WO2001009173A2 - Utilisation des acides quinique, shikimique et de leurs derives pour la preparation de ligands du recepteur du mannose - Google Patents

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WO2001009173A2
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receptor
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ligand
mannose receptor
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Cyrille Grandjean
Oleg Melnyk
Hélène Gras-Masse
Gerhild Angyalosi
Corinne Rommens
Claude Auriault
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Centre National De La Recherche Scientifique (Cnr S)
Institut Pasteur De Lille
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Definitions

  • the present invention relates to the use of quinic, shikimic acids and their derivatives for the preparation of mannose receptor ligands, to the ligands thus prepared, as well as to the therapeutic and diagnostic applications of these ligands.
  • Dendritic cells which represent a particular line of leukocytes originating in the bone marrow and which are present in practically all the tissues of the organism, play a key role in the control of the immune responses. Indeed, these cells appear to be the only cells capable in vivo of presenting antigens to naive and mature T lymphocytes, and of inducing, by activation of these T lymphocytes, an immune response of T helper type (J. BLANCHEREAU and RM STEINMANN , Nature, 1998, 392, 245-252). Activation of T cells by 'dendritic cells involves recognition and pre internalising antigens by them.
  • the mannose receptor belongs to the family of C-lectins which represents a group of calcium-dependent glycoproteins forming non-covalent bonds with carbohydrates. If, as the name suggests, the mannose receptor binds preferentially to D-mannose, it also appears to bind to other carbohydrates such as L-fucose, D-glucose and N-acetyl-D -glucosamine which, like D-mannose, comprise two hydroxyl functions carried by two adjacent carbon atoms of the cycle which constitutes them.
  • R 5 represents a group -OH, a group -SH, a group -NH-NH 2 , a halogen atom, or a linear, branched or cyclic, saturated or unsaturated carbon chain, comprising from 1 to 18 carbon atoms and optionally from 1 to 12 atoms chosen from oxygen, sulfur and nitrogen, said carbon chain being optionally substituted with 1 to 16 halogen atoms and optionally carrying at least one nucleophilic group or at least one electrophilic group, as a ligand for the mannose receptor or any receptor of the C-lectin family related to the mannose receptor, or for the preparation of such a ligand.
  • group is understood to mean
  • trimethylsilyl triethylsilyl, triisopropylsilyl, tertiobutyldimethylsilyl, tertiobutyldiphenylsilyl, trimethylsilylethyl ether, terr-butoxymethyl, methoxy-methyl, benzyloxymethyl, 2-methylethyl, methyl-methyloxy, methyl , 3'-dimethoxybutane-2 ', 3'-diyl.
  • nucleophilic group means a group having a pair of free electrons, that is to say an electron donor group, and by "electrophilic” group a group having a vacant low-energy molecular orbital capable of interacting with the pair of free electrons of a nucleophilic group.
  • electrophilic group a group having a vacant low-energy molecular orbital capable of interacting with the pair of free electrons of a nucleophilic group.
  • the nucleophilic group is preferably chosen from amino groups, thiols, ⁇ -aminothiols, alcohols, hydrazide and hydrazide derivatives, hydrazine and hydrazine derivatives, hydroxylamine and hydroxylamine derivatives
  • halogen atoms are bromine, chlorine and fluorine
  • suitable carbon chains are alkyl groups (methyl, ethyl, propyl, isopropyl, tert-butyl, pentyl, ...), alkenyl groups
  • the compounds corresponding to the general formulas (la) and (Ib) constitute mimes of D-mannose. They can be used, as such, as ligands for the D-mannose receptor, or be linked to other compounds to lead to the production of ligands in which they will act as mimics of D-mannose. Also, if it is appropriate that, in ligands such as ready to be used, the compounds of general formulas (la) and (Ib) have at least two vicinal free hydroxyl functions, so as to be able to mimic the D- mannose and allow these ligands to be recognized by the mannose receptor and to bind to the latter, it is not however necessary that these compounds initially have two free vicinal hydroxyl functions.
  • the compounds of general formulas (la) and / or (Ib) are chosen so that the groups -OR 2 and -OR 3 are in trans relationship, so as to mimic the two hydroxyls carried by the D-mannose cycle which appear to be involved in the bond between this compound and its receptor.
  • the compounds of formula (Ia) and / or (Ib) are such that R 5 represents a hydroxyl group (in which case the ring carries, in position 1, a carboxyl group).
  • the compound of formula (Ib) is such that Ri, R 2 and R 3 represent hydrogen atoms and R represents a hydroxyl group (-OH). If, in addition, the groups -ORi and -OR 2 are in the cis relationship, and the groups -OR 2 and -OR 3 are in the trans relationship, the configuration being 3R, 4S and 5R, the resulting compound consists of (-) - shikimic acid (or 3,4,5-trihydroxy-1-cyclohexene-1-carboxylic acid).
  • the compound of formula (la) is such that Ri, R 2 , R 3 and R represent hydrogen atoms and R 5 represents a hydroxyl group (-OH). If, in addition, the groups -OR 2 and -OR 3 are in a tr ⁇ ns relation, while the groups -ORi and -OR are each in a cis relation with respect to the group -OR 2 , and the configuration is lsn, 3R , 4s solicitand 5R, then the resulting compound consists of (-) - quinic acid (or 1,3,4,5-tetrahydroxy-cyclohexane-carboxylic acid).
  • the (-) - shikimic and (-) - quinic acids are commercially available, for example from the companies ALDRICH or ACROS.
  • the compound of formula (la) is such that Ri, R 2 , R 3 and R represent hydrogen atoms and R 5 represents a group -NH- (CH 2 ) 2 SH. It is then a derivative of quinic acid.
  • Ri, R 2 , R 3 and R represent hydrogen atoms and R 5 represents a group -NH- (CH 2 ) 2 SH. It is then a derivative of quinic acid.
  • a subject of the present invention is also a compound useful as a ligand for the mannose receptor or any receptor of the C-lectin family related to the mannose receptor, or as an intermediate compound for the preparation of such a ligand, which compound being characterized in that it corresponds to the general formula (III) below: (B'M) m (XN) n A (PY) v (ffl) in which: - B 1 corresponds to one or more general formulas (Ha) or (Ilb) below
  • W represents a bond or a linear, branched or cyclic, saturated or unsaturated carbon chain comprising from 1 to 18 carbon atoms and possibly from 1 to 12 atoms chosen from oxygen, sulfur and nitrogen, said carbon chain being optionally substituted by 1 to 16 halogen atoms,
  • X represents the remainder of an oligopeptide X ′ comprising from 1 to 6 amino acids
  • - m is an integer between 1 and 32
  • - n is an integer between 0 and 32
  • - y is an integer between 1 and 4, and
  • residues B 1 each corresponding to one of the general formulas (IIa) or (Ilb), this or these residues being intended to act as mimics of D-mannose with respect to the mannose receptor and resulting from the bond between one or more compounds corresponding to the general formula (la) and / or (Ib) previously defined and the compound A ', optionally via X and deprotection of the hydroxyl groups, in the case where the said compound (s) of general formula (la) and / or (Ib) initially has protected hydroxyl groups;
  • residue (s) X of a compound X ' this or these residue X playing the role, when they are present, of a spacer arm between B 1 and A, so as to control the distance between the different residues B 1 , when several of them are present in the compound of general formula (III) (that is to say when m is greater than 1).
  • residues X of oligopeptide nature have been described, it would not be departing from the scope of the present invention to use, as compound X ′, compounds of different nature, provided that they are capable of playing the role of arms spacer between B 1 and A.
  • the term “compound of interest” is intended to mean a compound whose internalization is sought to promote by cells via the mannose receptor or a receptor of the C-lectin family related to the latter (cells dendritics, cells of monocyte-macrophage lines, ).
  • the compound of interest can be linked to the remainder A, at a rate of 1 to 4 molecules of compound of interest per molecule of compound of general formula (III), by linking groups P each resulting from the reaction between two functional groups carried, for the first, by said compound of interest and for the second, by compound A '.
  • a ligand is obtained which is able, by the presence of the residue (s) B 1 , to bind specifically to the mannose receptor or to any receptor related to the latter and, by its bond with the compound of interest, to promote the internalization of the latter by cells expressing this type of receptor.
  • the compound A ′ is formed of a chain comprising several remains of an at least trifunctional compound, linked to each other by covalent bonds, and suitable for providing, at the level of the functional groups free from these residues (that is to say from functional groups which are not engaged in a covalent bond), several anchoring sites for the compound or compounds of general formula (la) and / or (Ib) or, when X is present, compound X ', and for compound Y'.
  • compound A ′ comprises from 2 to 32 and, preferably, from 4 to 16 residues of a trifunctional compound.
  • the compound A ′ can be presented either in a linear form or in a branched form and, in particular, of tree type (called "dendrimeric").
  • Examples of branched structures which are particularly well suited to the preparation of a mannose receptor ligand according to the invention are illustrated in FIGS. 1A and IB which very schematically represent a compound A 'in the form of two different dendrimers .
  • the compound A ′ comprises a chain of amino acids, identical or different, selected from the group consisting of lysine, hydroxylysine, serine, threonine, cysteine, romithine, aspartic acid and glutamic acid.
  • This amino acid can be both of the L series and of the D series and the compound A ′ can even comprise both residues of the L series and residues of the D series.
  • a compound A ′ based on lysine is preferred, the use of lysine being in fact particularly well suited to the production of a mannose receptor ligand according to the invention, insofar as it has been shown that macromolecules based on lysine are devoid of intrinsic immunogenicity (TAM, Proc. Natl. Acad. Sel. USA, 1988, 85, 540).
  • TAM intrinsic immunogenicity
  • the compound A ′ may also comprise one or more residues corresponding to one or more different compounds from the at least trifunctional compound which constitutes the basic element thereof.
  • This or these remains are in principle not intended to provide any connection between the various elements making up the ligand.
  • their presence is either intended to confer on this ligand additional characteristics such as one or more additional possibilities of coupling (for example, with a view to the subsequent production of a dimer of this ligand), or linked to the need to use, during its preparation, additional compounds, such as spacer arms.
  • these compounds, while being different from the at least trifunctional compound constituting the basic element of compound A ′ will preferably be of the same nature as the latter.
  • they will preferably be amino acids in the case where the compound A ′ comprises an amino acid.
  • n which represents the number of X residues present in the compound of general formula (III), can be:
  • linking groups M, N and P they are chosen, independently of one another, from the linking groups which comprise a function chosen from the oxime, hydrazone, amide, ester, thioester, hydrazide, hydroxamate, ether, thioether, amino, carbonate, carbamate, thiocarbonate, thiocarbamate, urea, thiouree and thiazolidine.
  • a function chosen from the oxime, hydrazone, amide, ester, thioester, hydrazide, hydroxamate, ether, thioether, amino, carbonate, carbamate, thiocarbonate, thiocarbamate, urea, thiouree and thiazolidine.
  • an oxime bond can be formed by reaction of an O-alkylamine group with a carbonyl group
  • a hydrazone bond can be formed by reaction of a hydrazine group with a carbonyl group
  • an amide bond (respectively, ester) can be formed by reaction of an amino group (respectively, alcohol) with an activated acid group or anhydride or acid halide
  • a thioester bond can be formed by reaction of a group thiol with an activated acid group or anhydride or acid halide
  • a hydrazide bond can be formed by reaction of a hydrazine group with an activated acid group, anhydride or acid halide,
  • an ether bond can be formed by reaction of an alcohol group with an alkyl halide group
  • a thioether bond can be formed by reaction of a thiol with an alkyl halide group
  • an amino bond can be formed by reaction between an amino group and an alkyl halide
  • a carbonate bond can be formed by reaction of a chloroformate group with an alcohol group
  • - a carbamate bond can be formed by reaction of a chloroformate group with an amino group
  • a thiocarbonate bond can be formed by reaction of a chlorothioformate group with an alcohol group
  • a thiocarbamate bond can be formed by reaction of a chlorothioformate group with an amino group
  • - a urea bond can be formed by reaction of an isocyanate group with an amino group
  • - a thiourean bond can be formed by reaction of an isothiocyanate group with an amino group
  • a thiazolidine bond can be formed by reaction of a ⁇ -aminothiol group with a carbonyl group
  • a hydroxamate bond can be formed by reaction between an activated acid group and a hydroxylamine group. It will therefore be understood that, in the general formula (III), B 1 , A and
  • X represent the residues of compounds naturally carrying functional groups capable of leading, by reaction to each other, to obtain the linking groups M, N and P as defined above, or of compounds having been modified from so as to carry such functional groups.
  • the compound corresponding to the general formula (III) can be prepared:
  • the compound of general formula (III) can be obtained by first coupling the compound or compounds corresponding to the general formula (la) and / or (Ib) with the compound X ', then by coupling the compound resulting from this first coupling with compound A ', and finally by coupling the compound resulting from this second coupling with compound Y', this latter coupling being optionally followed by deprotection of the hydroxyl groups carried by the residue (s) B 1 , in the case where the compound or compounds of formula (la) and / or (Ib) carry such groups.
  • the compound of general formula (III) can be obtained by coupling a compound resulting from the coupling between one or more compounds corresponding to the general formula (la) and / or (Ib) and the compound X ', with a resulting compound , for its part, of the coupling between the compound A 'and the compound Y', this latter coupling being able, here again, to be followed by deprotection as mentioned above.
  • the compounds Y ', A' and X ' are constituted by amino acids. So the compounds Y ', A' and X 'can be formed and assembled with each other by successive addition of the amino acids which compose them, for example according to the peptide synthesis techniques on solid support derived from the method initially described by MERRTPIELD (The Chemistry of Solid Phase Peptide Synthesis, STEWART and YOUNG Ed., 1984).
  • the compound corresponds to the general formula (III) in which m is an integer between 4 and 16, n is an integer between 2 and 8, X represents the remainder of a oligopeptide comprising from 2 to 4 amino acid residues, while A represents the remainder of a chain comprising from 2 to 8 lysine residues and which is in the form of a dendrimer.
  • the compound of general formula (III) is such that B 1 represents the remainder of one or more compounds chosen from (-) - shikimic acid and (-) - acid quinic.
  • the compound of interest Y ′ may be an antigen and, in particular, a vaccine antigen such as a synthetic peptide corresponding to one or more epitopes of a protein of a pathogenic agent.
  • a protein or polysaccharide subunit antigen a purified bacterial or viral fraction, an antibody such as an immunoglobulin or an antilymphocyte serum, a nucleic acid or a fragment of a nucleic acid (RNA or DNA sequence) coding for a protein of interest or for one or more antigenic determinants of this protein, a medicinal active principle such as an immunostimulant, an immunosupressant, a cytostatic or an antibiotic, and may, as such, be as well a substance of protein, peptide, osidic or polysaccharide, lipid, lipoproteinic, lipopolyosidic, polynucleotide nature, than a compound derived from chemistry.
  • the compound of interest can also be a detectable marker capable of allowing revelation of the presence of the ligand in the medium in which it is found, such as a radioisotope, a fluorochrome or an enzyme.
  • the compound of interest Y ' is consisting of an association of several substances of different nature such as, for example, an antigen or an antibody linked to a detectable marker.
  • the present invention also relates to a compound useful as an intermediate compound for the preparation of a ligand of the mannose receptor or of any receptor of the C-lectin family related to the mannose receptor, which compound is characterized in that '' it responds to the general formula (V) below:
  • X represents the remainder of an oligopeptide X ′ comprising from 1 to 6 amino acids
  • - m is an integer between 1 and 32
  • - n is an integer between 0 and 32
  • the residue (s) B 2 result from the coupling of one or more compounds corresponding to the general formula (la) and or (Ib) with the compound A ', optionally via X'.
  • M, N, m, n, as well as compounds A 'and X', are as described in relation to the general formula (III).
  • the compound of general formula (V) can be, like the compound corresponding to general formula (III), prepared by a convergent synthesis, by a recurrent synthesis, or also by a synthesis for partly convergent and for partly recurring.
  • the compound of general formula (V) is such that B 2 represents a residue of one or more compounds chosen from (-) - shikimic acid and (-) - quinic acid , possibly in protected form.
  • the present invention also relates to a compound useful as an intermediate compound for the preparation of a mannose receptor ligand or of any receptor of the C-lectin family related to the mannose receptor, which compound is characterized in that '' it meets the general formula (VI) below:
  • - m is an integer between 50 and 500
  • - A represents the remainder of a polymer A 'capable of forming a non-covalent complex with a compound of interest, such as a nucleic acid.
  • polymer means a set of molecules of variable molecular weight, resulting from the chain of several monomers.
  • This polymer is chosen from compounds capable of giving rise, on contact with a compound of interest, to the formation of a non-covalent complex with this compound, for example by means of ionic bonds, of dipolar bonds or electrostatic interactions, the complex thus obtained then being capable of being used as a ligand for the mannose receptor or any receptor of the C-lectin family related to the latter.
  • the polymer A ' is a cationic polymer.
  • suitable cationic polymers are lysine polymers such as those sold by the company Sigma under the references P0296, P6403, P4408, P7886, P0899, PI 149 or also P0124, and polyethyleneimines, such as that sold by the company FERMENTAS under the reference EXGEN 500 as a cell transfection reagent.
  • the present invention also relates to a compound useful as a ligand for the mannose receptor or any receptor of the C-lectin family related to the mannose receptor, which compound is characterized in that it is in the form of 'a non-covalent complex between a compound corresponding to the general formula (VI) as defined above and a compound of interest, such as a nucleic acid.
  • the ligands in accordance with the invention are of great interest. Indeed, while being able to be recognized very satisfactorily by the mannose receptor and to bind specifically with it, they have the advantage of being able to be easily prepared and at costs compatible with industrial exploitation, in particular by numerous peptide synthesis techniques on solid support.
  • ligands in the form of non-covalent complexes will be used between a compound of general formula (VI) and a polynucleotide sequence, and
  • Another subject of the present invention is the use of at least one compound corresponding to the general formula (la) and / or at least one compound corresponding to the general formula (Ib) for the preparation of a medicament capable of bind to the mannose receptor or to any receptor in the C-lectin family related to the mannose receptor.
  • the present invention also relates to a compound which is useful as a ligand for the mannose receptor or any receptor of the C-lectin family related to the mannose receptor, as defined above, for use as a medicament.
  • a drug is likely to find in the first place applications in all the therapeutic indications in which one seeks an induction, a modulation or a suppression of the immune responses and, more particularly, of those which are under the control of T cells.
  • This drug is also capable of being used for the vectorization of an active non-immunomodulatory principle towards target cells expressing a receptor of the C-lectin family.
  • the compounds useful as ligands in accordance with the invention can find applications in antibiotic therapy, for the vectorization of antibiotics such as fluoroquinones or colistin towards cells of the lines of monocytes-macrophages infected with bacteria. or by mycobacteria, or in the treatment of diseases related to a cellular enzyme deficiency such as GAUCHER's disease, in which case they will be used to vectorize the deficient enzyme to the KUPFER cells.
  • the present invention also relates to a compound useful as a ligand for the mannose receptor or any receptor of the C-lectin family related to the mannose receptor, as defined above, for use in vitro.
  • the present invention further relates to a diagnostic reagent, characterized in that it comprises a compound which is useful as a ligand for the mannose receptor or for any receptor of the C-lectin family related to the mannose receptor, as previously defined.
  • the present invention also comprises other provisions which will emerge from the additional description which follows, which relates to examples of the preparation of compounds useful as intermediate compounds for the preparation of conforming mannose receptor ligands to the invention, mannose receptor ligands in accordance with the invention and for demonstrating the biological properties of these ligands, as well as to the appended drawings in which:
  • FIG. 1A and IB illustrate two examples of branched conformations likely to be presented by the compound A ';
  • - Figures 2A, 2B and 2C illustrate the chemical structures of six compounds useful as intermediate compounds for the preparation of ligands according to the invention;
  • Figures 3 and 4 illustrate the chemical structures of 4 ligands according to the invention prepared from the compounds shown in Figures 2 A and 2B;
  • FIG. 5 illustrates the chemical structures of two ligands corresponding to formula (III) according to the invention, called 33F and 34F;
  • FIG. 6 and 7 illustrate the chemical structures of four ligands corresponding to formula (III) according to the invention, called 41F, 42F, 43F and 44F;
  • FIGS. 8 and 9 illustrate the chemical structures of a quinic acid derivative (compound G), two dendrimers (compounds H and I) and two peptide antigens (compounds J and K) which can be used to form ligands corresponding to formula (III) according to the invention, called 51 and 52;
  • FIGS. 10 and 11 illustrate the chemical structures of two ligands corresponding to formula (III) according to the invention, called 51 and 52;
  • - Figure 12 illustrates the ability of methyl quinate to inhibit the internalization of compound 31F, carrying residues of D-mannose, as described in Example 8 below;
  • FIG. 13 illustrates, in the form of curves, the average values of the fluorescence intensities presented by dendritic cells treated with 2 ligands in accordance with the invention (- • - and - * -) and with 2 control compounds (- ⁇ - and - ⁇ -) at concentrations between 1 and 10 ⁇ M;
  • FIG. 14 illustrates, in the form of curves, the average values of the fluorescence intensities presented by dendritic cells treated with 2 ligands in accordance with the invention (- • - and - • * -) and with 2 control compounds (- ⁇ - and -D-) at a concentration of 5 ⁇ M after pre-incubation of said cells in the presence of mannan solutions of concentrations between 10 ⁇ and 10 mg / ml;
  • FIG. 15 illustrates the percentage of specific internalization of di-, tetra- or octavalent ligands by the mannose receptor, as described in Example 8 below;
  • - Figure 16 illustrates the chemical structure of a ligand called 61F, consisting of a dendrimer comprising 4 L-lysine residues carrying 4 residues of D-mannose, as well as a fluorescein molecule (FITC), as described in Example 9 below;
  • - Figure 17 illustrates the percentage of positive cells detected during the incubation of Cos-1 cells with different compounds, as described in Example 9 below.
  • DCM dichloromethane
  • DIEA diisopropylethylamine
  • PBS phosphate buffer
  • TNBS 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid
  • TOF-PDMS time of flight spectrometry and plasma desorption
  • Trt trityle
  • TOF-PDMS spectra were recorded using an APPLIED BIOSYSTEMS Bio-Ion 20 plasma desorption mass spectrometer;
  • m represents an integer equal to 4, 8 or 16,
  • B 2 represents an acid (-) - shikimic or (-) - quinic residue
  • n is an integer equal to 2, 4 or 8 (in the case where m is respectively 4, 8 and 16)
  • A represents the remainder of a dendrimer comprising 2, 4 or 8 (in the case where m is equal respectively to 4, 8 and 16) L-lysine residues and having, on the one hand, 2, 4 or 8 chloroacetyl groups for its bond with an equivalent number of tripeptides and, on the other hand, a free amine group specific to allow its connection with a molecule of interest, • M represents an amide group (-CO-NH-), while N represents a thioether group (-CH 2 -S-CH 2 -CO-), have been prepared.
  • the second coupling - corresponding in fact to the first coupling of an L-lysine - was carried out using 4 equivalents (per amine function to react) of Boc-L-Lys (2-chlorobenzyloxycarbonyl) -OH, that is to say -display an L-lysine whose side chain is protected by a 2-chlorobenzyloxycarbonyl group, in the presence of an HBTU / HOBt DIEA mixture (4: 4: 12 eq. per amine function to react) in DMF (duration reaction time: 45 minutes).
  • the third coupling was carried out using 4 equivalents of Boc-L-Lys (Boc) -OH, in the presence of an HBTU / HOBt / DIEA mixture (4: 4: 12 eq. Per amine function to react) in DMF (reaction time: 45 minutes).
  • a third of the resin was deprotected, then acylated with 8 equivalents of preformed chloroacetic anhydride (via activation by DCC), to obtain a dendrimer (referred to as compound 13 in the following) comprising 2 L-lysine residues and having, on the one hand, a free amine group (which is none other than the ⁇ -amine group of the first L-lysine having been coupled to ⁇ -alanine) and, on the other hand, 2 chloroacetyl groups.
  • compound 14 (referred to as compound 14 below) comprising 4 L-lysine residues and having both a free amine group and 4 chloroacetyl groups.
  • the second half of the remaining resin was subjected to a fifth coupling with 4 equivalents of Boc-L-Lys (Boc) -OH, as previously described.
  • the deprotection and acylation of the resin with chloroacetic anhydride were repeated once again to obtain a dendrimer with 8 L-lysine residues (hereinafter called compound 15) having a free amine group and 8 chloroacetyl groups .
  • the HBTU (1 eq. Relative to the amino acid to be coupled), after dissolution in DMF, was added to a solution containing the amino acid to be coupled (0, 25 eq. Relative to the -NH functions for ⁇ -alanine, and 4 eq.
  • HOBt (1 eq. Relative to , amino acid)
  • DIEA 3 eq. with respect to the amino acid
  • the resin was successively filtered, washed 3 times with DMF (3 x 2 minutes) and DCM (3 2 minutes), treated with a TFA DCM mixture (50:50, 1 x 2 minutes, 1 x 20 minutes) suitable for cleavage of the Boc protective groups, washed again with DCM (2 x 2 minutes), neutralized with a DIEA / DCM mixture (5:95; 3 x 1 minute) and washed one last time with DCM (2 x 1 minute).
  • the cleavage of the dendrimers and their deprotection were obtained by reacting the resin with 11 ml of an HF / anisole mixture (10: 1) per gram of resin, at 0 ° C and for 60 minutes. Following which, they were successively precipitated in cold tert-butyl methyl ether, centrifuged, dissolved in water, lyophilized and purified by a semi-preparative RP-HPLC [gradient (AB): 100: 0 to 50: 50 in 120 minutes].
  • the tripeptides carrying the (-) - shikimic and (-) - quinic residues were prepared on a solid support, by first synthesizing the peptide of sequence (SI) and by secondly coupling a molecule of this tripeptide with 2 molecules of (-) - shikimic acid or 2 molecules derived from (-) - quinic acid, by formation of a bond between the amino groups of the N-terminal L-lysine of said tripeptide and the carboxyl group of said acids.
  • Compound 1 was prepared on a 2 mmol scale using an Fmoc-glycine p-benzyloxybenzyl resin (available under the trade name Fmoc-Gly-O-Wang from the company NOVABIOCHEM) loaded at 0.8 mmoles / g, and using:
  • L-cysteine was produced using 2 equivalents (per amine group to react) of
  • the cleavage of compound 1 was carried out by treating the resin with 25 ml of a TFA / H 2 O / Me 2 S mixture (95: 2.5: 2.5) at room temperature for 2 hours. The solution was concentrated under reduced pressure and the residue thus obtained was dissolved in water, then subjected to lyophilization leading to 1.64 g of a pale yellow powder. 107 mg of this powder were purified by a semi-preparative RP-HPLC [gradient (AB): 100: 0 to 50:50 in 110 minutes], which made it possible to obtain, after lyophilization, 15 mg of compound 1 pure, ie a yield of 14%.
  • Compound 1 has the following characteristics:
  • the coupling constants between the 3-H / 4-H and 4-H / 5-H protons of the two (-) - shikimic acid residues present in compound 1 as determined by N NMR spectrometry are 4.6 and 9.2 Hz. These constants are compatible with a pseudo-equatorial orientation of the hydroxyl functions carried by the carbon atoms located in positions 4 and 5 of the said acids and confirm the analogy of structure existing between (-) - shikimic acid. and D-mannose.
  • the cleavage of compound 3 was obtained by treating the resin with 20 ml of a CH 2 h / TFA PrsSiH (95: 2: 3) mixture (4 ⁇ 5 minutes). The solution was concentrated under reduced pressure and the residue thus obtained was dissolved in water, then subjected to lyophilization leading to the production of 1.40 g of a crude compound which has been dissolved in 25 ml of methanol. To the solution thus obtained, 1 M methanolic sodium methoxide was added dropwise with stirring until a pH of approximately 9 was obtained, then this mixture was allowed to react for 3 hours, by monitoring the course of the reaction by RP-HPLC. The mixture was then concentrated under reduced pressure.
  • a 100 mg sample of the residue was purified by semi-preparative RP-HPLC [gradient (A / B): 100: 0 to 90:10 in 10 minutes, then 90:10 to 50:50 in 70 minutes] to lead to the obtaining, after lyophilization, of 41 mg of pure compound 3, ie a yield of 59%.
  • Compound 3 has the following characteristics:
  • the couplings of compounds 13, 14 and 15 and of compounds 1 and 3 were carried out according to a procedure comprising 2 steps, namely: • a first step aimed at reducing the disulfide bond (S-SBu ') that each of the compounds 1 has and 3, by treating these compounds with tri-n-butylphosphine in a degassed n-propanol / water mixture (50:50), so as to obtain the elimination of the protective tert-butylthiol group carried by each of compounds 1 and 3 and, therefore, deprotection of their thiol function, and • a second step aimed at reacting compounds 1 and 3 thus reduced with compounds 13, 14 and 15, in a DMF / degassed water mixture (90:10) and in presence of potassium carbonate, so as to obtain the formation of a thioether bond between the thiol function of compounds 1 and 3 and one of the chloroacetyl functions of compounds 13, 14 and 15.
