WO2001004623A1 - Optischer sensor für kaliumionen - Google Patents

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WO2001004623A1
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fluorescence
chromophore
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Fritz Andreae
Georg Uray
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Fritz Andreae
Georg Uray
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    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label

Definitions

  • the invention relates to cyclic peptolides labeled with luminescence and their use for the specific determination of the concentration of potassium ions in a sample.
  • potassium is the most important cation for maintaining the cellular balance.
  • the tendency of potassium, like other alkali metals, to form complexes with crown ethers, crypts and macrolide antibiotics is known and can also be used for their analysis.
  • One of the most important representatives of the selective potassium ionophores is the natural product valinomycin.
  • Valinomycin belongs to the peptide class of depsipeptides, which, in contrast to simple peptides, are made up of ⁇ -amino acids and ⁇ -hydroxy acids alternately.
  • Valinomycin and some derivatives are currently the most effective complexing agents that can bind highly selective K + and the biologically meaningless Rb + even in the presence of much larger amounts of Na + and other ions.
  • Valinomycin is a cyclo-dodeka-depsipeptide, therefore it represents a macrocyclic, 36-membered ring system.
  • the literature describes some methods for determining the potassium concentration using the natural product valinomycin as an ionophore and a fluorophore in a matrix. If a potassium ion emerges from the solution due to binding to the ionophore, a potential difference is formed at the interface between the matrix and the solution, which is reflected in the spectroscopic properties of the potential-sensitive fluorophore.
  • the described problem of unequal molar ratios is solved according to the invention in that the ionophore is produced synthetically and is covalently linked to the label. whereby that molar ratio of the two components naturally remains constant.
  • the label can be attached to a side chain of one of the hydroxy acid or arruno acid constituents at a suitable point
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • the ionophore and for complexing the potassium Isoleucine (Ile) selected are used for the construction of the ionophore and for complexing the potassium Isoleucine (Ile) selected
  • the corresponding enantiomers of lactic acid (Lac) and hydroxylsovale ⁇ ansaure (Hiv) are used as corresponding hydroxy components
  • an orthogonal protecting group strategy is used, which specifically enables the splitting off of a protecting group and thus a selective introduction of the “labels” on the functional side chains of the ionophore.
  • these functional building blocks are enantiomers of ⁇ -amino acids or ⁇ Hydroxy carboxylic acids with a functional side chain, the alkyl radical of which is between 1 to 10 carbon radicals and which have an amino, carboxyl, hydroxyl, thiol, sulfonyl or terminal olefin group, or a suitable derivative thereof in the side chain.
  • Preferred representatives of the diamino acid derivatives are lysine (Lys), ormtin (Orn) or diminopropionic acid (Dap).
  • the carboxyl-containing amino acid derivatives are the enantiomers of aspartic acid (Asp), glutamic acid (Glu), or 2-amino-sub-acidic acid (Asu) also enantiomers of aromatic amino acid derivatives n can be used, such as nitro-phenylalanine, dinitro-phenylalanine, amino-phenylalanine, iodine-tyrosine or tyrosine.
  • Suitable thiol-containing amino acids are cysteine (Cys) or pemcillamine (pen) Alpha-hydroxy acids are converted and used, provided they are not already commercially available
  • the invention also provides that on the one hand the "labels" are covalently bound to the functional side chains of these modified building blocks, on the other hand they can also be used for covalent fixation of the entire molecule in the layer carrying the matrix or sensor.
  • This binding can be achieved, for example, by acid amide formation of a carboxyl group of the entire molecule with an amino-functionalized PEG, acrylic gel or cellulose material
  • labels Another manufacturing variant provides that "pre-marked" synthesis building blocks are used directly in the synthesis of the ionophore.
  • This method of selectively introducing groups which can be detected by fluorescence or absorption spectroscopy into peptides and their analogs, here called “labels”, is already in our patent AT 401 773 P described in detail This method has the advantage that it yields much better yields than when the individual dyes are subsequently introduced
  • Valinomycin itself has a considerable toxicity, which requires great precautionary measures when processed as sensor material.
  • the invention therefore also relates to the synthesis of completely new ionophores based on natural cyclic peptides, in which all optically active building blocks are replaced by their optically active antipodes
  • enantiomer of vahnomycin not described so far
  • cyclo (L-Val-D-H ⁇ v-D-Val-L-Lac) ⁇ is cyclo with the same effort Val-D-Lac) -
  • this has the advantage of the identical complex formation properties for the construction of measuring devices with changed, mostly weakened or eliminated biological effects as a result of the "non-physiological" chirate Examples
  • Nomenclature The nomenclature used in the following valinomycin derivatives refers to the natural valinomycin. The change from the original product is made by
  • the synthesis is carried out using automatic peptide synthesizers, with segment condensation of protected didepsipeptide derivatives taking place instead of the step-by-step linkage of the individual building blocks.
