CN117384257A - 小分子多肽kp-4在制备治疗肾脏纤维化或慢性肾脏病的药物中的用途 - Google Patents

小分子多肽kp-4在制备治疗肾脏纤维化或慢性肾脏病的药物中的用途 Download PDF

Info

Publication number
CN117384257A
CN117384257A CN202311183965.4A CN202311183965A CN117384257A CN 117384257 A CN117384257 A CN 117384257A CN 202311183965 A CN202311183965 A CN 202311183965A CN 117384257 A CN117384257 A CN 117384257A
Authority
CN
China
Prior art keywords
recombinant
polypeptide
kidney
fgfr1
modification
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202311183965.4A
Other languages
English (en)
Inventor
刘友华
黄文树
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Southern Hospital Southern Medical University
Original Assignee
Southern Hospital Southern Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Southern Hospital Southern Medical University filed Critical Southern Hospital Southern Medical University
Priority to CN202311183965.4A priority Critical patent/CN117384257A/zh
Publication of CN117384257A publication Critical patent/CN117384257A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/001—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof by chemical synthesis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明公开了小分子多肽KP‑4在制备治疗肾脏纤维化或慢性肾脏病的药物中的用途；所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；本发明通过实验发现，在单侧输尿管结扎和单侧肾脏进行缺血‑再灌注动物模型实验中；KP‑4可以减少肾脏间质胶原沉积显著减少，显著降低α‑平滑肌肌动蛋白、纤连蛋白和肾损伤分子1，并抑制成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)及其下游通路p‑ERK1/2蛋白表达，表明KP‑4能通过与FGFR1结合并拮抗FGF2/FGFR1信号通路，有效抑制肾小管损伤和肾脏纤维化、延缓或/和逆转慢性肾脏病的病程；且无明显毒副作用，因此可用于制备有效防治肾脏纤维化、慢性肾脏病的药物。

Description

小分子多肽KP-4在制备治疗肾脏纤维化或慢性肾脏病的药物 中的用途
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及小分子多肽KP-4在制备治疗肾脏纤维化或慢性肾脏病的药物中的用途。
背景技术
在过去的几十年中，由于糖尿病、高血压和肥胖症的患病率增加以及人口老龄化，慢性肾脏病(CKD)正达到流行水平。慢性肾脏病(CKD)最终进展至终末期肾功能衰竭(ESRD)，患者终身依赖“肾脏替代治疗”来维持生命。肾移植虽然是ESRD的一种高效的治疗方法，但却受到供体肾脏供应稀缺的限制。由于目前关于CKD的治疗效果有限，一般只能延缓肾脏疾病进展，而不能逆转疾病，因此亟须开发新的治疗方法来阻止或逆转CKD的进展。
