WO2001015721A1

WO2001015721A1 - Nouvelles utilisations de semaphorine et de facteur de croissance de cellules endotheliales vasculaires

Info

Publication number: WO2001015721A1
Application number: PCT/JP2000/005817
Authority: WO
Inventors: Toru Kimura; Kaoru Kikuchi; Mutsuo Taiji
Original assignee: Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited
Priority date: 1999-08-30
Filing date: 2000-08-29
Publication date: 2001-03-08
Also published as: AU6733400A

Description

明細書セマフォリン及び V E G Fの新規な用途

技術分野

本発明は、セマフォリン及び V E G Fの新規な用途に関する。さらに詳しくは、本発明は、クラス 3型セマフォリンを有効成分とする血管内皮細胞増殖抑制剤、 V E G F 1 6 5を有効成分とする神経突起伸長促進剤、またはクラス 3型セマフォリンの阻害物質を有効成分とする血管内皮細胞増殖促進剤などに関する。

背景技術

セマフォリンは発生期の神経回路網形成に重要な役割を果たしていると考えられる遺伝子ファミリーである。現在構造上数種に分類されることが知られており、合計で 20以上のセマフォリンフアミリーに含まれる遺伝子が同定されている。これらの多くのセマフォリン遺伝子の中で最も良く研究されているのがセマフォリン 3 A (Sema3A； Cell, 1, 551 (1999)によりこの名称に統一されたが、それ以前はマウスでは M-SeraD、ヒトでは H- Semalllと呼ばれていたもの）である。 Sema3Aは神経突起伸長阻害活性を示し、また数 ng/mlの濃度で強い神経突起の成長円錐退縮を起こすことが知られており、神経回路網の形成時には反発性の抑制因子として機能していると考えられている（Neuron, ϋ， 941 (1995) ) 。 Sema3Aは他のいくつかのセマフォリンと共にクラス 3型のサブグループに分類される分泌型セマフォリンである（Neuron, ϋ, 941 (1995) ) 。

1998年になり、アルカリフォスファターゼとの融合蛋白にした Sema3Aをリガンドとした発現クロ一ユングで、この Sema3Aの受容体がニューロピリンであることが明らかにされた (Cell, 90, 739 (1997) , Cell, 90, 753 (1997) ) 。また、ほぼ時期を同じくしてニューロピリンのノックァゥトマウスの解析結果も発表され、このニューロピリンのノックァゥトマウスの表現型は Sema3Aのノックァゥトマウスの表現型と非常に似ていること、また当該ノックァゥトマウスの胎仔において神経ガイダンス異常の認められることなどが明らかとなり、両者が密接に関連していること力 nn vivoで確認された（Neuron, , 995 (1997) )。また in vitroでは、抗ニユーロピリン抗体によ.つて Sema3Aの活性が阻害されること、さらに、ニューロピリンノックァゥトマウス由来の神経細胞では Seraa3Aによる成長円錐の退縮が全く起こらなかったことなどが報告された（Neuron, 19, 995 ( 1997) )。これらの報告に基づけば、 Sema3Aは受容体であるニューロピリンに結合することによって成長円錐の退縮を起こしていることは明らかである。さらに in vitroの結合実験から、ニューロピリンは、例えばセマフォリン 3 E (Sema3E、従来の M- SemaH) 等の他のクラス 3型セマフォリンとも結合することが示されており（Neuron, ， 539 (1997)、 Neuron, 19, 547 (1997) ) 、 Sema3Aのみならず他のクラス 3型セマフォリンの受容体もニューロピリンであると考えられている。

一方、前記と時期を同じくして、血管新生因子である VEGF (vascular endo- thelial growth factor) のうち生物学的に最も活性が強い VEGF165の特異的な受容体複合体にこのニューロピリンが含まれており、 VEGF165とニューロピリンとの結合が KDR/Flk - 1を介した VEGF165の活性発現に必須であることが示された (Cell, 92, 735 (1998) )。

VEGFは、培養血管内皮細胞に対する増殖作用、および血管透過性亢進作用の 2 つの性質を持つ物質として 1980年代に単離されたタンパク質であり、ヒトにおいては転写に際しての選択的スプライシングにより、 4種類のサブタイプ（ VEGF 121、 VEGF165、 VEGF189, VEGF206)の存在が報告されている（Science, 219, 983 (1983)、 J. Clin. Invest.， 84, 1470 (1989)、 Biochem. Biophys. Res. Commun.， 161, 851 (1989) )。 VEGFは、培養系における血管内皮細胞の増殖、遊走を促進し、 in vivoにおいては、血管新生、血管透過性の亢進を誘導することが知られている。更に、管腔形成の促進、組織因子やプラスミノーゲンァクチベータ一など凝固線溶系タンパク質の産生、細胞接着分子の血管内皮細胞上への発現などを誘導することも知られている。 VEGFのレセプターとしては Flt-1及ひ T DR/Flk-1が知られており（Oncogene, 6， 1677 (1991)、 Science, 255, 989 (1992)、 Cell, 72, 835 (1993) )、前記したように 1998年になって、ニューロピリンが VEGF165の塩基性ドメインに会合する細胞膜タンパク質であること、また、このニューロピリンの存在により KDR/Flk-1に対する VEGFの結合が約 10倍上昇し、生物活性も同程度上昇することが明らかとなった (Cell, 92, 735 (1998) ) ₀