  • a first step aimed at reducing the disulfide bond
  • ESI-MS spectrum measured: 6382.0, calculated: 6383.0, m / z 1594.5 (M-4H) 4 " , 1275.5 (M- 5H) 5 ⁇ 1062.8 (M-6H) 6 ⁇ 910.8 (M-7H) 7 ' .
  • Compound 26 ESI-MS spectrum: measured: 6671.0, calculated: 6671.2, m / z 2221.9 (M-3H) 3 " , 1666.7 (M-
  • ligands 21F, 22F, 23F and 24F which will be referred to as ligands 21F, 22F, 23F and 24F in the following - and corresponding to the general formula (III) in which: "m represents an integer equal to 4 or 8,
  • B 1 represents an acid (-) - shikimic or (-) - quinic residue
  • N is an integer equal to 2 or 4 (in the case where m is respectively equal to 4 and
  • X represents the remainder of a tripeptide of sequence (SI) as defined in example 1,
  • A represents the remainder of a dendrimer A 'comprising 2 or 4 (in the case where m is respectively equal to 4 and 8) L-lysine residues and having, on the one hand, 2 or 4 chloroacetyl groups for its bond with a equivalent number of tripeptides and, on the other hand, a free amine group capable of allowing its bond with Y, • Y represents the remainder of a fluorescein molecule,
  • M represents an amide group (-CO-NH-), N represents a thioether group
  • reaction mixtures were then left in the dark for 48 hours, the reactions being controlled by RP-HPLC. Then, each reaction mixture was diluted in water containing 10% acetic acid and lyophilized and the residues were purified by semi-preparative RP-HPLC.
  • ligand 23F measured: 3769.0, calculated: 3769.1, m / z 1254.9 (M-3H) 3 * , 941.2 (M- 4H) 4 " • ligand 24F: measured: 3624.0, calculated: 3624.1, m / z 1207.0 (M- 3H) 3 " , 905.4 (M- 4H) 4 ⁇
  • B 1 represents an acid (-) - shikimic or (-) - quinic residue
  • n is an integer equal to 0 (so that X is absent)
  • A represents the remainder of a linear sequence A 'comprising 3 L-lysine residues and having 3 free amino groups for its coupling with the three molecules of (-) - shikimic or (-) - quinic acid and being, of on the other hand, linked to Y via an amide bond,
  • Y represents a compound of interest formed by three Arg-Gly-Arg residues linked to a class II epitope, in this case the chicken ovalbumin peptide 323-339 (which will be called Ova 323-339 in what follows)
  • the group formed by the 3 Arg-Gly-Arg residues located upstream of the sequence of said Ova 323-339 peptide represents a group sensitive to endopeptidases
  • ligand 25 and ligand 28 These ligands will be called ligand 25 and ligand 28 respectively in the following.
  • the peptide of sequence (S2) was synthesized on a 0.25 mmol scale from 337 mg of an MBHA Rink amide resin loaded at 0.74 mmol / g (Company SENN CHEMICALS), and using:
  • the couplings of the first 20 amino acids were performed automatically using an APPLIED BIOSYSTEMS ABI431 synthesizer, while the couplings of L-lysines and S- (tert-butylthio) -L-cysteine were performed manually. In all cases, these couplings were carried out using
  • the cleavage of the resulting products and their deprotection were carried out by treating the resin with 10 ml of a TFA / H 2 O / 'Pr 3 SiH mixture (95: 2.5: 2.5) per gram of resin, at temperature room and for 90 minutes. Following which, they were successively precipitated in cold diethyl ether, centrifuged, dissolved in water, lyophilized and purified by a semi-preparative RP-HPLC [gradient (A / B): 100: 0 to 50: 50 in 120 minutes].
  • This compound 26 was subjected to a deacylation to obtain the ligand 28.
  • To do this to 23 mg of the compound 28 in solution in 10 ml of methanol distilled over magnesium, were added 300 ⁇ l of a 1M solution of sodium methanolate in methanol. The reaction mixture was stirred at room temperature, under nitrogen, for 45 minutes and the reaction was stopped by the addition of a few drops of acetic acid. The reaction crude was concentrated under reduced pressure and was purified by RP-HPLC using a gradient (AB): 100: 0 to 80: 20 in 30 minutes, then 80: 20 to 70: 30 in 25 minutes, then isocratic for 10 minutes to lead to 15 mg of ligand 28 (Yield: 75%).
  • AB a gradient
  • ESI-MS spectra of ligands 25 and 28 are the following:
  • B 1 represents an acid (-) - quinic (ligand 33F) or (-) - shikimic (ligand 34F) residue
  • A represents the remainder of a dipeptide comprising 1 L-lysine residue and 1 ⁇ -alanine residue (N ⁇ - (chloroacetyl) -L-lysyl- ⁇ -alanine-amide, the chemical structure of which is shown in FIG. 5) ,
  • X represents a tripeptide of formula (SI), as defined in example 1, • Y represents the remainder of a molecule of fluorescein,
  • M, N and P respectively represent an amide group (-CO-NH-), thioether (-CH 2 -S-CH 2 -CO-) and thiourea (-NH-CS-NH-), have been prepared.
  • This dipeptide is synthesized manually using a Rink amide-AM-PS resin (0.70 mmol / g, Senn Chemicals) using an ocmocitert-butyl strategy, on a scale of 0.7 mmol.
  • the coupling is followed by a TNBS test: HBTU dissolved in NMP (4 eq.), Is added to a mixture of the amino acid (4 eq.), HOBt (4 eq.) And DIEA ( 8 eq.) In the NMP. After 1 minute of stirring, the reaction mixture is added to the peptidyl-resin (1 eq.) Previously soaked in NMP comprising DIEA (4 eq.), And stirred for 40 minutes.
  • the peptidyl-resin (that is to say the peptide sequence on a solid support) is filtered, washed with NMP (3 x 2 minutes) and CH 2 C1 2 (3 x 2 minutes).
  • the protective groups Fmoc are removed by treatment with 20% piperidine in NMP (1 x 2 minutes, 1 x 20 minutes), followed by washing with NMP (2 x 2 minutes) and CH 2 C1 2 (2 x 1 minutes).
  • the peptidyl-resin is deprotected and acylated using an excess (4 eq.) Of chloroacetic anhydride, prepared via DIC activation.
  • the dipeptide is separated from the support and deprotected under the action of a TFA-TIS-H 2 O 90: 5: 5 mixture (11 ml per gram of peptidyl-resin), for 1.5 h at room temperature, precipitated in a cold diethyl ether-heptane mixture (1: 1), centrifuged, dissolved in water and lyophilized.
  • the dipeptide (184 mg, 65%) is obtained in the form of a white powder after purification by RP-HPLC (with the following gradient: 100: 0 to 90:10 (A / B) in 20 minutes), followed by 'a freeze-drying.
  • ligand 33F 5.04 mg (80% yield) of ligand 33F were obtained in the form of a white powder, after purification by RP-HPLC (gradient: 100: 0 to 85:15 (A / C) in 15 minutes, then 85:15 to 75:25 (A / C) in 30 minutes, then isocratic gradient), followed by lyophilization.
  • ligand 34F 2.42 mg (80% yield) of ligand 34F were obtained in the form of a white powder, after purification by RP-HPLC (gradient: 100: 0 to 85:15 (A / C) in 15 minutes, then 85:15 to 70:30 (A / C) in 50 minutes), followed by lyophilization.
  • B 1 represents an (-) - shikimic or (-) - quinic residue
  • Y represents the remainder of a fluorescein molecule
  • A represents the remainder of a dendrimer
  • X represents the remainder of a tripeptide of sequence (S2) or (S3), as they will be defined below, • M, N and P respectively represent an amide group (-CO-NH-), thioether (- CH -S-CH 2 -CO-) and thiourea (-NH-CS-NH-), were prepared according to the following protocol. a) Preparation of the compound O. derived from quinic acid in which the hvdroxyls located in positions 3 and 4 are protected in the form of a diacetal ( Figure 6).
  • Compound Q i.e. acid (ls n , 3R, 4s n , 5R, 2'S, 3'S) -3.4-0- (2 ', 3' -dimethoxybutane-2 ', 3' -diyl) - 1 , 3, 4,5 -tetrahydroxycyclohexane- 1 -carboxylic, is obtained from 980 mg (3.06 mmol) of the methyl ester of the acid 3,4-0- (2 ', 3'- dimethoxybutane-2', 3 '-diyl) - 1, 3, 4,5 -tetrahydroxycyclohexane- 1 -carboxylic (described by JL MONTCHAMP et al.
  • the tripeptides (S2) and (S3) are respectively neutral and positively charged in physiological medium, in contrast to the peptide (SI) described in Example 1, which is negatively charged in physiological medium.
  • each peptidyl resin i.e. the peptide sequence on solid support
  • 0.2 mmol of sequence (S2) on the one hand
  • 0.2 mmol of sequence ( S3) on the other hand
  • BOP 177 mg, 0.4 mmol, 2 eq.
  • DIEA 140 ⁇ l , 0.8 mmol, 4 eq.
  • each peptidyl-resin is placed in the presence of 61 mg (0.44 mmol, 2.2 eq.) Of shikimic acid, using activation by HBTU-HOBt-DIEA [(166 mg , 0.44 mmol, 2.2 eq.), (67 mg, 0.44 mmol, 2.2 eq.), (146 ml, 0.84 mmol, 4.2 eq.)] In the NMP, during 40 minutes at room temperature. The peptidyl-resin is then washed with DMF (2 x 2 minutes) and CH 2 CI 2 (3 x 1 minute). The coupling is carried out a second time.
  • the peptidyl-resins are then washed with Et 2 O.
  • the peptides are separated from the solid support by means of a treatment with a TFA-H 2 O-iPr 3 SiH 95: 2.5: 2.5 mixture (10 ml per gram of peptidyl-resin), for 1 h at room temperature, precipitated in a diethyl ether mixture - cold heptane, centrifuged, dissolved in water, then lyophilized.
  • the peptides (S2) q, (S2) s, (S3) q and (S3s) are obtained, which correspond respectively to the tripeptides (S2) and (S3) carrying two residues of quinic acid (peptides (S2) q and ( S3) q) or two shikimic acid residues (peptides (S2) s and (S3) s), as shown in Figures 6 and 7. • Peptide (S2) q
  • 35.6 mg (24% yield) of this product are obtained in the form of a white powder, after purification by RP-HPLC [gradient: 100: 0 to 72:28 (A / B) for 20 minutes, then 72: 28 at 62:38 (A / B) for 30 minutes] followed by lyophilization.
  • 48 mg (26% yield) of this product are obtained in the form of a white powder, after purification by RP-HPLC [gradient: 100: 0 to 90:10 (A / B) for 10 minutes, then 90: 10 at 85:15 (AB) for 12 minutes, then isocratic gradient] followed by lyophilization.
  • the medium The reaction mixture is stirred for 24 h at room temperature, the progress of the reaction being followed by RP-HPLC. Fluorescein isothiocyanate (4 eq.) Is added and the medium is stirred under nitrogen and protected from light overnight.
  • the medium is diluted in water, lyophilized and purified by RP-HPLC [gradient: 100: 0 to 85:15 (A / B) for 15 minutes, then 85:15 to 80:20 (A / B) for 15 minutes, then isocratic gradient] to give 2.38 mg (72% yield) of ligand 41F in the form of a white powder.
  • the mixture is added to the reaction medium containing the peptide compounds.
  • the pH of the mixture is adjusted to 8-8.5 by adding solid K 2 CO 3 .
  • the mixture is stirred under nitrogen and protected from light for 24 h, at room temperature, diluted in water, lyophilized and purified by RP-HPLC to give the ligands 42F, 43F or 44F.
  • ligand 42F are obtained in the form of a white powder, after purification by RP-HPLC HPLC [gradient: 100: 0 to 82:18 (A / B) for 18 minutes, then 82:18 to 72:28 (A / B) for 30 minutes], followed by lyophilization. His analysis is as follows: ESI-MS found 3620.0, calculated 3621.0; m / z 1207.7 (M + 3H) 3+ , 1001.8 (M + 3H-C 25 H 38 N 5 On) 3+ , 905.9 (M + 4H) 4+ .
  • ligand 44F are obtained in the form of a white powder, after purification by RP-HPLC HPLC [gradient: 100: 0 to 82:18 (A / B) for 18 minutes, then 82:18 to 75:25 (A / B) for 21 minutes, then isocratic gradient], followed by lyophilization. His analysis is as follows: ESI-MS found 4016, calculated 4017.6; m / z 1339.9 (M + 3H) 3+ , 1005.2 (M + 4H) 4+ , 804.4 (M + 5H) 5 * .
  • B 1 represents an acid (-) - quinic residue
  • Y represents the remainder of an antigen
  • A represents the remainder of a dendrimer A 'comprising 8 (in the case of ligand 51 represented in FIG. 10) or 4 (in the case of ligand 52 represented in FIG. 11) L-lysine residues,
  • ligands are obtained by ligation of derivatives of quinic acid, namely quinic acid functionalized by a thiol function (compound G), to a lysine dendrimer (dendrimer H or I) and to a peptide antigen (J antigen or K), according to the protocol described below.
  • a) Preparation of the quinic acid derivative (compound G. Figure 8).
  • Compound G represents 2- ⁇ N, N-di - [(l-> n, 3-K, 4.s n , 5.r?) - 1,3,4,5-tetrahydroxycyclohexane-l- disulfide carboxamido-l-yl] ethyl ⁇ .
  • the reaction medium is stirred for 1 h, then added to 0.1 mmol of an amino-PEGA resin (0.4 mmol / g) soaked in a minimum amount of DMF, the resin having, beforehand, been neutralized by 5% DIEA in the CH 2 C1 2 (2 x 1 minute) and DMF (3 x 1 minute).
  • BOP 177 mg, 4 eq. Is then added to DMF (1 ml) and the mixture obtained is stirred at room temperature for 40 minutes.
  • the resin is washed with DMF (4 x 2 minutes) and CH 2 C1 2 (2 x 2 minutes). It is soaked in DMF and acylated with 1,3-diaminopropane (0.65 ml) at room temperature for 1 h.
  • Fmoc- ⁇ -Ala-OH is first coupled to the resin.
  • the lysine residues are then introduced: the first lysine introduced is protected by a Boc group, the other lysines being added in the form of their derivatives Fmoc-
  • Boc groups of ⁇ -NH 2 of the first lysine residue and of the isopropylidene group of the spacer arm fixed on the support are removed by treatment with a TFA-H 2 O-anisole 95: 2.5: 2.5 (10 ml) mixture, for 2 h at room temperature.
  • the peptidyl-resin is washed with CH 2 C1 2 (5 x 1 minute) and with Et 2 O (2 x 1 minute), then dried and soaked in aqueous AcOH. NaIO 4 is added
  • the epitopes (peptide sequences designated HA 307 "319 and ⁇ 830 - 846 in FIG. 8) are synthesized on a scale of 0.25 mmol using a resin
  • the protective group of the side chains of Fmoc-L-Lys-OH is the Boc group; the protective group for Fmoc-L-Ser-OH, Fmoc-L-Glu-OH, Fmoc-L-Thr-OH, Fmoc-L-Tyr-OH and Fmoc-
  • L-Asp-OH are tert-butyl; the protective group for Fmoc-L-Asn-OH, Fmoc-
  • L-Gln-OH and Fmoc-L-His-OH is the trityl group; the protective group for Fmoc-L-Arg-OH is the 2,2,4,6,7-pentamethyldihydrobenzofuran-5-sulfonyl group.
  • the peptide is separated from the support and deprotected using the TFA-anisole-H 2 O 95: 2.5: 2.5 mixture (10 ml), for 3 h at room temperature, precipitated in cold diethyl ether, centrifuged, dissolved in water and freeze-dried.
  • the peptide is separated from the support and deprotected using the TFA-iPr 3 SiH-H 2 O 95: 2.5: 2.5 mixture (10 ml), for 1.5 h,
  • Ligand 52 is then isolated as described above for ligand 51. 0.71 mg of ligand 52 (yield of 42%) are obtained, in the form of a white powder, after purification by RP-HPLC [gradient: 100: 0 to 75:25 (A / B) for 20 minutes, then 75:25 to 60:40 (A / B) for 30 minutes] and lyophilization. Its analysis by positive ESI-MS is as follows: calculated 3913.6, found 3912; m / z: 1305.0 [M + 3H] 3+ , 979.1 [M + 4H] 4+ , 783.6 [M + 5H] 5+ .
  • B 1 represents an acid (-) - quinic residue, • M represents an amide function (-CO-NH-),
  • A represents the remainder of a linear polyethyleneimine polymer (PEI), were prepared by condensation of PEI on quinic acid 1,5-lactone ( ⁇ -lactone resulting from the esterification between the carboxyl group carried by the carbon located in position 1 and the hydroxyl group located in position 5 of (-) - quinic acid), according to the following protocol.
  • PEI linear polyethyleneimine polymer
  • D (-) - quinic acid (Aldrich) is transformed into bicyclic 1,5- ⁇ -lactone (also called “quinide”) by heating in toluene, in the presence of j-toluenesulfonic acid, as described in particular by HOL FISCHER in Chem. Ber., 1921, 54, 775-785, by M. PHILIPPE et al in J. Antibiotics, 1982, 25, 1507-1512 and by PQ HUANG et al in Tetrahedron Lett., 1995, 36, 8299-8302.
  • the lactone (10.1 mg, 58.1 ⁇ mol) reacts with 50 mg of PEI (25 kDa, Aldrich), which corresponds to 1162 ⁇ mol of amino groups, assuming a weight average molecular weight of 43 Da for the repetitive unit of the IEP.
  • the reaction is carried out in 2 ml of water, for 24 h and at 50 ° C.
  • the reaction medium is then diluted and lyophilized.
  • PEI is obtained substituted, at a rate of 5%, with quinic acid (hereinafter referred to as "5% QuinPEr”).
  • 5% QuinPEr quinic acid
  • PEI is obtained substituted, at a rate of 10%, with quinic acid (hereinafter referred to as "10% QuinPEr").
  • the completion of the reaction is indicated, by ⁇ and 13 C NMR analysis of the reaction medium, by the absence of the signal corresponding to the quinide (the condensation of the quinide on the PEI in fact results in the opening of the cycle of lactone).
  • the results were confirmed by quantitation of the amount of quinic acid coupled on the PEI conducted by ⁇ NMR spectroscopy on samples of the products obtained, purified by ultrafiltration on Amicon membranes ® (30000 Da, Millipore).
  • the quinic acid content of the PEI is confirmed by comparing the peak surfaces of the CH 2 protons of the polymer backbone and of the H-4, H-5 and H-6 protons of the quinic acid residues.
  • PEI is a branched polymer with secondary and primary amines.
  • the study of the N NMR specfre makes it possible to distinguish the quinic acids linked via a secondary or tertiary amide bond (the latter being indicated by an index ').
  • 5% QuinPEI and 10% Quin PEI respectively contain 30 and 26% of quinic acid residues connected via a tertiary amide bond, the rest being secondary amide bonds.
  • the internal reference is the sodium salt of 3- (trimethylsilyl) acid [2,2,3,3- dYI propionic.
  • the biological activity of the ligands in accordance with the invention has been verified by a series of in vitro experiments aimed at testing their ability to be internalized, via the mannose receptor, by dendritic cells obtained from human peripheral blood.
  • Compound 30F was prepared according to an operating protocol consisting of:
  • Compound 31F was, in turn, prepared by treating a compound 15 with 2-thioethyl- ⁇ , D-mannopyranoside, then reacting the resulting compound with FITC. b) Obtaining dendritic cells.
  • the dendritic cells were obtained by differentiation of monocytes, themselves isolated from mononuclear cells of human peripheral blood, according to a protocol derived from that described by AVRAMEAS et al. (Eur. J. Immunol, 1996, 26, 394-400). To do this, the mononuclear cells present in human peripheral blood samples (supplied by the Establishment of Blood Transfusion of Nord-Pas de Calais, FRANCE) were separated from the other elements of the blood by centrifugation in density gradient Ficoll / Passover (PHARMACIA company), then washed 3 times, by centrifugation, with RPMI 1640 medium (GIBCO company) containing 3 mM EDTA.
  • the mononuclear cells thus isolated were suspended, at 37 ° C. and under an atmosphere at 5% CO 2 , in a culture medium comprising RPMI 1640 medium supplemented with 5.10 * 5 M of ⁇ -mercaptoethanol (Company MERCK), 2 mM of L-glutamine (Company MERCK), 1 mM of sodium pyruvate (Company GIBCO), 10% of fetal calf serum inactivated by heat (GIBCO company), 100 IU / ml of penicillin and per 100 ⁇ g / ml of streptomycin (both from the company SPECIA).
  • a culture medium comprising RPMI 1640 medium supplemented with 5.10 * 5 M of ⁇ -mercaptoethanol (Company MERCK), 2 mM of L-glutamine (Company MERCK), 1 mM of sodium pyruvate (Company GIBCO), 10% of fetal calf serum inactivated by heat (
  • the resulting suspension was distributed over 10 cm diameter petri dishes, at a rate of 8 to 12 ⁇ 10 7 cells per disc.
  • Monocyte enrichment was obtained by allowing these cells to adhere to the dishes, at 37 ° C. and in a humidified CO 2 (5%) incubator, for 3 to 4 hours.
  • the adherent cells were re-cultured in the medium described above, but also comprising 800 U / ml of growth factor from recombinant human granulocytic and macrophagic lines (Company PEPRO TECH) and 1000 U / ml of recombinant human interleukin-4 (Company PEPRO TECH), at a rate of 10 6 cells per ml of medium.
  • step b) above clearly present the surface antigens characteristic of dendritic cells
  • part of these cells were washed 2 times with PBS buffer containing 0.03 mg / ml of bovine serum albumin, then incubated, on ice and for 30 minutes, with a mouse monoclonal antibody directed against the human mannose receptor and conjugated with phycoerythrin (Company BECTON DICKINSON) and: either a monoclonal antibody mouse directed against the human CD antigen, which represents one of the main surface antigens of dendritic cells, namely a mouse monoclonal antibody directed against the human CD 14 antigen, which represents one of the antigens monocyte surface and macrophages, these last two antibodies being labeled with FITC (BECTON DICKINSON Company).
  • methyl-quinate is a mimic of mannose in internalization with the mannose receptor of dendritic cells
  • competition between methyl-quinate, or methyl- ⁇ -D-mannopyranoside (serving as inhibition control ), and compound 31F is studied according to the following protocol: the dendritic cells are recovered, washed with PBS buffer, preincubated at 37 ° C., then incubated for 20 minutes, at 37 ° C., with solutions of increasing concentrations of methyl -quinate and compound 31F (in final concentration of 5 ⁇ M). The cells are then washed with PBS, fixed in 1% paraformaldehyde, then analyzed by flow cytofluorometry, as described in c) above.
  • non-adherent cells collected in step b) above were washed 2 times with PBS buffer containing 1 mM of chloride calcium. Following which, these cells were preincubated, at 37 ° C and for 10 minutes, then incubated, at 37 ° C and for 20 minutes, with different solutions each containing one of the compounds to be tested, at a concentration between 1 and 10 ⁇ M. The cells were then washed 3 times with cold PBS buffer and fixed for 20 minutes in 2% paraformaldehyde. The fluorescence associated with these cells was then assessed by a FACScan analysis using the abovementioned cytometer.
  • these tests were repeated by preincubating the cells in the presence of mannan solutions extracted from Saccharomyces cerevisiae (Company SIGMA), mannan being, in fact, known to be selectively internalized via the mannose receptor.
  • mannan solutions extracted from Saccharomyces cerevisiae Company SIGMA
  • the dendritic cells are recovered, washed with PBS buffer, incubated at 37 ° C., then preincubated for 20 minutes, at 37 ° C., in the presence of mannan solutions extracted from Saccharomyces cerevisiae of concentrations between 10 " * and 10 mg / ml.
  • ligands 23 F and 24F (in a final concentration of 5 ⁇ M) are added (incubation: 20 minutes at 37 ° C.)
  • the cells are washed with PBS, fixed in 1% paraformaldehyde and analyzed. by flow cytofluorometry, as described in c) above f) Influence of the number of mannose mimes carried by the ligands in accordance with the invention on the internalization of these ligands
  • the optimal construction i.e.
  • the dendritic cells are incubated for 20 min nutes at 37 ° C with 10 ⁇ M of ligands comprising 2, 4 or 8 residues of mannose, quinic acid or shikimic acid (di-, tetra- or octavalent ligands). After fixation in paraformaldehyde, the cells are analyzed by flow cytofluorometry, as described in c) above.
  • ligands carrying shikimic acid residues 34F (divalent ligand), 21F (tetravalent ligand) and 23F (octavalent ligand),
  • ligands carrying quinic acid residues 33F (divalent ligand), 22F (tetravalent ligand) and 24F (octavalent ligand).
  • Figure 12 illustrates the ability of methyl quinate to inhibit the internalization of compound 31F. The percentages are shown on the ordinate inhibition, calculated by the formula:
  • MnX represents the mean value of the fluorescence intensity
  • MnX 3 IF represents the signal due to the internalization of the compound 31F alone
  • MnX mqui represents the signal due to the internalization of the compound 31F in the presence of different concentrations (expressed in mM) of methyl quinate, indicated on the abscissa.
  • the curve indicated by the symbols - * - represents the inhibition of the internalization of the compound 31F by methyl quinate, and the curve indicated by the symbols - represents the inhibition of the internalization of the compound 31F by methyl - ⁇ -D-mannopyranoside, compound serving as inhibition control.
  • FIG. 13 illustrates, in the form of curves, the average values of the fluorescence intensities presented by the dendritic cells after an incubation in the presence of solutions comprising respectively from 1 to 10 ⁇ M of ligand 23F (- • -), of ligand 24F ( - • * -), of compound 30F (- ⁇ -) and of compound 31F (-D-).
  • solutions comprising respectively from 1 to 10 ⁇ M of ligand 23F (- • -), of ligand 24F ( - • * -), of compound 30F (- ⁇ -) and of compound 31F (-D-).
  • AU average values of the fluorescence intensities
  • abscissa the concentrations of the solutions.
  • Figure 13 shows that an incubation of dendritic cells, for a duration of 20 minutes and carried out in the presence of a solution dosed with 1 ⁇ M of ligand 23F or of ligand 24F is sufficient to obtain an internalization of these ligands by these cells. . It also shows that this internalization is specific since the compound 30F (carrying polyhydroxylated chains) practically does not penetrate into the dendritic cells, and this whatever the dose of this compound used for the incubation of these cells, whereas the compound 31F (carrier of D-mannose residues) is found very widely in said dendritic cells. Furthermore, FIG.
  • Figure 14 shows that the internalization, by dendritic cells, of ligands 23F and 24F, as well as that of compound 31F decreases drastically as the concentration of mannan increases. This indicates the existence of a strong competition between these ligands and the mannan with respect to the mannose receptor and confirms that the internalization of the ligands in accordance with the invention by dendritic cells is effected by the mannose receptor. c) Influence of the number of mannose mimes carried by the ligands in accordance with the invention on the internalization of these ligands.
  • Figure 15 shows, on the ordinate, the percentage of specific internalization of the di-, tetra- or octavalent ligands (abscissa) by the mannose receptor.
  • the tetra- or octavalent ligands are preferably internalized by the mannose receptor, compared to the divalent ligands.
  • the optimal structures sought are those comprising 4 mimes of mannose, which are more easily synthesized than those comprising 8 mimes of mannose.
  • Dendritic cells differentiated from mononuclear cells in the presence of IL-4 and the growth factor GM-CSF, are used on D + 5. They are incubated for 45 minutes at 4 ° C with 10 ⁇ g of human receptor anti-mannose (PHARMIGEN) and 5 ⁇ M of one of the following constructions:
  • 61F ( Figure 16): dendrimer consisting of 4 L-lysine residues carrying 4 residues of D-mannose, as well as a fluorescein molecule (FITC). Construction 61F was prepared like compound 31F (cf. example 8, paragraph a), but by reacting 2-thioethyl- ⁇ , D-mannopyrannoside with a compound
  • 21F, 22F and 64F constructions carrying respectively residues of shikimic acid, quinic acid and polyhydroxylated chains of galacto configuration (coming from molecules of galactonolactones).
  • Construction 64F was prepared like compound 30F (cf. example 8, paragraph a), but using a compound 13 for coupling (cf. example 1, paragraph 1.1).
  • the preparation of ligands 21F and 22F is described in Example 2 above.
  • Structure 61 F serves as a positive control, while structure 64F serves as a negative control.
  • the structures 21F and 22F represent ligands in accordance with the present invention.
  • the cells are placed at 37 ° C for 5 minutes. After incubation, they are fixed for 45 minutes at 4 ° C. with a solution of the following composition: PBS (0.1 mM MgCl 2 , 0.1 mM Ca 2 ), paraformaldehyde at 4%, sucrose. The fixing reaction is stopped using an ammonium chloride solution (50 mM), for 10 minutes and at room temperature. The cells are washed 3 times with PBS, then deposited on poly-L-lysine slides.
