WO2001031000A1

WO2001031000A1 - Procede visant a une amelioration genetique de levure

Info

Publication number: WO2001031000A1
Application number: PCT/JP2000/007491
Authority: WO
Inventors: Toshihiko Ashikari; Misa Ochiai
Original assignee: Suntory Limited
Priority date: 1999-10-26
Filing date: 2000-10-26
Publication date: 2001-05-03
Also published as: AU7958500A; JP2001120276A; CA2356594A1; ATE456653T1; US6723562B1; DK1142998T3; EP1142998A4; EP1142998A1; JP4231170B2; DE60043772D1; AU784895B2; EP1142998B1; CA2356594C

Description

明細書

酵母の育種方法技術分野

本発明は、酵母の部位特異的組換えを用いて、選択マーカー遺伝子が欠失した形質転換体を作製する方法に関する。この方法を利用することにより、目的とする遺伝子を酵母に導入した後に、選択マーカ一遺伝子を有さず、かつ好ましい形質を導入した酵母の形質転換体を得ることができる。本発明の形質転換方法によつて得られた酵母は、サッカロマイセス属酵母を利用する酒類製造やパン製造、特にビール製造に使用することができる。背景技術

酵母においては、現在までに多くの遺伝子導入方法が報告されているが、遺伝子導入効率が低いため、それらのいずれの方法においても形質転換体を選択するためには選択マーカーが必要である。選択マーカーとしては栄養要求性の回復などがあるが、酵母への栄養要求性の付与は困難である場合が多いため、一般的には抗生物質などの薬剤に対する耐性遺伝子が用いられている。しかしながら、酵母で効率よく利用できる薬剤耐性遺伝子の種類が少ないことから同一株を繰り返し形質転換するためには選択マーカ一遺伝子を取り除き再利用を行うことが望まれる。また、組換え体の実用化における安全性の面などからも、形質転換体から選択マーカ一遺伝子を取り除くことが望ましい。

これらの問題を解決するために形質転換体から選択マーカー遺伝子を除く方法が開発されている。部位特異的な組換えを利用した方法がその一つである。部位特異的組換えは、組換えを行う酵素がその酵素が認識する特異的な塩基配列である 2個の認識配列に作用し、該認識配列間で組換えを引き起こすことにより起こる。これらの組換えは 1対の認識配列の配置により、欠失、挿入、逆位等の現象を引き起こす。部位特異的な組換えとしてパクテリオファージ P1 由来の Cre/lox、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae) 由来の FLP/FRT、醤油酵母 (Zygosaccharomyces rouxii) 由来の R/RS、そして、バクテリオファ一ジ Mu 由来の Gin/gixの 4つが知られている（それぞれは組換えを行う酵素とその酵素が認識する特異的な塩基配列の組合せで示してある）。

出芽酵母は細胞中に 2 mプラスミドと呼ばれる環状 2本鎖 DNAを持つことが知られており、プラスミドには部位特異的組換え機構が存在することが明らかになつている（Broach，J.R.，Guarascio,V.R. and Jayaram,M., Cell, 29, 227-234, 1982) 。 2 / mプラスミドは 6318bpからなる環状プラスミドで、分子中に 599bpからなる 1対の逆向き反復配列を持ち、この逆向き反復配列間で部位特異的組換えをおこすことが知られている。この逆向き反復配列間での組換え部位は、 8bpのスぺ一サー配列と、それを挟む 13bpの 1つのミスマッチを含む短い逆向き反復配列から構成され（FRT配列）、さらに片側には 1個の 13bpの反復配列が続く。部位特異的組換えは、プラスミド自身にコードされた FLP遺伝子より発現される組換え酵素（Flp蛋白質）が、逆向き反復配列内の組換え部位に存在する特異的な塩基配列である FRT配列に作用することによって起こる。なお、 FRT配列としては、 8bpのスぺーサー配列と 13bpの逆向き反復配列からなる 34bpの配列が知られている（J.F.Senecoff, R.C.Bruckner, and M.M.Cox, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 82, 7270-7274, 1985) 。しかしながら、この 34bpの FRT配列を用いて部位特異的組換えを行うと、組換え後に染色体上に組換え酵素の認識配列が残り、目的としない組換えを誘導する可能性があることから実用的ではない。

そこで、組換え後に染色体上に残る認識配列間での組換えを抑える必要があつた。

組換え酵素とその酵素の認識配列による部位特異的な組換えを用いた選択マー力一遺伝子の切り出しについてはいくつか報告されており、たとえば、出芽酵母で FLP/FRT の系を利用した選択マーカ一遺伝子の切り出しが報告されている (F.Storici, M.Coglievina and C.V.Bruschi, Yeast, 15, 271-283, 1999) 。 Storici らは、 kanMX4遺伝子または URA3K1遺伝子を選択マーカー遺伝子とし、 2 mプラスミドをもつ Cir+株の場合には、同方向に繰り返し配置した FRT配列の間に選択マーカ一遺伝子を、一方 2 mプラスミドをもたない Cir^Q株の場合には同様に配置した FRT配列の間に選択マーカ一遺伝子と共に FLP遺伝子を組み込み出芽酵母を形質転換した。得られた形質転換株を非選択培地で培養することにより FRT配列間での組換えを引き起こし、選択マ一カー遺伝子を除去することに成功した。彼らは、 FRT配列のコアの部分（8bpのスぺ一サ一配列部分）に塩基置換を導入すると、同じ塩基置換を持つものどうしの組換えは起こるが別の塩基置換を持つものとの組換えは抑えられることを利用し、繰り返し形質転換と選択マーカ一遺伝子の切り出しを行う際には、そのたびごとに別の塩基置換をもつ FRT配列を利用することにより、染色体上に残る FRT配列間での目的としない組換えを抑えた。しかしながら、彼らの方法では、選択マーカー遺伝子の切り出し効率は 0.01%— 1.39%と非常に低く、選択マーカー遺伝子が除去された株を選択するのは容易ではない。さらに、 FRT配列のコアの部分の塩基置換も数が限られており、何回も利用できるわけではない。

また、出芽酵母で、醤油酵母由来の部位特異的組換えの系である R/RS系を利用した方法が開発されている（特開平 10— 66587号公報）。同公報によると、同方向に繰り返し配置した RS配列の間に選択マーカー遺伝子およびガラクト一スにより誘導できるプロモーターに連結した R遺伝子を組み込み出芽酵母を形質転換した。その際、 R遺伝子と選択マーカー遺伝子とを挟む 1対の RS配列をそれぞれ外側から数塩基欠失させることにより、組換え後に残る RS配列による目的としない組換えを抑えた。しかしながら、この方法では、外来の組換え酵素の遺伝子（R遺伝子）を導入する必要があった。また、形質転換する酵母の株の違いによって選択マーカ一遺伝子の切り出し効率にバラツキがあり、特に実用株である醸造用酵母や野生型酵母では選択マーカ一遺伝子の切り出し効率が低いため選択マーカー遺伝子が除去された株を選択するのは容易ではない。

一方、出芽酵母では高発現させると細胞の増殖を阻害する配列 (増殖阻害配列）があることが報告されている。こうした配列を利用した選択マーカ一遺伝子の切り出しは既に報告されている (M. Kawahata et. al. , Yeast 15, 1-10， 1999) 。 Kawahataらは、同方向に繰り返し配置した大腸菌由来の約 1.2kbの hisG間に、 URA3遺伝子と、ガラクト一スで誘導可能なプロモーターに増殖阻害配列を連結し形質転換に用いた。染色体に挿入後、ガラクト一スを含む培地で培養することにより、 96%以上の効率で選択マーカー遺伝子を除去することに成功した。しかしながら、選択マーカ一遺伝子の切り出しには相同組換えを利用しているため、染色体上に選択マーカー遺伝子の切り出し痕として残る不必要な配列が長く、実用的でない。

そこで、本発明者らは、選択マーカー遺伝子を欠失し、かつ望ましい目的遺伝子を効率よく発現する形質転換体を作製する方法を提供することを課題とした。また、このようにして作製された形質転換酵母の酒類製造やパン製造、特にビール製造への利用を検討することも本発明の課題である。発明の開示

上記課題を解決するために、本発明者らは、 FRT配列と増殖阻害配列を組み合わせることにより、選択マーカー遺伝子を欠失した酵母の形質転換体を作製する方法を見出した。

具体的には、本発明は、

( 1 ) 選択マーカー遺伝子、

( 2 ) ガラクトースで誘導可能な増殖阻害配列、

( 3 ) ( 1 ) と（2 ) とを挟む同方向に配置された 1対の FRT配列、及び

( 4 ) ( 3 ) の両側に配置される酵母染色体 DNA との間で組換え可能な DNA 断片、

からなる DNA構成物であつて、該 FRT配列が次の配列：

5， -GAAGTTCCTATAC TTTCTAGA GAATAGGAACTTC - 3，（配列番号： 1 )

逆向き反復スぺ一サー逆向き反復

配列（1 ) 配列配列（2 ) を含んで成るか又はこれと実質的に同一な配列を含んで成り、但し該 1対の FRT 配列のそれぞれは、間に挟まれた選択マーカー遺伝子と増殖阻害配列から遠位の側の逆向き反復配列において、スぺーサ一配列から遠位の側において少なくとも 1個以上、 6個以下の塩基が欠失していることを特徵とする DNA構成物を提供する。また、本発明は、

( 1 ) 前記 DNA構成物を酵母細胞に導入し、該 DNA構成物に存在する、酵母染色体 DNAとの間で組換え可能な DNA断片と、酵母染色体 DNAとの間の組換えにより、該 DNA構成物を酵母染色体に組み込み、

( 2 ) 該 DNA構成物に含まれている選択マーカー遺伝子の発現により、該 DNA 構成物が導入された酵母細胞を選択し、

( 3 ) 非選択培地で培養し、該 DNA構成物に含まれる 1対の FRT配列間において組換えを起こさせることにより、選択マーカー遺伝子を切除し、

( 4 ) ガラクトースを含む培地で培養し、増殖可能な酵母細胞を選択する、ことを特徴とするサッカロマイセス属酵母の形質転換方法を提供する。

また、本発明は、前記形質転換方法を用いることにより得られたサッカロマイセス属酵母を提供する。

さらに本発明は、前記サッカロマイセス属酵母を用いることを特徴とするビールの製造方法を提供する。

さらに本発明は、前記製法により得られるビールを提供する。図面の簡単な説明

図 1は、野生型 FRT配列を含むプラスミド pPUFRTl-101の構築を示す概略図である。

図 2は、プラスミド pPUFRT3— 103の構築を示す概略図である。

図 3は、実施例 1で作製した DNA構成物に用いた 1対の FRT配列とこれから組換えによって生じる再構成された配列を示す。

図 4は、プラスミド pPUGINFRT3-103の構築を示す概略図である。

図 5 A及び 5 Bは、プラスミド pPPGINFRT3の構築を示す概略図である。図 6は、本発明の DNA構成物を用いた部位特異的組換えによる選択マーカ一遺伝子の除去を示す概略図である。

図 7は、選択マ一カー遺伝子と増殖阻害配列から見て外側にあたる数個の塩基がそれぞれ欠失した 1対の FRT配列を用いることにより、組換え後に残存する配列が FLP遺伝子産物により認識されにくい配列となることを示す概略図である' 発明を実施するための最良の形態

本発明の DNA構成物、及びこれを用いるサッカロマイセス属酵母の形質転換方法の概略を図 6に示す。図 6に示すように、本発明の DNA構成物においては、

( 1 ) 選択マーカ一遺伝子、

( 2 ) ガラクトースで誘導可能な増殖阻害配列（G I N) 、

からなる。

本発明の DNA構成物中の FRT配列は次の配列：

5， -GAAGTTCCTATAC TTTCTAGA GAATAGGAACTTC- 3，（配列番号： 1 )

逆向き反復スぺーサ一逆向き反復

配列（1 ) 配列配列（2 ) を含んで成るか又はこれと実質的に同一な配列を含んで成り、但し該 1対の FRT 配列のそれぞれは、間に挟まれた選択マーカ一遺伝子と増殖阻害配列から遠位の側の逆向き反復配列において、スぺーサー配列から遠位の側において少なくとも 1個以上、 6個以下の塩基が欠失している。欠失している塩基の数は 1対の FRT 配列のそれぞれで同じであっても異なっていてもよい。

すなわち、 1対の FRT配列のうちの、図 6における FRT配列 (a) は、選択マ —カー遺伝子と増殖阻害配列から遠位の側の逆向き反復配列において、スぺ一サ —配列から遠位の側の 1個以上、 6個以下の塩基が欠失している。

また、他方の FRT配列は（図 6における FRT配列 (b)) は、選択マーカ一遺伝子と増殖阻害配列から遠位の側の逆向き反復配列において、スぺ一サー配列から遠位の側の 1個以上、 6個以下の塩基が欠失している。

本発明の DNA構成物中の FRT配列において、上記の意味における欠失することができる塩基数は、スぺーサー配列に隣接する反復配列を構成する塩基（計 1 3個）の内の 1個以上、 6個以下であり、好ましくは 2個以上、 5個以下であり、より好ましくは 3個以上、 5個以下である。塩基が 6個より多く欠失すると、 DNA 組換えの可能性が極めて低くなり好ましくない。

本発明で用いる FRT配列は、配列番号： 1に示す配列を含んで成るが、その一方の側の逆向き反復配列において、上述したように短縮されている。しかしながら、短縮された逆向き反復配列とは反対側の逆向き反復配列では 1 3個の塩基がそのまま維持されていることが望ましく、さらに反復配列が連結されて延長されていてもよい。天然の FRT配列においては、配列番号： 1に示す配列の片側さらに 1個の 1 3 b pの反復配列により延長された構造を有しており、本発明の FRT配列においても、前記のごとく短縮された逆向き反復配列の側とは反対の逆向き反復配列は、天然配列と同様に反復していてもよい。

本発明で用いる FRT配列は、上に定義した配列を有するものの他に、それと実質的に同じ塩基配列を有するものも含まれる。ここで「実質的に同じ配列」とは、 Flpタンパク質によって認識され、 FRT配列間で組換えを起こすことができる配列であり、例えば上記に定義した配列に対して、 1又は数個の塩基の置換、欠失又は付加により修飾されている塩基配列を意味する。

例えば本発明の一例である DNA構成物の構造を示す pPUGINFRT3-103 (図 4 ) では、 1対の FRT配列のうちの、図 4における FRT3 (配列番号： 5 ) は、選択マーカー遺伝子と増殖阻害配列から遠位の側の逆向き反復配列において、スぺ一サ一配列から遠位の側の 5個の塩基が欠失しており、また選択マーカー遺伝子と増殖阻害配列に近位の側の逆向き反復配列は 1 3個の塩基が維持されている。なお、図 4に示す pPUGINFRT3-103において、 FRT3、 FRT103の近くに記載している矢印はその方向性を示しており、具体的には、図 4における FRT3は、図 3における FRT3の 3 ' 側が PRA側にあり、図 3における 5 ' 側が URA3側に挿入されている。また、図 4における FRT103は、図 3における FRT103の 3 ' 側が GIN11M86側にあり、図 3における 5 ' 側が PRA-tail側に挿入されていることを示している。

また、他方の FRT配列は（図 4における FRT103) (配列番号： 6 ) は、選択マーカ一遺伝子と増殖阻害配列から遠位の側の逆向き反復配列において、スぺ

—サー配列から遠位の側の 4個の塩基が欠失しており、また選択マーカー遺伝子と増殖阻害配列に近位の側の逆向き反復配列は 1 3個の塩基が維持されている。上記のごとき 1対の FRT配列を有する DNA構成物に対して、酵母のもつ 2 mプラスミド上の FLP遺伝子により発現される組換え酵素が作用すれば、 DNA の組換えが生ずる。

その結果、選択マーカー遺伝子と増殖阻害配列が除去されると共に、一方の FRT配列（例えば FRT3) の短縮された側の部分と、他方の FRT配列（例えば、 FRT103) の短縮された側の部分とが融合した配列が再構成される。この再構成された配列は、スぺーサー配列の両端に短縮された逆向き反復配列を有しており、例えば FRT3配列と FRT103配列とからは、図 3に示す FRT3W配列（配列番号： 7 ) が生ずる。

下記の実施例で作製した DNA構成物に用いた 1対の FRT配列とこれから組換えによって生じる再構成された配列を図 3に例示する。このうち、 1対の FRT 配列が FRT2と FRT102の組合せ、及び FRT3と FRT103の組合せは本発明の DNA構成物に使用する好ましい 1対の FRT配列である。しかし、 FRT4及び FRT104はそれぞれ、選択マーカー遺伝子と増殖阻害配列から遠位の側の逆向き反復配列において、スぺーサ一配列から遠位の側の 7個の塩基が欠失しており、これを 1対の FRT配列として用いた DNA構成物では組換え効率が低いことが判明した。

実施例 1に示すごとく、スぺ一サー配列を中心にして、一方の側の逆向き反復配列のみが短縮された FRT配列は酵母のもつ 2 プラスミド上の FLP遺伝子産物の作用によって組換えを生ずるが、両側の逆向き反復配列が短縮された場合 (例えば、 FRT3W配列）には FLP遺伝子産物の作用による組換が生じにくくなる。

本発明の DNA構成物では、上記 FRT配列とガラクトースで誘導可能な増殖阻害配列とを組み合わせることにより、選択マーカー遺伝子を切除し、かつガラクトースを含む培地で増殖可能な酵母細胞を選択することが可能となる。

本発明で用いるガラクトースで誘導可能な増殖阻害配列とは、ガラクト一スを含む培地で培養したときに細胞の増殖を阻害する RNA又は蛋白質をコードする配列をいう。例えば、本実施例において使用した GIN11 は、サッカロマイセス酵母の細胞内にで高発現させることにより、細胞の増殖を阻害する DNA断片の一つとして単離された（R.Akada et. al.， Mol. Gen. Genet. 254, 267-274, 1997) 。 GIN11以外にも、高発現させることにより細胞増殖を抑制あるいは阻害する遺伝子あるいは DNA配列を用いることも可能である。例えば、 GIN4、 URA2、 BNI1、 PSP1、 BOIl、 RBP1、 SAC7、 TPK3、 PRKl (R. Akada et al., Mol. Gen. Genet. 254， 267-274, 1997) 、 ACT1、 ARF2、 ATE1、 AUA1、 ERG6、 HSF1、 MCM1、 NHP6A、 NTH1、 RH01、 SEC17、 SIR1、 SRP40 (C. Espinet et al., Yeast, 11, 25-32, 1995) 等が使用できる。

増殖阻害配列を本発明の DNA構成物に組み込むには、 GAL1プロモーターなどの適当なプロモーターに連結して導入する。

選択マーカー遺伝子と増殖阻害配列は 1対の FRT配列に挟まれて存在するが、選択マーカ一遺伝子と増殖阻害配列はどちらが上流側にあってもよい。

また、選択マーカー遺伝子としては、酵母において使用される任意の選択マーカー遺伝子を用いることができ、例えばゲネチシン含有培地で選択可能なゲネチシン耐性遺伝子やその他にセルレニン耐性遺伝子、シクロへキシミド耐性遺伝子等の薬剤耐性選択マーカー遺伝子、あるいは URA3遺伝子、 LEU2遺伝子、 TRP1 遺伝子、 HIS4遺伝子等の栄養要求性に基づく選択マーカー遺伝子を使用することができる。後述する実施例に示すように、本発明においては、栄養要求性に基づく選択マ一力一遺伝子であっても、薬剤耐性に基づく選択マーカ一遺伝子であつても、本発明の DNA構成物に含まれる 1対の FRT配列間において組換えを起こさせることにより、選択マーカー遺伝子を効率よく切除することができた。酵母染色体 DNAとの間で組換え可能な DNA断片は、酵母染色体上の遺伝子の一部分と相同性を有する DNA断片であり、酵母染色体上の遺伝子としては、その遺伝子が破壊されても酵母の増殖が阻害されない遺伝子であって、例えばプ口テアーゼ A遺伝子、リボソーム DNA遺伝子、 C Y C 7遺伝子等、が挙げられる。

本発明では、酵母染色体 DNAとの間で組換え可能な DNA断片と、その近傍にある FRT配列の間に、目的遺伝子が挿入されていることが好ましい。

本発明の DNA構成物は当業者に公知の方法により作製することができ、具体的手法は例えば Sambrook らの Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) に記載のものを用いることができる。

本発明はまた、上記の DNA構成物を用いる、サッカロマイセス属酵母の形質転換方法を提供する。この方法においては、

( 2 ) 該 DNA構成物に含まれている選択マーカ一遺伝子の発現により、該 DNA 構成物が導入された酵母細胞を選択し、

( 4 ) ガラクトースを含む培地で培養し、増殖可能な酵母細胞を選択する。

この形質転換操作は複数回反復することができ、これにより、下記に説明するように、同一の選択マーカー遺伝子を用いて複数の目的遺伝子を酵母の染色体に導入することができる。上記の方法において、 DNA構成物はそれ自体からなる、もしくはそれ自体を含む DNA断片として、又は該 DNA構成物が挿入されたプラスミドの形で酵母細胞中に導入することができる。この導入は、すでに知られている任意の方法、例えば酢酸リチウム法、塩化リチウム法、プロトプラスト法等により行うことができる。

サッカロマイセス属酵母としては、サッカロマイセス ·セレビシェ、サッカロマイセス '力一ルスベンゲンシス、サッカロマイセス 'バイアヌス、サッカロマイセス ·パストリアヌス、サッカロマイセス ·ディアス夕チカス等が使用できる。次いで形質転換体から DNA構成物に含まれている選択マーカー遺伝子を発現させることにより、該 DNA構成物が導入された酵母細胞を選択する。次にこれを非選択培地、例えば完全栄養培地である Y P D培地（グルコース 2 %、ぺプトン 2 %、酵母エキス 2 %) で培養すると、酵母細胞内 FLP遺伝子の発現産物である Flp組換え酵素の働きにより 1対の FRT配列間において組換えを起こす細胞がある。一方、 FRT配列間で組換えがおこらなかった細胞はガラクト一スを含む培地で培養することにより増殖阻害配列の発現が誘導され増殖が阻害される。したがって、ガラクトースを含む培地で増殖できる細胞は染色体上に挿入された FRT配列間で組換えがおこり、その間に挿入されていた選択マーカー遺伝子および増殖阻害配列が除去されたものである。これによつて、好ましい酵母形質転換体であって、かつ選択マーカー遺伝子が除去された酵母細胞を得ることができる。本発明の方法では、同方向に配置した FRT配列の間に発現可能な選択マーカ —遺伝子とガラクト一スで誘導可能な増殖阻害配列を配置した DNA構成物、例えば DNA断片、プラスミド、その他のベクター等を用いて形質転換を行うが、その際、前記のごとく定義される 1対の FRT配列を用いることにより、組換え後に残存する配列が FLP遺伝子産物により認識されにくい配列になり、目的としない組換えを誘導する可能性が低減し、形質転換体から選択マーカー遺伝子を特異的に除去し、目的とする形質転換体を得ることができる（図 7参照）。本発明では上述したように、 FLP遺伝子は酵母自体の 2 / mプラスミド上に存在するために、外来の組換え酵素の遺伝子を導入する必要がない。

本発明の方法を用いることにより、後代をとつたり、再度の形質転換や交配などの操作を伴うことなく、選択マ一カー遺伝子の除去が可能となった。また、選択マーカー遺伝子に関する安全性評価を省略することも可能になり、開発期間を短縮でき、開発コストも低減することができる。さらに、選択マーカー遺伝子が欠失した形質転換体を用いて、再び同じ選択マーカー遺伝子を用いた形質転換が可能となり、複数の遺伝子を繰り返し導入することも可能となる。本発明の方法は、例えば有用な蛋白質をコードする目的遺伝子を酵母の染色体に導入する場合に、次のようにして用いることができる。

本発明の DNA構成物においては、前記のごとく配置された 1対の FRT配列を含んで成る DNA断片の両端に、 1対の FRT配列を挟むように、酵母染色体 DNA との間で組換え可能な DNA断片（酵母染色体組換え領域と称する場合がある）が直接に又は間接に連結されている。 FRT配列と右又は左ボーダーとが間接的に連結されている場合には、それらの間に酵母の染色体に組み込むべき目的とする遺伝子が挿入されている（図 6を参照のこと）。この DNA構成物が酵母に導入 1/31000 P JP