以上のように、 Sema3Aおよび VEGF165は全く異なる作用を有する因子でありな 7 P

3 がら、 Sema3Aの活性発現、および KDR/Flk-1を介した VEGF165の活性発現のいずれにおいてもニューロピリンへの結合が必須であることが明らかとなってきた。また最近になって、 Sema3Aと VEGF165との関係において、 Sema3Aの有する成長円錐退縮活性は VEGF165により抑制され、 VEGF165の有する血管内皮細胞遊走活性は Sema3Aにより抑制されることが明らかにされている

(J. Cell. Biol. , 146 (1) , 233 (1999) ) 。

発明の開示

本発明は、クラス 3型セマフォリンおよひ *VEGF165の作用に関して従来知られていなかった新たな知見を得たことに基づき、当該セマフォリン、 VEGF165、または前記セマフォリンに対する阻害剤の新規な用途を提供することを目的とする。すなわち本発明は、クラス 3型セマフォリンを有効成分とする血管内皮細胞増殖抑制剤、 V E G F 1 6 5を有効成分とする神経突起伸長促進剤、またはクラス 3 型セマフォリンの阻害物質を有効成分とする血管内皮細胞増殖促進剤などを提供することを目的とする。

本発明者らは、クラス 3型セマフォリンに属する Sema3Aと VEGF165の作用とを詳細に検討した結果、 Sema3Aは血管内皮細胞の増殖を抑制する効果を有すること、および、 VEGF165は神経突起の伸長を促進する効果を有することを明らかにした。そしてこのような知見を得たことにより、クラス 3型セマフォリンは血管内皮細胞増殖抑制剤として、また VEGF165は神経突起伸長促進剤として使用できることが明らかとなった。

さらに本発明者らは、 Sema3Aの有する成長円錐退縮活性を阻害する阻害剤を血管内皮細胞に作用させたところ、当該阻害剤は血管内皮細胞増殖活性を有することを明らカこした。このような、セマフォリン阻害活性と血管内皮細胞増殖活性との関連については従来全く示唆されておらず、本発明により初めて明らかにされたことである。前記のようなセマフォリン阻害活性と血管内皮細胞増殖活性とを併せ持つという、新たな作用機序を有する薬剤は、傷害部位において血管新生の促進作用と神経の再生促進作用の両方の作用を発揮するため、従来の血管新生剤と比較してより傷害の修復が促進されるものと考えられる。

本発明は、以上のような知見に基づき完成するに至ったものである。すなわち本発明は、

(1) クラス 3型セマフォリン又はその改変体、あるいはこれらをコードする遺伝子を有効成分として含有する、血管内皮細胞増殖抑制剤、

(2) VEGF 1 65又はその改変体、あるいはこれらをコードする遺伝子を有効成分として含有する、神経突起伸長促進剤、

(3) 血管内皮細胞増殖促進剤を同定する方法であって、

(a) 被験物質とクラス 3型セマフォリンとを接触させ、当該被験物質が当該セマフォリンの有する成長円錐退縮活性を阻害するカゝ否かを測定する工程、及び

(b) 当該被験物質を血管内皮細胞に接触させ、当該被験物質が血管内皮細胞の増殖を促進するか否かを測定する工程、

を含む方法、

(4) 前記（3) 記載の方法により選択される、神経突起伸長促進作用を有する血管内皮細胞増殖促進剤、

(5) クラス 3型セマフォリンの有する成長円錐退縮活性を阻害する物質を有効成分とする、血管内皮細胞増殖促進剤、ならびに

(6) クラス 3型セマフォリンの有する成長円錐 5¾|活性を阻害するが、クラス 3型セマフォリンとニューロピリンとの結合は阻害しない物質を有効成分とする、前記 (5) 記載の血管内皮細胞増殖促進剤、に関する。

本発明において血管内皮細胞増殖抑制剤とは、クラス 3型セマフォリン又はその改変体、あるいはこれらの物質をコードする遺伝子を有効成分として含有するものである。ここで「クラス 3型セマフォリン」とは、セマフォリンドメインおよび Igドメインを有することを特徴とし、セマフォリンドメインの分子進化樹を作成した際にお互いに近縁なことが示されるセマフォリンを指すものである。具体的には Cell, ^，551(1999)に記載されており、例えば Sema3A

(Cell, 75, 217(1993), Cell, 75, 1389(1993)) 、 Sema3E (国際公開第 98/22504号パンフレット、 Genbank Ac No. AB002329) などが挙げられる。これらクラス 3 型セマフォリンをコードする遺伝子の配列情報は全て、インターネットのァドレス http: //www. semaphorin— nomenclature, comにおレヽて公開されているにめ、当該インターネット情報または前記文献等に記載の配列情報に基づき、適当な DN A部分をハイプリダイゼーシヨンのプローブまたは P C Rのプライマ一とし、例えば脳由来の cDNAライブラリ一等を用いてクローニングすることができる。これらのクローニングは、例えは olecular Cloning 2nd Edt. , Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)などの基本書に従い、当業者ならば容易に行うことがでさる。

以上のようにして得られたクラス 3型セマフォリンをコードする遺伝子を発現させてタンパクを産生することも現在では容易に行うことができ、例えば前述の Molecular Cloning等の多くの成書や文献に基づいて実施することができる。すなわち、クローユングされた各クラス 3型セマフォリンをコードする遺伝子を公知の発現ベクター（例えば pcDNAl. 1、インビトロジェン社など）に連結した後、適当な宿主に導入して発現 ·生産させることにより、当該セマフォリンを得ることができる。宿主としては、原核性生物細胞または真核性生物細胞のいずれでも良く、例えば大腸菌株や動物細胞株（COS細胞、 CH0細胞等）は広く普及しており入手は容易である。クラス 3型セマフォリンは分泌型のセマフォリンであるため、形質転換細胞の培養上清中に当該セマフォリンは存在している。従って、通常のカラムクロマトグラフィー又は抗体を用いたァフィ二ティー精製等の方法により、当該セマフォリンを容易に精製することができる。

本発明においてクラス 3型セマフォリンの「改変体」とは、例えば、 1)クラス 3型セマフォリンをコードする遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイス 'する DNAによりコードされるタンパク質、 2)クラス 3型セマフォリンのアミノ酸配列に対して 1若しくは複数（好ましくは数個）のアミノ酸が置換、欠失及び Z又は付カ卩されたアミノ酸配列からなるタンパク質、などのうち、血管内皮細胞増殖抑制活性を有するものを指す。このようなクラス 3型セマフォリンの改変体をコードする遺伝子は、例えば部位特異的突然変異誘発法、 PCR法、または通常のハイブリダィゼーシヨン法などにより容易に得ることができる。具体的には、例えば国際公開第 98/22504号パンフレットなどを参考にして行うことができる。以上のようにして作製されたクラス 3型セマフォリンおよびその改変体、あるいはこれらをコ一ドする遺伝子が血管内皮細胞増殖抑制活性を有することを確認する方法としては、例えばヒト臍帯静脈血管内皮細胞である HUVEC (大日本製薬）ゃゥシ大動脈内皮細胞である BAE細胞（セルシステムズ）などの血管内皮細胞に対して前記セマフォリン等を添加 ·作用させ、例え miTT溶液（ケミコン社）添加後に細胞内に蓄積した Forraazan (生細胞中で生成された MTT変換体）の量を測定することなどによって、容易に測定することができる。詳しくは実施例を参照されたい。

本発明の血管内皮細胞増殖抑制剤は、上記したようなクラス 3型セマフォリン又はその改変体、あるいはこれらの物質をコードする遺伝子を有効成分として含有するものであり、血管内皮細胞の増殖を抑制することにより血管新生を抑制する効果を有する。従って本発明の血管内皮細胞増殖抑制剤は、血管新生が病態の形成、進展に関与することが知られている各種疾患に適用することができる。具体的には、悪性腫瘍（腎癌、前立腺癌、卵巣癌、力ポジ肉腫など）、眼内血管新生性疾患（糖尿病性網膜症、血管新生性緑内障、未熟児網膜症など）、慢性関節リウマチ、血管腫、 B a s e d o w病（甲状腺機能亢進症）、動脈硬化、乾癬、良性腫瘍、その他血管新生を伴う炎症性疾患などに適用することができる。本発明の血管内皮細胞増殖抑制剤のうち、クラス 3型セマフォリン又はその改変体タンパクを有効成分とする場合には、以下のような投与方法、投与形態および投与量が使用され得る。