肾脏纤维化，尤其是肾小管间质纤维化是几乎所有进展性CKD的共同途径，其特征是细胞外基质过量表达、扩张和沉积，导致肾小管细胞损伤、炎症细胞浸润、肌成纤维细胞活化、小管萎缩和微血管稀疏化，最终肾脏功能衰竭。大量研究表明，成纤维细胞生长因子2(FGF2)是一种具有显著促增殖、分化作用的细胞因子，其生物学功能的发挥由细胞表面受体FGFR介导完成，而FGF2/FGFR1信号的持续激活是肾脏纤维化和CKD发生发展的一个关键途径。因此，寻找阻断FGF2/FGFR1信号通路的对策，对于抑制肾脏纤维化的发生发展具有重要的理论意义和临床应用价值。
FGF2的配体在体内可以与不同的蛋白质结合，从而调节其生物学活性。蛋白质相互作用通常是通过特定的氨基酸序列所组成的结构域完成的。本发明通过筛选多肽文库，发现一个特异的小分子多肽(KP-4)，能抑制肾脏纤维化的关键信号通路，抑制肾小管损伤和肾脏纤维化、延缓或/和逆转慢性肾脏病的病程。
发明内容
本发明第一方面的目的，在于提供多肽或其药用盐。
本发明第二方面的目的，在于提供生物材料。
本发明第三方面的目的，在于提供上述多肽或其药用盐或生物材料的应用。
本发明第四方面的目的，在于提供一种产品。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一方面，提供多肽或其药用盐；所述多肽为下述任一种：
a1)氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的多肽；
a2)将a1)所述多肽的氨基酸序列经过缺失、替换、添加和/或修饰一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与如a1)所述氨基酸序列功能相同的氨基酸序列。
优选地，所述修饰为对所述多肽的氨基端的氨基酸进行修饰、对所述多肽的羧基端的氨基酸进行修饰或对所述多肽的序列内部的氨基酸进行修饰中的一种或多种的组合。
优选地，所述修饰为化学修饰。
优选地，所述化学修饰包括聚乙二醇修饰，脂肪酸修饰，糖基化修饰，乙酰化修饰，酰胺化修饰，磷酸化修饰或多肽领域可接受的其他修饰中的一种或多种的组合。
本发明的第二方面，提供生物材料，所述生物材料为下述任一种：
b1)编码本发明第一方面所述多肽的核酸分子；
b2)含有b1)所述核酸分子的表达盒；
b3)含有b1)所述核酸分子的重组载体、或含有b2)所述表达盒的重组载体；
b4)含有b1)所述核酸分子的重组细胞、或含有b2)所述表达盒的重组细胞、或含有b3)所述重组载体的重组细胞；
b5)含有b1)所述核酸分子的重组组织、或含有b2)所述表达盒的重组组织、或含有b3)所述重组载体的重组组织；
b6)含有b1)所述核酸分子的重组器官、或含有b2)所述表达盒的重组器官、或含有b3)所述重组载体的重组器官；
b7)含有b1)所述核酸分子的重组微生物、或含有b2)所述表达盒的重组微生物、或含有b3)所述重组载体的重组微生物。
在本发明的一些实施方式中，所述载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒、噬菌体、黏粒、Ti质粒或病毒载体。
在本发明的一些实施方式中，所述的表达盒是指能够在宿主细胞中表达所述基因的DNA，该DNA不但可包括启动基因转录的启动子，还可包括终止基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。
上述生物材料中，所述的重组细胞述细胞包括原核细胞或真核细胞。所述细胞非植物或动物新品种。
优选地，所述原核细胞包括大肠杆菌、链霉菌、枯草芽孢杆菌等本领域熟知的能够用于表达目的蛋白的原核细胞。
优选地，所述真核细胞包括酵母细胞、哺乳动物细胞、植物细胞和昆虫细胞中的至少一种。
所述的重组组织可为重组昆虫组织和/或重组植物组织和/或重组动物组织。
所述的重组器官可为重组昆虫器官和/或重组植物器官和/或重组动物器官。
本发明的第三方面，提供本发明第一方面所述多肽或其药用盐或本发明第二方面所述生物材料在制备产品中的应用；
所述产品的功能为以下至少一种：
c1)预防和/或治疗慢性肾脏病；
c2)预防和/或治疗肾纤维化；
c3)预防和/或治疗肾小管损伤；
c4)降低肾脏间胶质原沉积；
c5)抑制α-平滑肌肌动蛋白、纤连蛋白、肾损伤分子1、FGFR1和/或p-ERK1/2蛋白表达；
c6)抑制FGF2/FGFR1信号通路。
优选地，所述产品中本发明第一方面所述多肽的工作浓度为1～20μg/mL。
优选地，所述产品中本发明第一方面所述多肽的工作浓度为2～10μg/mL。
优选地，所述产品包括药物或试剂。
优选地，所述药物还包括至少一种其他预防和/或治疗慢性肾脏病或肾纤维化的活性成分。
优选地，所述药物还包括药学上可接受的辅料。