  • the fluorescein signal is amplified by incubation at 37 ° C for 30 minutes with a Rabbit anti-FITC IgG coupled to Alexa Fluor 488 (dilution: 1/200 th ) (MOLECULAR PROBES) at the same time as the incubation with the second goat antibody, anti-mouse IgG coupled to Alexa Fluor 568 (dilution: 1/500 th ) (MOLECULAR PROBES), allowing the detection of ranti-mannose receptor.
  • Incubation with the second antibodies is carried out in PBS, BSA (1 mg / ml), saponin (0.05%) medium.
  • the cells are washed with PBS containing 1 mg / ml of BSA and 0.05% of saponin, then with PBS / BSA and finally with PBS, then mounted between slide and coverslip in VECTASHIELD mounting medium.
  • the observation of the slides is carried out by confocal microscopy on a LEICA TCS NT device having a Krypton / Argon laser (excitation 488, 468 and 647).
  • the acquisition of the two wavelengths (namely the acquisition of the fluorescence emitted by the Alexa 568, corresponding to the mannose receptor, and the acquisition of the fluorescence emitted by the Alexa 488, corresponding to the structures tested) is performed simultaneously and the superposition of the two images makes it possible to view the two markers at the same time, on the same cell section, carried out along the z axis of the cell.
  • Cos-1 cells which do not express the mannose receptor in their native state, are transfected with the plasmid CD8 containing a coding sequence for the mannose receptor (MR). 48 hours after transfection, the cells are collected: 10 to 15% of them express the transgene. In what follows, these cells are called “Cos MR”.
  • 22F dendrimer consisting of 4 L-lysine residues carrying 4 residues of quinic acid, as well as a fluorescein molecule (FITC). It is a ligand in accordance with the present invention.
  • 64F construction carrying polyhydroxylated chains of galacto configuration (negative control).
  • test c) incubation of Cos MR cells with compound 22F
  • test d incubation of Cos-1 cells (not transfected) with compound 22F.
  • the non-transfected Cos-1 cells do not, of course, give rise to internalization of compound 22F: the detected signal is comparable to the background noise of the device.
  • the detected signal is comparable to the background noise of the device.
  • Test b) shows the inhibition of the internalization of compound 22F by the mannan.
  • construct 22F it is well internalized in a specific manner by the cells transfected by the MR receptor (test c).

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Abstract

La présente invention se rapporte à l'utilisation des acides quinique, shikimique et de leurs dérivés pour la préparation de ligands du récepteur du mannose, aux ligands ainsi préparés, ainsi qu'aux applications de ces ligands, notamment pour la préparation de médicaments et, plus particulièrement pour la préparation de vaccins et de médicaments destinés à assurer la vectorisation d'un principe actif vers des cellules cibles exprimant le récepteur du mannose ou un récepteur lui étant apparenté, la transfection de séquences d'ADN et d'ARN et ses multiples utilisations en thérapie génique, et la préparation de réactifs de laboratoire, notamment de réactifs de diagnostic.

Description

UTILISATION DES ACIDES QUINIQUE, SHIKIMIQUE ET DE LEURS DERIVES POUR LA PREPARATION DE LIGANDS DU RECEPTEUR DU
MANNOSE
La présente Invention se rapporte à l'utilisation des acides quinique, shikimique et de leurs dérivés pour la préparation de ligands du récepteur du mannose, aux ligands ainsi préparés, ainsi qu'aux applications thérapeutiques et diagnostiques de ces ligands.
Les cellules dendritiques, qui représentent une lignée particulière de leucocytes originaires de la moelle osseuse et qui sont présentes dans pratiquement tous les tissus de l'organisme, jouent un rôle clé dans le contrôle des réponses immunitaires. En effet, ces cellules apparaissent être les seules cellules capables in vivo de présenter les antigènes aux lymphocytes T naïfs et matures, et d'induire, par activation de ces lymphocytes T, une réponse immunitaire de type T auxiliaire (J. BLANCHEREAU et R.M. STEINMANN, Nature, 1998, 392, 245-252). L'activation des lymphocytes T par les ' cellules dendritiques implique une reconnaissance et une internalisation préalables des antigènes par ces dernières. Or, il a été montré que l'internalisation des antigènes par les cellules dendritiques s'effectue non seulement par macropinocytose, mais également par un mécanisme d'endocytose ayant pour médiateur, un récepteur spécifique des hydrates de carbone et dénommé récepteur du mannose (A. AVRAMEAS et a , Eur. J. Immunol, 1996, 26, 394-400).
Le récepteur du mannose appartient à la famille des C-lectines qui représente un groupe de glycoprotéines calcium-dépendantes formant des liaisons non-covalentes avec les hydrates de carbone. Si, comme son nom l'indique, le récepteur du mannose se lie préférentiellement au D-mannose, il apparaît se lier également à d'autres hydrates de carbone comme le L-fucose, le D-glucose et la N-acétyl-D-glucosamine qui, comme le D-mannose, comprennent deux fonctions hydroxyles portées par deux atomes de carbone adjacents du cycle qui les constitue. Il semble que la liaison entre le récepteur du mannose et ces hydrates de carbone s'établisse par la coordination d'un ion calcium entre des résidus acide aminé du site de reconnaissance de ce récepteur et les deux fonctions hydroxyles adjacentes desdits hydrates de carbone (W.I. WEIS et a , Nature, 1992, 360, 127-134). Par ailleurs, comme c'est le cas pour toutes les lectines, la reconnaissance des hydrates de carbone par le récepteur du mannose, bien que spécifique, est faible, de l'ordre de 10"6 à 10"3 M. La liaison simultanée de plusieurs molécules d'hydrates de carbone à plusieurs sites de reconnaissance du récepteur du mannose permet de compenser cette faible affinité. Ce phénomène est appelé « effet de groupe ».
Il a également été montré, non seulement que l'internalisation, par les cellules dendritiques, d'antigènes mannosylés est notablement supérieure à celle d'antigènes non-mannosylés, mais qu'une culture de populations clonales de lymphocytes T de spécificité restreinte à certains complexes peptide-HLA de classe II, réalisée en présence, d'une part, de cellules dendritiques et, d'autre part, de protéines ou de peptides mannosylés se traduit par une stimulation de ces lymphocytes de 200 à 10 000 fois plus élevée que celle obtenue lorsque ces mêmes protéines et peptides ne sont pas mannosylés (M.C.A.A. TAN et a , Eur. J. Immunol, 1997, 27, 2426-2435). II est apparu, de ce fait, possible d'induire, de stimuler ou de moduler une réponse immunitaire en favorisant rinternalisation d'un antigène par les cellules dendritiques via le récepteur du mannose, par le couplage de cet antigène avec une structure chimique porteuse de plusieurs molécules d'un hydrate de carbone spécifiquement reconnu par ce récepteur (M.C.A.A. TAN et al, ibid.). Ceci présente un intérêt tout particulier en vaccinologie et notamment pour le développement de vaccins à base de peptides synthétiques. En effet, si ces derniers présentent l'avantage d'être à la fois chimiquement définis, de composition précise, affranchis des difficultés de la production biologique, purifiés et, enfin, de distribution aisée en raison de leur stabilité, ils présentent généralement l'inconvénient majeur d'être faiblement immunogènes.
C'est ainsi que les Inventeurs ont proposé de modifier des antigènes peptidiques en les greffant sur une structure dendrimérique comprenant un cœur de type arbre de L-lysine lié à plusieurs restes glycosyles et, notamment, à des restes D-mannose (C. GRANDJEAN et a , l lè e Réunion Peptides et Protéines, 17-22 Janvier 1999, AUSSOIS, FRANCE).
Toutefois, il apparaît que, dans l'optique du développement à une échelle industrielle d'un médicament et, notamment, d'un vaccin, l'utilisation d'hydrates de carbone naturels comme le D-mannose ou le D-glucose, est susceptible de poser un certain nombre de difficultés, tant sur un plan technique que financier, en raison de ce que ces composés sont difficiles à lier à d'autres structures chimiques et sont instables dans de nombreux milieux réactionnels - en particulier, dans les milieux acides - et dans de nombreux milieux biologiques.
Le problème se pose, par conséquent, de disposer de composés présentant, vis-à-vis du mannose récepteur, une affinité et une spécificité telles qu'ils puissent être reconnus par ce récepteur et se lier sélectivement avec lui, tout en étant dépourvus des inconvénients propres aux hydrates de carbone naturels. Or, les Inventeurs, toujours dans le cadre de leurs recherches sur le récepteur du mannose, ont constaté que, de manière surprenante, les acides quinique, shikimique et leurs dérivés qui représentent, de par leur nature carbocyclique, des composés chimiquement plus stables que les hydrates de carbone naturels, et donc plus faciles à utiliser dans des processus de synthèse, sont capables de mimer le D-mannose vis-à-vis de son récepteur, c'est-à-dire de se lier sélectivement à ce dernier, et par conséquent de remplacer avantageusement les hydrates de carbone naturels dans la préparation de ligands destinés à favoriser l'internalisation d'une substance par des cellules exprimant ce récepteur ou un récepteur de la famille des C-lectines lui étant apparenté. La présente Invention a donc pour objet l'utilisation d'au moins un composé répondant à la formule générale (la) et/ou d'au moins un composé répondant à la formule générale (Ib) :
Figure imgf000004_0001
(la) (Ib) dans lesquelles :
- Ri, R2, R3 et Rt représentent, indépendamment les uns des autres, un atome d'hydrogène ou un groupe protecteur, - R5 représente un groupe -OH, un groupe -SH, un groupe -NH-NH2, un atome d'halogène, ou une chaîne carbonée linéaire, ramifiée ou cyclique, saturée ou insaturée, comprenant de 1 à 18 atomes de carbone et éventuellement de 1 à 12 atomes choisis parmi l'oxygène, le soufre et l'azote, ladite chaîne carbonée étant éventuellement substituée par 1 à 16 atomes d'halogène et portant éventuellement au moins un groupe nucléophile ou au moins un groupe électrophile, en tant que ligand du récepteur du mannose ou de tout récepteur de la famille des C-lectines apparenté au récepteur du mannose, ou pour la préparation d'un tel ligand. Au sens de la présente Invention, on entend par groupe
«protecteur » un groupe protecteur d'une fonction hydroxyle ou d'un diol (auquel cas deux groupes choisis parmi Ri, R2, R et R peuvent être reliés de façon covalente l'un à l'autre pour former ensemble un cycle), tel que défini dans l'ouvrage Protective Groups in Organic Synthesis, T.W. GREENE et P.G.M. WUTS, Seconde Edition 1991, J. WJXEY and Sons. A titre d'exemples et de façon non-limitative, on peut citer les groupes triméthylsilyle, triéthylsilyle, triisopropylsilyle, tertiobutyldiméthylsilyle, tertiobutyldiphénylsilyle, triméthylsilyléthyléther, terr-butoxyméthyle, méthoxy- méthyle, benzyloxyméthyle, 2-méthoxyéthoxyméthyle, méthylthiométhyle, acétyle, ou 2',3'-diméthoxybutane-2',3'-diyle. Par ailleurs, on entend par groupe « nucléophile » un groupe possédant une paire d'électrons libres, c'est-à-dire un groupe donneur d'électrons, et par groupe « électrophile » un groupe possédant une orbitale moléculaire vacante de faible énergie capable d'interagir avec la paire d'électrons libres d'un groupe nucléophile. La présence d'au moins un groupe nucléophile ou électrophile dans les composés de formules (la) et (Ib) permet avantageusement leur incorporation dans d'autres structures, telles que des structures porteuses, en faisant réagir ce groupe nucléophile ou électrophile avec des fonctions réactives correspondantes portées par ladite structure, comme cela sera décrit en détails ci-après.
Dans le cadre de la présente Invention, le groupe nucléophile est, de préférence, choisi parmi les groupes aminés, thiols, β-aminothiols, alcools, hydrazide et dérivés d' hydrazide, hydrazine et dérivés d'hydrazine, hydroxylamine et dérivés d'hydroxylamine, tandis que le groupe électrophile est, de préférence, choisi parmi les groupes α-oxo-aldéhydes, -CORa (avec par exemple Ra = H, halogène, imidazolyle, hétérocycle aromatique), -CO2R (avec par exemple Ra = H, aryle, succinimidyle, sulfosuccinimidyle, hétérocycle aromatique) et ses dérivés (anhydrides symétriques, anhydrides mixtes, esters activés), -OCORa (avec par exemple Ra = halogène, imidazolyle, hétérocycle aromatique), -OCO2Ra (avec par exemple Ra = aryle, hétéroaryle, succinimidyle, sulfosuccinimidyle), -OCSRa (avec par exemple Ra = halogène, imidazolyle, hétérocycle aromatique), -OCSORa (avec par exemple Ra = aryle, succinimidyle, sulfosuccinimidyle, hétérocycle aromatique), -NRaCOR (avec par exemple Ra = méthyle et Rb = halogène, imidazolyle, hétérocycle aromatique), -NRaCOORb (avec par exemple Ra = H et Rb = aryle, succinimidyle, sulfosuccinimidyle), -NRaCSRb (avec par exemple Ra = H et Rb = halogène, imidazolyle, hétérocycle aromatique), -NRaCSORb (avec par exemple Ra = H et Rb = aryle, succinimidyle, sulfosuccinimidyle), -NCO, -NCS, maléimide et halogénures d'alkyles. A titre d'exemples et de façon non-limitative, dans les formules générales (la) et (Ib) :
- des atomes d'halogène convenables sont le brome, le chlore et le fluor ; et
- des chaînes carbonées convenables sont des groupes alkyles (méthyle, éthyle, propyle, isopropyle, tertiobutyle, pentyle, ...), des groupes alkenyles
(vinyle, allyle, butényle, pentényle, ...), des groupes alkynyles (éthynyle, propynyle, butynyle, pentynyle, ...), des groupes cycloalkyles (cyclopentyle, cyclohexyle, ...), des hétérocycles (pipérazine, ...), des groupes aryles (phényle, crésyle, ...), des groupes hétéroaryles (pyridine, pyrimidine, pyrazine, ...), des groupes polyéthylèneglycols ou encore des polyamines.
Les composés répondant aux formules générales (la) et (Ib) constituent des mimes du D-mannose. Ils peuvent être utilisés, en tant que tels, comme ligands du récepteur du D-mannose, ou être liés à d'autres composés pour conduire à l'obtention de ligands au sein desquels ils joueront le rôle de mimes du D-mannose. Aussi, s'il convient que, dans les ligands tels que prêts à être utilisés, les composés de formules générales (la) et (Ib) présentent au moins deux fonctions hydroxyles libres vicinales, de manière à être en mesure de mimer le D-mannose et à permettre à ces ligands d'être reconnus par le récepteur du mannose et de se lier à ce dernier, il n'est toutefois pas nécessaire que ces composés présentent initialement deux fonctions hydroxyles vicinales libres.
Ainsi, conformément à l'Invention, il est tout à fait possible d'utiliser, pour la préparation d'un ligand, au moins un composé de formule (la) et/ou au moins un composé de formule (Ib) comprenant, sur deux atomes de carbone adjacents du cycle, deux groupes hydroxyles protégés par un groupe protecteur, les autres groupes portés par les atomes du cycle pouvant être éventuellement eux aussi protégés. Cela sera même souhaitable dans un certain nombre de cas, notamment pour éviter que des groupes portés par les atomes de carbone du cycle du composé de formule générale (la) ou (Ib) n'interfèrent lors du couplage dudit composé pour conduire à des cyclisations intramoléculaires ou des dimérisations. Bien entendu, les groupes protégeant les deux fonctions hydroxyles portées par les deux atomes de carbone adjacents du cycle seront éliminés préalablement à toute utilisation du ligand, l'élimination des autres groupes protecteurs étant facultative.
Selon une disposition préférée de l'Invention, les composés de formules générales (la) et/ou (Ib) sont choisis de telle sorte que les groupes -OR2 et -OR3 soient en relation trans, de manière à mimer les deux hydroxyles portés par le cycle du D-mannose qui apparaissent être impliquées dans la liaison entre ce composé et son récepteur.
De préférence, les composés de formule (la) et/ou (Ib) sont tels que R5 représente un groupe hydroxyle (auquel cas le cycle porte, en position 1, un groupe carboxyle).
En effet, la présence d'un groupe carboxyle sur le cycle des composés de formules (la) et (Ib) offre l'avantage de conférer à ces composés de nombreuses possibilités de couplage, par exemple par l'intermédiaire d'une liaison de type amide, ester, thioester, hydrazide ou hydroxamate. Par ailleurs, ces couplages peuvent être aisément réalisés par une simple activation de ce groupe carboxyle selon les techniques d'activation classiquement utilisées pour la synthèse peptidique et, notamment, pour la synthèse peptidique sur support solide. Ces techniques sont décrites, par exemple, dans l'ouvrage The Practice of Peptides Synthesis, M. et A. BODANSKY, 1984, SPRINGLER-VERLAG, Berlin. Selon une disposition particulièrement préférée de l'Invention, le composé de formule (Ib) est tel que Ri, R2 et R3 représentent des atomes d'hydrogène et R représente un groupe hydroxyle (-OH). Si, en outre, les groupes -ORi et -OR2 se trouvent en relation cis, et les groupes -OR2 et -OR3 se trouvent en relation trans, la configuration étant 3R, 4S et 5R, le composé résultant consiste en de l'acide (-)-shikimique (ou acide 3,4,5-trihydroxy-l-cyclohexène-l-carboxylique).
Selon une autre disposition préférée de l'Invention, le composé de formule (la) est tel que Ri, R2, R3 et R représentent des atomes d'hydrogène et R5 représente un groupe hydroxyle (-OH). Si, en outre, les groupes -OR2 et -OR3 se trouvent en relation trαns, alors que les groupes -ORi et -OR se trouvent chacun en relation cis par rapport au groupe -OR2, et la configuration est lsn, 3R, 4s„ et 5R, alors le composé résultant consiste en de l'acide (-)-quinique (ou acide 1,3,4,5-tétrahydroxy- cyclohexane-carboxylique).
Les acides (-)-shikimique et (-)-quinique sont disponibles commercialement, par exemple auprès des Sociétés ALDRICH ou ACROS.
Selon encore une autre disposition préférée de l'Invention, le composé de formule (la) est tel que Ri, R2, R3 et R représentent des atomes d'hydrogène et R5 représente un groupe -NH-(CH2)2-SH. Il s'agit alors d'un dérivé de l'acide quinique. D'une manière générale, il est bien entendu que les formules (la) et
(Ib), qui représentent les acides quinique et shikimique et certains de leurs dérivés, obtenus par substitution des hydroxyles portés aux positions 2, 3 et 4 (et éventuellement en position 1) du cycle, et par substitution de la fonction carbonyle située en position 1 du cycle (groupe R5), ne sont pas limitatives, et que tout autre dérivé des acides quinique et shikimique pourrait être utilisé sans sortir du cadre de la présente Invention.
La présente Invention a également pour objet un composé utile en tant que ligand du récepteur du mannose ou de tout récepteur de la famille des C-lectines apparenté au récepteur du mannose, ou en tant que composé intermédiaire pour la préparation d'un tel ligand, lequel composé étant caractérisé en ce qu'il répond à la formule générale (III) ci-après : (B'M)m(XN)nA(PY)v (ffl) dans laquelle : - B1 répond à une ou plusieurs formules générales (Ha) ou (Ilb) ci-après
Figure imgf000009_0001
(Ha) (Ilb)
où W représente une liaison ou une chaîne carbonée linéaire, ramifiée ou cyclique, saturée ou insaturée, comprenant de 1 à 18 atomes de carbone et éventuellement de 1 à 12 atomes choisis parmi l'oxygène, le soufre et l'azote, ladite chaîne carbonée étant éventuellement substituée par 1 à 16 atomes d'halogène,
- X représente le reste d'un oligopeptide X' comprenant de 1 à 6 acides aminés,
- A représente le reste d'un composé A' au moins difonctionnel,
- Y représente le reste d'un composé d'intérêt Y',
- m est un nombre entier compris entre 1 et 32, - n est un nombre entier compris entre 0 et 32,
- y est un nombre entier compris entre 1 et 4, et
- M, N et P représentent chacun un groupe de liaison, respectivement entre B et A quand n = 0 ou B1 et X quand n est différent de 0, entre X et A quand n est différent de 0, et entre A et Y, et comprennent, indépendamment les uns des autres, une fonction choisie parmi les fonctions oxime, hydrazone, amide, ester, thioester, hydrazide, hydroxamate, éther, thioéther, aminé, carbonate, carbamate, thiocarbonate, thiocarbamate, urée, thiourée et thiazolidine.
Dans la formule (III), ainsi que dans tout ce qui suit, des exemples d'atomes d'halogène et de chaînes carbonées convenables sont tels que décrits précédemment en rapport avec les composés de formules générales (la) et (Ib). Le composé répondant à la formule générale (III) comprend donc :
* en tant qu'éléments obligatoires :
• un ou plusieurs restes B1 répondant chacun à l'une des formules générales (lia) ou (Ilb), ce ou ces restes étant destinés à jouer le rôle de mimes du D-mannose vis-à-vis du récepteur du mannose et résultant de la liaison entre un ou plusieurs composés répondant à la formule générale (la) et/ou (Ib) précédemment définie et le composé A', éventuellement via X et de la déprotection des groupes hydroxyles, dans le cas où le ou lesdits composés de formule générale (la) et/ou (Ib) présente initialement des groupes hydroxyles protégés ;
• un ou plusieurs restes Y d'un composé Y' correspondant à un composé d'intérêt ;
• le reste A d'un composé A' présentant au moins une double fonctionnalité, puisque son rôle est de porter à la fois le ou les restes B1 et le ou les restes Y ; et
* en tant qu'élément(s) accessoire(s), le ou les restes X d'un composé X', ce ou ces restes X jouant le rôle, lorsqu'ils sont présents, de bras espaceur entre B1 et A, de façon à contrôler la distance entre les différents restes B1, lorsque plusieurs d'entre eux sont présents dans le composé de formule générale (III) (c'est-à-dire lorsque m est supérieur à 1). Bien que des restes X de nature oligopeptidique aient été décrits, on ne sortirait pas du cadre de la présente Invention en utilisant, en tant que composé X', des composés de nature différente, pourvu qu'ils soient aptes à jouer le rôle de bras espaceur entre B1 et A. A titre d'exemples et de façon non limitative, on peut citer l'acide mercaptopropionique, les thioamines, les bromoamines et les bras espaceurs du type polyéthylèneglycol comme le
4,7, 10-trioxa- 1 , 13-tridécane diamine.
Au sens de la présente Invention, on entend par « composé d'intérêt » un composé dont on cherche à favoriser l'intemalisation par des cellules via le récepteur du mannose ou un récepteur de la famille des C-lectines apparenté à ce dernier (cellules dendritiques, cellules des lignées monocytes-macrophages, ...).
A cette fin, le composé d'intérêt peut être lié au reste A, à raison de 1 à 4 molécules de composé d'intérêt par molécule de composé de formule générale (III), par des groupes de liaison P résultant chacun de la réaction entre deux groupes fonctionnels portés, pour le premier, par ledit composé d'intérêt et pour le second, par le composé A'. On obtient un ligand apte, de par la présence du ou des restes B1, à se lier spécifiquement au récepteur du mannose ou à tout récepteur apparenté à ce dernier et, de par sa liaison avec le composé d'intérêt, à favoriser l'intemalisation de ce dernier par les cellules exprimant ce type de récepteur.
Selon une disposition avantageuse de l'Invention, le composé A' est formé d'un enchaînement comprenant plusieurs restes d'un composé au moins trifonctionnel, liés les uns aux autres par des liaisons covalentes, et propre à offrir, au niveau des groupes fonctionnels libres de ces restes (c'est-à-dire des groupes fonctionnels qui ne sont pas engagés dans une liaison covalente), plusieurs sites d'ancrage pour le ou les composés de formule générale (la) et/ou (Ib) ou, lorsque X est présent, le composé X', et pour le composé Y'.
Selon une modalité préférée de cette disposition, le composé A' comprend de 2 à 32 et, de préférence, de 4 à 16 restes d'un composé trifonctionnel.
Conformément à l'Invention, le composé A' peut se présenter soit sous une forme linéaire, soit sous une forme ramifiée et, notamment, de type arborescente (dite « dendrimérique »). Des exemples de structures ramifiées particulièrement bien adaptées à la préparation d'un ligand du récepteur du mannose selon l'Invention sont illustrés dans les Figures 1A et IB qui représentent, de manière très schématique, un composé A' sous la forme de deux dendrimères différents.
De préférence, le composé A' comprend un enchaînement d'acides aminés, identiques ou différents, sélectionnés dans le groupe constitué par la lysine, l'hydroxylysine, la serine, la thréonine, la cystéine, romithine, l'acide aspartique et l'acide glutamique. Cet acide aminé peut être aussi bien de la série L que de la série D et le composé A' peut même comprendre à la fois des résidus de la série L et des résidus de la série D.
Un composé A' à base de lysine est préféré, l'utilisation de la lysine étant en effet particulièrement bien adaptée à la réalisation d'un ligand du récepteur du mannose selon l'Invention, dans la mesure où il a été montré que des macromolécules à base de lysine sont dénuées d'immunogénicité intrinsèque (TAM, Proc. Natl. Acad. Sel. USA, 1988, 85, 540). Toutefois, il est possible d'utiliser, en tant que composé A', des enchaînements de composés trifonctionnels autres que les acides aminés cités ci- dessus, pour autant qu'ils présentent une biocompatibilité satisfaisante. A titre d'exemples et de façon non-limitative, on peut citer la 3,3'-iminobis(propylamine), la 2,2'-iminobis(éthylamine), l'acide gallique, le tris(2-carboxyéthyl)nitrométhane (M. BRETTEICH et al, Synlett, 1998, 1396), le tris(hydroxyméthyl)aminométhane (P. R. ASHTON et a , J. Org. Chem., 1998, 63, 3429) et la (dihydroxy)propylamine.
Accessoirement, le composé A' peut comprendre, en outre, un ou plusieurs restes correspondant à un ou plusieurs composés différents du composé au moins trifonctionnel qui en constitue l'élément de base. Ce ou ces restes n'ont en principe pas vocation à assurer une quelconque liaison entre les différents éléments composant le ligand. En fait, leur présence est soit destinée à conférer à ce ligand des caractères additionnels tels qu'une ou plusieurs possibilités supplémentaires de couplage (par exemple, en vue de la réalisation ultérieure d'un dimère de ce ligand), soit liée à la nécessité d'utiliser, au cours de sa préparation, des composés additionnels, tels que des bras espaceurs. Il va de soi que ces composés, tout en étant différents du composé au moins trifonctionnel constituant l'élément de base du composé A', seront de préférence de la même nature que celui-ci. Ainsi, par exemple, ils seront préférentiellement des acides aminés dans le cas où le composé A' comprend un acide aminé.
Conformément à l'Invention, n, qui représente le nombre de restes X présents dans le composé de formule générale (III), peut être :
• soit égal à 0, auquel cas le ou les restes B1 sont directement liés au reste A, . soit compris entre 1 et 32, auquel cas, si n est égal à 1, le ou les restes B1 sont liés au reste A par l'intermédiaire d'un seul reste X, tandis que, si n est différent de 1, chaque reste X peut servir d'élément de liaison entre un ou plusieurs restes B1 et le reste A.
Quant aux groupes de liaison M, N et P, ils sont choisis, indépendamment les uns des autres, parmi les groupes de liaison qui comprennent une fonction choisie parmi les fonctions oxime, hydrazone, amide, ester, thioester, hydrazide, hydroxamate, éther, thioéther, aminé, carbonate, carbamate, thiocarbonate, thiocarbamate, urée, thiouree et thiazolidine. A titre d'exemples et de façon non- limitative :
- une liaison oxime peut être formée par réaction d'un groupe O-alkylamine avec un groupe carbonyle, - une liaison hydrazone peut être formée par réaction d'un groupe hydrazine avec un groupe carbonyle,
- une liaison amide (respectivement, ester) peut être formée par réaction d'un groupe aminé (respectivement, alcool) avec un groupe acide activé ou anhydride ou halogenure d'acide, - une liaison thioester peut être formée par réaction d'un groupe thiol avec un groupe acide activé ou anhydride ou halogenure d'acide,
- une liaison hydrazide peut être formée par réaction d'un groupe hydrazine avec un groupe acide activé, anhydride ou halogenure d'acide,
- une liaison éther peut être formée par réaction d'un groupe alcool avec un groupe halogenure d'alkyle,
- une liaison thioéther peut être formée par réaction d'un thiol avec un groupe halogenure d'alkyle,
- une liaison aminé peut être formée par réaction entre un groupe aminé et un halogenure d'alkyle, - une liaison carbonate peut être formée par réaction d'un groupe chloroformate avec un groupe alcool,
- une liaison carbamate peut être formée par réaction d'un groupe chloroformate avec un groupe aminé,
- une liaison thiocarbonate peut être formée par réaction d'un groupe chlorothioformate avec un groupe alcool,
- une liaison thiocarbamate peut être formée par réaction d'un groupe chlorothioformate avec un groupe aminé,
- une liaison urée peut être formée par réaction d'un groupe isocyanate avec un groupe aminé, - une liaison thiouree peut être formée par réaction d'un groupe isothiocyanate avec un groupe aminé, - une liaison thiazolidine peut être formée par réaction d'un groupe β-aminothiol avec un groupe carbonyle, tandis que
- une liaison hydroxamate peut être formée par réaction entre un groupe acide activé et un groupe hydroxylamine. On comprendra dès lors que, dans la formule générale (III), B1, A et
X représentent les restes de composés portant naturellement des groupes fonctionnels propres à conduire, par réaction les uns sur les autres, à l'obtention des groupes de liaison M, N et P tels que définis ci-dessus, ou de composés ayant été modifiés de manière à porter de tels groupes fonctionnels. A cet égard, il convient de préciser que, conformément à l'Invention, le composé répondant à la formule générale (III) peut être préparé :
- soit par une synthèse convergente, c'est-à-dire par assemblage de composés disponibles dans le commerce et éventuellement modifiés pour les besoins de la préparation du composé répondant à la formule générale (III), et/ou de composés préalablement synthétisés.
Ainsi, par exemple, le composé de formule générale (III) peut être obtenu en couplant, dans un premier temps, le ou les composés répondant à la formule générale (la) et/ou (Ib) avec le composé X', puis en couplant le composé résultant de ce premier couplage avec le composé A', et enfin en couplant le composé résultant de ce deuxième couplage avec le composé Y', ce dernier couplage étant éventuellement suivi de la déprotection des groupes hydroxyles portés par le ou les restes B1, dans le cas où le ou les composés de formule (la) et/ou (Ib) portent de tels groupes.
En variante, le composé de formule générale (III) peut être obtenu en couplant un composé résultant du couplage entre un ou plusieurs composés répondant à la formule générale (la) et/ou (Ib) et le composé X', avec un composé résultant, lui, du couplage entre le composé A' et le composé Y', ce dernier couplage pouvant, là encore, être suivi d'une déprotection telle que susdite.
Bien entendu, tout autre ordre d'assemblage peut également être envisagé pour autant qu'il permette d'obtenir un composé répondant à la formule générale (III).
- soit par une stratégie de synthèse récurrente, notamment dans le cas où les composés Y', A' et X' sont constitués par des acides aminés. Ainsi, les composés Y', A' et X' peuvent être formés et assemblés les uns aux autres par addition successive des acides aminés qui les composent, par exemple selon les techniques de synthèse peptidique sur support solide dérivées de la méthode initialement décrite par MERRTPIELD (The Chemistry of Solid Phase Peptide Synthesis, STEWART et YOUNG Ed., 1984).
- soit encore par une stratégie de synthèse pour partie convergente et pour partie récurrente.
Selon une disposition préférée de l'Invention, le composé répond à la formule générale (III) dans laquelle m est un nombre entier compris entre 4 et 16, n est un nombre entier compris entre 2 et 8, X représente le reste d'un oligopeptide comprenant de 2 à 4 résidus d'acides aminés, tandis que A représente le reste d'un enchaînement comprenant de 2 à 8 résidus de lysine et se présentant sous la forme d'un dendrimère.
Selon une autre disposition préférée de l'Invention, le composé de formule générale (III) est tel que B1 représente le reste d'un ou plusieurs composés choisis parmi l'acide (-)-shikimique et l'acide (-)-quinique.
Selon l'usage auquel est destiné le ligand, le composé d'intérêt Y' peut être un antigène et, notamment, un antigène vaccinal tel qu'un peptide de synthèse correspondant à un ou plusieurs épitopes d'une protéine d'un agent pathogène, un antigène sous-unité protéique ou polysaccharidique, une fraction bactérienne ou virale purifiée, un anticorps tel qu'une immunoglobuline ou un sérum antilymphocytes, un acide nucléique ou un fragment d'un acide nucléique (séquence d'ARN ou d'ADN) codant pour une protéine d'intérêt ou pour un ou plusieurs déterminants antigéniques de cette protéine, un principe actif médicamenteux tel qu'un immunostimulant, un immunosupresseur, un cytostatique ou un antibiotique, et peut, à ce titre, être aussi bien une substance de nature protéinique, peptidique, osidique ou polyosidique, lipidique, lipoprotéinique, lipopolyosidique, polynucléotidique, qu'un composé issu de la chimie.
Le composé d'intérêt peut également être un marqueur détectable propre à permettre une révélation de la présence du ligand dans le milieu où il se trouve, tel qu'un radioisotope, un fluorochrome ou une enzyme.
Bien entendu, il est aussi possible que le composé d'intérêt Y' soit constitué d'une association de plusieurs susbtances de nature différente comme par exemple, un antigène ou un anticorps lié à un marqueur détectable.
La présente Invention a aussi pour objet un composé utile en tant que composé intermédiaire pour la préparation d'un ligand du récepteur du mannose ou de tout récepteur de la famille des C-lectines apparenté au récepteur du mannose, lequel composé est caractérisé en ce qu'il répond à la formule générale (V) ci-après :
(B2M)m(XN)nA (V) dans laquelle : - B répond à une ou plusieurs formules générales (IVa) ou (IVb) ci-après
Figure imgf000016_0001
(IVa) (IVb)
où Ri, R2, R , R4 et R5 sont tels que définis précédemment en rapport avec les composés de formules générales (la) et (Ib), et où W est tel que défini précédemment en rapport avec les composés de formules générales (Ha) et (Ilb),
- X représente le reste d'un oligopeptide X' comprenant de 1 à 6 acides aminés,
- A représente le reste d'un composé A' au moins difonctionnel,
- m est un nombre entier compris entre 1 et 32, - n est un nombre entier compris entre 0 et 32, et
- M et N représentent chacun un groupe de liaison, respectivement entre B2 et A quand n = 0 ou B2 et X quand n est différent de 0, et entre X et A quand n est différent de 0, et comprennent, indépendamment l'un de l'autre, une fonction choisie parmi les fonctions oxime, hydrazone, amide, ester, thioester, hydrazide, hydroxamate, éther, thioéther, aminé, carbonate, carbamate, thiocarbonate, thiocarbamate, urée, thiouree et thiazolidine.
Ainsi, dans la formule générale (V), le ou les restes B2 résultent du couplage d'un ou plusieurs composés répondant à la formule générale (la) et ou (Ib) avec le composé A', éventuellement via X'. Dans le composé de formule générale (V), M, N, m, n, ainsi que les composés A' et X', sont tels que décrits en relation avec la formule générale (III).
Par ailleurs, le composé de formule générale (V) peut être, comme le composé répondant à la formule générale (III), préparé par une synthèse convergente, par une synthèse récurrente, ou encore par une synthèse pour partie convergente et pour partie récurrente.
Selon une disposition préférée de l'Invention, le composé de formule générale (V) est tel que B2 représente un reste d'un ou plusieurs composés choisis parmi l'acide (-)-shikimique et l'acide (-)-quinique, éventuellement sous forme protégée. La présente Invention a encore pour objet un composé utile en tant que composé intermédiaire pour la préparation d'un ligand du récepteur du mannose ou de tout récepteur de la famille des C-lectines apparenté au récepteur du mannose, lequel composé est caractérisé en ce qu'il répond à la formule générale (VI) ci-après :
(B'M)mA (VI) dans laquelle :
- B1 et M ont la même signification que dans la formule générale (IH),
- m est un nombre entier compris entre 50 et 500, et
- A représente le reste d'un polymère A' capable de former un complexe non- covalent avec un composé d'intérêt, tel qu'un acide nucléique.
Au sens de la présente Invention, on entend par « polymère » un ensemble de molécules de poids moléculaire variable, résultant de l'enchaînement de plusieurs monomères.
Ce polymère est choisi parmi des composés capables de donner lieu, au contact d'un composé d'intérêt, à la formation d'un complexe non-covalent avec ce composé, par exemple par l'intermédiaire de liaisons ioniques, de liaisons dipolaires ou d'interactions électrostatiques, le complexe ainsi obtenu étant alors susceptible d'être utilisé en tant que ligand du récepteur du mannose ou de tout récepteur de la famille des C-lectines apparenté à ce dernier.
De préférence, le polymère A' est un polymère cationique. A titre d'exemples et de façon non-limitative, des polymères cationiques convenables sont des polymères de lysine tels que ceux commercialisés par la Société SIGMA sous les références P0296, P6403, P4408, P7886, P0899, PI 149 ou encore P0124, et des polyéthylèneimines, tels que celui commercialisé par la Société FERMENTAS sous la référence EXGEN 500 en tant que réactif de transfection cellulaire. La présente Invention a également pour objet un composé utile en tant que ligand du récepteur du mannose ou de tout récepteur de la famille des C-lectines apparenté au récepteur du mannose, lequel composé est caractérisé en ce qu'il se présente sous la forme d'un complexe non-covalent entre un composé répondant à la formule générale (VI) telle que définie ci-dessus et un composé d'intérêt, tel qu'un acide nucléique.
Les ligands conformes à l'Invention sont de grand intérêt. En effet, tout en étant aptes à être reconnus de manière très satisfaisante par le récepteur du mannose et à se lier spécifiquement avec lui, ils présentent l'avantage de pouvoir être préparés aisément et à des coûts compatibles avec une exploitation industrielle, notamment par les nombreuses techniques de synthèse peptidique sur support solide.
Ces ligands sont susceptibles de trouver de nombreuses applications telles que :
- la préparation de médicaments et, plus particulièrement, la préparation de vaccins et de médicaments destinés à assurer la vectorisation d'un principe actif vers des cellules cibles exprimant le récepteur du mannose ou un récepteur lui étant apparenté,
- la transfection de séquences d'ADN et d'ARN et ses multiples utilisations en thérapie génique ; dans ce dernier cas, on utilisera des ligands se présentant sous la forme de complexes non-covalents entre un composé de formule générale (VI) et une séquence polynucléotidique, et
- la préparation de réactifs de laboratoire et, notamment, de réactifs de diagnostic. La présente Invention a encore pour objet l'utilisation d'au moins un composé répondant à la formule générale (la) et/ou d'au moins un composé répondant à la formule générale (Ib) pour la préparation d'un médicament capable de se lier au récepteur du mannose ou à tout récepteur de la famille des C-lectines apparenté au récepteur du mannose.
La présente Invention a encore pour objet un composé utile en tant que ligand du récepteur du mannose ou de tout récepteur de la famille des C-lectines apparenté au récepteur du mannose, tel que précédemment défini, pour l'utilisation en tant que médicament. Un tel médicament est susceptible de trouver en premier lieu des applications dans toutes les indications thérapeutiques dans lesquelles on recherche une induction, une modulation ou une suppression des réponses immunitaires et, plus particulièrement, de celles qui sont sous le contrôle des cellules T. A titre d'exemples et de façon non-limitative, on peut citer : - la prévention et le traitement des maladies infectieuses et, notamment, la vaccinologie, auquel cas le composé d'intérêt sera un antigène vaccinal ou un acide nucléique ou un fragment d'acide nucléique codant pour une protéine vaccinale ou pour un ou plusieurs déterminants antigéniques d'une telle protéine, et l'immunothérapie anti-infectieuse non-spécifique ; - le traitement des maladies auto-immunes telles que le lupus érythémateux disséminé, la polyarthrite rhumatoïde ou la maladie de WEGENER ;
- le traitement des déficits immunitaires congénitaux ou acquis ;
- la prévention ou le traitement des états d'hypersensibilité ;
- le traitement des pathologies cancéreuses ; et - la prévention des rejets dans les greffes d'organes.
Ce médicament est également susceptible d'être utilisé pour la vectorisation d'un principe actif non-immunomodulateur vers des cellules cibles exprimant un récepteur de la famille des C-lectines. Ainsi, par exemple, les composés utiles en tant que ligands conformes à l'Invention peuvent trouver des applications en antibiothérapie, pour la vectorisation d'antibiotiques telles que les fluoroquinones ou la colistine vers des cellules des lignées des monocytes-macrophages infectées par des bactéries ou par des mycobactéries, ou dans le traitement de maladies liées à une déficience enzymatique cellulaire comme la maladie de GAUCHER, auquel cas ils serviront à vectoriser l'enzyme déficiente jusqu'aux cellules de KUPFER.
La présente Invention a encore pour objet un composé utile en tant que ligand du récepteur du mannose ou de tout récepteur de la famille des C-lectines apparenté au récepteur du mannose, tel que précédemment défini, pour l'utilisation in vitro.
La présente Invention a, en outre, pour objet un réactif de diagnostic, caractérisé en ce qu'il comprend un composé utile en tant que ligand du récepteur du mannose ou de tout récepteur de la famille des C-lectines apparenté au récepteur du mannose, tel que précédemment défini.
Outre les dispositions qui précèdent, la présente Invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront du complément de description qui suit, qui se rapporte à des exemples de préparation de composés utiles en tant que composés intermédiaires pour la préparation de ligands du récepteur du mannose conformes à l'Invention, de ligands du récepteur du mannose conformes à l'Invention et de démonstration des propriétés biologiques de ces ligands, ainsi qu'aux dessins annexés dans lesquels :
- les Figures 1A et IB illustrent deux exemples de conformations ramifiées susceptibles d'être présentées par le composé A' ; - les Figures 2A, 2B et 2C illustrent les structures chimiques de six composés utiles en tant que composés intermédiaires pour la préparation de ligands conformes à l'Invention ;
- les Figures 3 et 4 illustrent les structures chimiques de 4 ligands conformes à l'Invention préparés à partir des composés montrés sur les Figures 2 A et 2B ;
- la Figure 5 illustre les structures chimiques de deux ligands répondant à la formule (III) conforme à l'Invention, dénommés 33F et 34F ;
- les Figure 6 et 7 illustrent les structures chimiques de quatre ligands répondant à la formule (III) conforme à l'Invention, dénommés 41F, 42F, 43F et 44F ;
- les figures 8 et 9 illustrent les structures chimiques d'un dérivé de l'acide quinique (composé G), de deux dendrimères (composés H et I) et de deux antigènes peptidiques (composés J et K) utilisables pour former des ligands répondant à la formule (III) conforme à l'Invention, dénommés 51 et 52 ;
- les Figures 10 et 11 illustrent les structures chimiques de deux ligands répondant à la formule (III) conformes à l'invention, dénommés 51 et 52 ; - la Figure 12 illustre la capacité du méthyl-quinate à inhiber l'intemalisation du composé 31F, porteurs de résidus du D-mannose, comme décrit dans l'exemple 8 ci-après ;
- la Figure 13 illustre, sous la forme de courbes, les valeurs moyennes des intensités de fluorescence présentées par des cellules dendritiques traitées par 2 ligands conformes à l'Invention (-•- et -*-) et par 2 composés témoins (-Δ- et -α-) à des concentrations comprises entre 1 et 10 μM ;
- la Figure 14 illustre, sous la forme de courbes, les valeurs moyennes des intensités de fluorescence présentées par des cellules dendritiques traitées par 2 ligands conformes à l'Invention (-•- et -•*-) et par 2 composés témoins (-Δ- et -D-) à une concentration de 5 μM après une préincubation desdites cellules en présence de solutions de mannane de concentrations comprises entre 10^ et 10 mg/ml ;
- la Figure 15 illustre le pourcentage d'internalisation spécifique de ligands di-, tétra- ou octavalents par le récepteur du mannose, comme décrit dans l'exemple 8 ci-après ;
- la Figure 16 illustre la structure chimique d'un ligand dénommé 61F, constitué d'un dendrimère comprenant 4 résidus L-lysine portant 4 restes de D-mannose, ainsi qu'une molécule de fluorescéine (FITC), comme décrit dans l'exemple 9 ci-après ; - la Figure 17 illustre le pourcentage de cellules positives détectées lors de l'incubation de cellules Cos-1 avec différents composés, tel que décrit dans l'exemple 9 ci-après.
Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustrations de l'objet de l'Invention et n'en constituent en aucune manière une limitation.
Dans ce qui suit, on utilisera les formules suivantes : Ac2O : anhydride d'acétyle Boc : t-butyloxycarbonyle
'Bu : tert-butyle
DCC : dicyclohexylcarbodiimide
DCM : dichlorométhane DIEA : diisopropyléthylamine
DMF : diméthylformamide éq. : équivalent
EDTA : éthylène diamide tétraacétique
ESI-MS : spectrométrie de masse à électrospray Fmoc : 9-fluorénylméthoxycarbonyle
HOBt : N-hydroxybenzotriazole
HBTU : N-oxyde d'hexafluorophosphate de [(lH-benzotriazol-1-yl) (diméthylamino)- méthy lène] -N-méthylméthanaminium
MBΗA : 4-méthylbenzhydrylamine Mit : 4-méthyltrityle
NMP : N-méthylpyrrolidone
PBS : tampon phosphate
Pmc : 2,2,2,5,7,8-pentaméthylchroman-6-sulfonyle
RMN : résonance magnétique nucléaire RP-ΗPLC : chromatographie liquide haute performance en phase inverse
TFA : acide trifluoroacétique
TNBS : acide 2,4,6-trinitrobenzène sulfonique
TOF-PDMS : spectrométrie à temps de vol et désorption plasma
Trt : trityle Par ailleurs, dans le cadre des exemples qui suivent :
• la mesure des rotations optiques a été effectuée avec un polarimètre PERKTN- ELMER 241 et les valeurs [α]D sont exprimées en unités de 10"' degrés.cm2/g ;
• les chromatographies liquides haute performance en phase inverse semi- préparatives et analytiques ont été réalisées à l'aide d'un système SΗTMADZU LC-9A ou LC-4A, en utilisant une colonne BECKMANN ultrapore C-8 (300 A,
5 μm, 4,6 x 250 mm) ou ΗYPERSIL hyperprep C-18 (300 A, 8 μm, 15 x 500 mm), un débit de 1 ou de 3 ml/minute, une détection à 215 ou à 230 nm, et l'un des 5 systèmes d'élution suivants :
- système A : TFA à 0,05% dans de l'eau
- système B : TFA à 0,05% dans un mélange acétonitrile/eau (80:20)
- système C : TFA à 0,05% dans un mélange acétonitrile/eau (60:40) - système D : tampon phosphate 50 mM, pH 6,95
- système E : un mélange de tampon phosphate 50 mM, pH 6,95, et d'acétonitrile (50:50)
- système F : TFA à 0,05% dans un mélange eau/isopropanol (60:40) ;
• les spectres TOF-PDMS ont été enregistrés à l'aide d'un spectromètre de masse à désorption par plasma APPLIED BIOSYSTEMS Bio-Ion 20 ;
• les spectres ESI-MS ont été enregistrés à l'aide d'un spectromètre de masse à source d'ionisation par électrospray Micromass Quatro II ; tandis que
• les spectres RMN Η et 13C ont été enregistrés à l'aide d'un spectromètre de masse BRUKER DRX 300 ou DRX 600 ; les déplacements chimiques sont exprimés en ppm, en prenant comme standard interne, le tétraméthylsilane, celui du sel de sodium de l'acide triméthylsilylpropionique deuteré.
EXEMPLE 1 : PREPARATION DE COMPOSES UTILES EN TANT QUE COMPOSES INTERMEDIAIRES POUR LA PREPARATION DE LIGANDS CONFORMES A L'INVENTION
Six composés se présentant sous la forme de dendrimères et répondant à la formule générale (V) dans laquelle :
• m représente un nombre entier égal à 4, 8 ou 16,
• B2 représente un reste acide (-)-shikimique ou (-)-quinique, • n est un nombre entier égal à 2, 4 ou 8 (dans le cas où m est respectivement égal à 4, 8 et 16),
• X représente le reste d'un tripeptide de séquence (SI) ci-après :
Lys-Cys(tert-butylthio)-Gly-OH (SI)
A représente le reste d'un dendrimère comprenant 2, 4 ou 8 (dans le cas où m est respectivement égal à 4, 8 et 16) résidus L-lysine et présentant, d'une part, 2, 4 ou 8 groupes chloroacétyles pour sa liaison avec un nombre équivalent de tripeptides et, d'autre part, un groupe amine libre propre à permettre sa liaison avec une molécule d'intérêt, • M représente un groupe amide (-CO-NH-), tandis que N représente un groupe thioéther (-CH2-S-CH2-CO-), ont été préparés.
La préparation de ces composés a été réalisée en utilisant une stratégie de synthèse convergente, c'est-à-dire en procédant : - en premier lieu, à la préparation des dendrimères A',
- puis, à la préparation des tripeptides de séquence (SI) et à leur couplage avec deux molécules d'acide (-)-shikimique ou (-)-quinique, et
- enfin, au couplage des dendrimères A' et des tripeptides porteurs des restes acide (-)-shikimique ou (-)-quinique, par déprotection de la fonction thiol de ces tripeptides et par formation d'une liaison thioéther entre cette fonction thiol et un groupe chloroacétyle desdits dendrimères A'.
Les structures chimiques de ces composés, qui seront dénommés dans ce qui suit :
• composés 21, 23 et 25, pour ce qui est des composés comprenant respectivement 4, 8 et 16 restes acide (-)-shikimique, et
• composés 22, 24 et 26, pour ce qui est des composés contenant respectivement 4, 8 et 16 restes acide (-)-quinique, sont représentées sur les Figures 2A, 2B et 2C. 1.1 - Préparation des dendrimères A' Chaque dendrimère A' a été préparé à une échelle de 0,5 mmole par une synthèse sur support solide, à partir de 15 g d'une résine MBHA initialement chargée à 0,4 mmoles/g (Société SENN CHEMICALS) et en utilisant :
• une stratégie Boc/benzyle pour la protection des acides aminés à coupler,
• un mélange HBTU/HOBt/DIEA dans du DMF, en tant que réactifs d'activation pour les couplages des acides aminés, et
• des tests à la ninhydrine (KAISER et al. Anal. Biochem., 1970, 34, 595) et au TNBS (HANCOCK et BATTERSBY, Anal. Biochem., 1976, 1 , 261) pour le contrôle des opérations de couplage et de déprotection.
Afin d'abaisser la charge en fonctions aminés libres de la résine à une valeur de 0,1 mmoles/g, 0,25 équivalent (par fonction amine devant réagir) de Boc-β-Ala-OH a été, dans un premier temps, couplé à cette résine, en présence d'un mélange HBTU/ΗOBt/DIEA (0,25 : 0,25 : 0,75 éq. par fonction amine devant réagir) dans du DMF (durée de la réaction : 1 heure). Puis, les groupes aminés de la résine restées libres ont été protégés par acétylation, en faisant réagir la résine avec un mélange Ac2O/DIEA/DCM (5:10:85) pendant 10 minutes.
Le deuxième couplage - correspondant en fait au premier couplage d'une L-lysine - a été réalisé en utilisant 4 équivalents (par fonction amine devant réagir) de Boc-L-Lys(2-chlorobenzyloxycarbonyle)-OH, c'est-à-dire d'une L-lysine dont la chaîne latérale est protégée par un groupe 2-chlorobenzyloxycarbonyle, en présence d'un mélange HBTU/HOBt DIEA (4:4:12 éq. par fonction amine devant réagir) dans du DMF (durée de la réaction : 45 minutes). Le troisième couplage a, lui, été effectué en utilisant 4 équivalents de Boc-L-Lys(Boc)-OH, en présence d'un mélange HBTU/HOBt/ DIEA (4:4:12 éq. par fonction amine devant réagir) dans du DMF (durée de la réaction : 45 minutes).
A l'issue de ce troisième couplage, un tiers de la résine a été déprotégé, puis acylé par 8 équivalents d'anhydride chloroacétique préformé (via une activation par du DCC), pour obtenir un dendrimère (dénommé composé 13 dans ce qui suit) comprenant 2 résidus L-lysine et présentant d'une part, un groupe amine libre (qui n'est autre que le groupe ε-amine de la première L-lysine ayant été couplée à la β-alanine) et d'autre part, 2 groupes chloroacétyles.
Les deux autres tiers de la résine ont fait l'objet d'un quatrième couplage pour obtenir la fixation de deux L-lysines supplémentaires. Ce couplage a été réalisé avec 4 équivalents de Boc-L-Lys(Boc)-OH, en présence d'un mélange
HBTU/HOBt DIEA (4:4:12 éq. par fonction amine devant réagir) dans du DMF
(durée de la réaction : 45 minutes).
A l'issue du quatrième couplage, la moitié de la résine restante (soit 1/3 de la quantité de résine initiale) a été à son tour déprotégée et acylée par 8 équivalents d'anhydride chloroacétique préformé pour obtenir un dendrimère
(dénommé composé 14 dans ce qui suit) comprenant 4 résidus L-lysine et présentant à la fois un groupe amine libre et 4 groupes chloroacétyles.
La seconde moitiée de la résine restante a été soumise à un cinquième couplage avec 4 équivalents de Boc-L-Lys(Boc)-OH, comme décrit précédemment. Les opérations de déprotection et d'acylation de la résine par l'anhydride chloroacétique ont été reconduites encore une fois pour obtenir un dendrimère à 8 résidus L-lysine (dénommé composé 15 dans ce qui suit) présentant un groupe amine libre et 8 groupes chloroacétyles.
En pratique, lors de chaque opération de couplage, l'HBTU (1 éq. par rapport à l'acide aminé à coupler), après dissolution dans le DMF, a été ajouté à une solution contenant l'acide aminé à coupler (0,25 éq. par rapport aux fonctions -NH pour la β-alanine, et 4 éq. pour le couplage des lysines), de l'HOBt (1 éq. par rapport à, l'acide aminé) et de la DIEA (3 éq. par rapport à l'acide aminé) dans du DMF. L'ensemble a été mélangé pendant 1 minute à température ambiante, puis ajouté à la résine préalablement imbibée par du DMF. La suspension a été agitée mécaniquement pendant toute la durée de la réaction.
Par ailleurs, entre chaque opération de couplage, la résine a été successivement filtrée, lavée 3 fois avec du DMF (3 x 2 minutes) et du DCM (3 2 minutes), traitée par un mélange TFA DCM (50:50, 1 x 2 minutes, 1 x 20 minutes) propre à permettre le clivage des groupements protecteurs Boc, lavée à nouveau par du DCM (2 x 2 minutes), neutralisée avec un mélange DIEA/DCM (5:95 ; 3 x 1 minute) et lavée une dernière fois avec du DCM (2 x 1 minute).
Le clivage des dendrimères et leur déprotection ont été obtenus en faisant réagir la résine avec 11 ml d'un mélange HF/anisole (10:1) par gramme de résine, à 0°C et pendant 60 minutes. A la suite de quoi, ils ont été successivement précipités dans du tert-butylméthyléther froid, centrifugés, dissout dans de l'eau, lyophilisés et purifiés par une RP-HPLC semi-préparative [gradient (A B) : 100:0 à 50:50 en 120 minutes].
Ont été ainsi obtenus : . 160 mg de dendrimère 13 (Rdt : 52%) ; spectre TOF-PDMS : m/z 498 (M+H)+ ; • 215 mg de dendrimère 14 (Rdt : 42%) ; spectre TOF-PDMS : m/z 928 (M+Na)+ ; et • 182 mg de dendrimère 15 (Rdt : 20%) ; spectre TOF-PDMS : m/z 1726 (M+H)+. 1.2 - Préparation des tripeptides porteurs des restes acide (-)-shikimique et (-)-quinique
La préparation des tripeptides porteurs des restes acide (-)-shikimique et (-)-quinique a été réalisée sur support solide, en synthétisant dans un premier temps le peptide de séquence (SI) et en couplant dans un deuxième temps une molécule de ce tripeptide avec 2 molécules d'acide (-)-shikimique ou 2 molécules dérivées de l'acide (-)-quinique, par formation d'une liaison entre les groupes amine de la L-lysine N-terminale dudit tripeptide et le groupe carboxyle desdits acides. Ont été ainsi obtenues : • d'une part, la Nα^-di-[(3iî,45,5Λ)-3,4,5-trihydroxy-l-cyclohexenecarbox-l-yl]-L- lysyl-[-S'-(tert-butylthio)]-L-cystéyl-glycine, qui sera dénommée composé 1 dans ce qui suit, et
• d'autre part, la Nα^Vf-di-[(l5n,3R,4.;n,5Λ)-l,3,4,5-tétrahydroxy-l-cyclohexane- carbox-l-yl]-L-lysyl-[5-(tert-burylthio)]-L-cystéyl-glycine, qui sera dénommée composé 3 dans ce qui suit. a) Préparation du composé 1
Le composé 1 a été préparé à une échelle de 2 mmoles à l'aide d'une résine Fmoc-glycine p-benzyloxybenzyle (disponible sous la dénomination commerciale Fmoc-Gly-O-Wang auprès de la Société NOVABIOCHEM) chargée à 0,8 mmoles/g, et en utilisant :
• une stratégie Fmoc pour la protection des fonctions amine des acides aminés à coupler,
• un mélange HBTU/DIEA dans de la NMP, en tant que réactifs d'activation pour les couplages des acides aminés, • un mélange pipéridine/NMP pour éliminer les groupements protecteurs Fmoc, et
• des tests à la rύnhydrine et au TNBS pour le contrôle des réactions de couplage et de déprotection.