すなわち、本発明の血管内皮細胞増殖抑制剤の患者への投与方法としては、静脈注射による投与が好ましいが、経口投与、坐薬としての投与、皮下注射、筋肉 t, 局所注入、腹腔内投与、さらには点眼や塗布などが行える。本発明の血管内皮細胞増殖抑制剤は、上記の投与方法に依存して、種々の単位投与形態で投与することができる。例えば静脈投与のためには、本発明のタンパク質を、医薬として許容され得る担体、好ましくは水性担体の中に溶解または懸濁させて用いることができる。水性担体としては、例えば、水、緩衝化水、生理的食塩水などを使用することができる。このようにして作製された水溶液は、そのまま包装する、あるいは凍結乾燥することができ、凍結乾燥した調製物は投与前に無菌の水溶液に溶解させて使用することができる。

以上の調製物は、医薬として許容される補助剤、例えば、 ph調節剤あるいは緩衝剤、張度調節剤、浸潤剤などを、より具体的には、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩ィ匕カリウム、塩化カルシウム、ソノレビタンモノラウレートなどを含有することができる。

経口投与のためには、本発明のタンパク質を、粉末、錠剤、ピル、カプセル剤及びシロップ剤の単位投与形態にして用いることができる。また皮下注射、筋肉注射、局所注入、腹腔内投与のためには、本発明のタンパク質を水性または油担体の中に溶解または懸濁させて用いることができる。あるいは、コラーゲン等の生体親和性の材料を用いて、徐放性製剤として投与することもできる。

以上のような本発明の血管内皮細胞増殖抑制剤の投与量は、一日量 0. 0001 〜 100mg、好ましくは 0. 001〜10mg程度を症状が改善されるまで投与することが可能である。

本発明の血管内皮細胞増殖抑制剤のうち、クラス 3型セマフォリン又はその改変体をコードする遺伝子を有効成分とし、遺伝子治療剤として使用する際には、以下のような遺伝子導入方法、導入形態および導入量が使用され得る。

前記遺伝子を有効成分とする遺伝子治療剤を患者に投与する場合、その投与形態としては非ウィルスベクターを用いた場合と、ウィルスベクターを用いた場合の二つに大別される（実験医学別冊、遺伝子治療の基礎技術、羊土社、 1996) 。以下、具体的に説明する。

A. 非ウィルスベクターを用いる場合

遺伝子発現ベクターに本発明の D N Aを組み込み、リン酸一カルシウム共沈法、リボソームを用いて D N A分子を導入する方法（リボソーム法、リポフエクチン法、リポフエクトァミン法、 HV J—リボソーム法）、エレクト口ポレーシヨン法、マイクロインジェクション法、パーティクルガンで坦体とともに D NA分子を細胞に移入する方法、 n a k e d—D N Aの直接導入法等の何れかの方法により組換え発現ベクターを細胞内に取り込ませることが可能である。ここで用いられる発現ベクターとしては、例えば p C A G G S (Gene 108, 193-200 (1991) ) 、 p B K— CMV、 p c D N A 3 . 1、 p Z e o S V (インビトロゲン社、ストラタジーン社)等の市販のベクターが挙げられる。

B . ウィルスベクターを用いる場合

ウィルスベクターとしては、組換えアデノウイルス、レトロウイルス等のウイルスベクターを用いた方法が代表的なものである。より具体的には、例えば、無毒化したレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウィルス、ヘルぺスウイルス、ワクシニアウィルス、ボックスウィルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、センダイウィルス、 SV40、免疫不全症ウィルス（H I V) 等の DNA ウィルスまたは RNAウィルスに本発明の DNAを導入し、細胞に組換えウィルスを感染させることによって、細胞内に遺伝子を導入することが可能である。前記ウィルスベクターの内、アデノウィルスの感染効率が他のウィルスベクタ一を用いた場合よりもはるかに高いことが知られており、従って、アデノウィルスベタター系を用いることが好ましい。

これらの方法の何れかを用いることによって、前記遺伝子を患者に投与することができる。患者への投与方法は、治療目的の疾患、症状などに応じた適当な投与経路により投与される。例えば、動脈、静脈、皮下、筋肉内等に投与することなどが可能である。なお非ウィルスベクターによる遺伝子治療では、局所投与や組織移行性を高めた剤形との組み合わせ等によつて疾患部位の近傍に遺伝子を導くことが好ましいが、ウィルスベクターによる遺伝子治療では、必ずしも局所投与をする必要はなく、静脈内投与等も可能である。投与形態としては、製剤形態

