5. 4 %、 n =5)の△ mtDNA4696を有しおいた。
さらに、 94. 0 %の AmtDNA4696を有する 24週霢の雄マりスの腎組織の所芋を図 3hに、 同じ週霢の正垞雄マりスの腎臓を図 3gに瀺す。 AmtDNAを有するマりス の腎組織においおは、 皮質の近䜍および遠䜍尿现管の顕著な拡匵が芳察され、 郚 分的にェォシン染性の物質を含んでいた。
⑩ AmtDNA4696がマりス血䞭成分に及がす圱響
△ mtDNA4696を有する 12週霢の雄マりス 12個䜓の尟郚より末梢血を採取し、 1. 5 g/kg䜓重のグルコヌスを経口で投䞎した前埌の血䞭ピルビン酞レベルmg/ dL)および乳酞レベルmgZdL)を枬定し、 そのレベルの倉動ず AmtDNA4696の割合 ずの関係を調べた。 血䞭ピルビン酞レベルおよび乳酞レベルは NAD _ NADH間の濃 床倉化により枬定した。 結果を図 4aおよび bに瀺す。
さらに、 ⑥ず同じ 47. 3、 70. 0、 79. 0、 82. 8、 84. 8 %の AmtDNA4696 を持぀ 21 週霢の F2雄マりス 5個䜓から䞊蚘同様に末梢血を採取し、 ドラむケムFuj i F i lm) により枬定した血䞭尿玠窒玠レベルおよびクレアチンレベルを、 正垞型の mtDNA を有するマりスの末梢血に぀いお埗られた数倀ず比范した。結果を図 4cに瀺す。 (結果
図 4bからわかるように、筋組織䞭の AmtDNA4696の割合が倚いマりスほど末梢 血䞭の乳酞倀が増加しおいた図䞭、 菱圢癜はグルコヌス投䞎の前、 菱圢黒 は投䞎埌の倀を瀺す。
この結果ず⑥で埗られた AmtDNA4696を有する心筋における所芋図 3d)から、 AmtDNA4696 を有するマりスはミ トコンドリア病の疟患モデルずしお利甚できる こずが明らかずなった。
さらに、 図 4cからわかるように、 AmtDNA4696を倚く有するマりスは、 正垞型 mtDNA を有するマりスず比范しお非垞に高いレベルの血䞭尿玠窒玠ずクレアチニ ンを有しおいた。
この結果ず⑥で埗られた AmtDNA4696 を有する腎組織における所芋図 3f およ び h)から、 AmtDNA4696を倚く有するマりスの死亡の原因は尿现管原性の腎機胜 障害であるず掚察された。
腎機胜障害はミ トコンドリア病で共通に認められる症状ではないが、 腎臓のミ トコンドリァ機胜異垞の報告䟋もあるこずから、 本発明者らはこれたで原因䞍明 であ぀た腎臓病のいく぀かは突然倉異 mtDNAの蓄積にその原因があるこずをここ で提案したい。
筋線維の䞭で 85%以䞋の AmtDNA4696 を含むものが正垞なミ トコンドリアの呌 吞機胜を瀺す理由ずしおは、 A mtDNA4696 の受容䜓ずなった受粟卵䞭の正垞型 mtDNAを有するミ トコンドリァず、導入された AmtDNA4696を有するミ トコンドリ ァずの間に盞互䜜甚があるこずを考慮するず良く説明するこずができる。 すなわ ち、 哺乳類のミ トコンドリアが機胜的に単䞀であり、 互いの盞互䜜甚の結果䞭身 を亀換するこずができる、 ずいう本発明者らが以前提唱した考え方を支持するも のである。
さらに、 本発明者らは、 受粟の際に卵に導入された粟子の mtDNAが 2现胞期に なる前に完党に排陀されるこずを以前報告しおいる。 しかし今回の研究では、 △ mtDNA4696 を持぀䜓现胞のミ トコンドリアは、 受粟卵に導入しおもそこからの排 陀をたぬがれる事を芋いだした。 したがっお、 わずか 2䞖代を経るこずで倖から導入した AmtDNA4696 を倧量に 含むマりスを暹立できたのは以䞋の二぀の理由 䞀぀は導入された AmtDNA4696 を有する䜓现胞由来ミ トコンドリァは胚からの陀倖を免れるこずができたこず、 もう䞀぀は該 AmtDNA4696が正垞型 mtDNAよリ耇補に有利であっお、 その結果△ mtDNA4696は次の䞖代に䌝わリ正垞型 mtDNAを垭巻できたこずによるず思われる。
これたで、 AmtDNA が雌の生殖现胞系列を通しお次の䞖代に䌝わるこずはショ りゞペりバ゚で報告されおいるが、 欠倱突然倉異が原因であるヒトの Kearns - Sayre症候矀では報告がない。 しかし、 点突然倉異 mtDNAが母性遺䌝するこずに ぀いおは他のミ トコンドリア病の患者で認められおいる。 この病原性を持぀点突 然倉異 mtDNAが呌吞掻性䜎䞋を匕き起こすためには 90%以䞊の蓄積が必芁である のに察し、 欠倱突然倉異 mtDNAの堎合は 70%であ぀た。