  • the starting material is a carrier resin made of PEG-PS copropolymer which has a chlorotrityl anchor group for linking to the first didepsipeptide FMOC-D-Val-O-L-Lac.
  • the loading and checking of the conversion rate is carried out according to the procedures typical of peptide chemistry for trityl carrier resins.
  • FMOC-L-Val-OD-Hiv didepsipeptide building blocks: FMOC-L-Val-OD-Hiv; FMOC-D-Glu (OtBu) -0-L-Lac; FMOC-D-Val-O-L-Lac and FMOC-L-Orn (t-BOC) -0-D-Hiv.
  • the FMOC protective group is split off with 30% pipe in DMF
  • MeOH dichloromethane (20 10 50 v / v%) achieved within 1 hour at RT. After the carrier resin has been separated off, the solution is concentrated on a Rotavapor and the residue formed is evaporated
  • Main signal 1330.59 MH + linear product The linear product is purified by means of preparative liquid chromatography.
  • the CN cyclization is carried out according to the methods customary in peptide chemistry, with PyBOP preferably being used as the condensing agent.
  • the solution becomes mixed with water and lyophilized.
  • An amorphous crystalline powder remains, which is purified by means of preparative HPLC. Yield approx. 35 -40% of theory
  • FMOC-D-Lys (t-BOC) -L-Lac and FMOC-L-Lys (Dde) -D-Hiv are used as synthesis building blocks.
  • the synthesis on the resin and the cleavage are carried out as previously described.
  • the cyclization is preferably carried out with PyBOP to form the cyclic valinomycin derivative.
  • Bodipy ® introduced as succinimidyl ester in Lys in positions 1 and 9. The immobilization on the
  • the carboxyl group in the sensor-bearing layer remains unchanged.

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Abstract

Die Erfingung betrifft speziell fluoreszenzmarkierte zyklische Peptolide (Depsipeptide) und deren Verwendung zur optischen Bestimmung der Konzentration von Kaliumionen in einer Probe. Ein spektroskopisch meßbarer Effekt wird erfindungsgemäß dadurch erzeugt, daß sich durch Komplexierung des Kaliumions in einem fluoreszenzmarkierten makrocyclischen Peptolid-Ionophor, dessen Konformation stark verändert. Das einfachste Meßmolekül besteht somit aus mindestens einem Ionophor und einem damit kovalent verbundenen Chromophor (Label). Es kann weiters erfindungsgenäss bei Vorhandensein von zwei an geeigneter Stelle kovalent gebundenen Chromophoren im Meßsystem durch Änderung der räumlichen Lage der beiden Molekülteile zueinander in Abhängigkeit von der Konzentration des Elektrolyten mindestens eine deren optischer Eigenschaften verändert werden. (Fluoreszenz Resonanz Energie Tranfer (FRET), Donor-Akzeptor Wechselwirkung).

Description

Optischer Sensor für Kaliumionen
Die Erfindung betrifft luminiszenzmarkierte zyklische Peptolide und deren Verwendung zur spezifischen Bestimmung der Konzentration von Kaliumionen in einer Probe. Kalium stellt neben Natrium das wichtigste Kation für die Aufrechterhaltung des zellulären Gleichgewichtes dar. Gerade in der Intensiv- und Notfallsmedizin spielt daher die rasche und zuverlässige Erfassung der Kaliumkonzentration biologischer Systeme in Anwesenheit eines wesentlich höheren Natriumspiegels eine überaus wichtige Rolle. Die Neigung des Kaliums, ebenso wie anderer Alkalimetalle, mit Kronenethem, Kryptaπden und Makrolid-Antibiotika Komplexe zu bilden, ist bekannt und läßt sich auch zu deren Analyse ausnützen. Zu den wichtigsten Vertretern der selektiven Kaliumionophore gehört der Naturstoff Valinomycin. Es gehört zur Peptolidklasse der Depsipeptide, welche im Gegensatz zu einfachen Peptiden alternierend aus α-Aminosäuren und α -Hydroxysäuren aufgebaut sind. Valinomycin und auch einige Derivate sind die zur Zeit wirksamsten Komplexbildner, die hochselektiv K+ und das biologisch bedeutungslose Rb+ selbst in Anwesenheit von weit größeren Mengen Na+ und anderen Ionen binden können. Valinomycin ist ein cyclo-Dodeka-Depsipeptid, es stellt daher ein macrozyklisches, 36-gliedriges Ringsystem dar. Es besteht aus 6 α-Aminosäure- und 6 α-Hydroxycarbonsäureeinheiten, nämlich L-Valin, D-Hydroxy-isovaleriansäure, D-Valin und L- Milchsäure in dreifach wiederholter Sequenz. Daher ist es trotz seiner Größe verhältnismäßig einfach aufgebaut und wird mit cyclo(L-Val-D-Hiv-D-Val-L-Lac)3 in Kurzform beschrieben. Eine Reihe von Varianten mit veränderter Hydroxy- und Aminosäurezusammensetzung ist bekannt. Diese sind ebenfalls mehr oder weniger selektive Kaliumionophore.