(例えば液剤など）をとり得るが、必要に応じて慣用の担体等を加えても良い。また、疾患部位の周囲に遺伝子を存在し易くするために、徐放性の製剤（ミニべレット製剤等）を調製し患部近くに埋め込むことも可能であり、あるいはォスモチックポンプなどを用いて患部に連続的に徐々に投与することも可能である。本発明の遺伝子治療剤を実際に医薬として作用させるには、 DNAを直接体内に導入する i n V i V o法、及びヒトからある種の細胞を取り出して体外で D NAを該細胞に導入し、その細胞を体内に戻す e X V i v o法がある（日経サィエンス、 1994年 4月号、 20— 45頁、月刊薬事、 36 (1) ， 23— 4 8 ( 1994) 、実験医学増刊、 12 (15) 、（1994) ) 。本発明では、 i n V i v o法が好ましい。

製剤中の DNAの含量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調節することができるが、通常、本発明の DN Aとして 0001— 100mg、好ましくは 0. 001— 10mgであり、これを数日ないし数ケ月に 1回投与するのが好ましい。

本発明において神経突起伸長促進剤とは、 VEGF165又はその改変体、あるいはこれらの物質をコードする遺伝子を有効成分として含有するものである。ここで「VEGF165」とは、 Science, ^， 1306 ( 1989)に記載の配列を有するものであり、当該配列情報に基づき当業者ならば VEGF165の遺伝子を容易にクローニングし、またタンパク質を発現することができる。また、 VEGF165は市販されており（例えばゲンザィム社）、これらの市販品を利用することもできる。

以上のような VEGF165およびその遺伝子は、前記クラス 3型セマフォリンと同様の手法により調製することができる。さらに、 VEGFの改変体およびその遺伝子についても、前記クラス 3型セマフォリンの改変体と同様の手法により調製することができる。

以上のようにして作製された VEGF165およびその改変体、あるいはこれらをコードする遺伝子は神経突起伸長促進活性を有するものであるが、ここで「神経突起伸長促進活性」とは、クラス 3型セマフォリンの有する成長円錐退縮活性、神経突起伸長阻害活性を阻害する活性を指す。 VEGF165およびその改変体、あるいはこれらをコードする遺伝子が神経突起伸長促進活性を有することを確認する方法としては、例えば、国際公開第 98/22504号パンフレットに記載の神経突起伸長促進活性、成長円錐退縮阻害活性の測定法や、後述の実施例に記載の方法などが挙げられる。

本発明の神経突起伸長促進剤は、上記したような VEGF165又はその改変体、あるいはこれらの物質をコードする遺伝子を有効成分として含有するものであり、神経突起の伸長を促進することにより、例えば骨折等による脊髄損傷の治療薬として使用することができる。

本発明の神経突起伸長促進剤の具体的な投与方法、投与形態および投与量については、前記血管内皮細胞増殖抑制剤と同様の投与方法、投与形態および投与量が使用され得る。

本発明における血管内皮細胞増殖促進剤とは、クラス 3型セマフォリンの有する成長円錐退縮活性を阻害する物質を有効成分として含有するものである。ここで、クラス 3型セマフォリンの有する成長円錐退縮活性を阻害する物質とは、クラス 3型セマフォリンの有する成長円錐退縮活性を阻害するものであれば、その構造 ·形状等は問わず、タンパク性の因子、低分子化合物等の種々の物質が含まれる。具体例としては、実施例に記載の化合物 M162が挙げられる。ここで M162 とは脂肪族化合物であり、また紫外吸収スぺクトルが弱い化合物である。

被験物質がセマフォリンの有する成長円錐退縮活性を阻害する力否かを測定する手法としては、例えば国際公開第 98/22504号パンフレツ卜に記載の成長円錐退縮活性の阻害活性測定法や、後述の実施例に記載の方法などが挙げられる。

また、前記測定法により選択された陽性物質が血管内皮細胞増殖促進活性を有することは、前記血管内皮細胞増殖抑制剤の測定法と同様の手法により測定することができる。詳しくは後述の実施例を参照されたい。以上の測定系に被験物質を供することにより、本発明の血管内皮細胞増殖促進剤を容易に選択することができる。

本発明においては、前記の如き血管内皮細胞増殖促進剤を同定する方法をも提供するものである。すなわち本発明は、血管内皮細胞増殖促進剤を同定する方法であって、

( a ) 被験物質とクラス 3型セマフォリンとを接触させ、当該被験物質が当該セマフォリンの有する成長円錐退縮活性を阻害するか否かを測定する工程、及び

( b ) 当該被験物質を血管内皮細胞に接触させ、当該被験物質が血管内皮細胞の増殖を促進する力、否かを測定する工程、

を含む方法をも提供するものである。

本発明の同定方法により、セマフォリンの有する成長円錐退縮活性を阻害し、かつ、血管内皮細胞増殖促進活性を有する物質を選択することができる。このような、セマフォリン阻害活性と血管内皮細胞増殖活性とを併せ持つという、従来にない新たな作用機序を有する薬剤は、傷害部位において血管新生の促進作用と神経の再生促進作用の両方の作用を発揮するため、従来の血管新生剤と比較してより傷害の修復が促進されるものと考えられる。