优选地，所述药学上可接受的辅料包括：稀释剂、黏合剂、润湿剂、润滑剂、崩解剂、溶剂、乳化剂、助溶剂、防腐剂、pH调节剂、渗透压调节剂、表面活性剂、包衣材料、抗氧剂或缓冲剂中的至少一种。
优选地，所述药物的剂型包括混悬剂、颗粒剂、胶囊剂、散剂、片剂、滴丸剂、注射剂、栓剂、气雾剂或滴剂中的至少一种。
优选地，所述药物的给药途径包括静脉注射、腹腔注射、肌肉注射、皮下注射、口服给药、舌下给药、鼻腔给药或雾化给药中的至少一种。
本发明的第四方面，提供一种产品，所述产品包含本发明第一方面所述多肽或其药用盐或本发明第二方面所述生物材料。
优选地，所述产品的功能为以下至少一种：
c1)预防和/或治疗慢性肾脏病；
c2)预防和/或治疗肾纤维化；
c3)预防和/或治疗肾小管损伤；
c4)降低肾脏间胶质原沉积；
c5)抑制α-平滑肌肌动蛋白、纤连蛋白、肾损伤分子1、FGFR1和/或p-ERK1/2蛋白表达；
c6)抑制FGF2/FGFR1信号通路。
优选地，所述产品包括药物或试剂。
优选地，所述药物还包括至少一种其他预防和/或治疗慢性肾脏病或肾纤维化的活性成分。
优选地，所述药物还包括药学上可接受的辅料。
优选地，所述药学上可接受的辅料包括：稀释剂、黏合剂、润湿剂、润滑剂、崩解剂、溶剂、乳化剂、助溶剂、防腐剂、pH调节剂、渗透压调节剂、表面活性剂、包衣材料、抗氧剂或缓冲剂中的至少一种。
优选地，所述药物的剂型包括混悬剂、颗粒剂、胶囊剂、散剂、片剂、滴丸剂、注射剂、栓剂、气雾剂或滴剂中的至少一种。
优选地，所述药物的给药途径包括静脉注射、腹腔注射、肌肉注射、皮下注射、口服给药、舌下给药、鼻腔给药或雾化给药中的至少一种。
本发明的有益效果是：
本发明提供了一种新的小分子多肽，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；通过单侧输尿管梗阻(UUO)和单侧缺血再灌注损伤(UIRI)肾病模型检测小分子多肽(KP-4)的作用；结果表明：与UUO或UIRI模型组比较，KP-4组肾脏间质胶原沉积显著减少，α-平滑肌肌动蛋白、纤连蛋白和肾损伤分子1均显著降低，成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)及其下游通路p-ERK1/2蛋白表达明显下调，表明KP-4能通过与FGFR1结合并拮抗FGF2/FGFR1信号通路，有效抑制肾小管损伤和肾脏纤维化、延缓或/和逆转慢性肾脏病的病程；且无明显毒副作用，因此可用于制备有效防治肾脏纤维化、慢性肾脏病的药物。
附图说明
图1是KP-4的筛选和鉴定。大鼠成纤维细胞(NRK-49F)给予不同的小分子多肽处理1小时后用FGF2刺激30分钟。其中，图1A：第1到第6号小分子多肽对FGF2刺激后p-ERK1/2蛋白的拮抗作用；图1B：KP-4的氨基酸序列。
图2是KP-4与FGF2竞争性结合FGFR1。其中，图2A：KP-4抑制FGFR1与sKlotho的相互作用；图2B：KP-4抑制FGFR1与FGF2的相互作用；图2C：KP-4特异性抑制FGFR1与FGF2的相互作用；图2D：Co-IP证明KP-4与FGFR1结合。
图3是FGFR1与KP-4的最优构象结合模式图。该图中，FGFR1：蓝色，KP-4：红色。
图4是UUO模型各组小鼠肾脏Masson染色图。该图中，Sham：假手术组；KP-4：单纯给药组；UUO：模型对照组；UUO+KP-4：模型治疗组。
图5是UUO模型各组小鼠肾脏纤维化和肾小管损伤指标的免疫染色图。该图中，Sham：假手术组；KP-4：单纯给药组；UUO：模型对照组；UUO+KP-4：模型治疗组。
图6是UUO模型各组小鼠肾组织FGFR1及其下游通路p-ERK1/2蛋白水平的免疫印迹图。其中，图6A为免疫印迹检测的代表性结果；图6B和图6C为所有结果的统计图。Sham：假手术组；KP-4：单纯给药组；UUO：模型对照组；UUO+KP-4：模型治疗组。
图7是UIRI模型各组小鼠肾脏Masson染色图。该图中，Sham：假手术组；KP-4：单纯给药组；UUO：模型对照组；UUO+KP-4：模型治疗组。
图8是UIRI模型各组小鼠肾脏纤维化和肾小管损伤指标的免疫染色图。该图中，Sham：假手术组；KP-4：单纯给药组；UUO：模型对照组；UUO+KP-4：模型治疗组。
图9是免疫印迹法检测各组小鼠肾脏FGFR1及其下游通路p-ERK1/2蛋白水平。其中，图9A为免疫印迹检测的代表性结果；图9B和图9C分别为FGFR1和p-ERK1/2蛋白表达量的统计图。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
本发明所涉及的动物模型：