In der Literatur sind einige Methoden zur Bestimmung der Kaliumkonzentration mittels des Naturstoffes Valinomycin als lonophor und einem Fluorophor in einer Matrix beschrieben. Tritt durch Bindung an den lonophor ein Kaliumioπ aus der Lösung, bildet sich dadurch eine Potentialdifferenz an der Grenzfläche zwischen Matrix und Lösung aus, die sich in den spektroskopischen Eigenschaften des potentialsensitiven Fluorophors bemerkbar macht.
Es ist aber auch bekannt ( Reinhoudt D. N.; Anal. Chem., 66, 3618, 1994 ), daß Hersteller derzeitiger Kaliumsensoren auf Valinomycinbasis unter dem Problem des „Auswaschens" einer Komponente aus der den Sensor tragenden Schicht leiden. Dieses Problem ist auch durch eine beschriebene Methode (P. Ross, US 4 973 393 A) der Immobilisierung von Valinomycin nur unzureichend behoben. Denn auch dabei kann es durch „Auswaschen" des Fluorophors zu einer Änderung der molaren Verhältnisse zwischen Fluorophor und lonophor kommen, was eine exakte und vor allem konstante Messung erschwert. Es wurde dadurch zu verbessern versucht, daß sowohl lonophor als auch Fluorophor getrennt kovalent in der Matrixschicht eingebettet wurden. Dies macht jedoch eine genaue Kontrolle der jeweils erzielten molaren Verhältnisse der beiden essentiellen Bestandteile notwendig, es führt aber auch leicht zu verschiedenartigen Chargen in der Herstellung.
Das beschriebene Problem der ungleichen Molverhältnisse wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß der lonophor synthetisch hergestellt und dabei kovalent mit dem Label verbunden ist. wodurch das molare Verhältnis der beiden Komponenten naturgemäß konstant bleibt Der Label kann in einem geeigneten Schritt im Laufe der Synthese an einer Seitenkette eines der Hydroxysaure- bzw Arruno- saurebestandteile an passenden Stelle angebunden werden
Diese Art der Sensorkonzeption eignet sich bereits sehr gut für die Verwendung in sogenannten Sensorelektroden Zur fallweise völligen Beseitigung des Problems des Auswaschens und zur größeren Langzeitstabilitat wird erfindungsgemaß vorgeschlagen, neben dem Fluorophor gleichzeitig an einer Seitenkette des Ionophors oder des Fluorophors eine zusätzliche funktionelle Gruppe synthetisch einzubauen, die zur kovalenten Bindung an der den Sensor tragenden Schicht geeignet ist Zur Verbesserung der Empfindlichkeit und der Anwendungsbreite von Sensorelektroden mit erweiterter Funktion wird weiters erfindungsgemaß der synthetische Einbau eines zweiten Chromophors an geeigneter Stelle des Peptolidgerusts vorgeschlagen lonophore wie Valinomycin oder andere zyklische Peptohde erfahren bei Komplexierung eines Ions oft eine dramatische Änderung ihrer Konformation Dadurch kann der bekannte Effekt der molekularen Anziehung von elektronenreichen und elektronenarmen Aromaten (sogenannte "π-Basen" und "π- Sauren") als Meßpπnzip genutzt werden Auch stellt der Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer (FRET) eine nützliche Interaktion zwischen den elektronischen angeregten Zustanden zweier Farbstoffmolekule dar Bei diesem stark distanzabhangigen Effekt wird die Anregungsenergie des Donors direkt ohne Aussendung eines Photons an das Akzeptormolekul übertragen Derartige Wechselwirkungen werden bei der Enantiomerentrennung („Pirkle-Phasen") oder bei diversen Enzym-Substrat-Assays seit langem angewandt Diese Annäherung muß räumlich möglich sein, das heißt, die restlichen vorhandenen Substituenten dürfen nicht den Annaherungs- vorgang behindern
Erfindungsgemaß wird dies dadurch ermöglicht, daß an geeigneten Seitenketten am lonophor durch kovalente Bindung zwei passende Chromophore als „Labels" befestigt werden Auch diese Variante sieht eine eventuelle zusatzliche kovalente Fixierung des Gesamtmolekuls an der Matπx vor Erfindungsgemaß werden als lonophore zyklische Peptohde verwendet