本発明の血管內皮細胞増殖促進剤は、上記したようにクラス 3型セマフォリンの有する成長円錐退縮活性を阻害する物質を有効成分として含有するものであり、血管内皮細胞の増殖を促進することにより血管新生を促進するものである。従つて本発明の血管内皮細胞増殖促進剤は、例えば虚血性疾患または動脈疾患といつた循環器系の疾患に適用することができる。すなわち心疾患としては、虚血性心疾患、心筋梗塞、急性心筋梗塞、心筋症、狭心症、不安定狭心症、冠動脈硬化、心不全などが挙げられ、四肢虚血性疾患としては、閉塞性動脈硬化症、バージャ —病、血管損傷、動脈塞栓症、動脈血栓症、臓器動脈閉塞、動脈瘤などが挙げられる。さらに本発明の血管内皮細胞増殖促進剤は、 PTCA後の再狭窄や血管移植後の吻合部狭窄の予防にも適用することができ、さらに創傷治癒の促進のためにも使用され得る。

本発明の血管内皮細胞増殖促進剤の具体的な投与方法、投与形態および投与量については、前記血管内皮細胞増殖抑制剤と同様の投与方法、投与形態および投与量が使用され得る。

以上のような本発明の血管内皮細胞増殖促進剤の好ましい形態は、クラス 3型セマフォリンの有する成長円錐退縮活性を阻害するという特徴のみならず、クラス 3型セマフォリンとニューロピリンとの結合を阻害しないという特徴をも併せ持つ物質を有効成分とするものである。当該物質も、前記の活性を有する限り、その構造 ·形状等は問わず、具体例としては実施例に記載の M162が挙げられる。なお、クラス 3型セマフォリンとニューロピリンとの結合を阻害するか否かは、後述の実施例に記載の方法に準じて測定することができる。

図面の簡単な説明

図 1は、 Sema3Aの有する成長円錐退縮活性を VEGF165が濃度依存的に阻害した結果を示すグラフである。図中、縦軸は成長円錐退縮活性を、また横軸は VEGF165の濃度を示す。図には VEGF165処理後に Sema3Aを添加した場合（白丸： + Sema3A) と Sema3Aを添加しなかった場合（黒丸：一 Sema3A) を示した。

図 2は、 BAE細胞（牛大動脈内皮細胞）の増殖を Sema3Aが濃度依存的に抑制した結果を示すグラフである。図中、縦軸は細胞増殖を、横軸は Setn_a3Aの濃度を示す。白カラムは VEGF165 (3ng/ml) 存在下、黒カラムは VEGF165非存在下での場合を示す。各カラムに標準偏差を付加した（n=6) 。 t検定（Student's) の結果、 Sema3A^添加に比較して統計的有意差が認められた点を *で示した（* p<0. 05、 * * pく 0. 01) 。図 3は、 Sema3Aの有する成長円錐退縮活性を M162が濃度依存的に阻害した結果を示すグラフである。図中、縦軸は成長円錐退縮活性を、横軸は M162の濃度を示す。図には M162処理後に Sema3Aを添加した場合（白丸： +Sema3A) と Sema3Aを添加しなかった場合（黒丸：一 S_ema3A) を示した。同時に各点には標準偏差

(n=3) も表示した。

図 4は、 Sema3A-APのニューロピリンへの結合を M162は阻害しないことを示すグラフである。図中、縦軸はニューロピリンに結合した Sema3A- AP量（あるいは APのみ）を示す。左カラム（白）は AP、中央カラム（グレー）は Sema3A- AP単独、右カラム（黒）は M162存在下での Sema3A- APのニューロピリンへの結合を示す。図 5は、 Sema3Aの活性阻害剤 (M162) による BAE細胞（ゥシ大動脈内皮細胞）の増殖促進作用を示したグラフである。図中、縦軸は 570nmの吸光度で表した細胞増殖を、横軸は M162の濃度を示す。黒丸は VEGF165 (3ng/ral) 存在下、白丸は VEGF165非存在下での場合を示す。各点には標準偏差（n=6) も示した。 t検定 (Student's) の結果、 M162未処理に比較して統計的有意差が認められた点を * で示した（* pく 0. 05、 * * * p<0. 001) 。