されれば、この DNA構成物の酵母染色体組換え領域と酵母の対応する染色体遺伝子との間で組換えが生じ、 DNA構成物が全体として酵母染色体 DNAに組み込まれる。

次に、この酵母を培養すれば酵母自体の 2 mプラスミド上の FLP遺伝子産物が生産され、これが FRT配列に作用して、 1対の FRT配列間で前記のごとき部位特異的組換えが生じ、これら 1対の FRT配列に挟まれた領域（選択マーカ一遺伝子及び増殖阻害配列を含む領域）が除去され、組換えにより融合した（両端が短縮された） FRT配列と酵母染色体組換え領域との間の目的遺伝子が酵母染色体遺伝子に組み込まれたまま残る。そして、上記の両端が短縮された FRT配列はもはや組換えを生じないから、挿入された目的遺伝子は酵母染色体中に安定に維持される。

すなわち、本発明によれば、目的遺伝子が酵母染色体に挿入された後選択マーカー遺伝子（及び増殖阻害配列）が除去され、且つ FRT配列が機能できなくなる。従って、目的遺伝子を 1回導入した後、同じ選択マーカー遺伝子を含有する遺伝子導入用べクタ一（本発明の DNA構成物）を用いて、さらなる目的遺伝子の導入を行うことができる。

本発明はさらに、このような方法を用いて、目的遺伝子が安定に導入された酵母を用いることを特徴とする酒類、特にビールの製造方法を提供する。目的遺伝子としてはビールの品質や醸造工程を改良するための種々の遺伝子であってよレ^ 例えば、ビール醸造では酵母の代謝により好ましくない香味（オフフレーバー）が生成される。それらの生成量は醸造用酵母の特定の遺伝子発現を調節することにより、低減もしくは消失させることが可能となる。例えば、ビールのオフフレ一バーの例として硫化水素や VDK (ダイァセチルと 2，3-ペン夕ジオン）が挙げられる。硫化水素は硫黄同化経路の中間代謝物であって、一般的なビール酵母を用いた場合はビール醸造中での発生を押さえることは困難である。ところが、遺伝子組換技術を利用し、ビール酵母の MET25遺伝子を高発現させることにより、ビール醸造中の硫化水素の発生が抑えられることが報告されている（特開平 7- 303475号公報）。オフフレーバーのもう一つの例である VDKは分枝アミノ酸合成経路の中間代謝物であり、この場合も遺伝子組換技術を利用して酵母の ILV5 遺伝子を高発現させることにより、 VDKの発生が抑えられることが報告されている（S.M. Mithieux and A.S. Weiss, Yeast 11:311-316, 1995) 。

上述したように、遺伝子組換技術を用いてオフフレーバーの生成を抑えた酵母の育種は文献上いくつか知られているが、実ブラントを用いて商業生産に利用されているものは皆無である。このようにせっかく育種された有用酵母が商業生産で利用されない一因として遺伝子組換酵母の DNA中に存在する選択マーカー遺伝子や酵母以外の微生物に由来する DNA断片の存在がある。

本発明では、選択マーカー遺伝子やその他の不要な DNA配列の両端に FRT配列を挿入することにより、形質転換後には不要な配列を除去することが可能となる。その結果、選択マーカー遺伝子の再利用が可能となり、選択マーカー遺伝子の種類が少ないビール酵母に複数個の遺伝子が導入できるようになることから、ビール酵母の育種の幅が格段に広がる。例えば、先に別々の育種例として示した ILV5遺伝子と MET25遺伝子を同じ酵母細胞に別々に入れることが可能になり、硫化水素と VDKの両方の生成を抑えた酵母の育種へとつながる。また、本発明により得られる形質転換ビール酵母はビール酵母以外の DNA配列を含まないことから、安全性の点で社会的受容も受けやすく、その結果、商業生産での利用が可能になる。

本発明がオフフレーバー除去の酵母育種だけでなく、醸造の効率化などの他の育種にも利用できることは明白である。例えば糖 (Y. Kodama, J. Am. Soc. Brew. Chem. 53:24-29, 1995) やアミノ酸のトランスポー夕一を遺伝子組換により強化することにより、発酵速度の向上が可能であり、また、浸透圧やアルコールなどのストレスに対する抵抗性を遺伝子工学的に付与することにより、高濃度のアルコールが製造できるようになることから効率的な醸造が可能になる。このような育種に本発明を利用することにより、オフフレーバー除去で記載したのと同じ効果が期待できる。

本発明では、 1倍体酵母のみならず、醸造用の 2倍体酵母においても選択マー力一遺伝子の除去を効率よく行うことが確認され、実際のビール製造への利用が期待できる。

【実施例】以下に本発明を実施例に基づいて詳細に説明するが、これらの実施例は例示を目的として提供されているだけであって、本発明の範囲を限定することを意図しているものではない。実験の手順は特に記述しない限り、 Sambrook らの Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) ίこ従つ /こ。実施例 1 ： FRT配列を利用した選択マーカー遺伝子の切り出し効率の検討

( 1 ) 野生型 FRT配列を含むプラスミドの構築

FRT配列をプラスミドに導入するために以下の 4種類のオリゴヌクレオチドを合成した（下線部が野生型 FRT配列）。

FRTl-a

5'-TCGACGAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCG -3' (配列番号： 1 1 )

FRTl-b

5'-AATTCGAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGCXAACTTCCT- 3' (配列番号： 1 2 )

FRT101-a

5'-AGCTTGAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATACxCxAACTTCCxCATG-3' (配列番号： 1 3 )

FRT101-b

5'-CGAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTCA-3' (配列番号： 1 4 ) これらの合成 DNAの末端をリン酸化したのち、 FRTl-aと FRTl-b、 FRT101-a と FRT101-bをそれぞれアニーリングし、前者を pUC18 (東洋紡績株式会社）の制限酵素 EcoRI-Sallサイトに、つづいて後者を制限酵素 SpM-Hindlllサイトに挿入し、プラスミド pFRTl-101 (図 1 ) を構築した。

選択マーカ一遺伝子には、 URA3遺伝子を用いた。 URA3 遺伝子をもつ株は Ura+の形質で選択でき、一方 URA3遺伝子の除去された ura3株は、 5-フルォロォロチン酸耐性で選択が可能であり、 ura3株を宿主とすれば、選択マーカ一遺伝子 URA3を有する株、除去された株ともに容易に判定できる。 ·

別途、 pUC18を制限酵素 EcoRI及び Sphlで消化し、 Blunting Kit (宝酒造（株）製）で末端を平滑化したのちセルフライゲーションを行うことにより連結し、 pUC18HSpを構築した。この制限酵素 Hindlllサイトに YEp24 (Botstein,D.,et al.， Gene, 8,17,1979)の URA3遺伝子を含む 1.2kbの制限酵素 Hindlll断片を揷入し、 pURA34を構築した。（図 1) 。

pFRTl-101を制限酵素 Sphlで消化後、 Blunting Kit (宝酒造（株）製）で末端を平滑化したのち、 pURA34を制限酵素 Hindlllで消化後 Blunting Kit (宝酒造（株）製）で末端を平滑化して得た約 1.2kb の断片と連結し、プラスミド PURA3FRT1-101 (図 1 ) を構築した。

PURA3FRT1-101を制限酵素 EcoRIと Hindlllで処理して得られる約 1.2kb の DNA断片と pPRACerll (図 1 ) を EcoRIと Hindlllで処理して得られる約 4.2kb の断片を連結しプラスミド pPUFRTl-101 を構築した（図 1 ) 。なお、 pPRACerllは、 pBluescript SK+ (東洋紡（株））に、 pHMl53から切り出した Hindlll-Sall断片（J. Bacteriol., 172, 610-618, 1990)と、 gap terminatorと gap promoter (Appl. Microbiol. Biotechnol., 32, 129-133, 1989) に挟まれた Cer耐性遺伝子（PDR4の約 1.7kbの Dral-Kpnl断片として得た： Gene, 101, 149-152, 1991) と、プロテアーゼ A遺伝子（PRA) としてプラスミド CBZ1の SacI-EcoRI 断片及び Hindlll-Xhol断片（Mol. Cell. Biol., 6, 2500-2510, 1986) とを揷入することによって構築した。

( 2 ) 選択マ一カー遺伝子から見て外側にあたる数塩基が野生型 FRT配列と比較し欠失した FRT配列を含むプラスミドの構築

次に、 pPUFRTl-101の野生型 FRTを、合成 DNAにより作成された種々の長さの FRT配列に置き換えたプラスミドを作成する。用いた合成 DNAの配列は以下に示す通りである。

FRT2-a： 5'-CTAGAGAATAGGAACG-3' (配列番号： 1 5 )

FRT2-b： 5'-AATTCGTTCCTATTCT-3' (配列番号： 1 6 )

FRT102-a： 5'-AGCTTGTTCCTATACTTT-3' (配列番号： 1 7 )

FRT102-b： 5'-CTAGAAAGTATAGGAACA-3' (配列番号： 1 8 )

FRT3-a： 5'-CTAGAGAATAGGAG-3' (配列番号： 1 9 )

FRT3-b： 5'-AATTCTCCTATTCT-3' (配列番号： 2 0 ) FRT103-a： 5'-AGCTTTCCTATACTTT-3' (配列番号： 2 1 )

FRT103-b： 5'-CTAGAAAGTATAGGAA-3' (配列番号： 2 2 )

FRT4-a： 5'-CTAGAGAATAGG-3' (配列番号： 2 3 )

FRT4-b： 5'-AATTCCTATTCT-3' (配列番号： 2 4 )

FRT104-a： 5'-AGCTTCTATACTTT-3 (配列番号： 2 5 )

FRT104-b： 5'-CTAGAAAGTATAGA-3' (配列番号： 2 6 )

上記の配列は合成 DNAの 5'末端をリン酸化したのち、 FRT2-aと FRT2-bと FRT102-aと FRT102-b、 FRT3-aと FRT3-bと FRT103-aと FRT103-b、 FRT4-a と FRT4-bと FRT104-aと FRT104-bの組み合わせでァニーリングし、それぞれ pUC18の EcoRI-Hindlllサイトに挿入し、プラスミド pFRT2w、 pFRT3w (図 2 ) 、 pFRT4wを構築した。なお、上記工程ではそれぞれ 4種の合成 DNAをァ二一リングして、両端が欠失した W配列を作製してプラスミドに挿入したが、例えば FRT3-aと FRT3-bと FRT103-aと FRT103-bの組み合わせで得られる W配列を以下に示す。

3b 103b

3W 5' -AATTCTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAA-3'

3' -GAGGATAAGAGATCTTTCATATCCTTTCGA-5'

3a 103a これらプラスミド (pFRT2w、 pFRT3w、 pFRT4w) の Xbalサイトにプラスミド PURA3FRT1-101を Xbalで処理して得られる約 1.2kbの断片をそれぞれ挿入し、プラスミド pURA3FRT2-102、 pURA3FRT3-103 (図 2 ) 、 pURA3FRT4-104 を構築した。これらのプラスミドは同じ向きに並べた 1対の FRT配列の間に選択マーカー遺伝子 URA3が配置されており、各々の FRT配列は、選択マーカー遺伝子から見て外側にあたる数残基が野生型 FRT配列と比較し欠失したものである。

このようにして得られた FRT配列およびその組み合わせで切り出し後に生じる FRT配列を図 3にまとめた。これらのプラスミドをそれぞれ EcoRIと Hindlllで処理して得られる約 1.2kb の断片と pPRACerllを EcoRIと Hindlllで処理して得られる約 4.2kbの断片を連結し、プラスミド pPUFRT2— 102、 pPUFRT3— 103 (図 2 ) 、 pPUFRT4- 104を構築した。

( 3 ) In vivoにおける組換え頻度の検討

一倍体酵母として R27-7C-1C株 (MAT o; trpl leu2 his3 ura3)を用いた。酵母の形質転換はリチウムクロライドを用いた方法（Kodama,Y.， et al.， J. Am. Soc. Brew. Chem.,53, 24-29, 1995) により行うことが可能である。

pPUFRTl-101, pPUFRT2— 102、 pPUFRT3_ 103、 pPUFRT4— 104、それぞれ約を Kpnlと Saclで処理し、エタノール沈殿後、 10 1の TE緩衝液に溶解してその全量を酵母の組換えに使用し、 Ura+に形質転換した株を選択した。すなわち、 Ura—選択培地（Yeast Nitrogen Base [(NH₄)₂SO₄](DIFCO社)、ダルコ —ス 2 %、ロイシン 0.01%、トリプトファン 0.01% 1、寒天 2 %) に上記形質転換操作をした酵母を塗布し、 30 で 72時間ィンキュベートする。

こうして得られた形質転換株を YPD液体培地で 30 で一寸晩培養し、 R27-7C- 1C株のもつプラスミド上の FLP遺伝子より発現される組換え酵素による、染色体上に導入した 2個の FRT配列間での組換えを誘導した。

培養液を無菌水で適当に希釈し、そのうち 100 1を YPD寒天培地および 5- フルォロォロチン酸を含む寒天培地（Yeast Nitrogen Base [(NH₄)₂SO₄](DIFCO 社)、グルコース 2 %、ゥラシル 0.005%、ロイシン 0.01%、トリプトファン 0.01%、 5-フルォロォロチン酸 0.1%、寒天 2 %) にそれぞれ塗布し、 30 で 48時間培養したのち、出現したコロニーの数を数えた。 5-フルォロォロチン酸を含む培地で増殖できる細胞が組換えが起こった細胞である。結果を表 1に示した。

【表 1】

FRT配列組換え頻度

FRT1- FRTIOI (野生型) 1/3 - \/1

FRT2-FRT102

FRT3-FRT103 1/10⁵ - 1/10⁶

FRT4-FRT104 < l /W 表 1に示す通り、 in vivoにおける組換え効率は、野生型 FRT配列の組み合わせでも 1ノ2以下であり、欠失が多くなるにしたがってその頻度が急激に低下することが分かった。実施例 2： FRT配列と GIN11を組み合わせた選択マ一カー遺伝子の切り出し効率の検討

( 1 ) プラスミド pPUGINFRT3-103の構築

GIN11を有するプラスミドを作製するために、 2種類のオリゴヌクレオチドを合成した。

GIN-1： 5'- TGGATCCGGAATTTCGACGGATCAATAAC-3' (配列番号： 2 7 ) GIN-2 ： 5'-TTCTGCAGACTAGATGCACTCATATCATTATGCAC-3' (配列番号 ·· 2 8 )

これらのオリゴヌクレオチドをプライマーとし、プラスミド pAUR135 (宝酒造（株））を铸型として PCRを行うことにより得られた約 0.7kbの断片を BamHI と Pstlで処理し、 pHM999 (特開平 10— 66587号公報）を EcoRIと BamHIで処理して得られる GAL1プロモー夕一を含む約 0.8kbの断片とともに、 pUC19 の EcoRI-Pstlサイトに挿入することにより、 GIN11M86 (宝酒造（株）製）を GAL1プロモーターに連結したプラスミド pPGALlGIN (図 4 ) を作製した。これを EcoRIと Pstlで処理して得られる約 1.5kbの断片の末端を Blunting Kit (宝酒造（株）製）で平滑化したのち、 pPUFRT3-103の Smalサイトに挿入し、プラスミド pPUGINFRT3-103を得た。（図 4 )

( 2 ) 研究室株を用いた選択マーカー遺伝子の除去

一倍体酵母として R27-7C-1C株 (MAT a trpl leu2 his3 ura3)を用いた。プラスミド pPUGINFRT3-103を Kpnlと Saclで処理して得られる約 4.1kbの DNA 断片（約 10 g) を酵母の組換えに使用し、形質転換体の Ura+の形質により選択した。

得られた形質転換体を非選択培地で培養すると細胞内にある Flp組換え酵素の働きによって FRT配列間で組換えをおこす細胞がある。一方、 FRT配列間で組換えがおこらなかつた細胞はガラクトースを含む培地で培養することにより

GIN11M86の発現が誘導され増殖が阻害される。したがって、ガラクトースを含む培地で増殖できる細胞は染色体上に挿入された FRT配列間で組換えがおこり、その間に挿入されていた選択マ一力一遺伝子および GAL1プロモーターに連結された GIN11M86が除去されたものである。

得られた形質転換体を 10mlの YPGal (ペプトン 2 %、酵母エキス 1 %、ガラク！ ^一ス 2 %) 液体培地にて 30 ：、 24時間培養し、 FRT配列間での組換えをおこすとともに、 GIN11M86 の発現を誘導した。培養液を適当に希釈し、 YPGal 寒天培地に塗付し 30でで 48時間培養した。得られたコロニーのうち 100株を 5- フルォロォロチン酸寒天培地および Ura—選択寒天培地で 30で、 48時間培養した。その結果、すべての株が Ura選択寒天培地でのみ生育できなかった。つまり、 YPGal寒天培地で生育できた株は、すべて URA3遺伝子が除去されたことを示している。実施例 3 ：薬剤耐性選択マーカー遺伝子の除去

( 1 ) プラスミド pPPGINFRT3の構築

選択マーカー遺伝子として PDR4 (セルレニンおよびシクロへキシミド耐性遺伝子）を用い、ガラクト一スにより誘導される GAL1 プロモーターにつないだ GIN11M86とともに部位特異的組換え配列（FRT3，FRT103) で挟んだ。プラスミド pPGALlGINを制限酵素 EcoRIで処理し Blunting Kit (宝酒造（株））で末端を平滑化したのち制限酵素 Pstlで処理して得られる約 1.5kb の断片を、プラスミド pFRTl-101の HincII-Pstlサイ卜に挿入し、プラスミド pFRTlGIN (図 5 A) を構築した。 pFRTlGINを制限酵素 Xbalで処理して得られる約 1.5kb の断片を pFRT3wの Xbalサイトに挿入し、プラスミド pFRT3-103-GINを得た（図 5 A) 。

pPRACerllを Sphlと Sailで処理して得られる約 2.7kbの断片を pUC18の Sphl-Sallサイトに揷入したあと Sailで処理し、 Blunting Kitで末端を平滑化して pPstlリンカ一（東洋紡績（株））を挿入しプラスミド pPGAPDHPDR4を構築した（図 5 A)。 pPGAPDHPDR4を Sphlと Pstlで処理して得られる約 2.7kb の断片を pFRT3-103-GIN の Sphl-Pstlサイトに揷入し、プラスミド pFRT3- 103-GINPDR4を構築した（図 5 B ) 。これを EcoRIと Hindlllで処理して得られる約 4.2kbの断片と pPRACerllを EcoRIと Hindlllで処理して得られる約 4.2kbの断片を連結し、プラスミド pPPGINFRT3 (図 5 B ) を構築した。