Après élimination des groupements Fmoc protégeant les fonctions amine des résidus glycine de la résine, par traitement de cette dernière par un mélange pipéridine/NMP (20:80) pendant 20 minutes, le couplage du résidu S-(tert-butylthio)-
L-cystéine a été réalisé en utilisant 2 équivalents (par groupe amine devant réagir) de
Fmoc-L-Cys(terr-butylthio)-OH en présence du mélange HBTU/DIEA (2:3 éq.) dans de la NMP (durée de la réaction : 40 minutes). L'utilisation d'un groupe tert-butylthiol comme groupement protecteur de la fonction thiol du résidu L-cystéine a été choisie en raison de ce que ce groupe est à la fois peu sensible aux conditions réactionnelles utilisées au cours des opérations de couplage et de clivage, tout en étant susceptible d'être aisément éliminé par l'action de trialkylphosphines.
Ce premier couplage a été suivi d'un second couplage destiné à fixer la L-lysine du tripeptide, lequel a été effectué en utilisant 2 équivalents de Fmoc-L-Lys(Fmoc)-OH en présence de 5 équivalents de mélange HBTU/DIEA (2:3 éq.) dans de la NMP (durée de la réaction : 40 minutes). Puis, il a été procédé au couplage des deux molécules d'acide
(-)-shikimique en activant 2 équivalents (par fonction amine devant réagir) de cet acide par, un mélange HBTU/DIEA (1:1 éq.) dans de la NMP pendant 30 secondes, et en ajoutant ledit acide à la résine préalablement imbibée dans du NMP (durée de la réaction : 40 minutes). Au terme de cette opération de couplage, le solvant a été filtré, la résine a été lavée successivement avec de la NMP (3 x 2 minutes) et du DCM (3 x 2 minutes), puis séchée.
Le clivage du composé 1 a été réalisé en traitant la résine par 25 ml d'un mélange TFA/H2O/Me2S (95:2,5:2,5) à la température ambiante pendant 2 heures. La solution a été concentrée sous pression réduite et le résidu ainsi obtenu a été dissous dans de l'eau, puis soumis à une lyophilisation conduisant à l'obtention d'1,64 g d'une poudre jaune pâle. 107 mg de cette poudre ont été purifiés par une RP-HPLC semi-préparative [gradient (A B) : 100:0 à 50:50 en 110 minutes], ce qui a permis d'obtenir, après lyophilisation, 15 mg de composé 1 pur, soit un rendement de 14%.
Le composé 1 présente les caractéristiques suivantes :
Rotation optique : [α]p -117 (c 0.19, H20) ;
Spectre RMN Η : δH(300 MHz; H2O-D2O 90:10) 1.16 (3 x 3 H, 3 s, C(CH3)3), 1.14-
1.35 (2 H, m, 2 lysyl γ-H), 1.37-1.44 (2 H, m, 2 lysyl δ-H), 1.62-1.75 (2 H, m, 2 lysyl β-H), 2.00-2.11 ( 2 H, m, 2 6-H), 2.59 ( 1 H, dd, J 11.3 et J 17.4, 1 6-H), 2.60 (1 H, dd, J 11.1 et J 17.0, 1 6-H), 2.90 (1 H, dd, Jα,p 7.0 et J - 14.1, 1 cystéyl β-H), 3.04- 3.16 (2 H, m, 2 lysyl ε-H), 3.09 (1 H, dd, Jα,β 4.9 et J - 14, 1 cystéyl β-H), 3.58 et 3.59 (2 H, 2 dd, J3,4 4.6 etJ4j5 9.2, 2 4-H), 3.73-3.76 (2 H, m, 2 glycyl α-H), 3.83-3.88 (2 H, m, 2 5-H), 4.17 (1 H, m, lysyl α-H), 4.25-4.29 (2 H, m, 2 3-H), 4.52 (1 H, m, 1 cystéyl α-H), 6.22 et 6.28 (2 H, 2 br d, J2,3 4.0, 2 2-H), 7.86 (1 H, t, Jε>NH 5.4, 1 lysyl εNH), 8.02 (1 H, t, Jα,NH 5.6, 1 glycyl NH), 8.06 (1 H, d, Jα,NH 6.6, 1 lysyl αNH), 8.32 (1 H, d, Jα,NH 7.7, 1 cystéyl NH);
Spectre RMN 13C : δc(81.3 MHz; H2O-D2O 90:10) 22.9 (lysyl γ-C), 28.3 (lysyl δ-C), 29.4 (C(CΗ3)3), 30.7 (lysyl β-C), 31.7 et 31.5 (2 6-C), 39.8 (lysyl ε-C), 40.6 (cystéyl β-C), 41.8 (glycyl α-C), 48.7 (C(CH3)3), 53.3 (cystéyl α-C), 54.9 (lysyl α-C), 66.3 et 66.8 (2 4-C et 2 5-C), 71.9 et 72.0 (2 3-C), 131.1 et 132.1 (2 1-C), 133.1 et 133.7 (2 2- C), 170.5, 171.0, 172.7, 173.4 et 174.6 (5 XC=O) ; Spectre TOF-PDMS : m/z 729 (M+Na)+.
Les constantes de couplage entre les protons 3-H/4-H et 4-H/5-H des deux restes acide (-)-shikimique présents dans le composé 1 telles que déterminées par spectrométrie RMN Η sont respectivement de 4,6 et 9,2 Hz. Ces constantes sont compatibles avec une orientation pseudo-équatoriale des fonctions hydroxyles portées par les atomes de carbone situés en positions 4 et 5 desdits acides et viennent confirmer l'analogie de structure existant entre l'acide (-)-shikimique et le D-mannose. b) Préparation du composé 3 Le composé 3 a été préparé à une échelle de 2 mmoles à l'aide d'une résine Fmoc-glycine o-methoxy- 7-(benzyloxy)benzyle (disponible sous la dénomination commerciale Fmoc-Gly-Sasrin auprès de la Société BACHEM) chargée à 0,8 mmoles/g et en utilisant :
• une stratégie Fmoc/tert-butyle pour la protection des acides aminés à coupler, • un mélange HBTU/DIEA dans de la NMP, en tant que réactifs d'activation pour les couplages des acides aminés,
• un mélange pipéridine/NMP pour éliminer les groupements protecteurs Fmoc, et
• des tests à la ninhydrine et au TNBS pour le contrôle des opérations de couplage et de déprotection. Les couplages de la S-(tert-butylthio)-L-cystéine et de la L-lysine ont été réalisés dans des conditions identiques à celles utilisées pour la préparation du composé 1.
Par contre, le couplage des deux molécules d'acide (-)-quinique a été, lui, effectué selon un protocole opératoire différent de celui utilisé pour le couplage de l'acide (-)-shikimique. En effet, il s'est avéré que l'activation de l'acide (-)-quinique se traduisait immédiatement par la formation d'une γ-lactone bicyclique, par estérification entre le groupe carboxyle porté par le carbone situé en position 1 et le groupe hydroxyle porté par le carbone situé en position 3 de cet acide, et qu'il était donc nécessaire de protéger les fonctions hydroxyle de l'acide (-)-quinique avant de procéder à son couplage. II a donc été choisi de soumettre l'acide (-)-quinique à une peracétylation par de l'anhydride acétique, de manière à obtenir l'acide (l->n,3i?,4sn,5Λ)-l,3,4,5-tétraacétoxycyclohexane-l-carboxylique qui n'est autre que le dérivé tétraacétylé de l'acide (-)-quinique et qui sera dénommé composé 9 dans ce qui suit, puis de transformer ce dernier en son fluorure d'acide (dénommé composé 18 dans ce qui suit) en traitant le composé 9 par du fluorure de cyanuryle.
Pour ce faire, une goutte d'acide perchlorique a été ajoutée, à température ambiante et sous agitation, à une suspension contenant 4 g (21 mmoles) d'acide (-)-quinique dans 30 ml d'un mélange acide acétique/ Ac O (2:1). L'agitation a été poursuivie pendant 12 heures au terme desquelles le mélange résultant a été dilué avec du chloroforme et soumis à une extraction par une solution saturée en bicarbonate de sodium, puis par de l'eau. La couche organique a été séchée par du sulfate de sodium, filtrée et concentrée sous pression réduite. Le résidu a été précipité par addition de pentane pour donner 6,45 g de composé 9, soit un rendement de 86%.
La transformation de l'acide 9 en son fluorure a été réalisée en ajoutant, goutte à goutte et sous agitation, 937 μl (11,10 mmoles) de fluorure de cyanuryle à une solution comprenant 500 mg (1,39 moles) de composé 9 dans 6 ml de chlorure de méthylène et 112 μl (1,39 mmoles) de pyridine, et en portant le mélange résultant à reflux pendant 2 heures. Un précipité blanc s'étant formé, ce mélange a été filtré, puis il a été soumis à une extraction par de l'eau. L'élimination du solvant de la couche organique, après séchage de cette dernière par du sulfate de sodium, a conduit à l'obtention d'une huile correspondant au composé 18 et qui a été soumise à un séchage sous vide pendant plusieurs heures. Les composés 9 et 18 présentent les caractéristiques spectrales suivantes :
Composé 9 :
Spectre RMN Η : δH(300 MHz; CDC13) 1.87 (1 H, dd, J5,6 10.2 et J6,6- 13.6, 6-H), 1.96, 1.98, 2.03 et 2.08 (4 x 3 H, 4 s, 4 CH3), 1.98-2.03 (1 H, m, 6'-H), 2.36 (1 H, dd,
J2.2- 15.9 etJ2.3 3.3, 2-H), 2.50 (1 H, dd, J2,2- 15.9 et Jrj 3.2, 2'-H), 4.97 (1 H, dd, J3>4
3.4 et J4,5 9.4, 4-H), 5.31 (1 H, ddd, J4,5 9.4, J5,6 10.2 etJ5,6- 4.2, 5-H), 5.50 (1 H, m, 3-
H) ;
Spectre RMN 13C : δc(81.3 MHz; CDC13) 21.0, 21.1, 21.2 et 21.4 (4 CH3), 32.0 et 36.3 (2-C et 6-C), 66.7, 67.7 et 71.3 (3-C, 4-C et 5-C), 78.8 (1-C), 170.1-170.5 (4
CO2Me), 173.1 (CO2H) ;
Composé 18 :
Spectre RMN Η : δH(300 MHz; CDC13) 1.97-2.05 (1 H, m, 6-H), 2.03, 2.06, 2.08 et
2.16 (4 x 3 H, 4 s, 4 CH3), 2.45 (1 H, dd, J2,2- 15.4 et J2,3 3.7, 2-H), 2.50-2.66 (2 H, m, 2'-H et 6'-H), 5.08 (1 H, dd, J3,4 3.5 et J4>5 9.1, 4-H), 5.38 (1 H, ddd, J4>5 9.1, J5,6' 9.1 etJ5,6 5.1, 5-H), 5.56 (1 H, m, 3-H) ;
Spectre RMN 13C : δc(81.3 MHz; CDC13) 20.4, 20.6, 20.8 et 20.9 (4 CH3), 31.9 et 35.4
(2-C et 6-C), 66.0, 68.2 et 70.4 (3-C, 4-C et 5-C), 76.7 (JC.F 53.2, 1-C), 160.3 (JQF
373.4, COF), 169.6, 169.7, 169.8 et 169.8 (4 CO2Me). Le couplage des deux molécules de composé 18 a été réalisé en acylant la résine une première fois par 2 équivalents (par fonction amine devant réagir) de composé 18 en présence de 3 équivalents de DIEA dans de la NMP (durée de la réaction : 60 minutes), puis, après avoir lavé la résine avec de la NMP (3 2 minutes) et du DCM (3 x 2 minutes), en l'acylant une seconde fois, mais en utilisant 1 équivalent des différents réactifs.
Au terme de cette opération de couplage, le solvant a été filtré, la résine a été lavée successivement avec de la NMP (3 x 2 minutes) et du DCM (3 x 2 minutes), puis séchée.
Le clivage du composé 3 a été obtenu en traitant la résine par 20 ml d'un mélange CH^h/TFA PrsSiH (95:2:3) (4 x 5 minutes). La solution a été concentrée sous pression réduite et le résidu ainsi obtenu a été dissout dans de l'eau, puis soumis à une lyophilisation conduisant à l'obtention d'1,40 g d'un composé brut qui a été dissout dans 25 ml de méthanol. A la solution ainsi obtenue, a été ajouté, goutte à goutte et sous agitation, du méthylate de sodium méthanolique 1 M jusqu'à l'obtention d'un pH d'environ 9, puis on a laissé ce mélange réagir pendant 3 heures, en contrôlant le déroulement de la réaction par une RP-HPLC. Le mélange a été ensuite concentré sous pression réduite. Un échantillon de 100 mg du résidu a été purifié par une RP-HPLC semi-préparative [gradient (A/B) : 100:0 à 90:10 en 10 minutes, puis 90:10 à 50:50 en 70 minutes] pour conduire à l'obtention, après lyophilisation, de 41 mg de composé 3 pur, soit un rendement de 59%. Le composé 3 présente les caractéristiques suivantes :
25 Rotation optique : [α]D -73 (c 0.49, H2O) ;
Spectre RMN Η : δH(300 MHz; H2O-D2O 90:10) 1.12 (3 x 3 H, s, 3 CH3), 1.15-1.22 (2 H, m, 2 lysyl γ-H), 1.34 (2 H, quintet, Jγ>δ 7.2 et Jδ,ε 7.2, 2 lysyl δ-H), 1.57-1.90 (10 H, m, 2 lysyl β-H, 4 2-H et 4 6-H), 2.83 (1 H, dd, Jα,β 8.6 et Jβ(β- 14, 1 cystéyl β-H), 3.02 (3 H, m, 1 cystéyl β-H et 2 lysyl ε-H), 3.33 (2 H, dd, J3,4 9.6 et J ,5 2.9, 2 4-H), 3.79 ( 2 H, d, Jα,NH 5.8, 2 glycyl α-H), 3.80-3.90 (2 H, m, 2 5-H), 4.01 (2 H, br s, 2 3- H), 4.11 (1 H, dt, Jα,NH 7.0 et Jα,β 7.2, 1 lysyl α-H), 4.54 (1 H, dt, Jα,NH 7.6 et Jα,β 6.0, 1 cystéyl α-H), 8.02 (1 H, t, Jα,NH 5.9, 1 lysyl εNH), 8.11 (1 H, d, Jα,NH 7.0, 1 lysyl αNH), 8.21 (1 H, t, Jα,NH 5.8, 1 glycyl NH), 8.35 (1 H, d, Jα,NH 7.6, 1 cystéyl NH) ; Spectre RMN 13C : δc(81.3 MHz; H2O-D2O 90:10) 22.7 (lysyl γ-C), 28.3 (lysyl δ-C), 29.4 (C(CH3)3), 30.9 (lysyl β-C), 37.5 (2 2-C), 39.4 (lysyl ε-C), 40.7 (cystéyl β-C et 2 6-C), 41.8 (glycyl α-C), 48.6 (C(CH3)3), 53.1 (cystéyl α-C), 54.4 (lysyl α-C), 66.7 et 66.8 (2 3-C), 70.8 (2 5-C), 75.4 (2 4-C), 77.2 (2 1-C), 172.5, 173.4, 174.4, 177.1 et 177.4 (5 XC=O) ; Spectre ESI-MS : m/z 741 (M-H)".
Les constantes de couplage entre les protons 3-H/4-H et 4-H/5-H des deux restes acide (-)-quinique présents dans le composé 3 telles que déterminées par spectrométrie RMN Η sont respectivement de 9,6 et 2,9 Hz. Ces constantes sont compatibles avec une conformation « chaise » du cyclohexane plaçant le groupe amide en position équatoriale, les hydroxyles 3 et 4 en relation trans di-équatoriale et les hydroxyles 4 et 5 en relation cis équatoriale-axiale. 1.3 - Couplages des dendrimères A' et des tripeptides porteurs des restes acide (-)-shikimique et (-)-quinique
Les couplages des composés 13, 14 et 15 et des composés 1 et 3 ont été réalisés selon une procédure comprenant 2 étapes, à savoir : • une première étape visant à réduire la liaison disulfure (S-SBu') que présente chacun des composés 1 et 3, en traitant ces composés par du tri-n-butylphosphine dans un mélange n-propanol/eau dégazés (50:50), de manière à obtenir l'élimination du groupe protecteur tert-butylthiol porté par chacun des composés 1 et 3 et, partant, la déprotection de leur fonction thiol, et • une seconde étape visant à faire réagir les composés 1 et 3 ainsi réduits avec les composés 13, 14 et 15, dans un mélange DMF/eau dégazés (90:10) et en présence de carbonate de potassium, de manière à obtenir la formation d'une liaison thioéther entre la fonction thiol des composés 1 et 3 et l'une des fonctions chloroacétyles des composés 13, 14 et 15. Ainsi, à une solution contenant 1,5 équivalent (par groupe chloroacétyle devant réagir à la deuxième étape) de composé 1 ou de composé 3 dans 1 ml d'un mélange n-propanol/eau dégazés (50:50), a été ajouté 1 équivalent de tri-/ι- butylphosphine. Chaque mélange réactionnel a été laissé, sous agitation et sous azote, à température ambiante pendant 24 heures, puis les solvants et le tert-butylmercaptan libéré ont été évaporés sous pression réduite et les résidus ont été séchés sous vide pendant 15 minutes.
Chacun de ces résidus, après dissolution dans un mélange DMF/eau dégazés (90:10), a été ajouté à 1 équivalent (1-5 μmoles) d'un composé 13, 14 ou 15 et à 20 équivalents de carbonate de potassium. Chaque mélange réactionnel a été laissé, sous agitation et à température ambiante, pendant 72 à 96 heures - les réactions étant contrôlées par des RP-HPLC -, puis, dilué dans de l'eau et lyophilisé. Les résidus ont été alors purifiés par des RP-HPLC semi-préparatives. Ont été ainsi obtenus :
• 3,39 mg de composé 21 (Rdt : 61%) en utilisant un gradient (A/C) : 100:0 à 70:30 en 70 minutes,
• 5,98 mg de composé 22 (Rdt : 66%) en utilisant un gradient (A/C) : 100:0 à 75:25 en 25 minutes, puis isocratique, • 2,25 mg de composé 23 (Rdt : 42%) en utilisant un gradient (A/C) : 100:0 à 80:20 en 35 minutes, puis isocratique,
• 5,75 mg de composé 24 (Rdt : 56%) en utilisant un gradient (A/C) : 100:0 à 75:25 en 25 minutes, puis isocratique, • 3,15 mg de composé 25 (Rdt : 43%) en utilisant un gradient (A/C) : 100:0 à 75:25 en 40 minutes, puis isocratique, et
• 7,03 mg de composé 26 (Rdt : 61%) en utilisant un gradient (A/C) 100:0 à 80:20 en 35 minutes, puis isocratique, se présentant tous sous la forme d'une poudre blanche. Les composés 21 à 26 présentent les caractéristiques spectrales suivantes : Composé 21 : Spectre RMN Η : δH(600 MHz; H2O-D2O 90:10) 1.31-1.46 (8 H, m, 8 lysyl γ-H), 1.43-1.60 (6 H, m, 6 lysyl δ-H), 1.64 (2 H, m, 2 lysyl δ-H), 1.68-1.89 (8 H, m, 8 lysyl β-H), 2.17-2.23 (4 H, m, 4 6-H), 2.46 and 2.51 (2 x 1 H, 2 dt, Ja,a- 15.4 and Jα,β 6.2, 2 alanyl α-H), 2.70- 2.80 (4 H, m, 4 6'-H), 2.89-2.95 (2 H, m, 2 cystéyl β-H), 2.96-3.01 (2 H, m, 2 lysyl ε- H), 3.06 (2 H, dd, Jα,β 5.3 and Jβ>β- 14.9, 2 cystéyl β'-H), 3.21 (2 H, m, 2 lysyl ε-H), ), 3.25 (2 H, m, 2 lysyl ε-H), 3.27 (1 H, d, J 16.5, CHH), 3.30 (1 H, d, J 16.5, CHH), 3.33 (2 H, s, CH2), 3.41-3.50 (2 x 1 H, 2 ddt, Jα,β 6.2, Jβ,β- 12.6 and JβtNH 6.2, 2 β- alanyl β-H), 3.71-3.76 (4 H, m, 4 4-H), 3.95 (4 H, d, Jα,NH 6.3, 4 glycyl α-H), 4.00- 4.05 (4 H, m, 4 5-H), 4.25 (2 H, dt, Jα>β 5.6 and Jα,NH 6.3, 2 lysyl α-H), 4.32-4.38 (4 H, m, 4 lysyl α-H), 4.42-4.44 (4 H, m, 4 3-H), 4.58-4.62 (2 H, m, 2 cystéyl α-H), 6.38 and 6.44 (2 x 2 H, 2 br d, J2>3 4.0, 2 x 2 2-H), 6.90 (1 H, s, NHH), 7.54 (br s, εNH2), 7.60 (1 H, s, NHH), 8.07 (2 Η, t, Jα,NΗ 6.8, 2 lysyl εNH), 8.15 (1 H, t, Jα,NH 6.2, β- alanyl NH), 8.24 (1 H, t, Jε,NH 6.3, 1 lysyl εNH), 8.25-8.27 (2 H, m, 2 lysyl αNH), 8.31 and 8.32 (2 x 1 H, 2 t, Jα,NH 6.3, 2 glycyl NH), 8.42 (1 H, d, Jα,NH 6.8, 1 lysyl αNH), 8.47 (1 H, d, Jα,NH 6.3, 1 lysyl αNH), 8.61 (2 H, d, Jα,NH 7.6, 2 cystéyl NH) ; Spectre ESI-MS : m/z 1660.4 (M-H)\ 829.9 (M-2H)2\ Composé 22 :
Spectre RMN Η : δH(300 MHz; H2O-D2O 90:10) 1.22-1.28 (8 H, m, 8 lysyl γ-H), 1.34-1.43 (6 H, m, 6 lysyl δ-H), 1.52 (2 H, m, 2 lysyl δ-H), 1.57-1.64 (8 H, m, 8 lysyl β-H), 1.65-1.99 (16 H, m, 8 2-H and 8 6-H), 2.33 (2 H, t, Jα,β 6.3, 2 β-alanyl α-H), 2.69-2.84 (4 H, m, 2 cystéyl β-H and 2 lysyl ε-H), 2.92 (2 H, dd, Jα,β 5.3 and Jβιβ- 14, 1 2 cystéyl β-H), 2.98-3.11 (6 H, m, 6 lysyl ε-H), 3.15 and 3.19 (2 x 2 H, 2 s, 2 CH2), 3.23 and 3.34 (2 x 1 H, 2 ddt, Jα,β 5.3, Jβ,β- 13.0 and JP,NH 5.7, 2 β-alanyl β-H), 3.38 (4 H, dd, J3,4 3.1 and J4,5 9.7, 4 4-H), 3.76 and 3.77 (4 H, 2 t, Jα,NH 6.3, 2 glycyl α-H), 3.87-3.96 (4 H, m, 4 5-H), 4.06 (4 H, br s, 4 3-H), 4.10-4.16 (4 H, m, 4 lysyl α-H), 4.60-4.64 (2 H, m, 2 cystéyl β-H), 6.73 and 7.42 (2 x 1 H, 2 s, NHH and NHH), 7.96 (1 Η, t, JαjNΗ 5.7, β- alanyl NH), 8.07 (1 H, t, Jα,NH 6.3, 1 lysyl εNH), 8.10 (1 H, t, J„,NH 6.9, 1 lysyl εNH), 8.11 (2 H, t, Jα,NH 6.3, 2 glycyl NH), 8.12 (1 H, t, Jε,NH 6.8, 1 lysyl εNH), 8.13 (2 H, d, Jα,NH 6.8, 2 lysyl αNH), 8.25 (1 H, d, Jα,NH 6.7, 1 lysyl αNH), 8.29 (1 H, d, Jα,NH 6.3, 1 lysyl αNH), 8.39 (2 H, d, Jα,NH 7.6, 2 cystéyl NH ;
Spectre ESI-MS : m/z 1732.5 (M-HV, 865.6 (M-2H)2\
Composé 23 :
Spectre ESI-MS : mesuré : 3235.0, calculé : 3235.6, m/z 1616.4 (M-2H)2", 1077.3 (M-
3H)3\ 807.7 (M-4H)4\ Composé 24 :
Spectre ESI-MS : mesuré : 3379.0, calculé : 3379.7, m/z 1688.3 (M-2H)2\ 1125.3 (M-
3H)3\ 843.8 (M-4H)4\
Composé 25 :
Spectre ESI-MS : mesuré : 6382.0, calculé : 6383.0, m/z 1594.5 (M-4H)4", 1275.5 (M- 5H)5\ 1062.8 (M-6H)6\ 910.8 (M-7H)7'. Composé 26 : Spectre ESI-MS : mesuré : 6671.0, calculé : 6671.2, m/z 2221.9 (M-3H)3", 1666.7 (M-
4H)4-, 1333.1 (M-5H)5-, 1110.8 (M-6H)6\ 952.0 (M-7H) 7- EXEMPLE 2 : PREPARATION DE LIGANDS CONFORMES A L'INVENTION
Quatre ligands - qui seront dénommés ligands 21F, 22F, 23F et 24F dans ce qui suit - et répondant à la formule générale (III) dans laquelle : « m représente un nombre entier égal à 4 ou 8,
• B1 représente un reste acide (-)-shikimique ou (-)-quinique,
« n est un nombre entier égal à 2 ou 4 (dans le cas où m est respectivement égal à 4 et
8),
• X représente le reste d'un tripeptide de séquence (SI) telle que définie dans l'exemple 1,
. A représente le reste d'un dendrimère A' comprenant 2 ou 4 (dans le cas où m est respectivement égal à 4 et 8) résidus L-lysine et présentant, d'une part, 2 ou 4 groupes chloroacétyles pour sa liaison avec un nombre équivalent de tripeptides et, d'autre part, un groupe amine libre propre à permettre sa liaison avec Y, • Y représente le reste d'une molécule de fluorescéine,
. M représente un groupe amide (-CO-NH-), N représente un groupe thioéther
(-CH2-S-CH2-CO-), tandis que P représente un groupe thiouree (-NH-CS-NH-), ont été préparés en couplant les composés 1 et 3, après déprotection de leur fonction thiol dans des conditions identiques à celles décrites au § 1.4 dudit exemple 1, avec des composés 13 et 14 ayant préalablement réagi avec du FITC.
Ainsi, comme décrit au § 1.4 de l'exemple 1, à une solution contenant 1,5 équivalent (par groupe chloroacétyle devant réagir ultérieurement) de composé 1 ou de composé 3 dans 1 ml d'un mélange n-propanol/eau dégazés (50:50), a été ajouté 1 équivalent de tri-n-butylphosphine. Chaque mélange réactionnel a été laissé, sous agitation et sous azote, à température ambiante pendant 24 heures, puis les solvants ont été évaporés sous pression réduite et les résidus ont été séchés sous vide pendant 15 minutes.
Par ailleurs, 1 équivalent (1-2,5 μmoles) de composé 13 ou 14 a été mis à réagir avec 1,1 équivalent de FITC et 4 équivalents de diisopropyléthylamine dans 1 ml de DMF dégazé, à température ambiante et à l'obscurité, pendant 4 heures au terme desquelles chaque mélange réactionnel a été ajouté à une solution comprenant l'un des résidus précédemment obtenus dans 300 μl d'eau dégazée. Les parois des récipients contenant lesdits mélanges réactiormels ont été rincées avec 200 μl de DMF dégazé et le pH des différents mélanges réactionnels a été amené à une valeur de 8-8,5 par addition de carbonate de potassium.
Ces mélanges réactionnels ont ensuite été laissés à l'obscurité pendant 48 heures, les réactions étant contrôlées par des RP-HPLC. Puis, chaque mélange réactionnel a été dilué dans de l'eau contenant 10% d'acide acétique et lyophilisé et les résidus ont été purifiés par des RP-HPLC semi-préparatives.
Ont été ainsi obtenus :
• 1,82 mg de ligand 21F (Rdt : 46%) en utilisant un gradient (A/C) : 100:0 à 75:25 en 15 minutes, puis 75:25 à 65:35 en 30 minutes,
• 1,42 mg de ligand 22F (Rdt : 27%) en utilisant un gradient (A C) : 100:0 à 75:25 en 15 minutes, puis 75:25 à 65:35 en 30 minutes,
• 4,56 mg de ligand 23F (Rdt : 62%) en utilisant un gradient (A C) : 100:0 à 85:15 en 15 minutes, puis 85:15 à 70:30 en 30 minutes, • 3,57 mg de ligand 24F (Rdt : 50%) en utilisant un gradient (A C) : 100:0 à 85:15 en 15 minutes, puis 85:15 à 70:30 en 30 minutes, se présentant tous sous la forme d'une poudre blanche.
