WO2001032899A1

WO2001032899A1 - Methode de transfert de gene

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Publication number: WO2001032899A1
Application number: PCT/JP2000/007373
Authority: WO
Inventors: Takashi Ueno; Hajime Matsumura; Keiji Tanaka; Tomoko Iwasaki; Mitsuhiro Ueno; Kei Fujinaga; Kiyozo Asada; Ikunoshin Kato
Original assignee: Takara Shuzo Co., Ltd.
Priority date: 1999-10-29
Filing date: 2000-10-23
Publication date: 2001-05-10
Also published as: ATE529525T1; US6995010B1; CN1387574A; CN1183257C; EP1225229A4; AU7953900A; EP1225229B1; EP1225229A1; KR20020057975A

Description

明細書遺伝子導入方法技術分野

本発明は、医学、細胞工学、遺伝子工学、発生工学などの分野において標的細胞への遺伝子導入効率を向上させ、標的細胞の形質転換を効率良く行うことを可能にする方法、およびそれに関連する一連の技術に関する。背景技術

多数のヒト疾病についてその機構が解明され、また、組換え D N A技術、および細胞への遗伝子導入技術が急速に進歩したことより、近年、重篤な遺伝病を治療するための体細胞遺伝子治療法のプロトコールの開発が進められている。また、最近では遺伝病のみならず A I D Sのようなウィルス感染症や癌の治療にも遺伝子治療を適用しょうという試みがなされている。

現在一般に使用されているウィルスベクターとしてレトロウィルスベクタ一、アデノウイルスベクタ一、アデノ随伴ウィルス（A A V) ベクタ一等が挙げられる。レトロウイルスベクターは容易に調製でき、標的細胞の染色体 D N Aに外来遺伝子を組込むことができるため、長期にわたる遺伝子発現が望まれる遺伝子治療に有用である。しかし、レトロウイルスベクタ一を使用すると、外来遺伝子が染色体 D N A上のランダムな位置に組込まれるため、癌などを引き起こす可能性を潜在的に持っている。また。レトロウイルスベクターは静止期の細胞には感染することができないため、標的にできる細胞種は限られている。

一方、アデノウイルスベクタ一はその調製法に問題を有していたが、簡便な調製法が開発されている。該ベクタ一は静止期の細胞を含む多くの細胞に高い効率で感染することができる。しカゝし、標的細胞の染色体 D N Aに外来遺伝子を組込む機構を有していないため、通常、外来遺伝子の発現は一過的である。

さらに、 A A Vベクターは静止期の細胞に感染することができ、かつ、外来遺伝子をヒト 1 9番染色体の AA V S 1部位に特異的に組込むという性質を有している。このため、 A A Vベクターを用いて導入された遺伝子は、潜在的な危険なしに細胞中で長期発現されることが期待される。しかし A A Vの調製は煩雑であり、また、細胞に導入することのできる遺伝子の大きさが非常に小さいという実用上の問題を有している。

以上のように、遺伝子治療に使用される従来のウィルスベクタ一はそれぞれに長所、短所を有している。簡便な取り扱い、高い遺伝子導入効率、導入遺伝子の長期にわたる発現を可能とする遺伝子導入方法は知られておらず、このような性質を満たすシステムが望まれていた。

そのようなシステムを開発する試みの一つとして、遺伝子導入効率が高く、高力価のベクタ一の作製が容易であるという利点を有するアデノウイルスベクタ一に、 A A Vの部位特異的な外来遺伝子の組込みに必要な領域を組込み、外来遺伝子を標的細胞の染色体 D N Aに組込むことが出来ないというアデノウイルスべクターの欠点を克服しょうとする試みが挙げられる（例えば、米国特許第 5， 8 4 3 , 7 4 2号参照）。

しかしながら、 A A Vの部位特異的な外来遺伝子の組込みに必要な領域がコードする R e pタンパク質は、アデノウイルスの増殖を阻害するので、該領域を持つアデノウイルスは増殖できない。それゆえ、そのようなベクターの調製は不可能であり、その結果、そのようなベクターによる遺伝子導入は事実上不可能である。

Recchiaらは、 r e p遺伝子を発現させるためのプロモーターに肝細胞特異的なプロモーター _α 1 A Tプロモータ一を用いることで上記問題の解決を試みている（Recchiaら、プロシーディングズォブザナショナルアカデミーォブサイエンシーズォブ U S A (Proceedings of the National Academy of Sciences of USA) 、第 96卷、第 2615〜2620頁（1999) ) 。 α 1 A Tプロモータ一は肝細胞特異的なプロモーターであるので、アデノウイルスベクター作製のためのウィルス産生細胞（プロデューサー細胞）内では働かない。従って、アデノウィルスベクターに含有された r e p遺伝子は発現せず、該アデノウイルスべクタ一の増殖は阻害されない。

しかしながら、 Recchiaらの方法は、 r e p遺伝子を発現させるためのプロモ —ターが肝細胞特異的なプロモータ一であるため、外来遺伝子を染色体 D N A中に組込むことができる細胞種は肝細胞に限定されるという欠点を有している。

従来技術には以上のような欠点があり、遺伝子導入効率が高く、高力価のべクターの作製が容易であり、外来遺伝子の標的細胞の染色体 D N Aへの組込みが可能で、幅広い細胞種に外来遺伝子の導入が可能な方法が望まれている。

発明の目的

従って、本発明の主な目的は、遺伝子導入効率が高く、高力価のベクターの作製が容易であり、外来遺伝子の標的細胞の染色体 D N Aへの組込みが可能で、幅広い細胞種に外来遺伝子の導入が可能な遺伝子導入方法を提供することである。

発明の概要

本発明者らは鋭意研究の結果、例えば C r e / 1 o X P発現制御系のようなリコンビナーゼとリコンビナ一ゼ認識配列を用いた発現制御系を用いることで、外来遺伝子を、幅広い細胞種に導入し、かつその染色体 D N A中に組込むことができることを見出した。即ち、アデノウイルスベクターに含有された r e p遺伝子のウイルス産生細胞中での発現をリコンピナーゼ認識配列に挾まれたスタツファ —配列を挿入することで抑制し、一方、該アデノウイルスベクタ一が導入された標的細胞においてはリコンビナーゼの働きによりリコンビナーゼ認識配列に挟まれたスタッファ一配列が除去されて r e p遺伝子が発現し、同時に標的細胞に導入されている I T Rを配した外来遺伝子を標的細胞の染色体 D N Aに組込むことができる方法を確立し、該方法に使用されるシステムを構築し、発明を完成した。即ち、本発明は、（ 1 ) 目的遺伝子の両側に A A Vの I T Rを配した配列を有する第 1の核酸、（2 ) A A Vの r e p遺伝子とプロモーターの間に 2つのリコンビナ一ゼ認識配列に挟まれたスタッファー配列を配した第 2の核酸、をアデノウィルスベクタ一用いて外来遺伝子を細胞内に導入し、該細胞内でリコンビナーゼの作用により目的外来遺伝子を高い効率で幅広い種類の標的細胞の染色体 D N Aに部位特異的に組込む方法を提供するものである。