このプラスミドでは FRT3と FRT103の間に、ガラク I スで誘導できるプロモーターに連結された GIN11 と、酵母の構成的なプロモーターの一つであるグリセロアルデヒド 3リン酸脱水素酵素のプロモーターに連結された PDR4遺伝子が挿入されている。

( 2 ) 研究室株を用いた選択マーカー遺伝子の除去

プラスミド pPPGINFRT3約 10 gを制限酵素 Kpnlと Saclで処理し、エタノール沈殿後、 10 1の TE緩衝液に溶解してその全量を形質転換に使用した。宿主として一倍体 R27-7C-1C株を用い、リチュウムクロライドを用いた方法により形質転換した。その後、 l g/mlのシクロへキシミドを含む YPDプレートに塗付し、 30でで 2日間培養してシクロへキシミド耐性株を選択した。

選択マーカ一遺伝子を切り出すために YPGal液体培地 10mlに形質転換株を 1 白金耳植菌し、 30でで 24時間振とう培養した。適当に希釈したあと YPGalプレ一卜に塗付し 30 で 2日間培養した。得られたコロニーを任意に 100株選択し、シクロへキシミドを含む YPDプレートにレプリカしてシクロへキシミド耐性を調べた。

その結果、 100株中 100株がシクロへキシミド感受性であり、これらの株では部位特異的組換えにより選択マーカ一遺伝子が切り出されたと考えられる。

( 3 ) 醸造用酵母を用いた選択マーカー遺伝子の除去

( 3 - 1 ) 1回目の形質転換と選択マーカ一遺伝子の除去

形質転換体の作出は研究室株を用いた場合と同じ方法で行った。宿主としては 2倍体の野生型酵母 AY-1株（MAT a/ a野生型）を用いたが、二倍以上の倍数を持つ酵母であればいずれの酵母を用いても良い。

得られた形質転換体のコロニーを 10mlの YPGal液体培地に 1白金耳植菌し、 30 で 24時間培養した。適当に希釈したあと YPGalプレートに塗付し 30でで 2 日間培養した。得られたコロニーを任意に 100株選択し、 l g/mlのシクロへキシミドを含む YPD寒天培地にレプリカしてシクロへキシミド耐性を調べた。その結果、 100株中 100株がシクロへキシミドを含む寒天培地では生育できず、これらの株では部位特異的組換えにより選択マーカー遺伝子が切り出されたと考えられる。

( 3 - 2 ) 2回目の形質転換と選択マーカー遺伝子の除去

上記操作によって得られた形質転換後に選択マーカー遺伝子が除去された株から 1株をもとに、 2回目の形質転換を行った。形質転換および選択マーカ一遺伝子の除去操作は 1回目と同様に行った。

その結果、 100株中 100株がシクロへキシミドを含む寒天培地では生育できず、これらの株では部位特異的組換えにより選択マーカ一遺伝子が切り出されたと考えられる。

Claims

請求の範囲 (1) 選択マーカー遺伝子、 (2) ガラクトースで誘導可能な増殖阻害配列、 (3) (1) と（2) とを挟む同方向に配置された 1対の FRT配列、及び(4) (3) の両側に配置される酵母染色体 DNA との間で組換え可能な DNA 断片、からなる DNA構成物であつて、該 FRT配列が次の配列： 5， -GAAGTTCCTATAC TTTCTAGA GAATAGGAACTTC - 3，（配列番号： 1 ) 逆向き反復スぺ一サー逆向き反復配列（1) 配列配列（2) を含んで成るか又はこれと実質的に同一な配列を含んで成り、但し該 1対の FRT 配列のそれぞれは、間に挟まれた選択マーカー遺伝子と増殖阻害配列から遠位の側の逆向き反復配列において、スぺーサー配列から遠位の側において少なくとも 1個以上、 6個以下の塩基が欠失していることを特徵とする DNA構成物。 2.酵母染色体 DNAとの間で組換え可能な DNA断片と、その近傍にある FRT 配列の間に、目的遺伝子が挿入されている、請求項 1に記載の DNA構成物。 3. サッカロマイセス属酵母の形質転換方法において、

(1) 請求項 1記載の DNA構成物を酵母細胞に導入し、該 DNA構成物に存在する、酵母染色体 DNAとの間で組換え可能な DNA断片と、酵母染色体 DNAとの間の組換えにより、該 DNA構成物を酵母染色体に組み込み、

(2) 該 DNA構成物に含まれている選択マーカー遺伝子の発現により、該 DNA 構成物が導入された酵母細胞を選択し、

(3) 非選択培地で培養し、該 DNA構成物に含まれる 1対の FRT配列間において組換えを起こさせることにより、選択マーカー遺伝子を切除し、

(4) ガラクトースを含む培地で培養し、増殖可能な酵母細胞を選択する、ことを特徴とするサッカロマイセス属酵母の形質転換方法。

4 ·酵母染色体 DNAとの間で組換え可能な DNA断片と、その近傍にある FRT 配列との間に目的遺伝子が揷入されている DNA構成物を用い、該目的遺伝子を酵母染色体に挿入することを特徴とする、請求項 3記載のサッカロマイセス属酵母の形質転換方法。

5 . 請求項 4記載の方法を複数回行うことにより、複数の目的遺伝子を導入することを特徴とする、請求項 4記載のサッカロマイセス属酵母の形質転換方法。

6 . 請求項 3〜 5のいずれかに記載の方法によつて形質転換されたサッカロマイセス属酵母。

7 . 請求項 6記載のサッカロマイセス属酵母を用いることを特徴とするビールの製造方法。

8 . 請求項 7の方法により得られるビール。