单侧输尿管结扎(UUO)是经典的CKD动物模型，其特点是可以快速完整地展示梗阻肾脏间质纤维化不同病理阶段和特征，包括炎细胞浸润、小管细胞的增殖和凋亡、肌成纤维细胞的活化、纤连蛋白(Fibronectin)和I型胶原(Collagen I)的沉积。缺血-再灌注(IRI)模型是经典的急性肾损伤(AKI)向慢性肾脏病(CKD)进展的模型。
单侧肾脏进行缺血-再灌注(UIRI)手术后10天，然后合并进行对侧肾脏的切除，能够明显展示慢性肾脏纤维化的病理过程，其造模方法简便易行，成功率高，且具备手术切口小、手术时间短及并发症少的优点，建立的模型适合于急性肾损伤向慢性肾纤维化进展的研究。
在病理上，通常采用Masson染色，来观察组织细胞外胶原蛋白沉积情况。而更具体的组织纤维化则常常应用肌成纤维细胞的标志α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、纤连蛋白和肾损伤分子1(KIM-1)的免疫染色，还有免疫印迹方法(Western blotting)来定性、定量观察和评估。
实施例1：KP-4小分子多肽的筛选
1.实验材料：
细胞：大鼠成纤维细胞。
培养液：含10％血清的DMEM/F12(1:1)培养液。
培养条件：37℃含5％二氧化碳的培养箱。
小分子多肽文库：有文献报道，klotho能通过竞争结合FGFR1，阻断FGF2/FGFR1信号转导，从而抑制肾脏纤维化，延缓慢性肾病进展。因此本实施例由计算机设计产生6条多肽序列，平均每条长度约为30氨基酸，交由武汉丹港生物科技公司人工合成，建成小分子多肽文库；其中涉及的6条多肽序列在氨基酸序列结构上与抗衰老蛋白klotho分子的一段序列同源；以筛选出分子量更小、对肾脏纤维化或慢性肾病效果更好的肽段。
其中6条多肽的序列分别如下：
KP-1、FQGTFPDGFLWAVGSAAYQTEGGWQQHGKG(SEQ ID NO.1)；
KP-2、QHGKGASIWDTFTHHPLAPPGDSRNASLP(SEQ ID NO.2)；
KP-3、RNASLPLGAPSPLQPATGDVASDSYNNVF(SEQ ID NO.3)；
KP-4、NNVFRDTEALRELGVTHYRFSISWARVLPNG(SEQ ID NO.4)；
KP-5、GSAGVPNREGLRYYRRLLERLRELGVQPVVT(SEQ ID NO.5)；
KP-6、QPVVTLYHWDLPQRLQDAYGGWANRALADH(SEQ ID NO.6)；
除KP-5肽段C端进行酰胺化修饰外，其余肽段进行N端乙酰化修饰。
2.实验处理：
(I)将培养好的大鼠成纤维细胞以1.5×106种于6孔细胞培养板，培养1天，饥饿12小时，提前1小时给予6种不同的小分子多肽(终浓度10μg/ml)和Klotho重组蛋白(终浓度100ng/ml)。然后加入FGF2刺激30分钟，30分钟后收取蛋白，进行Western blot实验，筛选其中对FGF2诱导p-ERK1/2蛋白抑制最强的肽段。
3.实验结果
(I)实验结果如图1A所示，部分小分子肽段能抑制FGF2所介导的p-ERK1/2的表达。其中第4肽段(命名为KP-4)抑制作用最强。
(II)KP-4的氨基酸序列
实验结果如图1B所示，多肽KP-4的氨基酸序列为NNVFRDTEALRELGVTHYRFSISWARVLPNG(SEQ ID NO.4)。
实施例2：KP-4与FGF2竞争性结合FGFR1
1.实验材料：
细胞：大鼠成纤维细胞。
培养液：含10％血清的DMEM/F12(1:1)培养液。
培养条件：37℃含5％二氧化碳的培养箱。
2.实验处理：
(I)在验证KP-4与FGFR1相互作用的Co-IP实验中，将培养好的大鼠成纤维细胞种在6cm皿上的密度约80％。次日长满后不作处理即收细胞。在验证KP-4与FGF2竞争性结合FGFR1的Co-IP实验中，NRK-49F细胞种在6cm皿上的密度约80％。细胞贴壁后无血清培养基饥饿12小时。提前1小时孵育KP-1、KP-4或KP-6(终浓度为10μg/ml)，加FGF2刺激30分钟后收细胞。在验证KP-4阻断Klotho与FGFR1相互作用的Co-IP实验中，NRK-49F细胞种在6cm皿上的密度约90％。次日在相应的分组加入klotho或KP-4和klotho，培养24小时后，在相应分组加入FGF2刺激30分钟后收细胞。
(II)使用Discovery Studio 2021软件进行多肽蛋白的对接分析。
3.实验结果