詳細には、上記 2種の核酸をリコンピナーゼを発現する標的細胞に導入すると、標的細胞内のリコンビナーゼの働きにより、第 2の核酸上の 2つのリコンピナ一ゼ認識配列に挟まれたスタッファー配列が除去され、 r e p遺伝子が発現する。このようにして発現した R e pタンパク質と第 1の核酸上の I T Rの働きにより、第 1の核酸上の外来遺伝子は標的細胞の染色体 D N Aに組込まれる。

即ち、本発明を概説すれば、本発明の第 1の発明は、外来遺伝子を細胞内に導入する方法に関し、

( a ) アデノウイルスベクターを使用して、

( 1 ) 導入しょうとする目的外来遺伝子の両側にアデノ随伴ウィルス由来 I T Rを配した配列を有する第 1の核酸と

( 2 ) アデノ随伴ウィルス由来の r e p遺伝子および該遺伝子を発現させるためのプロモーターを有し、該 r e p遺伝子と該プロモータ一の間に 2つのリコンピナーゼ認識配列に挟まれたスタッファ一配列が挿入された第 2の核酸

を細胞に導入する工程、

( b ) ( a ) 工程で得られる細胞內でリコンビナーゼの作用により R e pタンパク質を発現させて、目的外来遺伝子を細胞の染色体 D N A中に組込む工程を包含することを特徴とする外来遺伝子導入方法に関する。

本発明の第 2の発明は、外来遺伝子を細胞内に導入するためのシステムに関し、 ( 1 ) 導入しようとする目的遺伝子の両側にアデノ随伴ウィルス由来 I T Rを配した配列を有する第 1の核酸を含有するアデノウィルスべクターと

( 2 ) アデノ随伴ウィルス由来の r e p遺伝子および該遺伝子を発現させるためのプロモータ一を有し、該 _{r e} p遺伝子と該プロモーターの間に 2つのリコンビナーゼ認識配列に挟まれたスタッファ一配列が挿入された第 2の核酸を含有するアデノウィルスベクタ一

とを含むことを特徴とする外来遺伝子導入システムに関する。

本発明の第 3の発明は、外来遺伝子を細胞内に導入するためのシステムに関し、導入しょうとする目的遺伝子の両側にアデノ随伴ウィルス由来 I T Rを配した配列を有する第 1の核酸と、アデノ随伴ウィルス由来の r e p遺伝子および該遺伝子を発現させるためのプロモーターを有し、該 r e p遺伝子と該プロモータ一の間に 2つのリコンビナーゼ認識配列に挟まれたスタッファ一配列が挿入された第 2の核酸とを含有するアデノウィルスベクタ一を含むことを特徴とする外来遺伝子導入システムに関する。

本発明の第 4の発明は、第 1の発明の方法で外来遺伝子を導入した形質転換細胞に関する。

本発明の第 5の発明は、第 2または第 3の発明のシステムを用いて外来遺伝子を導入した形質転換細胞に関する。図面の簡単な説明

図 1 ：部位特異的組込み検出用ドットブロットハイブリダィゼーションの結果を示す図である。

発明の詳細な説明

以下、さらに詳細に本発明を説明する。

アデノウィルスは線状 2本鎖 D N Aウィルスであり、そのゲノム D N Aの大きさは約 3 6 k bで、ゲノム D N Aの両端の 5 ' 末端にはウィルスがコードする末端タンパク質が共有結合して、 D N A—末端蛋白複合体（DNA-terminal protein complex； DNA-TPC) を形成している。

本発明のベクターに用いられるアデノウィルスは特に限定はないが、例えば增殖効率が高く、病原性が軽微なヒトアデノウイルス 2型、 5型を用いることができる。これらのアデノウイルスのゲノムより、ウィルスの複製に関与する E 1領域を欠失した非増殖型アデノウィルスをベクターとして使用する。 E 1領域を欠失したアデノウィルスは増殖能を欠くため、標的細胞内で病的な事態を起こしうるウィルスの増殖を起こさず、安全性の観点から本発明に好適である。

ウィルスのゲノムの欠失はベクターとして機能できる範囲であれば特に限定はなく、前記した E 1領域に加えて、培養細胞でのウィルス増殖には必須でない E 3領域の一部または全部を除去したものも使用できる。

E 1領域を欠失させたアデノウィルス、あるいは E 1領域および E 3領域を欠失させたアデノウィルスは、 E 1領域の遺伝子を持続的に発現するヒト胎児腎由来細胞 2 9 3細胞で増殖させることが出来る。また、副作用の原因となりうる免疫原産生の軽減の観点から、上記した E 1領域、 E 3領域の欠失に加え、さらに E 2領域を欠失したもの、 E 4領域を欠失したものも使用でき、またウィルス遺伝子を完全に除去した gut less adenovirus vector (Parksら、プロシ一ディングズォブザナショナルアカデミーォブサェンシ一ズオフ、' USA (Proceedings of the Nat ional Academy of Sciences of USA) 、第 93卷、第 13565〜13570頁（19%) ) も使用できる。

これらのアデノウィルスは、欠失させた領域にコ一ドされる遺伝子を発現する細胞にて、あるいは欠損させた領域をコ一ドするヘルパーゥィルスと共感染させることで増殖させることができる。

本発明に用いられる第 1の核酸は、導入しょうとする目的外来遺伝子の両側に

A A V (アデノ随伴ウィルス）由来の I T R ( inverted terminal repeat) を配した配列を有する核酸である。この第 1の核酸は特に限定するものではないが、好適にはアデノウィルスベクタ一に組込んで使用される。該核酸にコードされた目的遺伝子は、 A A Vの I T Rおよび後に述べる第 2の核酸より発現される R e pタンパク質の働きにより、標的細胞のゲノムに部位特異的に組込まれる。

I T RはA A Vの1本鎖D N Aの両端に存在する 1 4 5塩基の T字型ヘアピン構造で、宿主であるヒトの第 1 9番染色体の A A V S 1部位へのウィルスゲノムの組込みに必須の配列を含む（平井幸彦ら、実験医学、第 12巻、第 15号、第 1811 〜1816頁、（1994) ) 。本発明に用いられる I T Rは、 A A V S 1部位への組込み活性を有していれば特に限定はなく、置換、欠失、挿入、付カ卩を有するものでめって t>良レ、。