Les structures chimiques de ces ligands sont représentées sur les Figures 3 et 4. Leurs spectres ESI-MS sont les suivants :
. ligand 21F : m/z 2123.5 (M-H)\ 1062.3 (M-2H)2'
• ligand 22F : mesuré : 2051.0, calculé : 2051.2, m/z 1026.1 (M-2H)2'
. ligand 23F : mesuré : 3769.0, calculé : 3769.1, m/z 1254.9 (M-3H)3*, 941.2 (M- 4H)4" • ligand 24F : mesuré : 3624.0, calculé : 3624.1, m/z 1207.0 (M-3H)3", 905.4 (M- 4H)4\
EXEMPLE 3 : PREPARATION DE LIGANDS CONFORMES A L'INVENTION Deux ligands répondant à la formule générale (III) dans laquelle :
• m est un nombre entier égal à 3,
• B1 représente un reste acide (-)-shikimique ou (-)-quinique, • n est un nombre entier égal à 0 (en sorte que X est absent),
• A représente le reste d'un enchaînement linéaire A' comprenant 3 résidus L-lysine et présentant 3 groupes aminés libres pour son couplage avec les trois molécules d'acide (-)-shikimique ou (-)-quinique et étant, d'autre part, lié à Y via une liaison amide,
• Y représente un composé d'intérêt formé par trois résidus Arg-Gly-Arg liés à un épitope de classe II, en l'espèce le peptide 323-339 d'ovalbumine de poule (qui sera dénommé Ova 323-339 dans ce qui suit),
• M et P représentent un groupe amide (-CO-NH-), ont été préparés.
La préparation de ces ligands a été réalisée en procédant :
• en premier lieu, à la synthèse, sur un support solide, d'un peptide présentant la séquence (S2) suivante :
323 Ac-Cys[S-(tert-butylthio)]-Lys(Mtt)-Lys(Mtt)-Lys(Mtt)-Arg(Pmc)-Gly-Arg
(Pmc)-Ile-Ser('Bu)-Gln(Trt)-Ala-Val-His(Trt)-Ala-Ala-His(Trt)-Ala-
339 Glu('Bu)-Ile-Asn(Trt)-Glu('Bu)-Ala-Gly-Arg(Pmc) (S2)
dans laquelle :
- les 17 résidus acide aminé situés à l'extrémité C-terminale correspondent à la séquence du peptide Ova 323-339,
- le groupe formé par les 3 résidus Arg-Gly-Arg situés en amont de la séquence dudit peptide Ova 323-339 représente un groupe sensible aux endopeptidases,
- le groupe formé par les 3 résidus Lys-Lys-Lys correspond à l'enchaînement des L-lysine, tandis que
- le résidu S-(tert-butylthio)-L-cystéine acétylée situé à l'extrémité N-terminale est destiné à permettre un couplage ultérieur du ligand, par exemple pour l'obtention d'un dimère ;
• puis, au couplage des résidus L-lysine de ce peptide et des acides (-)-shikimique et (-)-quinique (sous la forme de son dérivé tétra-O-acétylé), par formation d'une liaison amide entre les groupes ε-amine desdits résidus L-lysine et les groupes carboxyles desdits acides.
Ces ligands seront dénommés respectivement ligand 25 et ligand 28 dans ce qui suit.
Le peptide de séquence (S2) a été synthétisé à une échelle de 0,25 mmole à partir de 337 mg d'une résine MBHA Rink amide chargée à 0,74 mmoles/g (Société SENN CHEMICALS), et en utilisant :
- une stratégie Fmoc/tert-butyle pour la protection des acides aminés à coupler,
- un groupe 2,2,2,5,7,8-pentaméthylchroman-6-sulfonyle comme groupement protecteur des chaînes latérales des L-arginines, - un groupe tert-butyle comme groupement protecteur des chaînes latérales des L-sérine et acides L-glutamique,
- un groupe trityle comme groupement protecteur des chaînes latérales de la L-asparagine, de la L-glutamine et des L-histidines,
- un groupe 4-méthyltrityle comme groupement protecteur des chaînes latérales des L-lysines,
- un mélange HBTU/HOBt/DIEA dans du DMF, en tant que réactifs d'activation pour le couplage des acides aminés,
- un mélange pipéridine/DMF pour éliminer les groupements protecteurs Fmoc, et
- des tests à la ninhydrine et au TNBS pour le contrôle des opérations de couplage et de déprotection.
Les couplages des 20 premiers acides aminés ont été réalisés de façon automatisée au moyen d'un synthétiseur APPLIED BIOSYSTEMS ABI431, tandis que les couplages des L-lysines et de la S-(tert-butylthio)-L-cystéine ont été effectués manuellement. Dans tous les cas, ces couplages ont été réalisés en utilisant
4 équivalents (par fonction amine devant réagir) d'acide aminé, en présence du mélange HBTU/HOBt/DIEA (4:4:12 éq. par fonction amine devant réagir) dans du DMF, et en activant les acides aminés pendant 1 minute avant de les ajouter à la résine. En pratique, le HBTU (4 éq.) a été dissout dans du DMF, puis ajouté à une solution contenant l'acide aminé à coupler, l'HOBt (4 éq.) et la DIEA (8 éq.) dans du DMF. L'ensemble a été mélangé pendant 1 minute, puis ajouté à la résine préalablement imbibée par du DMF. Le mélange réactionnel résultant a été agité mécaniquement pendant toute la durée de la réaction, c'est-à-dire pendant 40 minutes pour les couplages automatisés et 45 minutes pour les couplages manuels.
Les couplages des L-lysines et de la S-(tert-butylthio)-L-cystéine ont tous été suivis d'un traitement de la résine par un mélange Ac2O/DIEA/DCM (5:10:85) d'une durée de 10 minutes destiné à acétyler les groupes aminés qui n'auraient pas été couplés.
Par ailleurs, entre chaque opération de couplage, la résine a été successivement filtrée, lavée avec du DMF (3 x 2 minutes) et du DCM
(3 x 2 minutes), traitée par un mélange pipéridine/DMF (20:80) pour obtenir le clivage des groupements Fmoc, et lavée à nouveau avec du DMF (2 x 2 minutes) et du DCM
(3 x 1 minute).
A l'issue du couplage de la S-(tert-butylthio)-L-cystéine et de son acétylation, les groupes protecteurs 4-méthyltrityles des résidus L-lysine ont été hydrolyses en lavant la résine avec un mélange TFA/DCM (1:99) en flux continu jusqu'à disparition de sa coloration jaune.
Les couplages du peptide de séquence (S2) avec les acides (-)-shikimique et (-)-quinique ont été réalisés en faisant réagir, à température ambiante et pendant 45 minutes, des fractions de la résine ainsi lavée avec 4 équivalents d'acide (-)-shikimique ou 4 équivalents d'acide tétra-0-acétyl-(-)-quinique préalablement activés par 4 équivalents de HBTU et 4 équivalents de HOBt, en présence de 12 équivalents de DIEA dans du DMF, et en contrôlant les réactions par des tests à la nynhidrine et au TNBS.
Le clivage des produits résultants et leur déprotection ont été réalisés en traitant la résine par 10 ml d'un mélange TFA/H2O/'Pr3SiH (95:2,5:2,5) par gramme de résine, à température ambiante et pendant 90 minutes. A la suite de quoi, ils ont été successivement précipités dans du diéthyléther froid, centrifugés, dissout dans de l'eau, lyophilisés et purifiés par une RP-HPLC semi-préparative [gradient (A/B) : 100:0 à 50:50 en 120 minutes]. Ont été ainsi obtenus : • 48 mg de ligand 25 (Rdt : 29%) en utilisant un gradient (A/B) : 100:0 à 50:50 en 100 minutes ; et • 25 mg d'un composé 26 (Rdt : 15%) en utilisant un gradient (A/B) : 100:0 à 60:40 en 100 minutes.
Ce composé 26 a été soumis à une désacylation pour obtenir le ligand 28. Pour ce faire, à 23 mg du composé 28 en solution dans 10 ml de methanol distillé sur magnésium, ont été ajoutés 300 μl d'une solution 1M de méthanolate de sodium dans du methanol. Le mélange réactionnel a été agité à température ambiante, sous azote, pendant 45 minutes et la réaction a été stoppée par l'addition de quelques gouttes d'acide acétique. Le brut réactionnel a été concentré sous pression réduite et a été purifié par RP-HPLC en utilisant un gradient (A B) : 100 :0 à 80 :20 en 30 minutes, puis 80 :20 à 70 :30 en 25 minutes, puis isocratique pendant 10 minutes pour conduire à 15 mg de ligand 28 (Rdt : 75%).
Les spectres ESI-MS des ligands 25 et 28 sont les suivants :
• ligand, 25 : mesuré : 3228.0, calculé : 3228.7, m/z 1076.9 (M+3H)3+, 808.0 (M+4H)4+, 646.7 (M+5H)5+
• ligand 28 : mesuré : 3283, calculé : 3282.7, m/z 1641.9 (M+2H)2+, 1094.9 (M+3H)3+, 821.4 (M+4H)4+, 657.4 (M+5H)5+.
EXEMPLE 4 : PREPARATION DE LIGANDS CONFORMES A L'INVENTION
Deux ligands répondant à la formule générale (III) conforme à l'invention (Figure 5), dans laquelle : m est un nombre entier égal à 2, n est un nombre entier égal à 1, y est un nombre entier égal à 1 ,
• B1 représente un reste acide (-)-quinique (ligand 33F) ou (-)-shikimique (ligand 34F),
• A représente le reste d'un dipeptide comprenant 1 résidu L-lysine et 1 résidu β-alanine (Nα-(chloroacétyl)-L-lysyl-β-alanine-amide, dont la structure chimique est représentée sur la Figure 5),
X représente un tripeptide de formule (SI), telle que définie dans l'exemple 1, • Y représente le reste d'une molécule de fluorescéine,
M, N et P représentent respectivement un groupe amide (-CO-NH-), thioéther (-CH2-S-CH2-CO-) et thiouree (-NH-CS-NH-), ont été préparés. a) Préparation du dipeptide Nα-(chloroacétyl)-L-lvsyl-β-alanine- amide.
Ce dipeptide est synthétisé manuellement à l'aide d'une résine Rink amide-AM-PS (0.70 mmol/g, Senn Chemicals) en utilisant une stratégie Εmocitert- butyle, à une échelle de 0.7 mmole. Le couplage est suivi par un test au TNBS : du HBTU dissous dans du NMP (4 éq.), est ajouté à un mélange de l'acide aminé (4 éq.), d'HOBt (4 éq.) et de DIEA (8 éq.) dans le NMP. Après 1 minute d'agitation, le mélange réactionnel est ajouté à la peptidyl-résine (1 éq.) préalablement imbibée de NMP comprenant du DIEA (4 éq.), et agité pendant 40 minutes. La peptidyl-résine (c'est-à-dire dire la séquence peptidique sur support solide) est filtrée, lavée par du NMP (3 x 2 minutes) et du CH2C12 (3 x 2 minutes). Les groupements protecteurs Fmoc sont supprimés par un traitement avec de la pipéridine à 20% dans le NMP (1 x 2 minutes, 1 x 20 minutes), suivi d'un lavage avec du NMP (2 x 2 minutes) et du CH2C12 (2 x 1 minutes). Après la seconde étape de couplage, la peptidyl-résine est déprotégée et acylée en utilisant un excès (4 éq.) d'anhydride chloroacétique, préparé via une activation DIC. Enfin, le dipeptide est séparé du support et déprotégé sous l'action d'un mélange TFA-TIS-H2O 90:5:5 (11 ml par gramme de peptidyl-résine), pendant 1,5 h à température ambiante, précipité dans un mélange diéthyléther-heptane (1 :1) froid, centrifugé, dissous dans l'eau et lyophilisé. Le dipeptide (184 mg, 65%) est obtenu sous la forme d'une poudre blanche après purification par RP-HPLC (avec le gradient suivant : 100:0 à 90:10 (A/B) en 20 minutes), suivie d'une lyophilisation. Son analyse est la suivante : TOF-PDMS m/z 292.6 (M+H)+; RMN Η (D2O-H2O 10:90): δ 8.37 (d, J= 6.8 Hz, 1H, lysyl αNH), 8.07 (t, J = 5.7 Hz, 1H, β-alanyl NH), 7.40 (s large, 1H, NH2), 4.11 (dt, J= 6.8 et 6.8 Hz, 1H, lysyl α-H), 4.01 (s, 2H, CH2), 3.31 (dt, J= 5.7 et 6.6 Hz, 2H, β-alanyl β-H), 2.84-2.81 (m, 2H, lysyl ε-H), 2.33 (t, J = 6.6 Hz, 2H, β-alanyl α-H), 1.72-1.53 (m, 4H, lysyl β- et δ-H), 1.42-1.22 (m, 2H, lysyl γ-H); RMN I3C (D2O-H2O 10:90): δ 175.7, 172.4, et 168.6 (3 CON), 53.2 (lysyl α-C), 41.0 (CH2), 38.4 (lysyl ε-C), 34.8 et 33.5 (β-alanyl α-C et β-C), 29.4 (lysyl β- C), 25.3 (lysyl δ-C), 21.0 (lysyl γ-C). b) Obtention des ligands répondant à la formule générale flID conforme à l'invention.
Le couplage du dipeptide préparé en a) avec, d'une part, les tripeptides porteurs des restes (-)-shikimique (composé 1) et (-)-quinique (composé 3), dont la synthèse est décrite dans l'exemple 1, et d'autre part, avec une molécule de fluorescéine, est effectué conformément au protocole décrit dans l'exemple 2. On obtient ainsi les ligands 33F et 34F.
5,04 mg (80% de rendement) de ligand 33F ont été obtenus sous la forme d'une poudre blanche, après purification par RP-HPLC (gradient : 100:0 à 85:15 (A/C) en 15 minutes, puis 85:15 à 75:25 (A/C) en 30 minutes, puis gradient isocratique), suivie d'une lyophilisation. Analyse du ligand 33F : ESI-MS positive m/z 1300.3 (M+H)+, 650.8 (M+2H)2+; RMN Η (DMSO-rf6): δ 10.2 (s large, IH, NH-fluor), 8.40-8.32 (m, 3H, H-fluor, lysyl αNH et lysyl εNH), 8.31 (t, J = 5.1 Hz, IH, glycyl NH), 8.24 (d, J= 7.8 Hz, lysyl αNH), 8.10 (t, J = 5.2 Hz, IH, β-alanyl NH), 7.82-7.80 (m, 2H, cysteinyl NH et lysyl εNH), 7.80 (d, J = 8.3 Hz, H-fluor), 7.41 (s large, IH, NHH), 7.22 (d, j = 8.3 Hz, H-fluor), 6.90 (s large, IH, NHH), 6.74-6.60 (m, 6Η, 6 H-fluor).
2,42 mg (80% de rendement) de ligand 34F ont été obtenus sous la forme d'une poudre blanche, après purification par RP-HPLC (gradient : 100:0 à 85:15 (A/C) en 15 minutes, puis 85:15 à 70:30 (A/C) en 50 minutes), suivie d'une lyophilisation. Analyse du ligand 34F : ESI-MS positive m/z 1264.4 (M+H)+, 632.8 (M+2H)2+; RMN Η (DMSO-</6): δ 10.07 (s, IH, OH), 9.81 (s large, IH, NH-fluor), 8.22 (t, J = 5.7 Hz, IH, glycyl NH), 8.20 (s large, IH, H-fluor), 8.11 (d, J = 8.0 Hz, 2H, 2 lysyl αNH), 8.01 (t, J = 5.6 Hz, IH, lysyl εNH), 7.99 (t, J = 5.8 Hz, β-alanyl NH), 7.77 (t, J= 5.6 Hz, IH, lysyl εNH), 7.75 (d, J= 7.6 Hz, IH, cysteinyl NH), 7.69 (d large, J= 8.3 Hz, H-fluor), 7.28 (s large, IH, NHH), 7.12 (d, J= 8.3 Hz, H-fluor), 6.80 (s large, IH, NHH), 6.74-6.60 (m, 6Η, 6 H-fluor), 6.31 et 6.22 (2 s larges, 2 shikimoyl H-2). EXEMPLE 5 : PREPARATION DE LIGANDS CONFORMES A L'INVENTION
Quatre ligands répondant à la formule générale (III) conforme à l'invention, dans laquelle : m est un nombre entier égal à 8, n est un nombre entier égal à 4, y est un nombre entier égal à 1,
B1 représente un reste acide (-)-shikimique ou (-)-quinique, Y représente le reste d'une molécule de fluorescéine, A représente le reste d'un dendrimère A' comprenant 4 résidus L-lysine et présentant 4 groupes chloroacétyles pour sa liaison avec 4 tripeptides, et un groupe amine libre propre à permettre sa liaison avec Y,
X représente le reste d'un tripeptide de séquence (S2) ou (S3), telles qu'elles seront définies ci-dessous, • M, N et P représentent respectivement un groupe amide (-CO-NH-), thioéther (-CH -S-CH2-CO-) et thiouree (-NH-CS-NH-), ont été préparés selon le protocole suivant. a) Préparation du composé O. dérivé de l'acide quinique dans lequel les hvdroxyles situés aux positions 3 et 4 sont protégés sous forme d'un diacétal fFigure 6).
Le composé Q, à savoir l'acide (lsn, 3R, 4sn, 5R, 2'S, 3'S)-3,4-0- (2 ' ,3 ' -diméthoxybutane-2 ' ,3 ' -diyl)- 1 ,3 ,4,5 -tétrahydroxycyclohexane- 1 -carboxylique, est obtenu à partir 980 mg (3.06 mmol) de l'ester méthylique de l'acide 3,4-0-(2',3'- diméthoxybutane-2',3 '-diyl)- 1 ,3 ,4,5 -tétrahydroxycyclohexane- 1 -carboxylique (décrit par J.L. MONTCHAMP et al. dans J. Org. Chem., 1996, 61, 3897-3899) dissous dans 12 ml d'une solution MeOH-aq/NaOH 0.1 M (1:1). Le mélange réactionnel est agité à température ambiante pendant 2 h et concentré sous pression réduite. Le résidu est séparé à l'aide d'EtOAc et d'acide citrique aqueux (0,1 M). La phase aqueuse est extraite deux fois avec EtOAc. Les phases organiques sont réunies, séchées sur Na2SO , filtrées et concentrées sous pression réduite. On obtient 780 mg (rendement de 80%) du composé Q après cristallisation dans Et2O-heptane. RMN Η : δ (DMSO- d6) 4.05 (1 H, ddd, J4.6, 10.1 et 12.6 Hz, H-5), 3.89 (1 H, s large, H-3), 3.31 (1 H, dd, J 2.8 et 10.1 Hz, H-4), 3.15 (2 x 3 H, s, 2 OCH3), 1.89 (1 H, dd, J4.6 et 12.6 Hz, H-6), 1.74-1.64 (3 H, m, 2 H-2 et H-6'), 1.23 et 1.14 (2 x 3 H, 2 s, 2 CH3); RMN 13C : δ (OMSO-d6) 177.0 (COO), 76.0 (C-l), 73.9 (C-4), 69.0 (C-3), 63.8 (C-5), 48.1 et 48.0 (2 OCH3), 39.1 et 39.5 (C-2 et C-6), 18.6 (2 CH3). b) Préparation des tripeptides de séquences (S2~> et (S3).
Ces tripeptides présentent les séquences suivantes : Lys-Cys(tert-butylthio)-Gly-OH (S2)
Lys-Cys(tert-butylthio)-Arg-NH2 (S3)
Les tripeptides (S2) et (S3) sont respectivement neutres et chargés positivement en milieu physiologique, par opposition au peptide (SI) décrit dans l'exemple 1, qui est chargé négativement en milieu physiologique.
Ils sont obtenus selon le même protocole que celui décrit dans l'exemple 1 pour la synthèse du peptide (SI), si ce n'est que les synthèses ont été réalisées à partir d'une résine Rink amide-AM-PS (0.70 mmol/g, Senn Chemicals), à une échelle de 0.2 mmole. Le groupement protecteur du Fmoc-L-Arg-OH est un groupe 2,2,5, 7,8-pentaméthylchroman-6-sulfonyle. c) Couplage de l'acide shikimique et du dérivé de l'acide quinique (composé O) sur les peptides (S2) et (S3).
0,2 mmole de chaque peptidyl-résine (c'est-à-dire la séquence peptidique sur support solide), à savoir 0,2 mmole de séquence (S2), d'une part, et 0,2 mmole de séquence (S3), d'autre part, sont mis en présence de 123 mg (0.4 mmol, 2 éq.) du composé Q, en présence de BOP (177 mg, 0,4 mmol, 2 éq.) et de DIEA (140 μl, 0,8 mmol, 4 éq.) dans le DMF pendant 1 h et à température ambiante. La peptidyl-résine est ensuite lavée par du DMF (2 x 2 minutes) et du CH2CI2 (3 x 1 minute). Le couplage est effectué une seconde fois.
Par ailleurs, 0,2 mmole de chaque peptidyl-résine sont mis en présence de 61 mg (0,44 mmol, 2,2 éq.) d'acide shikimique, en utilisant un activation par HBTU-HOBt-DIEA [(166 mg, 0,44 mmol, 2,2 éq.), (67 mg, 0,44 mmol, 2,2 éq.), (146 ml, 0,84 mmol, 4,2 éq.)] dans le NMP, pendant 40 minutes à température ambiante. La peptidyl-résine est ensuite lavée par du DMF (2 x 2 minutes) et du CH2CI2 (3 x 1 minute). Le couplage est effectué une seconde fois.
Les peptidyl-résines sont ensuite lavées par Et2O. Les peptides sont séparés du support solide au moyen d'un traitement par un mélange TFA-H2O-iPr3SiH 95:2.5:2.5 (10 ml par gramme de peptidyl-résine), pendant 1 h à température ambiante, précipités dans un mélange diéthyléther-heptane froid, centrifugés, dissous dans l'eau, puis lyophilisés. On obtient les peptides (S2)q, (S2)s, (S3)q et (S3s), qui correspondent respectivement aux tripeptides (S2) et (S3) portant deux restes d'acide quinique (peptides (S2)q et (S3)q) ou deux restes d'acide shikimique (peptides (S2)s et (S3)s), comme représentés sur les Figures 6 et 7. • Peptide (S2)q
Il s'agit du Nα,Nε-di-[(lsn,3R,4sn,5R)-l,3,4,5-tétrahydroxycyclo- hexane- 1 -carbox- 1 -yl]-L-lysyl-[S-(tert-butylthio)]-L-cysteinyl-glycine-amide. On obtient 35.6 mg (rendement de 24%) de ce produit sous la forme d'une poudre blanche, après purification par RP-HPLC [gradient: 100:0 à 72:28 (A/B) pendant 20 minutes, puis 72:28 à 62:38 (A/B) pendant 30 minutes] suivie d'une lyophilisation.
RMN Η : δ (D2O-H2O 5:95) 8.50 (1 H, d, J 6.9 Hz, Cysteinyl NH), 8.35 (1 H, t, J 5.9 Hz, Glycyl NH), 8.16 (1 H, d, J 6.9 Hz, Lysyl αNH), 8.12 (1 H, d, J 6.1 Hz, Lysyl εNH), 7.30 et 7.00 (2 x 1 H, 2 s large, NH2), 4.52 (1 H, m, Cysteinyl αH), 4.16 (1 H, dt, / 6.9 et 5.9 Hz, Lysyl αH). 4.09-4.08 (2 H, m, 2 H-3), 3.97-3.90 (2 H, m 2 H-5),
3.85 (1 H, dd, J 5.9 et 10.4 Hz. Glycyl αH), 3.72 (1 H, dd, J 5.9 et 10.4 Hz, Glycyl αH), 3.43-3.38 (2 H. m, H-4), 3.14-3.09 (2 H, m, Lysyl εH and Cysteinyl βH), 2.94 (1 H, dd, J 8.5 et 14.0, Cysteinyl βH), 2.05-1.65 (6 H, m, 2 H-2, 2 H-6 etLysyl βH),
1.45-1.38 (1 H, m, Lysyl δH), 1.23-1.19 (2 H, m, Lysyl γH), 1.20 (3 x 3 H, s, 3 CH3);
RMN 13C: δ (D2O-H2O 5:95) 177.5, 177.2, 174.7, 174.3 et 172.8 (5 CON), 77.1 (2 C-
1), 75.5 et 75.4 ( 2 C-4), 70.8 (2 C-3), 66.8 et 66.7 (2 C-5), 54.4 (Lysyl αC), 53.5
(Cysteinyl αC), 48.6 [C(CH3)3], 42.8 (Glycyl αC), 40.7 (2 C-6), 40.3 (Cysteinyl βC), 39.4 4 (Lysyl εC), 37.5 (2 C-2), 30.8 (Lysyl βC), 29.4 [C(CH3)3], 28.3 (Lysyl δC),
22.7 (Lysyl γC); m/z (TOF-PDMS) 765 (M+Na)+.
• Peptide (S2)s
Il s'agit du Λ'σ,Nf-di-[(3Λ,45'.5i?)-3,4,5-trihydroxy-l-cyclohexene- carbox-l-yl]-L-lysyl-[lS-(tert-butv'lthio)]-L-cysteinyl-glycine-amide. On obtient 56 mg (rendement de 40%) de ce produit sous la forme d'une poudre blanche, après purification par RP-HPLC [gradient: 100:0 à 90:10 (A/B) pendant 10 minutes, puis 90:10 à 85:15 (A/B) pendant 15 minutes, puis gradient isocratique (A/B)] suivie d'une lyophilisation. RMN Η : δ (D2O-H2O 5:95) 8.46 (1 H, d, J 7.1 Hz, Cysteinyl NH),
8.27 (1 H, t, J5.8 Hz, Glycyl NH), 8.08 (1 H, d, J6.2 Hz, Lysyl αNH), 7.87 (1 H, t, J
5.5 Hz, Lysyl εNH), 7.26 et 7.0 (2 x 1 H, s large, NH2), 6.28 et 6.22 (2 x 1 H, 2 d larges, J3.7 Hz, 2 H-2), 4.50 (1 H, m, Cysteinyl αH), 4.26 (2 H, m, 2 H-3), 4.17 (1 H, dt, J6.2 et 6.4, Lysyl αH), 3.89-3.83 (2 H, m, 2 H-5), 3.80 et 3.76 (2 x 1 H, 2 dd, J5.8 et 15.4 Hz, 2 Glycyl αH), 3.71-3.54 (2 H, m, 2 H-4), 3.12-3.06 (2 H, m, Lysyl εH et
Cysteinyl βH), 2.90 (1 H, dd, J8.9 et 14.0 Hz, Cysteinyl βH), 2.62-2.53 (2 H, m, 2 H-
6), 2.05 (2 H, dd, J6.9 et 18.7 Hz, 2 H-6'), 1.76-1.56 (2 H, m, 2 Lysyl βH), 1.43-1.37 (2 H. m, 2 Lysyl δH), 1.27-1.15 (2 H, m, 2 Lysyl γH), 1.15 (3 x 3 H, s, 3 CH3); RMN
13C : δ (D2O-H2O 5:95) 175.0, 174.4, 172.9, 171.0 et 170.5 (5 CON), 133.7 et 133.0
(2 C-2), 132.2 et 131.0 (2 C-l), 72.0 et 71.9 (2 C-3), 66.8 et 66.3 (2 C-4 et 2 C-5),
55.0 (Lysyl αC), 53.7 (Cysteinyl αC), 48.7 [C(CH3)3], 42.7 (Glycyl αC), 40.2
(Cysteinyl βC), 39.8 (Lysyl εC), 31.7 et 31.5 (2 C-6), 30.6 (Lysyl βC), 29.4 [C(CH3)3], 28.3 (Lysyl δC), 22.9 (Lysyl γC); m/z (TOF-PDMS) 729 (M+Na)+.
• Peptide (S3)q
Il s'agit du Λ^ -di-[(l5n,3R,45n,5iî)-l,3,4,5-tétrahydroxycyclo- hexane- 1 -carbox- 1 -yl]-L-lysyl-[-S'-(tert-butylthio)]-L-cysteinyl-L-argimne-amide. On obtient 45 mg (rendement de 24%) de ce produit sous la forme d'une poudre blanche, après purification par RP-HPLC [gradient: 100:0 à 85:15 (A/B) pendant 15 minutes, puis 85:15 à 75:25 (A/B) pendant 30 minutes] suivie d'une lyophilisation. RMN Η : δ
(D2O-H2O 5:95) 8.39 (1 H, d, J7.0 Hz, Cysteinyl NH), 8.27 (1 H, d, J7.5 Hz, Lysyl αNH), 8.14 (1 H, d, J6.9 Hz, Arginyl αNH), 8.12 (1 H, t, J 6.1 Hz, Lysyl εNH), 7.42 et
7.0 (2 H. 2 s, NH2), 7.1 (1 H, t, J 5.3 Hz, Arginyl δNH), 6.55 (s large, guanidinium), 4.50 ( 1 H, m, Cysteinyl αH), 4.30-4.10 (2 H, m, Arginyl αH et Lysyl αH), 4.09 (2 H, s large, 2 H-3), 3.98-3.89 (2 H, m, 2 H-5), 3.43-3.37 (2 H, m, 2 H-4), 3.10-3.05 (5 H, m, 2 Arginyl δH, 2 Lysyl εH et Cysteinyl βH), 2.97 (1 H, dd, J 8.9 et 14.0 Hz,
Cysteinyl βH), 1.95-1.54 (8 H, m, 2 Arginyl βH, 2 Lysyl βH, 2 H-2 et 2 H-6), 1.55-
1.48 (2 H, m, 2 Arginyl γH), 1.49-1.32 (2 H, m, 2 Lysyl δH), 1.27-1.15 ( 2 H, m, 2 Lysyl γH), 1.20 ( 3 x 3 H, s, 3 CH3); RMN 13C : δ (D2O-H2O 5:95) 177.5, 177.2, 176.2, 174.5 et 172.1 (5 CON), 157.3 [NH(C=NH)NH2], 77.2 (2 C-l), 75.5 (2 C-3), 70.9 et 70.8 (2 C-5), 66.8 et 66.7 (2 C-4), 55.6 (Cysteinyl αH), 53.6 (Lysyl αH et Arginyl αH), 48.8 [C(CH3)3], 41.0 et 40.5 6 (Cysteinyl βH et Arginyl δH), 40.7 (2 C- 6), 39.4 (Lysyl εH), 37.5 (2 C-2), 30.9 (Lysyl βH), 29.4 [C(CH3)3], 28.6 et 28.4 (Lysyl δH et ArginylβH), 24.9 (Arginyl γH), 22.7 (Lysyl γH); m/z (TOF-PDMS) 842 (M+H)+.
• Peptide (S3)s
Il s'agit du Nûr,Nfi-di-[(3i-,41S',5i?)-3,4,5-trihydroxy-l-cyclohexene- carbox-l-yl]-L-lysyl-[ιS'-(tert-butylthio)]-L-cysteinyl-L-arginine-amide. On obtient 48 mg (rendement de 26%) de ce produit sous la forme d'une poudre blanche, après purification par RP-HPLC [gradient: 100:0 à 90:10 (A/B) pendant 10 minutes, puis 90:10 à 85:15 (A B) pendant 12 minutes, puis gradient isocratique] suivie d'une lyophilisation. RMN Η : δ (D2O-H2O 5:95) 8.40 (1 H, d, J 6.8 Hz, Cysteinyl NH), 8.14 (1 H, d, J7.8 Hz, Lysyl αNH), 8.11 (1 H, d, J7.7 Hz, Arginyl αNH), 7.92 (1 H, t, J 5.7 Hz, Lysyl εNH), 7.39 et 7.05 (2 x 1 H, 2 s large, NH2), 7.07 (1 H, t, J 5.4 Hz, Arginyl °NH), 8.40 (1 H, d, J6.8 Hz, Cysteinyl NH), 6.55 (s large, guanidinium), 6.36 et 6.27 (2 x 1 H, 2 d large, J 3.9 Hz, 2 H-2), 4.52 (1 H, m, Cysteinyl αH), 4.33-4.28 (2 H, m, 2 H-3), 4.21-4.16 (2 H, m, Lysyl αH and Arginyl αH), 3.92-3.88 (2 H, m, 2 H- 5), 3.64-3.60 (2 H, m, 2 H-4), 3.15-2.96 (6 H, m, 2 Cysteinyl βH, 2 Lysyl εH, 2 Arginyl δH), 2.65-2.53 (2 H , m, 2 H-6), 2.10 (2 H, d large, J 6.6 Hz, 2 H-6'), 1.78- 1.65 (4 H, m, 2 Lysyl βH et 2 Arginyl βH), 1.54-1.40 (2 H, m, 2 Lysyl δH et 2 Arginyl γH), 1.31 (3 x 3 H, s, 3 CH3); RMN I3C : δ (D2O-H2O 5:95) 176.3, 174.9, 172.3, 171.0 et 170.5 (5 CON), 157.2 [NH(C=NH)NH2], 133.6 et 133.0 (2 C-2), 132.4 et 131.1 (2 C-l), 72.0 (2 C-3), 66.8 et 66.2 (2 C-4 and 2 C-5), 55.2 et 54.0 (Lysyl αC et Arginyl αC), 53.6 (Cysteinyl αC), 48.9 [C(CH3)3], 41.0 (Cysteinyl βC), 40.1 (Arginyl δC), 39.7 (Lysyl εC), 31.6 (2 C-6), 30.6 (Lysyl βC), 29.4 [C(CH3)3], 28.5 et 28.3 (Arginyl βC et Lysyl δC), 24.9 (Arginyl γC), 22.9 (Lysyl γC); m/z (TOF-PDMS) 805 (M+Na)+. d) Préparation du ligand 41F (Figure 6). 6 éq. du peptide (S2)q sont mis en solution dans un mélange dégazé de nPrOH-H2O 50:50 (1 ml). On y introduit 6 éq. de nBu3P. Le mélange est agité à température ambiante pendant 24 h, sous azote. Le solvant est évaporé sous pression réduite et le résidu obtenu est encore séché sous vide pendant 15 minutes. On ajoute 500 μl du mélange dégazé DMF-aq NaOAc 0.1 M (90:10), puis 0,9 μmol (1 éq.) du dendrimère de L-lysine 14, dont la préparation est décrite dans l'exemple 1. Le milieu réactionnel est agité pendant 24 h à température ambiante, l'avancement de la réaction étant suivi par RP-HPLC. De l'isothiocyanate de fluorescéine (4 éq.) est ajouté et le milieu est agité sous azote et à l'abri de la lumière pendant une nuit. Le milieu est dilué dans de l'eau, lyophilisé et purifié par RP-HPLC [gradient: 100:0 à 85:15 (A/B) pendant 15 minutes, puis 85:15 à 80:20 (A/B) pendant 15 minutes, puis gradient isocratique] pour donner 2,38 mg (rendement de 72%) du ligand 41F sous la forme d'une poudre blanche. Son analyse est la suivante : ESI-MS trouvé 3763.0, calculé 3765.1 ; m/z 1883.0 (M+2H) +, 1255.5 (M+3H)3+. e) Préparation des ligands 42F (Figure 6). 43F et 44F (Figure 7). 6 éq. du peptide (S2)s (ou du peptide (S3)s, ou encore du peptide
(S3)q) sont mis en solution dans un mélange dégazé de nPrOH-H2O 50:50 (1 ml). On y introduit 6 éq. de nBu3P. Le mélange est agité à température ambiante pendant 24 h, sous azote. Le solvant est évaporé sous pression réduite et le résidu obtenu est encore séché sous vide pendant 15 minutes, puis dissous dans 50 μl d'eau. 1 éq. (0,5-1 μmol) du dendrimère de L-lysine 14, dont la préparation est décrite dans l'exemple 1, dans 300 μl de DMF comprenant 4 éq. de DIEA est ajouté à 1 éq. d'isothiocyanate de fluorescéine. Le mélange est agité sous azote et à l'abri de la lumière pendant 2 h. Une fois la réaction achevée (d'après son suivi par RP-HPLC), le mélange est ajouté au milieu réactionnel contenant les composés peptidiques. Le pH du mélange est ajusté à 8-8,5 par ajout de K2CO3 solide. Le mélange est agité sous azote et à l'abri de la lumière pendant 24 h, à température ambiante, dilué dans de l'eau, lyophilisé et purifié par RP-HPLC pour donner les ligands 42F, 43F ou 44F.
On obtient 1,3 mg (rendement de 36%) du ligand 42F sous la forme d'une poudre blanche, après purification par RP-HPLC HPLC [gradient: 100:0 à 82:18 (A/B) pendant 18 minutes, puis 82:18 à 72:28 (A/B) pendant 30 minutes], suivie d'une lyophilisation. Son analyse est la suivante : ESI-MS trouvé 3620.0, calculé 3621.0 ; m/z 1207.7 (M+3H)3+, 1001.8 (M+3H-C25H38N5On)3+, 905.9 (M+4H)4+.
On obtient 1,3 mg (rendement de 36%) du ligand 43F sous la forme d'une poudre blanche, après purification par RP-HPLC HPLC [gradient: 100:0 à
82:18 (A/B) pendant 18 minutes, puis 82:18 à 72:28 (A/B) pendant 30 minutes], suivie d'une lyophilisation. Son analyse est la suivante : ESI-MS trouvé 4160.0, calculé 4161.7 ; m/z 1387.6 (M+3H)3+, 1041.0 (M+4H)4+, 833.0 (M+5H)5+.
On obtient 1,3 mg (rendement de 36%) du ligand 44F sous la forme d'une poudre blanche, après purification par RP-HPLC HPLC [gradient: 100:0 à 82:18 (A/B) pendant 18 minutes, puis 82:18 à 75:25 (A/B) pendant 21 minutes, puis gradient isocratique], suivie d'une lyophilisation. Son analyse est la suivante : ESI-MS trouvé 4016, calculé 4017.6 ; m/z 1339.9 (M+3H)3+, 1005.2 (M+4H)4+, 804.4 (M+5H)5*.
EXEMPLE 6 : PREPARATION DE LIGANDS CONFORMES A L'INVENTION
Deux ligands répondant à la formule générale (HI) conforme à l'invention, dans laquelle : m est un nombre entier égal à 4 ou à 8, n est un nombre entier égal à 0 (et donc X est absent), • y est un nombre entier égal à 1,
B1 représente un reste acide (-)-quinique, Y représente le reste d'un antigène,
A représente le reste d'un dendrimère A' comprenant 8 (dans le cas du ligand 51 représenté sur la Figure 10) ou 4 (dans le cas du ligand 52 représenté sur la Figure 11) résidus L-lysine,
M et P représentent respectivement des groupes thioéther (-CH2-S-CH2-CO-) et hydrazone (-CO-CH=N-NH-CH2-CO-), ont été préparés selon le protocole suivant.
Ces ligands sont obtenus par ligation de dérivés de l'acide quinique, à savoir l'acide quinique fonctionnalisé par une fonction thiol (composé G), à un dendrimère de lysine (dendrimère H ou I) et à un antigène peptidique (antigène J ou K), selon le protocole décrit ci-après. a) Préparation du dérivé de l'acide quinique (composé G. Figure 8). Le composé G représente le disulfure de 2-{N,N-di-[(l->n,3-K,4.sn,5.r?)- l,3,4,5-tétrahydroxycyclohexane-l-carboxamido-l-yl]}éthyl. Il est obtenu en mélangeant, pendant une nuit et à 50°C, 52 mg (0,3 mmol) d'acide quinique lactone et 34 mg (1 éq.) de chlorhydrate de cystéamine, dans de l'eau dégazée contenant du K2CO solide (pH 8-9). Le mélange est ensuite agité à température ambiante pendant 24 h, en présence d'air, avant d'être purifié par RP-HPLC [gradient: 100:0 à 80:20 (A/C) pendant 15 minutes, puis isocratique], puis lyophilisé pour donner le composé G (70 mg, 71%) sous la forme d'une poudre blanche. Son analyse est la suivante : RMN Η : δ = 8.24 (t, 3J(H,H) = 5.8 Hz, 2 H; 2 NH), 4.05 (ddd, 3J(H,H) = 3, 3 et 6.2 Hz, 2 H; 2 H-3), 3.90 (ddd, 3J(H,H) = 4.7, 9 et 11.6 Hz, 2 H; 2 H-5), 3.40 (t, 3J(H,H) = 6.4 Hz, 4 H; 2 CH2), 3.38 (dd, 3J(H,H) = 3 et 9 Hz, 2 H; 2 H-4), 2.73 (t, J(H,H) = 6.4 Hz, 4 H; 2 CH2), 1.94-1.83 (m, 6 H; 4 H-2 et 2 H-6), 1.77 (dd, 3J(H,H) = 11.6 et 13.4 Hz, 2 H; 2 H-6'); RMN 13C : δ = 177.5 (2 CON), 77.8 (2 C-l), 75.4 (2 C-4), 70.8 (2 C-3), 66.7 (2 C-5), 40.7 (2 C-6), 38.5, 37.5 et 37.1 (4 CH2 et 2 C-2); TOF-PDMS: m/z 469 [M+H]+. b) Préparation des dendrimères H (Figure 8) et I ("Figure 9).
• Fonctionnalisation d'une résine amino-PEGA par un bras espaceur. On ajoute successivement, à une solution d'ester diméthylique de l'acide (+)-2,3-0-isopropylidene-D-tartarique (733 μl), 7.2 μl (4 éq.) d'eau et 59.6 μl (4 éq.) de l,8-diazabicyclo[5,4,0]undéc-7-ène, à température ambiante. Le milieu réactionnel est agité pendant 1 h, puis ajouté à 0.1 mmol d'une résine amino-PEGA (0.4 mmol/g) imbibée dans une quantité minimale de DMF, la résine ayant, au préalable, été neutralisée par 5% DIEA dans le CH2C12 (2 x 1 minute) et le DMF (3 x 1 minute). On ajoute ensuite du BOP (177 mg, 4 éq.) dans le DMF (1 ml) et le mélange obtenu est agité à température ambiante pendant 40 minutes. La résine est lavée par du DMF (4 x 2 minutes) et du CH2C12 (2 x 2 minutes). Elle est imbibée de DMF et acylée par du 1,3-diaminopropane (0.65 ml) à température ambiante pendant 1 h. Enfin, la résine est lavée par du DMF (3 x 1 minute) et du CH2CI2 (2 x 2 minutes). • Synthèse des dendrimères à base de L-lysine. Ces dendrimères sont synthétisés sur la résine amino-PEGA fonctionnalisée comme indiqué ci-dessus (0.2 mmol/g, Senn Chemicals) en utilisant une stratégie Fmoc/tert-Butyle, à une échelle de 0,1 mmole. Les étapes de couplage sont réalisées à l'aide d'un excès de 10 (pour les deux premiers couplages) ou de 4 éq. en acides aminés par rapport aux groupements aminés réactionnels, l'activation étant effectuée par le mélange HBTU-HOBt-DIEA dans le NMP. Les couplages sont suivis, par exemple, par le test du TNBS, comme décrit dans l'exemple 4.
Le Fmoc-β-Ala-OH est d'abord couplé à la résine. Les résidus lysines sont ensuite introduits : la première lysine introduite est protégée par un groupement Boc, les autres lysines étant ajoutées sous la forme de leurs dérivés Fmoc-
L-Lys(Fmoc)-OH. Après les quatrième et cinquième étapes de couplage, les peptides sont déprotégés en phase solide et acylés, dans du DMF, en utilisant un excès (4 éq.) d'anhydride chloroacétique, préparé en utilisant une activation au DCC. La peptidyl- résine est lavée par du DMF (3 x 1 minute), par du CH2C12 (3 x 2 minutes) et par Et2O
(2 x 1 minute), puis séchée. Les groupements Boc du ε-NH2 du premier résidu lysine et du groupe isopropylidène du bras espaceur fixé sur le support sont éliminés par un traitement avec un mélange TFA-H2O-anisole 95:2.5:2.5 (10 ml), pendant 2 h à température ambiante. La peptidyl-résine est lavée par du CH2C12 (5 x 1 minute) et par Et2O (2 x 1 minute), puis séchée et imbibée d'AcOH aqueux. On y ajoute du NaIO4
(128.3 mg, 6 éq.) dissous dans un mélange AcOH aqueux (33%)/H2O 1:1 (2 ml). Le mélange est agité pendant 5 minutes, puis 200 μl d'éthylène glycol y sont ajoutés. La résine est lavée à l'eau (2 x 6 ml) et les filtrats récupérés sont purifiés par RP-HPLC.
Après purification par RP-HPLC [gradient: 100:0 à 50:50 (A/B) pendant 120 minutes] et lyophilisation, on obtient 28 mg (rendement de 31%) du dendrimère H sous la forme d'une poudre blanche. Son analyse est la suivante : m/z
(ESI-MS positive) 1038.4 (M+H2O)+, 1020.3 (M+H)+.
Après purification par RP-HPLC [gradient: 100:0 à 90:10 (A/B) pendant 10 minutes, puis 90:10 à 70:30 (A/B) pendant 40 minutes, puis isocratique] et lyophilisation, on obtient 45 mg (rendement de 23,5%) du dendrimère I sous la forme d'une poudre blanche. Son analyse est la suivante : m/z (ESI-MS positive) 1855.5
(M+H2O)+, 1838.3 (M+H)+, 919.5 (M+2H)2+. c) Préparation des antigènes peptidiques J et K (Figure 8).
Les épitopes (séquences peptidiques dénomées HA307"319 et χχ830-846 sur la Figure 8) sont synthétisés sur une échelle de 0.25 mmole à l'aide d'une résine
Rink amide-Nleu-AM-PS (0.38 mmol/g, Senn Chemicals), sur un synthétiseur automatique de peptides Applied Biosystems A431. Le groupement protecteur des chaînes latérales du Fmoc-L-Lys-OH est le groupe Boc ; le groupement protecteur pour Fmoc-L-Ser-OH, Fmoc-L-Glu-OH, Fmoc-L-Thr-OH, Fmoc-L-Tyr-OH et Fmoc-
L-Asp-OH sont le tert-butyle ; le groupement protecteur pour Fmoc-L-Asn-OH, Fmoc-
L-Gln-OH et Fmoc-L-His-OH est le groupe trityle ; le groupement protecteur pour Fmoc-L-Arg-OH est le groupe 2,2,4,6,7-pentaméthyldihydrobenzofuran-5-sulfonyle.
• Préparation de l'antigène J (H2N-Gly-HA307-319).
Une fois la synthèse peptidique effectuée, la peptidyl-résine
(0,125 mmol) est déprotégée et couplée deux fois manuellement en utilisant un excès de 4 éq. d'anhydride bromoacétique, préparé par une activation au DIC (pendant 20 minutes) dans le DMF, suivie d'un lavage au DMF (3 x 1 minute) et au CH2CI2 (3 x 2 minutes). 66 mg (4 éq.) de tert-butylcarbazate sont ajoutés à la peptidyl-résine imbibée de DMF contenant du DIEA (174 μl 8 éq.). Le mélange est agité une nuit, puis lavé par du DMF (3 x 1 minute), du CH2CI2 (3 x 2 minutes) et par Et2O (2 x 1 minutes). Enfin, le peptide est séparé du support et déprotégé au moyen du mélange TFA-anisole-H2O 95:2.5:2.5 (10 ml), pendant 3 h à température ambiante, précipité dans du diéthyléther froid, centrifugé, dissous dans l'eau et lyophilisé. On obtient
101 mg (rendement de 40%) de l'antigène J sous la forme d'une poudre blanche après purification par RP-HPLC semi-préparative [gradient: 100:0 à 50:50 (A/F) pendant 90 minutes] et lyophilisation. L'analyse de l'antigène J par ESI-MS positive est la suivante : m/z 1575 (M+H)+.
. Préparation de l'antigène K (H2N-Gly-TT830-846). On procède comme indiqué ci-dessus en rapport avec la préparation de l'antigène J, aux différences près que :
- le peptide est séparé du support et déprotégé au moyen du mélange TFA-iPr3SiH-H2O 95:2.5:2.5 (10 ml), pendant 1,5 h,
- le gradient, pour la purification de l'antigène par RP-HPLC, est le suivant : 100:0 à 75:25 (A/F) pendant 25 minutes, puis isocratique (A/F). Après purification par RP-HPLC et lyophilisation, l'antigène K est obtenu sous la forme d'une poudre blanche, avec un rendement de 15%. Son analyse par ESI-MS positive est la suivante : calculé 2052.5, trouvé 2052.0 ; m/z: 1026.7 [M+2H]2+, 684.8 [M+3H]3+, 514.0 [M+4H]4+. d) Préparation des ligands 51 et 52.
• Ligand 51 (Figure 10).
Le composé G (1,5 éq. / groupes chloroacétiques à substituer), dont la préparation est décrite au paragraphe a) ci-dessus, est dissous dans le mélange nPrOH-H2θ 1:1 (500 μl). On ajoute du tri-n-butylphosphine (1 éq.). Après une nuit à température ambiante sous atmosphère d'azote, le mélange est concentré sous pression réduite pendant 20 minutes, repris dans 500 μl d'eau et ajouté à 0,8 μmol (1 éq.) de dendrimère I dissous dans 600 μl de DMF. Le pH est ajusté à 8-8,5 par addition de potassium de carbonate solide. Le mélange est agité pendant 24 à 48 h à température ambiante et sous atmosphère d'azote. On ajoute ensuite 350 μl d'un tampon citrate/phosphate et l'antigène peptidique J. Le pH est ajusté à 5,2 par addition d'HCl aqueux IN. Le mélange est agité pendant 12 h à température ambiante, dilué dans de l'eau, congelé et lyophilisé. 1,52 mg du ligand 51 (rendement de 35%) sont obtenus, sous la forme d'une poudre blanche, après purification par RP-HPLC [gradient: 100:0 à 90:10 (A/B) pendant 10 minutes, puis 90:10 à 75:25 (A/B) pendant 50 minutes] et lyophilisation. Son analyse par ESI-MS positive est la suivante : calculé 5114.1, trouvé 5112 ; m/z: 1704.9 [M+3H]3+, 1278.9 [M+4H]4+, 1030.9 [M+5H+K]5+, 859.3 [M+5H+K]6+.
• Ligand 52 (Figure 11).
Le composé G (1,5 éq. / groupes chloroacétiques à substituer) est dissous dans le mélange nPrOH-H2O 1:1 (500 μl). On ajoute du tri-n-butylphosphine (1 éq.). Après une nuit à température ambiante sous atmosphère d'azote, le mélange est concentré sous pression réduite pendant 20 minutes. En parallèle, 0.4 μmol du dendrimère H sont mis en présence de 1 éq. d'antigène K dans le mélange 'BuOH- H2O (180-20 μl), à température ambiante et sous atmosphère d'azote. Une fois la réaction terminée (suivie par RP-HPLC), le milieu réactionnel est ajouté au composé G préparé ci-dessus et le pH est ajusté à 8-8.5 par addition de potassium de carbonate solide. Le ligand 52 est ensuite isolé comme décrit ci-dessus pour le ligand 51. 0,71 mg du ligand 52 (rendement de 42%) sont obtenus, sous la forme d'une poudre blanche, après purification par RP-HPLC [gradient: 100:0 à 75:25 (A/B) pendant 20 minutes, puis 75:25 à 60:40 (A/B) pendant 30 minutes] et lyophilisation. Son analyse par ESI-MS positive est la suivante : calculé 3913.6, trouvé 3912 ; m/z: 1305.0 [M+3H]3+, 979.1 [M+4H]4+, 783.6 [M+5H]5+.
EXEMPLE 7 : PREPARATION DE COMPOSES UTILES EN TANT QUE COMPOSES INTERMEDIAIRES POUR LA PREPARATION DE LIGANDS CONFORMES A L'INVENTION
Deux composés répondant à la formule générale (VI) conforme à l'invention, dans laquelle : m est un nombre entier égal à 58 environ (pour le composé dénommé « 5% QuinPEI » dans ce qui suit) et 116 environ environ (pour le composé dénommé « 10% QuinPEI » dans ce qui suit) ,
B1 représente un reste acide (-)-quinique, • M représente une fonction amide (-CO-NH-),
A représente le reste d'un polymère linéaire de polyéthylèneimine (PEI), ont été préparés par condensation du PEI sur l'acide quinique 1,5-lactone (γ-lactone résultant de l'esterification entre le groupe carboxyle porté par le carbone situé en position 1 et le groupe hydroxyle situé en position 5 de l'acide (-)-quinique), selon le protocole suivant.
L'acide D(-)-quinique (Aldrich) est transformé en 1,5-γ-lactone bicyclique (aussi dénommée "quinide") par chauffage dans du toluène, en présence d'acide j-toluènesulfonique, comme décrit notamment par H.O.L. FISCHER dans Chem. Ber., 1921, 54, 775-785, par M. PHILIPPE et al dans J. Antibiotics, 1982, 25, 1507-1512 et par P.Q. HUANG et al dans Tetrahedron Lett., 1995, 36, 8299-8302. La lactone (10,1 mg, 58,1 μmol) réagit avec 50 mg de PEI (25 kDa, Aldrich), ce qui correspond à 1162 μmol de groupes amino, en supposant une masse moléculaire moyenne en poids de 43 Da pour l'unité répétitive du PEI. La réaction est effectuée dans 2 ml d'eau, pendant 24 h et à 50°C. Le milieu réactionnel est ensuite dilué et lyophilisé. On obtient du PEI substitué, à un taux de 5%, par de l'acide quinique (dénommé ci-après "5% QuinPEr"). En utilisant deux fois plus de lactone (20,2 mg, 116,2 μmol), on obtient du PEI substitué, à un taux de 10%, par de l'acide quinique (dénommé ci-après "10% QuinPEr'). L'achèvement de la réaction est indiqué, par analyse RMN Η et 13C du milieu réactionnel, par l'absence du signal correspondant à la quinide (la condensation de la quinide sur le PEI se traduit en effet par l'ouverture du cycle de la lactone). Les résultats sont confirmés par quantification de la quantité d'acide quinique couplée sur le PEI, réalisée par spectroscopie RMN Η sur des échantillons des produits obtenus, purifiés par ultrafiltration sur des membranes amicon® (30000 Da, Millipore). La teneur du PEI en acide quinique est confirmée en comparant les surfaces des pics des protons des CH2 du squelette du polymère et des protons H-4, H-5 and H-6 des résidus d'acide quinique.
Le PEI est un polymère branché présentant des aminés secondaires et primaires. L'étude du specfre RMN Η permet de distinguer les acides quiniques liés via une liaison amide secondaire ou tertiaire (ces derniers étant signalés par un indice '). Ainsi, 5% QuinPEI et 10% Quin PEI contiennent respectivement 30 et 26% de résidus d'acide quinique branchés via une liaison amide tertiaire, le reste étant des liaisons amides secondaires. Dans les données qui suivent (analyses RMN Η et ' C effectuées dans D2O-H2O 10:90), la référence interne est le sel de sodium de l'acide 3-(triméthylsilyl) [2,2,3,3-dYI propionique.
5% QuinPEI: RMN Η δ 4.06 (s large, H-3'), 3.98 (ddd, J= 1.1, 3.3 et 7 Hz, H-3), 3.95-3.85 (m, 1 H, H-5'), 3.85 (ddd, J 4.8, 9.1 et 10.5 Hz, H-5), 3.39 (dd, J= 1.1 et 9.1 Hz, H-4 and H-4'), 3.20, 3.06, 2.71, 2.60 et 2.51 (5 s large, CH et CH2 PEI), 1.80-1.68 (m, 4 H, H-2, H-2', H-6 et H-6'); RMN I3C δ 180.7 (CON'), 177.5 (CON), 77.4 (C-l), 77.1 (C-l '), 75.7 (C-4), 75.5 (C-4'), 70.9 (C-3 et C-3'), 67.5 (C-5), 66.7 (C-5'), 56.5-46.0 (C PEI), 41.1 et 40.8 (C-6 et C-6'), 39.7-37.0 (C PEI), 38.0 (C-2 et C-2'). 10% QuinPEI: RMN Η δ 4.05 (d large, H-3'), 3.96 (ddd, J = 3.2,
3.2 et 7 Hz, H-3), 3.95-3.85 (m, H-5'), 3.85 (ddd, J4.8, 9.1 et 10.8 Hz, H-5), 3.37 (dd, J = 3.2 et 9.1 Hz, H-4 et H-4'), 3.17, 3.00, 2.65, 2.57 et 2.49 (5 s large, CH et CH2 PEI), 1.72-1.69 (m, 4 H, H-2, H-2', H-6 et H-6'); RMN 13C δ 181.7 (CON'), 177.3 (CON), 77.4 (C-l), 77.1 (C-l'), 75.7 (C-4), 75.5 (C-4'), 70.9 (C-3 et C-3'), 67.5 (C-5), 66.7 (C-5'), 55.4-46.0 (C PEI), 41.0 (C-6 et C-6'), 40.0-38.0 (C PEI), 37.9 (C-2 et C-2').
EXEMPLE 8 . ACTIVITE BIOLOGIQUE DES LIGANDS CONFORMES A L'INVENTION
L'activité biologique des ligands conformes à l'Invention a été vérifiée par une série d'expérimentations in vitro visant à tester leur aptitude à être intemalisés, via le récepteur du mannose, par des cellules dendritiques obtenues à partir de sang périphérique humain.
Les expérimentations rapportées ici ont été réalisées avec les composés suivants : • le méthyl-quinate (c'est-à-dire l'ester méthylique de l'acide quimque), qui est décrit par E. DELFOURNE et al. dans J. Chem. Res., 1991, 56-57, • le méthyl-α-D-mannopyranoside, commercialisé par la Société LANCASTER, les ligands liés à de la fluorescéine 23F et 24F dont la préparation est décrite dans l'exemple 2 ci-avant, • un composé, qui sera dénommé composé 30F dans ce qui suit et se différenciant des ligands 23F et 24F en ce qu'il comprend 8 chaînes polyhydroxylées de configuration galacto au lieu des 8 restes acide (-)-shikimique ou (-)-quinique, ce composé étant destiné à servir de "témoin" négatif en raison de la faible affinité que présente le récepteur du mannose vis-à-vis du D-galactose et des composés apparentés à ce dernier, et un composé, qui sera dénommé composé 31F dans ce qui suit et se présentant sous la forme d'un dendrimère constitué par 8 résidus L-lysine et 8 restes D-mannose, ce composé étant, lui, destiné à servir de "témoin" positif puisque le récepteur du mannose se lie préférentiellement au D-mannose. 1) - Protocole a) Préparation des composés 30F et 31F.