(I)实验结果如图2A所示，为进一步探讨KP-4对FGF2信号的调控作用，我们用FGF2刺激成纤维细胞，并且给予klotho或给予klotho和KP-4同时进行孵育，用FGFR1的一抗拉出与FGFR1结合的复合物，检测klotho或KP-4是否能与FGFR1结合。当我们用klotho进行孵育时，用FGFR1可以拉下FGFR1-sklotho复合物，说明klotho能与FGFR1结合，而当我们给予klotho和KP-4同时进行孵育时，用FGFR1拉下的FGFR1-sklotho复合物显著减少，说明FGFR1不仅能与klotho结合，也能与KP-4结合。
实验结果如图2B所示，为进一步证实KP-4能与FGFR1结合从而阻断FGF2与FGFR1的结合，我们用FGF2刺激成纤维细胞，并且给予KP-4进行孵育，用FGFR1的一抗拉出FGFR1-FGF2复合物，当FGF2刺激成纤维细胞时，用FGFR1的一抗可以拉下许多FGFR1-FGF2复合物，说明FGF2能与FGFR1结合，而给予KP-4进行孵育后，用FGFR1拉下的FGFR1-FGF2复合物显著减少，说明KP-4能与FGFR1结合，进而阻断FGF2与FGFR1的结合。
实验结果如图2C所示，为探究KP-1和KP-6是否能像KP-4一样与FGFR1结合，进而阻断FGF2信号，我们用FGF2刺激成纤维细胞，并且给予KP-4或KP-1或KP-6进行孵育，用FGFR1的一抗拉出FGFR1-FGF2复合物，当FGF2刺激成纤维细胞时，用FGFR1的一抗可以拉下许多FGFR1-FGF2复合物，而给予不同浓度的KP-4进行孵育后，用FGFR1拉下的FGFR1-FGF2复合物随着KP-4浓度的增加而逐渐减少，而给予KP-1或KP-6进行孵育后，用FGFR1拉下的FGFR1-FGF2复合物与模型组相比无明显改变，说明KP-1和KP-6不能与FGFR1结合，也不影响FGF2与FGFR1的结合，而KP-4能与FGFR1结合，从而阻断FGF2与FGFR1的结合。
实验结果如图2D所示，为进一步证实KP-4能与FGFR1结合，我们使用FGF2对成纤维细胞进行刺激，提取细胞蛋白，蛋白裂解液加入FITC-KP-4或FITC，然后用FGFR1的一抗拉出与FGFR1结合的复合物。用FGFR1的一抗拉下FGF2刺激成纤维细胞的蛋白样品，大量的FITC在FGFR1-FITC-KP-4的复合物里，对照组的IgG不能把复合物拉下来，而不带KP-4的FITC无法被FGFR1拉下来，这说明KP-4能与FGFR1结合。
(II)实验结果如图3所示，FGFR1与KP-4的最优构象结合模式图。
实施例3：小分子多肽KP-4对小鼠UUO模型肾脏纤维化的抑制作用
1.实验动物：C57小鼠，6-8周，雄性，体重18-24g，SPF级。
先将动物称重、编号，选择健康、体重在18-24g的小鼠24只，随机分为4组，每组6只。包括假手术组、单纯给药组、模型对照组及模型治疗组。
2.实验分组
1)假手术组：室温，每只小鼠约腹腔注射1％的戊巴比妥钠0.12ml，即剂量(6ml/kg)，然后将小鼠放置于鼠笼中待其完全麻醉后，选择左侧腹约2cm为切口；局部消毒后，逐层切开皮肤、皮下、肌层及腹膜，发现左侧输尿管后，随即逐层缝合切口。局部消毒后，核实标记，置于相应鼠笼。
2)单纯给药组：室温，每只小鼠约腹腔注射1％的戊巴比妥钠0.12ml，即剂量(6ml/kg)，然后将小鼠放置于鼠笼中待其完全麻醉后，选择左侧腹约2cm为切口；局部消毒后，逐层切开皮肤、皮下、肌层及腹膜，发现左侧输尿管后，随即逐层缝合切口。局部消毒后，核实标记，置于相应鼠笼。
3)模型对照组：同上麻醉、消毒。逐层切开皮肤、皮下、肌层及腹膜，找到左侧输尿管后，于输尿管上1/3段结扎，逐层缝合切口。局部消毒后，核实标记，置于相应鼠笼。
4)模型治疗组：同上麻醉、消毒。逐层切开皮肤、皮下、肌层及腹膜，找到左侧输尿管后，于输尿管上1/3段结扎，逐层缝合切口。局部消毒后，核实标记，置于相应鼠笼。
3.实验过程
KP-4水溶性的粉末用无菌的0.01mol/L冰醋酸稀释为25mg/ml的储存浓度。实验各组分笼饲养。假手术组仅观察。模型对照组仅给予0.01mol/L冰醋酸腹腔注射。单纯给药组和模型治疗组予以UUO开始后的连续6天按照4mg/kg腹腔注射KP-4溶液。饲养7天后杀死各组小鼠，均取左侧肾脏，分别予以4％中性缓冲甲醛固定及液氮冷冻组织。甲醛固定组织在经脱水、包埋、切片、制片后，分别予以Masson染色及α-平滑肌肌动蛋白、纤连蛋白和肾损伤分子1的免疫染色。冰冻组织匀浆后提取蛋白，用免疫印迹法(Western Blot)检测FGFR1及下游通路p-ERK1/2蛋白表达水平。
4.实验结果
(I)、Masson染色结果显示KP-4减少UUO小鼠肾间质胶原沉积
实验结果如图4所示，模型治疗组小鼠肾间质胶原沉积明显低于模型对照组。