2つの I T Rの間に挿入される外来遺伝子には特に限定はなく、導入を望まれる任意の遺伝子であってよい。例えば、治療の対象となる疾患に関連している酵素やその他のタンパク質をコ一ドする遺伝子、アンチセンス核酸やリボザィム、デコイのような機能的な核酸分子をコードする遺伝子等が挙げられる。これらの遺伝子の起源にも特に限定はなく、該遺伝子が導入される細胞と同種の生物由来のもの、異種の生物由来のもの、化学的に合成されたもの、さらにはこれらの組合わせであっても良い。また、これらの遺伝子にその発現を調節するための適当なプロモーター、ェンハンサーといった調節要素が付加されていても良い。また、 2つの I T Rの間に挿入される目的外来遺伝子のサイズは、特に限定するものではないが、組換えアデノウィルスベクターのパッケージングの観点から、例えば E 1領域および E 3領域を欠失した株の場合、約 7 . 2 k b以下であることが望ましい。また、 gutless adenovirus vectorにおいては 3 7 k b以下であることが望ましい。

本発明の第 1の核酸に使用されるプロモーターは、目的遺伝子を標的細胞内で発現できるものであれば特に限定はなく、例えば、 C A Gプロモーター、 S R a プロモーター、 E F 1 αプロモーター、 CMVプロモーター、 P G Kプロモータ —等が挙げられ、目的に応じて選択することができる。組織特異的プロモータ一を用いれば、組織特異的に目的遺伝子を発現させることができ、例えば肝臓特異的プロモーターである _α 1 A Tプロモータ一を用いれば、肝細胞特異的に、骨格筋特異的 α—ァクチンプロモータ一を用いれば骨格筋特異的に、神経特異的エノラーゼプロモータ一を用いれば神経特異的に、血管内皮細胞特異的 t i eプロモ一ターを用いれば血管内皮細胞特異的に、胃癌特異的 C E Aプロモーターを用いれば胃癌特異的に、 II干癌特異的 A F Pプロモータ一を用いれば肝癌特異的に、それぞれ発現させることができる。

本発明の第 2の核酸は、プロモーター Zリコンピナーゼ認識配列スタツファ —配列 Zリコンピナ一ゼ認識配列 Z A A Vの r e p遺伝子、をこの順序で配列したものである。この第 2の核酸は、特に限定されるものではないが、好適にはァデノウィルスベクタ一に組込んで使用される。該核酸は、前記した第 1の核酸にコ一ドされた目的外来遺伝子を標的細胞の染色体 D N Aに組込むために必要な r e p遺伝子を標的細胞内で発現する核酸である。

該核酸は、プロモーターと r e p遺伝子の間にスタッファー配列が存在するため、リコンビナーゼの存在しないアデノウイルス増殖用の細胞（プロデューサー細胞）内では、細胞傷害性、アデノウィルス増殖阻害活性を有する r e p遺伝子は発現せず、ウィルスを大量に増殖させることができる。一方、リコンビナーゼを発現している任意の標的細胞においては、リコンビナ一ゼによってリコンビナーゼ認識配列に挟まれたスタッファー配列が切り出され、プロモーターと r e p 遺伝子の開始コドンが近接し、 r e p遺伝子の発現が可能となる。 AAVの Re p領域は、 R e p 78、 Re p 68、 Re p 52、 Re p 40の 4種のタンパク質をコードしている。このうち l a r g e R e pと呼ばれる R e p 78タンパク質または R e p 68タンパク質がヒト 1 9番染色体の AAVS 1部位への A A Vゲノムの糸込みに必須である。本発明に使用される r e p遺伝子は、第 1の発明の核酸にコードされた目的外来遺伝子の標的細胞染色体 DNA への組込みを行なう活性を有するものであれば特に限定はなく、例えば前記した Re p 78タンパク質、 R e p 68タンパク質、またはこれらにその活性を失わないような置換、欠失、付加、揷入がなされたタンパク質をコードするものであつても良い。

尚、 R e p 78タンパク質、 R e p 68タンパク質のコード領域には各々 R e p 52タンパク質、 R e p 40タンパク質がコードされている。これら R e p 5 2タンパク質、 R e p 40タンパク質はアデノウィルスの増殖を阻害する活性を有するため、本発明に使用される r e p遺伝子は、部位特異的変異導入法などにより R e p 52タンパク質、 R e p 40タンパク質の発現が起こらないようにしておくのが望ましい。例えば、 R e p 78タンパク質の 225番目のアミノ酸残基をメチォニンからグリシンに改変することで、 R e p 52タンパク質、 Re p 40タンパク質の発現を起こらないようにすることができる。

本発明の第 2の核酸に使用されるプロモータ一としては、標的細胞内で活性を示し、スタッファー配列の除去後に r e p遺伝子を発現させることが可能なものであれば特に限定はなく、目的に応じて適したものを選択することが出来る。第 2の核酸に使用されるプロモータ一は、その発現がプロデューサー細胞においてスタッファー配列の存在のためにほぼ完全に抑制され得るので、プロデューサ一細胞内での発現の有無とは無関係に選択することができる。

例えば、 AA Vの p 5プロモーター、 SRaプロモーター、 EF 1 αプロモーター、 CMVプロモーター、 SV40プロモーター、マウス白血病ウィルス由来の 5' LTRプロモータ一等のウィルス由来のプロモータ一、または CAGプロモーター等のウィルス由来の部分を有するフュージョンプロモーターは組織を問わず多くの細胞種で働くことが知られているため、多くの細胞種をターゲットとする場合に好適である。また、組織特異的なプロモータ一を選択することによって、組織特異的に目的遺伝子を導入することが出来る。アデノウイルスが感染でき、染色体に AA V S 1部位を含む細胞であれば、目的遺伝子を導入する組織または細胞に特に限定はなく、プロモータ一を自由に選択することにより、実質的にあらゆるヒト組織または細胞に目的遺伝子を導入することが出来る。例えば、目的遺伝子を骨格筋に導入する場合には骨格筋特異的 _α—ァクチンプロモータ一、神経に導入する場合には神経特異的エノラ一ゼプロモーター、血管内皮細胞に導入する場合には血管内皮細胞特異的 t i eプロモーター等を選択することが出来る。また、癌細胞を標的として自殺遺伝子を導入する場合などには、胃癌特異的 C E Aプロモータ一、肝癌特異的 A F Pプロモータ一等を選択すれば良い。