実施例

以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。

実施例 1

VEGF165による Sema3Aの活性阻害作用

実験に使用する Sema3Aは以下のようにして調製した。すなわちまず、 Neuron, 14, 941 (1995)に記載の Setna3Aの配列情報をもとに PCR反応を行うことによりクロ —ニングされた Sema3Aのシグナル配列の下流に His6配列を付加した遺伝子を発現プラスミド pUCSR ひに組み込み、この発現プラスミドを FuGENE (ベーリンガー）トランスフエクシヨン試薬を用いてメーカーのプロトコールにしたがって C0S7細胞に導入した。この形質転換細胞の培養上清よりニッケルァフイエティーカラムを用いて文献（ J . Neurosi. , 17, 9183 (1997) )に記載の方法で精製することにより、 Sema3Aタンパクを調製した。また VEGF165は、ゲンザィム社製のものを用いた。ニヮトリ E7後根神経節 (DRG) を常法により調製し、 10%FCSを含む F12培地中でー晚培養した。その後、培地に0

の¥56?165を添加し、 1時間培養した後に、培地に更に 2u/ml (50%の成長円錐を退縮させる Sema3Aの濃度を lu/mlとする）のマウスセマフォリン 3A (Sema3A)を添加し、更に 1時間培養した。 1時間経過後、すみやかに 1 %になるようにダルタルァノレデヒドを添加し、室温に 15分間放置し組織片を固定した後に、顕微鏡下で退縮した成長円錐の割合を計測した。結果を図 1に示す。図 1に示すように、 VEGF165の濃度が増すに従って退縮する成長円錐の割合が減少した。この時、 S_etna3Aの活性を 50%阻害する VEGF165の濃度は約 l i _g/mlであった。一方、 VEGF165単独では 5 μ g/mlの濃度で添加しても全く影響を示さなかった。これらの結果から、 VEGF165によって Sem_a3Aの有する神経突起の成長円錐退縮活性の阻害されることが明らかとなった。実施例 2

S_etna3Aによる血管内皮細胞増殖抑制作用

BAE細胞 (Bovine Aortic Endotherial Cel lノウシ大動脈内皮細胞：セルシステムズ）を 96ゥエルプレート（住友べ一クライト ¾ 、 SUMILON CELLTIGHT PL) に 1ゥエルあたり 10000個撒き込み（培地： DMEM+10% FCS、 100 /x lZゥエル）、同時に、精製 Sema3A (最終濃度 50、 100 ng/ml) を添加し、 37°C、 5% C0₂存在下で 2日間培養した。培養終了後、 5 mg/mlの MTT溶液（ケミコン社製）を各ゥエルに 10 /i l添加し、さらに 1時間培養した。その後、培養上清を除き、 50 /x lの DMS0 で細胞内に蓄積した Formazan (生細胞中で生成された MTT変換体）を溶解し、 570 nmの吸光度を測定することにより、 BAE細胞の增殖を測定した。結果を図 2に示す。

図 2から明らかなように、添加した Sema3Aの濃度に依存して血管内皮細胞の増殖抑制効果がみられた。

実施例 3

Sema3Aの活性阻害剤の同定

ニヮトリ E7後根神経節 (DRG) を常法により調製し、 10%FCSを含む培地中で一晚培養した。その後、培地に0

/1 /1111の\1162を添加し、 1時間培養した後に、 2u/mlのマウス Setna3Aを添加し、更に 1時間培養した。 1時間経過後、すみやかに 1%になるようにダルタルァノレデヒドを添加し、室温に 15分間放置し組織片を固定した後に顕微鏡下で退縮した成長円錐の割合を測定した。結果を図 3 に示す。

図 3に示すように、 M162の濃度が増すに従って退縮する成長円錐の割合が减少した。一方、 M162職虫では 10 /i g/mlの濃度で添加しても全く影響を示さなかった。これらの結果から、 M162によって S_etna3Aの有する神経突起の成長円錐退縮活性の P且害されることが明らかとなつた。

実施例 4

Sema3Aとニューロピリンとの結合に対する Sema3A阻害剤の影響

Sema3Aのカルボキシ末端の 14アミノ酸を欠失させ、代わってヒト胎盤由来アルカリホスファターゼ（AP) を付加した融合蛋白（Sema3A- AP) をコードする遺伝子を発現プラスミド pUCSR aに組み込んだ。この発現プラスミドを C0S7細胞に FuGENE6トランスフエクシヨン試薬（ベーリンガー 'マンハイム）を用いて導入し、その培養上清中に Sema3A- APを発現させた。 Setna3A-APを含む培養上清は、発現プラスミド導入の 3日後に回収した（以下、回収した培養上清を Sema3A- AP CM と略す）。

C0S7細胞にラットニユーロピリン遺伝子（GenBank Ac No. AF016296) を組み込んだ発現プラスミド（pUCSR a -NP1) を FuGENE6トランスフエクション試薬を用いて導入し、 4時間培養後に 6ゥエルプレート（SUMILON CELLTIGHT PL) に 500， 000細胞ウエルで撒き直し、さらに 2 間培養した。このニューロピリン発現 C0S7細胞を 1ゥェルあたり 2 mlの HBH緩衝液 (10 ttiM HEPES/pH7. 2, 0. 5% BSA，

0. 5 mM NaN3を含む Hank's- balanced salt solut ion) で 1回洗浄し、 HBH緩衝液で希釈した Sema3A-AP CMを単独あるレ、は M162とともに添カ卩し（0. 5 ml ウエル）、室温に 90分間放置した。その後、上清を除き、細胞を HBH緩衝液（2 tnlノウェノレ）で 6回洗浄することで過剰の Sema3A_APを除去した。洗浄後、 10 mM Tris- HCl/pH8. 0, 1% Triton X-100 ( 1 ml/ゥエル）を添加することで C0S7の細胞膜を可溶化し、遠心（15, 000 rpm， 10分）によって不溶物を除いた。この操作により、 C0S7細胞表面上のニューロピリンに結合した Sema3A- APは可溶性画分に回収されたことになる。

次に、ニューロピリンに結合した Sema3A- AP量をその APの活性を測定することで調べた。まず、得られた可溶性画分を 65°Cで 30分間処理することで C0S7細胞に由来する内在性 APを失活させた。これに等量の 2x SEAP緩衝液 (2 M

diethanolamine/pH9. 8, 1 mM MgC12, 20 mM L-homoarginine) 及び 1/10容量の 120 mM p-nitrophenyl phosphate (シグマ）を加え、室温に 24〜48時間放置した後、 APによって生成する p - nitrophenol (p - nitrophenyl phosphateの脱ジン酸体）の 405 nmの吸光度を測定した。以上の操作を APのみで処理したものについても行った（ネガティブコントロール）。

その結果、図 4に示すように Sema3A- AP単独の場合と Sema3A - APと M162が共存した場合とで可溶性画分中の Sema3A- AP量に違いはなく、 M162は Sema3A- APのニュー口ピリンへの結合を阻害しないことが示された。なお別途、 M162は AP活性に影響しないことを確認している。

実施例 5

Sema3A阻害剤による血管内皮細胞増殖促進作用

BAE細胞を 96ゥエルプレートに 1ゥエルあたり 10000個撒き込み、同時に 0 ju M〜 5 /z Mの M162を添加し、 37°C、 5% C0₂存在下で 2日間培養した。培養終了後、 5 mg/mlの MTT溶液を各ゥエルに 10 i l添加し、さらに 1時間培養した。その後、培養上清を除き、 50 1の1) 150で細胞内に蓄積した 0^ 30 (生細胞中で生成された MTT変換体）を溶解し、 570 nmの吸光度を測定することにより、 BAE細胞の増殖を測定した。以上の操作を血管内皮細胞增殖因子（VEGF165) の存在下、非存在下の両方の場合で行った。結果を図 5に示す。図 5に示すように M162の濃度が增すに従つて細胞増殖が促進された。

産業上の利用の可能性

本発明により、クラス 3型セマフォリンを有効成分とする血管内皮細胞増殖抑制剤、 V E G F 1 6 5を有効成分とする神経突起伸長促進剤、またはクラス 3型セマフォリンの阻害物質を有効成分とする血管内皮細胞増殖促進剤などを提供することができる。

Claims

請求の範囲

1. クラス 3型セマフォリン又はその改変体、あるいはこれらをコードする遺伝子を有効成分として含有する、血管内皮細胞増殖抑制剤。

2. VEGF 165又はその改変体、あるいはこれらをコードする遺伝子を有効成分として含有する、神経突起伸長促進剤。

3. 血管内皮細胞増殖促進剤を同定する方法であって、

(b) 当該被験物質を血管内皮細胞に接触させ、当該被験物質が血管内皮細胞の増殖を促進する力否かを測定する工程、

を含む方法。

4. 請求項 3記載の方法により選択される、神経突起伸長促進作用を有する血管内皮細胞増殖促進剤。

5. クラス 3型セマフォリンの有する成長円錐退縮活性を阻害する物質を有効成分とする、血管内皮細胞増殖促進剤。

6. クラス 3型セマフォリンの有する成長円錐退縮活性を阻害するが、クラス 3型セマフォリンとニューロピリンとの結合は阻害しない物質を有効成分とする、請求項 5記載の血管内皮細胞増殖促進剤。