したがっお、 本発明により提䟛されるマりスの AmtDNA4696 の毒性はヒトの欠 倱突然倉異 mtDNAによるそれよりは少なく、 ヒトの点突然倉異 mtDNAの毒性ず同 皋床のものであるず思われる。
たたヒトの分裂組織では AmtDNA が蓄積されないのに察し、 本発明のマりスの △ mtDNA4696が分裂組織にも倧量に蓄積しおいた図 2c)。 これは、 マりスの分裂 现胞は AmtDNA4696を蓄積しおも生存できる事を瀺しおいる。
これらのこずから、 本発明のマりスずヒトの AmtDNA の間に認められた子孫ぞ の䌝達ず組織ぞの分垃状況の違いは、 本発明のマりスの AmtDNA4696 がヒトのそ れょリも毒性が匱いこず、 たたはマりスの现胞が゚ネルギヌ欠損に耐性であるた めに、 マりスの卵现胞、 胚、 そしお分裂組織に AmtDNA4696 が倧量に含たれおも 生存するこずができ、 最終的にはマりスの AmtDNA4696 の母性遺䌝ず分裂組織に おける倧量の分垃が可胜になった結果であるず考えられる。
これたでに、 æ ž DNAにコヌドされおいる因子で、 ミ トコンドリアの機胜に関わ る遺䌝子のノックアりトによっおミ トコンドリァ機胜に異垞を持぀マりスの報告 䟋は倚いが、 これらは mtDNA突然倉異によっお匕き起こされる疟患のモデルには なり埗ない。
たた、 最近、 非垞に少量のクロラムプ二コヌル耐性 mtDNAを持぀キメラマり スが報告されおいる。 しかしながら、 このようなキメラマりスは、 倧量にクロラ 5 ムプ二コヌル耐性 mtDNAを持぀雌のタむプの ES现胞を正垞な胚盀胞期の胚に移 怍するこずによっお埗られるもので、 このようなキメラマりスをクロラムプ二 コヌルを甚いお遞択するこずが䞍可胜なので、 クロラムプ二コヌル耐性 mtDNA の割合が急激に枛少し、 最終的には生殖现胞を通しお次の䞖代に䌝達されるこず はなかった。 本明现曞䞭で匕甚した党おの文献は、 そのたた参考ずしお本明现曞䞭に組み入 れるものずする。 産業䞊の利甚可胜性
本発明により、 倉異型 mtDNAを现胞ぞ導入するための有効な方法の提䟛が可胜 ずなった。 たた、 AmtDNA4696 を倉異型 mtDNA ずしお䜿甚するこずにより、 △ mtDNA4696 を有する mtDNAノックァゥトマりスの䜜出が可胜ずなった。 このマり スは AmtDNA の䌝達ず様々な組織での発珟の機構を詳现に研究する䞊で有効なこ ずから、 ミ トコンドリア病の病態モデルずしお掻甚できる。 このマりスはさらに、 突然倉異 mtDNAの蓄積が老化や老化関連疟患の原因になっおいるずいう仮説を怜 蚌するのにも利甚できる。 倚くのミ トコンドリァ病は老化に䌎っお発症するこず から、 われわれはこのマりスが老化するのを埅っおさらに研究をすすめる予定で ある。 さらに、 すべおの幎霢のすべおの病状の進行段階の怜䜓が様々な割合の△ mtDNA を持ったすべおの組織から提䟛できるこずから、 これたでに予想し埗なか ぀た原因䞍明の病気が mtDNAの突然倉異によるものであるこずを蚌明できる可胜 性もある。 そしお、 モデル動物でのみ可胜な治療薬のスクリヌニングや遺䌝子治 療法の確立にも掻甚できる。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 倉異型ミ トコンドリア DNAを有する脱栞した现胞をミ トコンドリア DNA欠損 现胞ず融合させおサむブリツドを䜜補し、 該サむブリツドを脱栞した埌、 生殖现 胞ず融合させるこずを特城ずする、 倉異型ミ トコンドリア DNAの生殖现胞ぞの導 入方法。
2 . 倉異型ミ トコンドリア DNAが欠倱突然倉異ミ トコンドリア DNA4696である、 請求項 1蚘茉の導入方法。
3 . 請求項 2蚘茉の方法によリ䜜補された生殖现胞を仮芪マりスに移怍しお埗ら れるミ トコンドリア DNAノックアりトマりス。
4 . 生殖现胞が前栞期の胚である、 請求項 3蚘茉のミ トコンドリア DNAノックァ ゥ卜マりス。
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