本発明のシステムにおいては、 r e p遺伝子の発現が多いほど目的外来遺伝子の染色体 D N Aへの組込み効率が上昇する可能性があるが、同時に標的細胞に対する毒性も上昇する可能性が有ると考えられる。 r e p遺伝子産物である R e p タンパク質の細胞に対する毒性は細胞種によって異なるため、標的細胞によって r e p遺伝子の発現量を至適化する必要があり、そのために標的細胞に応じて最適の発現強度を持つプロモーターを選択すれば良い。例えば、上記したプロモ一タ一、 C A Gプロモータ一、 CMVプロモーター、 S V 4 0プロモーターの発現強度は多くの細胞種において C A Gプロモータ一〉 C MVプロモータ一〉 S V 4 0プロモータ一であることが知られている。それゆえ、例えば、 R e pタンパク質の細胞毒性に対する感受性の高い細胞種を標的細胞に用いる場合には S V 4 0 プロモーター、感受性の低い細胞種を標的細胞に用いる場合には C A Gプロモーター、感受性が中程度の細胞種を標的細胞に用いる場合には CMVプロモータ一を用いることが出来る。

また、 AA Vの p 5プロモータ一は R e pタンパク質の存在下で発現が抑制されるプロモーターであり、このようなプロモーターを用いれば、一旦 r e p遺伝子が発現した後、発現した R e pタンパク質によって p 5プロモータ一の活性が抑制され、 r e p遺伝子の過剰発現が抑えられるため、 R e pタンパク質による毒性を最小に抑えることが出来る。

本発明で使用されるスタッファー配列は、第 2の核酸においてプロモーターと r e p遺伝子の間に介在し、プロモーターによる r e p遺伝子の発現を抑制するための配列である。該スタツファー配列は、プロモータ一との間に介在して r e p遺伝子の発現を抑制するものであれば特に限定はないが、厳密な発現制御の観点から、ターミネータ一配列、ポリ A配列等を含む配列が望ましい。第 2の核酸に使用されるプロモ一ターの発現はスタツファ一配列によってほぼ完全に抑制され得るので、プロデューサ一細胞における効率的な組換えアデノウィルスの生産が期待できる。スタッファ一配列によるプロデューサー細胞内でのプロモーターの抑制は、転写レベルで（例えば、ノーザンブロッテイングもしくは R T— P C Rによって）、またはプロデューサー細胞による,組換えウィルス生産能を測定することによって確^■される。

リコンピナーゼぉよびリコンピナ一ゼ認、識配列を利用した発現性制御系には、 C r e / 1 o X P発現制御系（Kanegaeら、ヌクレイックァシッズリサーチ

(Nucleic Acids Research) 、第 23卷、第 3816〜3821頁（1995) ) 、酵母の 2 μ プラスミド由来 F L Ρ遺伝子がコードするリコンビナーゼ（Broarchら、セル (cel l) 、第 29巻、第 227〜234頁（1982) ) を利用する発現制御系、

Zygosaccharomyces rouxi iの p S R 1プラスミドの R遺伝子にコードされるリコンビナーゼ（Matsuzakiら、モレキュラーアンドセノレラーバイオロジー

(Molecular and Cel lular Biology) 、第 8卷、第 955〜962頁 ( 1988) ) を利用する発現制御系等が挙げられる。本発明に用いられる発現制御系に特に限定はないが、組み換え効率のの観点から、 C r e Z 1 o X P発現制御系が好適である。従って、本発明で用いられるリコンビナ一ゼ認識配列は、リコンビナ一ゼが該配列を認識し、該配列に挟まれた上記スタッファー配列を除去できるものであれは特に限定はなく、例えば C r e / 1 o X P発現制御系における C r eリコンビナーゼ認識配列である 1 o X P配列が挙げられる。

1 o X P配列は、大腸菌 P 1ファージがコードする部位特異的リコンビナーゼ

C r eが認識する配列である（Abremskiら、ジャーナルォブバイオロジカルケミストリ一（Journal of Biological Chemistry) 、第 259卷、第 1509〜1514頁 ( 1984) 、 Hoessら、プロシーディングズォブザナショナルアカデミーォブサイエンシーズォブ USA (Proceedings of the National Academy of Sciences of USA) 、第 81巻、第 1026〜1029頁（1984) 、 Hoessら、ジャーナルォブモレキユラ一バイオロジー（Journal of Molecular Biology) 、第 181卷、第 351〜 362頁（1985) ) 。 C r eリコンビナーゼは、 34塩基からなる 1 o x P配列中の最小単位を特異的に認識し、 2つの 1 o X P配列間で DNAの切断 ·鎖の交換を行なう。即ち、同一分子上に同方向に 2つの 1 o X P配列が存在する場合には、 C r eリコンビナーゼの作用によりその間に挟まれた DNA配列が環状分子となつて切り出される（切り出し反応）。本発明に使用される 1 o x P配列は、 Hoessら、プロシ一ディングズォブザナショナルアカデミーォブサイェンシースォブ USA (Proceedings of the National Academy of Sciences of USA) 、第 81卷、第 1026〜L029頁（1984) に記載の最小単位のみを用いることもできる。

本発明に使用される 1 o X P配列は、 C r eリコンビナーゼが認識し切り出し反応を行なうことが出来るものであれば特に限定はなく、大腸菌 P 1ファージ由来の野生型の 1 o X P配列の他、 C r eリコンビナーゼが認識し、切り出し反応を行なうことができる範囲内で該配列に置換、欠失、付加、挿入がなされた変異配列であっても良い。該変異配列としては、例えば Leeら、ジーン（Gene) 、第 216卷、第 55〜65頁（1998) に記載の 1 ο χ Ρ 22 7 2、 1 ο χ Ρ 5 1 7 1、 1 ο χ Ρ 2 2 7 1、 1 ο χ Ρ 3 1 7 1、 1 o x P 5 2 7 2 1 o x P 5 37 2等が挙げられる。

本発明で使用されるリコンビナ一ゼには特に限定はなく、第 2の核酸のリコンピナ一ゼ認識配列を認識し、切り出し反応を行なうことができるものを選択して使用すれば良い。例えば、 1 o X P配列間のスタッファー配列の切り出しには大腸菌ファージ P 1由来の部位特異的リコンビナーゼである C r e リコンビナ一ゼを使用することができる。本発明で使用されるリコンビナーゼは、リコンビナーゼ認識配列を認識し、 DN A組換え活性を示すものであれば特に限定はなく、例えば、当該活性を示す範囲で野生型リコンビナーゼのアミノ酸配列に置換、欠失、付加、挿入がなされた西己列を有するものであっても良い。また、細胞内での核移行を促進するため核移行シグナルを付加したものも使用できる。

リコンビナーゼを標的細胞内で発現させる方法には特に限定はなく、例えばリコンビナーゼをコードする核酸を細胞内に導入して発現させることができる。該核酸の導入方法には特に限定はないが、遺伝子導入効率が高く、高力価のベクタ —の作製の容易なアデノウィルスベクターを用いた導入法が好適である。

リコンビナーゼ発現用べクタ一に用いられるプロモーターは、リコンビナ一ゼ遺伝子を発現させ、 R e pの発現を誘導し、目的外来遺伝子の組込みを可能にするものであれば特に限定はなく、例えば、 C A Gプロモーター、 S R aプロモ一ター、 E F 1 αプロモータ一、 C MVプロモーター、 P G Κプロモータ一のように様々な組織で活性を持つプロモータ一であつても良く、上記した肝臓特異的プ口モーターである _α 1 A Tプロモーター等のように特定の組織においてのみ働く組織特異的プロモータ一であっても良い。組織特異的プロモータ一を使用した場合、特定の組織の細胞の染色体 D N Aにのみ特異的に外来遺伝子を組込むことが可能である。

標的細胞に目的遺伝子を導入するには、上記した第 1の核酸を含有するアデノウィルスベクターおよび第 2の核酸を含有するアデノウィルスベクターを、リコンビナーゼを発現する細胞に導入する。 2種のベクターの導入は同時に行なっても良いし、別々に行なっても良い。また、第 1の核酸と第 2の核酸の両方を含有する 1種のアデノウイルスベクタ一を細胞に導入しても良い。即ち、第 1の核酸の要素である A A Vの I T Rに挟まれた目的遺伝子と、第 2の核酸の要素であるプロモータ一ノリコンピナ一ゼ認識配列ダスタツファ一配列 Zリコンピナ一ゼ認識配列 ZAA Vの r e p遺伝子を同一のベクタ一上に存在させたアデノウィルスベクターを導入しても良い。

リコンビナーゼを、細胞內に導入されたリコンビナーゼ遺伝子により発現させる場合は、第 1の核酸を含有するアデノウイルスベクタ一、第 2の核酸を含有するアデノウイルスベクター、およびリコンビナーゼ遺伝子を細胞に導入するためのベクターを標的細胞に導入する。 3種のベクタ一の導入は同時に行なっても良いし、別々に行なっても良い。また、第 1の核酸と第 2の核酸は同一のアデノウィルスべクタ一に含有されていても良く、該ベクターとリコンビナーゼ遺伝子を細胞に導入するためのベクターとを組合わせて使用される。また、第 1の核酸とリコンビナーゼ遺伝子が同一のアデノウィルスベクターに含有されていても良い _c 即ち、第 1の核酸の要素である A A Vの I T Rに挟まれた目的遺伝子と、リコンピナ一ゼ遺伝子を同一のベクターに含有させたアデノウィルスベクターと、上記の第 2の核酸を有するアデノウィルスベクタ一とを用いることができる。

標的細胞内で発現したリコンビナ一ゼ、例えば C r e リコンビナーゼは、第 2 の核酸上の 2つのリコンビナ一ゼ認識配列、例えば 1 o X P配列を認識し、切り出し反応によって 2つのリコンビナ一ゼ認識配列に挟まれたスタツファ一配列を除去する。その結果、第 2の核酸上のプロモーターと r e p遺伝子が隣接するようになり、プロモータ一の働きにより r e p遺伝子の発現が起こる。このようにして第 2の核酸より生産された R e pタンパク質の作用により、第 1の核酸の I T Rに挟まれた目的遺伝子が標的細胞の 1 9番染色体の A A V S 1部位に組込まれる。このようにして標的細胞の染色体に組込まれた目的遺伝子は、標的細胞内で安定に保持され、目的遺伝子が長期に渡り安定に発現される。また、 r e p遺伝子発現のためのプロモータ一として任意のプロモーターを用いることができるので、目的遺伝子を任意の細胞で発現させることができる。

本発明に使用されるアデノウイルスベクタ一は、通常のアデノウイルスと同様に容易に高力価のウィルスを調製することができる。本発明のアデノウィルスべクタ一の調製法としては、例えば C O S— T P C法（プロシ一ディングズォブザナショナルザアカデミーォブザサイエンシーズォブザ U S A (Proceedings of the National Academy of the Sc iences of the USA) 、第 93卷、第 1320頁（1996) ) が挙げられる。該方法によれば煩瑣な操作を行なうことなく、高い効率で本発明のべクターを調製することができる。

本発明に使用されるアデノウィルスベクタ一は、アデノウィルスと同様に静止期を含む多くの細胞種に効率よく感染し、そのため様々な組織または細胞に対する遺伝子治療に利用できる。また、 A A Vと同様に部位特異的に外来遺伝子を組込むことができるため、ランダムな位置への組込みによって癌などが引き起こされる危険性なしに、外来遺伝子の長期にわたる発現が可能である。

さらに、本発明に使用されるアデノウイルスベクターにおいては、レトロウイルスべクタ一と異なり任意のプロモーターによって目的外来遺伝子の発現を行なうことができ、また r e p遺伝子の発現も任意のプロモ一ターで行なうことができるので、適用できる細胞種に限定はなく、任意の種類の標的細胞に外来遺伝子を導入することができる。また、 A A Vと異なり大きなサイズの目的外来遺伝子を挿入できる。

即ち、本発明の遺伝子導入方法は、従来のシステムの欠点であった、標的細胞種の限定、非効率的な感染、短期の発現、発現制御の困難性を全て克服した優れたシステムであり、従来の方法の限界により効果が限定されていたあらゆる遺伝子治療に使用でき、顕著な治療効果を期待できる。

本発明の遺伝子導入方法による遺伝子治療の対象になる疾患には、特に限定はなく、先天的に遺伝子に異常が見られる遺伝子病、 A I D Sのようなウィルス感染症、癌の治療に利用できる。本発明の遺伝子導入方法では導入した遺伝子が標的細胞の染色体 D N Aに組込まれるため、外来遺伝子の長期発現が可能であり、例えばアデノシンデァミナーゼ欠損症、筋ジストロフィ一やフエ二ルケトン尿症等、先天的に遺伝子の異常が見られる遺伝病の治療に特に有用である。

また、本発明の遺伝子導入方法は、遺伝子治療のみならず、種々の外来遺伝子を持つ細胞をインビトロで得るためにも有用であり、得られた遺伝子導入細胞は有用物質の生産、疾患モデルの開発等に有用である。

また、本発明の第 1の核酸を有するアデノウイルスベクター、第 2の核酸を含有するアデノウィルスベクターを含有するキットを使用することにより、本発明を簡便に行なうことができる。キット中は、例えば、任意の目的外来遺伝子を組込んだ第 1の核酸を有するアデノウィルスベクタ一を作製するためのコンポーネント、第 2の核酸を含有するアデノウイルスベクターを含み、さらにリコンビナ —ゼ発現用ベクターを含むことができる。また、さらに、アデノウイルス作製用培養細胞（プロデューサー細胞）、培地、細胞培養用プレート等を含んでいても良い。