Le composé 30F a été préparé selon un protocole opératoire consistant :
• dans un premier temps, à synthétiser un tripeptide de séquence (SI) dans des conditions analogues à celles décrites au § 1.2 de l'exemple 1 ci-avant pour la préparation du composé 1 ; • puis, après clivage de ce tripeptide, par traitement de la résine par 25 ml d'un mélange TFA/H2O/Me2S (95:2,5:2,5) à la température ambiante pendant 2 heures, à coupler 1 molécule dudit tripeptide avec 2 molécules de D-galactonolactone, en faisant réagir 160 mg (0,90 mmoles) de D-galactonolactone avec une solution contenant 140 mg (0,22 mmoles) de tripeptide et 0,79 mmoles de DIEA dans 5 ml de methanol porté à reflux pendant 24 heures, puis en ajoutant à ce mélange réactionnel 80 mg (0,45 mmoles) de D-galactonolactone supplémentaires et maintenant le reflux pendant encore 24 heures ; et
. enfin, en couplant, dans des conditions identiques à celles décrites dans l'exemple 2 ci-avant, la iVα^Vf-di-[(2iî,3Λ,45,,5i?)-2,3,4,5-tétrahydroxy-l-hexane- carbox-l-yl]-L-lysyl-[5-(tert-butylthio)]-L-cystéyl-glycine ainsi obtenue avec un composé 14 ayant préalablement réagi avec du FITC.
Le composé 31F a été, quant à lui, préparé en traitant, un composé 15 par du 2-thioéthyl-α,D-mannopyranoside, puis en faisant réagir le composé résultant avec du FITC. b) Obtention des cellules dendritiques.
Les cellules dendritiques ont été obtenues par différenciation de monocytes, eux-mêmes isolés à partir de cellules mononuclées de sang périphérique humain, selon un protocole dérivé de celui décrit par AVRAMEAS et al. (Eur. J. Immunol, 1996, 26, 394-400). Pour ce faire, les cellules mononuclées présentes dans des prélèvements de sang périphérique humain (fournis par l'Etablissement de Transfusion Sanguine du Nord-Pas de Calais, FRANCE) ont été séparées des autres éléments du sang par centrifugation en gradient de densité Ficoll/Pâque (Société PHARMACIA), puis lavées 3 fois, par centrifugation, avec du milieu RPMI 1640 (Société GIBCO) contenant 3 mM d'EDTA.
Les cellules mononuclées ainsi isolées ont été mises en suspension, à 37°C et sous une atmosphère à 5% de CO2, dans un milieu de culture comprenant du milieu RPMI 1640 supplémenté par 5.10*5 M de β-mercaptoéthanol (Société MERCK), 2 mM de L-glutamine (Société MERCK), 1 mM de pyruvate de sodium (Société GIBCO), 10% de sérum foetal de veau inactivé par la chaleur (Société GIBCO), lOO UI/ml de pénicilline et par lOO μg/ml de streptomycine (toutes deux provenant de la Société SPECIA).
Puis, la suspension résultante a été répartie sur des boîtes de Pétri de 10 cm de diamètre, à raison de 8 à 12.107 cellules par disque. L'enrichissement en monocytes a été obtenu en laissant adhérer ces cellules aux boîtes, à 37°C et dans un incubateur à CO2 (5%) humidifié, pendant 3 à 4 heures. Après élimination des cellules non-adhérentes, les cellules adhérentes ont été remises en culture dans le milieu décrit ci-avant, mais comprenant de plus , 800 U/ml de facteur de croissance des lignées granulocytaires et macrophagiques humain recombinant (Société PEPRO TECH) et 1000 U/ml d'interleukine-4 humaine recombinante (Société PEPRO TECH), à raison de 106 cellules par ml de milieu. Elles ont été alors mises en culture, dans des plaques de culture cellulaire de 24 puits et dans les mêmes conditions de température et d'atmosphère que précédemment, pendant 6 à 8 jours au cours desquels il y a différentiation des monocytes vers les cellules dendritiques (ces dernières étant faiblement adhérentes). c) Analyse par cytométrie de flux des cellules non-adhérentes recueillies.
Afin de vérifier que les cellules non-adhérentes recueillies à l'étape b) ci-avant présentent bien les antigènes de surface caractéristiques des cellules dendritiques, une partie de ces cellules ont été lavées 2 fois avec du tampon PBS contenant 0,03 mg/ml de sérum albumine bovine, puis mises à incuber, sur de la glace et pendant 30 minutes, avec un anticorps monoclonal de souris dirigé contre le récepteur du mannose humain et conjugé à de la phycoérythrine (Société BECTON DICKINSON) et : soit un anticorps monoclonal de souris dirigé contre l'antigène CD la humain, qui représente l'un des principaux antigènes de surface des cellules dendritiques, soit un anticorps monoclonal de souris dirigé contre l'antigène CD 14 humain, qui représente, lui, l'un des antigènes de surface propres aux monocytes et macrophages, ces deux derniers anticorps étant marqués par du FITC (Société BECTON DICKINSON).
A l'issue de ces incubations, les cellules ont été lavées avec du tampon PBS et remises en suspension dans ce même tampon. La fluorescence leur étant associée a alors été analysée par cytofluorométrie, au moyen d'un cytomètre EPICS XL-MCL (Société COULTER CORPORATION). d) Test d'inhibition de l'intemalisation du composé 31F par le méthyl-quinate. Afin de montrer que le méthyl-quinate est un mime du mannose dans l'intemalisation avec le récepteur du mannose des cellules dendritiques, la compétition entre le méthyl-quinate, ou le méthyl-α-D-mannopyranoside (servant de témoin d'inhibition), et le composé 31F est étudiée selon le protocole suivant: les cellules dendritiques sont récupérées, lavées avec du tampon PBS, préincubées à 37°C, puis incubées pendant 20 minutes, à 37°C, avec des solutions de concentrations croissantes en méthyl-quinate et le composé 31F (en concentration finale de 5μM). Les cellules sont ensuite lavées avec du PBS, fixées dans du paraformaldéhyde à 1%, puis analysées par cytofluorométrie de flux, comme décrit en c) ci-dessus. e) Intemalisation des ligands conformes à l'Invention par les cellules dendritiques.
Les tests visant à apprécier l'intemalisation des ligands 23F et 24F ont été réalisés selon le protocole suivant : des cellules non-adhérentes recueillies à l'étape b) ci-avant ont été lavées 2 fois avec du tampon PBS contenant 1 mM de chlorure de calcium. A la suite de quoi, ces cellules ont été préincubées, à 37°C et pendant 10 minutes, puis mises à incuber, à 37°C et pendant 20 minutes, avec différentes solutions contenant chacune l'un des composés à tester, à une concentration comprise entre 1 et 10 μM. Les cellules ont ensuite été lavées 3 fois avec du tampon PBS froid et fixées pendant 20 minutes dans du paraformaldéhyde à 2%. La fluorescence associée à ces cellules a été alors appréciée par une analyse FACScan au moyen du cytomètre précité.
Par ailleurs, afin de vérifier que l'intemalisation des ligands 23F et 24F par les cellules dendritiques est bien liée à une reconnaissance de ces ligands par le récepteur du mannose et non à un autre mécanisme, ces tests ont été reconduits en préincubant les cellules en présence de solutions de mannane extrait de Saccharomyces cerevisiae (Société SIGMA), le mannane étant, en effet, connu pour être internalisé de manière sélective via le récepteur du mannose. Dans ce but, les cellules dendritiques sont récupérées, lavées avec du tampon PBS, incubées à 37°C, puis préincubées pendant 20 minutes, à 37°C, en présence de solutions de mannane extrait de Saccharomyces cerevisiae de concentrations comprises entre 10"* et 10 mg/ml. Ensuite, les ligands 23 F et 24F (en concentration finale de 5μM) sont ajoutés (incubation : 20 minutes à 37°C). Les cellules sont lavées au PBS, fixées dans du paraformaldéhyde à 1% et analysées par cytofluorométrie de flux, comme décrit en c) ci-dessus. f) Influence du nombre de mimes du mannose portés par les ligands conformes à l'Invention sur l'intemalisation de ces ligands. Afin d'étudier quelle est la construction optimale, c'est-à-dire quel est le ligand comportant le nombre de mimes du mannose le plus réduit (pour faciliter la synthèse chimique du ligand) qui est internalisé de façon spécifique par les récepteurs du mannose, les cellules dendritiques sont incubées pendant 20 minutes à 37°C avec 10 μM de ligands comprenant 2, 4 ou 8 résidus du mannose, de l'acide quinique ou de l'acide shikimique (ligands di-, tétra- ou octavalents). Après fixation dans du paraformaldéhyde, les cellules sont analysées par cytofluorométrie de flux, comme décrit en c) ci-dessus.
Pour ces expériences, les ligands suivants ont été utilisés :
. ligands porteurs de résidus d'acide shikimique : 34F (ligand divalent), 21F (ligand tétravalent) et 23F (ligand octavalent),
. ligands porteurs de résidus d'acide quinique : 33F (ligand divalent), 22F (ligand tétravalent) et 24F (ligand octavalent).
2) - Résultats a) Test d'inhibition de l'internalisation du composé 31F par le méthyl-quinate.
La Figure 12 illustre la capacité du méthyl-quinate à inhiber l'intemalisation du composé 31F. En ordonnées figurent les pourcentages d'inhibition, calculés par la formule :
% inhibition = (MnX 3 IF - MnX mqui) / MnX 3 IF où :
. « MnX » représente la valeur moyenne de l'intensité de fluorescence, . « MnX 3 IF » représente le signal dû à l'intemalisation du composé 31F seul,
. « MnX mqui » représente le signal dû à l'intemalisation du composé 31F en présence de différentes concentrations (exprimées en mM) de méthyl-quinate, indiquées en abscisses.
La courbe signalée par les symboles -*- représente l'inhibition de l'intemalisation du composé 31F par le méthyl-quinate, et la courbe signalée par les symboles -o- représente l'inhibition de l'intemalisation du composé 31F par le méthyl-α-D-mannopyranoside, composé servant de témoin d'inhibition.
En présence de méthyl-quinate, on remarque une inhibition efficace à 75% de l'intemalisation spécifique par le récepteur du mannose, comparable à celle du ligand de référence, le méthyl-α-D-mannopyranoside. b) Internalisation des ligands conformes à l'Invention par les cellules dendritiques.
La Figure 13 illustre, sous la forme de courbes, les valeurs moyennes des intensités de fluorescence présentées par les cellules dendritiques après une incubation en présence de solutions comprenant respectivement de 1 à 10 μM de ligand 23F (-•-), de ligand 24F (-•*-), de composé 30F (-Δ-) et de composé 31F (-D-). Sont exprimées, en ordonnées, les valeurs moyennes des intensités de fluorescence (UA) et, en abscisses, les concentrations des solutions.
La Figure 13 montre qu'une incubation des cellules dendritiques, d'une durée de 20 minutes et réalisée en présence d'une solution dosée à 1 μM de ligand 23F ou de ligand 24F est suffisante pour obtenir une internalisation de ces ligands par ces cellules. Elle montre également que cette internalisation est spécifique puisque le composé 30F (porteur de chaînes polyhydroxylées) ne pénètre pratiquement pas dans les cellules dendritiques, et ce quelle que soit la dose de ce composé utilisée pour l'incubation de ces cellules, alors que le composé 31F (porteur de restes D-mannose) se retrouve très largement dans lesdites cellules dendritiques. Par ailleurs, la Figure 14 illustre, sous la forme de courbes, les valeurs moyennes des intensités de fluorescence présentées par les cellules dendritiques lorsque celles-ci ont été soumises successivement à une préincubation en présence de solutions de mannane de concentrations comprises entre 10"4 et 10 mg/ml, puis à une incubation avec des solutions comprenant 5 μM de ligand 23F (-•-), de ligand 24F (-*-), de composé 30F (-Δ-) ou de composé 31F (-D-). Sont exprimées, en ordonnées, les valeurs moyennes de fluorescence (UA) et, en abscisses, les concentrations des solutions de mannane.
La Figure 14 montre que l'intemalisation, par les cellules dendritiques, des ligands 23F et 24F, ainsi que celle du composé 31F diminue drastiquement au fur et à mesure que la concentration en mannane augmente. Ceci signe l'existence d'une forte compétition entre ces ligands et le mannane vis-à-vis du récepteur du mannose et vient confirmer que l'intemalisation des ligands conformes à l'Invention par les cellules dendritiques s'effectue bien par l'intermédiaire du récepteur du mannose. c) Influence du nombre de mimes du mannose portés par les ligands conformes à l'Invention sur l'intemalisation de ces ligands.
La Figure 15 représente, en ordonnées, le pourcentage d'intemalisation spécifique des ligands di-, tétra- ou octavalents (abscisses) par le récepteur du mannose. Les ligands tétra- ou octavalents sont intemalisés de façon préférentielle par le récepteur du mannose, par rapport aux ligands divalents. On peut donc considérer que les structures optimales recherchées sont celles comprenant 4 mimes du mannose, qui sont plus facilement synthétiser que celles comprenant 8 mimes du mannose. Par opposition au ligand naturel (ligand portant des résidus du mannose), dont l'intemalisation est optimale pour une structure octavalente, on constate que les ligands portant des résidus d'acide quinique ou shikimique sont intemalisés de façon optimale lorsqu'ils sont trétravalents. EXEMPLE 9 : SPECIFICITE DE L 'INTERNALISATION DES LIGANDS CONFORMES A L'INVENTION DANS LES CELLULES DENDRITIQUES VIA LES RECEPTEURS DU MANNOSE
1) Analyse par microscopie confocale. L'intemalisation et la distribution des ligands conformes à l'Invention dans les cellules dendriques est analysée par microscopie confocale avec double et triple marquage du récepteur du mannose et du noyau des cellules.
Les cellules dendritiques, différenciées à partir de cellules mononuclées en présence d'IL-4 et du facteur de croissance GM-CSF, sont utilisées à J+5. Elles sont incubées pendant 45 minutes à 4°C avec 10 μg d'anti-mannose récepteur humain (PHARMIGEN) et 5 μM de l'une des constructions suivantes :
. 61F (Figure 16) : dendrimère constitué de 4 résidus L-lysine portant 4 restes de D-mannose, ainsi qu'une molécule de fluorescéine (FITC). La construction 61F a été préparée comme le composé 31F (cf. exemple 8, paragraphe a), mais en faisant réagir du 2-thioéthyl-α,D-mannopyrannoside avec un composé
14 (cf. exemple 1, paragraphe 1.1) ;
. 21F, 22F et 64F : constructions portant respectivement des restes d'acide shikimique, d'acide quinique et des chaînes polyhydroxylées de configuration galacto (provenant de molécules de galactonolactones). La construction 64F a été préparée comme le composé 30F (cf. exemple 8, paragraphe a), mais en utilisant un composé 13 pour le couplage (cf. exemple 1, paragraphe 1.1). La préparation des ligands 21F et 22F est décrite dans l'exemple 2 ci-avant.
La structure 61 F sert de témoin positif, tandis que la structure 64F sert de témoin négatif. Les structures 21F et 22F représentent des ligands conformes à la présente invention.
Les cellules sont placées à 37°C pendant 5 minutes. Après incubation, elles sont fixées pendant 45 minutes à 4°C par une solution de composition suivante : PBS (0.1 mM MgCl2, 0.1 mM Ca2), paraformaldéhyde à 4%, sucrose. La réaction de fixation est arrêtée au moyen d'une solution de chlorure d'ammonium (50mM), pendant 10 minutes et à température ambiante. Les cellules sont lavées 3 fois par du PBS, puis déposées sur des lames de poly-L-lysine. Le signal de la fluorescéine est amplifié par incubation à 37°C, pendant 30 minutes, avec un IgG anti-FITC de lapin couplé à l'Alexa Fluor 488 (dilution : l/200ème) (MOLECULAR PROBES) en même temps que l'incubation avec le second anticorps de chèvre, IgG anti-souris couplé à l'Alexa Fluor 568 (dilution : l/500eme) (MOLECULAR PROBES), permettant la détection de ranti-mannose récepteur. L'incubation avec les seconds anticorps est réalisée en milieu PBS, BSA (lmg/ml), saponine (0.05%).
Les cellules sont lavées par du PBS contenant lmg/ml de BSA et 0,05% de saponine, puis par du PBS/BSA et enfin par du PBS, puis montées entre lame et lamelle en milieu de montage VECTASHIELD. L'observation des lames est réalisée par microscopie confocale sur un appareil LEICA TCS NT possédant un laser Krypton/ Argon (excitation 488, 468 et 647). L'acquisition des deux longueurs d'onde (à savoir l'acquisition de la fluorescence émise par l'Alexa 568, correspondant au récepteur du mannose, et l'acquisition de la fluorescence émise par l'Alexa 488, correspondant aux structures testées) est effectuée simultanément et la superposition des deux images permet de visualiser les deux marqueurs en même temps, sur la même coupe de cellule, effectuée selon l'axe z de la cellule.
On remarque une co-localisation des deux marqueurs, et donc une co-localisation des ligands 61F, 21F et 22F marqués a la fluorescéine avec le récepteur du mannose, permettant d'affirmer que les ligands conformes à l'invention sont bien intemalisés dans les cellules dendritiques via le récepteur du mannose.
2) Analyse au moyen de cellules Cos transfectées par le récepteur du mannose.
Des cellules Cos-1, n'exprimant pas, à l'état natif, le récepteur du mannose, sont transfectées par le plasmide CD8 contenant une séquence codante pour le récepteur du mannose (MR). 48 heures après la transfection, les cellules sont collectées : 10 à 15% d'entre elles expriment le transgène. Dans ce qui suit, ces cellules sont dénommées « Cos MR ».
Des tests d'internalisation sont réalisées à partir de ces cellules, en utilisant les composés suivantes : 22F : dendrimère constitué de 4 résidus L-lysine portant 4 restes d'acide quinique, ainsi qu'une molécule de fluorescéine (FITC). Il s'agit d'un ligand conforme à la présente Invention. . 64F : construction portant des chaînes polyhydroxylées de configuration galacto (témoin négatif).
Les tests d'internalisation consistent à incuber les cellules, pendant 20 minutes et à 37°C, en présence de 10 μmoles des composés 22F ou 64F, puis à laver les cellules avec du PBS froid et à les fixer par du paraformaldéhyde à 1%, avant d'effectuer l'analyse FACScan au moyen du cytomèfre décrit dans l'exemple 8. La Figure 17 représente le pourcentages de cellules positives détectées (en abscisses) pour les quatre tests suivants, indiqués sur l'axe des ordonnées :
. test a) : incubation des cellules Cos MR avec le composé 64F, . test b) : incubation des cellules Cos MR avec le composé 22F, en présence d'une solution de mannane (5 mg/ml) telle que décrite dans l'exemple 8, le mannane . entrant en compétition avec le composé 22F vis-à-vis du récepteur du mannose,
. test c) : incubation des cellules Cos MR avec le composé 22F, . test d) : incubation des cellules Cos-1 (non transfectées) avec le composé 22F.
D'après la Figure 17, les cellules Cos-1 non transfectées (test d) ne donnent, bien entendu, pas lieu à une internalisation du composé 22F : le signal détecté est assimilable au bruit de fond de l'appareil. Il en va de même pour les cellules Cos MR incubées avec le composé 64F, non spécifique du récepteur du mannose (test a). Le test b) traduit rinhibition de l'intemalisation du composé 22F par le mannane. Quant à la construction 22F, elle est bien intemalisée de manière spécifique par les cellules transfectées par le récepteur MR (test c).

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation d'au moins un composé répondant à la formule générale (la) et/ou d'au moins un composé répondant à la formule générale (Ib) :
Figure imgf000067_0001
(la) (Ib) dans lesquelles :
- Ri, R2, R3 et R représentent, indépendamment les uns des autres, un atome d'hydrogène ou un groupe protecteur, - R5 représente un groupe -OH, un groupe -SH, un groupe -NH-NH2, un atome d'halogène, ou une chaîne carbonée linéaire, ramifiée ou cyclique, saturée ou insaturée, comprenant de 1 à 18 atomes de carbone et éventuellement de 1 à 12 atomes choisis parmi l'oxygène, le soufre et l'azote, ladite chaîne carbonée étant éventuellement substituée par 1 à 16 atomes d'halogène et portant éventuellement au moins un groupe nucléophile ou au moins un groupe électrophile, en tant que ligand du récepteur du mannose ou de tout récepteur de la famille des C-lectines apparenté au récepteur du mannose, ou pour la préparation d'un tel ligand.
2. Utilisation selon la revendication 1, dans laquelle les composés de formules générales (la) et/ou (Ib) sont tels que les groupes -OR2 et -OR sont en relation trans.
3. Utilisation selon la revendication 1 ou la revendication 2, dans laquelle les composés de formules générales (la) et/ou (Ib) sont tels que R5 représente un groupe hydroxyle.
4. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle le composé de formule (Ib) est tel que Ri, R2 et R représentent des atomes d'hydrogène et R5 représente un groupe hydroxyle.
5. Utilisation selon la revendication 4, dans laquelle le composé de formule (Ib) représente de l'acide (-)-shikimique.
6. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans laquelle le composé de formule (la) est tel que Ri, R2, R et R4 représentent des atomes d'hydrogène et R5 représente un groupe hydroxyle.
7. Utilisation selon la revendication 6, dans laquelle le composé de formule (la) représente l'acide (-)-quinique.
8. Utilisation selon la revendication 1 ou la revendication 2, dans laquelle le composé de formule (la) est tel que Ri, R2, R3 et R4 représentent des atomes d'hydrogène et R5 représente un groupe -NH-(CH2)2-SH.
9. Composé utile en tant que ligand du récepteur du mannose ou de tout récepteur de la famille des C-lectines apparenté au récepteur du mannose, ou en tant que composé intermédiaire pour la préparation d'un tel ligand, caractérisé en ce qu'il répond à la formule générale (III) ci-après :
(B'M)m(XN)nA(PY)y (IH)
dans laquelle :
- B1 répond à une ou plusieurs formules générales (lia) ou (Ilb) ci-après
Figure imgf000068_0001
(Ila) (Ilb)
où W représente une liaison ou une chaîne carbonée linéaire, ramifiée ou cyclique, saturée ou insaturée, comprenant de 1 à 18 atomes de carbone et éventuellement de 1 à 12 atomes choisis parmi l'oxygène, le soufre et l'azote, ladite chaîne carbonée étant éventuellement substituée par 1 à 16 atomes d'halogène,
- X représente le reste d'un oligopeptide X' comprenant de 1 à 6 acides aminés,
- A représente le reste d'un composé A' au moins difonctionnel,
- Y représente le reste d'un composé d'intérêt Y', - m est un nombre entier compris entre 1 et 32,
- n est un nombre entier compris entre 0 et 32,
- y est un nombre entier compris entre 1 et 4, et
- M, N et P représentent chacun un groupe de liaison, respectivement entre B1 et A quand n = 0 ou B1 et X quand n est différent de 0, entre X et A quand n est différent de 0, et entre A et Y, et comprennent, indépendamment les uns des autres, une fonction choisie parmi les fonctions oxime, hydrazone, amide, ester, thioester, hydrazide, hydroxamate, éther, thioéther, amine, carbonate, carbamate, thiocarbonate, thiocarbamate, urée, thiouree et thiazolidine.
10. Composé selon la revendication 9, dans lequel le composé A' est formé d'un enchaînement comprenant plusieurs restes d'un composé au moins trifonctionnel, liés les uns aux autres par des liaisons covalentes, et propre à offrir, au niveau des groupes fonctionnels libres de ces restes, plusieurs sites d'ancrage pour le ou les composés de formule générale (la) et/ou (Ib) ou, lorsque X est présent, le composé X', et pour le composé Y'.
11. Composé selon la revendication 10, dans lequel le composé A' comprend de 2 à 32 et, de préférence, de 4 à 16 restes d'un composé trifonctionnel.
12. Composé selon l'une quelconque des revendications 9 à 11, dans lequel le composé A' se présente soit sous une forme linéaire, soit sous une forme ramifiée et, notamment, de type arborescente.
13. Composé selon l'une quelconque des revendications 9 à 12, dans lequel le composé A' comprend un enchaînement d'acides aminés, identiques ou différents, sélectionnés dans le groupe constitué par la lysine, l'hydroxylysine, la serine, la thréonine, la cystéine, l'ornithine, l'acide aspartique et l'acide glutamique.
14. Composé selon l'une quelconque des revendications 9 à 13, dans lequel le composé de formule générale (IIT) est tel que m est un nombre entier compris enfre 4 et 16, n est un nombre entier compris entre 2 et 8, X représente le reste d'un oligopeptide comprenant de 2 à 4 résidus d'acides aminés, et A représente le reste d'un enchaînement comprenant de 2 à 8 résidus de lysine et se présentant sous la forme d'un dendrimère.
15. Composé selon l'une quelconque des revendications 9 à 14, dans lequel le composé de formule générale (III) est tel que B1 représente le reste d'un ou plusieurs composés choisis parmi l'acide (-)-shikimique et l'acide (-)-quinique.
16. Composé selon l'une quelconque des revendications 9 à 14, dans lequel Y' choisi parmi les antigènes, les anticorps, les acides nucléiques et les fragments d'acides nucléiques codant pour une protéine d'intérêt ou pour un ou plusieurs déterminants antigéniques de cette protéine, les fractions bactériennes et virales purifiées, les principes actifs médicamenteux et les marqueurs détectables.
17. Composé utile en tant que composé intermédiaire pour la préparation d'un ligand du récepteur du mannose ou de tout récepteur de la famille des C-lectines apparenté au récepteur du mannose, caractérisé en ce qu'il répond à la formule générale (V) ci-après :
(B2M)m(XN)nA (V) dans laquelle : - B2 répond à une ou plusieurs formules générales (IVa) ou (IVb) ci-après :
Figure imgf000070_0001
(IVa) (IVb)
où Ri, R2, R3, R et R5 sont tels que définis dans l'une quelconque des revendications 1 à 8, et où W est tel que dans la revendication 9,
- X représente le reste d'un oligopeptide X' comprenant de 1 à 6 acides aminés,
- A représente le reste d'un composé A' au moins difonctionnel, - m est un nombre entier compris entre 1 et 32,
- n est un nombre entier compris entre 0 et 32, et
- M et N représentent chacun un groupe de liaison, respectivement entre B2 et A quand n = 0 ou B2 et X quand n est différent de 0, et enfre X et A quand n est différent de 0, et comprennent, indépendamment l'un de l'autre, une fonction choisie parmi les fonctions oxime, hydrazone, amide, ester, thioester, hydrazide, hydroxamate, éther, thioéther, amine, carbonate, carbamate, thiocarbonate, thiocarbamate, urée, thiouree et thiazolidine.
18. Composé de formule générale (V) selon la revendication 17, dans lequel M, N, m, n, ainsi que les composés A' et X', sont tels que définis dans l'une quelconque des revendications 9 à 14.
19. Composé selon la revendication 17 ou la revendication 18, dans lequel B2 représente un reste d'un ou plusieurs composés choisis parmi l'acide (-)-shikimique et l'acide (-)-quinique, éventuellement sous forme protégée.
20. Composé utile en tant que composé intermédiaire pour la préparation d'un ligand du récepteur du mannose ou de tout récepteur de la famille des C-lectines apparenté au récepteur du mannose, caractérisé en ce qu'il répond à la formule générale (VI) ci-après :
(B'M)mA (VI) dans laquelle :
- B1 et M sont tels que définis dans la revendication 9 ou la revendication 15,
- m est un nombre entier compris entre 50 et 500, et
- A représente le reste d'un polymère A' capable de former un complexe non- covalent avec un composé d'intérêt, tel qu'un acide nucléique.
21. Composé selon la revendication 20, dans lequel le polymère A' est un polymère cationique, tel qu'un polymère de lysine ou un polyéthylèneimine.
22. Composé utile en tant que ligand du récepteur du mannose ou de tout récepteur de la famille des C-lectines apparenté au récepteur du mannose, caractérisé en ce qu'il se présente sous la forme d'un complexe non-covalent entre un composé répondant à la formule générale (VI) telle que définie dans la revendication 20 ou la revendication 21, et un composé d'intérêt, tel qu'un acide nucléique.
23. Utilisation d'au moins un composé répondant à la formule générale (la) et/ou d'au moins un composé répondant à la formule générale (Ib) pour la préparation d'un médicament capable de se lier au récepteur du mannose ou à tout récepteur de la famille des C-lectines apparenté au récepteur du mannose.
24. Composé utile en tant que ligand du récepteur du mannose ou de tout récepteur de la famille des C-lectines apparenté au récepteur du mannose selon l'une quelconque des revendications 9 à 16 et 22, pour l'utilisation en tant que médicament.
25. Composé utile en tant que ligand du récepteur du mannose ou de tout récepteur de la famille des C-lectines apparenté au récepteur du mannose selon l'une quelconque des revendications 9 à 16 et 22, pour l'utilisation in vitro.
26. Réactif de diagnostic, caractérisé en ce qu'il comprend un composé utile en tant que ligand du récepteur du mannose ou de tout récepteur de la famille des C-lectines apparenté au récepteur du mannose selon l'une quelconque des revendications 9 à 16 et 22.
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