(II)、KP-4减少UUO小鼠肾间质纤维化和改善肾小管损伤
实验结果如图5所示，与模型对照组比较，模型治疗组小鼠肾脏组织纤连蛋白、α-平滑肌肌动蛋白和肾损伤分子1的蛋白水平明显降低。
(III)、KP-4抑制UUO小鼠的异常活化的FGFR1信号通路
实验结果如图6所示，与模型对照组比较，模型治疗组小鼠肾脏的FGFR1蛋白及其下游通路p-ERK蛋白明显降低。
实施例4：小分子多肽KP-4对小鼠UIRI模型肾脏纤维化的抑制作用
1.实验动物：C57小鼠，6-8周，雄性，体重18-24g，SPF级。
先将动物称重、编号，选择健康、体重在18-24g的小鼠24只，随机分为4组，每组6只。包括假手术组、单纯给药组、模型对照组及模型治疗组。
2.实验各组
1)假手术组：室温，每只小鼠约腹腔注射1％的戊巴比妥钠0.12ml，即剂量(6ml/kg)，然后将小鼠放置于鼠笼中待其完全麻醉后，选择左侧腹约2cm为切口；局部消毒后，逐层切开皮肤、皮下、肌层及腹膜，发现左侧肾蒂后随即逐层缝合切口。局部消毒后，核实标记，置于相应鼠笼。
2)单纯给药组：室温，每只小鼠约腹腔注射1％的戊巴比妥钠0.12ml，即剂量(6ml/kg)，然后将小鼠放置于鼠笼中待其完全麻醉后，选择左侧腹约2cm为切口；局部消毒后，逐层切开皮肤、皮下、肌层及腹膜，发现左侧肾蒂后随即逐层缝合切口。局部消毒后，核实标记，置于相应鼠笼。
3)模型对照组：同上麻醉、消毒。逐层切开皮肤、皮下、肌层及腹膜，找到左侧肾蒂后用动脉夹迅速阻断左侧肾蒂，可见肾脏有鲜红变成紫黑色，表示夹闭成功，将小鼠置于37℃的恒温金属浴上，计时35分钟，手术结束后逐层缝合。局部消毒后，核实标记，置于相应鼠笼。于手术后第10天行右侧肾切除，同上麻醉、消毒。行右侧背部约1cm切口，先结扎右侧肾蒂，再切除右侧肾，手术结束后逐层缝合切口。局部消毒后，核实标记，置于相应鼠笼。
4)模型治疗组：同上麻醉、消毒。逐层切开皮肤、皮下、肌层及腹膜，找到左侧肾蒂后用动脉夹迅速阻断左侧肾蒂，可见肾脏有鲜红变成紫黑色，表示夹闭成功，将小鼠置于37℃的恒温金属浴上，计时35分钟，手术结束后逐层缝合切口。局部消毒后，核实标记，置于相应鼠笼。于手术后第10天行右侧肾切除，同上麻醉、消毒。行右侧背部约1cm切口，先结扎右侧肾蒂，再切除右侧肾，手术结束后逐层缝合切口。局部消毒后，核实标记，置于相应鼠笼。
3.实验过程
KP-4水溶性的粉末用无菌的0.01mol/L冰醋酸稀释为25mg/ml的储存浓度。各组分笼饲养。假手术组仅观察。模型对照组仅给予0.01mol/L冰醋酸腹腔注射。单纯给药组和模型治疗组予以缺血再灌注损伤开始后第5天的连续7天以按照4mg/kg腹腔注射KP-4溶液。饲养第11天杀死各组小鼠，收集血标本，均取左侧肾脏，分别予以4％中性缓冲甲醛固定及液氮冷冻组织。甲醛固定组织在经脱水、包埋、切片、制片后，分别予以Masson染色及α-平滑肌肌动蛋白、纤连蛋白和肾损伤分子1的免疫染色。冰冻组织匀浆后提取蛋白，用免疫印迹法(Western Blot)检测FGFR1及下游通路p-ERK蛋白表达水平。
4.实验结果
(I)、KP-4减少UIRI小鼠肾间质胶原沉积
实验结果如图7所示，Masson染色结果显示模型治疗组小鼠肾间质胶原沉积明显低于模型对照组。
(II)、KP-4减少UIRI小鼠肾间质纤维化和改善肾小管损伤
实验结果如图8所示，与模型对照组比较，模型治疗组小鼠肾组织α-平滑肌肌动蛋白、纤连蛋白和肾损伤分子1的蛋白水平明显降低。
(III)、KP-4抑制UIRI小鼠的异常活化的FGFR1信号通路
实验结果如图9所示，与模型对照组比较，模型治疗组小鼠肾脏的FGFR1蛋白及其下游通路p-ERK1/2蛋白明显降低。
综上所述，KP-4可以明显减少UUO、UIRI小鼠肾间质胶原蛋白沉积，显著降低UUO、UIRI小鼠肾组织纤连蛋白、α-平滑肌肌动蛋白和肾损伤分子1的表达水平，并可以明显抑制CKD模型中的异常活化的FGF2/FGFR1信号通路。因此，KP-4可以成为有效抑制CKD进展的新药。
上述具体实施方式对本发明作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (10)

1.多肽或其药用盐；所述多肽为下述任一种：
a1)氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的多肽；