本発明の遺伝子導入法は、例えば、以下のようにして行なうことができる。第 1の核酸を含有するアデノウィルスベクタ一は以下のようにして作製できる。 A A Vのゲノム D N Aを含むプラスミドより r e p領域、 c a p領域を除去し、ここに導入しようとする外来遺伝子を挿入する。導入する外来遺伝子の由来には特に限定はなく、ゲノムや組換え体から調製したものでも良く、 P C Rによって増幅したものでも良く、あるいは化学合成したものでも良い。このようにして作製されたプラスミドは、外来遺伝子の両側に A A Vの I TRの配列を配した配列力らなる integration unit 持つ。

次に、上記のようにして得られたプラスミドより、制限酵素消化によって上記 integration unitを調製する。得られた integration unitをアデノウイノレスェクスプレツシヨンベクターキット（宝酒造社製、以下、キット 1と呼ぶ）に含まれているコスミド p Ax c w (E l、 E 3遺伝子を欠失したアデノウイルスゲノムのほぼ全長を含むコスミド）の Swa I部位に挿入し、得られた組換えコスミドからキッ卜 1を用いて上記 integration unit, 即ち第 1の核酸を含有する組換えアデノウイルスを作製することができる。

第 2の核酸を含有するアデノウィルスべクターは以下のようにして作製できる。上記の AAVのゲノム DNAを含むプラスミドより、 R e p 78タンパク質をコ一ドする領域を調製する。 R e p 78タンパク質をコ一ドする領域の調製は、上記プラスミドを铸型とした PCR増幅、あるいは上記プラスミドを制限酵素処理することで得ることができる。

このようにして得られた DN A断片上にはアデノウィルスの増殖を抑制する R e p 52タンパク質をコードする領域が含まれているため、該領域の発現を無くすために、部位特異的変異導入法によって R e p 78タンパク質の 225番目のアミノ酸残基のメチォニンに対応する塩基配列 ATGをグリシンに対応する塩基配列 GG Aに改変する。

次に、以上のようにして変異を導入した r e p 78遺伝子断片を、アデノウィルスゲノム、プロモーター 1 o X P酉己列 Zスタッファ一配列ノ 1 o X P配列 Swa Iクローニングサイトを含むコスミド pAxCALNLwの Swa I部位に挿入し、プロモータ一/ 1 o X P配列スタツファー配列 Z 1 o X P配列/変異導入 r e p 78遺伝子断片、即ち第 2の核酸を含有するコスミドを作製する。該コスミドょりキット 1を用いてプロモーター 1 o X P配列/スタッファー配列/ 1 o X P配列 Z変異導入 r e p 78遺伝子断片、即ち第 2の核酸を含有するアデノウィルスを作製することができる。

なお、第 2の核酸を含有するアデノウイルスの作製に使用されるコスミド pA x CALNLwは、 C r 1 o x P発現制御アデノウイルスキット（商品名、 Ad e n o v i r u s C r eZ l o x P— R e g u l a t e d E x p r e s s i o n V e c t o r K i t, 宝酒造社製、以下、キット 2と呼ぶ）に添付のものが使用でき、すなわち、上記キット 1に添付の p Ax C Aw t (上記コスミド p Ax c wに C AGプロモーター配列を挿入したコスミド）の Sw a lサイトに、 1 o X P配列、ネオマイシン耐性遺伝子、 S V 40ウィルスポリ Aシグナル、 1 o X P配列、 Sw a I リンカ一をこの順序で挿入して調製したものが使用ができる。この場合、ネオマイシン耐性遺伝子および SV40ウィルスポリ Aシグナルがスタッファ一配列に相当する。

c r e遺伝子発現のためのアデノウイルスベクターは、上記した第 1、第 2のベクターと同様に、 c r e遺伝子をコスミド p Ax c wの Sw a I部位に挿入し、得られた組換えコスミドからキット 1を用いて作製することができる。あるいは、 Kanegaeら、ヌクレイックァシッズリサーチ（Nucleic Acids Research) 、第 23卷、第 3816〜3821頁（1995) に記載の c r e遺伝子発現用アデノウイルスべクター Ax CANC r eを使用することもできる。該アデノウイルスベクタ一 A x

C ANC r eは上記の C r e/ 1 o x P発現制御アデノウィルスキット（宝酒造社製、キット 2) に添付のものを使用することも出来る。このようにして得られた組換えアデノウィルスの力価測定法は公知であり、例えば上記したキット 1の方法に従って測定することができる。

このようにして得られた 3種類のアデノウィルスベクタ一を常法に従って標的細胞に導入する。この細胞において、まず。 r e遺伝子の発現により C r eリコンビナ一ゼが生成し、 1 o X P配列間のスタッファー配列を除去する。続いて r e p遺伝子の発現により R e pタンパク質が生成し、 I TR間に位置する目的外来遺伝子を当該細胞の染色体 DN A中に組込む。目的の外来遺伝子が標的細胞の染色体 DN Aの AAVS 1部位に部位特異的に組込まれているかどうかは、遺伝子導入標的細胞より調製した染色体 DN Aを铸型として、 integration unitにァニールするプライマーと AAVS 1部位にァニールするプライマーを用いて PC Rを行なうことによって確認することができる。

細胞あたりの特異的組込みの頻度（組込み効率）は、例えば、以下のような方法で測定することができる。

integration unitに薬剤耐性遺伝子（例えばネオマイシン耐性遺伝子）が挿入された第 1の核酸を調製する。この第 1の核酸が、標的細胞の染色体 D N Aへ組込まれた場合には、標的細胞が増殖しても娘細胞は常に薬剤耐性遺伝子を持っており、薬剤耐性を示す。一方、標的細胞の染色体 D N Aへの組込みが起こらなかつた場合には、細胞に導入された薬剤耐性遺伝子は、増殖して生じた娘細胞には保持されず、娘細胞は薬剤感受性となる。従って、薬剤耐性遺伝子が挿入された第 1の核酸を標的細胞に導入した後に薬剤（例えばネオマイシン）を含む培地で長期培養すると、組込みが起こった細胞のみが増殖しコロニ一（薬剤耐性コロニ ―) を形成する。

標的細胞への外来遺伝子の組込み効率は、上記薬剤耐性コロニー数（薬剤耐性コロニー）の、薬剤を含まない培地で長期培養して生じたコロニー数（総コロニ

―) に対する割合として求めることができる。即ち、下記式、

(組込み効率） = (薬剤耐性コロニー） ÷ (総コロニー）

で求めることができる。

ただし、このようにして求められた組込み効率は部位非特異的組込みをも含んでいる。部位特異的組込み効率を求めるには、薬剤耐性コロニーをいくつかピックアップし、特異的組込みか否かを前述の P C Rを用いた方法により確認し、薬剤耐性コロニーに占める部位特異的組込みコロニーの割合を求め、上記組込み効率の値に乗ずることにより、外来遺伝子の標的細胞への部位特異的組込み効率を求めることができる。実施例

以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。実施例 1

組換えアデノウィルスベクターの作製

1 . 1 第 1のべクタ一の作製（第 1の核酸を含有するアデノウイルスベクタ一）

外来遺伝子として i3ガラクトシダ一ゼ遺伝子を含むアデノウィルスベクタ一 A X AAVZを以下のようにして作製した。

配列表の配列番号 1で示される塩基配列を持つ A AVのゲノム DNAを含むプラスミド pAV l (ATCC 372 15) の A V a I Iサイト（配列表の配列番号 1の塩基番号 1 9 1) に、配列表の配列番号 4に塩基配列を有する合成 DN Aと配列表の配列番号 5に塩基配列を示す合成 DN Aからなる 2本鎖 E c o RV リンカーを、 N c o Iサイト（配列表の配列番号 1の塩基番号 4485) に配列表の配列番号 6に塩基配列を示す合成 D N A同士がァニールした 2本鎖からなる 2本鎖 E c o RVリンカ一をそれぞれ揷入し、プラスミド p AV 1 E 5を得た。次にプラスミド p /3 g a 1 (クロ一ンテック社製）を E c o R I、 H i n d i I I消化することにより、 CMVプロモータ一、 ]3ガラクトシダーゼ遺伝子および S Vポリ Aシグナルからなる DNA断片（i3 g a 1発現ユニット）を得た。この断片の末端を DNAブランティングキット（宝酒造）を用いて平滑化し、 pAV 1 E 5の E c o RV部位に挿入した。このようにして得られたプラスミドを B g 1 I I消化し AAVの I TRに挟まれた /3 g a 1発現ユニット（以下、 integration unitと呼ぶ）を調製した。このようにして §られた integration unitをアデノウイルスエクスプレッションベクタ一キット（宝酒造社製、以下、キット 1と呼ぶ）に含まれているコスミド pAx c wの Swa l部位に挿入し、得られた,組換えコスミドカらキット 1を用いて組換えアデノウイルス Ax I TR Zを作製した。

1. 2 第 2のべクタ一の作製（第 2の核酸を含有するアデノウイルスベクタ一）

標的細胞での r e p遺伝子発現のためのアデノウイルスベクタ一 Ax CALN LR e p 78を以下のようにして作製した。

上記したプラスミド pAV lを铸型として、配列表の配列番号 2に示される塩基配列の REPFプライマーおよび配列表の配列番号 3に示される塩基配列の R EPRプライマーを用いて PCR反応を行い、 r e p 78遺伝子を含む配列表の配列番号 1の塩基番号 3 1 3〜 2205の領域を増幅した。 P C R反応は T a k a r a T a q (宝酒造社製）を用いて行なった。

得られた増幅 DNA断片上には r e p 78遺伝子に加えてアデノウィルスの増殖を抑制する r e p 52遺伝子がコ一ドされている。該遺伝子の発現を無くすために、 Re p 78の 225番目のアミノ酸残基をメチォニンからグリシンに改変した。具体的には、プラスミド pAV lを铸型として、配列表の配列番号 1 1に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて Mu t a n S u p e r E x p r e s s i o n Km (宝酒造）にて配列表の配列番号 1の塩基番号 993 〜995の ATGを GGAに改変し、次いで上記のように増幅 D N A断片を得た。以上のようにして変異を導入した増幅 DN A断片を、 C r eZ l o x P発現制御アデノウイルスキット（宝酒造社製、以下、キット 2と呼ぶ）に添付のコスミド p A X C A LN L wの S w a I部位に挿入し、キット 1を用いてアデノウィルス AxCALNLRe p 78を作製した。

1. 3 第 3のべクタ一（c r e遺伝子発現用ベクター）

c r e遺伝子発現のためのアデノウィルスベクタ一 Ax CANC r eは C r e / 1 o x P発現制御アデノウィルスキット（宝酒造社製、キット 2) に添付のものを使用した。実施例 2

He L a細胞（ATCC CCL— 2) を 24ゥエル細胞培養用プレート（岩城硝子）に培養しておいた。細胞の培養は 10%牛胎児血清を含む DMEM培地 (共にバイオウイタカ一社製）を用いて行った。組換えアデノウイルス Ax C A NC r e、 Ax CALNLR e p 78、 Ax I T R Zを単独あるいは組み合わせてキット 1の説明書に従い感染させた。 2日間の培養の後、感染細胞内で integration unitの AAV S 1部位への挿入が起こったか否かを以下のようにして調べた。

感染細胞からゲノム DN Aをキット 1の説明書に示された方法に従って調製し、得られたゲノム DNAを铸型にして、 integration unitにァニールするプライマ一 8 1 (配列表の配列番号 7) と、 AAVS 1部位にァニールするプライマ一 1 722 (配列表の配列番号 8) とを用いて PCRを行った。 PCR産物各 Ι μ ΐ をナイロン膜（ハイボンド Ν、アマ一シャム社製）にスポットし、 D I Gラベリング &デテクシヨンキット（ベーリンガーマンハイム社製）を用いてドットブロットハイブリダィゼーシヨンを行ない、部位特異的組込みが起こっているかどうかを検出した。このときプロ一ブは配列番号 9および配列番号 10にそれぞれ塩基配列を示すプライマー 79、 80を用いて、ヒトゲノム DNAを铸型にして、 PCR D I Gプローブ合成キット（ベ一リンガーマンハイム社製）を用いて作製した。ここで得られたプローブは AAVS 1部位の塩基配列を有するものである。結果を図 1に示す。図 1より明らかなように、 AxCANC r e、 Ax CA LNLR e p 78、 Λ x I T R Z単独で、あるいは 3つの組換えウィルスの内の

2つを組み合わせて感染させた場合には外来遺伝子の部位特異的な組込みは起こらず、 3つの組換えウィルスを共感染させた細胞でのみ部位特異的な組込みが起こっていた。実施例 3

次に、ヒト肺由来細胞株 A549 (ATCC CCL— 1 85) 、ヒト肝臓由来細胞株 H e p G 2 (ATCC HB— 8065) を標的細胞として感染実験を行ない、 He L a細胞以外の細胞への外来遺伝子の導入を試みた。

実施例 1で得られた組換えアデノウイルス Ax CAN C r e、 AxCALNL R e p 78、 A x I T R Zを単独あるいは組合せて実施例 2と同様に感染させ、部位特異的組込みが起こっているかどうかを実施例 2と同様の方法で検出した。その結果、 A549細胞、 H e p G 2細胞の何れの場合においても、 He L a 細胞の場合と同様、 AxCANC r e、 Ax CALNLR e p 78, Ax I TR Z単独で、あるいは 3つの組換えウィルスの内の 2つを組合わせて感染させた場合には外来遺伝子の部位特異的組込みは起こらず、 3つの組換えウィルスを共感染させた場合においてのみ、部位特異的組込みが起こっていた。

このことは、本発明の方法によって He L a細胞のみならず、様々なヒト細胞に対して外来遺伝子の部位特異的組込みが可能であることを示唆している。産業上の利用の可能性

本発明は、高い効率でヒト細胞およびヒト個体に外来遺伝子を導入し、 19番染色体の AAVS 1部位に特異的に組込む外来遺伝子導入方法を提供する。本発明は特に遺伝子治療に有用である。配列表フリーテキスト

SEQ ID NO: 2： PCR primer designated as REPF to amplify Rep78 gene.

SEQ ID NO: 3： PCR primer designated as REPR to amplify Rep78 gene.

SEQ ID NO: 4： EcoRV linker.

SEQ ID NO: 5： EcoRV linker.

SEQ ID NO: 6： EcoRV linker.

SEQ ID NO：7： PCR primer designated as 82 which anneals with integration unit.

SEQ ID NO: 8： PCR primer designated as 1722 which anneals with AAVS1 region.

SEQ ID NO: 9： PCR primer designated as 80 to amplify AAVS1 region used as a probe.

SEQ ID NO: 10： PCR primer designated as 80 to amplify AAVS1 region used as a probe.

SEQ ID NO: 11： Designed oligonucleotide to introduce mutation into Rep78 gene.

Claims

請求の範囲

1 . 外来遺伝子を細胞内に導入する方法であって、

( a ) アデノウイルスベクターを使用して、

( 1 ) 導入しょうとする目的外来遺伝子の両側にアデノ随伴ウィルス由来 I T

Rを配した配列を有する第 1の核酸と、

( 2 ) アデノ随伴ウィルス由来の r e p遺伝子および該遺伝子を発現させるためのプロモータ一を有し、該 r e p遺伝子と該プロモーターの間に 2つのリコンピナ一ゼ認識配列に挟まれたスタッファ一配列が挿入された第 2の核酸

を細胞に導入する工程、

( b ) ( a ) 工程で得られる細胞内でリコンビナ一ゼの作用により R e pタンパク質を発現させて、目的外来遺伝子を細胞の染色体 D N A中に組込む工程を包含することを特徴とする外来遺伝子導入方法。

2 . 第 1、第 2の核酸が同一のアデノウイルスベクタ一によって細胞内に導入されることを特徴とする請求項 1記載の外来遺伝子導入方法。

3 . 第 1、第 2の核酸が別のアデノウイルスベクターによって細胞内に導入されることを特徴とする請求項 1記載の外来遺伝子導入方法。

4 . リコンビナ一ゼが、細胞内に導入されたリコンビナーゼ遺伝子により発現されることを特徴とする請求項 1〜 3いずれか 1項記載の外来遺伝子導入方法。

5 . リコンビナーゼ遺伝子が、アデノウイルスベクタ一によって細胞内に導入されることを特徴とする請求項 4記載の外来遺伝子導入方法。

6 . リコンビナーゼ遺伝子と第 1の核酸が同一のアデノウィルスベクターにより細胞内に導入されることを特徴とする請求項 5記載の外来遺伝子導入方法。

7 . リコンビナーゼ遺伝子が、第 1の核酸および第 2の核酸とは異なるアデノウィルスベクターによって細胞内に導入されることを特徴とする請求項 5記載の外来遺伝子導入方法。

8 . 第 2の核酸のリコンビナーゼ認識配列が 1 o X Pの塩基配列であり、かつ、リコンビナーゼが大腸菌 P 1ファージ由来のリコンビナーゼ C r eであることを特徴とする請求項 1〜 7レ、ずれか 1項記載の外来遺伝子導入方法。

9 . 外来遺伝子を細胞内に導入するためのシステムであって、

( 1 ) 導入しようとする目的遺伝子の両側にアデノ随伴ウィルス由来 I T Rを配した配列を有する第 1の核酸を含有するアデノウィルスべクターと

( 2 ) アデノ随伴ウィルス由来の r e p遺伝子および該遺伝子を発現させるためのプロモーターを有し、該 r e p遺伝子と該プロモーターの間に 2つのリコンビナ一ゼ認識配列に挟まれたスタッファ一配列が揷入された第 2の核酸を含有するアデノウィルスベクター

とを含むことを特徴とする外来遺伝子導入システム。

1 0 . 外来遺伝子を細胞内に導入するためのシステムであって、導入しようとする目的遺伝子の両側にアデノ随伴ウィルス由来 I T Rを配した配列を有する第

1の核酸と、アデノ随伴ウィルス由来の r e p遺伝子および該遺伝子を発現させるためのプロモータ一を有し、該 r e p遺伝子と該プロモーターの間に 2つのリコンピナ一ゼ認識配列に挾まれたスタッファ一配列が挿入された第 2の核酸とを含有するアデノウィルスベクタ一を含むことを特徴とする外来遺伝子導入システム。

1 1 . リコンビナーゼ遺伝子を細胞に導入するためのベクタ一を含むことを特徴とする請求項 9または 1 0記載の外来遺伝子導入システム。

1 2 . リコンビナーゼ遺伝子を細胞に導入するためのベクタ一がアデノウィルスベクタ一であることを特徴とする請求項 1 1記載の外来遺伝子導入システム。

1 3 . リコンビナーゼ遺伝子を細胞に導入するためのベクタ一が、第 1の核酸を含有するアデノウイルスベクタ一と同一であり、かつ、第 2の核酸を含有するアデノウィルスベクターとは異なることを特徴とする請求項 1 2記載の外来遺伝子導入システム。

1 4 . 第 1の核酸を含有するアデノウイルスベクタ一、第 2の核酸を含有するアデノウィルスベクターおよびリコンビナーゼ遺伝子を細胞に導入するためのベクタ一が互いに異なることを特徴とする請求項 1 2記載の外来遺伝子導入システム。

1 5 . 第 2の核酸のリコンビナーゼ認識配列が 1 o X Pの塩基配列であり、かつ、リコンビナーゼが大腸菌 P 1ファージ由来のリコンビナ一ゼ C r eであることを特徴とする請求項 9〜 1 4レ、ずれか 1項記載の外来遺伝子導入システム。

1 6 . 請求項 1〜 8 、ずれか 1項記載の方法で外来遺伝子を導入した形質転換細胞。

1 7 . 請求項 9〜1 5いずれか 1項記載のシステムを用いて外来遺伝子を導入した形質転換細胞。