WO2001016316A1 - Proteine recepteur couplee a une proteine g et adn correspondant - Google Patents

Proteine recepteur couplee a une proteine g et adn correspondant Download PDF

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WO2001016316A1
WO2001016316A1 PCT/JP2000/005684 JP0005684W WO0116316A1 WO 2001016316 A1 WO2001016316 A1 WO 2001016316A1 JP 0005684 W JP0005684 W JP 0005684W WO 0116316 A1 WO0116316 A1 WO 0116316A1
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WO
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protein
present
salt
ligand
dna
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PCT/JP2000/005684
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English (en)
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Inventor
Takuya Watanabe
Kuniko Kikuchi
Yasushi Shintani
Original Assignee
Takeda Chemical Industries, Ltd.
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Definitions

  • the present invention relates to a novel protein (G protein-coupled receptor Yuichi protein) derived from human brain, a salt thereof, DNA encoding the same, and the like.
  • G protein-coupled receptor Yuichi protein G protein-coupled receptor Yuichi protein
  • G protein conjugated guanine nucleotide-binding protein
  • G protein-coupled receptor proteins are present on the surface of various functional cells of living cells and organs, and are very useful as targets for molecules that regulate the functions of these living cells and organs, such as hormones, neurotransmitters and bioactive substances. Plays an important role. To clarify the relationship between substances that regulate complex functions in cells and organs of various organisms and their specific receptor proteins, particularly G protein-coupled receptor proteins, It will elucidate the functions of cells and organs and provide a very important means for drug development closely related to those functions.
  • the physiological functions of the brain are regulated by the regulation of many hormones, hormone-like substances, neurotransmitters or bioactive substances.
  • neurotransmitters are present in various parts of the brain, and regulate their physiological functions through their corresponding receptor proteins.
  • the present invention relates to a novel protein derived from human brain (G protein-coupled receptor protein), a partial peptide or a salt thereof, a DNA containing the protein or a DNA encoding the partial peptide, and a DNA containing the DNA.
  • G protein-coupled receptor protein G protein-coupled receptor protein
  • a method for screening a compound or a salt thereof that changes the binding property between the ligand and the protein (G protein-coupled receptor protein), the screening kit, the screening method or the screening Ligand obtained using the kit and the protein (G protein-coupled receptor Yuichi protein) Providing the compound or its salt that changes the binding property, and the ligand and the protein (G protein coupled receptions evening one protein) compound that alters the binding property between or the like medicine comprising the salt thereof.
  • the present inventors isolated cDNA encoding a novel protein (G protein-coupled receptor protein) derived from human brain and analyzed the entire nucleotide sequence. Successfully analyzed. When this nucleotide sequence was translated into an amino acid sequence, the first to seventh transmembrane regions were confirmed on the hydrophobicity plot, and the protein encoded by these cDNAs was conjugated to a seven-transmembrane G protein. It was confirmed to be a type receptor protein (Fig. 3). The present inventors have conducted further studies based on these findings, and as a result, have completed the present invention.
  • G protein-coupled receptor protein G protein-coupled receptor protein
  • a protein or a salt thereof which comprises an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1,
  • the protein is: (1) 1 or 2 or more in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 9, more preferably several (1 or 2))
  • the amino acid sequence of which amino acid has been deleted 2 SEQ ID NO: 1 or 2 or more (preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, Preferably an amino acid sequence to which several (1 or 2) amino acids have been added; and 3 one or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (preferably about 1 to 30, more preferably Is a protein containing an amino acid sequence in which about 1 to 10, more preferably several (one or two) amino acids are substituted with another amino acid, or an amino acid sequence obtained by combining them.
  • 1) described protein Or (16) the protein according to (1) or a salt thereof or the partial peptide or a salt thereof according to (2) above, and a test compound, which is contacted with the test compound. Decision method,
  • the ligands are angiotensin, bombesin, canapinoid, cholesis tokinin, glutamine, serotonin, melatonin, neuropeptide Y, obioid, pudding, vasoprescin, oxitocin, PACAP, secretin, glucagon, calcitonin, adrenomedullin, sodomenostin , GHRH, CRF, ACTH, GRP, PTH, VIP (Vasoactive Intestinal and Rerated Polypeptide), Somatos-tin, Dopamine, Motilin, amylin, bradykinin, CGRP (calcitonin gene relayed peptide), leukotriene, pancreatastatin, prostaglandin, trompoxan, adenosine, adrenaline, cysteine and / 3-chemokine (eg, IL-8, GROa, GR ⁇ ; 3, GROA, NAP-2, ENA
  • the labeled ligand may be a protein described in (1) or a salt thereof or (2) A method for screening a compound or a salt thereof that changes the binding property between the ligand and the protein or the salt thereof according to the above (1), wherein the amount of binding to the partial peptide or the salt thereof is measured and compared.
  • the compound that activates the protein according to the above (1) is angiotensin, bombesin, canapinoid, cholecystokinin, glutamine, serotonin, melatonin, neuropeptide Y, opioid, purine, vasoprescin, oxocytosine, PACAP, secretin, glucagon, calcitonin, adrenomedullin, somatos, GHRH, CRF, ACTH, GRP, PTH, VIP (Vasoactive Intestinal and Reliable Polypeptide), somatos, dopamine, motilin, amylin , Bradykinin,
  • CGRP calcium phosphatidylcholine
  • leukotriene leukotriene
  • pancreastatin prostaglandin
  • thromboxane adenosine
  • adrenaline HI and / 3-chemokine
  • IL-8 e.g. IL-8, GR 8 ⁇ , GRO / 3, GROr> NAP—2, ENA_78, PF4, IP 10, GCP—2, MCP—1, HC 14, MCP—3, 1—309, ⁇ ⁇ 1 ⁇ , MIP—li3, RANT ES, etc.
  • Endothelin Endothelin, The screening method according to the above (23) or (24), which is enterogastrin, hismin, neurotensin, TRH, pancreatic polypeptide or galanin;
  • a compound or a salt thereof which can be obtained by the screening method according to any one of (18) to (25), which alters the binding property between the ligand and the protein according to (1) or a salt thereof,
  • a compound or a salt thereof which can be obtained by the screening method according to the above (18) to (25), which changes the binding property between the ligand and the protein or the salt thereof according to the above (1).
  • a medicament characterized in that:
  • (31) a compound or a salt thereof, which can be obtained by using the screening kit according to any of (28) to (30) above, which alters the binding property between the ligand and the protein or salt thereof according to (1) above;
  • a medicament characterized by:
  • test solution is reacted with the antibody of (8) insolubilized on the carrier and the labeled antibody of (8) simultaneously or continuously, and then the labeling agent on the insolubilized carrier is reacted.
  • FIG. 1 shows the nucleotide sequence (AQ27) of DN ⁇ encoding the human brain-derived protein of the present invention obtained in Example 1 and the amino acid sequence deduced therefrom (following FIG. 2).
  • FIG. 2 shows the nucleotide sequence (AQ27) of the DNA encoding the human brain-derived protein of the present invention obtained in Example 1 and the amino acid sequence deduced therefrom (FIG. 1). Continued) .
  • FIG. 3 shows a hydrophobicity plot of the human brain-derived protein of the present invention.
  • FIG. 4 shows the results of analysis of the tissue distribution of AQ27 expression performed in Example 2.
  • FIG. 5 shows the results of analysis of the reactivity of Met-Enk marked hal in-Arg-Pheamide to AQ27 performed in Example 3.
  • the vertical axis indicates the acidification rate, and the horizontal axis indicates the measurement cycle.
  • References indicate the reactivity of receptor-expressing CH0 cells, and ⁇ indicates the reactivity of mock cells.
  • the protein of the present invention contains the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 [amino acid sequence in FIGS. 1 and 2]. (Hereinafter, the protein of the present invention (G protein-coupled receptor protein) or a salt thereof may be abbreviated as the protein of the present invention).
  • the protein of the present invention can be used, for example, in any cells of human mammals (eg, guinea pig, rat, mouse, mouse, egret, bush, sheep, monkey, monkey, etc.) (eg, , Spleen cells, nerve cells, glial cells, Teng / 3 cells, bone marrow cells, mesangial cells, Langerhans cells, epidermal cells, epithelial cells, endothelial cells, fibroblasts, fiber cells, muscle cells, adipocytes, immunity Cells (eg, macrophages, T cells, B cells, natural killer cells, mast cells, neutrophils, basophils, eosinophils, monocytes), megakaryocytes, synovial cells, chondrocytes, bone cells, Osteoblasts, osteoclasts, mammary cells, hepatocytes or stromal cells, or their precursors, stem cells or cancer cells, etc., and cells of the blood cell
  • human mammals eg,
  • amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is, for example, about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. Is an amino acid sequence having a homology of about 90% or more, more preferably about 95% or more.
  • Examples of the protein having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 of the present invention include, for example, a protein having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, A protein having substantially the same activity as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is preferred.
  • substantially the same activity examples include a ligand binding activity and a signal information transmitting action. Substantially the same indicates that their activities are the same in nature. Therefore, it is preferable that the activities such as ligand binding activity and signal transduction are equivalent (eg, about 0.5 to 2 times), but the quantitative factors such as the degree of these activities and the molecular weight of the protein are different. You may.
  • the measurement of the activity such as the ligand binding activity and the signal information transduction can be carried out according to a method known per se.
  • the activity can be measured according to a ligand determination method described later and a screening method.
  • the protein of the present invention includes: (1) one or two or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (preferably, about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, more preferably An amino acid sequence in which several (1 or 2) amino acids have been deleted, and 1 or 2 or more (preferably about 1 to 30) or more in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 Preferably about 1 to 10 amino acids, and more preferably several (one or two) amino acids; 3 SEQ ID NO: One or more (preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, and still more preferably several (1 or 2)) amino acids in the amino acid sequence represented by 1 An amino acid sequence substituted with an amino acid, or a protein containing an amino acid sequence obtained by combining them is also used.
  • SEQ ID NO: 1 preferably, about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, more preferably An amino acid sequence in which several (1 or 2) amino acids have been deleted, and 1 or 2 or more (preferably about 1 to 30) or more in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1
  • the protein has a N-terminus (amino terminus) at the left end and a C-terminus (carboxyl terminus) at the right end according to the convention of peptide labeling.
  • the C-terminal is usually a carboxyl group (one COOH) or a carboxylate (one COO one),
  • the C-terminus may be an amide (—C ⁇ NH 2 ) or an ester (one COOR).
  • R in the ester e.g., methyl, Echiru, n- propyl Le
  • Flip E alkyl groups such as isopropyl or n- butyl, consequent opening pentyl, C 3, such as cyclohexyl - 8 cycloalkyl group, for example, phenylene Le, alpha-C 6 2 Ariru groups, naphthyl, for example, benzyl, phenethyl that what phenylene Lou alkyl or alpha-naphthylmethyl etc. alpha-naphthyl - C - 2 C 7 such as an alkyl group _ i 4 in addition to Ararukiru group, Viva Roy Ruo carboxymethyl groups commonly as a oral ester.
  • the protein of the present invention When the protein of the present invention has a carboxyl group (or carboxylate) at a position other than the C-terminus, the protein of the present invention includes a carboxyl group amidated or esterified.
  • the ester in this case, for example, the above-mentioned C-terminal ester and the like are used.
  • the amino acid of the N-terminal methionine residue may be a protecting group (for example, an acyl group such as a C 2 _ 6 alkanoyl group such as a formyl group or an acetyl group). ), The glutamyl group formed by cleavage of the N-terminal side in vivo and pyroglutamine oxidation, the substituent on the side chain of the amino acid in the molecule (for example, — ⁇ H, —SH, amino group, coercive with imidazole group, indole group, etc.
  • a protecting group for example, an acyl group such as a C 2 _ 6 alkanoyl group such as a formyl group or an acetyl group.
  • Guanijino group appropriate protecting groups (e.g., formyl group, such as a single 6 Ashiru group such as C 2 _ 6 Arukanoiru group such Asechiru group) Protected proteins or complex proteins such as so-called glycoproteins to which sugar chains are bound are also included.
  • protecting groups e.g., formyl group, such as a single 6 Ashiru group such as C 2 _ 6 Arukanoiru group such Asechiru group
  • Protected proteins or complex proteins such as so-called glycoproteins to which sugar chains are bound are also included.
  • protein of the present invention include, for example, a protein derived from human (more preferably, derived from human brain) containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the partial peptide of the protein of the present invention may be any of the above-mentioned partial peptides of the protein of the present invention.
  • the molecules those which are exposed outside the cell membrane and have receptor binding activity are used.
  • the partial peptide of the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is an extracellular region (hydrophilic region) in the hydrophobic plot analysis shown in FIG. It is a peptide that contains the part that was analyzed. Further, a peptide partially containing a hydrophobic (Hydrophobic) site can also be used. A peptide containing individual domains may be used, but a peptide containing a plurality of domains simultaneously may be used.
  • the number of amino acids of the partial peptide of the present invention is at least 20 or more, preferably 50 or more, more preferably 100 or more of the amino acid sequences constituting the protein of the present invention. Peptides and the like are preferred.
  • a substantially identical amino acid sequence refers to an amino acid sequence of about 50% or more, preferably about 70% or more, more preferably about 80% or more, still more preferably about 90% or more, most preferably Indicates an amino acid sequence having about 95% or more homology.
  • substantially the same activity has the same meaning as described above.
  • the “substantially the same activity” can be measured in the same manner as described above.
  • the partial peptide of the present invention comprises one or more (preferably about 1 to 10, more preferably several (1 or 2)) amino acids in the above amino acid sequence.
  • Two or more (preferably about 1 to 10, more preferably about 1 to 5, and more preferably several (1 or 2)) amino acids may be substituted with another amino acid.
  • the C-terminus is usually a hydroxyl group (-COOH) or a carboxylate (-(: ⁇ -).
  • the C-terminus is an amide (-C ⁇ NH 2 ) or ester (—COOR).
  • the partial peptide of the present invention includes a peptide in which the amino group of the N-terminal methionine residue is protected with a protecting group, and a Gin formed by cleavage of the N-terminal side in vivo.
  • a protecting group for protecting the amino acid in the molecule
  • a Gin formed by cleavage of the N-terminal side in vivo examples thereof include those in which the amino acid in the molecule is pyroglutamine-oxidized, those in which the substituent on the side chain of the amino acid in the molecule is protected by an appropriate protecting group, and those in which a sugar chain is bonded, such as a so-called glycopeptide.
  • the C-terminus is usually a hydroxyl group (one COOH) or a carboxylate (_CO ⁇ —). It may be NH 2 ) or an ester (—COOR).
  • the salt of the protein of the present invention or its partial peptide is particularly preferably a physiologically acceptable acid addition salt.
  • suitable salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid) , Tartaric acid, cunic acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid).
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid
  • Tartaric acid cunic acid, malic acid, oxalic acid
  • benzoic acid methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid
  • the protein of the present invention or a salt thereof can be produced from the above-described human or mammalian cells or tissues by a method for purifying the protein known per se, or a plasmid containing a DNA encoding the protein of the present invention described below. It can also be produced by culturing the transformant. In addition, it can also be produced by the protein synthesis method described below or according to it.
  • the cells When manufactured from human or mammalian tissues or cells, human or mammalian tissues Alternatively, the cells can be homogenized, extracted with an acid or the like, and the extract can be purified and isolated by a combination of chromatography such as reverse phase chromatography and ion exchange chromatography.
  • chromatography such as reverse phase chromatography and ion exchange chromatography.
  • a commercially available resin for protein synthesis can be usually used.
  • resins include chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzylalcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, PAM resin, and 4-hydroxymethyl resin.
  • Methylphenylacetamidomethyl resin, polyacrylamide resin, 4- (2 ', 4'-dimethoxyphenylhydroxymethyl) phenoxy resin, 4- (2', 4'-dimethoxyphenyl-1-Fmocaminoethyl) phenoxy Resins and the like can be mentioned.
  • amino acids having a suitably protected amino group and side chain functional group are condensed on the resin in accordance with the sequence of the target protein in accordance with various known condensation methods.
  • various protecting groups are removed at the same time, and an intramolecular disulfide bond formation reaction is carried out in a highly diluted solution to obtain a target protein or an amide thereof.
  • carbodiimides include DC (:, N, ⁇ '-diisopropylcarpoimide, ⁇ ⁇ ⁇ -ethyl- ⁇ '-(3-dimethylaminoprolyl) carbopimide, etc.
  • the activation by these is racemization
  • the protected amino acid may be added directly to the resin along with the inhibitory additives (e.g., HOBt, HOOBt), or added to the resin after pre-activation of the protected amino acid as a symmetric anhydride or HOBt ester or H00Bt ester.
  • the inhibitory additives e.g., HOBt, HOOBt
  • the solvent used for the activation of the protected amino acid and the condensation with the resin can be appropriately selected from solvents known to be usable for the protein condensation reaction.
  • acid amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, N-methylpyrrolidone, and halogenated compounds such as methylene chloride and chloroform.
  • the reaction temperature is appropriately selected from a range known to be usable for a protein bond formation reaction, and is usually appropriately selected from a range of about 120 ° C to 50 ° C.
  • the activated amino acid derivative is usually used in a 1.5 to 4-fold excess.
  • Examples of the protecting group for the amino group of the starting material include, for example, Z, Boc, succinylpentyloxycarbonyl, isopolonyloxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, - ⁇ , Br- ⁇ , adamantylo Xycarbonyl, trifluoroacetyl, phthaloyl, formyl, 2-nitrophenylsulfenyl, diphenylphosphinothioyl, Fmoc and the like are used.
  • the lipoxyl group may be, for example, an alkyl esterified (eg, methyl, ethyl, propyl, butyl, tert-butyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl, etc.) Is cyclic alkyl esterification), aralkyl esterification (for example, benzyl ester, 4-nitrobenzyl ester, 4-methoxybenzyl ester, 4-cyclobenzoyl ester, benzhydryl esterification), phenacyl esterification, benzyl It can be protected by oxycarbonyl hydrazide, evening butoxycarbonyl hydrazide, trityl hydrazide and the like.
  • an alkyl esterified eg, methyl, ethyl, propyl, butyl, tert-butyl, cyclopenty
  • the hydroxyl group of serine can be protected, for example, by esterification or etherification.
  • a group suitable for the esterification for example, a lower alkanol group such as an acetyl group, an aroyl group such as a benzoyl group, a group derived from carbonic acid such as a benzyloxycarbonyl group, an ethoxycarbonyl group, and the like are used.
  • a group suitable for etherification include a benzyl group, a tetrahydrobiranyl group, and a t-butyl group.
  • a protecting group for the phenolic hydroxyl group of tyrosine for example, Bzl, CI 2 -Bz and 2-nitrobenzyl, Br-Z, tertiary butyl and the like are used.
  • imidazole protecting group for histidine for example, Tos, 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl, DNP, benzyloxymethyl, Bum, Boc, Trt, Fmoc and the like are used.
  • Examples of the activated carboxyl groups of the raw materials include, for example, corresponding acid anhydrides, azides, and activated esters [alcohols (eg, phenol, 2,4,5-trichlorophenol, 2,4 -Dinitrophenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, H0NB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, ester with HOBt).
  • alcohols eg, phenol, 2,4,5-trichlorophenol, 2,4 -Dinitrophenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, H0NB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, ester with HOBt.
  • As the activated amino group of the raw material for example, a corresponding phosphoric amide is used.
  • Methods for removing (eliminating) protecting groups include, for example, catalytic reduction in a stream of hydrogen in the presence of a catalyst such as Pd—black or Pd-carbon, or anhydrous hydrogen fluoride, methanesulfone, or the like.
  • the elimination reaction by the above-mentioned acid treatment is generally carried out at a temperature of about ⁇ 20 ° C. (: to 40 ° C.).
  • anisol for example, anisol, phenol, thioanisol
  • a cation scavenger such as meta-cresol, para-cresol, dimethyl sulfide, 1,4-butanedithiol, 1,2-ethanedithiol, etc.
  • a protecting group for histidine imidazole The 2,4-dinitrophenyl group used is removed by thiophenol treatment, and the formyl group used as an indole protecting group for tributofan is treated with an acid in the presence of 1,2-ethanedithiol or 1,4-butanedithiol as described above.
  • an a-carboxyl group of a carboxy-terminal amino acid is protected by amidation, and then a peptide (protein) chain is extended to a desired length on the amino group side.
  • a protein in which only the N-terminal a-amino group protecting group of the peptide chain was removed and a protein in which only the C-terminal protecting group of lipoxyl group was removed were produced.
  • all the protecting groups are removed by the above method to obtain a desired crude protein. This crude protein is purified using various known purification means, and the main fraction is freeze-dried to obtain an amide of the desired protein.
  • ester of a protein for example, after condensing a lipoxyl group of a carboxy-terminal amino acid with a desired alcohol to form an amino acid ester, the ester of the desired protein can be obtained in the same manner as the amide of a protein. Can be obtained.
  • the partial peptide of the protein of the present invention or a salt thereof can be produced according to a peptide synthesis method known per se, or by cleaving the protein of the present invention with an appropriate peptidase.
  • a peptide synthesis method for example, any of a solid phase synthesis method and a liquid phase synthesis method may be used.
  • the target peptide can be produced by condensing a partial peptide or amino acid capable of constituting the protein of the present invention with the remaining portion, and when the product has a protecting group, removing the protecting group.
  • Known condensation methods and elimination of protecting groups include, for example, the methods described in the following 1 to 5.
  • the partial peptide of the present invention can be purified and isolated by a combination of ordinary purification methods such as solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, and recrystallization.
  • the partial peptide obtained by the above method is a free form, it can be converted to an appropriate salt by a known method, and when it is obtained as a salt, it can be converted to a free form by a known method. be able to.
  • the DNA encoding the protein of the present invention any DNA may be used as long as it contains the above-described nucleotide sequence encoding the protein of the present invention.
  • genomic DNA genomic DNA library
  • genomic DNA library any of genomic DNA, genomic DNA library, the above-described cell-tissue-derived cDNA, the above-described cell-tissue-derived cDNA library, and synthetic DNA.
  • the vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like.
  • RT-PCR method reverse transcriptase polymerase chain reaction
  • the DNA encoding the protein of the present invention includes, for example, DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 and high string DNA that encodes a protein that has a DNA that hybridizes under gentle conditions and has substantially the same activity (eg, ligand binding activity, signal transduction activity, etc.) as the protein of the present invention. Any one may be used.
  • Examples of the DNA that hybridizes with the DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 under high stringency conditions include, for example, about 70% or more, and preferably about 80% of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2. Above, more preferably about 90% or more, even more preferably about 95% or more containing a base sequence having homology DNA or the like is used.
  • Hybridization is carried out by a method known per se or a method analogous thereto, for example, a method known as "Molecular Cloning” 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press) , 1989).
  • a method known as "Molecular Cloning” 2nd J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press
  • the reaction can be performed under high stringent conditions.
  • High stringency conditions include, for example, a sodium concentration of about 19 to 40 mM, preferably about 19 to 20 mM, and a temperature of about 50 to 70 ° C, preferably about 60 to 6 ° C. The conditions at 5 ° C are shown. In particular, the case where the sodium concentration is about 19 mM and the temperature is about 65 ° C is most preferable.
  • the DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 includes a DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • nucleotide (oligonucleotide) containing the nucleotide sequence encoding the protein of the present invention or containing a part of the nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence is to encode the protein of the present invention or a partial peptide thereof. It is used to mean not only DNA but also RNA.
  • an antisense (oligo) nucleotide (nucleic acid) capable of inhibiting the replication or expression of the protein gene of the present invention is cloned or determined. It can be designed and synthesized based on sequence information.
  • Such (oligo) nucleotides (nucleic acids) can hybridize with RNA of the G protein-coupled protein gene and can inhibit the synthesis or function of the RNA, or can bind to G protein-coupled protein-related RNA. It is possible to regulate and control the expression of the G protein-coupled protein gene through the interaction of.
  • (Oligo) nucleotides complementary to the selected sequence of the G protein-coupled protein-related RNA and (oligo) nucleotides capable of specifically hybridizing with the G protein-coupled protein-related RNA are in vivo. And in vitro It is useful for regulating and controlling the expression of white matter-coupled protein gene, and is also useful for treating or diagnosing diseases.
  • corresponding means having homology or being complementary to a specific sequence of nucleotides, base sequences or nucleic acids including genes.
  • the “correspondence” between a nucleotide, a nucleotide sequence or a nucleic acid and a peptide (protein) is a peptide specified by a directive derived from the nucleotide (nucleic acid) sequence or its complement.
  • G protein-coupled protein gene usually refers to amino acids.
  • the region, the 3 'end palindrome region, and the 3' end hairpin loop can be selected as preferred regions of interest, but any region within the G protein-coupled protein gene can be selected as the region of interest.
  • the relationship between the target nucleic acid and the (oligo) nucleotide complementary to at least a part of the target region is that the relationship between the (oligo) nucleotide that can hybridize with the target is “antisense”. it can.
  • Antisense-(oligo) nucleotides are 2-deoxy D-liposome-containing polydeoxynucleotides, D-ribose-containing polydeoxynucleotides, purine or pyrimidine base N- Other types of polynucleotides that are glycosides, or other polymers with non-nucleotide backbones (eg, commercially available protein nucleic acids and synthetic sequence-specific nucleic acid polymers) or other polymers containing special linkages (eg, Polymers include base pairs that are found in DNA and RNA, which contain nucleotides with a configuration that allows the attachment of bases).
  • RNA hybrids can be unmodified polynucleotides or unmodified oligonucleotides, or Modified, e.g., labeled in the art, tagged, capsulated, methylated, substituted for one or more natural nucleotides by analogs, intramolecular nucleotides Modified, eg uncharged Those having a bond (for example, methylphosphonate, phosphotriester, phosphoramidate, olebamate, etc.), those having a charged bond or a sulfur-containing bond (for example, phosphorothioate, phosphorodithioate, etc.), For example, those having side chains such as proteins (nucleases, nuclease inhibitors, toxins, antibodies, signal peptides, poly-L-lysine, etc.) and sugars (e
  • nucleoside may include not only those containing purine and pyrimidine bases but also those having other modified complex ring bases. Such modifications may include methylated purines and pyrimidines, acylated purines and pyrimidines, or other heterocycles. Modified nucleotides and modified nucleotides may also be modified at the sugar moiety, e.g., one or more hydroxyl groups are replaced with halogens, aliphatic groups, etc., or functional groups such as ethers, amines, etc. May be converted to
  • the antisense nucleic acid of the present invention is RNA, DNA, or a modified nucleic acid.
  • modified nucleic acid include, but are not limited to, sulfur derivatives of nucleic acids, thiophosphate derivatives, and polynucleoside amides, which are resistant to degradation of oligonucleoside amides.
  • the antisense nucleic acid of the present invention can be preferably designed according to the following policy. That is, to make the antisense nucleic acid more stable in the cell, to increase the cell permeability of the antisense nucleic acid, to have a greater affinity for the target sense strand, and to be more toxic if it is toxic. Minimize the toxicity of sense nucleic acids.
  • the antisense nucleic acids of the present invention may contain altered or modified sugars, bases, or bonds, are provided in special forms such as ribosomes and microspheres, are applied by gene therapy, or are added. Can be given in a written form.
  • polycations such as polylysine, which acts to neutralize the charge of the phosphate skeleton, and lipids, which increase the interaction with the cell membrane or increase the uptake of nucleic acids ( For example, phospholipids, cholesterol, etc.).
  • Preferred lipids for addition include cholesterol and its derivatives (eg, cholesteryl chromate formate, cholic acid, etc.).
  • nucleic acid can be attached via a base, sugar, or intramolecular nucleoside linkage.
  • Other groups include cap groups specifically located at the 3 'or 5' end of nucleic acids that prevent degradation by nucleases such as exonuclease and RNase. I can do it.
  • capping groups include, but are not limited to, hydroxyl-protecting groups known in the art, including glycols such as polyethylene glycol and tetraethylene glycol.
  • the inhibitory activity of the antisense nucleic acid can be examined using the transformant of the present invention, the in vivo or in vitro gene expression system of the present invention, or the in vivo or in vitro translation system of a protein.
  • the nucleic acid itself can be applied to cells by various methods known per se.
  • the DNA encoding the partial peptide of the present invention may be any DNA as long as it contains the above-described nucleotide sequence encoding the partial peptide of the present invention.
  • any of genomic DNA, genomic DNA library, the above-mentioned cell DNA-derived cDNA library, the above-described cell / tissue-derived cDNA library, and synthetic DNA may be used.
  • the vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like.
  • RT-PCR method a direct Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction
  • the DNA encoding the partial peptide of the present invention includes, for example, DNA having a partial nucleotide sequence of DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, or ⁇ represented by SEQ ID NO: 2.
  • Examples of the DNA that hybridizes with the DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 under high stringency conditions include, for example, about 70% or more, and preferably about 80% of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • DNA containing a nucleotide sequence having a homology of at least about 90% or more, more preferably about 95% or more, and particularly preferably about 98% or more is used.
  • a synthetic DNA primer having a partial nucleotide sequence of the protein of the present invention is used.
  • Hybridization can be performed according to, for example, the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). When a commercially available library is used, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual.
  • the DNA base sequence can be converted using PCR or a known kit, for example, Mutan TM -super Express Km (Takara Shuzo Co., Ltd.), Mutan TM -K (Takara Shuzo Co., Ltd.), etc. It can be carried out according to a method known per se, such as the Gupped duplex method or the Kunkel method, or a method analogous thereto.
  • the DNA encoding the cloned protein can be used as is, or If desired, it can be used after digestion with a restriction enzyme or addition of a linker.
  • the DNA may have ATG as a translation initiation codon at the 5 'end and TAA, TGA or TAG as a translation stop codon at the 3' end. These translation initiation codon and translation termination codon can also be added using an appropriate synthetic DNA adapter.
  • the expression vector for the protein of the present invention includes, for example, (a) cutting out a target DNA fragment from DNA encoding the protein of the present invention, and (mouth) promoting the DNA fragment in a suitable expression vector in a suitable expression vector. It can be manufactured by connecting downstream.
  • the vector examples include a plasmid derived from Escherichia coli (eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13), a plasmid derived from Bacillus subtilis (eg, pUB110, pTP5, pC194), a plasmid derived from yeast ( For example, pSH19, pSH15), bacteriophages such as ⁇ phage, animal viruses such as retrovirus, vaccinia virus, baculovirus, etc., pAl-11, pXT1, pRc / CMV, pRc / RSV, pcDNAIZNeo, etc. are used.
  • Escherichia coli eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13
  • Bacillus subtilis eg, pUB110, pTP5, pC194
  • yeast e.g, pSH19, pSH15
  • the promoter used in the present invention may be any promoter as long as it is appropriate for the host used for gene expression.
  • SR promoter when animal cells are used as hosts, SR promoter, SV40 promoter, HIV-LTR promoter, CMV promoter, HSV-TK promoter and the like can be mentioned.
  • the CMV promoter overnight, the SR ⁇ promoter, and the like.
  • the host is Escherichia, the trp promoter, lac promoter, recA promoter, ⁇ promoter, lpp promoter—Yuichi, etc., and if the host is Bacillus, the SPOL promoter, SPO2
  • yeast such as a promoter, pen P promoter, and the like, a PH05 promoter, a PGK promoter, a GAP promoter, an ADH promoter, and the like are preferable.
  • the host is an insect cell, polyhedrin pro Motors, P10 promoters and the like are preferred.
  • the expression vector optionally contains an enhancer, a splicing signal, a poly-A addition signal, a selection marker, an SV40 replication origin (hereinafter sometimes abbreviated as SV40 ori), and the like.
  • the selection marker one, for example, dihydrofolate reductase (hereinafter sometimes abbreviated as Dhir) gene [methotrexate (MTX) resistance], ampicillin resistant gene (hereinafter sometimes abbreviated as Amp r), neomycin Resistance gene (hereinafter sometimes abbreviated as "Ne”, G418 resistance).
  • Dhir dihydrofolate reductase
  • Amp r ampicillin resistant gene
  • Ne neomycin Resistance gene
  • the target gene is thymidine.
  • a signal sequence suitable for the host is added to the N-terminal of the protein of the present invention.
  • the host is a bacterium belonging to the genus Escherichia, a PhoA signal sequence, an immediate A signal sequence, etc.
  • the host is a bacterium belonging to the genus Bacillus, an ⁇ -amylase signal sequence, a subtilisin signal sequence, etc.
  • the host is yeast, the MFa signal sequence, SUC2 signal sequence, etc .; if the host is an animal cell, the insulin signal sequence, ⁇ -interferon signal sequence, antibody molecule, signal sequence, etc. Available.
  • a transformant can be produced.
  • Escherichia bacteria for example, Escherichia bacteria, Bacillus bacteria, yeast, insect cells, insects, animal cells, and the like are used.
  • Escherichia examples include Escherichia coli (Escherichia col 0 K12 ⁇ DH 1 [Processings of the National Academy of Sciences]. Natl. Acad. Sci. US A), 60, 160 (1968)], JM103 [Nucleic Acids Research], (Nucleic Acids Research), 9, 309 (1981)], JA221 [Journal of Ob. ⁇ Molecular ⁇ Biology (Journal of Molecular Biology)], 120, 517 (1978)], HB101 [Journal of Molecular Molecular Biology, 41, 459 (1969)], C600 [Genetics, 39, 440 (1954)] )] Is used.
  • Bacillus spp. include, for example, Bacillus subtilis MI114 [Gene, 24, 255 (1983)], 207-21 [Journal of Biochemistry, 95, 87 (1 984)].
  • yeast examples include, for example, Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R-, NA87-11A, DKD-5D, 20B-12, Schizosaccharomyces pombe N CYC 1913, NCYC 2036, Pichia pastoris and the like are used.
  • insect cells for example, when the virus is Ac NPV, a cell line derived from the larvae of night moth (Spodoptera frugiperda cell; S f cell), MG1 cell derived from the midgut of Trichoplusia ni, and egg derived from Trichoplusia ni egg High Five TM cells, cells derived from Mamestrabrassicae or cells derived from Estigmena acrea are used.
  • S NPV a silkworm-derived cell line (Bombyxmori N; Bm N cell) is used.
  • S ⁇ cells include Sf9 cells (ATCC CRL1711) and Sf21 cells (Vaughn, JL et al., In Vivo, 13, 213-217, (1977)) and the like. Used.
  • insects for example, silkworm larvae are used [Maeda et al., Nature, 315, 592 (1985)].
  • animal cells examples include monkey cell COS-7, Vero, Chinese hamster cell CHO (hereinafter abbreviated as CHO cell), dh fr gene-deficient chinini—zhamster cell CHO (hereinafter CHO (dhfr-) cell) Abbreviations), mouse L cells, mouse AtT-20, mouse myeloma cells, rat GH3, human FL cells, and the like.
  • Transformation of Bacillus can be performed, for example, according to the method described in Molecular & General Genetics, Vol. 168, 11 (1979).
  • Transformation of insect cells or insects can be performed, for example, according to the method described in Bio / Technology, 6, 47-55 (1988).
  • a liquid medium is suitable as a medium used for culturing, and a carbon source necessary for the growth of the transformant is contained therein.
  • the carbon source include glucose, dextrin, soluble starch, and sucrose.
  • examples of the nitrogen source include ammonium salts, nitrates, corn chip liquor, peptone, casein, meat extract, soybean meal, and potato extract.
  • examples of the inorganic or organic substance such as a liquid and the inorganic substance include calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, and magnesium chloride.
  • yeast, vitamins, growth promotion Factors and the like may be added.
  • the pH of the medium is preferably about 5-8.
  • Examples of a medium for culturing Escherichia bacteria include, for example, M9 medium containing glucose and casamino acids [Miller, Journal of Experiments-Molecular Genetics (Journal of Experiments in Molecular Genetics), 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972].
  • a drug such as 3) 3-indolylacrylic acid can be added to make the promoter work efficiently.
  • the cultivation is usually performed at about 15 to 43 ° C for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring can be applied.
  • the cultivation is usually performed at about 30 to 40 ° C for about 6 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring can be applied.
  • Burkholder's minimum medium Bostian, KL et al., "Processings of the National Academy of Sciences” Soc. USA (Pro Natl. Acad. Sci. USA), 77, 4505 (1980)] and an SD medium containing 0.5% casamino acid [Bitter, G. ⁇ . "Proc. Natl. Acad. Sci. USA,” Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5330 (11984)
  • the pH of the medium is preferably adjusted to about 5 to 8. Culture is usually performed at about 20 ° C to 35 ° C for about 24 to 72 hours, and aeration and stirring are added as necessary.
  • the culture medium When culturing an insect cell or a transformant whose host is an insect, the culture medium was immobilized in Grace's Insect Medium (Grace, TCC, Nature, 195, 788 (1962)). A solution to which an additive such as a serum is appropriately added is used. The pH of the medium is preferably adjusted to about 6.2 to 6.4. Culture is usually performed at about 27 ° C for about 3 to 5 days, and aeration and agitation are added as necessary.
  • MEM medium containing 5-20% fetal bovine serum (Science, 122, 501 (1952)], DMEM medium [Virology, 8, 396 (1959)], RPMI 1640 medium [Journal 'Ob' the 'American' Medi sword '' Association (The Journal of the American Medical Association) 199, 519 (1967)], 199 medium [Processing-the-'Society for ' The 'biological' medicine (Proceeding of the Society for the Biological Medicine), 73, 1 (1950)] is used.
  • the pH is about 6-8.
  • the cultivation is usually performed at about 30 to 40 ° C for about 15 to 60 hours, and aeration and agitation are added as necessary.
  • the G protein-coupled protein of the present invention can be produced in the transformant, inside the cell membrane, or outside the cell.
  • the protein of the present invention can be separated and purified from the culture by, for example, the following method.
  • the cells or cells are collected by a known method after culturing, suspended in an appropriate buffer, and sonicated, lysozyme and / or freeze-thawed. After the cells or cells are destroyed, a method of obtaining a crude protein extract by centrifugation or filtration is used as appropriate.
  • the buffer may contain a protein denaturant such as urea or guanidine hydrochloride, or a surfactant such as Triton X-100 TM .
  • Purification of the protein contained in the thus obtained culture supernatant or extract can be carried out by appropriately combining known separation and purification methods.
  • These known separation and purification methods include methods using solubility such as salting out and solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
  • Methods that mainly use differences in molecular weight such as methods, methods that use differences in charge, such as ion-exchange chromatography, methods that use specific affinity, such as affinity chromatography, and reverse-phase high-performance liquid chromatography.
  • a method utilizing a difference in hydrophobicity such as isoelectric point electrophoresis or a method utilizing a difference in isoelectric point is used.
  • the protein thus obtained when the protein thus obtained is obtained in a free form, it can be converted to a salt by a method known per se or a method analogous thereto, and conversely, when the protein is obtained in a salt, a method known per se or It can be converted into a free form or another salt by a method analogous thereto.
  • the protein produced by the recombinant can be arbitrarily modified or the polypeptide can be partially removed by the action of an appropriate protein-modifying enzyme before or after purification.
  • an appropriate protein-modifying enzyme for example, trypsin, chymotrypsin, arginyl endopeptidase, protein kinase, glycosidase and the like are used.
  • the activity of the thus-produced protein of the present invention or a salt thereof can be measured by a binding experiment with a labeled ligand, an enzymimnoassay using a specific antibody, or the like.
  • the antibody against the protein of the present invention, its partial peptide, or a salt thereof may be any of a polyclonal antibody and a monoclonal antibody as long as it can recognize the protein of the present invention, its partial peptide, or a salt thereof. .
  • Antibodies against the protein of the present invention, its partial peptide or a salt thereof can be prepared by using the protein or the like of the present invention as an antigen according to a known method for producing an antibody or antiserum. Can be manufactured.
  • the protein or the like of the present invention is administered to a mammal at a site where the antibody can be produced by administration, itself or together with a carrier or a diluent.
  • Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance antibody production upon administration. Administration is usually performed once every 2 to 6 weeks, for a total of about 2 to 10 times.
  • the mammals used include, for example, monkeys, egrets, dogs, guinea pigs, mice, rats, sheep, goats, and mice and rats. It is preferably used.
  • a warm-blooded animal immunized with an antigen for example, an individual with an antibody titer is selected from a mouse, and the spleen or lymph node is collected 2 to 5 days after the final immunization.
  • an individual with an antibody titer is selected from a mouse, and the spleen or lymph node is collected 2 to 5 days after the final immunization.
  • myeloma cells By fusing the contained antibody-producing cells with myeloma cells, a monoclonal antibody-producing hybridoma can be prepared.
  • the measurement of the antibody titer in the antiserum can be performed, for example, by reacting the labeled protein of the present invention described below with the antiserum, and then measuring the activity of the labeling agent bound to the antibody. .
  • the fusion operation can be carried out according to a known method, for example, the method of Koehler and Milsin [Nature, 256, 495 (1975)].
  • the fusion promoter include polyethylene render glycol (PEG) and Sendai virus, but PEG is preferably used.
  • myeloma cells examples include NS_1, P3U1, SP 2/0, and P3U1 is preferably used.
  • the preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen cells) and the number of myeloma cells used is about 1: 1 to 20: 1, and PEG (preferably PEG 1000 to PEG 6000) is about 10 to 80%.
  • the cells are added at a concentration and incubated at about 20 to 40 ° C., preferably about 30 to 37 ° C. for about 1 to 10 minutes, so that cell fusion can be carried out efficiently.
  • a hybridoma culture supernatant is added to a solid phase (eg, a microplate) on which an antigen such as the protein of the present invention is adsorbed directly or together with a carrier.
  • an anti-immunoglobulin antibody labeled with a radioactive substance or enzyme if the cells used for cell fusion are mice, an anti-mouse immunoglobulin antibody is used
  • a monoclonal antibody to which protein A is added and bound to a solid phase A monoclonal antibody bound to a solid phase is prepared by adding a hybridoma culture supernatant to a solid phase to which an anti-immunoglobulin antibody or protein A has been adsorbed, adding a protein of the present invention labeled with a radioactive substance, an enzyme, or the like. Examples include a method of detecting an antibody.
  • Monoclonal antibodies can be selected according to a method known per se or a method analogous thereto. Usually, it can be carried out in a medium for animal cells supplemented with HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine).
  • HAT hyperxanthine, aminopterin, thymidine
  • any medium can be used as long as it can grow a hybridoma.
  • RPMI164 medium containing 1 to 20%, preferably 10 to 20% fetal bovine serum
  • GIT medium containing 1 to 10% fetal bovine serum (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
  • serum-free medium for hybridoma culture SFM-101, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.
  • the culture temperature is usually from 20 to 40 ° C, preferably about 37 ° C.
  • the culturing time is usually 5 days to 3 weeks, preferably 1 week to 2 weeks.
  • the culture can be usually performed under 5% carbon dioxide gas.
  • the antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the measurement of the antibody titer in the antiserum described above.
  • Monoclonal antibodies can be separated and purified in the same manner as ordinary polyclonal antibodies.
  • immunoglobulin separation and purification eg, salting out, alcohol precipitation, isoelectric precipitation, electrophoresis, ion exchanger (eg, DEAE), ultracentrifugation, gel filtration, antigen-binding solid phase or specific purification method in which only antibodies are collected using an active adsorbent such as protein A or protein G, and the bonds are dissociated to obtain antibodies.
  • an active adsorbent such as protein A or protein G
  • the polyclonal antibody of the present invention can be produced by a method known per se or a method analogous thereto. For example, a complex of an immunizing antigen (antigen such as the protein of the present invention) and a carrier-protein is formed, and a mammal is immunized in the same manner as in the above-described method for producing a monoclonal antibody. It can be produced by collecting the antibody-containing substance and separating and purifying the antibody.
  • the type of carrier protein and the mixing ratio of carrier and hapten depend on the efficiency of the antibody against the hapten immunized by cross-linking the carrier. If possible, any material may be cross-linked at any ratio.
  • a method is used in which min, dicythyroglobulin, keyhole, limpet, hemocyanin and the like are coupled in a weight ratio of about 0.1 to 20 and preferably about 1 to 5 with respect to 1 hapten.
  • various condensing agents can be used for force coupling between the hapten and the carrier.
  • daltaraldehyde, carbodiimide, a maleimide active ester, an active ester reagent containing a thiol group or a dithioviridyl group, or the like is used.
  • the condensation product is administered to a warm-blooded animal at a site where antibody production is possible or together with a carrier or diluent.
  • Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance antibody production ability upon administration.
  • the administration can usually be performed once every about 2 to 6 weeks, for a total of about 3 to 10 times.
  • the polyclonal antibody can be collected from blood, ascites, etc., preferably from blood, of the mammal immunized by the above method.
  • the measurement of the polyclonal antibody titer in the antiserum can be performed in the same manner as the measurement of the antibody titer in the serum described above. Separation and purification of the polyclonal antibody can be carried out according to the same immunoglobulin separation and purification method as the above-mentioned separation and purification of the monoclonal antibody.
  • the protein of the present invention, its partial peptide or a salt thereof, and the DNA encoding them are: (1) a method for determining a ligand for the protein of the present invention; (2) obtaining antibodies and antisera; and (3) expression of a recombinant protein.
  • a receptor-binding Atsushi system using the same expression system and screening of drug candidate compounds, ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ Drug design based on comparison with structurally similar ligands and receptors, 6Gene diagnosis It can be used as a reagent for preparing probes or PCR primers in (1), (2) a transgenic animal, or (2) a drug such as a gene preventive or therapeutic agent.
  • a human-mammal specific G protein-coupled receptor (Eg, agonist, antagonist, etc.) can be screened, and the agonist or antagonist can be used as an agent for preventing or treating various diseases. .
  • a protein, a partial peptide or a salt thereof of the present invention (hereinafter sometimes abbreviated as the protein of the present invention), a DNA encoding the protein of the present invention or a partial peptide thereof (hereinafter abbreviated as a DNA of the present invention)
  • the use of antibodies against the protein or the like of the present invention (hereinafter, may be abbreviated as the antibody of the present invention) will be specifically described below.
  • the protein of the present invention or a salt thereof or the partial peptide of the present invention or a salt thereof is useful as a reagent for searching for or determining a ligand (agonist) for the protein of the present invention or a salt thereof.
  • the present invention provides a method for determining a ligand for a protein of the present invention, which comprises contacting a protein of the present invention or a salt thereof or a partial peptide of the present invention or a salt thereof with a test compound.
  • Test compounds include known ligands (for example, angiotensin, bombesin, canapinoid, cholecystokinin, glutamine, serotonin, melatonin, neuropeptide Y, opioid, purine, vasopressin, oxytocin, PACAP, secretin) , Glucagon, calcitonin, adrenomedullin, somatos quintin, GHRH, CRF, ACTH, GRP, PTH, VIP (Vasoactive Intestinal and Rerated Polypeptide), somatostin, dopamine, motilin, amylin, bradykinin, C GRP (calcitonin gene relayed peptide), leukotriene, pancreastatin, prostaglandin, tropoxane, adenosine, adrenaline, ⁇ - and 3-chemokines (eg, IL-8 GRO a, GRO / 3, GROT, NAP—2, E
  • Tissue extract, cell culture supernatant, etc. are used.
  • the tissue extract, cell culture supernatant, and the like are added to the protein of the present invention, and fractionation is performed while measuring cell stimulating activity and the like, so that a single ligand can be finally obtained.
  • the method for determining the ligand of the present invention uses the protein of the present invention, a partial peptide thereof or a salt thereof, or constructs an expression system for a recombinant protein, and uses a receptor using the expression system.
  • bind to cell stimulating activity to a protein of the present invention e.g., Arakidon acid release, acetylcholine release, intracellular C a 2 + release, intracellular c AM P production, intracellular c GM
  • the protein of the present invention or a partial peptide thereof is brought into contact with a test compound, for example, the amount of the test compound bound to the protein or the partial peptide, It is characterized by measuring its activity.
  • the present invention relates to the following: (1) when a labeled test compound is brought into contact with the protein or its salt of the present invention or the partial peptide of the present invention or its salt, A method for determining a ligand for the protein or a salt thereof according to the present invention, which comprises measuring the amount of binding to the protein or a salt thereof, or the partial peptide or a salt thereof;
  • Protein-mediated cell stimulating activity eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular c AM
  • P production intracellular c-GMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuations, intracellular protein phosphorylation, activation of c-fos, activity to promote or suppress PH decrease, etc.
  • cell-mediated cell-stimulating activity eg, arachidone
  • Acid release acetylcholine release
  • intracellular Ca 2+ release intracellular cAMP generation
  • intracellular cGMP generation inositol monophosphate production
  • cell membrane potential fluctuation intracellular protein phosphorylation
  • c-fos a method for determining a ligand for the protein of the present invention or a salt thereof, which is characterized by measuring an activity of promoting or suppressing the activation, reduction of pH, and the like.
  • the protein used in the ligand determination method may be any protein containing the above-described protein of the present invention or the partial peptide of the present invention. Suitable proteins are suitable.
  • the above-described expression method is used, but it is preferable to express the DNA encoding the protein in mammalian cells or insect cells.
  • Complementary DNA is usually used as the DNA fragment encoding the protein portion of interest, but is not necessarily limited to this.
  • Gene fragments or synthetic DNA may be used.
  • the DNA fragment In order to introduce a DNA fragment encoding the protein of the present invention into host animal cells and express them efficiently, the DNA fragment must be expressed by a nuclear polyhedrosis virus belonging to a baculovirus using an insect as a host.
  • NPV polyhedrin promoter
  • SV40-derived promoter retrovirus promoter overnight, metamouth thionine promoter overnight, human heat shock promoter, cytomegalovirus promoter, downstream promoter of SR promoter, etc.
  • human heat shock promoter cytomegalovirus promoter
  • downstream promoter of SR promoter etc.
  • it is incorporated into Examination of the quantity and quality of the expressed receptor can be carried out in a manner known per se. For example, it can be carried out according to the method described in the literature [Nambi, P. et al., The Journal of Biological Chemistry (J. Biol. Chem.), 267, pp. 19555-19559, 1992]. it can.
  • a cell containing the protein or a cell membrane fraction thereof may be used.
  • the cells When cells containing the protein of the present invention are used in the method for determining a ligand of the present invention, the cells may be immobilized with daltaraldehyde, formalin, or the like.
  • the immobilization method can be performed according to a method known per se.
  • the cell containing the protein of the present invention refers to a host cell expressing the protein of the present invention.
  • Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast, insect cells, animal cells and the like are used as the host cell.
  • the cell membrane fraction refers to a cell membrane-rich fraction obtained by disrupting cells and then obtained by a method known per se.
  • Cells can be crushed by crushing the cells with a Potter-Elvehjem homogenizer, crushing with a Pelling Blender ⁇ Polytron (manufactured by Kinematica), crushing with an ultrasonic wave, pressing the cells from a narrow nozzle while applying pressure with a French press, etc. Fracture due to eruption is mentioned.
  • centrifugal fractionation methods such as differential centrifugation and density gradient centrifugation are mainly used.
  • the cell lysate is slow (500 centrifugation for a short period of time (typically about 1 to 10 minutes) at a speed of 1 to 3 minutes (rpm to 3000 rpm), and centrifugation of the supernatant at a higher speed (15000 to 30000 rpm) for a period of usually 30 minutes to 2 hours.
  • the precipitate is the membrane fraction.
  • the membrane fraction is rich in the expressed protein and membrane components such as cell-derived phospholipids and membrane proteins.
  • the amount of protein in cells containing the protein or its membrane fraction is the amount of protein in cells containing the protein or its membrane fraction.
  • the protein fraction is preferably a natural receptor protein fraction or a recombinant receptor protein fraction having an activity equivalent thereto.
  • equivalent activity refers to equivalent ligand binding activity, signal transduction action, and the like.
  • the labeled test compound [3 H], [125 I], [14 C], [35 S] labeled angiotensin etc., bombesin, Kanapinoido, Koreshisutoki Nin, glutamine, serotonin, melatonin, neuropeptide Y , Obioid, Purine, Vasoplethsin, Oxytocin, PACAP, Secretin, Glucagon, Calcitonin, Adrenomedullin, Somatosin, GHRH, CRF, ACTH, GRP, PTH, VIP (Vasoactive Intestinal and Retained Polypeptides) ), Somatos-tin, dopamine, motilin, amylin, bradykinin, CGRP (calcitonin gene-related peptide), leukotriene, pancreastatin, prostaglandin, tropoxane, adenosine, adrenaline, and / 3 —Chemokines (eg, IL-8, GR
  • a cell or a membrane fraction of the cell containing the protein of the present invention is suspended in a buffer suitable for the determination method.
  • the buffer may be any buffer such as a phosphate buffer having a pH of 4 to 10 (preferably pH 6 to 8) or a buffer such as a tris-hydrochloride buffer, which does not inhibit the binding between the ligand and the protein of the present invention.
  • various proteins such as surfactants such as CHAPS, Tween-80 TM (Kao-Atlas), digitonin, and dexicolate, serum albumin, and gelatin are used.
  • a protease inhibitor such as PMS F, Leptin, E-64 (manufactured by Peptide Research Laboratories), or Peptisutin is added for the purpose of suppressing receptor degradation and ligand degradation by protease. You can do it.
  • a protease inhibitor such as PMS F, Leptin, E-64 (manufactured by Peptide Research Laboratories), or Peptisutin is added for the purpose of suppressing receptor degradation and ligand degradation by protease. You can do it.
  • PMS F protease inhibitor
  • Leptin Leptin
  • E-64 manufactured by Peptide Research Laboratories
  • the reaction is carried out at about 0 to 50 ° C, preferably about 4: to 37 ° C, for about 20 minutes to 24 hours, preferably for about 30 minutes to 3 hours.
  • the reaction solution is filtered through a glass fiber filter or the like, washed with an appropriate amount of the same buffer, and the radioactivity remaining on the glass fiber filter is measured using a liquid scintillation counter or an oven.
  • a test compound whose count (B-NSB) obtained by subtracting the non-specific binding amount (NSB) from the total binding amount (B) exceeds Ocpm is selected as a ligand (agonist) for the protein of the present invention or a salt thereof. Can be.
  • cell stimulating activity via the protein for example, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ Release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein Phosphorylation, activation of c-fos, activity of promoting or suppressing pH reduction, etc.
  • cell stimulating activity via the protein for example, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ Release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein Phosphorylation, activation of c-fos, activity of promoting or suppressing pH reduction, etc.
  • the assay Before performing ligand determination, replace the medium with a fresh medium or an appropriate buffer that is not toxic to cells, add test compounds, etc., incubate for a certain period of time, and then extract cells or collect supernatant.
  • the products produced are quantified according to the respective method. If the production of a substance (for example, arachidonic acid) as an indicator of cell stimulating activity is difficult due to a degrading enzyme contained in a cell, the assay may be performed by adding an inhibitor against the degrading enzyme. . In addition, activities such as suppression of cAMP production can be detected as an activity of suppressing production of cells whose basic production has been increased by forskolin or the like.
  • a substance for example, arachidonic acid
  • activities such as suppression of cAMP production can be detected as an activity of suppressing production of cells whose basic production has been increased by forskolin or the like.
  • the kit for determining a ligand that binds to the protein of the present invention or a salt thereof contains the protein of the present invention or a salt thereof, the partial peptide of the present invention or a salt thereof, a cell containing the protein of the present invention, or a protein of the present invention. It contains the membrane fraction of the cells to be treated.
  • Examples of the ligand determination kit of the present invention include the following. 1. Reagent for ligand determination
  • the solution may be sterilized by filtration through a 0.45 zm filter and stored at 4 ° C, or may be prepared at use.
  • CHO cells expressing the protein of the present invention were subcultured on a 12-well plate at 5 ⁇ 10 5 Z holes and cultured for 2 days at 37 ° (: 5% C 2 , 95% air).
  • the same as the labeled compound is prepared at a concentration 100 to 1000 times higher.
  • the ligand capable of binding to the protein of the present invention or a salt thereof includes, for example, substances specifically present in the brain, pituitary gland, engulf, and the like. Specifically, angiotensin and bombesin , Canapinoid, cholecystokinin, glumin, serotonin, melatonin, neuropeptide Y, opioid, purine, vasopressin, oxitosine, PACAP, secretin, glucagon, calcitonin, adrenomedullin, somatosulin, GHRH, CRF, A CTH, GRP, PTH, VIP (Vasoactive Intestinal And Renewed Polypeptide), Somatosin, Dopamine, Motilin, Amylin, Bradykinin, CGRP (Calcitonin Gene Relayed Peptide), Leukotriene, Pancrea Statins, pros Prostaglandin, Tron Bokisan, adenosine,
  • the protein of the present invention or the DNA encoding the protein can be replaced with the protein of the present invention in accordance with the action of the ligand. It can be used as a medicament such as a preventive and / or therapeutic agent for diseases associated with dysfunction.
  • the DNA encoding the protein of the present invention is useful as a medicament such as a preventive and / or therapeutic agent for diseases associated with dysfunction of the safe and low-toxic receptor protein of the present invention.
  • the protein of the present invention or the DNA of the present invention may be used for central diseases (eg, Alzheimer's disease, dementia's eating disorders (anorexia), epilepsy, etc.), hormonal diseases (eg, weak labor, laxative bleeding, before and after delivery of the placenta, uterus) Renal failure, cesarean section, abortion, milk stasis, etc., liver / bile / win / endocrine disorders (eg, diabetes, eating disorders, etc.), inflammatory diseases (allergies, asthma, rheumatism, etc.), cardiovascular diseases (Eg hypertension-cardiac hypertrophy 'angina pectoris ⁇ arteriosclerosis, etc.) and is useful for Z or treatment.
  • central diseases eg, Alzheimer's disease, dementia's eating disorders (anorexia), epilepsy, etc.
  • hormonal diseases eg, weak labor, laxative bleeding, before and after delivery of the placenta, uterus Renal failure, cesarean section, abortion, milk stas
  • the protein of the present invention When the protein of the present invention is used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent, it can be formulated according to a conventional method.
  • the DNA encoding the protein of the present invention hereinafter sometimes abbreviated as the DNA of the present invention
  • the DNA of the present invention may be used alone or in a retroviral vector or adenovirus. After insertion into a suitable vector such as a virus vector or an adenovirus associated virus vector, the method can be carried out according to a conventional method.
  • the DNA of the present invention can be administered as it is or together with adjuvants for promoting uptake, using a gene gun or a catheter such as a hydrogel catheter.
  • the protein of the present invention or (2) DNA encoding the protein may be orally administered as tablets, capsules, elixirs, microcapsules, or the like, or coated with water or other water, if necessary. It can be used parenterally in the form of injections, such as sterile solutions with pharmaceutically acceptable liquids or suspensions.
  • the protein of the present invention or (2) DNA encoding the protein is generally recognized together with known physiologically recognized carriers, flavors, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, and the like. It can be manufactured by mixing in the unit dosage form required for the practice of the formulation. The amount of active ingredient in these preparations is such that a suitable dosage in the specified range can be obtained.
  • Additives that can be incorporated into tablets, capsules, etc. include, for example, binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, alginic acid, etc.
  • binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, gum arabic
  • excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, alginic acid, etc.
  • leavening agents such as magnesium stearate
  • sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin
  • flavoring agents such as peppermint, cocoa oil or cherry are used.
  • a liquid carrier such as oils and fats can be further contained in the above type of material.
  • Sterile compositions for injection can be formulated according to standard pharmaceutical practice, such as dissolving or suspending the active substance in vehicles such as water for injection, or naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, coconut oil, etc. .
  • aqueous solution for injection for example, physiological saline, isotonic solution containing glucose and other auxiliary agents (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.) and the like are used.
  • Agent for example For example, alcohols (eg, ethanol), polyalcohols (eg, propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactants (eg, Polysorbate 80 TM , HCO-50) may be used in combination.
  • oily liquid for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and may be used in combination with solubilizers such as benzyl benzoate and benzyl alcohol.
  • prophylactic / therapeutic agent examples include a buffer (for example, a phosphate buffer and a sodium acetate buffer), a soothing agent (for example, benzalkonidum chloride, pro-proin hydrochloride, etc.), a stabilizer (for example, It may be combined with human serum albumin, polyethylene glycol, etc.), preservatives (eg, benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidants and the like.
  • a buffer for example, a phosphate buffer and a sodium acetate buffer
  • a soothing agent for example, benzalkonidum chloride, pro-proin hydrochloride, etc.
  • a stabilizer for example, It may be combined with human serum albumin, polyethylene glycol, etc.
  • preservatives eg, benzyl alcohol, phenol, etc.
  • antioxidants and the like examples of the prophylactic / therapeutic agent.
  • the prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic, for example, against human mammals (for example, rats, puppies, sheep, bush, bush, cats, cats, dogs, monkeys, etc.). Can be administered.
  • human mammals for example, rats, puppies, sheep, bush, bush, cats, cats, dogs, monkeys, etc.
  • the dosage of the protein or DNA of the present invention varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method, and the like.
  • oral administration in general, in anorexic patients (60 kg) in adults, About 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg per day.
  • the single dose varies depending on the subject, target organ, symptoms, administration method, etc.
  • anorexia nervosa in adults (as 6 O kg)
  • the dose can be administered in terms of 6 O kg.
  • the DNA of the present invention can be used as a probe to produce the protein of the present invention or a portion thereof in a human or mammal (eg, rat, rabbit, rabbit, sheep, bush, rabbit, cat, dog, monkey, etc.).
  • DNA or m encoding the peptide Since RNA abnormality (gene abnormality) can be detected, it is useful as a gene diagnostic agent for, for example, damage, mutation or decreased expression of the DNA or mRNA, and increase or excessive expression of the DNA or mRNA. .
  • the above-described genetic diagnosis using the DNA of the present invention can be performed, for example, by the known Northern hybridization or PCR-S SCP method (Genomics, Vol. 5, pp. 874-879 (1989), Procagings. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America; 86, 2766-2770 (1989) It can be implemented by such means.
  • the concentration of the ligand in the living body can be quantified with high sensitivity.
  • the quantification method of the present invention can be used, for example, in combination with a competition method. That is, the ligand concentration in the sample can be measured by bringing the sample into contact with the protein of the present invention or the like. Specifically, for example, it can be used according to the method described in (1) or (2) below or a method analogous thereto.
  • the binding between the ligand and the protein or the like of the present invention can be achieved.
  • peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, etc. or salts thereof can be efficiently screened.
  • Such compounds include (ii) cell stimulation via G protein-coupled receptor Activity (e.g., Arakidon acid release, acetylcholine release, intracellular C a 2 + release, intracellular c AM P production, intracellular c GM P, production of inositol phosphate, changes in cell membrane potential, phosphorylation of intracellular proteins, c (I) a compound having an activity of promoting or suppressing the activation of fos, a decrease in pH, etc.
  • G protein-coupled receptor Activity e.g., Arakidon acid release, acetylcholine release, intracellular C a 2 + release, intracellular c AM P production, intracellular c GM P, production of inositol phosphate, changes in cell membrane potential, phosphorylation of intracellular proteins, c
  • G protein-coupled receptor Activity e.g., Arakidon acid release, acetylcholine release, intracellular C a 2 + release, intracellular c AM P production, intra
  • the compound of (a) be screened by the ligand determination method described above).
  • the present invention relates to (i) the case where the protein of the present invention, its partial peptide or a salt thereof is brought into contact with a ligand, and (ii) the protein of the present invention, its partial peptide or a salt thereof, Screening of a compound or a salt thereof that changes the binding property between the ligand and the protein of the present invention, a partial peptide thereof or a salt thereof, which is compared with the case where the ligand and the test compound are brought into contact with each other.
  • the screening method of the present invention is characterized in that, in the cases (i) and (ii), for example, the amount of a ligand bound to the protein or the like, the cell stimulating activity, and the like are measured and compared.
  • the present invention provides
  • the labeled ligand and the test compound are brought into contact with the cell containing the protein or the like of the present invention or the membrane of the cell.
  • the method is characterized in that the amount of the labeled ligand bound to the cell or the membrane fraction when contacted with the fraction is measured and compared.
  • a compound that activates the protein or the like of the present invention for example, a ligand for the protein or the like of the present invention
  • a cell containing the protein or the like of the present invention or when the protein or the like of the present invention is activated.
  • Receptor-mediated cell stimulating activity eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular c
  • a compound and a test compound are brought into contact with cells containing the protein of the present invention.
  • a method for screening a compound or a salt thereof that changes the binding property between a ligand and a protein of the present invention which is characterized by measuring and comparing;
  • a compound that activates the protein or the like of the present invention eg, a ligand for the protein or the like of the present invention
  • a transformant containing the DNA of the present invention When the cells are brought into contact with a protein or the like, the compound or the like that activates the protein or the like of the present invention and the test compound are expressed on the cell membrane by culturing a transformant containing the DNA of the present invention.
  • cell stimulating activity mediated by the receptor e.g., Arakidon acid release, acetylcholine release, intracellular C a 2 + release, intracellular c AM P production, intracellular c GM P product, inositol phosphate production, cell membrane Potential fluctuation, phosphorylation of intracellular proteins, activation of c-fos, activity to promote or suppress pH reduction, etc.
  • a method for screening a compound or a salt thereof, which changes the binding property between the ligand and the protein of the present invention which is characterized by measuring and comparing
  • a cell, tissue or cell membrane fraction containing a G protein-coupled receptor receptor protein such as a rat is used.
  • candidate compounds primary screening
  • secondary screening to confirm whether the candidate compounds actually inhibit the binding of human G protein-coupled receptor protein to ligand was needed. If the cell, tissue or cell membrane fraction is used as it is, other receptor proteins are also mixed, so it was difficult to actually screen for an agonist or antagonist against the target receptor protein.
  • the human-derived protein of the present invention primary screening is not required, and it is possible to efficiently screen for a compound that inhibits the binding between a ligand and a G protein-coupled receptor protein. it can. Furthermore, whether the screened compound is an agonist or an engonist can be easily evaluated.
  • the protein and the like of the present invention used in the screening method of the present invention may be any as long as they contain the above-described protein and the like of the present invention.
  • Cell membrane fractions of mammalian organs are preferred.
  • human-derived receptor proteins expressed in large amounts using recombinants are suitable for screening.
  • the above-mentioned method is used for producing the protein and the like of the present invention, but it is preferably carried out by expressing the DNA of the present invention in mammalian cells and insect cells.
  • Complementary DNA is used as the DNA fragment encoding the target protein portion, but is not necessarily limited to this.
  • gene fragments or synthetic DNA may be used.
  • NPV virus
  • the promoter into the downstream of the promoter overnight, the retrovirus promoter, the metamouth thionein promoter, the human heat shock promoter, the cytomegalovirus promoter overnight, and the SRo! Promoter.
  • the amount and quality of the expressed receptor can be examined by a method known per se.
  • the method can be carried out according to the method described in the literature [Namb i, P. et al., The Journal 'ob' Biological Chemistry (J. Biol. Chem.), 267, 19555-19559, 1992]. Can be.
  • the protein or the like containing the protein of the present invention may be a protein or the like purified according to a method known per se, or a cell containing the protein or the like may be used. Alternatively, a membrane fraction of a cell containing the protein or the like may be used.
  • the cells When cells containing the protein or the like of the present invention are used in the screening method of the present invention, the cells may be immobilized with daltaraldehyde, formalin, or the like.
  • the immobilization method can be performed according to a method known per se.
  • the cell containing the protein or the like of the present invention refers to a host cell that expresses the protein or the like, and the host cell is preferably Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast, insect cells, animal cells, or the like.
  • the cell membrane fraction refers to a cell membrane-rich fraction obtained by disrupting cells and then obtained by a method known per se.
  • Cell crushing methods include crushing the cells with a Potter-Elvehj em-type homogenizer, crushing with a Perling Blender- 10 Polytron (Kinematica), crushing with ultrasonic waves, and applying pressure with a French press. Examples include crushing by ejecting cells from a thin nozzle.
  • centrifugal fractionation methods such as differential centrifugation and density gradient centrifugation are mainly used.
  • the cell lysate is centrifuged at a low speed (500 rpm to 300 rpm) for a short time (usually about 1 minute to 10 minutes), and the supernatant is further centrifuged (150 rpm to 30000 rpm). (0.0000 rpm) at 30 minutes to 2 hours
  • the precipitate obtained is used as the membrane fraction.
  • the membrane fraction is rich in expressed proteins and membrane components such as cell-derived phospholipids and membrane proteins.
  • the amount of the protein in a cell or a membrane fraction containing the protein or the like is preferably 10 3 to 10 8 molecules per cell, and more preferably 10 5 to 10 7 molecules per cell.
  • the protein fraction is preferably a natural receptor protein fraction or a recombinant receptor protein protein having an activity equivalent thereto.
  • “equivalent activity” means equivalent ligand binding activity, signal transduction action, and the like.
  • a labeled ligand, a labeled ligand analog compound, or the like is used as the labeled ligand.
  • ligands labeled with [ 3 H], [ 125 I], [ 14 C], [ 35 S] and the like are used.
  • a membrane fraction of a cell or a cell containing the protein of the present invention is first suitable for screening.
  • a buffer Any buffer may be used as long as it does not inhibit the binding between the ligand and the protein, such as a phosphate buffer having a pH of 4 to 10 (preferably pH 6 to 8) and a buffer of Tris-HCl.
  • a surfactant such as CHAPS, Tween-80 TM (Kaoichi Atlas), digitonin, or deoxycholate can be added to the buffer.
  • protease inhibitors such as PMSF, leptin, E-64 (manufactured by Peptide Research Institute), and peptide suptin can be added for the purpose of suppressing receptor degradation and degradation of the ligand by proteases.
  • 0. Label a certain amount (5000 cpm to 5 OOOOO cpm) on the receptor solution of Olml to 10 ml.
  • the reaction solution is filtered through a glass fiber filter paper or the like, washed with an appropriate amount of the same buffer, and the radioactivity remaining on the glass fiber filter paper is measured using a liquid scintillation counter or an air counter.
  • the count (B. NSB) which is obtained by subtracting the non-specific binding amount (NSB) from the count when no antagonist is present (B.)
  • the specific binding amount (B-NS B) ) Potency For example, a test compound having a potency of 50% or less can be selected as a candidate substance having a competitive inhibitory ability.
  • a protein-mediated cell stimulating activity for example, arachidonic acid release, acetylcholine release, Promotes intracellular Ca 2+ release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, fluctuations in cell membrane potential, phosphorylation of intracellular proteins, activation of c-fos, lowering of pH, etc.
  • Activity or inhibitory activity can be measured using a known method or a commercially available measurement kit.
  • cells containing the protein or the like of the present invention are cultured in a multiwell plate or the like. Before conducting screening, replace the cells with fresh medium or an appropriate buffer that is not toxic to cells, add test compounds, etc., incubate for a certain period of time, and then extract cells or remove supernatant. Collect and quantify the product produced according to each method. If the production of a substance (for example, arachidonic acid) as an indicator of cell stimulating activity is difficult due to a degrading enzyme contained in cells, an inhibitor for the degrading enzyme is added to perform the assay. Is also good. In addition, activities such as inhibition of CAMP production can be detected as an activity of inhibiting production of cells whose basic production has been increased with forskolin or the like.
  • a substance for example, arachidonic acid
  • Cells expressing the protein of the present invention and the like are preferably cell lines having the natural protein of the present invention and the like, and cell lines expressing the above-mentioned recombinant proteins and the like.
  • test compounds for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, etc. are used, and these compounds are novel compounds. Or a known compound. ,
  • a screening kit for a compound or a salt thereof that alters the binding property between a ligand and the protein or the like of the present invention may be a cell containing the protein or the like of the present invention, or a cell containing the protein or the like of the present invention. And a membrane fraction containing the same.
  • screening kit of the present invention examples include the following. 1. Screening reagent
  • CHO cells expressing the protein of the present invention were subcultured on a 12-well plate in 5 ⁇ 10 5 Z-wells and cultured at 37 ° C., 5% C 2 , 95% air for 2 days.
  • the compound or a salt thereof obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is a compound having an action of changing the binding property between the ligand and the protein or the like of the present invention.
  • cell stimulating activity via G protein-coupled receptor eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular cAMP generation, intracellular cGMP generation, inositol lysate
  • G protein-coupled receptor eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular cAMP generation, intracellular cGMP generation, inositol lysate
  • a so-called agonist to the protein of the present invention having an activity of promoting or suppressing acid production, fluctuation of cell membrane potential, phosphorylation of intracellular protein, activation of c-fos, decrease of pH, etc.
  • (Mouth) a compound not having the cell stimulating activity (so-called angonist for the protein of the present invention); A compound that enhances the binding force between Gand and the G protein-coupled protein of the present invention, or (2) a compound that decreases the binding force between the ligand and the G protein-coupled protein of the present invention.
  • Examples of the compound include a peptide, a protein, a non-peptidic compound, a synthetic compound, a fermentation product, and the like. These compounds may be novel compounds or known compounds.
  • the agonist against the protein or the like of the present invention has the same action as the physiological activity of the ligand on the protein or the like of the present invention, it is a safe and low toxic drug depending on the ligand activity
  • a central disease Eg Alzheimer's disease ⁇ dementia 'eating disorders (anorexia) ⁇ epilepsy etc.
  • hormonal diseases eg weak labor, flaccid bleeding, before and after placenta delivery, uterine remodeling failure, cesarean section, abortion, milk stasis Hepatic / biliary / ⁇ / endocrine disorders (eg, diabetes, eating disorders, etc.), inflammatory disorders (eg, allergy, asthma, rheumatism, etc.), cardiovascular diseases (eg, hypertension, cardiac hypertrophy, angina pectoris) ⁇ Prevention and / or treatment of arteriosclerosis).
  • central disease Eg Alzheimer's disease ⁇ dementia 'eating disorders (anorexia) ⁇ epilepsy etc.
  • hormonal diseases eg weak labor,
  • Angonist against the protein or the like of the present invention can suppress the physiological activity of the ligand against the protein or the like of the present invention, and thus is a safe and low toxic drug that suppresses the ligand activity [eg, hormone secretion regulator Central diseases, hormonal diseases, hepatobiliary Z ⁇ Z endocrine diseases (eg, anti-obesity drugs, excessive eating, etc.), and inflammatory diseases caused by excessive production of ligands for the proteins and the like of the present invention. Disease, cardiovascular disease prevention and Z or therapeutic agents].
  • hormone secretion regulator Central diseases, hormonal diseases, hepatobiliary Z ⁇ Z endocrine diseases (eg, anti-obesity drugs, excessive eating, etc.), and inflammatory diseases caused by excessive production of ligands for the proteins and the like of the present invention.
  • Disease, cardiovascular disease prevention and Z or therapeutic agents e.g, cardiovascular disease prevention and Z or therapeutic agents.
  • Compounds that decrease the binding force between the ligand and the protein of the present invention include safe and low-toxic drugs for decreasing the physiological activity of the ligand for the protein of the present invention [for example, hormone secretion regulators, the present invention Prevention of central diseases, hormonal diseases, hepatic / biliary Z Teng endocrine diseases (eg, anti-obesity drugs, overeating, etc.), inflammatory diseases, and circulatory diseases caused by excessive production of ligands for proteins, etc. And or therapeutic agents, etc.].
  • a compound or a salt thereof obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is used as the above-mentioned pharmaceutical composition, it is subjected to a conventional method.
  • a conventional method can be implemented.
  • tablets, capsules, elixirs, microcapsules, sterile solutions, suspensions, and the like can be prepared in the same manner as the above-mentioned drug containing the protein of the present invention.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic, they can be administered, for example, to human mammals (for example, rats, puppies, sheep, pigs, puppies, cats, dogs, monkeys, etc.). can do.
  • human mammals for example, rats, puppies, sheep, pigs, puppies, cats, dogs, monkeys, etc.
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, and the like. However, in the case of oral administration, in general, for an adult (as 60 kg), the dose is daily. About 0.1 to: L 00 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 2 Omg. In the case of parenteral administration, the single dose varies depending on the administration target, target organ, symptoms, administration method, and the like. For example, in the case of an injection, it is usually one dose for adults (as 6 O kg). It is convenient to administer intravenously about 0.01 to 3 Omg per day, preferably about 0.1 to 2 Omg, more preferably about 0.1 to 1 Omg. In the case of other animals, the dose can be administered in terms of 6 O kg.
  • the antibody of the present invention can specifically recognize the protein and the like of the present invention, it can be used for quantification of the protein and the like of the present invention in a test solution, particularly for quantification by a sandwich immunoassay. That is, the present invention is characterized by, for example, (i) reacting the antibody of the present invention with a test wave and a labeled protein or the like competitively and measuring the ratio of the labeled protein or the like bound to the antibody.
  • a method for quantifying the protein or the like of the present invention in a test solution is characterized by, for example, (i) reacting the antibody of the present invention with a test wave and a labeled protein or the like competitively and measuring the ratio of the labeled protein or the like bound to the antibody.
  • the monoclonal antibody of the present invention (hereinafter sometimes referred to as the monoclonal antibody of the present invention), and detection by tissue staining, etc. it can.
  • the antibody molecule itself may be used, or the F (ab ') 2 , Fab', or Fab fraction of the antibody molecule may be used.
  • the assay method using an antibody against the protein or the like of the present invention is not particularly limited, and the amount of the antibody, antigen or antibody-antigen complex corresponding to the amount of antigen (eg, the amount of protein) in the test solution is determined. Any measurement method can be used as long as it is detected by chemical or physical means and calculated from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of antigen. For example, nephrometry, a competition method, an immunometric method and a sandwich method are preferably used, but in terms of sensitivity and specificity, a sandwich method described later is particularly preferable.
  • a labeling agent used in a measurement method using a labeling substance for example, a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance and the like are used.
  • the radioisotope for example, [1 2 5 I], [1 3 1 I], [3 H], and [1 4 C] used.
  • the enzyme is preferably a stable enzyme having a large specific activity.
  • i3-galactosidase, j3-dalcosidase, alkaline phosphatase, peroxidase, malate dehydrogenase and the like are used.
  • the fluorescent substance for example, fluorescamine, fluorescein isothiosinate and the like are used.
  • the luminescent substance for example, luminol, luminol derivative, luciferin, lucigenin and the like are used.
  • a biotin-avidin system can be used for binding the antibody or antigen to the labeling agent.
  • insolubilization of an antigen or an antibody physical adsorption may be used, or a method using a chemical bond usually used for insolubilizing and immobilizing a protein or an enzyme may be used.
  • the carrier for example, insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose, synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon, and glass are used.
  • test solution was added to the insolubilized monoclonal antibody of the present invention.
  • Primary reaction followed by the reaction of the labeled monoclonal antibody of the present invention (secondary reaction), and then measuring the activity of the labeling agent on the insolubilized carrier.
  • the amount of the protein of the invention can be determined.
  • the primary reaction and the secondary reaction may be performed in the reverse order, may be performed simultaneously, or may be performed at staggered times.
  • the labeling agent and the method of insolubilization can be the same as those described above.
  • the antibody used for the solid phase antibody or the labeling antibody does not necessarily need to be one type, and a mixture of two or more types of antibodies is used for the purpose of improving measurement sensitivity and the like. You may.
  • the monoclonal antibody of the present invention used in the primary reaction and the secondary reaction is an antibody having a different binding site to the protein or the like of the present invention. It is preferably used. That is, when the antibody used in the primary reaction and the secondary reaction is, for example, the antibody used in the secondary reaction recognizes the C-terminal of the protein of the present invention, the antibody used in the primary reaction is preferably An antibody that recognizes other than the C-terminal, for example, the N-terminal, is used.
  • the monoclonal antibody of the present invention can be used in a measurement system other than the sandwich method, for example, a competition method, an immunometric method, or a nephrometry.
  • a competition method the antigen in the test solution and the labeled antigen are allowed to react competitively with the antibody, and then the unreacted labeled antigen is separated from (F) and the labeled antigen (B) bound to the antibody. Then (BZF separation), measure the labeling amount of either B or F, and determine the amount of antigen in the test solution.
  • a soluble antibody is used as an antibody
  • BZF separation is performed using polyethylene render
  • a liquid phase method using a second antibody against the antibody a solid phase antibody is used as the first antibody
  • An immobilization method using an immobilized antibody as the second antibody and a soluble antibody is used for the first antibody.
  • an antigen in a test solution and a solid-phased antigen are subjected to a competitive reaction with a fixed amount of a labeled antibody, and then the solid phase and the liquid phase are separated. Is allowed to react with an excess amount of the labeled antibody. Then, the immobilized antigen is added to bind the unreacted labeled antibody to the solid phase, and then the solid phase and the liquid phase are separated. Then either The amount of the label in the phase is measured, and the amount of the antigen in the test solution is quantified.
  • nephelometry the amount of insoluble sediment generated as a result of an antigen-antibody reaction in a gel or in a solution is measured. Even when the amount of antigen in the test solution is small and only a small amount of sediment is obtained, laser-nephrometry utilizing laser-scattering is preferably used.
  • the protein of the present invention or a salt thereof can be quantified with high sensitivity by using the antibody of the present invention. Furthermore, various diseases can be diagnosed by quantifying the protein of the present invention or its salt using the antibody of the present invention.
  • the antibody of the present invention can be used for detecting the protein of the present invention or the like present in a subject such as a body fluid or a tissue. Further, the protein of the present invention is purified. It can be used for preparing an antibody column to be used for the detection, detecting the protein of the present invention in each fraction at the time of purification, analyzing the behavior of the protein of the present invention in test cells, and the like.
  • a transgenic non-human animal expressing the protein or the like of the present invention can be prepared.
  • Non-human animals include mammals (e.g., rats, mice, egrets, sheep, sheep, pigs, pests, cats, dogs, monkeys, etc.) and the like (hereinafter abbreviated as animals). ⁇ egrets are suitable.
  • the DNA of the present invention In transferring the DNA of the present invention to a target animal, it is generally advantageous to use the DNA as a gene construct linked downstream of a promoter capable of being expressed in animal cells.
  • a gene construct linked to the downstream of various promoters capable of expressing the DNA of the present invention derived from an animal having high homology to animal cells for example, DNA
  • DNA microinjection into fertilized eggs of a heron a DNA-transferred animal that highly produces the protein of the present invention can be produced.
  • a ubiquitous expression promoter such as a virus-derived promoter or meta-mouth thionein may be used, but preferably, an NGF gene promoter specifically expressed in the brain, and a phenolase gene promoter are used.
  • Transfer of the DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the target animal.
  • the presence of the protein or the like of the present invention in the germinal cells of the produced animal after the transfer of DNA means that all the offspring of the produced animal have the protein or the like of the present invention in all of its germ cells and somatic cells.
  • the offspring of this type of animal that has inherited the gene have the protein of the present invention in all of its germinal and somatic cells.
  • the DNA-transferred animal of the present invention can be bred in a normal breeding environment as a DNA-bearing animal after confirming that the gene is stably maintained by the cross. Furthermore, by crossing male and female animals having the target DNA, a homozygous animal having the transgene on both homologous chromosomes is obtained, and by crossing the male and female animals, all progeny have the DNA. Breeding can be carried out as follows.
  • the animal to which the DNA of the present invention has been transferred has high expression of the protein or the like of the present invention, and thus is useful as an agonist for screening the protein or the like of the present invention or an animal for screening an gonist.
  • the DNA transgenic animal of the present invention can also be used as a cell source for tissue culture.
  • tissue culture For example, by directly analyzing the DNA or RNA in the tissue of the DNA-transferred mouse of the present invention or by analyzing the tissue in which the protein of the present invention expressed by the gene is present, the protein of the present invention can be obtained. Can be analyzed. Cells of a tissue having the protein or the like of the present invention can be cultured by standard tissue culture techniques, and these can be used to study the function of cells from tissues that are generally difficult to culture, such as those derived from brain or peripheral tissues. it can. In addition, by using the cells, for example, it is possible to select a drug that enhances the function of various tissues. Further, if there is a high expression cell line, the protein of the present invention can be isolated and purified therefrom.
  • bases, amino acids, and the like are indicated by abbreviations based on the abbreviations by the IUPAC-I UB Commission on Biochemical Nomenclature or commonly used abbreviations in the art, and examples thereof are described below.
  • amino acids may have optical isomers, L-form shall be indicated unless otherwise specified.
  • HONB trihydroxy-5-norporene-2,3-dicarboximide
  • FIG 1 shows the amino acid sequence of the human brain-derived protein of the present invention.
  • Example 7 shows a base sequence of a for-primed primer used in Example 2 described later.
  • Example 7 shows the nucleotide sequence of a reverse primer used in Example 2 described later.
  • Example 7 shows the nucleotide sequence of a probe used in Example 2 described later.
  • the composition of the reaction solution used in the reaction was one-tenth of the above cDNA as type III, and 1Z50 amount of Advantage2 Polymerase Mix (CLONTECH), primer 1 and primer 2 were added at 0.2 M each, dNTPs 200 M, and Attached to enzyme
  • the buffer was added to obtain a liquid volume of.
  • the PCR reaction is performed at 95 ° C for 1 minute, 95 ° C for 30 seconds, 5 cycles of 72 ° C for 4 minutes, 95 ° C for 30 seconds, and for 5 cycles of 70 ° for 4 minutes.
  • the cycle of 30 seconds, 68 ° C for 30 seconds, and 66 ° C for 4 minutes was repeated 30 times, and the extension reaction was performed at 68 ° C for 3 minutes.
  • the reaction product after the PCR reaction was subcloned into plasmid vector 1 / V5 / His (Invitrogen) according to the prescription of the Cloning Kit (Invitrogen), and the resulting plasmid was named pcDNA3.AQ27. did.
  • cDNA sequence was obtained.
  • a protein having an amino acid sequence derived from this cDNA was named AQ27, and this transformant was named Escherichia coli DH5a / pcDNA3.AQ27.
  • primers and probes were designed using Primer Express ver.1.0 (PE Biosystems Japan), and forward primers AQ27taqF (5'-CAATG CTAGG TGTGG TCTGG CT-3 '(SEQ ID NO: 5)) and reverse primers AQ27taqR (5'-GATCT CAAGT TGTTG CACGT GC-3 '(SEQ ID NO: 6)) and probe AQ27-515T (5'-TGGCA GTCAT CGTAG GATCA CCCAT G-3' (SEQ ID NO: 7)) were prepared.
  • the reporter dye of the probe was labeled with FA (6-carboxyfluorescein).
  • the standard cDNA is a PCR fragment obtained by amplifying pcDNA3.AQ27 with type I using primer 1 (SEQ ID NO: 3) and primer 1 (SEQ ID NO: 4) using the QIAquick PCR Purification Kit [QIAGEN (Germany)]. and purified by, 10 ° - using 10 was prepared in 6 copies / 1.
  • the TaqMan PCR reaction is performed using TaqMan Universal PCR Master Mix (PE ) Was reacted with ABI PRISM 7700 Sequence Detection System (PE Biosystems Japan) according to the attached instructions. The results are shown in FIG. AQ27 was highly expressed in heart, liver and testis.
  • the cells were seeded at 2.7X10 5 cells / capsule, cultured overnight, and then set on a cytosensor (Molecular Devices). After the acidification rate stabilizes, Met-Enkephalin-Arg-Pheamide (Bachem, H-2835) is actuated at a concentration of 10 / M for 7 minutes and 2 seconds, and the activation of cells is determined based on the increase rate of the acidification rate. It was measured. As a result, it was confirmed that Met-Enkephalin-Arg-Pheamide specifically activated AQ27-expressing CH0 cells and reacted specifically with AQ27 (FIG. 5).
  • the protein of the present invention is: 1) determination of ligand (agonist), 2) acquisition of antibodies and antiserum, 3) expression system of recombinant protein 4 Receptor binding using the same expression system Development of Atsushi system and screening of drug candidate compounds 5
  • Drug design based on comparison with structurally similar ligands / receptors ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ Gene diagnosis It can be used as a reagent for the preparation of probes and PCR primers, (1) for the preparation of transgenic animals, or (2) as a medicament such as a gene preventive or therapeutic agent.

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Description

明細書 新規 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質およびその DN A 技術分野
本発明は、 ヒト脳由来の新規蛋白質 （G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質） ま たはその塩およびそれをコードする DN Aなどに関する。 背景技術
多くのホルモンや神経伝達物質は、 細胞膜に存在する特異的なレセプ夕ー蛋 白質を通じて生体の機能を調節している。 これらのレセプター蛋白質の多くは 共役している guanine nucleotide- binding protein (以下、 G蛋白質と略称す る場合がある） の活性化を通じて細胞内のシグナル伝達を行ない、 また 7個の 膜貫通領域を有する共通した構造をもっていることから、 G蛋白質共役型レセ プ夕ー蛋白質あるいは 7回膜貫通型レセプ夕一蛋白質と総称される。
G蛋白質共役型レセプター蛋白質は生体の細胞や臓器の各機能細胞表面に存 在し、 それら生体の細胞や臓器の機能を調節する分子、 例えばホルモン、 神経 伝達物質および生理活性物質等の標的として非常に重要な役割を担っている。 各種生体の細胞や臓器の内の複雑な機能を調節する物質と、 その特異的レセ プ夕ー蛋白質、 特には G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質との関係を明らかにす ることは、 各種生体の細胞や臓器の機能を解明し、 それら機能と密接に関連し た医薬品開発に非常に重要な手段を提供することとなる。
例えば、 脳などの中枢神経系の器官では、 多くのホルモン、 ホルモン様物質、 神経伝達物質あるいは生理活性物質などによる調節のもとで脳の生理的な機能 の調節が行なわれている。 特に、 神経伝達物質は脳内の様々な部位に存在し、 それぞれに対応するレセプ夕一蛋白質を通してその生理機能の調節を行ってい る。 脳内には未だ未知の神経伝達物質も多く、 そのレセプター蛋白質をコード する c DNAの構造に関しても、 これまで報告されていないものも多いと考え られる。 さらに、 既知のレセプ夕一蛋白質のサブタイプが存在するかどうかに ついても分かっていなかった。
脳における複雑な機能を調節する物質と、 その特異的レセプ夕一蛋白質との 関係を明らかにすることは、 医薬品開発に非常に重要な手段である。 また、 レ セプ夕一蛋白質に対するァゴニス卜、 アン夕ゴニストを効率よくスクリーニン グし、 医薬品を開発するためには、 脳内で発現しているレセプ夕一蛋白質の遺 伝子の機能を解明し、 それらを適当な発現系で発現させることが必要であった。 近年、 生体内で発現している遺伝子を解析する手段として、 C D N Aの配列 をランダムに解析する研究が活発に行なわれており、 このようにして得られた c D N Aの断片配列が Expres sed Sequence Tag ( E S T ) としてデ一夕ベース に登録され、 公開されている。 しかし、 多くの E S Tは配列情報のみであり、 その機能を推定することは困難である。 発明の開示
本発明は、 ヒト脳由来の新規蛋白質 （G蛋白質共役型レセプター蛋白質） 、 その部分べプチドまたはそれらの塩、 該蛋白質またはその部分べプチドをコ一 ドする D N Aを含有する D N A、 該 D N Aを含有する組換えべクタ一、 該組換 えベクターで形質転換された形質転換体、 該蛋白質またはその塩の製造法、 該 蛋白質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩に対する抗体、 該蛋白質 （G蛋白 質共役型レセプ夕一蛋白質） に対するリガンドの決定方法、 リガンドと該蛋白 質 （G蛋白質共役型レセプター蛋白質） との結合性を変化させる化合物または その塩のスクリーニング方法、 該スクリーニング用キット、 該スクリーニング 方法もしくはスクリーニングキットを用いて得られるリガンドと該蛋白質 （G 蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質） との結合性を変化させる化合物またはその塩、 およびリガンドと該蛋白質 （G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質） との結合性を 変化させる化合物またはその塩を含有してなる医薬などを提供する。
本発明者らは、 鋭意研究を重ねた結果、 ヒト脳由来の新規な蛋白質 （G蛋白 質共役型レセプター蛋白質） をコードする c D N Aを単離し、 全塩基配列を解 析することに成功した。 そして、 この塩基配列をアミノ酸配列に翻訳したとこ ろ、 第 1〜第 7膜貫通領域が疎水性プロット上で確認され、 これらの c DNA にコードされる蛋白質が 7回膜貫通型の G蛋白質共役型レセプター蛋白質であ ることを確認した （図 3) 。 本発明者らは、 これらの知見に基づいて、 さらに 研究を重ねた結果、 本発明を完成するに至った。
すなわち、 本発明は、
(1) 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の ァミノ酸配列を含有することを特徴とする蛋白質またはその塩、
(2) 上記 （1) 記載の蛋白質の部分ペプチドまたはその塩、
(3) 上記 （1) 記載の蛋白質をコードする DNAを含有する DNA、
(4) 配列番号： 2で表される塩基配列を有する上記 （3) 記載の DNA、
(5) 上記 （3) 記載の DN Aを含有する組換えべクタ一、
(6) 上記 （5) 記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体、
(7)上記（6)記載の形質転換体を培養し、 上記（1)記載の蛋白質を生成 · 蓄積せしめることを特徴とする上記 （1 ) 記載の蛋白質またはその塩の製造法、
(8) 上記 （1) 記載の蛋白質もしくは上記 （2) 記載の部分ペプチドまたは その塩に対する抗体、
(9) 上記 （1) 記載の蛋白質もしくは上記 （2) 記載の部分ペプチドまたは その塩を用いることを特徴とする上記 （1) 記載の蛋白質またはその塩に対す るリガンドの決定方法、
(1 0) 上記 （1) 記載の蛋白質もしくは上記 （2) 記載の部分ペプチドまた はその塩を用いることを特徴とするリガンドと上記 （1) 記載の蛋白質または その塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
(1 1) 上記 （1) 記載の蛋白質もしくは上記 （2) 記載の部分ペプチドまた はその塩を含有することを特徴とするリガンドと上記 （1) 記載の蛋白質また はその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キッ 卜、
(1 2) 上記 （1 0) 記載のスクリーニング方法または上記 （1 1) 記載のス クリーニング用キットを用いて得られうる、 リガンドと上記 （1) 記載の蛋白 質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩、
(13) 上記 （10) 記載のスクリーニング方法または上記 （11) 記載のス クリーニング用キットを用いて得られうる、 リガンドと上記 (1) 記載の蛋白 質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩を含有してなる医 薬、 および
(14) 上記 （3) 記載の DNAとハイストリンジェン卜な条件下でハイプリ ダイズする DN Aなどを提供する。
より具体的には、
(15) 蛋白質が、 ①配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列中の 1または 2 個以上 （好ましくは、 1〜30個程度、 より好ましくは 1〜9個程度、 さらに 好ましくは数個 （1または 2個） ） のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、 ②配 列番号： 1で表わされるアミノ酸配列に 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜 30個程度、 より好ましくは 1〜10個程度、 さらに好ましくは数個 （1また は 2個） ） のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、 ③配列番号： 1で表わされる アミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜30個程度、 より好ま しくは 1〜10個程度、 さらに好ましくは数個 （1または 2個） ） のアミノ酸 が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、 または④それらを組み合わせたァ ミノ酸配列を含有する蛋白質である上記 （1) 記載の蛋白質またはその塩、 (16) 上記 （1) 記載の蛋白質もしくはその塩または上記 （2) 記載の部分 ペプチドもしくはその塩と、 試験化合物とを接触させることを特徴とする上記 (10) 記載のリガンドの決定方法、
(17) リガンドがアンギオテンシン、 ボンべシン、 カナピノイド、 コレシス トキニン、 グルタミン、 セロトニン、 メラトニン、 ニューロペプチド Y、 オビ ォイド、 プリン、 バソプレツシン、 ォキシトシン、 PACAP、 セクレチン、 グルカゴン、 カルシトニン、 アドレノメジュリン、 ソマトス夕チン、 GHRH、 CRF、 ACTH、 GRP、 PTH、 V I P (バソアクティブ インテスティ ナル アンド リレイテッド ポリペプチド） 、 ソマトス夕チン、 ドーパミン、 モチリン、 アミリン、 ブラジキニン、 CGRP (カルシトニンジーンリレーテ イツドペプチド） 、 ロイコトリェン、 パンクレアスタチン、 プロスタグランジ ン、 トロンポキサン、 アデノシン、 アドレナリン、 ひおよび /3—ケモカイン (chemokine) (例えば、 I L— 8、 GROa、 GR〇;3、 GROァ、 NAP— 2、 ENA— 78、 PF4、 I P 10、 GCP - 2、 MCP_ 1、 HC 14、 MCP— 3、 I一 309、 M I P 1ひ、 M I P— 1 )3、 RANTESなど） 、 エンドセリン、 ェンテロガストリン、 ヒスタミン、 ニューロテンシン、 TRH、 パンクレアティックポリぺプ夕イドまたはガラニンである上記 （9) 記載のリ ガンドの決定方法、
(1 8) ( i ) 上記 （1) 記載の蛋白質もしくはその塩または上記 （2) 記載 の部分ペプチドもしくはその塩と、 リガンドとを接触させた場合と、 （ii) 上 記 （1) 記載の蛋白質もしくはその塩または上記 （2) 記載の部分ペプチドも しくはその塩と、 リガンドおよび試験化合物とを接触させた場合との比較を行 なうことを特徴とする上記 （1 1) 記載のスクリーニング方法、
(1 9) ( i) 標識したリガンドを上記 （1) 記載の蛋白質もしくはその塩ま たは上記（2) 記載の部分ペプチドもしくはその塩に接触させた場合と、 （ii) 標識したリガンドおよび試験化合物を上記 （1) 記載の蛋白質もしくはその塩 または上記 （2) 記載の部分ペプチドまたはその塩に接触させた場合における、 標識したリガンドの上記 （1) 記載の蛋白質もしくはその塩または上記 （2) 記載の部分ペプチドもしくはその塩に対する結合量を測定し、 比較することを 特徴とするリガンドと上記 （1) 記載の蛋白質またはその塩との結合性を変化 させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
(20) ( i) 標識したリガンドを上記 （1) 記載の蛋白質を含有する細胞に 接触させた場合と、 (ii) 標識したリガンドおよび試験化合物を上記 （1) 記 載の蛋白質を含有する細胞に接触させた場合における、 標識したリガンドの該 細胞に対する結合量を測定し、比較することを特徴とするリガンドと上記（1) 記載の蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスク リーニング方法、 (2 1) ( i) 標識したリガンドを上記 （1) 記載の蛋白質を含有する細胞の 膜画分に接触させた場合と、 （ii) 標識したリガンドおよび試験化合物を上記
(1) 記載の蛋白質を含有する細胞の膜画分に接触させた場合における、 標識 したリガンドの該細胞の膜画分に対する結合量を測定し、 比較することを特徴 とするリガンドと上記 （1) 記載の蛋白質またはその塩との結合性を変化させ る化合物またはその塩のスクリ一ニング方法、
(22) (i) 標識したリガンドを上記 （6) 記載の形質転換体を培養するこ とによって該形質転換体の細胞膜に発現した蛋白質に接触させた場合と、 （ii) 標識したリガンドおよび試験化合物を上記 （6) 記載の形質転換体を培養する ことによって該形質転換体の細胞膜に発現した蛋白質に接触させた場合におけ る、 標識したリガンドの該蛋白質に対する結合量を測定し、 比較することを特 徴とするリガンドと上記 （1) 記載の蛋白質またはその塩との結合性を変化さ せる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
(23) ( i) 上記 （1) 記載の蛋白質またはその塩を活性化する化合物を上 記 （1) 記載の蛋白質を含有する細胞に接触させた場合と、 （ii) 上記 （1) 記載の蛋白質またはその塩を活性化する化合物および試験化合物を上記 （ 1 ) 記載の蛋白質を含有する細胞に接触させた場合における、 蛋白質を介した細胞 刺激活性を測定し、 比較することを特徴とするリガンドと上記 （1) 記載の蛋 白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリ一ニン グ方法、
(24)上記（1) 記載の蛋白質またはその塩を活性化する化合物を上記（6) 記載の形質転換体を培養することによって該形質転換体の細胞膜に発現した蛋 白質に接触させた場合と、 上記 （1) 記載の蛋白質またはその塩を活性化する 化合物および試験化合物を上記 （6) 記載の形質転換体を培養することによつ て該形質転換体の細胞膜に発現した蛋白質に接触させた場合における、 該蛋白 質を介する細胞刺激活性を測定し、 比較することを特徴とするリガンドと上記
( 1 ) 記載の蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩 のスクリーニング方法、 (25) 上記 （1) 記載の蛋白質を活性化する化合物が、 アンギオテンシン、 ボンべシン、 カナピノイド、 コレシストキニン、 グルタミン、 セロトニン、 メ ラトニン、 ニューロペプチド Y、 ォピオイド、 プリン、 バソプレツシン、 ォキ シトシン、 PACAP、 セクレチン、 グルカゴン、 カルシトニン、 アドレノメ ジュリン、 ソマトス夕チン、 GHRH、 CRF、 ACTH、 GRP、 PTH、 V I P (バソアクティブ インテスティナル アンド リレイテッド ポリべ プチド） 、 ソマトス夕チン、 ド一パミン、 モチリン、 アミリン、 ブラジキニン、
CGRP (カルシトニンジーンリレーティッドペプチド） 、 ロイコトリェン、 パンクレアスタチン、 プロスタグランジン、 トロンボキサン、 アデノシン、 ァ ドレナリン、 ひおよび /3—ケモカイン （chemokine) (例えば、 I L— 8、 GR Οα、 GRO/3、 GROr > NAP— 2、 ENA_78、 PF4、 I P 10、 GCP— 2、 MCP— 1、 HC 14、 MCP— 3、 1—309、 ΜΙ Ρ 1 α、 MI P— l i3、 RANT ESなど） 、 エンドセリン、 ェンテロガストリン、 ヒ ス夕ミン、 ニューロテンシン、 TRH、 パンクレアティックポリぺプタイドま たはガラニンである上記 （23) または上記 （24) 記載のスクリーニング方 法、
(26) 上記 （18) 〜 （25) 記載のスクリーニング方法で得られうる、 リ ガンドと上記 （1) 記載の蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物 またはその塩、
(27) 上記 （18) 〜 （25) 項記載のスクリーニング方法で得られうる、 リガンドと上記 （1) 記載の蛋白質またはその塩との結合性を変化させるの化 合物またはその塩を含有することを特徴とする医薬、
(28) 上記 （1) 記載の蛋白質を含有する細胞を含有することを特徴とする 上記 （1 1) 記載のスクリーニング用キット、
( 29) 上記 （1) 記載の蛋白質を含有する細胞の膜画分を含有することを特 徵とする上記 （1 1) 記載のスクリーニング用キット、
(30) 上記 （6) 記載の形質転換体を培養することによって該形質転換体の 細胞膜に発現した蛋白質を含有することを特徴とする上記 （1 1) 記載のスク リーニング用キッ卜、
(31) 上記 （28) 〜 （30) 記載のスクリーニング用キットを用いて得ら れうる、 リガンドと上記 （1) 記載の蛋白質またはその塩との結合性を変化さ せる化合物またはその塩、
(32) 上記 （28) 〜 （30) 記載のスクリーニング用キットを用いて得ら れうる、 リガンドと上記 （1) 記載の蛋白質またはその塩との結合性を変化さ せる化合物またはその塩を含有することを特徴とする医薬、
(33) 上記 （8) 記載の抗体と、 上記 （1) 記載の蛋白質もしくは上記 （2) 記載の部分べプチドまたはその塩とを接触させることを特徴とする上記 （ 1 ) 記載の蛋白質もしくは上記 （2) 記載の部分ペプチドまたはその塩の定量法、
(34) 上記 （8) 記載の抗体と、 被検液および標識化された上記 （1) 記載 の蛋白質もしくは上記 （2) 記載の部分ペプチドまたはその塩とを競合的に反 応させ、 該抗体に結合した標識化された上記 （1) 記載の蛋白質もしくは上記
( 2 ) 記載の部分べプチドまたはその塩の割合を測定することを特徴とする被 検液中の上記 （1) 記載の蛋白質もしくは上記 （2) 記載の部分ペプチドまた はその塩の定量法、 および
(35) 被検液と担体上に不溶化した上記 （8) 記載の抗体および標識化され た上記 （8) 項記載の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、 不溶化 担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検波中の上記 （1) 記載 の蛋白質もしくは上記 （2) 記載の部分ペプチドまたはその塩の定量法などを 提供する。 図面の簡単な説明
図 1は実施例 1で得られた本発明のヒト脳由来蛋白質をコードする DN Αの 塩基配列 （AQ27) 、 およびそれから推定されるアミノ酸配列を示す （図 2 に続く） 。
図 2は実施例 1で得られた本発明のヒト脳由来蛋白質をコ一ドする DNAの 塩基配列 （AQ27) 、 およびそれから推定されるアミノ酸配列を示す （図 1 の続き） 。
図 3は本発明のヒト脳由来蛋白質の疎水性プロットを示す。
図 4は実施例 2で行われた AQ27 の発現組織分布の解析結果を示す。
図 5は実施例 3で行われた AQ27に対する Met- Enk印 hal in-Arg-Phe amideの反 応性の解析結果を示す。 縦軸は Acidification rate, 横軸は測定サイクルを表 わし、 參は受容体発現 CH0細胞の、 〇は mock細胞の反応性を示す。 発明の実施をするための最良の形態
本発明の蛋白質 （G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質） は、 配列番号： 1で表 わされるアミノ酸配列 〔図 1〜図 2中のアミノ酸配列〕 と同一もしくは実質的 に同一のアミノ酸配列を含有するレセプ夕一蛋白質である （以下、 本発明の蛋 白質 （G蛋白質共役型レセプター蛋白質） またはその塩を本発明の蛋白質と略 記する場合がある） 。
本発明の蛋白質 （G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質） は、 例えば、 ヒトゃ哺 乳動物 （例えば、 モルモット、 ラット、 マウス、 ゥサギ、 ブ夕、 ヒッジ、 ゥシ、 サルなど） のあらゆる細胞 （例えば、 脾細胞、 神経細胞、 グリア細胞、 .滕臓 /3 細胞、 骨髄細胞、 メサンギゥム細胞、 ランゲルハンス細胞、 表皮細胞、 上皮細 胞、 内皮細胞、 繊維芽細胞、 繊維細胞、 筋細胞、 脂肪細胞、 免疫細胞 （例、 マ クロファージ、 T細胞、 B細胞、 ナチュラルキラ一細胞、 肥満細胞、 好中球、 好塩基球、 好酸球、 単球） 、 巨核球、 滑膜細胞、 軟骨細胞、 骨細胞、 骨芽細胞、 破骨細胞、 乳腺細胞、 肝細胞もしくは間質細胞、 またはこれら細胞の前駆細胞、 幹細胞もしくはガン細胞など） や血球系の細胞 （例えば、 MEL， Ml, CT LL- 2, HT- 2, WEH I— 3, HL - 60, J〇SK_ 1， K 562, ML- 1, MOLT— 3, MOLT - 4, MOLT - 10， CCRF - CEM， TALL- 1, J u r k a t , CCRT— HSB— 2, KE— 37, SKW- 3， HUT- 78, HUT- 102, H 9, U 937, THP- 1 , HEL, J K- 1, CMK, KO— 812， MEG— 01など） 、 またはそれらの細胞 が存在するあらゆる組織、 例えば、 脳、 脳の各部位 （例、 嗅球、 扁頭核、 大脳 基底球、 海馬、 視床、 視床下部、 視床下核、 大脳皮質、 延髄、 小脳、 後頭葉、 前頭葉、 側頭葉、 被殻、 尾状核、 脳染、 黒質） 、 脊髄、 下垂体、 胃、 fl萃臓、 腎 臓、 肝臓、 生殖腺、 甲状腺、 胆のう、 骨髄、 副腎、 皮膚、 筋肉、 肺、 消化管 （例、 大腸、 小腸） 、 血管、 心臓、 胸腺、 脾臓、 顎下腺、 末梢血、 末梢血球、 前立腺、 睾丸、 精巣、 卵巣、 胎盤、 子宮、 骨、 関節、 骨格筋など （特に、 脳や脳の各部 位） に由来する蛋白質であってもよく、 また合成蛋白質であってもよい。
配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とし ては、 例えば、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と約 7 0 %以上、 好ま しくは約 8 0 %以上、より好ましくは約 9 0 %以上、さらに好ましくは約 9 5 % 以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
本発明の配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸 配列を含有する蛋白質としては、 例えば、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸 配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、 配列番号： 1で表わされるァミノ 酸配列と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが好ましい。
実質的に同質の活性としては、 例えば、 リガンド結合活性、 シグナル情報伝 達作用などが挙げられる。 実質的に同質とは、 それらの活性が性質的に同質で あることを示す。 したがって、 リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用など の活性が同等 （例、 約 0 . 5〜2倍） であることが好ましいが、 これらの活性 の程度や蛋白質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性の測定は、 自体公知の方 法に準じて行なうことができるが、 例えば、 後述するリガンドの決定方法ゃス クリ一ニング方法に従って測定することができる。
また、 本発明の蛋白質としては、 ①配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列 中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜3 0個程度、 より好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数個 （1または 2個） ） のアミノ酸が欠失したァ ミノ酸配列、②配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列に 1または 2個以上（好 ましくは、 1〜3 0個程度、 より好ましくは 1〜 1 0個程度、 さらに好ましく は数個 （1または 2個） ） のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、 ③配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜3 0個 程度、より好ましくは 1〜 1 0個程度、さらに好ましくは数個（ 1または 2個）） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、 または④それらを組み 合わせたアミノ酸配列を含有する蛋白質なども用いられる。
本明細書における蛋白質は、 ペプチド標記の慣例に従って左端が N末端 （ァ ミノ末端） 、 右端が C末端 （カルボキシル末端） である。 配列番号： 1で表わ されるアミノ酸配列を含有する蛋白質をはじめとする本発明の蛋白質は、 C末 端が通常カルボキシル基 （一 C O OH) またはカルポキシレート（一 C O O一） であるが、 C末端がアミド （― C〇N H 2) またはエステル （一 C O O R) で あってもよい。
ここでエステルにおける Rとしては、 例えば、 メチル、 ェチル、 n—プロピ ル、 イソプロピルもしくは n—ブチルなどのじェ アルキル基、 例えば、 シク 口ペンチル、 シクロへキシルなどの C 3 - 8シクロアルキル基、 例えば、 フエ二 ル、 α—ナフチルなどの C 6 2ァリール基、 例えば、 ベンジル、 フエネチルな どのフエ二ルー アルキル基もしくは α—ナフチルメチルなどの α—ナフ チル— C — 2アルキル基などの C 7 _ i 4ァラルキル基のほか、 経口用エステルと して汎用されるビバロイルォキシメチル基などが用いられる。
本発明の蛋白質が C末端以外にカルボキシル基 （またはカルポキシレート） を有している場合、 カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているも のも本発明の蛋白質に含まれる。 この場合のエステルとしては、 例えば上記し た C末端のエステルなどが用いられる。
さらに、 本発明の蛋白質には、 上記した蛋白質において、 N末端のメチォ二 ン残基のァミノ基が保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチル基などの C 2 _ 6ァ ルカノィル基などの ァシル基など） で保護されているもの、 N端側が生 体内で切断され生成したグル夕ミル基がピログルタミン酸化したもの、 分子内 のアミノ酸の側鎖上の置換基 （例えば、 —〇H、 — S H、 アミノ基、 イミダゾ ール基、 インドール基、 グァニジノ基など） が適当な保護基 （例えば、 ホルミ ル基、 ァセチル基などの C 2 _ 6アルカノィル基などの 一 6ァシル基など）で保 護されているもの、 あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複合蛋白 質なども含まれる。
本発明の蛋白質の具体例としては、 例えば、 配列番号： 1で表わされるアミ ノ酸配列を含有するヒト由来 （より好ましくはヒト脳由来） の蛋白質などがあ げられる。
本発明の蛋白質の部分ペプチド（以下、部分ペプチドと略記する場合がある） としては、 前記した本発明の蛋白質の部分ペプチドであれば何れのものであつ てもよいが、 例えば、 本発明の蛋白質分子のうち、 細胞膜の外に露出している 部位であって、 レセプ夕一結合活性を有するものなどが用いられる。
具体的には、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質の部分 ぺプチドとしては、 〔図 3〕 で示される疎水性プロット解析において細胞外領 域（親水性（Hydroph i l i c) 部位） であると分析された部分を含むペプチドであ る。 また、 疎水性（Hydrophob i c)部位を一部に含むペプチドも同様に用いるこ とができる。 個々のドメインを個別に含むペプチドも用い得るが、 複数のドメ インを同時に含む部分のペプチドでも良い。 本発明の部分ペプチドのァミノ 酸の数は、 前記した本発明の蛋白質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも 2 0 個以上、 好ましくは 5 0個以上、 より好ましくは 1 0 0個以上のアミノ酸配列 を有するぺプチドなどが好ましい。
実質的に同一のアミノ酸配列とは、 これらアミノ酸配列と約 5 0 %以上、 好 ましくは約 7 0 %以上、 より好ましくは約 8 0 %以上、 さらに好ましくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有するアミノ酸配列を示す。 ここで、 「実質的に同質の活性」 とは、 前記と同意義を示す。 「実質的に同 質の活性」 の測定は前記と同様に行なうことができる。
また、本発明の部分べプチドは、上記アミノ酸配列中の 1または 2個以上（好 ましくは、 1 ~ 1 0個程度、 さらに好ましくは数個 （1または 2個） ） のアミ ノ酸が欠失し、 または、 そのアミノ酸配列に 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜2 0個程度、 より好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数個 ( 1 または 2個） ） のアミノ酸が付加し、 または、 そのアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜10個程度、 より好ましくは 1〜5個程度、 さら に好ましくは数個 （1または 2個） ） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されて いてもよい。
また、 本発明の部分ペプチドは C末端が通常力ルポキシル基 （一 COOH) またはカルボキシレート （—（：〇〇—） であるが、 前記した本発明の蛋白質の ごとく、 C末端がアミド （― C〇NH2) またはエステル （― COOR) であ つてもよい。
さらに、 本発明の部分ペプチドには、 前記した本発明の蛋白質と同様に、 N 末端のメチォニン残基のァミノ基が保護基で保護されているもの、 N端側が生 体内で切断され生成した Ginがピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸 の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、 あるいは糖鎖が結合 したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
また、 本発明の部分ペプチドは C末端が通常力ルポキシル基 （一 COOH) またはカルポキシレート（_CO〇—） であるが、 前記した本発明の蛋白質のご とく、 C末端がアミド （― C〇NH2) またはエステル （― COOR) であつ てもよい。
本発明の蛋白質またはその部分ペプチドの塩としては、 とりわけ生理学的に 許容される酸付加塩が好ましい。 この様な塩としては、 例えば無機酸 （例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸） との塩 などが用いられる。
本発明の蛋白質またはその塩は、 前述したヒトゃ哺乳動物の細胞または組織 から自体公知の蛋白質の精製方法によって製造することもできるし、 後述する 本発明の蛋白質をコードする DN Aを含有する形質転換体を培養することによ つても製造することができる。 また、 後述の蛋白質合成法またはこれに準じて 製造することもできる。
ヒトゃ哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、 ヒトゃ哺乳動物の組織 または細胞をホモジナイズした後、 酸などで抽出を行ない、 該抽出液を逆相ク 口マトグラフィ一、 イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー を組み合わせることにより精製単離することができる。
本発明の蛋白質、 その部分ペプチドもしくはそれらの塩またはそれらのアミ ド体の合成には、 通常市販の蛋白質合成用樹脂を用いることができる。 そのよ うな樹脂としては、 例えば、 クロロメチル樹脂、 ヒドロキシメチル樹脂、 ベン ズヒドリルァミン樹脂、 アミノメチル樹脂、 4—ベンジルォキシベンジルアル コール樹脂、 4一メチルベンズヒドリルァミン樹脂、 PAM樹脂、 4ーヒドロキシ メチルメチルフエニルァセトアミドメチル樹脂、 ポリアクリルアミド樹脂、 4 - (2' , 4' -ジメトキシフエ二ルーヒドロキシメチル） フエノキシ樹脂、 4一 (2' , 4' -ジメトキシフエニル一 Fmocアミノエチル） フエノキシ樹脂などを挙げ ることができる。 このような樹脂を用い、 ひ—ァミノ基と側鎖官能基を適当に 保護したアミノ酸を、 目的とする蛋白質の配列通りに、 自体公知の各種縮合方 法に従い、 樹脂上で縮合させる。 反応の最後に樹脂から蛋白質を切り出すと同 時に各種保護基を除去し、 さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフイ ド結合形成 反応を実施し、 目的の蛋白質またはそれらのアミド体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、 蛋白質合成に使用できる各種活性 化試薬を用いることができるが、 特に、 カルポジイミド類がよい。 カルポジィ ミド類としては、 DC (：、 N, Ν' -ジイソプロピルカルポジイミド、 Ν-ェチル - Ν' - (3 - ジメチルァミノプロリル） カルポジイミドなどが用いられる。 これらによる活 性化にはラセミ化抑制添加剤 （例えば、 HOB t, HOOBt)とともに保護アミノ酸を 直接樹脂に添加するかまたは、対称酸無水物または HOB tエステルあるいは H00B t エステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加す ることができる。
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、 蛋白質縮 合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。 例えば、 N , N—ジメチルホルムアミド， N , N—ジメチルァセトアミド， N—メチル ピロリドンなどの酸アミド類、 塩化メチレン， クロ口ホルムなどのハロゲン化 炭化水素類、 トリフルォロェ夕ノールなどのアルコール類、 ジメチルスルホキ シドなどのスルホキシド類、 ピリジン， ジォキサン， テトラヒドロフランなど のエーテル類、 ァセトニ卜リル， プロピオ二トリルなどの二トリル類、 酢酸メ チル， 酢酸ェチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用い られる。 反応温度は蛋白質結合形成反応に使用され得ることが知られている範 囲から適宜選択され、 通常約一 2 0 °C〜5 0 °Cの範囲から適宜選択される。 活 性化されたァミノ酸誘導体は通常 1 . 5〜 4倍過剰で用いられる。ニンヒドリン 反応を用いたテス卜の結果、 縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うこと なく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。 反応を 繰り返しても十分な縮合が得られないときには、 無水酢酸またはァセチルイミ ダゾールを用いて未反応アミノ酸をァセチル化することができる。
原料のァミノ基の保護基としては、 例えば、 Z、 Boc、 夕ーシャリーペンチル ォキシ力ルポニル、 イソポルニルォキシカルポニル、 4ーメトキシベンジルォ キシカルポニル、 -Ζ、 Br- Ζ、 ァダマンチルォキシカルボニル、 トリフルォロ ァセチル、 フタロイル、 ホルミル、 2—ニトロフエニルスルフエニル、 ジフエ ニルホスフィノチオイル、 Fmocなどが用いられる。
力ルポキシル基は、 例えば、 アルキルエステル化 （例えば、 メチル、 ェチル、 プロピル、 ブチル、 夕ーシャリーブチル、 シクロペンチル、 シクロへキシル、 シクロへプチル、 シクロォクチル、 2—ァダマンチルなどの直鎖状、 分枝状も しくは環状アルキルエステル化） 、 ァラルキルエステル化 （例えば、 ベンジル エステル、 4—ニトロべンジルエステル、 4ーメトキシベンジルエステル、 4 —クロ口べンジルエステル、 ベンズヒドリルエステル化） 、 フエナシルエステ ル化、 ベンジルォキシカルボニルヒドラジド化、 夕ーシャリーブトキシカルボ ニルヒドラジド化、 トリチルヒドラジド化などによつて保護することができる。 セリンの水酸基は、 例えば、 エステル化またはエーテル化によって保護する ことができる。 このエステル化に適する基としては、 例えば、 ァセチル基など の低級アルカノィル基、 ベンゾィル基などのァロイル基、 ベンジルォキシカル ボニル基、 エトキシカルポニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられ る。 また、 エーテル化に適する基としては、 例えば、 ベンジル基、 テトラヒド ロビラニル基、 t-ブチル基などである。
チロシンのフエノール性水酸基の保護基としては、 例えば、 Bz l、 CI 2-Bzし 2 _ニトロベンジル、 Br- Z、 ターシャリーブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾ一ルの保護基としては、 例えば、 Tos、 4 -メトキシ- 2, 3, 6-トリメチルベンゼンスルホニル、 DNP、 ベンジルォキシメチル、 Bum、 Boc、 Tr t、 Fmocなどが用いられる。
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、 例えば、 対応する酸無 水物、 アジド、 活性エステル 〔アルコール （例えば、 ペン夕クロ口フエノール、 2， 4, 5 -トリクロ口フエノール、 2， 4-ジニトロフエノール、 シァノメチルアルコ —ル、 パラニトロフエノール、 H0NB、 N-ヒドロキシスクシミド、 N-ヒドロキシ フタルイミド、 HOBt) とのエステル〕 などが用いられる。 原料のァミノ基の活 性化されたものとしては、 例えば、 対応するリン酸アミドが用いられる。
保護基の除去 （脱離） 方法としては、 例えば、 P d —黒あるいは P d -炭素な どの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、 また、 無水フッ化水素、 メ タンスルホン酸、 トリフルォロメ夕ンスルホン酸、 トリフルォロ酢酸あるいは これらの混合液などによる酸処理や、 ジイソプロピルェチルァミン、 トリェチ ルァミン、 ピぺリジン、 ピぺラジンなどによる塩基処理、 また液体アンモニア 中ナトリウムによる還元なども用いられる。 上記酸処理による脱離反応は、 一 般に約— 2 0 ° (：〜 4 0 °Cの温度で行なわれるが、 酸処理においては、 例えば、 ァニソ一ル、 フエノール、 チオア二ソ一ル、 メタクレゾ一ル、 パラクレゾール、 ジメチルスルフイ ド、 1, 4-ブタンジチオール、 1， 2-エタンジチオールなどのよ うなカチオン捕捉剤の添加が有効である。 また、 ヒスチジンのイミダゾ一ル保 護基として用いられる 2, 4-ジニトロフエニル基はチォフエノール処理により除 去され、 トリブトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上 記の 1， 2-エタンジチオール、 1, 4-ブタンジチオールなどの存在下の酸処理によ る脱保護以外に、 希水酸化ナトリウム溶液、 希アンモニアなどによるアルカリ 処理によっても除去される。 原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、 およびその保 護基の脱離、 反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段 から適宜選択しうる。
蛋白質のアミド体を得る別の方法としては、 例えば、 まず、 カルポキシ末端 アミノ酸の a—カルボキシル基をアミド化して保護した後、 アミノ基側にぺプ チド （蛋白質） 鎖を所望の鎖長まで延ばした後、 該ペプチド鎖の N末端の a— ァミノ基の保護基のみを除いた蛋白質と C末端の力ルポキシル基の保護基のみ を除去した蛋白質とを製造し、 この両蛋白質を上記したような混合溶媒中で縮 合させる。 縮合反応の詳細については上記と同様である。 縮合により得られた 保護蛋白質を精製した後、 上記方法によりすベての保護基を除去し、 所望の粗 蛋白質を得ることができる。 この粗蛋白質は既知の各種精製手段を駆使して精 製し、 主要画分を凍結乾燥することで所望の蛋白質のアミド体を得ることがで さる。
蛋白質のエステル体を得るには、 例えば、 カルポキシ末端アミノ酸のひ一力 ルポキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、 蛋白 質のアミド体と同様にして、 所望の蛋白質のエステル体を得ることができる。 本発明の蛋白質の部分ペプチドまたはその塩は、 自体公知のペプチドの合成 法に従って、 あるいは本発明の蛋白質を適当なぺプチダ一ゼで切断することに よって製造することができる。 ペプチドの合成法としては、 例えば、 固相合成 法、 液相合成法のいずれによっても良い。 すなわち、 本発明の蛋白質を構成し 得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、 生成物が保護基 を有する場合は保護基を脱離することにより目的のぺプチドを製造することが できる。 公知の縮合方法や保護基の脱離としては、 例えば、 以下の①〜⑤に記 載された方法が挙げられる。
(DM. Bodanszky および Μ· A. Onde t t i , ペプチド シンセシス （Pept ide Synthes i s) , Int ersc i ence Pub l i shers, New York (1966年）
② Schroederおよび Luebke、 ザ ペプチド（The Pept i de) , Academi c Press, New York (1965年） ③泉屋信夫他、 ペプチド合成の基礎と実験、 丸善 (株） （1975年）
④矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、 蛋白質の化学 IV、 205、 (1977 年）
⑤矢島治明監修、 続医薬品の開発第 14巻 ペプチド合成広川書店
また、 反応後は通常の精製法、 たとえば、 溶媒抽出，蒸留 ·カラムクロマト グラフィー ·液体クロマトグラフィー ·再結晶などを組み合わせて本発明の部 分べプチドを精製単離することができる。 上記方法で得られる部分べプチドが 遊離体である場合は、 公知の方法によって適当な塩に変換することができるし、 逆に塩で得られた場合は、 公知の方法によって遊離体に変換することができる。 本発明の蛋白質をコードする DNAとしては、 前述した本発明の蛋白質をコ ードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。 また、 ゲノム DNA、 ゲノム DNAライブラリー、 前記した細胞 ·組織由来の cDN A、 前記した細胞 ·組織由来の c DNAライブラリー、 合成 DNAのいずれで もよい。 ライブラリーに使用するべクタ一は、 バクテリオファージ、 プラスミ ド、 コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞 · 組織より total RN Aまたは mRN A画分を調製したものを用いて直接 Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (以下、 R T-P C R法と略称する） によって増幅することもできる。
具体的には、 本発明の蛋白質をコードする DN Aとしては、 例えば、 配列番 号： 2で表わされる塩基配列を含有する DNA、 または配列番号： 2で表わさ れる塩基配列を有する DNAとハイストリンジェントな条件下でハイブリダィ ズする DN Aを有し、 本発明の蛋白質と実質的に同質の活性 （例、 リガンド結 合活性、 シグナル情報伝達作用など） を有する蛋白質をコードする DNAであ れば何れのものでもよい。
配列番号： 2で表わされる塩基配列を有する DNAとハイストリンジェント な条件下でハイブリダィズする DNAとしては、 例えば、 配列番号： 2で表わ される塩基配列と約 70%以上、 好ましくは約 80%以上、 より好ましくは約 90%以上、 さらに好ましくは約 95%以上の相同性を有する塩基配列を含有 する D N Aなどが用いられる。
ハイブリダィゼーシヨンは、 自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、 例 えは、 モレ千ユラ—クロ一ニンク (Mol ecul ar Cl oning) 2 nd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行な うことができる。 また、 市販のライブラリーを使用する場合、 添付の使用説明 書に記載の方法に従って行なうことができる。 より好ましくは、 ハイストリン ジェントな条件に従つて行なうことができる。
ハイストリンジェントな条件とは、 例えば、 ナトリゥム濃度が約 1 9〜4 0 mM、 好ましくは約 1 9〜 2 0 mMで、 温度が約 5 0〜 7 0 °C、 好ましくは約 6 0〜6 5 °Cの条件を示す。 特に、 ナトリウム濃度が約 1 9 mMで温度が約 6 5 °Cの場合が最も好ましい。
より具体的には、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列を含有する蛋白質 をコードする D N Aとしては、 配列番号： 2で表わされる塩基配列を有する D NAがあげられる。
本発明の蛋白質をコードする塩基配列を含有する、 または該塩基配列と相補 的な塩基配列の一部を含有してなるヌクレオチド （オリゴヌクレオチド） とは、 本発明の蛋白質またはその部分ペプチドをコードする D N Aを包含するだけで はなく、 R N Aをも包含する意味で用いられる。
本発明に従えば、 本発明の蛋白質遺伝子の複製又は発現を阻害することので きるアンチセンス · （オリゴ） ヌクレオチド （核酸） を、 クローン化したある いは決定された蛋白質をコードする塩基配列の塩基配列情報に基づき設計し、 合成しうる。 そうした （オリゴ） ヌクレオチド （核酸） は、 G蛋白質共役型蛋 白質遺伝子の R N Aとハイブリダィズすることができ、 該 R N Aの合成又は機 能を阻害することができるか、 あるいは G蛋白質共役型蛋白質関連 R N Aとの 相互作用を介して G蛋白質共役型蛋白質遺伝子の発現を調節 ·制御することが できる。 G蛋白質共役型蛋白質関連 R NAの選択された配列に相補的な （オリ ゴ） ヌクレオチド、 及び G蛋白質共役型蛋白質関連 R NAと特異的にハイプリ ダイズすることができる （オリゴ） ヌクレオチドは、 生体内及び生体外で G蛋 白質共役型蛋白質遺伝子の発現を調節 ·制御するのに有用であり、 また病気な どの治療又は診断に有用である。
用語 「対応する」 とは、 遺伝子を含めたヌクレオチド、 塩基配列又は核酸の 特定の配列に相同性を有するあるいは相補的であることを意味する。 ヌクレオ チド、 塩基配列又は核酸とペプチド （蛋白質） との間で 「対応する」 とは、 ヌ クレオチド （核酸） の配列又はその相補体から誘導される指令にあるペプチド
(蛋白質） のアミノ酸を通常指している。 G蛋白質共役型蛋白質遺伝子の 5' 端ヘアピンループ、 5' 端 6—ベースペア ' リピート、 5' 端非翻訳領域、 ポ リペプチド翻訳開始コドン、 蛋白質コード領域、 ORF翻訳開始コドン、 3' 端非翻訳領域、 3' 端パリンドローム領域、 及び 3' 端ヘアピンループは好ま しい対象領域として選択しうるが、 G蛋白質共役型蛋白質遺伝子内の如何なる 領域も対象として選択しうる。
目的核酸と、 対象領域の少なくとも一部に相補的な （オリゴ） ヌクレオチド との関係は、 対象物とハイブリダィズすることができる （オリゴ） ヌクレオチ ドとの関係は、 「アンチセンス」 であるということができる。 アンチセンス - (オリゴ） ヌクレオチドは、 2—デォキシー D—リポ一スを含有しているポリ デォキシヌクレオチド、 D—リボースを含有しているポリデォキシヌクレオチ ド、 プリン又はピリミジン塩基の N—グリコシドであるその他のタイプのポリ ヌクレオチド、 あるいは非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマー （例え ば、 市販の蛋白質核酸及び合成配列特異的な核酸ポリマー） 又は特殊な結合を 含有するその他のポリマー （但し、 該ポリマーは DNAや RNA中に見出され るような塩基のペアリナグゃ塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを 含有する） などが挙げられる。 それらは、 2本鎖 DNA、 1本鎖 DNA、 2本 鎖 RNA、 1本鎖 RNA、 さらに DNA： RNAハイブリッドであることがで き、 さらに非修飾ポリヌクレオチド又は非修飾オリゴヌクレオチド、 さらには 公知の修飾の付加されたもの、 例えば当該分野で知られた標識のあるもの、 キ ヤップの付いたもの、 メチル化されたもの、 1個以上の天然のヌクレオチドを 類縁物で置換したもの、 分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、 例えば非荷電 結合 （例えば、 メチルホスホネート、 ホスホトリエステル、 ホスホルアミデー ト、 力ルバメートなど） を持つもの、 電荷を有する結合又は硫黄含有結合 （例 えば、 ホスホロチォエート、 ホスホロジチォエー卜など） を持つもの、 例えば 蛋白質 （ヌクレア一ゼ、 ヌクレア一ゼ ·インヒビ夕一、 トキシン、 抗体、 シグ ナルぺプチド、 ポリ一 Lーリジンなど）や糖 （例えば、 モノサッカライドなど） などの側鎖基を有しているもの、 インターカレント化合物 （例えば、 ァクリジ ン、 プソラレンなど） を持つもの、 キレート化合物 （例えば、 金属、 放射活性 をもつ金属、 ホウ素、 酸化性の金属など） を含有するもの、 アルキル化剤を含 有するもの、 修飾された結合を持つもの （例えば、 αァノマー型の核酸など） であってもよい。 ここで 「ヌクレオシド」 、 「ヌクレオチド」 及び 「核酸」 と は、 プリン及びピリミジン塩基を含有するのみでなく、 修飾されたその他の複 素環型塩基をもつようなものを含んでいて良い。 こうした修飾物は、 メチル化 されたプリン及びピリミジン、 ァシル化されたプリン及びピリミジン、 あるい はその他の複素環を含むものであってよい。 修飾されたヌクレオチド及び修飾 されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾されていてよく、 例えば 1個以上の水 酸基がハロゲンとか、 脂肪族基などで置換されていたり、 あるいはエーテル、 ァミンなどの官能基に変換されていてよい。
本発明のアンチセンス核酸は、 R N A、 D N A、 あるいは修飾された核酸で ある。 修飾された核酸の具体例としては核酸の硫黄誘導体ゃチォホスフェート 誘導体、 そしてポリヌクレオシドアミドゃオリゴヌクレオシドアミドの分解に 抵抗性のものが挙げられるが、 それに限定されるものではない。 本発明のアン チセンス核酸は次のような方針で好ましく設計されうる。 すなわち、 細胞内で のアンチセンス核酸をより安定なものにする、 アンチセンス核酸の細胞透過性 をより高める、 目標とするセンス鎖に対する親和性をより大きなものにする、 そしてもし毒性があるならアンチセンス核酸の毒性をより小さなものにする。 こうして修飾は当該分野で数多く知られており、例えば J. Kawakami e t al. , Pharm Tech Japan, Vo l. 8, pp. 247, 1992 ; Vol. 8, pp. 395, 1992 ; S. T. Crooke et al. ed. , An t i sense Research and Appl i cat i ons, CRC Press, 1993 などに 開示がある。
本発明のアンチセンス核酸は、 変化せしめられたり、 修飾された糖、 塩基、 結合を含有していて良く、 リボゾーム、 ミクロスフエアのような特殊な形態で 供与されたり、 遺伝子治療により適用されたり、 付加された形態で与えられる ことができうる。 こうして付加形態で用いられるものとしては、 リン酸基骨格 の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、 細胞膜との 相互作用を高めたり、 核酸の取込みを増大せしめるような脂質 （例えば、 ホス ホリッピド、 コレステロールなど） といった粗水性のものが挙げられる。 付加 するに好ましい脂質としては、 コレステロールやその誘導体 （例えば、 コレス テリルクロ口ホルメート、 コール酸など） が挙げられる。 こうしたものは、 核 酸の 3 ' 端あるいは 5 ' 端に付着させることができ、 塩基、 糖、 分子内ヌクレ オシド結合を介して付着させることができうる。 その他の基としては、 核酸の 3 ' 端あるいは 5 ' 端に特異的に配置されたキャップ用の基で、 ェキソヌクレ ァ一ゼ、 R N a s eなどのヌクレア一ゼによる分解を阻止するためのものが挙 げられる。 こうしたキャップ用の基としては、 ポリエチレングリコール、 テト ラエチレングリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水 酸基の保護基が挙げられるが、 それに限定されるものではない。
アンチセンス核酸の阻害活性は、 本発明の形質転換体、 本発明の生体内や生 体外の遺伝子発現系、 あるいは蛋白質の生体内や生体外の翻訳系を用いて調べ ることができる。 該核酸其れ自体公知の各種の方法で細胞に適用できる。
本発明の部分ペプチドをコ一ドする D NAとしては、 前述した本発明の部分 ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであって もよい。 また、 ゲノム D NA、 ゲノム D NAライブラリ一、 前記した細胞 '組 織由来の c D NA、 前記した細胞 ·組織由来の c D N Aライブラリー、 合成 D NAのいずれでもよい。 ライブラリ一に使用するべクタ一は、 バクテリオファ —ジ、 プラスミド、 コスミド、 ファ一ジミドなどいずれであってもよい。 また、 前記した細胞 ·組織より m R N A画分を調製したものを用いて直接 Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reac t i on (以下、 R T- P C R法と略称する) によって増幅することもできる。
具体的には、 本発明の部分ペプチドをコードする DNAとしては、 例えば、 配列番号： 2で表わされる塩基配列を有する DN Aの部分塩基配列を有する D NA、 または②配列番号： 2で表わされる塩基配列を有する DNAとハイスト リンジェン卜な条件下でハイブリダィズする DNAを有し、 本発明の蛋白質べ プチドと実質的に同質の活性 （例、 リガンド結合活性、 シグナル情報伝達作用 など） を有する蛋白質をコ一ドする DNAの部分塩基配列を有する DNAなど が用いられる。
配列番号： 2で表わされる塩基配列を有する DNAとハイストリンジェント な条件下でハイブリダィズする DNAとしては、 例えば、 配列番号： 2で表わ される塩基配列と約 70%以上、 好ましくは約 80%以上、 より好ましくは約 90%以上、 さらに好ましくは約 95 %以上、 なかでも好ましくは約 98%以 上の相同性を有する塩基配列を含有する D N Aなどが用いられる。
本発明の蛋白質またはその部分ペプチド（以下、本発明の蛋白質と略記する） を完全にコードする DN Aのクローニングの手段としては、 本発明の蛋白質の 部分塩基配列を有する合成 DN Aプライマーを用いて PC R法によって増幅す るか、 または適当なベクターに組み込んだ DN Aを本発明の蛋白質の一部ある いは全領域をコ一ドする DNA断片もしくは合成 DNAを用いて標識したもの とのハイブリダィゼ一シヨンによつて選別することができる。 ハイブリダイゼ ーシヨンの方法は、例えば、 モレキュラー 'クローニング（Molecular Cloning) 2nd (J. Sambrook et al.， Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の 方法などに従って行なうことができる。 また、 市販のライブラリーを使用する 場合、 添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
DNAの塩基配列の変換は、 PCRや公知のキット、 例えば、 Mutan™- super Express Km (宝酒造 （株） ） 、 Mutan™- K (宝酒造 （株） ) 等を用いて、 0DA-LA PCR法、 Gupped duplex法や Kunkel法等の自体公知の方法あるいはそれらに準 じる方法に従って行なうことができる。
クローン化された蛋白質をコードする DNAは目的によりそのまま、 または 所望により制限酵素で消化したり、 リンカーを付加したりして使用することが できる。 該 DN Aはその 5' 末端側に翻訳開始コドンとしての AT Gを有し、 また 3' 末端側には翻訳終止コドンとしての TAA、 TG Aまたは TAGを有 していてもよい。 これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、 適当な合成 D N Aアダプタ一を用いて付加することもできる。
本発明の蛋白質の発現ベクターは、 例えば、 （ィ） 本発明の蛋白質をコード する DNAから目的とする DNA断片を切り出し、 （口） 該 DNA断片を適当 な発現べクタ一中のプロモー夕一の下流に連結することにより製造することが できる。
ベクタ一としては、 大腸菌由来のプラスミド （例、 pBR 322, pBR 3 25， pUC 12, pUC 13) 、 枯草菌由来のプラスミド （例、 pUB 1 1 0, pTP 5, pC 194) 、 酵母由来プラスミド （例、 p SH 19， p SH 15) 、 λファ一ジなどのバクテリオファージ、 レトロウイルス， ワクシニア ウィルス， バキュロウィルスなどの動物ウィルスなどの他、 pAl— 11、 p XT 1、 p R c/CMV, pRc/RS V, p c D N A I ZN e oなどが用い られる。
本発明で用いられるプロモーターとしては、 遺伝子の発現に用いる宿主に対 応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。 例えば、 動物細胞 を宿主として用いる場合は、 SRひプロモータ一、 SV40プロモーター、 H I V-LTRプロモーター、 CMVプロモ一夕一、 H S V-TKプロモー夕一な どが挙げられる。
これらのうち、 CMVプロモ一夕一、 S R αプロモーターなどを用いるのが 好ましい。 宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 t r pプロモーター、 l a cプロモーター、 r e cAプロモーター、 λΡ^プロモータ一、 l p pプロモ —夕一などが、 宿主がバチルス属菌である場合は、 SPO lプロモーター、 S PO 2プロモータ一、 p e n Pプロモ一夕一など、 宿主が酵母である場合は、 PH05プロモータ一、 PGKプロモータ一、 GAPプロモーター、 ADHプ 口モーターなどが好ましい。 宿主が昆虫細胞である場合は、 ポリヘドリンプロ モーター、 P 10プロモーターなどが好ましい。
発現ベクターには、 以上の他に、 所望によりェンハンサー、 スプライシング シグナル、 ポリ A付加シグナル、 選択マ一カー、 SV40複製オリジン （以下、 S V40 o r iと略称する場合がある） などを含有しているものを用いること ができる。 選択マーカ一としては、 例えば、 ジヒドロ葉酸還元酵素 （以下、 d h i rと略称する場合がある） 遺伝子 〔メソトレキセート （MTX) 耐性〕 、 アンピシリン耐性遺伝子 （以下、 Amp rと略称する場合がある） 、 ネオマイ シン耐性遺伝子 （以下、 Ne o「と略称する場合がある、 G418耐性） 等が 挙げられる。 特に、 CH〇 （d h f r— ) 細胞を用いて d h f r遺伝子を選択 マーカ一として使用する場合、 目的遺伝子をチミジンを含まない培地によって も選択できる。
また、 必要に応じて、 宿主に合ったシグナル配列を、 本発明の蛋白質の N端 末側に付加する。宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 PhoA ·シグナル配列、 0即 A ·シグナル配列などが、 宿主がバチルス属菌である場合は、 α—アミラー ゼ ·シグナル配列、 サブチリシン ·シグナル配列などが、 宿主が酵母である場 合は、 MFa ·シグナル配列、 SUC2 ·シグナル配列など、 宿主が動物細胞 である場合には、 インシュリン ·シグナル配列、 α—インターフェロン ·シグ ナル配列、 抗体分子 ·シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築された本発明の蛋白質をコードする DN Αを含有するべ クタ一を用いて、 形質転換体を製造することができる。
宿主としては、 例えば、 ェシエリヒア属菌、 バチルス属菌、 酵母、 昆虫細胞、 昆虫、 動物細胞などが用いられる。
ェシエリヒア属菌の具体例としては、ェシエリヒア 'コリ（Escherichia col 0 K 12 · DH 1 〔プロシ一ジングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォ ブ 'サイェンシィズ 'ォブ ·ザ ·ュ一エスエー （Pro Natl. Acad. Sci. US A) , 60巻， 160 (1968)〕 ， J M 103 〔ヌクイレック 'ァシッズ' リサーチ， （Nucleic Acids Research) ， 9巻， 309 (1981)〕 ， JA2 21 〔ジャーナル ·ォブ ·モレキュラー ·バイオロジー （Journal of Molecular Biology)〕 ， 120巻， 517 (1978)〕 ， HB 101 〔ジャーナル ·ォブ · モレキュラー 'バイオロジー， 41巻， 459 (1969)〕 ， C 600 〔ジェ ネティックス （Genetics) ， 39巻， 440 (1954)〕 などが用いられる。 バチルス属菌としては、 例えば、 バチルス ·サチルス （Bacillus subtilis) M I 114 〔ジーン， 24巻， 255(1983)〕 ， 207 - 21 〔ジャーナ ル 'ォブ 'バイオケミストリー （Journal of Biochemistry) , 95巻， 87 (1 984)〕 などが用いられる。
酵母としては、 例えば、 サッカロマイセス セレピシェ （Saccharomyces cerevisiae) AH 22， AH22R―， NA87 - 1 1 A, DKD- 5 D, 2 0B— 12、 シゾサッカロマイセス ボンべ （Schizosaccharomyces pombe) N CYC 1913, NCYC 2036、 ピキア パストリス （Pichia pastoris) などが用いられる。
昆虫細胞としては、 例えば、 ウィルスが Ac NPVの場合は、 夜盗蛾の幼虫 由来株化細胞 (Spodoptera frugiperda cell； S f細胞) 、 Trichoplusia ni の中腸由来の MG 1細胞、 Trichoplusia niの卵由来の High FiveTM細胞、 Mamestrabrassicae由来の細胞または Estigmena acrea由来の細胞などが用いら れる。 ウィルスが BmNP Vの場合は、 蚕由来株化細胞 （Bombyxmori N； Bm N細胞） などが用いられる。 該 S ί細胞としては、 例えば、 S f 9細胞 （ATCC CRL1711)、 S f 21細胞（以上、 Vaughn, J. L.ら、 イン ·ヴイボ （In Vivo) , 13, 213-217, (1977)) などが用いられる。
昆虫としては、 例えば、 カイコの幼虫などが用いられる 〔前田ら、 ネィチヤ 一 (Nature) , 315巻， 592 (1985)〕 。
動物細胞としては、 例えば、 サル細胞 COS— 7, Vero, チャイニーズハム スター細胞 CHO (以下、 CHO細胞と略記） ， dh f r遺伝子欠損チヤィニ —ズハムスター細胞 CHO (以下、 CHO (dh f r-) 細胞と略記） ， マウ ス L細胞， マウス A t T— 20， マウスミエローマ細胞， ラット GH3, ヒト FL細胞などが用いられる。
ェシエリヒア属菌を形質転換するには、 例えば、 プロシージングズ *ォブ' ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンジィズ ·ォブ ·ザ ·ユーエスェ ― (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 69卷， 21 10 (1972)やジーン (Gene) ， 17巻， 107 (1982)などに記載の方法に従って行なうことが できる。 バチルス属菌を形質転換するには、例えば、モレキュラー 'アンド · ジエネラリレ 'ジェネティックス （Molecular & General Genet ics) , 168巻， 1 1 1 (1979)などに記載の方法に従って行なうことができる。
酵母を形質転換するには、例えば、メッソズ'イン'ェンザィモロジ一 (Me t hods inEnzymology)， 194巻， 182— 187 (1991)、 プロシージングズ · ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ'ォブ ·ザ*ユー エスエー （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 75巻， 1929 (1978) などに記載の方法に従つて行なうことができる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、 例えば、 バイオ/テクノロジー (Bio/Technology) , 6, 47-55 (1988)) などに記載の方法に従って行なうことが できる。
動物細胞を形質転換するには、 例えば、 細胞工学別冊 8 新 細胞工学実験 プロトコール. 263— 267 ( 1995) (秀潤社発行） 、 ヴィロロジー (Virology) , 52巻， 456 ( 1973)に記載の方法に従って行なうことが できる。
このようにして、 G蛋白質共役型蛋白質をコードする DNAを含有する発現 ベクターで形質転換された形質転換体が得られる。
宿主がェシエリヒア属菌、 バチルス属菌である形質転換体を培養する際、 培 養に使用される培地としては液体培地が適当であり、 その中には該形質転換体 の生育に必要な炭素源、 窒素源、 無機物その他が含有せしめられる。 炭素源と しては、 例えば、 グルコース、 デキストリン、 可溶性澱粉、 ショ糖など、 窒素 源としては、 例えば、 アンモニゥム塩類、 硝酸塩類、 コーンスチープ' リカー、 ペプトン、 カゼイン、 肉エキス、 大豆粕、 バレイショ抽出液などの無機または 有機物質、 無機物としては、 例えば、 塩化カルシウム、 リン酸二水素ナトリウ ム、 塩化マグネシウムなどが挙げられる。 また、 酵母、 ビタミン類、 生長促進 因子などを添加してもよい。 培地の pHは約 5〜8が望ましい。
ェシエリヒア属菌を培養する際の培地としては、 例えば、 グルコース、 カザ ミノ酸を含む M 9培地 〔ミラ一 （Miller) ， ジャーナル ·ォブ ·ェクスぺリメ ンッ ' -モレキュラー ·ジエネティックス (Journal of Experiments in Molecular Genet ics) ， 43 1—433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1 972〕が好ましい。 ここに必要によりプロモータ一を効率よく働かせ るために、 例えば、 3 )3—インドリル アクリル酸のような薬剤を加えること ができる。
宿主がェシエリヒア属菌の場合、 培養は通常約 1 5〜43°Cで約 3〜24時 間行ない、 必要により、 通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、 培養は通常約 30〜 40 °Cで約 6〜 24時間行 ない、 必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 バーク ホールダー（Burkholder)最小培地〔Bostian, K. L. ら、 「プロシージングズ · ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ユー エスェ一 （Pro Natl. Acad. Sci. USA) , 77巻， 4505 (1 980)〕 や 0. 5 %カザミノ酸を含有する SD培地 〔Bitter， G. Α. ら、 「プロシージン グズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ · ュ一エスエー （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) ， 8 1巻， 5330 ( 1 98 4) 〕 が挙げられる。 培地の pHは約 5〜 8に調整するのが好ましい。 培養は 通常約 20°C〜35°Cで約 24〜72時間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を 加える。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、 培地としては、 Grace' s Insect Medium (Grace, T. C. C. ,ネイチヤー (Nature) ， 195, 788 (1962)) に非動化した 1 0 %ゥシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。 培地の pHは約 6. 2〜6. 4に調整するのが好ましい。 培養は通常約 27°C で約 3〜5日間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 約 5〜20 %の胎児牛血清を含む MEM培地 〔サイエンス （Science)， 122巻, 501 (1952)〕 ， DMEM培地 〔ヴイロロジー （Virology) ， 8巻， 39 6 (1959)〕， RPMI 1640培地〔ジャーナル'ォブ'ザ 'ァメリカン ' メディ刀 レ ' ァソシェ——シヨン (The Journal of the American Medical Association) 199巻， 519 (1967)〕 ， 199培地 〔プロシ一ジング- ォブ'ザ 'ソサイエティ ·フォー'ザ 'バイオロジカル 'メディスン（Proceeding of the Society for the Biological Medicine) ， 73巻， 1 (1950)〕 な どが用いられる。 pHは約 6〜8であるのが好ましい。 培養は通常約 30で〜 40°Cで約 15〜60時間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
以上のようにして、 形質転換体の細胞内、 細胞膜または細胞外に本発明の G 蛋白質共役型蛋白質を生成せしめることができる。
上記培養物から本発明の蛋白質を分離精製するには、 例えば、 下記の方法に より行なうことができる。
本発明の蛋白質を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、 培養後、 公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、 これを適当な緩衝液に懸濁し、 超音波、 リゾチームおよび または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊した のち、 遠心分離やろ過により蛋白質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられ る。 緩衝液の中に尿素や塩酸グァニジンなどの蛋白質変性剤や、 トリトン X— 100TMなどの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中に蛋白質が分泌さ れる場合には、 培養終了後、 それ自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清と を分離し、 上清を集める。
このようにして得られた培養上清、 あるいは抽出液中に含まれる蛋白質の精 製は、 自体公知の分離 ·精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。 こ れらの公知の分離、 精製法としては、 塩析ゃ溶媒沈澱法などの溶解度を利用す る方法、 透析法、 限外ろ過法、 ゲルろ過法、 および SD S—ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、 イオン交換クロ マトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、 ァフィ二ティーク口マトダラ フィ一などの特異的親和性を利用する方法、 逆相高速液体クロマ などの疎水性の差を利用する方法、 等電点電気泳動法などの等電点の差を利用 する方法などが用いられる。
かくして得られる蛋白質が遊離体で得られた場合には、 自体公知の方法ある いはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、 逆に塩で得られた場 合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、 遊離体または他の塩 に変換することができる。
なお、 組換え体が産生する蛋白質を、 精製前または精製後に適当な蛋白修飾 酵素を作用させることにより、 任意に修飾を加えたり、 ポリペプチドを部分的 に除去することもできる。 蛋白修飾酵素としては、 例えば、 トリプシン、 キモ トリプシン、 アルギニルエンドべプチダ一ゼ、 プロテインキナーゼ、 グリコシ ダーゼなどが用いられる。
かくして生成する本発明の蛋白質またはその塩の活性は、 標識したリガンド との結合実験および特異抗体を用いたェンザィムィムノアッセィなどにより測 定することができる。
本発明の蛋白質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩に対する抗体は、 本発 明の蛋白質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩を認識し得る抗体であれば、 ポリクローナル抗体、 モノクローナル抗体の何れであつてもよい。
本発明の蛋白質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩 （以下、 本発明の蛋白 質等と略記する） に対する抗体は、 本発明の蛋白質等を抗原として用い、 自体 公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
〔モノクローナル抗体の作製〕
( a ) モノクロナール抗体産生細胞の作製
本発明の蛋白質等は、 哺乳動物に対して投与により抗体産生が可能な部位に それ自体あるいは担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体産生能 を高めるため、 完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバント を投与してもよい。 投与は通常 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計 2〜 1 0回程度行な われる。 用いられる哺乳動物としては、 例えば、 サル、 ゥサギ、 ィヌ、 モルモ ット、 マウス、 ラット、 ヒッジ、 ャギが挙げられるが、 マウスおよびラットが 好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、 抗原を免疫された温血動物、 例えば、 マウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の 2〜 5日後に 脾臓またはリンパ節を採取し、 それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と 融合させることにより、 モノクローナル抗体産生ハイプリドーマを調製するこ とができる。 抗血清中の抗体価の測定は、 例えば、 後記の標識化した本発明の 蛋白質等と抗血清とを反応させたのち、 抗体に結合した標識剤の活性を測定す ることにより行なうことができる。 融合操作は既知の方法、 例えば、 ケーラー とミルス夕ィンの方法 〔ネィチヤ一 （Nature)、 256卷、 495頁 （ 1975 年） 〕 に従い実施することができる。 融合促進剤としては、 例えば、 ポリェチ レンダリコール （PEG) やセンダイウィルスなどが挙げられるが、 好ましく は PEGが用いられる。
骨髄腫細胞としては、 例えば、 NS_ 1、 P 3U1、 SP 2/0などが挙げ られるが、 P 3U1が好ましく用いられる。 用いられる抗体産生細胞 （脾臓細 胞） 数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は 1 ： 1〜20 ： 1程度であり、 PE G (好ましくは、 PEG 1000〜PEG6000) が 10~80 %程度の濃 度で添加され、 約 20〜 40 °C、 好ましくは約 30〜 37 °Cで約 1〜 10分間 ィンキュベー卜することにより効率よく細胞融合を実施できる。
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が 使用できるが、 例えば、 本発明の蛋白質等抗原を直接あるいは担体とともに吸 着させた固相 （例、 マイクロプレート） にハイプリドーマ培養上清を添加し、 次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロプリン抗体 （細胞融合に用い られる細胞がマウスの場合、 抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる） また はプロテイン Aを加え、 固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、 抗免疫グロブリン抗体またはプロテイン Aを吸着させた固相にハイプリドーマ 培養上清を添加し、 放射性物質や酵素などで標識した本発明の蛋白質等を加え、 固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。
モノク口一ナル抗体の選別は、 自体公知あるいはそれに準じる方法に従つて 行なうことができるが、 通常は HA T (ヒポキサンチン、 アミノプテリン、 チ ミジン） を添加した動物細胞用培地などで行なうことができる。 選別および育 種用培地としては、 ハイプリドーマが生育できるものならばどのような培地を 用いても良い。 例えば、 1〜2 0 %、 好ましくは 1 0〜 2 0 %の牛胎児血清を 含む R P M I 1 6 4 0培地、 1〜 1 0 %の牛胎児血清を含む G I T培地（和光 純薬工業 （株） ） またはハイプリドーマ培養用無血清培地 （S F M— 1 0 1、 日水製薬 （株） ） などを用いることができる。 培養温度は、 通常 2 0〜4 0 °C、 好ましくは約 3 7 °Cである。 培養時間は、 通常 5日〜 3週間、 好ましくは 1週 間〜 2週間である。 培養は、 通常 5 %炭酸ガス下で行なうことができる。 ハイ プリドーマ培養上清の抗体価は、 上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして 測定できる。
( b ) モノクロナール抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、 通常のポリクローナル抗体の分離精製と 同様に免疫グロブリンの分離精製法 〔例、 塩析法、 アルコール沈殿法、 等電点 沈殿法、 電気泳動法、 イオン交換体 （例、 D E A E ) による吸脱着法、 超遠心 法、 ゲルろ過法、 抗原結合固相またはプロテイン Aあるいはプロテイン Gなど の活性吸着剤により抗体のみを採取し、 結合を解離させて抗体を得る特異的精 製法〕 に従って行なうことができる。
〔ポリクローナル抗体の作製〕
本発明のポリクローナル抗体は、 それ自体公知あるいはそれに準じる方法に したがって製造することができる。例えば、免疫抗原（本発明の蛋白質等抗原） とキャリア一蛋白質との複合体をつくり、 上記のモノクローナル抗体の製造法 と同様に哺乳動物に免疫を行ない、 該免疫動物から本発明の蛋白質等に対する 抗体含有物を採取して、 抗体の分離精製を行なうことにより製造できる。
哺乳動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリア一蛋白質との複合 体に関し、 キャリアー蛋白質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、 キヤリァ一に架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、 どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、 例えば、 ゥシ血清アルブ ミン、 ゥシサイログロブリン、 キーホール · リンペット ·へモシァニン等を重 量比でハプテン 1に対し、約 0. 1〜2 0、好ましくは約 1〜 5の割合でカプル させる方法が用いられる。
また、 ハプテンとキャリアーの力プリングには、 種々の縮合剤を用いること ができるが、 ダルタルアルデヒドやカルポジイミド、 マレイミド活性エステル、 チオール基、 ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。 縮合生成物は、 温血動物に対して、 抗体産生が可能な部位にそれ自体あるい は担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体産生能を高めるため、 完全フロイントアジュバントゃ不完全フロイントアジュバントを投与してもよ い。 投与は、 通常約 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計約 3〜1 0回程度行なうことが できる。
ポリクローナル抗体は、 上記の方法で免疫された哺乳動物の血液、 腹水など、 好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、 上記の血清中の抗体価の測定と 同様にして測定できる。 ポリクローナル抗体の分離精製は、 上記のモノクロ一 ナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従つて行なうこと ができる。 本発明の蛋白質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩、 およびそれらをコー ドする D N Aは、 ①本発明の蛋白質に対するリガンドの決定方法、 ②抗体およ び抗血清の入手、 ③組換え型蛋白質の発現系の構築、 ④同発現系を用いたレセ プタ一結合アツセィ系の開発と医薬品候補化合物のスクリーニング、 ⑤構造的 に類似したリガンド · レセプターとの比較にもとづいたドラッグデザインの実 施、 ⑥遺伝子診断におけるプローブや P C Rプライマーを作成するための試薬、 ⑦トランスジエニック動物の作製または⑧遺伝子予防 ·治療剤等の医薬などと して用いることができる。
特に、 本発明の組換え型蛋白質の発現系を用いたレセプター結合アツセィ系 を用いることによって、 ヒトゃ哺乳動物に特異的な G蛋白質共役型レセプター に対するリガンドの結合性を変化させる化合物 （例、 ァゴニスト、 アン夕ゴニ ストなど） をスクリーニングすることができ、 該ァゴ二ストまたはアンタゴニ ストを各種疾病の予防 ·治療剤などとして使用することができる。
本発明の蛋白質、 部分ペプチドまたはそれらの塩 （以下、 本発明の蛋白質等 と略記する場合がある） 、 本発明の蛋白質またはその部分ペプチドをコードす る DNA (以下、 本発明の DNAと略記する場合がある） および本発明の蛋白 質等に対する抗体 （以下、 本発明の抗体と略記する場合がある） の用途につい て、 以下に具体的に説明する。
( 1) 本発明の蛋白質に対するリガンド （ァゴ二スト） の決定方法
本発明の蛋白質もしくはその塩または本発明の部分べプチドもしくはその塩 は、 本発明の蛋白質またはその塩に対するリガンド （ァゴ二スト） を探索し、 または決定するための試薬として有用である。
すなわち、 本発明は、 本発明の蛋白質もしくはその塩または本発明の部分べ プチドもしくはその塩と、 試験化合物とを接触させることを特徴とする本発明 の蛋白質に対するリガンドの決定方法を提供する。
試験化合物としては、 公知のリガンド （例えば、 アンギオテンシン、 ボンべ シン、 カナピノイド、 コレシストキニン、 グルタミン、 セロ卜ニン、 メラ卜二 ン、 ニューロペプチド Y、 ォピオイド、 プリン、 バソプレツシン、 ォキシトシ ン、 PACAP、 セクレチン、 グルカゴン、 カルシトニン、 アドレノメジユリ ン、 ソマトス夕チン、 GHRH、 CRF、 ACTH、 GRP、 PTH, V I P (バソアクティブ インテスティナル アンド リレイテッド ポリべプチ ド） 、 ソマトス夕チン、 ドーパミン、 モチリン、 アミリン、 ブラジキニン、 C GRP (カルシトニンジーンリレーティッドペプチド） 、 ロイコトリェン、 パ ンクレアスタチン、 プロスタグランジン、 トロンポキサン、 アデノシン、 アド レナリン、 αおよび3—ケモカイン （chemokine) (例えば、 I L— 8、 GRO a、 GRO/3、 GROT、 NAP— 2、 ENA— 78、 P F 4、 I P 1 0、 G CP - 2、 MCP - 1、 HC 14、 MCP— 3、 1— 309、 M I P 1 M I P— l j3、 RANTESなど） 、 エンドセリン、 ェンテロガストリン、 ヒス 夕ミン、 ニューロテンシン、 T R H、 パンクレアティックポリぺプタイドまた はガラニンなどがあげられ、 またその他に、 例えば、 ヒトまたは哺乳動物 （例 えば、 マウス、 ラット、 ブ夕、 ゥシ、 ヒッジ、 サルなど） の組織抽出物、 細胞 培養上清などが用いられる。 例えば、 該組織抽出物、 細胞培養上清などを本発 明の蛋白質に添加し、 細胞刺激活性などを測定しながら分画し、 最終的に単一 のリガンドを得ることができる。
具体的には、 本発明のリガンド決定方法は、 本発明の蛋白質、 その部分ぺプ チドもしくはそれらの塩を用いるか、 または組換え型蛋白質の発現系を構築し、 該発現系を用いたレセプ夕一結合アツセィ系を用いることによって、 本発明の 蛋白質に結合して細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン 遊離、 細胞内 C a 2 +遊離、 細胞内 c AM P生成、 細胞内 c GM P生成、 イノシ ト一ルリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c一 f o s活 性化、 P Hの低下などを促進する活性または抑制する活性）を有する化合物（例 えば、 ペプチド、 蛋白質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物など） またはその塩を決定する方法である。
本発明のリガンド決定方法においては、 本発明の蛋白質またはその部分ぺプ チドと試験化合物とを接触させた場合の、 例えば、 該蛋白質または該部分ぺプ チドに対する試験化合物の結合量や、 細胞刺激活性などを測定することを特徴 とする。
より具体的には、 本発明は、 ①標識した試験化合物を、 本発明の蛋白質もし くはその塩または本発明の部分べプチドもしくはその塩に接触させた場合にお ける、 標識した試験化合物の該蛋白質もしくはその塩、 または該部分ペプチド もしくはその塩に対する結合量を測定することを特徴とする本発明の蛋白質ま たはその塩に対するリガンドの決定方法、
②標識した試験化合物を、 本発明の蛋白質を含有する細胞または該細胞の膜画 分に接触させた場合における、 標識した試験化合物の該細胞または該膜画分に 対する結合量を測定することを特徴とする本発明の蛋白質またはその塩に対す るリガンドの決定方法、 ③標識した試験化合物を、 本発明の蛋白質をコードする D NAを含有する形質 転換体を培養することによって細胞膜上に発現した蛋白質に接触させた場合に おける、 標識した試験化合物の該蛋白質またはその塩に対する結合量を測定す ることを特徴とする本発明の蛋白質に対するリガンドの決定方法、
④試験化合物を、 本発明の蛋白質を含有する細胞に接触させた場合における、 蛋白質を介した細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊 離、 細胞内 C a 2 +遊離、 細胞内 c AM P生成、 細胞内 c GM P生成、 イノシト ールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c一 f o sの活 性化、 P Hの低下などを促進する活性または抑制する活性など） を測定するこ とを特徴とする本発明の蛋白質またはその塩に対するリガンドの決定方法、 お よび
⑤試験化合物を、 本発明の蛋白質をコ一ドする D NAを含有する形質転換体を 培養することによって細胞膜上に発現した蛋白質に接触させた場合における、 蛋白質を介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊 離、 細胞内 C a 2 +遊離、 細胞内 c AM P生成、 細胞内 c GM P生成、 イノシト 一ルリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c一 f o sの活 性化、 P Hの低下などを促進する活性または抑制する活性など） を測定するこ とを特徴とする本発明の蛋白質またはその塩に対するリガンドの決定方法を提 供する。
特に、 上記①〜③の試験を行ない、 試験化合物が本発明の蛋白質に結合する ことを確認した後に、 上記④〜⑤の試験を行なうことが好ましい。
まず、 リガンド決定方法に用いる蛋白質としては、 前記した本発明の蛋白質 または本発明の部分べプチドを含有するものであれば何れのものであってもよ いが、 動物細胞を用いて大量発現させた蛋白質が適している。
本発明の蛋白質を製造するには、 前述の発現方法が用いられるが、 該蛋白質 をコードする D N Aを哺乳動物細胞や昆虫細胞で発現することにより行なうこ とが好ましい。 目的とする蛋白質部分をコードする D NA断片には、 通常、 相 補 D N Aが用いられるが、 必ずしもこれに制約されるものではない。 例えば、 遺伝子断片や合成 DNAを用いてもよい。 本発明の蛋白質をコードする DNA 断片を宿主動物細胞に導入し、 それらを効率よく発現させるためには、 該 DN A断片を昆虫を宿主とするバキュロウィルスに属する核多角体病ウィルス (nuclear polyhedrosis virus； NPV) のポリヘドリンプロモーター、 SV 40由来のプロモーター、 レトロウイルスのプロモ一夕一、 メタ口チォネイン プロモ一夕一、 ヒトヒートショックプロモータ一、 サイトメガロウィルスプロ モータ一、 SRひプロモーターなどの下流に組み込むのが好ましい。 発現した レセプ夕一の量と質の検査はそれ自体公知の方法で行うことができる。 例えば、 文献 〔Nambi， P. ら、 ザ ·ジャーナル ·ォブ ·バイオロジカル ·ケミストリー (J. Biol. Chem. ) ， 267巻， 19555〜19559頁， 1992年〕 に記載の方法に従って行 うことができる。
したがって、 本発明のリガンド決定方法において、 本発明の蛋白質、 その部 分ペプチドまたはそれらの塩を含有するものとしては、 それ自体公知の方法に 従って精製した蛋白質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩であってもよいし、 該蛋白質を含有する細胞またはその細胞膜画分を用いてもよい。
本発明のリガンド決定方法において、 本発明の蛋白質を含有する細胞を用い る場合、 該細胞をダルタルアルデヒド、 ホルマリンなどで固定化してもよい。 固定化方法はそれ自体公知の方法に従って行なうことができる。
本発明の蛋白質を含有する細胞としては、 本発明の蛋白質を発現した宿主細 胞をいうが、 該宿主細胞としては、 大腸菌、 枯草菌、 酵母、 昆虫細胞、 動物細 胞などが用いられる。
細胞膜画分としては、 細胞を破碎した後、 それ自体公知の方法で得られる細 胞膜が多く含まれる画分のことをいう。 細胞の破碎方法としては、 Potter— Elvehjem型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、 ヮーリングブレンダーゃポ リトロン （Kinematica社製） による破砕、 超音波による破砕、 フレンチプレス などで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破碎などが挙 げられる。 細胞膜の分画には、 分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠 心力による分画法が主として用いられる。 例えば、 細胞破碎液を低速 （500 r pm〜3000 r pm) で短時間 （通常、 約 1分〜 10分） 遠心し、 上清を さらに高速 （15000 r pm〜30000 r pm) で通常 30分〜 2時間遠 心し、 得られる沈澱を膜画分とする。 該膜画分中には、 発現した蛋白質と細胞 由来のリン脂質や膜蛋白質などの膜成分が多く含まれる。
該蛋白質を含有する細胞やその膜画分中の蛋白質の量は、 1細胞当たり
103〜108分子であるのが好ましく、 105〜107分子であるのが好適であ る。 なお、 発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活性 （比活性） が高 くなり、 高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばかりでなく、 同一口 ットで大量の試料を測定できるようになる。
本発明の蛋白質またはその塩に対するリガンドを決定する前記の①〜③の方 法を実施するためには、 適当な蛋白質画分と、 標識した試験化合物が必要であ る。
蛋白質画分としては、 天然型のレセプ夕一蛋白質画分か、 またはそれと同等 の活性を有する組換え型レセプ夕一画分などが望ましい。 ここで、 同等の活性 とは、 同等のリガンド結合活性、 シグナル情報伝達作用などを示す。
標識した試験化合物としては、 〔3H〕 、 〔125 I〕 、 〔14C〕 、 〔35S〕 などで標識したアンギオテンシン、 ボンべシン、 カナピノイド、 コレシストキ ニン、 グルタミン、 セロトニン、 メラトニン、 ニューロペプチド Y、 オビオイ ド、 プリン、 バソプレツシン、 ォキシトシン、 PACAP、 セクレチン、 グル 力ゴン、 カルシトニン、 アドレノメジュリン、 ソマトス夕チン、 GHRH、 C RF、 ACTH、 GRP、 PTH、 V I P (バソアクティブ インテスティナ ル アンド リイテッド ポリペプチド） 、 ソマトス夕チン、 ドーパミン、 モ チリン、 アミリン、 ブラジキニン、 CGRP (カルシトニンジーンリレーティ ッドペプチド） 、 ロイコトリェン、 パンクレアスタチン、 プロスタグランジン、 トロンポキサン、 アデノシン、 アドレナリン、 ひおよび /3—ケモカイン (chemokine) (例えば、 I L一 8、 GR〇a、 GRO 3、 GROァ、 NAP— 2、 ENA— 78、 PF4、 I P 10、 GCP - 2、 MCP_ 1、 HC 14、 MCP— 3、 1— 309、 MI P 1ひ、 M I P— 1 )3、 RANTESなど） 、 エンドセリン、 ェンテロガストリン、 ヒスタミン、 ニューロテンシン、 TRH、 パンクレアティックポリべプ夕ィド、 ガラニンなどが好適である。
具体的には、 本発明の蛋白質またはその塩に対するリガンドの決定方法を行 なうには、 まず本発明の蛋白質を含有する細胞または細胞の膜画分を、 決定方 法に適したバッファ一に懸濁することによりレセプ夕一標品を調製する。 バッ ファーには、 pH4〜10 (望ましくは pH6〜8) のリン酸バッファ一、 ト リス—塩酸バッファーなどのリガンドと本発明の蛋白質との結合を阻害しない バッファーであればいずれでもよい。 また、 非特異的結合を低減させる目的で、 CHAPS, Twe e n— 80™ (花王—アトラス社） 、 ジギトニン、 デォキ シコレ一トなどの界面活性剤ゃゥシ血清アルブミンゃゼラチンなどの各種蛋白 質をバッファーに加えることもできる。 さらに、 プロテア一ゼによるリセプ夕 一やリガンドの分解を抑える目的で PMS F、 ロイぺプチン、 E—64 (ぺプ チド研究所製） 、 ぺプス夕チンなどのプロテア一ゼ阻害剤を添加することもで きる。 0.0 lm 1〜 1 Omlの該レセプ夕一溶液に、 一定量 （5000 c pm 〜500000 c pm) の 〔3H〕 、 〔125 I〕 、 〔14C〕 、 〔35S〕 などで 標識した試験化合物を共存させる。 非特異的結合量 （NSB) を知るために大 過剰の未標識の試験化合物を加えた反応チューブも用意する。 反応は約 0 か ら 50°C、 望ましくは約 4 :から 37°Cで、 約 20分から 24時間、 望ましく は約 30分から 3時間行なう。 反応後、 ガラス繊維濾紙等で濾過し、 適量の同 バッファーで洗浄した後、 ガラス繊維濾紙に残存する放射活性を液体シンチレ ーシヨンカウンタ一あるいはァーカウン夕一で計測する。 全結合量 （B) から 非特 ¼的結合量 （NSB) を引いたカウント （B— NSB) が O c pmを越え る試験化合物を本発明の蛋白質またはその塩に対するリガンド （ァゴニスト） として選択することができる。
本発明の蛋白質またはその塩に対するリガンドを決定する前記の④〜⑤の方 法を実施するためには、 該蛋白質を介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン 酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a2+遊離、 細胞内 c AMP生成、 細胞 内 cGMP生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質の リン酸化、 c一 f o sの活性化、 pHの低下などを促進する活性または抑制す る活性など） を公知の方法または市販の測定用キットを用いて測定することが できる。 具体的には、 まず、 本発明の蛋白質を含有する細胞をマルチウエルプ レート等に培養する。 リガンド決定を行なうにあたっては前もって新鮮な培地 あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッファ一に交換し、 試験化合物などを 添加して一定時間インキュベートした後、 細胞を抽出あるいは上清液を回収し て、 生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。 細胞刺激活性の指標と する物質 （例えば、 ァラキドン酸など） の生成が、 細胞が含有する分解酵素に よって検定困難な場合は、 該分解酵素に対する阻害剤を添加してアツセィを行 なってもよい。 また、 c AMP産生抑制などの活性については、 フオルスコリ ンなどで細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用と して検出することができる。
本発明の蛋白質またはその塩に結合するリガンド決定用キットは、 本発明の 蛋白質もしくはその塩、 本発明の部分ペプチドもしくはその塩、 本発明の蛋白 質を含有する細胞、 または本発明の蛋白質を含有する細胞の膜画分などを含有 するものである。
本発明のリガンド決定用キッ卜の例としては、 次のものが挙げられる。 1. リガンド決定用試薬
①測定用緩衝液および洗浄用緩衝液
Hanks' Balanced Salt Solution (ギブコ社製） に、 0. 05%のゥシ血清ァ ルブミン （シグマ社製） を加えたもの。
孔径 0.45 zmのフィルターで濾過滅菌し、 4°Cで保存するか、あるいは用 時調製しても良い。
② G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質標品
本発明の蛋白質を発現させた CHO細胞を、 12穴プレートに 5 X 105個 Z穴で継代し、 37° (：、 5%C〇2、 95 % a i rで 2日間培養したもの。
③標識試験化合物
市販の 〔3H〕 、 〔125 I〕 、 〔14C〕 、 〔35S〕 などで標識した化合物、 または適当な方法で標識化したもの
水溶液の状態のものを 4°Cあるいは— 2 or:にて保存し、 用時に測定用緩衝 液にて に希釈する。 水に難溶性を示す試験化合物については、 ジメチル ホルムアミド、 DMSO、 メタノール等に溶解する。
④非標識試験化合物
標識化合物と同じものを 1 00〜1000倍濃い濃度に調製する。
2. 測定法
① 12穴組織培養用プレートにて培養した本発明の蛋白質発現 CHO細胞を、 測定用緩衝液 1 m 1で 2回洗浄した後、 490 1の測定用緩衝液を各穴に加 える。
②標識試験化合物を 5 a 1加え、 室温にて 1時間反応させる。 非特異的結合量 を知るためには非標識試験化合物を 5 1加えておく。
③反応液を除去し、 lm 1の洗浄用緩衝液で 3回洗浄する。 細胞に結合した標 識試験化合物を 0. 2N N aOH- 1 %SDSで溶解し、 4m 1の液体シンチ レーター A (和光純薬製） と混合する。
④液体シンチレ一シヨンカウンタ一 （ベックマン社製） を用いて放射活性を測 定する。
本発明の蛋白質またはその塩に結合することができるリガンドとしては、 例 えば、 脳、 下垂体、 滕臓などに特異的に存在する物質などが挙げられ、 具体的 には、 アンギオテンシン、 ボンべシン、 カナピノイド、 コレシストキニン、 グ ル夕ミン、 セロトニン、 メラトニン、 ニューロペプチド Y、 ォピオイド、 プリ ン、 バソプレツシン、 ォキシトシン、 PACAP、 セクレチン、 グルカゴン、 カルシトニン、 アドレノメジュリン、 ソマトス夕チン、 GHRH、 CRF、 A CTH、 GRP、 PTH、 V I P (バソアクティブ インテスティナル アン ド リレイテッド ポリペプチド） 、 ソマトス夕チン、 ド一パミン、 モチリン、 アミリン、 ブラジキニン、 CGRP (カルシ卜ニンジーンリレーティッドぺプ チド） 、 ロイコトリェン、 パンクレアスタチン、 プロスタグランジン、 トロン ボキサン、 アデノシン、 アドレナリン、 ひおよび ]3—ケモカイン （chemokine) (例えば、 I L一 8、 GROa、 GR〇i3、 GROr、 NAP— 2、 ENA_ 78、 PF4、 I P 10、 GCP_2、 MCP— 1、 HC 14、 MCP_3、 1—309、 M I P 1 M I P— 1 )3、 RANT ESなど） 、 エンドセリン、 ェンテロガストリン、 ヒスタミン、 ニューロテンシン、 TRH、 パンクレアテ イツクポリぺプタイド、 ガラニンなどが用いられる。
(2) 本発明の蛋白質欠乏症の予防 ·治療剤
上記 （1) の方法において、 本発明の蛋白質に対するリガンドが明らかにな れば、 該リガンドが有する作用に応じて、 ①本発明の蛋白質または②該蛋白質 をコードする DNAを、 本発明の蛋白質の機能不全に関連する疾患の予防およ び Zまたは治療剤などの医薬として使用することができる。
例えば、 生体内において本発明の蛋白質が減少しているためにリガンドの生 理作用が期待できない （該蛋白質の欠乏症） 患者がいる場合に、 ①本発明の蛋 白質を該患者に投与し該蛋白質の量を補充したり、 ② （ィ） 本発明の蛋白質を コードする DN Aを該患者に投与し発現させることによって、 あるいは （口） 対象となる細胞に本発明の蛋白質をコ一ドする DNAを挿入し発現させた後に、 該細胞を該患者に移植することなどによって、 患者の体内における蛋白質の量 を増加させ、 リガンドの作用を充分に発揮させることができる。 したがって、 本発明の蛋白質をコードする DNAは、 安全で低毒性な本発明のレセプタ一蛋 白質の機能不全に関連する疾患の予防および/または治療剤などの医薬として 有用である。
本発明の蛋白質または本発明の D N Aは中枢疾患 (例えばァルツハイマー病 · 痴呆'摂食障害 （拒食症） ，てんかんなど）、 ホルモン系の疾患 （例えば、 微弱 陣痛、 弛緩出血、 胎盤娩出前後、 子宮復古不全、 帝王切開術、 人工妊娠中絶、 乳汁うっ滞など） 、 肝/胆 /勝/内分泌疾患 (例えば糖尿病 ·摂食障害など)、 炎症 性疾患（アレルギー ·喘息 · リュウマチなど）、 循環器疾患 (例えば高血圧症-心 肥大'狭心症 ·動脈硬化等）の予防および Zまたは治療に有用である。
本発明の蛋白質を上記予防 ·治療剤として使用する場合は、 常套手段に従つ て製剤化することができる。 一方、 本発明の蛋白質をコードする D N A (以下、 本発明の D N Aと略記す る場合がある） を上記予防 ·治療剤として使用する場合は、 本発明の D NAを 単独あるいはレトロウイルスベクター、 アデノウイルスベクター、 アデノウィ ルスァソシエーテッドウィルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、 常套手段に従って実施することができる。 本発明の D NAは、 そのままで、 あ るいは摂取促進のための補助剤とともに、 遺伝子銃やハイドロゲルカテーテル のようなカテーテルによって投与できる。
例えば、 ①本発明の蛋白質または②該蛋白質をコードする D NAは、 必要に 応じて糖衣を施した錠剤、 カプセル剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤な どとして経口的に、 あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との 無菌性溶液、 または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。 例え ば、 ①本発明の蛋白質または②該蛋白質をコードする D N Aを生理学的に認め られる公知の担体、 香味剤、 賦形剤、 べヒクル、 防腐剤、 安定剤、 結合剤など とともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和すること によって製造することができる。 これら製剤における有効成分量は指示された 範囲の適当な用量が得られるようにするものである。
錠剤、 カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、 例えばゼラ チン、 コーンスターチ、 トラガント、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セ ルロースのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸などのよう な膨化剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖またはサ ッカリンのような甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油またはチェリーのような 香味剤などが用いられる。 調剤単位形態がカプセルである場合には、 前記タイ プの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。 注射のため の無菌組成物は注射用水のようなべヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油など のような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に 従って処方することができる。 注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液 （例えば、 D—ソルビトール、 D—マ ンニトール、 塩化ナトリウムなど） などが用いられ、 適当な溶解補助剤、 例え ば、 アルコール （例、 エタノール） 、 ポリアルコール （例、 プロピレングリコ —ル、 ポリエチレングリコール） 、 非イオン性界面活性剤 （例、 ポリソルベー ト 80TM、 HCO— 50) などと併用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油などが用いられ、 溶解補助剤である安息香酸ベンジル、 ベンジ ルアルコールなどと併用してもよい。
また、 上記予防 ·治療剤は、 例えば、 緩衝剤 （例えば、 リン酸塩緩衝液、 酢 酸ナトリウム緩衝液） 、 無痛化剤 （例えば、 塩化ベンザルコニゥム、 塩酸プロ 力インなど） 、 安定剤 （例えば、 ヒト血清アルブミン、 ポリエチレングリコ一 ルなど） 、 保存剤 （例えば、 ベンジルアルコール、 フエノールなど） 、 酸化防 止剤などと配合してもよい。 調製された注射液は通常、 適当なアンプルに充填 される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトゃ哺 乳動物 （例えば、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルな ど） に対して投与することができる。
本発明の蛋白質または DNAの投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与 方法などにより差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に成人 （60 kgとし て） の拒食症患者においては、 一日につき約 0. lmg〜100mg、好ましく は約 1. 0〜50mg、 より好ましくは約 1. 0〜20mgである。 非経口的 に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法な どによっても異なるが、 例えば、 注射剤の形では通常成人 （6 O kgとして） の拒食症患者においては、 一日につき約 0. 01〜30mg程度、 好ましくは 約 0. 1〜2 Omg程度、 より好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射 により投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 6 O kg当たりに換算 した量を投与することができる。
(3) 遺伝子診断剤
本発明の DN Aは、 プローブとして使用することにより、 ヒトまたは哺乳動 物 （例えば、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） における本発明の蛋白質またはその部分ペプチドをコードする DN Aまたは m RNAの異常 （遺伝子異常） を検出することができるので、 例えば、 該 DNA または mRNAの損傷、 突然変異あるいは発現低下や、 該 DNAまたは mRN Aの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断剤として有用である。
本発明の DNAを用いる上記の遺伝子診断は、 例えば、 自体公知のノーザン ハイブリダィゼ一シヨンや PCR—S SCP法 （ゲノミックス （Genomics) , 第 5巻， 874〜879頁 （ 1989年） 、 プロシージングズ.ォブ ·ザ ·ナ ショナル'アカデミー'ォブ 'サイェンシィズ 'ォブ 'ユーエスエー（Proceedings of the Nat inal Academy of Sciences of the United States of America; ， 第 86巻， 2766〜 2770頁 （1 989年） ） などにより実施することが できる。
(4) 本発明の蛋白質に対するリガンドの定量法
本発明の蛋白質等は、 リガンドに対して結合性を有しているので、 生体内に おけるリガンド濃度を感度良く定量することができる。
本発明の定量法は、 例えば、 競合法と組み合わせることによって用いること ができる。 すなわち、 被検体を本発明の蛋白質等と接触させることによって被 検体中のリガンド濃度を測定することができる。 具体的には、 例えば、 以下の ①または②などに記載の方法あるいはそれに準じる方法に従って用いることが できる。
①入江寛編 「ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 49年発行）
②入江寛編 「続ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 54年発行）
(5) 本発明の蛋白質とリガンドとの結合性を変化させる化合物のスクリ一二 ング方法
本発明の蛋白質等を用いるか、 または組換え型蛋白質等の発現系を構築し、 該発現系を用いたレセプ夕一結合アツセィ系を用いることによって、 リガンド と本発明の蛋白質等との結合性を変化させる化合物 （例えば、 ペプチド、 蛋白 質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物など） またはその塩を効率 よくスクリーニングすることができる。
このような化合物には、 （ィ） G蛋白質共役型レセプ夕一を介して細胞刺激 活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2 +遊離、 細胞内 c AM P生成、 細胞内 c GM P生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜 電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c一 f o sの活性化、 p Hの低下などを 促進する活性または抑制する活性など） を有する化合物 （いわゆる、 本発明の 蛋白質に対するァゴニスト） 、 （口） 該細胞刺激活性を有しない化合物 （いわ ゆる、 本発明の蛋白質に対するアン夕ゴニスト） 、 （ハ） リガンドと本発明の 蛋白質との結合力を増強する化合物， あるいは （二） リガンドと本発明の蛋白 質との結合力を減少させる化合物などが含まれる （なお、 上記 （ィ） の化合物 は、 前記したリガンド決定方法によってスクリーニングすることが好ましい） 。 すなわち、 本発明は、 （ i ) 本発明の蛋白質、 その部分ペプチドまたはそれ らの塩と、 リガンドとを接触させた場合と （i i ) 本発明の蛋白質、 その部分べ プチドまたはそれらの塩と、 リガンドおよび試験化合物とを接触させた場合と の比較を行なうことを特徴とするリガンドと本発明の蛋白質、 その部分べプチ ドまたはそれらの塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリー二 ング方法を提供する。
本発明のスクリーニング方法においては、 （i ) と （i i ) の場合における、 例えば、 該蛋白質等に対するリガンドの結合量、 細胞刺激活性などを測定して、 比較することを特徴とする。
より具体的には、 本発明は、
①標識したリガンドを、 本発明の蛋白質等に接触させた場合と、 標識したリガ ンドおよび試験化合物を本発明の蛋白質等に接触させた場合における、 標識し たリガンドの該蛋白質等に対する結合量を測定し、 比較することを特徴とする リガンドと本発明の蛋白質等との結合性を変化させる化合物またはその塩のス クリーニング方法、
②標識したリガンドを、 本発明の蛋白質等を含有する細胞または該細胞の膜画 分に接触させた場合と、 標識したリガンドおよび試験化合物を本発明の蛋白質 等を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合における、 標識した リガンドの該細胞または該膜画分に対する結合量を測定し、 比較することを特 徴とするリガンドと本発明の蛋白質等との結合性を変化させる化合物またはそ の塩のスクリ一ニング方法、
③標識したリガンドを、 本発明の D N Aを含有する形質転換体を培養すること によって細胞膜上に発現した蛋白質等に接触させた場合と、 標識したリガンド および試験化合物を本発明の D N Aを含有する形質転換体を培養することによ つて細胞膜上に発現した本発明の蛋白質等に接触させた場合における、 標識し たリガンドの該蛋白質等に対する結合量を測定し、 比較することを特徴とする リガンドと本発明の蛋白質等との結合性を変化させる化合物またはその塩のス クリーニング方法、
④本発明の蛋白質等を活性化する化合物 （例えば、 本発明の蛋白質等に対する リガンドなど） を本発明の蛋白質等を含有する細胞に接触させた場合と、 本発 明の蛋白質等を活性化する化合物および試験化合物を本発明の蛋白質等を含有 する細胞に接触させた場合における、 レセプターを介した細胞刺激活性 （例え ば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2 +遊離、 細胞内 c A M P生成、 細胞内 c GM P生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c一 f o sの活性化、 p Hの低下などを促進する活 性または抑制する活性など） を測定し、 比較することを特徴とするリガンドと 本発明の蛋白質等との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリ一ニン グ方法、 および
⑤本発明の蛋白質等を活性化する化合物 （例えば、 本発明の蛋白質等に対する リガンドなど） を本発明の D N Aを含有する形質転換体を培養することによつ て細胞膜上に発現した本発明の蛋白質等に接触させた場合と、 本発明の蛋白質 等を活性化する化合物および試験化合物を本発明の D NAを含有する形質転換 体を培養することによって細胞膜上に発現した本発明の蛋白質等に接触させた 場合における、 レセプターを介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2 +遊離、 細胞内 c AM P生成、 細胞内 c GM P生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c - f o sの活性化、 p Hの低下などを促進する活性または抑制する活性など） を測定し、 比較することを特徴とするリガンドと本発明の蛋白質等との結合性 を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
本発明の蛋白質等が得られる以前は、 G蛋白質共役型レセプ夕一ァゴニスト またはアン夕ゴニストをスクリーニングする場合、 まずラットなどの G蛋白質 共役型レセプ夕一蛋白質を含む細胞、 組織またはその細胞膜画分を用いて候補 化合物を得て （一次スクリーニング） 、 その後に該候補化合物が実際にヒトの G蛋白質共役型レセプター蛋白質とリガンドとの結合を阻害するか否かを確認 する試験 （二次スクリーニング） が必要であった。 細胞、 組織または細胞膜画 分をそのまま用いれば他のレセプ夕一蛋白質も混在するために、 目的とするレ セプ夕一蛋白質に対するァゴニストまたはアンタゴニストを実際にスクリー二 ングすることは困難であった。
しかしながら、 例えば、 本発明のヒト由来蛋白質を用いることによって、 一 次スクリ一ニングの必要がなくなり、 リガンドと G蛋白質共役型レセプ夕ー蛋 白質との結合を阻害する化合物を効率良くスクリーニングすることができる。 さらに、 スクリーニングされた化合物がァゴニストかアン夕ゴニストかを簡便 に評価することができる。
本発明のスクリーニング方法の具体的な説明を以下にする。
まず、 本発明のスクリーニング方法に用いる本発明の蛋白質等としては、 前 記した本発明の蛋白質等を含有するものであれば何れのものであってもよいが、 本発明の蛋白質等を含有する哺乳動物の臓器の細胞膜画分が好適である。 しか し、 特にヒト由来の臓器は入手が極めて困難なことから、 スクリーニングに用 いられるものとしては、 組換え体を用いて大量発現させたヒト由来のレセプ夕 一蛋白質等などが適している。
本発明の蛋白質等を製造するには、 前述の方法が用いられるが、 本発明の D N Aを哺乳細胞や昆虫細胞で発現することにより行なうことが好ましい。 目的 とする蛋白質部分をコードする D NA断片には相補 D NAが用いられるが、 必 ずしもこれに制約されるものではない。 例えば、 遺伝子断片や合成 D NAを用 いてもよい。 本発明の蛋白質をコードする D N A断片を宿主動物細胞に導入し、 それらを効率よく発現させるためには、 該 D N A断片を昆虫を宿主とするバキ ュロウィルスに属する核多角体病ウィルス （nuc lear polyhedros i s vi rus； N P V) のポリヘドリンプロモー夕一、 S V 4 0由来のプロモ一夕一、 レトロゥ ィルスのプロモーター、 メタ口チォネインプロモーター、 ヒトヒートショック プロモーター、 サイ卜メガロウィルスプロモ一夕一、 S R o!プロモーターなど の下流に組み込むのが好ましい。 発現したレセプターの量と質の検査はそれ自 体公知の方法で行うことができる。 例えば、 文献 〔Namb i， P. ら、 ザ…ジャー ナル 'ォブ 'バイオロジカル ·ケミストリー （J. Biol. Chem. ) ， 267巻， 19555 〜19559頁， 1992年〕 に記載の方法に従って行なうことができる。
したがって、 本発明のスクリーニング方法において、 本発明の蛋白質等を含 有するものとしては、 それ自体公知の方法に従って精製した蛋白質等であって もよいし、 該蛋白質等を含有する細胞を用いてもよく、 また該蛋白質等を含有 する細胞の膜画分を用いてもよい。
本発明のスクリーニング方法において、 本発明の蛋白質等を含有する細胞を 用いる場合、 該細胞をダルタルアルデヒド、 ホルマリンなどで固定化してもよ い。 固定化方法はそれ自体公知の方法に従って行なうことができる。
本発明の蛋白質等を含有する細胞としては、 該蛋白質等を発現した宿主細胞 をいうが、 該宿主細胞としては、 大腸菌、 枯草菌、 酵母、 昆虫細胞、 動物細胞 などが好ましい。
細胞膜画分としては、 細胞を破碎した後、 それ自体公知の方法で得られる細 胞膜が多く含まれる画分のことをいう。 細胞の破砕方法としては、 Pot ter— Elvehj em型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、 ヮーリングブレンダ一ゃポ リトロン （Kinemat i c a社製） のよる破砕、 超音波による破砕、 フレンチプレス などで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などが挙 げられる。 細胞膜の分画には、 分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠 心力による分画法が主として用いられる。 例えば、 細胞破砕液を低速 （5 0 0 r p m〜3 0 0 0 r p m) で短時間 （通常、 約 1分〜 1 0分） 遠心し、 上清を さらに高速 （1 5 0 0 0 r p m〜3 0 0 0 0 r p m) で通常 3 0分〜 2時間遠 心し、 得られる沈澱を膜画分とする。 該膜画分中には、 発現した蛋白質等と細 胞由来のリン脂質や膜蛋白質などの膜成分が多く含まれる。
該蛋白質等を含有する細胞や膜画分中の該蛋白質の量は、 1細胞当たり 103〜 108分子であるのが好ましく、 105〜 107分子であるのが好適であ る。 なお、 発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活性 （比活性） が高 くなり、 高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばかりでなく、 同一口 ットで大量の試料を測定できるようになる。
リガンドと本発明の蛋白質等との結合性を変化させる化合物をスクリーニン グする前記の①〜③を実施するためには、 例えば、 適当な蛋白質画分と、 標識 したリガンドが必要である。
蛋白質画分としては、 天然型のレセプ夕一蛋白質画分か、 またはそれと同等 の活性を有する組換え型レセプ夕一蛋白質画分などが望ましい。 ここで、 同等 の活性とは、 同等のリガンド結合活性、 シグナル情報伝達作用などを示す。 標識したリガンドとしては、 標識したリガンド、 標識したリガンドアナログ 化合物などが用いられる。 例えば 〔3H〕 、 〔125 I〕 、 〔14C〕 、 〔35S〕 などで標識されたリガンドなどが用いられる。
具体的には、 リガンドと本発明の蛋白質等との結合性を変化させる化合物の スクリーニングを行なうには、 まず本発明の蛋白質等を含有する細胞または細 胞の膜画分を、 スクリーニングに適したバッファーに懸濁することにより蛋白 質標品を調製する。 バッファ一には、 pH4〜10 (望ましくは pH6〜8) のリン酸バッファー、 トリス—塩酸バッファ一などのリガンドと蛋白質との結 合を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。 また、 非特異的結合を低 減させる目的で、 CHAPS、 Twe e n-80™ (花王一アトラス社） 、 ジ ギトニン、 デォキシコレートなどの界面活性剤をバッファーに加えることもで きる。 さらに、 プロテアーゼによるレセプ夕一やリガンドの分解を抑える目的 で PMSF、 ロイぺプチン、 E— 64 (ペプチド研究所製） 、 ぺプス夕チンな どのプロテアーゼ阻害剤を添加することもできる。 0. O lm l〜 10mlの該 レセプター溶液に、 一定量 （5000 c pm〜5 O O O O O c pm) の標識し たリガンドを添加し、同時に 1 0— 4M〜1 0— 1 ϋΜの試験化合物を共存させる。 非特異的結合量 （NS B) を知るために大過剰の未標識のリガンドを加えた反 応チューブも用意する。反応は約 0°Cから 50°C、望ましくは約 4°Cから 3 7°C で、 約 2 0分から 24時間、 望ましくは約 3 0分から 3時間行う。 反応後、 ガ ラス繊維濾紙等で濾過し、 適量の同バッファーで洗浄した後、 ガラス繊維濾紙 に残存する放射活性を液体シンチレーシヨンカウンタ一またはァ—カウンター で計測する。拮抗する物質がない場合のカウント（B。）から非特異的結合量（N S B) を引いたカウント （B。一 NS B) を 1 0 0 %とした時、 特異的結合量 (B-NS B) 力 例えば、 5 0%以下になる試験化合物を拮抗阻害能力のあ る候補物質として選択することができる。
リガンドと本発明の蛋白質等との結合性を変化させる化合物スクリーニング する前記の④〜⑤の方法を実施するためには、 例えば、 蛋白質を介する細胞刺 激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a2+遊離、 細胞内 cAM P生成、 細胞内 c GMP生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜 電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c一 f o sの活性化、 pHの低下などを 促進する活性または抑制する活性など） を公知の方法または市販の測定用キッ トを用いて測定することができる。
具体的には、 まず、 本発明の蛋白質等を含有する細胞をマルチウヱルプレー ト等に培養する。 スクリーニングを行なうにあたっては前もって新鮮な培地あ るいは細胞に毒性を示さない適当なバッファ一に交換し、 試験化合物などを添 加して一定時間ィンキュベ一トした後、 細胞を抽出あるいは上清液を回収して、 生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。 細胞刺激活性の指標とする 物質 （例えば、 ァラキドン酸など） の生成が、 細胞が含有する分解酵素によつ て検定困難な場合は、 該分解酵素に対する阻害剤を添加してアツセィを行なつ てもよい。 また、 CAMP産生抑制などの活性については、 フォルスコリンな どで細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用として 検出することができる。
細胞刺激活性を測定してスクリーニングを行なうには、 適当な蛋白質を発現 した細胞が必要である。 本発明の蛋白質等を発現した細胞としては、 天然型の 本発明の蛋白質等を有する細胞株、 前述の組換え型蛋白質等を発現した細胞株 などが望ましい。
試験化合物としては、 例えば、 ペプチド、 タンパク、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液などが用 いられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物であつ てもよい。 ，
リガンドと本発明の蛋白質等との結合性を変化させる化合物またはその塩の スクリーニング用キットは、 本発明の蛋白質等、 本発明の蛋白質等を含有する 細胞、 または本発明の蛋白質等を含有する細胞の膜画分を含有するものなどで ある。
本発明のスクリーニング用キッ卜の例としては、 次のものが挙げられる。 1. スクリーニング用試薬
①測定用緩衝液および洗浄用緩衝液
Hanks' Balanced Salt Solution (ギブコ社製） に、 0. 05%のゥシ血清ァ ルブミン （シグマ社製） を加えたもの。
孔径 0.45 のフィル夕一で濾過滅菌し、 4°Cで保存するか、あるいは用 時調製しても良い。
② G蛋白質共役型レセプ夕一標品
本発明の蛋白質を発現させた CHO細胞を、 12穴プレー卜に 5 X 105個 Z穴で継代し、 37°C、 5%C〇2、 95 % a i rで 2日間培養したもの。
③標識リガンド
市販の 〔3H〕 、 〔125 I〕 、 〔14C〕 、 〔35S〕 などで標識したリガンド 水 溶液の状態のものを 4°Cあるいは一 20°Cにて保存し、 用時に測定用緩衝液に て に希釈する。
④リガンド標準液
リガンドを 0. 1 %ゥシ血清アルブミン（シグマ社製）を含む PBSで ImM となるように溶解し、 — 20°Cで保存する。 2. 測定法
① 12穴組織培養用プレートにて培養した本発明の蛋白質発現 CH〇細胞を、 測定用緩衝液 1 m 1で 2回洗浄した後、 490 1の測定用緩衝液を各穴に加 える。
② 10— 3〜10—1QMの試験化合物溶液を 5 1加えた後、 標識リガンドを 5 1加え、 室温にて 1時間反応させる。 非特異的結合量を知るためには試験化 合物の代わりに 10— 3Mのリガンドを 5 1加えておく。
③反応液を除去し、 lm 1の洗浄用緩衝液で 3回洗浄する。 細胞に結合した標 識リガンドを 0.2N NaOH— 1 %SDSで溶解し、 4m 1の液体シンチレ 一ター A (和光純薬製） と混合する。
④液体シンチレ一シヨンカウンタ一 （ベックマン社製） を用いて放射活性を測 定し、 Percent Maximum Binding (PMB) を次の式で求める。
PMB= [ (B-NS B) / (B。一 NSB) ] X 100
PMB： Percent Maximum Binding
B ：検体を加えた時の値
NSB： Non-specific Binding (非特異的結合量)
B 0 ：最大結合量 本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られ る化合物またはその塩は、 リガンドと本発明の蛋白質等との結合性を変化させ る作用を有する化合物であり、 具体的には、 （ィ） G蛋白質共役型レセプ夕一 を介して細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細 胞内 Ca2+遊離、 細胞内 cAMP生成、 細胞内 cGMP生成、 イノシトールリ ン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c一 f o sの活性化、 pHの低下などを促進する活性または抑制する活性など） を有する化合物 （い わゆる、 本発明の蛋白質に対するァゴニスト） 、 （口） 該細胞刺激活性を有し ない化合物 （いわゆる、 本発明の蛋白質に対するアン夕ゴニスト） 、 （八） リ ガンドと本発明の G蛋白質共役型蛋白質との結合力を増強する化合物、 あるい は （二） リガンドと本発明の G蛋白質共役型蛋白質との結合力を減少させる化 合物である。
該化合物としては、 ペプチド、 タンパク、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物などが挙げられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物であってもよい。
本発明の蛋白質等に対するァゴニス卜は、 本発明の蛋白質等に対するリガン ドが有する生理活性と同様の作用を有しているので、 該リガンド活性に応じて 安全で低毒性な医薬 [例えば、 中枢疾患 (例えばアルツハイマー病 ·痴呆 '摂食 障害 （拒食症） ·てんかんなど）、 ホルモン系の疾患 （例えば、 微弱陣痛、 弛緩 出血、 胎盤娩出前後、 子宮復古不全、 帝王切開術、 人工妊娠中絶、 乳汁うっ滞 など）、肝/胆 /塍 /内分泌疾患 (例えば糖尿病 ·摂食障害など）、炎症性疾患（ァレ ルギー '喘息 ·リュウマチなど）、循環器疾患 (例えば高血圧症 '心肥大 '狭心症 · 動脈硬化等）の予防および または治療剤など]として有用である。
本発明の蛋白質等に対するアン夕ゴニストは、 本発明の蛋白質等に対するリ ガンドが有する生理活性を抑制することができるので、 該リガンド活性を抑制 する安全で低毒性な医薬 [例えば、ホルモン分泌調節薬、本発明の蛋白質等に対 するリガンドの過剰な産生によつて惹起される中枢疾患、 ホルモン系の疾患、 肝ノ胆 Z塍 Z内分泌疾患 （例えば抗肥満薬，摂食過剰など） 、 炎症性疾患、 循 環器疾患の予防および Zまたは治療薬など]として有用である。
リガンドと本発明の蛋白質との結合力を減少させる化合物は、 本発明の蛋白 質等に対するリガンドが有する生理活性を減少させるための安全で低毒性な医 薬 [例えば、ホルモン分泌調節薬、本発明の蛋白質等に対するリガンドの過剰な 産生によって惹起される中枢疾患、 ホルモン系の疾患、 肝/胆 Z滕 内分泌疾 患 （例えば抗肥満薬 ·摂食過剰など） 、 炎症性疾患、 循環器疾患の予防および または治療薬など]として有用である。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られ る化合物またはその塩を上述の医薬組成物として使用する場合、 常套手段に従 つて実施することができる。 例えば、 前記した本発明の蛋白質を含有する医薬 と同様にして、 錠剤、 カプセル剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤、 無菌 性溶液、 懸濁液剤などとすることができる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトゃ哺 乳動物 （例えば、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルな ど） に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法な どにより差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に成人 （60 kgとして） に おいては、 一日につき約 0. 1〜： L 00mg、 好ましくは約 1. 0〜50mg、 より好ましくは約 1. 0〜2 Omgである。 非経口的に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによっても異なるが、 例えば、 注射剤の形では通常成人 （6 O kgとして） においては、 一日につき 約 0. 01〜3 Omg程度、 好ましくは約 0. 1〜2 Omg程度、 より好まし くは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射により投与するのが好都合である。 他 の動物の場合も、 6 O kg当たりに換算した量を投与することができる。
(6) 本発明の蛋白質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩の定量
本発明の抗体は、 本発明の蛋白質等を特異的に認識することができるので、 被検液中の本発明の蛋白質等の定量、 特にサンドィツチ免疫測定法による定量 などに使用することができる。 すなわち、 本発明は、 例えば、 （ i) 本発明の 抗体と、 被検波および標識化蛋白質等とを競合的に反応させ、 該抗体に結合し た標識化蛋白質等の割合を測定することを特徴とする被検液中の本発明の蛋白 質等の定量法、
(Π) 被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明の 抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、 不溶化担体上の標識剤の活性 を測定することを特徴とする被検波中の本発明の蛋白質等の定量法を提供する。 上記 （ii) においては、 一方の抗体が本発明の蛋白質等の N端部を認識する 抗体で、 他方の抗体が本発明の蛋白質等の C端部に反応する抗体であることが 好ましい。 本発明の蛋白質等に対するモノクローナル抗体 （以下、 本発明のモノクロ一 ナル抗体と称する場合がある） を用いて本発明の蛋白質等の測定を行なえるほ 力、、 組織染色等による検出を行なうこともできる。 これらの目的には、 抗体分 子そのものを用いてもよく、 また、 抗体分子の F ( a b ' ) 2 、 F a b '、 あるい は F a b画分を用いてもよい。 本発明の蛋白質等に対する抗体を用いる測定法 は、 特に制限されるべきものではなく、 被測定液中の抗原量 （例えば、 蛋白質 量） に対応した抗体、 抗原もしくは抗体一抗原複合体の量を化学的または物理 的手段により検出し、 これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準 曲線より算出する測定法であれば、 いずれの測定法を用いてもよい。 例えば、 ネフロメトリー、 競合法、 ィムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に 用いられるが、 感度、 特異性の点で、 後述するサンドイッチ法を用いるのが特 に好ましい。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、 例えば、 放射性同位 元素、 酵素、 蛍光物質、 発光物質などが用いられる。 放射性同位元素としては、 例えば、 〔1 2 5 I〕 、 〔1 3 1 I〕 、 〔3 H〕 、 〔1 4 C〕 などが用いられる。 上記 酵素としては、 安定で比活性の大きなものが好ましく、 例えば、 i3—ガラクト シダ一ゼ、 j3—ダルコシダーゼ、 アルカリフォスファタ一ゼ、 パーォキシダー ゼ、 リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。 蛍光物質としては、 例えば、 フル ォレスカミン、 フルォレツセンイソチオシァネートなどが用いられる。 発光物 質としては、 例えば、 ルミノール、 ルミノール誘導体、 ルシフェリン、 ルシゲ ニンなどが用いられる。 さらに、 抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビォチ ンーアビジン系を用いることもできる。
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、 物理吸着を用いてもよく、 また通常、 蛋白質あるいは酵素等を不溶化、 固定化するのに用いられる化学結合を用いる 方法でもよい。 担体としては、 例えば、 ァガロース、 デキストラン、 セルロー スなどの不溶性多糖類、 ポリスチレン、 ポリアクリルアミド、 シリコン等の合 成樹脂、 あるいはガラス等が用いられる。
サンドイッチ法においては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検液 を反応させ （1次反応） 、 さらに標識化した本発明のモノクローナル抗体を反 応させ （2次反応） たのち、 不溶化担体上の標識剤の活性を測定することによ り被検波中の本発明の蛋白質量を定量することができる。 1次反応と 2次反応 は逆の順序に行なっても、 また、 同時に行なってもよいし時間をずらして行な つてもよい。 標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができ る。
また、 サンドイッチ法による免疫測定法において、 固相用抗体あるいは標識 用抗体に用いられる抗体は必ずしも 1種類である必要はなく、 測定感度を向上 させる等の目的で 2種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
本発明のサンドイッチ法による本発明の蛋白質等の測定法においては、 1次 反応と 2次反応に用いられる本発明のモノク口一ナル抗体は本発明の蛋白質等 の結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。 即ち、 1次反応および 2次反応に用いられる抗体は、 例えば、 2次反応で用いられる抗体が、 本発明 の蛋白質の C端部を認識する場合、 1次反応で用いられる抗体は、 好ましくは C端部以外、 例えば N端部を認識する抗体が用いられる。
本発明のモノクローナル抗体をサンドィツチ法以外の測定システム、 例えば、 競合法、 ィムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることができ る。 競合法では、 被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応さ せたのち、 未反応の標識抗原と（F ) と抗体と結合した標識抗原（B ) とを分離 し （B Z F分離） 、 B， Fいずれかの標識量を測定し、 被検液中の抗原量を定 量する。 本反応法には、 抗体として可溶性抗体を用い、 B Z F分離をポリェチ レンダリコール、 前記抗体に対する第 2抗体などを用いる液相法、 および、 第 1抗体として固相化抗体を用いるか、 あるいは、 第 1抗体は可溶性のものを用 い第 2抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
ィムノメトリック法では、 被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化 抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、 あるいは、 被検波中 の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、 次に固相化抗原を加え未反応の標 識化抗体を固相に結合させたのち、 固相と液相を分離する。 次に、 いずれかの 相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、 ネフロメトリーでは、 ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果、 生じた不溶性の沈降物の量を測定する。 被検液中の抗原量が僅かであり、 少量 の沈降物しか得られない場合にもレーザ一の散乱を利用するレーザ一ネフロメ トリーなどが好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の測定方法に適用するにあたっては、 特別の条件、 操作等の設定は必要とされない。 それぞれの方法における通常の 条件、 操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明の蛋白質またはその 塩の測定系を構築すればよい。 これらの一般的な技術手段の詳細については、 総説、 成書などを参照することができる 〔例えば、 入江 寛編 「ラジオィムノ アツセィ〕 （講談社、 昭和 49年発行） 、 入江 寛編 「続ラジオィムノアッセ ィ〕 （講談社、 昭和 54年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免疫測定法」 （医学書 院、 昭和 53年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免疫測定法」 （第 2版） （医学書 院、 昭和 57年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免疫測定法」 （第 3版） （医学書 院、 昭和 6 2年発行） 、 「メソッズ 'イン ·ェンジモノジー （Methods in ENZYM0L0GY) J Vol. 70 (I匪 unochemical Techniques (Par t A))、 同書 Vol. 73 (Immunochemical Techniques (Part B))、 同書 Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part C))、 同書 Vol. 84 (Immunochemical Techniques (Part D:Selected Immunoassays)) > 同書 Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part E:Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods))、 同書 Vol. 121 (Immunochemical Techniques (Part I： Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies)) (以上、 アカデミックプレス社発行）など参照〕 。
以上のように、 本発明の抗体を用いることによって、 本発明の蛋白質または その塩を感度良く定量することができる。 さらに、 本発明の抗体を用いて本発 明の蛋白質またはその塩を定量することによって、 各種疾病の診断をすること ができる。
また、 本発明の抗体は、 体液や組織などの被検体中に存在する本発明の蛋白 質等を検出するために使用することができる。 また、 本発明の蛋白質等を精製 するために使用する抗体カラムの作製、 精製時の各分画中の本発明の蛋白質等 の検出、 被検細胞内における本発明の蛋白質の挙動の分析などのために使用す ることができる。
( 7 ) 本発明の G蛋白質共役型蛋白質をコードする D N Aを有する非ヒト動物 の作製
本発明の D N Aを用いて、 本発明の蛋白質等を発現するトランスジエニック 非ヒト動物を作製することができる。 非ヒト動物としては、 哺乳動物 （例えば、 ラット、 マウス、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） など (以下、 動物と略記する） が挙げれるが、 特に、 マウス、 ゥサギなどが好適で ある。
本発明の D N Aを対象動物に転移させるにあたっては、 該 D N Aを動物細胞 で発現させうるプロモーターの下流に結合した遺伝子コンストラクトとして用 いるのが一般に有利である。 例えば、 ゥサギ由来の本発明の D N Aを転移させ る場合、 これと相同性が高い動物由来の本発明の D N Aを動物細胞で発現させ うる各種プロモー夕一の下流に結合した遺伝子コンストラクトを、 例えば、 ゥ サギ受精卵へマイクロインジェクションすることによって本発明の蛋白質等を 高産生する D N A転移動物を作出できる。 このプロモーターとしては、 例えば、 ウィルス由来プロモーター、 メタ口チォネイン等のュビキアスな発現プロモー 夕一も使用しうるが、 好ましくは脳で特異的に発現する N G F遺伝子プロモー 夕ーゃェノラーゼ遺伝子プロモーターなどが用いられる。
受精卵細胞段階における本発明の D N Aの転移は、 対象動物の胚芽細胞およ び体細胞の全てに存在するように確保される。 D N A転移後の作出動物の胚芽 細胞において本発明の蛋白質等が存在することは、 作出動物の子孫が全てその 胚芽細胞及び体細胞の全てに本発明の蛋白質等を有することを意味する。 遺伝 子を受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発 明の蛋白質等を有する。
本発明の D N A転移動物は、 交配により遺伝子を安定に保持することを確認 して、 該 D N A保有動物として通常の飼育環境で飼育継代を行うことができる。 さらに、 目的 DNAを保有する雌雄の動物を交配することにより、 導入遺伝子 を相同染色体の両方に持つホモザィゴー卜動物を取得し、 この雌雄の動物を交 配することによりすべての子孫が該 D N Aを有するように繁殖継代することが できる。
本発明の DN Aが転移された動物は、 本発明の蛋白質等が高発現させられて いるので、 本発明の蛋白質等に対するァゴニストまたはアン夕ゴニス卜のスク リーニング用の動物などとして有用である。
本発明の D N A転移動物を、 組織培養のための細胞源として使用することも できる。 例えば、 本発明の DN A転移マウスの組織中の DN Aもしくは RN A を直接分析するか、 あるいは遺伝子により発現された本発明の蛋白質が存在す る組織を分析することにより、 本発明の蛋白質等について分析することができ る。 本発明の蛋白質等を有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、 これらを使用して、 例えば、 脳や末梢組織由来のような一般に培養困難な組織 からの細胞の機能を研究することができる。 また、 その細胞を用いることによ り、 例えば、 各種組織の機能を高めるような医薬の選択も可能である。 また、 高発現細胞株があれば、 そこから、 本発明の蛋白質等を単離精製することも可 能である。
本明細書および図面において、 塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、 I UP AC- I UB Commission on Biochemical Nomenclature による略号あ るいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、 その例を下記する。 ま たアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、 特に明示しなければ L体を示 すものとする。
DNA デォキシリボ核酸
c DNA 相補的デォキシリボ核酸
A アデニン
T チミン
G グァニン
C シ卜シン RNA リボ核酸 mRNA メッセンジャーリポ核酸 d ATP デォキシアデノシン三リン酸 dTTP デォキシチミジン三リン酸 dGTP デォキシグアノシン三リン酸 d CTP デォキシシチジン三リン酸 ATP アデノシン三リン酸
EDTA エチレンジァミン四酢酸 SDS ドデシル硫酸ナトリウム G 1 y グリシン
A 1 a ァラニン
Va 1 ン
Le u
I 1 e
S e r セリン
Th r スレオニン
Cy s システ ノ
Me t メチォニン
G 1 u グルタミン酸
As p
L y s リジン
Ar g アルギニン
H i s ヒスチジン
Ph e フエ二ルァラニン
Ty r チロシン
Tr p トリプトファン
P r o プロリン
A s n ァスパラギン G 1 n グルタミン
p G 1 u ピログルタミン酸
T o s p-卜ルエンスルフォニル
CHO ホルミル
B z 1
Cl2Bzl 2, 6—ジクロ口べンジル
Bom ベンジルォキシメチル
Z ベンジルォキシカルポニル
C 1 -z 2—クロ口べンジルォキシカルボニル
B r - Z
B o c tーブ卜キシカルボニル
DNP ジニトロフエノール
T r t 卜 Uチル
Bum t一ブトキシメチル
Fmo c N— 9—フルォレニルメトキシカルボニル
HOB t 1ーヒドロキシベンズトリアゾール
HOOB t 3, 4—ジヒドロ一 3—ヒドロキシ一 4ーォキソ一
1, 2, 3—ベンゾトリアジン
HONB ：卜ヒドロキシ -5-ノルポルネン- 2， 3-ジカルボキシイミド 本明細書の配列表の配列番号は、 以下の配列を示す。
〔配列番号： 1〕
本発明のヒト脳由来蛋白質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 2〕
配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列を有する本発明のヒト脳由来蛋白質 をコードする DNAの塩基配列を示す （AQ27) 。
〔配列番号： 3〕
後述の実施例 1および実施例 2で用いられたプライマー 1の塩基配列を示す。 〔配列番号： 4〕
後述の実施例 1および実施例 2で用いられたプライマー 2の塩基配列を示す。 〔配列番号： 5〕
後述の実施例 2で用いられたフォヮ一ドプライマ一の塩基配列を示す。
〔配列番号： 6〕
後述の実施例 2で用いられたリバースプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 7〕
後述の実施例 2で用いられたプローブの塩基配列を示す。
後述の実施例 1で得られた形質転換体ェシエリヒア コリ （Escherichia coli)DH5 α/ρ c DNA3. 1一 AQ 27は、平成 1 1年 8月 23日から曰 本国茨城県つくば巿東 1丁目 1一 3の通商産業省工業技術院生命工学工業技術 研究所 （N I BH) に寄託番号 FERM BP- 6854として、 平成 1 1年 8月 4日から日本国大阪府大阪市淀川区十三本町 2丁目 1 7— 8 5の財団法 人 ·発酵研究所 （ I F〇） に寄託番号 I F O 16304として寄託されてい る。
以下に実施例を示して、 本発明をより詳細に説明するが、 これらは本発明の 範囲を限定するものではない。 なお、 大腸菌を用いての遺伝子操作法は、 モレ キユラ一 'クローニング （Molecular cloning) に記載されている方法に従った。 実施例 1 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質 AQ 27をコードする cDNA のクローニングと塩基配列の決定
ヒト胎児脳 cDNA (CLONTECH社） を铸型とし、 2個のプライマー、 プライマ一 1 (5'- TGT CAG CAT GCA GGC GCT TAA CAT TAC CCC GGA GCA G -3' ；配列番号： 3) 及びプライマ一 2 (5'- GAC TAG TTT AAT GCC CAC TGT CTA AAG GAG AAT TCT C -3' ；配列番号： 4) を用いて PCR反応を 行った。 該反応における反応液の組成は上記 cDNAの 10分の 1量を铸型と して使用し、 Advantage2 Polymerase Mix (CLONTECH社） 1Z50量、 プライマー 1及びプライマー 2を各 0.2 M, dNTPs 200 M、 及び酵素に添付 のバッファーを加え、 の液量とした。 PCR反応は、 95°C ' 1分の後、 95°C ' 30秒、 72 °C · 4分のサイクルを 5回、 95 °C · 30秒、 70 ' 4分のサイクルを 5回、 95。0 30秒、 68°C ' 30秒、 66 °C ' 4分のサ イクルを 30回繰り返し、 最後に 68°0 3分の伸長反応を行った。 該 PCR 反応後の反応産物を ΤΑクロ一ニングキット （Invitrogen社） の処方に従いプ ラスミドベクタ一 pcDNA3. 1/V5/His (Invi trogen社） へサブクローニングし、 得られたプラスミドを pcDNA3.卜 AQ27と命名した。これを大腸菌 DH5 αに導入 し、 c DNAをもつクローンをアンピシリンを含む LB寒天培地中で選択した 後、 個々のクローンの配列を解析した結果、 新規 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋 白質をコードする cDNA配列を得た。 この c DNAより導き出されるァミノ 酸配列を有する蛋白質を A Q 2 7と命名し、 この形質転換体を大腸菌 (Escherichia coli) DH5 a/pcDNA3.卜 AQ27と命名した。 実施例 2 TaqMan PCRを用いた AQ27 の発現組織分布の解析
まずプライマ一及びプローブは Primer Express ver.1.0 ( PE バイオシス テムズジャパン ） を用いてデザインし、 フォワードプライマー AQ27taqF ( 5' - CAATG CTAGG TGTGG TCTGG CT - 3' (配列番号： 5) ) 、 リバースプラ イマ一 AQ27taqR ( 5' - GATCT CAAGT TGTTG CACGT GC - 3' (配列番号： 6 ) ) 、 プローブ AQ27-515T ( 5' - TGGCA GTCAT CGTAG GATCA CCCAT G - 3' (配列番 号 ： 7 ) ) を作製した。 プローブのリポーター色素は FA ( 6- carboxyf luorescein ) を付カロした。
スタンダード cDNA は、 pcDNA3.卜 AQ27を铸型にしてプライマー 1 (配列番 号： 3)、プライマ一 2 (配列番号： 4) を用いて増幅した PCR断片を QIAquick PCR Purification Kit [ QIAGEN ( Germany ) ] にて精製し、 10° - 106 コ ピー / 1 に調製して用いた。
各組織の cDNA ソースは Human Tissue cDNA Panel I 及び Panel II [ CLONTECH Laboratories, Inc. ( CA, USA ) ] を用いた。
TaqMan PCRの反応は TaqMan Universal PCR Master Mix ( PE ) の試薬を用い、 ABI PRISM 7700 Sequence Detection System ( PEバイオシステムズジャパン） にて、 添付の説明書に従い反応させた。 結果を図 4および表 1に示した。 AQ27 は心臓、 肝臓、 精巣に高い発現が見 られた。
Figure imgf000067_0001
実施例 3 (}27の\^卜6111^131131^- -？116 amideに対する反応
AQ27発現 CH0細胞および raock細胞をサイトセンサ一用のカプセルにそれぞれ
2.7X105cells/capsuleで播種し、 一晩培養した後、 サイトセンサ一 （モレキュ ラ一デバイス社） にセットした。 Acidification rateが安定した後、 Met - Enkephalin- Arg-Phe amide (Bachem社、 H- 2835)を 10 /Mの濃度で 7分 2秒間作用 させ、 Acidification rateの上昇率を指標に細胞の活性化を測定した。 その結 果、 Met- Enkephalin- Arg-Phe amideは AQ27発現 CH0細胞を特異的に活性化し、 AQ27に対して特異的に反応することが確認された （図 5) 。 産業上の利用可能性 本発明の蛋白質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩、 およびそれらをコー ドする D NAは、 ①リガンド （ァゴ二スト） の決定、 ②抗体および抗血清の入 手、 ③組み替え型蛋白質の発現系の構築、 ④同発現系を用いたレセプ夕一結合 アツセィ系の開発と医薬品候補化合物のスクリーニング、 ⑤構造的に類似した リガンド · レセプターとの比較にもとづいたドラッグデザインの実施、 ⑥遺伝 子診断におけるプローブや P C Rプライマーの作成のための試薬、 ⑦トランス ジエニック動物の作製または⑧遺伝子予防 ·治療剤等の医薬等として用いるこ とができる。

Claims

請求の範囲
1 . 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有することを特徴とする蛋白質またはその塩。
2 . 請求項 1記載の蛋白質の部分ペプチドまたはその塩。
3 . 請求項 1記載の蛋白質をコードする D NAを含有する D NA。
4 . 配列番号： 2で表される塩基配列を有する請求項 3記載の D NA。
5 . 請求項 3記載の D NAを含有する組換えべクタ一。
6 . 請求項 5記載の組換えべクタ一で形質転換された形質転換体。
7 . 請求項 6記載の形質転換体を培養し、 請求項 1記載の蛋白質を生成 ·蓄積 せしめることを特徴とする請求項 1記載の蛋白質またはその塩の製造法。
8 . 請求項 1記載の蛋白質もしくは請求項 2記載の部分べプチドまたはその塩 に対する抗体。
9 . 請求項 1記載の蛋白質もしくは請求項 2記載の部分べプチドまたはその塩 を用いることを特徴とする請求項 1記載の蛋白質またはその塩に対するリガン ドの決定方法。
1 0 . 請求項 1記載の蛋白質もしくは請求項 2記載の部分ペプチドまたはその 塩を用いることを特徴とするリガンドと請求項 1記載の蛋白質またはその塩と の結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法。
1 1 . 請求項 1記載の蛋白質もしくは請求項 2記載の部分ペプチドまたはその 塩を含有することを特徴とするリガンドと請求項 1記載の蛋白質またはその塩 との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
1 2 . 請求項 1 0記載のスクリーニング方法または請求項 1 1記載のスクリ一 ニング用キットを用いて得られうる、 リガンドと請求項 1記載の蛋白質または その塩との結合性を変化させる化合物またはその塩。
1 3 . 請求項 1 0記載のスクリーニング方法または請求項 1 1記載のスクリ一 ニング用キットを用いて得られうる、 リガンドと請求項 1記載の蛋白質または その塩との結合性を変化させる化合物またはその塩を含有してなる医薬。
1 . 請求項 3記載の DNAとハイストリンジェントな条件下でハイブリダィ ズする DNA。
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