a2)将a1)所述多肽的氨基酸序列经过缺失、替换、添加和/或修饰一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与如a1)所述氨基酸序列功能相同的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的多肽或其药用盐，其特征在于，所述修饰为化学修饰；优选地，所述化学修饰包括聚乙二醇修饰，脂肪酸修饰，糖基化修饰，乙酰化修饰，酰胺化修饰，磷酸化修饰或多肽领域可接受的其他修饰中的一种或多种的组合。
3.生物材料，所述生物材料为下述任一种：
b1)编码权利要求1所述多肽的核酸分子；
b2)含有b1)所述核酸分子的表达盒；
b3)含有b1)所述核酸分子的重组载体、或含有b2)所述表达盒的重组载体；
b4)含有b1)所述核酸分子的重组细胞、或含有b2)所述表达盒的重组细胞、或含有
b3)所述重组载体的重组细胞；
b5)含有b1)所述核酸分子的重组组织、或含有b2)所述表达盒的重组组织、或含有
b3)所述重组载体的重组组织；
b6)含有b1)所述核酸分子的重组器官、或含有b2)所述表达盒的重组器官、或含有
b3)所述重组载体的重组器官；
b7)含有b1)所述核酸分子的重组微生物、或含有b2)所述表达盒的重组微生物、或含有b3)所述重组载体的重组微生物。
4.权利要求1～2任一项所述多肽或其药用盐或权利要求3所述生物材料在制备产品中的应用；所述产品的功能为下述任一种：
c1)预防和/或治疗慢性肾脏病；
c2)预防和/或治疗肾纤维化；
c3)预防和/或治疗肾小管损伤；
c4)降低肾脏间胶质原沉积；
c5)抑制α-平滑肌肌动蛋白、纤连蛋白、肾损伤分子1、FGFR1和/或p-ERK1/2蛋白表达；
c6)抑制FGF2/FGFR1信号通路。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述产品中多肽的浓度为1～20μg/mL。
6.一种产品，所述产品包含权利要求1～2任一项所述多肽或其药用盐或权利要求3所述生物材料。
7.根据权利要求6所述的产品，其特征在于，所述产品包括试剂或药物。
8.根据权利要求7所述的产品，其特征在于，所述药物还包括至少一种其他预防和/或治疗慢性肾脏病或肾纤维化的活性成分。
9.根据权利要求7所述的产品，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的辅料。
10.根据权利要求7所述的产品，其特征在于，所述药物的剂型包括混悬剂、颗粒剂、胶囊剂、散剂、片剂、滴丸剂、注射剂、栓剂、气雾剂或滴剂中的至少一种；
优选地，所述药物的给药途径包括静脉注射、腹腔注射、肌肉注射、皮下注射、口服给药、舌下给药、鼻腔给药或雾化给药中的至少一种。
CN202311183965.4A 2023-09-14 2023-09-14 小分子多肽kp-4在制备治疗肾脏纤维化或慢性肾脏病的药物中的用途 Pending CN117384257A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311183965.4A CN117384257A (zh) 2023-09-14 2023-09-14 小分子多肽kp-4在制备治疗肾脏纤维化或慢性肾脏病的药物中的用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311183965.4A CN117384257A (zh) 2023-09-14 2023-09-14 小分子多肽kp-4在制备治疗肾脏纤维化或慢性肾脏病的药物中的用途

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117384257A true CN117384257A (zh) 2024-01-12

Family

ID=89462084

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202311183965.4A Pending CN117384257A (zh) 2023-09-14 2023-09-14 小分子多肽kp-4在制备治疗肾脏纤维化或慢性肾脏病的药物中的用途

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN117384257A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Awada et al. A single injection of protein-loaded coacervate-gel significantly improves cardiac function post infarction