Zur Herstellung dieser lonophore wird großteils die Synthese an festen Tragern gewählt, wobei man sich der in der Peptidchemie üblichen FMOC- oder t-BOC Synthesestrategie bedient Im Gegensatz zur herkömmlichen Peptid-synthese werden geschützte „Di-Depsipeptide" als Synthesebausteine verwendet Die Synthese dieser Bausteine erfolgt mittels konventioneller Synthesemethoden Erfindungsgemaß werden für den Aufbau des Ionophors und für die Komplexierung des Kaliums die essentiellen Aminosaurebausteine Glycin (Gly) und Sarcosin (Sar), sowie die optisch aktiven Bausteine Valin (Val), Alanin (Ala), Leucin (Leu) und Isoleucin (Ile) gewählt Als entsprechende Hydroxykomponenten werden erfindungsgemaß die Enantiomere der Milchsäure (Lac) und Hydroxy- lsovaleπansaure (Hiv) verwendet Zum Aufbau der mehrfach funktionahsierten lonophore wird eine orthogonale Schutzgruppenstrategie verwendet, die gezielt die Abspaltung einer Schutzgruppe und somit eine selektive Einfuhrung der „Labels" an der funktionellen Seitenketten des Ionophors ermöglicht Erfindungsgemaß handelt es sich bei diesen funktionellen Bausteinen um Enantiomere der α-Aminosauren oder α-Hydroxy- carbonsauren mit einer funktionellen Seitenkette, deren Alkylrest zwischen 1 bis 10 Kohlenstoffresten ausmacht und die eine Amino-, Carboxyl-, Hydroxyl-, Thiol-, Sulfonyl- oder eine endstandige Olefingruppe, oder ein geeignetes Derivat davon in der Seitenkette besitzen Bevorzugte Vertreter der Diaminosauredeπvate sind Lysin (Lys), Ormtin (Orn) oder Dιamιnopropιonsaure(Dap) Als carboxylhaltige Aminosauredeπvate eignen sich erfindungsgemaß die Enantiomere der Asparagin- saure (Asp), Glutaminsäure (Glu), oder 2-Amιno-Subeπnsaure (Asu) Es können aber auch Enantiomere von aromatischen Aminosauredeπvaten verwendet werden, wie Nitro-Phenylalanin, Dinitro-Phenylalanin, Amino-Phenylalanin, Jod-Tyrosin oder Tyrosin Als thiolhaltige Aminosäuren sind Cystein (Cys) oder Pemcillamin (Pen) geeignet Alle diese seitenkettenfunktionellen Aminosäuren können durch eine Diazotierungs- und Verkochungsreaktion in die entsprechenden alpha-Hydroxysauren umgewandelt und eingesetzt werden, sofern sie nicht ohnehin kommerziell erhaltlich sind
Die Erfindung sieht außerdem vor, daß an den funktionellen Seitenketten dieser geänderten Bausteine einerseits die „Labels" kovalent gebunden, anderseits diese auch für eine kovalente Fixierung des Gesamtmolekuls in der Matπx bzw Sensor tragenden Schicht verwendet werden können Diese Bindung kann z B durch Saureamidbildung einer Carboxylgruppe des Gesamtmolekuls mit einer aminofunktionalisierten PEG-, Acrylatgel- oder Cellulose Matπx erfolgen
Eine weitere Herstellungsvaπante sieht vor, daß bereits „vormarkierte" Synthesebausteine direkt bei der Synthese des Ionophors verwendet werden Diese Methode der selektiven Einfuhrung von fluoreszenz- oder absorptionsspektroskopisch detektierbaren Gruppen in Peptide und deren Analoga, hier „ Labels" genannt, ist bereits in unserem Patent AT 401 773 P ausführlich beschrieben Diese Methode hat den Vorteil, daß es dabei zu wesentlich besseren Ausbeuten kommt als bei der nachträglichen Einfuhrung der einzelnen Farbstoffe
Valinomycin selbst weist eine beachtliche Toxizitat auf, was in der Verarbeitung als Sensormaterial große Vorsichtsmaßnahmen erfordert Die Erfindung betrifft daher weiters die Synthese völlig neuer lonophore auf Basis naturlicher zyklischer Peptohde, in denen sämtliche optisch aktiven Bausteine durch deren optisch aktiven Antipoden ersetzt werden Als Beispiel wäre das bisher nicht beschriebene Spiegelbildmolekul (Enantiomer) des Vahnomycins zu nennen Anstelle von cyclo(L-Val-D-Hιv-D-Val-L-Lac)} wird mit dem ganz gleichen Aufwand cyclo
Figure imgf000004_0001
Val-D-Lac)-, synthetisiert Erfindungsgemaß hat dies den Vorteil der identen Kompexbildungs- eigenschaften zum Aufbau von Meßvorrichtungen bei geänderter, meist abgeschwächter oder eliminierter biologischer Wirkung infolge der „unphysiologischen" Chirahtat Beispiele
Nomenklatur: Die in den nachfolgenden Valinomycinderivaten verwendete Nomenklatur bezieht sich auf das natürliche Valinomycin. Die Änderung gegenüber dem ursprünglichen Produkt wird durch
Angabe der Position und Art des eingesetzten Bausteins, beginnend mit L-Valin in Position I indiziert.
(cyclo) 'L-Val- 2D-Hiv- D-Val- 4L-Lac- 5L-Val- 6D-Hiv- 7D-Val- 8L-Lac- 9L-Val- 10D-Hiv- "D-Val-
12L-Lac
Beispiel 1:
FMOC- L-Orn ( 5 (oder 6 )-TAMRA)-OH C45 H42N408 [ 766.85]
N2-(9-H-Fluoren-9yl)-methoxycarbonyl-N5-[tetramethylrhodamin-5'-carboxyl-]Ornithin
FMOC-L- Orn . HC1 (0.017 mmol) wird in 1.5 ml DMF gelöst und mit einer Lösung von 5'- (oder 6')- TAMRA-NHS (0.16 mmol) in 0.5 ml DMF versetzt. Die über Nacht bei RT gerührte Lösung wird anschließend mit 15 ml Diethylether versetzt und zentrifugiert. Der Rückstand wird erneut mit Ether digeriert und zentrifugiert.
Das so erhaltene dunkelrote Pulver wird mittels „Dry-Flash"- Chromatographie gereinigt. Die Reinheit und Identität wird per HPLC und Maldi-TOF-Massenspektrometrie überprüft. Dry-Flash Bedingung: Silica Gel H 15 g ; Laufmittel: CHC13:MeOH: Wasser (65:30:5 % v:v ) DC: CHC13:MeOH: Wasser (65:35:5 % v:v ) Rf.: 0.62 Ausbeute: 85 % ά. Theor.
Beispiel 2:
1L-Orn(t-BOC)- 7D-Glu(otBu)-Valinomycin C63 Hι05 N7 022 [1312,56]
(cyclo) 'L-Orn(t-BOC)- 2D-Hiv- 3D-Val- 4L-Lac- 5L-Val- 6D-Hiv- 7D-Glu(otBu)- 8L-Lac- 9L-Val- "TJ-Hiv- 'O-Val- ^L-Lac.
Die Synthese erfolgt mittels automatischen Peptid-Synthesizern, wobei anstelle der schrittweise Verknüpfung der einzelnen Bausteine eine Segmentkondensation von geschützten Didepsipeptid- Derivaten erfolgt. Ausgangsmaterial ist ein Trägerharz aus PEG-PS Copfropolymer welches eine Chlorotrityl-Ankergruppe zur Verknüfung mit dem ersten Didepsipeptid FMOC-D-Val-O-L-Lac besitzt. Die Beladung und Überprüfung der Umsetzungsrate erfolgt nach den in der Peptidchemie typischen Verfahren für Trityl-Trägerharze.
Nach Abspaltung der temporären FMOC-Schutzgruppe erfolgt die schrittweise Verlängerung mit den Didepsipeptidbausteinen : FMOC- L-Val-O-D-Hiv ; FMOC-D-Glu(otBu)-0-L-Lac; FMOC-D-Val-O- L-Lac und FMOC- L-Orn(t-BOC)-0-D-Hiv. Die Abspaltung der FMOC-Schutzgruppe erfolgt dabei mit 30 %ιgem Pipeπdin in DMF
Die Saureamidbildung bei der Segmentkondensation erfolgt nach der Aktivestermethode unter
Verwendung von Dnsopropyl-carbodiimid (DIC) und Hydroxybenzotπazol (HOBt)
Die Abspaltung des linearen Vahnomycin-Denvates vom Tragerharz wird entweder unter
Verwendung von Hexafluoro-isopropanol oder mit einer Spaltlosung bestehend aus Essigsaure
MeOH Dichlormethan (20 10 50 v/v % ) innerhalb von 1 Stunde bei RT erzielt Nach Abtrennung des Tragerharzes wird die Losung am Rotavapor eingeengt und der entstandene Ruckstand durch
Lyophi sation von Losungsmittelresten befreit
Ausbeute 85 % Rohausbeute des linearen Vahnomycindeπvates als weißes Pulver
Die Reinheit und Identität wird per HPLC und Maldi-TOF-Massenspektrometπe überprüft
Massenspektrometπe Matrix Dihydroxybenzoesaure (DHB)
Hauptsignal 1330,59 MH+ lineares Produkt Die Reinigung des linearen Produktes erfolgt mittels praparativer Flussigchromatographie Die C-N Zyklisierung erfolgt nach den in der Peptidcherme üblichen Methoden, wobei bevorzugt PyBOP als Kondensationsmittel verwendet wird Nach Überprüfung der vollständigen Umsetzung mittels HPLC -Analytik und Massenspektrometπe, wird die Losung mit Wasser versetzt und lyophihsiert Es bleibt ein amorph kristallines Pulver zurück, welches mittels praparativer HPLC gereinigt wird Ausbeute rd 35 -40 % d Theor
Beispiel 3;
,Orn(5'-FAM)-Valinomycin C75 H10ι N7 024 [1484.66]
(cyclo) 'L-Orn(5'-FAM)- 2D-Hιv- D-Val- L-Lac- 5L-Val- 6D-Hιv- 7D-Val- 8L-Lac- 9L-Val- 10D-Hιv- "D-Val- I2L-Lac
Die Synthese des cyclo Orn BOC) - Valinomycin (C59 H99 N7 O20) erfolgt analog Beispiel 2 cyclo 'θrn(BOC) - Valinomycin [1226,47 ] (0 004 mmol) wird in 1 ml Dichlormethan gelost und mit
1 ml Tπfluoressigsaure (TFA) versetzt Nach 1 Stunde bei RT wird die Losung am Rotavapor eingeengt, der Ruckstand in wäßrigem Acetonitπl aufgenommen und lyophihsiert
Durch HPLC / MS Untersuchung wird die vollständige Abspaltung der O-tBu- und t-BOC-
Schutzgruppe überprüft ( MH+ 1 127 4 m/z )
Der weiße Ruckstand wird nun in ca 500 μl DMF gelost und nach Zugabe von 0 008 mmol TEA wird
5'-Carboxy-Fluorescιn- N-Hydroxysuccinimidylester ( 0 0044 mmol FAM-SE) gelost in 250 μl DMF zugegeben und die Reaktionslosung ca 6 - 8 Stunden bei RT geschüttelt
Die Losung wird eingeengt und das Produkt mittels prap HPLC isoliert
Ausbeute 31 % d Theor Beispiel 4;
1Lys(5'-TAMRA)- Valinomycin C8o H113 N9 θ22 [1552,82]
(cyclo) 'L-Lys(5'-TAMRA)- 2D-Hiv- D-Val- 4L-Lac- 5L-Val- 6D-Hiv- 7D-Val- 8L-Lac- 9L-Val-
10D-Hiv- "D-Val- I2L-Lac.
Die Synthese erfolgt analog wie in Beispiel 2 beschrieben. Anstelle der nachträglichen Einführung des Label an einer Seitenkettenfunktion des Ionophors, wird hier bereits ein „vormarkierter"
Synthesebaustein in der Synthese eingesetzt.
In diesem Fall handelt es sich um FMOC-L-Lys(5 '-TAMRA)-D-Hiv-OH.
Ausbeute: 45 % d. Theor.
Beispiel 5:
1D-Lys(5'-TAMRA)-7L-Lys(5'-FAM)-Valinomycin C102 H126 N,0 028 [1940.17]
(cyclo) 'L-Lys(5'-FAM)- 2D-Hiv- 3D-Val- 4L-Lac- 5L-Val- 6D-Hiv- 7D-Lys(5'- TAMRA)- 8L-Lac- 9L-Val- l0D-Hiv- ' 'D-Val- 12L-Lac.
Die Synthese erfolgt analog wie in Beispiel 2 beschrieben. Als Synthesebausteine werden FMOC-D- Lys(t-BOC)-L-Lac und FMOC-L-Lys(Dde)-D-Hiv verwendet. Die Synthese am Harz sowie die Abspaltung erfolgt wie vorhin beschrieben. Die Zyklisierung erfolgt bevorzugterweise mit PyBOP zum zyklischen Valinomycin-Derivat.
Nach präp. HPLC-Reinigung wird eine selektive Abspaltung der einzelnen Seitenkettenschutzgruppen durchgeführt. Dazu wird zuerst mit 2 %iger Hydrazin-Lösung in DMF die Dde - Schutzgruppe vom L-Lysin entfernt und anschließend die Spaltlösung durch Lyophilisation entfernt. Der Rückstand wird in DMF aufgenommen und mit Fluorescein als Succinimidylester (SE) umgesetzt. Üblicherweise genügt ein 2.5-facher molarer Überschuß an FAM-SE zur vollständigen Umsetzung. Die Umsetzung wird mittels HPLC überprüft. Nach Entfernen des überschüssigen FAM-SE durch Chromatographie wird das gereinigte Zwischenprodukt lyophihsiert.
Ausbeute an 'L-Lys(5'-FAM)-7D-Lys(BOC)-Valinomycin als Zwischenprodukt : 22 % d. Theor. Dieses Zwischenprodukt wird nun mit 50 %iger TFA in DCM für rd. 30 min. behandelt, wobei die t-BOC Gruppe von der N£-Aminofunktion des 7Lys entfernt wird. Nach Entfernen der Spaltlösung am Rotavapor wird der Rückstand in wenig DMF aufgenommen und nach Zugabe von einem Äquivalent TEA mit rd. 2.5 Äquivalenten 5'-TAMRA-SE umgesetzt. Nach Überprüfung der Umsetzungsrate mittels HPLC und Massenspektrometrie wird das Produkt mittels praparativer RP-HPLC gereinigt. Ausbeute: rd. 10-12 % (d. Theor. ) Beispiel 6:
1Orn(Dabcyl)-7D-Glu(EDANS)- Valinomycin C8, H114 N12 023 S, [1655.92]
(cyclo) 'L-Orn(DABCYL)- 2D-Hiv- 3D-Val- 4L-Lac- 5L-Val- 6D-Hiv- 7D-Glu(EDANS)- 8L-Lac- 9L-Val- 10D-Hiv- "D-Val- I2L-Lac.
Die Synthese erfolgt analog wie in Beispiel 4 beschrieben. Als „vormarkierte" Synthesebausteine finden FMOC-L-Orn(Dabcyl)-D-Hiv-OH sowie FMOC-D-Glu(EDANS)-L-Lac-OH in der Synthese
Verwendung.
Ausbeute: rd. 38 % (d. Theor. )
Beispiel 7:
'L-Lys(Bodipy®-FL)-5L-Glu-9L-Lys(Bodipy®-FL)-Valinomycin
C84 H12o N12 022B2 F4 [1747.55]
(cyclo) 'L-Lys(Bodipy®-FL)- 2D-Hiv- 3D-Val- 4L-Lac- 5L-Glu- 6D-Hiv- 7D-Val- 8L-Lac-
9L-Lys(Bodipy®-FL) - 10D-Hiv- "D-Val- 12L-Lac.
Die Synthese erfolgt wie in Beispiel 2 beschrieben, wobei zusätzlich folgende Synthesebausteinen eingesetzt werden: FMOC-L-Glu(otBu)-D-Hiv, FMOC-L-Lys(t-BOC)-D-Hiv.
Nach Abspaltung , Reinigung und Zyklisierung werden mit TFA alle Schutzgruppen entfernt und
Bodipy® als Succinimidylester in Lys in Position 1 und 9 eingeführt. Die zur Immobilisation an der
Sensor tragenden Schicht gedachte Carboxylgruppe bleibt dabei unverändert.
Ausbeute: rd. 32 % (d. Theor. )
Beispiel 8:
1Orn(5'-FAM)- Valinomycin - Kalium-Komplex und Nachweis der selektiven Komplexierung von Kalium- gegenüber Natriumionen C75 Hioi N7 024 Ki [1523.76]
Proben vorbereitun g
0.5 mg (0.3 μmol) Orn(5'-FAM)-Valinomycin erhalten wie in Beispiel 3 beschrieben, werden in
5 ml Methanol gelöst.
Die massenspektroskopische Analyse mittels Maldi-TOF ergibt als Hauptsignal 1485 m/z als [MH+], sowie ein kleineres Signal mit 1523.8 m/z entsprechend [MK+]. Entgegen üblichen Maldi-TOF
Massenspektren, bei denen immer Natrium- neben Kaliumaddukten nachgewiesen werden können, zeigt sich hier wie bei Valinomycin selbst, als dominantes Nebenprodukt ausschließlich die durch ein
Kalium-Kation komplexierte Form.
• 1000 μl dieser Lösung (0.067 μmol ) werden nun mit 15 μl einer 5 mmolaren Natrium-Acetat Lösung inkubiert. Das Massenspektrum zeigt neben 1485.7 m/z als [MH+], auch im geringen Ausmaß 1507.65 m/z entsprechend dem Natrium-Komplex [MNa+] sowie 1523.8 m/z entsprechend dem Kalium- Komplex [MK+].
• 1000 μl der Lösung (0.067 μmol ) werden nun mit 15 μl einer 5 mmolaren Kalium-Acetat Lösung inkubiert. Das Ergebnis des Massenspektrum zeigt ausnahmslos 1523.8 m/z entsprechend dem Kalium- Komplex.
• Wird zu dieser den Kalium-Komplex enthaltenden Lösung nun in steigendem Maße Na-Acetat- Lösung zugegeben, so tritt keinerlei Verdrängung des Kaliums aus dem Komplex durch Natrium auf. Selbst bei 20-fachem Überschuß an Natrium-Ionen konnte kein Auftreten von [MNa+] Addukten in der massenspektroskopischen Analyse beobachtet werden.

Claims

Patentansprüche
1 Ein optischer Sensor für Kahumionen dadurch gekennzeichnet, daß der lonophor ein fluoreszenzmarkiertes zyklisches Peptohd, vorzugsweise ein fluoreszenzmarkiertes Depsipeptid, vorzugsweise ein fluoreszenzmarkierter Abkömmling des Vahnomycins oder seines Enantiomers ist und dessen funktiona sierte Seitenketten kovalent den Chromophor, oder den Chromophor und eine daran oder an einer weiteren Seitenkette gebundene freie zur Immobilisierung geeignete Funktion, oder zwei Chromophore und eine daran oder an einer weiteren Seitenkette gebundene freie zur Immobilisierung geeignete Funktion tragen
2 Ein optischer Sensor nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß die im lonophor enthaltenen Aminosäure- und Hydroxycarbonsaurereste Glycin, Sarcosin, Alanin, Vahn, Leucin, Isoleucin Prolin, Hydroxyisovaleπansaure und Milchsaure sind
3 Ein optischer Sensor nach Anspruch 1 und 2 dadurch gekennzeichnet, daß als funktionelle Bausteine ein bis drei im zyklischen lonophor enthaltene Reste aus Lysin, Ornithin, Diaminopropionsaure, Asparagmsaure, Glutaminsäure, Aminosubeπnsaure, Cystein, Tyrosin, und mit einer funktionellen Gruppe am Aromaten substituiertes Phenylalanin oder die entsprechenden daraus durch Austausch der Aminofunktion herstellbaren alpha-Hydroxysauren eingebaut sein können
4 Ein optischer Sensor nach Anspruch 1-3 dadurch gekennzeichnet, daß die im lonophor enthaltenen Aminosäure- und Hydroxycarbonsaurereste sowohl L- als auch D-Konfiguration besitzen können
5 Ein optischer Sensor nach Anspruch 1-4 dadurch gekennzeichnet, daß der lonophor kovalent mit einem Chromophor verbunden ist und eine weitere funktionelle Seitenkette besitzt, die direkt oder nach chemischer Aktivierung zur Immobilisierung an eine den Sensor tragenden Schicht geeignet
6 Ein optischer Sensor nach Anspruch 1-4 dadurch gekennzeichnet, daß der lonophor kovalent mit einem Fluorophor und einem aromatischen Kohlenwasserstoffrest, vorzugsweise Naphthyl, Anthryl, Pyrenyl, 3,5-Dιnιtrobenzoyl, 3,5-Dιmethylbenzoyl verbunden ist, der als Elektronen- Akzeptor oder Donator fungiert
7 Ein optischer Sensor nach Anspruch 1-4 dadurch gekennzeichnet, daß der lonophor zwei Chromophore kovalent gebunden hat
8 Ein optischer Sensor nach Anspruch 1-4 dadurch gekennzeichnet, daß der lonophor bis zu drei funktionelle Gruppen besitzt, wobei eine Funktionalität kovalent mit dem Tragermaterial verbunden wird
9 Ein optischer Sensor nach Anspruch 1-5, und 8 dadurch gekennzeichnet, daß die zur Immobilisierung an einer Matrix geeignete Funktion am Chromophor lokalisiert ist
10. Ein optischer Sensor nach Anspruch 1-5, 8 und 9 dadurch gekennzeichnet, daß die zur Immobilisierung an einer Matrix geeigneten Seitenketten des Ionophors oder des Chromophors eine Carboxyl- Amino-, Thiol-, Isocyanat-, Thiocyanat- Sulfonylgruppe tragen, die direkt oder nach chemischer Aktivierung zur Immobilisierung an eine den Sensor tragende Schicht geeignet sind.
1 l.Ein optischer Sensor nach Anspruch 1-10 dadurch gekennzeichnet, daß die kovalent am lonophor befestigten Chromophore vorzugsweise TAMRA, Oregon-Green™, FAM, EDANS, Bodipy-FLΘ, Dabcyl, Dabsyl, Texas-Red111 oder Cyanin-Farbstoffe sind.
12. Ein optischer Sensor nach Anspruch 1 bis 1 1 dadurch gekennzeichnet, daß durch die Bindung des zu messenden Ions sich mindestens eine optische Eigenschaft mindestens eines Chromophors ändert.
Die Erfindung betrifft speziell fluoreszenz-markierte zyklische Peptohde (Depsipeptide) und deren Verwendung zur optischen Bestimmung der Konzentration von Kaliumionen in einer Probe. Die Bestimmung erfolgt dadurch, daß das als lonophor fungierende Peptolid Kaliumionen aus einer Probe, die auch andere Ionen enthält, selektiv zu binden vermag und daß dadurch ein an den lonophor kovalent gebundener Chromophor mindestens eine seiner optischen Eigenschaften ändert oder diese Änderung an einem zweiten gebundenen Farbstoffrest induziert ( z. B. Fluoreszenz-Depolarisation). Ein spektroskopisch meßbarer Effekt wird erfindungsgemäß dadurch erzeugt, daß sich durch Komplexierung des Kaliumions in einem fluoreszenzmarkierten makrocychschen Peptolid-Ionophor dessen Konformation stark verändert. Das einfachste Meßmolekül besteht somit aus mindestens einem lonophor und einem damit kovalent verbundenem Chromophor (Label). Es kann weiters erfindungsgemäß bei Vorhandensein von zwei an geeigneter Stelle kovalent gebundenen Chromophoren im Meßsystem durch Änderung der räumlichen Lage der beiden Molekülteile zueinander in Abhängigkeit von der Konzentration des Elektrolyten mindestens eine deren optischer Eigenschaften verändert werden. (Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer (FRET), Donor- Akzeptor Wechselwirkung).
Das gesamte Molekülsystem kann erfindungsgemäß durch eine weitere Funktion, die an geeigneter Stelle positioniert ist, kovalent mit einer Matrix verankert werden.
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