US8158589B2 (en) Peptides with the capacity to bind to transforming growth factor β1 (TGF-β1)
EP1729810B1 (en) Methods of reducing aggregation of il-1ra
US7820160B2 (en) Midkine inhibitory compositions for the treatment of angiostenosis
Grek et al. Cardiac to cancer: connecting connexins to clinical opportunity
US9340602B2 (en) Matricryptic ECM peptides for tissue reconstruction
CN106822865B (zh) 小分子多肽kp-6在制备治疗慢性肾脏病的药物中的用途
CN101426808A (zh) 新颖的蛋白质转导结构域及其应用
CN111184856B (zh) 小分子多肽tp-7在制备治疗慢性肾脏病药物中的用途
EP2525806B1 (en) Angiopoietin-like-protein-4 (ANGPTL4) for the preservation of vascular endothelial-cell barrier integrity
CN108042791B (zh) 小分子多肽kp-1在制备治疗慢性肾脏病的药物中的用途
Murphy et al. Elevated expression of basic fibroblast growth factor messenger ribonucleic acid in acoustic neuromas
EP2552462B1 (en) Ccn3 peptides and analogs thereof for therapeutic use
US20130053319A1 (en) Chemokine derived peptides and uses for chronic wound and angiogenesis inhibition treatments
EP2436688B1 (en) Polypeptide having antibacterial activity and angiogenesis-inducing activity and wound-healing drug containing said polypeptide
Molinas et al. Role of vascular endothelial growth factor receptor 1 in basal adhesion formation and in carbon dioxide pneumoperitoneum-enhanced adhesion formation after laparoscopic surgery in mice
EP2200630A1 (en) Treatment of cardiovascular disorders using the cell differentiation signaling protein nell1
EP2464656A1 (en) Novel peptide and use thereof
CN117384257A (zh) 小分子多肽kp-4在制备治疗肾脏纤维化或慢性肾脏病的药物中的用途
US20160083522A1 (en) Arginine-Grafted Bioreducible Polymer Systems and Use in Treatment of Cardiac Conditions
US9371523B2 (en) Cell migration regulator
Schweigerer Basic fibroblast growth factor: properties and clinical implications
WO2023033130A1 (ja) 骨疾患を処置または予防するための組成物
WO2019048898A1 (en) PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF ENDOTHELIAL DYSFUNCTION
JPH09295946A (ja) 医薬組成物

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination