WO2000077036A2 - Gene pls1 (ou gene 421) du champignon pathogene du riz magnaporthe grisea indispensable a la pathogenie du champignon - Google Patents

Gene pls1 (ou gene 421) du champignon pathogene du riz magnaporthe grisea indispensable a la pathogenie du champignon Download PDF

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WO2000077036A2
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polynucleotide
polypeptide
plsl
pathogenesis
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Joaquim Cots
Mathieu Gourgues
Marie-Pascale Latorse
Marc-Henri Lebrun
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Aventis Cropscience S.A.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
    • C07K14/375—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from Basidiomycetes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Definitions

  • the present invention relates to a new plsl gene (or gene 421) essential for the pathogenesis of the fungus.
  • the subject of the invention is polynucleoti of /? /, _ • /, Plsl polypetides, host organisms expressing a Plsl polypeptide and their uses for the identification of new antifungal molecules.
  • the gene chosen as the target of potential fungicidal molecules is essential to the life of the fungus, its inhibition by the fungicidal molecule causing the death of the fungus, or essential to the pathogenesis of the fungus, its inhibition is not lethal for the fungus but simply inhibits its pathogenic power.
  • This second category of potential target genes for fungicidal molecules is particularly important for the development of a new generation of fungicide products that are more respectful of the environment, specifically attacking the pathogenic power of pathogenic fungi. The identification of the genes essential to the pathogenesis of the fungus is therefore necessary for the development of new fungicidal products.
  • the present invention relates to the identification and cloning of a new gene essential for the pathogenesis of the fungus called gene 421 or gene plsl (punchless 1) coding for a polypeptide Plsl.
  • gene 421 or gene plsl (punchless 1) coding for a polypeptide Plsl.
  • Plsl polypeptide
  • a udder mutant of Magnaporthe grisea, in which the gene is inactivated, is no longer pathogenic for rice and barley. Expression of the plsl gene is therefore essential for the pathogenesis of the fungus.
  • the invention also relates to the use of the plsl gene and the Plsl polypeptide to identify new antifungal molecules. Description of the sequence list
  • SEQ ID No. 1 Plsl gene or gene 421 of Magnaporthe grisea.
  • SEQ ID No. 2 Promoter of the plsl gene of Magnaporthe grisea.
  • SEQID No. 3 cDNA of the plsl gene of Magnaporthe grisea.
  • SEQ ID No. 4 Exons and introns of the plsl gene of Magnaporthe grisea.
  • SEQ ID No. 5 Open reading frame for the plsl gene of Magnaporthe grisea.
  • SEQ ID No. 6 Plsl polypeptide from Magnaporthe grisea.
  • SEQ ID No. 7 Genomic DNA of the P. higginsii plsl gene.
  • SEQ ID No.8 partial cDNA of the plsl gene of P. higginsii.
  • SEQ ID No. 9 Fragment of the P. higginsii Pls1 polypeptide.
  • SEQ ID No. 10 Genomic DNA of the Ncrassa plsl gene.
  • SEQ ID No. 11 partial cDNA of the plsl gene from Ncrassa.
  • SEQ ID No. 12 Fragment of the Ncrassa Pls1 polypeptide.
  • SEQ ID No. 13 Partial cDNA of the Botrytis pls1 gene.
  • SEQ ID No. 14 Fragment of the Botrytis Pls1 polypeptide.
  • SEQ ID No. 15 - 24 Primers for PCR.
  • the present invention relates to polynucleotides comprising a fungus plsl gene.
  • the plsl gene can be isolated from phytopathogenic fungi such as, for example, Botrytis cinerea . Mycosphaerella graminicola, Stagnospora nodorum, Blumeria graminis, Colleotrichum lindemuthianum, Puccinia graminis, Leptosphaeria maculons, Fusarium oxysporum, Fusarium graminearum and Venturia inaequalis.
  • the plsl gene is isolated from phytopathogenic fungi of the genus Magnaporthe.
  • the polynucleotides of the invention comprise a pls1 gene from Magnaporthe grisea.
  • the polynucleotides of the present invention comprise the coding sequence of a pls1 gene from Magnaporthe grisea.
  • the term "plsl polynucleotides” designates all of the polynucleotides of the present invention, preferably the polynucleotides of the plsl genomic sequence, the polynucleotides of the plsl cDNA sequence, as well as the polynucleotides encoding for the Pls1 polypeptides of the present invention.
  • the term “plsl polynucleotides” also denotes recombinant polynucleotides comprising the said polynucleotides.
  • polynucleotide means a single-stranded nucleotide chain or its complement or a double-stranded nucleotide chain which may be of DNA or RNA type.
  • the polynucleotides of the invention are of the DNA type, in particular double stranded DNA.
  • polynucleotide also denotes modified oligonucleotides and polynucleotides.
  • polynucleotides of the present invention are isolated or purified from their natural environment.
  • the polynucleotides of the present invention can be prepared by conventional techniques of molecular biology as described by Sambrook et al. (see Sambrook et al., Molecular Cloning: A Labratory
  • the invention relates to polynucleotides comprising the genomic sequence of the Magnaporthe grisea plsl gene of SEQ ID No. 1 and Seq ID No. 4.
  • This genomic sequence comprises 3 exons (positions 2363-2764, 2861-3025 and 3104- 3214 of SEQ ID NO. 1), 2 introns (positions 2765-2860 and 3026-3104 of SEQ ID NO.l) and regulatory sequences in 5 'and 3'.
  • the polynucleotides of the plsl genomic sequence comprise a polynucleotide chosen from the following polynucleotides: a) the polynucleotide of SEQ ID NO.1, b) a polynucleotide comprising at least one exon of SEQ ID NO.1; c) a polynucleotide comprising a combination of exons of SEQ ID NO.1.
  • the present invention also relates to a polynucleotide comprising a regulatory sequence 5 ′ or 3 ′ of the pls1 gene of Magnaporthe grisea.
  • the invention relates to a polynucleotide comprising the promoter of the plsl gene of Magnaporthe grisea whose sequence is between position 1 and position 1636 of SEQ ID NO. 1.
  • the sequence of the promoter of the plsl gene is also represented by SEQ ID No. 2.
  • the invention relates to a polynucleotide comprising a biologically active fragment of the promoter of the plsl gene of Magnaporthe grisea of SEQ ID NO. 2.
  • biologically active fragment is meant above a polynucleotide having a promoter activity and more particularly a promoter activity in fungi.
  • the techniques for evaluating the promoter activity of a polynucleotide are well known to those skilled in the art. These techniques conventionally involve the use of an expression vector comprising, in the direction of transcription, the polynucleotide to be tested and a reporter gene (see Sambrook et al., Molecular Cloning: A Labratory Manual,
  • the invention also relates to polynucleotides comprising the plsl cDNA of
  • Magnaporthe grisea from SEQ ID NO. 3.
  • the cDNA of the plsl gene of Magnaporthe grisea comprises the coding sequence of the plsl gene as well as a regulatory sequence 5 'UTR and a regulatory sequence 3' UTR.
  • the invention relates more particularly to 0 polynucleotides comprising the coding sequence of the plsl gene of Magnaporthe grisea of the
  • the invention also extends to polynucleotides comprising a polynucleotide chosen from the following polynucleotides: a) the polynucleotide of SEQ ID NO. 1; 5 b) the polynucleotide of SEQ ID NO. 2; c) the polynucleotide of SEQ ID NO. 3; d) the polynucleotide of SEQ ID NO. 4; e) the polynucleotide of SEQ ID NO.
  • homologous is meant according to the invention a polynucleotide having one or more sequence modifications compared to the reference sequence. These modifications can be deletions, additions or substitutions of one or more nucleotides of the reference sequence.
  • the percentage of homology will be at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% and preferably at least 98% and more preferably at least 99% by compared to the reference sequence.
  • the methods for measuring and identifying the homologies between the nucleic acid sequences are well known to those skilled in the art.
  • PILEUP Altschul et al., J. Mol.Evol. 36: 290-300, 1993; Altschul et al., J.Mol.Biol. 215: 403-10, 1990 ).
  • the invention therefore relates to polynucleotides comprising polynucleotides having at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% and preferably at least 98% and more preferably at least 99% homology with a polynucleotide of SEQ ID No. 1-5, 7, 8, 10, 11 yes 3.
  • the invention relates to a polynucleotide comprising a polynucleotide of at least 50, 100, 200, 300,
  • the polynucleotides homologous to a reference polynucleotide retain the function of the reference sequence.
  • sequence capable of selective hybridization is meant according to the invention the sequences which hybridize with the reference sequence at a level above the background noise significantly.
  • the level of the signal generated by the interaction between the sequence capable of selective hybridization and the reference sequences is generally 10 times, preferably 100 times more intense than that of the interaction of the other DNA sequences generating the background noise.
  • the stringent hybridization conditions allowing selective hybridization are well known to those skilled in the art. In general, the hybridization and washing temperature is at least 5 ° C. lower than the Tm of the reference sequence at a given pH and for a given ionic strength.
  • the hybridization temperature is at least 30 ° C for a polynucleotide of 15 to 50 nucleotides and at least 60 ° C for a polynucleotide of more than 50 nucleotides.
  • hybridization is carried out in the following buffer: 6X SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA, 0.02% PVP, 0.02% Ficoll, 0.02% BSA, 500 ⁇ g / ml denatured salmon sperm DNA.
  • the washes are for example carried out successively at low stringency in a 2X SSC buffer, 0.1% SDS, at medium stringency in a 0.5X SSC buffer, 01% SDS and at high stringency in a 0.1X SSC buffer, 0, 1% SDS.
  • Hybridization can of course be carried out according to other usual methods well known to those skilled in the art (see in particular Sambrook et al., Molecular Cloning: A Labratory Manual, 1989).
  • the invention therefore relates to polynucleotides comprising a polynucleotide capable of hybridizing selectively with a polynucleotide of SEQ ID Nos. 1-5, 7, 8, 10, 1 1 or 13.
  • the invention relates to a polynucleotide comprising a polynucleotide of at least 50, 100, 200, 300, 400, 500, 1000 nucleotides capable of selectively hybridizing with a polynucleotide of SEQ ID No. 1-5, 7, 8, 10, 11 or 13
  • the polynucleotides selectively hybridizing to a reference polynucleotide retain the function of the reference sequence.
  • the polynucleotides of the present invention retain the function of the pls1 gene of Magnaporthe grisea and code for a tetraspanin essential for the pathogenesis of the fungus.
  • the plsl gene controls different biological functions of the appressorium such as the differentiation of the infection needle.
  • the plsl gene codes for a polypeptide of the tetraspanin family. These membrane proteins are part of membrane complexes playing a role in cell signaling controlling the movement of animal cells. Tetraspanins are involved in the reorganization of the cytosquellette and in particular of the actin network and in cell signaling by PKC-phosphoinositides.
  • the polynucleotides of the present invention complement a plsl mutant of Magnaporthe grisea and restore its pathogenicity for rice and barley.
  • a plsl mutant according to the invention is a Magnaporthe grisea mutant in which the plsl gene of SEQ ID No. 1 is inactivated by techniques well known to those skilled in the art.
  • the present invention also relates to allelic variants of the plsl gene of Magnaporthe grisea.
  • the present invention also relates to the identification and cloning of genes homologous to the pls1 gene of Magnaporthe grisea in other phytopathogenic fungi.
  • these homologous genes are capable of being isolated or cloned from a phytopathogenic fungus chosen from Botrytis cinerea, Mycosphaerella graminicola, Stagnospora nodorum, Blumeria graminis, Colleotrichum lindemuthianum, Puccinia graminis, Leptosphaeria maculons, Fusarium oxysporum, Fusarium graminear Venturia inaequalis.
  • the subject of the invention is therefore the use of a polynucleotide or of a fragment of a polynucleotide of SEQ ID NO. 1 according to the invention for the identification of homologous genes in other phytopathogenic fungi.
  • the techniques allowing the cloning of homologous pls1 genes in other phytopathogenic fungi are well known to those skilled in the art.
  • Cloning is carried out, for example, by screening cDNA libraries or genomic DNA libraries with a polynucleotide or a fragment of a polynucleotide of SEQ ID NO.1. These libraries can also be screened by PCR using specific or degenerate oligonucleotides derived from SEQ ID No. 1 or from SEQ ID No. 3. For example, use the PCR primers of SEQ ID Nos. 17-22. Construction techniques and for screening these banks are well known to those skilled in the art (see in particular
  • Phytopathogenic fungus plsl genes can also be identified in databases by nucleotide or protein BLAST using SEQ ID NOs. 1-6.
  • the cloned genes retain the function of the pls1 gene of Magnaporthe grisea and code for a polypeptide of the tetraspanin family essential for the pathogenesis of the fungus.
  • the sequences of the cloned genes can be analyzed according to known methods in order to establish that they code for a polypeptide of the family of tetraspanins.
  • the techniques making it possible to establish that a known gene is essential to the pathogenesis of a fungus are known to those skilled in the art.
  • the gene studied is inactivated in the fungus by conventional techniques of molecular biology, in particular the replacement of the gene with a marker gene by homologous recombination.
  • the reduction in the pathogenesis of the fungus containing the inactivated gene is analyzed by phenotypic tests.
  • Other techniques well known to those skilled in the art can be used to establish that the polynucleotides of the invention retain the function of the pls1 gene of Magnaporthe grisea. Mention may in particular be made of the complementation of pis 1 mutants followed by tests for restoring the pathogenesis of the fungus.
  • the distribution of the plsl gene within the M. grisea species was analyzed by hybridization.
  • the genomic DNA of five pathogenic rice isolates from different regions of the world (Mali, Cameroon, Brazil, Japan, China), as well as that of six isolates from other host plants than rice (wheat, finger millet, millet, ginger) , Cyperus) was hybridized with a probe corresponding to the coding phase of the plsl gene under heterologous hybridization conditions (55 ° C., 2 SSC).
  • a hybridization signal corresponding to a single copy gene was detected in all the isolates analyzed, including that of a species related to M. grisea (PH54, Pyricularia higginsii) pathogen of Cyperaceae. This result shows that the plsl gene is strongly conserved within the Magnaporthe grisea species.
  • the nucleotide and protein sequences of genes homologous to the pls1 gene of Magnaporthe grisea have been cloned and are represented by SEQ ID Nos 7-14.
  • the present invention also relates to a polynucleotide comprising an antisense polynucleotide of the coding sequence of the pls1 gene.
  • antisense sequence is meant according to the invention a sequence coding for a total or partial antisense sequence of the coding sequence of the Pls1 polypeptide.
  • a subject of the invention is also polynucleotides comprising a polynucleotide encoding a polypeptide chosen from the following polypeptides: a) the polypeptide of SEQ ID No. 6; b) a polypeptide homologous to a polypeptide of SEQ ID No. 6; c) a biologically active fragment of a polypeptide as defined in a) or b).
  • the present invention also relates to Pls1 polypeptides of phytopathogenic fungus and more particularly of Magnaporthe grisea.
  • the term "Pls1 polypeptides” designates all of the polypeptides of the present invention as well as the polypeptides for which the polynucleotides of the present invention encode.
  • the term "Pls1 polypeptides” also refers to fusion proteins, recombinant proteins or chimeric proteins comprising these polypeptides.
  • the term “polypeptide” also denotes proteins and peptides as well as modified polypeptides.
  • the polypeptides of the invention are isolated or purified from their natural environment.
  • the polypeptides can be prepared by various methods. These methods are in particular the purification from natural sources such as cells naturally expressing these polypeptides, the production of recombinant polypeptides by appropriate host cells and their subsequent purification, production by chemical synthesis or, finally, a combination of these different approaches. These various production methods are well known to those skilled in the art.
  • the Plsl polypeptides of the present invention can be isolated from fungi expressing Plsl polypeptides.
  • the Pls1 polypeptides of the present invention are isolated from recombinant host organisms expressing a heterologous Pls1 polypeptide. These organisms are preferably chosen from bacteria, yeasts, fungi, animal or insect cells.
  • the subject of the present invention is a polypeptide comprising a Plsl polypeptide of Magnaporthe grisea of SEQ ID No. 6.
  • the invention also relates to polypeptides comprising a biologically active fragment or a homolog of the Plsl polypeptide of SEQ ID No. 6
  • fragment of a polypeptide refers to a polypeptide comprising part but not all of the polypeptide from which it is derived.
  • the invention relates to a polypeptide comprising a fragment of at least 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 100, 200 amino acids of a polypeptide of SEQ ID No. 6.
  • biologically active fragment designates a fragment of a polypeptide conserving the function of the polypeptide from which it is derived.
  • the biologically active fragments of the polypeptide of SEQ ID No. 6 thus preserve the function of the Pls1 polypeptide of Magnaporthe grisea.
  • These biologically fragments active therefore have an activity of fungus tetraspanins. Preferably, this activity is essential to the pathogenesis of the fungus.
  • homologous denotes a polypeptide which may have a deletion, an addition or a substitution of at least one amino acid.
  • the subject of the invention is a polypeptide having at least 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% and preferably at least 99% of homology with a polypeptide of SEQ ID No. 6.
  • the methods measuring and identifying homologies between polypeptides or proteins are known to those skilled in the art.
  • the default settings are used.
  • these homologous polypeptides retain the same biological activity as the Pls1 polypeptide of Magnaporthe grisea of SEQ ID No.6.
  • these polypeptides therefore have a fungus tetraspanin activity and control different biological functions appressorium as to vary the needle infection.
  • this activity is essential to the pathogenesis of the fungus.
  • these homologous polypeptides are capable of being isolated from phytopathogenic fungi.
  • the subject of the invention is also a fusion polypeptide comprising a Pls1 polypeptide as described above fused to a reporter polypeptide.
  • the reporter polypeptide allows rapid detection of the expression of a Pls1 polypeptide in a fungus or in another host organism.
  • GFP green fluorescent protein
  • GUS ⁇ -glucuronidase
  • the plsl gene can be expressed in different host organisms such as bacteria, yeasts, fungi, animal or insect cells.
  • the pls1 gene can be expressed in a host organism under the control of the pis 1 promoter of the present invention or under the control of a heterologous promoter. Expression tapes
  • a polynucleotide encoding a Pls1 polypeptide is inserted into an expression cassette using cloning techniques well known to those skilled in the art.
  • This expression cassette comprises the elements necessary for the transcription and translation of the sequences coding for the Pls1 polypeptide.
  • this expression cassette comprises both elements making it possible to produce a Pls1 polypeptide by a host cell and elements necessary for the regulation of this expression.
  • the expression cassettes according to the invention comprise, in the direction of transcription, a promoter functional in a host organism, the plsl gene or the coding sequence of the plsl gene and a terminator sequence in said organism host.
  • the expression cassette comprises, in the direction of transcription, a functional promoter in a host organism, a polynucleotide chosen from the following polynucleotides: a) a polynucleotides coding for the Pls1 polypeptide of SEQ ID No. 6 or for a biologically active fragment of the Pls1 polypeptide of SEQ ID No. 6; b) a polynucleotide of SEQ ID No. 1; c) a polynucleotide of SEQ ID No. 3; d) a polynucleotide of SEQ ID NO. 4; e) a polynucleotide of SEQ ID NO.
  • the expression cassette comprises, in the direction of transcription, a promoter functional in a host organism, a polynucleotide chosen from the following polynucleotides: a) a polynucleotides coding for the polypeptide comprising a Plsl polypeptide of SEQ ID No. 6 or for a biologically active fragment of the Plsl polypeptide of SEQ ID No. 6; h) a polynucleotide encoding a polypeptide comprising a polypeptide homologous to the Pls1 polypeptide of SEQ ID No. 6; i) a polynucleotide encoding a polypeptide comprising a Pls1 polypeptide fused to a reporter polypeptide; and a terminator sequence in said host organism.
  • promoter sequence can be used in the expression cassettes according to the invention.
  • the choice of promoter will depend in particular on the host organism chosen for the expression of the gene of interest. Some promoters allow constitutive expression while other promoters are on the contrary inducible.
  • functional promoters in fungi there may be mentioned in particular that of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from Aspergillus nidulans (Roberts et al., Current Genet. 15: 177-180, 1989).
  • RNA polymerase of bacteriophage T7 RNA polymerase of bacteriophage T7
  • functional promoters in yeasts there may be mentioned in particular that of the Gall gene (Elledge et al., Proc Natl Acad Sciences, USA. 88: 1731-1735, 1991) or the GAL4 and ADH promoters of S. cerevisiae.
  • functional promoters in insect cells mention may be made in particular of the baculovirus polyhedrin promoter AcMNPN (Weyer et al., J. Gene.Nirol. 72: 2967-2974, 1991).
  • the functional promoters in animal cells the promoter of metallothionein and promoters of viruses and adenoviruses. All of these promoters are described in the literature and well known to those skilled in the art.
  • the promoter of the plsl gene of Magnaporthe grisea can be used to express a heterologous gene in a host organism and in particular in fungi.
  • the invention therefore also relates to expression cassettes comprising the promoter of a pls1 gene operatively associated with a sequence coding for a heterologous protein, allowing the expression of said protein in fungi.
  • the expression cassette according to the invention comprises, in the direction of transcription, a polynucleotide of SEQ ID NO. 2 or a biologically active fragment of the polynucleotide of SEQ ID NO. 2, a sequence encoding a heterologous polypeptide and a functional terminator sequence in fungi.
  • sequence coding for a heterologous polypeptide is meant according to the invention a sequence coding for a polypeptide different from the Pls1 polypeptide.
  • Any gene of interest can be expressed in a host organism under the control of a pis 1 promoter.
  • the pls1 promoter is used for the expression of a heterologous gene in fungi.
  • the pls1 promoter is operably associated with the coding sequence of a reporter gene.
  • the activity of the plsl promoter under different conditions can thus be evaluated using a reporter gene such as the reporter genes GUS ( ⁇ -glucuronidase), GFP (green fluorescent protein), LUC (luciferase), CAT (chloramphenicol transferase ) or ⁇ -galactosidase (lacZ).
  • a reporter gene such as the reporter genes GUS ( ⁇ -glucuronidase), GFP (green fluorescent protein), LUC (luciferase), CAT (chloramphenicol transferase ) or ⁇ -galactosidase (lacZ).
  • the pls1 promoter is operably associated with the coding sequence of a marker gene.
  • the expression of the marker gene allows the selection of organisms transformed by their resistance to antibiotics or herbicides for example.
  • a gene for tolerance to an antibiotic or a herbicide such as the genes for resistance to hygromycin (hph: Punt et al., 1987), to phleomycin (ble: Drocourt, 1990) or to bialaphos herbicide (Bar: Pall and Brunelli, 1993).
  • the expression cassette according to the invention comprises, in the direction of transcription, a functional promoter in a fungus, in particular Magnaporthe grisea, the antisense sequence of the coding sequence of the plsl gene and a terminator sequence functional in said fungus.
  • the expression cassettes can also include any other sequence necessary for the expression of the pls1 gene or of a heterologous gene, such as, for example, regulatory elements or signal sequences allowing the addressing of the Pls1 polypeptide.
  • any regulatory sequence making it possible to increase the level of expression of the coding sequence inserted into said expression cassette.
  • terminator sequences can be used in the expression cassettes according to the invention, these sequences allow the termination of transcription and polyadenylation of the mRNA. Any terminator sequence functional in the selected host organism can be used.
  • the present invention also relates to a polynucleotide comprising an expression cassette according to the invention, advantageously the expression cassettes according to the present invention are inserted into a vector.
  • Vectors
  • the present invention therefore also relates to replication or expression vectors for the transformation of a host organism comprising at least one pls1 polynucleotide or an expression cassette according to the present invention.
  • This vector can in particular consist of a plasmid, a cosmid, a bacteriophage or a virus into which is inserted a plsl polynucleotide or an expression cassette according to the invention.
  • the techniques for constructing these vectors and for inserting a polynucleotide of the invention into these vectors are well known to those skilled in the art.
  • any vector capable of maintaining itself, of self-replicating or of propagating in a host cell and in particular in order to induce the expression of a polynucleotide or of a polypeptide can be used.
  • the vectors according to the invention comprise at least one origin of replication for their replication in a host organism.
  • the vectors of the invention also comprise at least one selection marker such as a gene for resistance to an antibiotic.
  • vectors such as pBluescript (Stratagene, La Jolla, Ca), pTrcHis (Invitrogen, La Jolla, Ca) and expression vectors derived from baculovirus such as those derived from the polyhedrin virus of Autographica californica ( AcMNPV).
  • pBluescript Stratagene, La Jolla, Ca
  • pTrcHis Invitrogen, La Jolla, Ca
  • expression vectors derived from baculovirus such as those derived from the polyhedrin virus of Autographica californica ( AcMNPV).
  • a preferred system combines a baculovirus and an insect cell is the baculovirus system pVl 11392 / Sf21 cells
  • Vectors derived from adenoviruses are used in particular for expression in animal cells. Those skilled in the art will choose the appropriate vectors, in particular as a function of the host organism to be transformed and as a function of the transformation technique used. The methods of transformation of host organisms are well known to those skilled in the art (Inoue et al., Gene 96: 23-28,
  • the vectors of the present invention are used in particular to transform a host organism for the replication of the vector and / or the expression of a Pls1 polypeptide in said host organism.
  • the invention relates to a method for preparing a Pls1 polypeptide comprising the following steps:
  • a host organism is transformed with an expression vector comprising an expression cassette according to the invention
  • the cultivated host organism is cultivated under conditions allowing the expression of the Pis 1 polypeptide
  • Pls1 polypeptides produced by a host organism transformed with a polynucleotide can be purified or isolated according to methods known to those skilled in the art.
  • Pls1 polypeptides can be expressed in a host organism as fusion proteins.
  • Mention will in particular be made of the pGEX vectors for the expression of fusion proteins comprising glutathione S-transferase (GST). These fusion proteins are easily purified by adsorption on glutathione-agarose beads. The GST group can then be eliminated by digestion with protease Xa.
  • GST glutathione S-transferase
  • Other systems for the expression and purification of fusion proteins are known to those skilled in the art.
  • Mention will also be made of fusion proteins comprising a reporter polypeptide such as GFP or the GUS protein. The expression of these fusion proteins is easily measured. Host organizations
  • the subject of the present invention is also a method of transforming a host organism by integration into said host organism of at least one plsl polynucleotide or of an expression cassette or of a vector according to the invention.
  • the polynucleotide can be integrated into the genome of the host organism or replicate stably in the host organism. Methods of transformation of host organisms are well known skilled in the art and widely described in the literature (Inoue et al., Gene 96: 23-28,
  • the present invention also relates to a host organism transformed with a polynucleotide plsl, an expression cassette or a vector according to the invention.
  • host organism is meant in particular according to the invention any mono or pluricellular organism, lower or higher, in particular chosen from bacteria, yeasts, fungi, animal cells and insect cells.
  • bacteria are chosen from Escherichia coli and Bacillus subtilis
  • yeasts are chosen from Pichia pastoris and Saccharomyces cerevisae
  • the insect cells are chosen from Spodoptera frugiperda and Drosophila melanogaster
  • the animal cells are chosen from CHO cells, HeLa and COS.
  • the present invention also relates to the use of pis 1 polynucleotides and of Pls1 polypeptides for the identification of genes involved in the pathogenesis of fungi or for the identification of new fungicidal molecules which inhibit the pathogenesis of fungi.
  • the plsl gene controls different biological functions of the appressorium such as differentiation of the infection needle and growth in the infected plant.
  • the diversity of functions controlled by the plsl gene suggests that it acts either in a signaling pathway controlling the activity of other genes, or in a differentiation process whose blockage leads to numerous side effects. It is for example possible to identify the genes whose expression depends on the plsl gene by the comparative study of the genes expressed in a mutant of M. grisea whose expression of the protein has been inhibited, in particular by means of a antisense according to the invention defined above, and the wild strain of M. grisea. Inhibition of pathogenesis of fungi
  • the invention relates to methods for inhibiting the pathogenesis of fungi by inactivating or inhibiting expression of the pls1 gene.
  • the mushrooms are chosen from Botrytis cinerea, Mycosphaerella graminicola, Stagnospora nodorum, Blumeria graminis,
  • Colleotrichum lindemuthianum Puccinia graminis, Leptosphaeria maculons, Fusarium oxysporum, Fusarium graminearum and Venturia inaequalis.
  • the invention relates to methods for inhibiting the pathogenesis of a fungus, the said methods comprising inhibiting the expression of a plsl polynucleotide according to the invention in said fungus, or inhibiting the expression of a Plsl polypeptide according to the invention in said fungus or the inhibition of the biological activity of a Plsl polypeptide according to the invention in said fungus.
  • this inhibition specifically affects the expression of the pls1 gene and the biological activity of the Pls1 polypeptide.
  • the invention therefore does not relate to methods comprising general inhibition of gene expression in the fungus. It will be understood that the inhibition of the expression of the pls1 gene can however lead to the inhibition of other genes belonging for example to the same signaling pathway or to the same membrane complex.
  • the pls1 gene is inactivated by insertional mutagenesis or by homologous recombination (gene replacement techniques or "knock out").
  • expression of a Pls1 polypeptide is inhibited by expression of an antisense polynucleotide of the pls1 gene in fungi.
  • the expression of the pls1 gene is inhibited by an inhibitor compound.
  • the level of expression of a pls1 polynucleotide or a PLS 1 polypeptide in fungi can be measured according to techniques described in the literature. Mention will in particular be made of the Northern blot, the PCR and the DNA arrays (DNA chips) for the polynucleotides and the Western blot for the polypeptides. Identification of new fungicidal molecules that inhibit the pathogenesis of fungi
  • the invention therefore relates to methods for the identification of compounds inhibiting the pathogenesis of fungi comprising a step of identifying a compound specifically inhibiting the expression of a plsl polynucleotide in said fungus, or a step of identifying a compound inhibiting the expression of a Plsl polypeptide in said fungus or a step of identifying a compound inhibiting the biological activity of a Plsl polypeptide in said fungus.
  • the mushrooms are chosen from Botrytis cinerea, Mycosphaerella graminicola, Stagnospora nodorum, Blumeria graminis, Colleotrichum lindemuthianum, Puccinia graminis, Leptosphaeria maculons, Fusarium oxysporum, Fusarium graminearum and Venturia inaequalis.
  • the plsl polynucleotides, the Plsl polypeptides, the vectors and the host organisms of the present invention can thus be used in various screening tests in order to identify new antifungal compounds.
  • Molecules directly inhibiting the activity of the Pls1 polypeptide could inhibit the pathogenesis of the fungus and lead to the development of new fungicides.
  • the invention therefore relates to a method for the identification of compounds inhibiting the pathogenesis of fungi comprising the following steps:
  • the method also comprises a step in which it is determined whether said compound inhibits the pathogenesis of fungi.
  • Any method for preparing a Pls1 polypeptide and for purifying or isolating it can be used in the methods of the present invention.
  • the Pls1 polypeptide is expressed in a heterologous expression system (for example bacteria, yeast, animal or insect cell) by means of a pis 1 polynucleotide according to the invention, the simplified purification of the Pls1 polypeptide then makes it possible to identify new molecules which bind to the Pls1 protein.
  • the Plsl protein is over-expressed in the membranes of a cell of a heterologous expression system, then the simplified purification of the membranes of the host organisms expressing the Plsl protein makes it possible to identify new molecules which bind to the protein Plsl.
  • the identification of said molecules is done by methods well known to those skilled in the art, in particular methods of physical detection of the binding of the compounds tested on the Plsl protein (BIACORE system; Karlson & al., J. of Biomolecular Interaction Analysis, special issue Drug Discovery: 18-22). Identification of inhibitors interacting with membrane complexes containing the Plsl protein
  • the proteins of the tetraspanin family to which the Pls1 protein belongs interact with other membrane proteins (Maecker et al., FASEB J., 11: 428-442, 1997).
  • the first step consists in identifying the proteins forming a membrane complex with the Plsl protein by molecular methods such as the double hybrid method (Van Aeist et al., PNAS. 90: 6213-6217, 1993) or the cloning of M genes. .
  • Such detection systems are well known to those skilled in the art profession, in particular the double hybrid yeast system (Van Aeist et al., PNAS. 90: 6213-6217, 1993) with fragments of the Plsl protein and those interacting with Plsl, or a system for measuring the binding of one of the proteins of the complex to the Plsl protein present in a membrane preparation using a pair Europium-allophycocyanin, each element of the fluorescence transfer device being grafted to the proteins tested (Mathis, Clin. Chem. 39: 1953-1959, 1993). Identification of inhibitors of regulators of expression of the plsl gene
  • Molecules inhibiting the expression of the plsl gene could also inhibit the pathogenesis of the fungus and lead to the development of new fungicides.
  • the expression “inhibition of the expression of the plsl gene” denotes the inhibition of the expression of a polynucleotide plsl as well as the inhibition of the expression of a polypeptide Plsl in the host organisms and preferably in the phytopathogenic fungi.
  • the subject of the invention is also a method for the identification of compounds inhibiting the pathogenesis of fungi comprising the following steps:
  • the method also comprises a step in which it is determined whether said compound inhibits the pathogenesis of fungi.
  • a polynucleotide according to the invention comprising the promoter pis 1 associated with the coding sequence of a reporter gene (GUS or GFP for example) makes it possible to measure the promoter activity of the plsl promoter in a fungal cell or in a host cell.
  • This method makes it possible to identify compounds inhibiting the activity of the pls1 promoter and therefore the expression of the pls1 gene at the transcriptional level.
  • a recombinant strain comprising the above gene is thus used to identify molecules inhibiting the expression of the pls1 gene, which is manifested by an inhibition of the expression of the reporter protein of the recombinant strain under the conditions of expression of the. plsl gene.
  • the invention relates to a method for the identification of compounds inhibiting the pathogenesis of fungi comprising the following steps:
  • the Pls1 polypeptide is a fusion polypeptide comprising a reporter polypeptide such as GUS or GFP, the expression of which is easily measured.
  • the method also includes a step in which determines whether said compound inhibits the pathogenesis of fungi. This process makes it possible to identify compounds inhibiting the expression of the gene ⁇ /, sJl at the transcriptional or translational level.
  • a recombinant strain expressing a Plsl polypeptide and preferably a Plsl polypeptide fused to a reporter is thus used to identify molecules inhibiting the expression of the plsl gene, which is manifested by an inhibition of the expression of the Plsl polypeptide of the recombinant strain. under the conditions of expression of the plsl gene.
  • the present invention therefore relates to a method for identifying compounds which inhibit the pathogenesis of fungi linked to expression of the plsl gene, said method consisting in subjecting a compound, or a mixture of compounds, to an appropriate test for the identification of the inhibiting compounds. of said pathogenesis of fungi and to select the compounds reacting positively to said test, if necessary to isolate them, then to identify them.
  • the appropriate test is a test as defined above.
  • a compound identified according to these methods is then tested for these anti-fungal properties and for its ability to inhibit the pathogenesis of the fungus for plants according to methods known to those skilled in the art.
  • the compound is evaluated using phenotypic tests such as pathogenesis tests on leaves or on whole plants.
  • compound is meant according to the invention any chemical compound or mixture of chemical compounds, including peptides and proteins.
  • mixture of compounds is understood according to the invention at least two different compounds, such as for example the (dia) stereoisomers of a molecule, mixtures of natural origin resulting from the extraction of biological material (plants, plant tissues, culture bacteria, yeast or fungal cultures, insects, animal tissues, etc.) or unpurified reaction mixtures or wholly or partly purified, or mixtures of products from combinatorial chemistry techniques.
  • biological material plants, plant tissues, culture bacteria, yeast or fungal cultures, insects, animal tissues, etc.
  • unpurified reaction mixtures or wholly or partly purified, or mixtures of products from combinatorial chemistry techniques.
  • the present invention finally relates to new compounds which inhibit the pathogenesis of fungi linked to the expression of the plsl gene, in particular the compounds identified by the methods according to the invention and / or the compounds derived from the compounds identified by the methods according to the invention .
  • the compounds which inhibit the pathogenesis of fungi linked to the expression of the plsl gene are not general inhibitors enzymes.
  • the compounds according to the invention are not compounds already known to have fungicidal activity and / or activity on the pathogenesis of fungi.
  • the subject of the invention is also a method for treating plants against a phytopathogenic fungus, characterized in that it comprises the treatment of said plants with a compound identified by a method according to the invention.
  • the present invention also relates to a method for preparing a compound inhibiting the pathogenesis of fungi, said method comprising the steps of identifying a compound inhibiting the pathogenesis of fungi linked to expression of the pls1 gene by the method of identification according to the invention, then preparation of said compound identified by the usual methods of chemical synthesis, enzymatic synthesis and / or extraction of biological material.
  • the step of preparation of the compound can be preceded if necessary by a step called optimization by which a compound derived from the compound identified by the identification process according to the invention is identified, said derivative compound then being prepared by the methods usual.
  • Figure la Hybridization profile of genomic DNA digests of the mutant psll by a pAN7.1 probe.
  • Figure lb Structure of the genome region of the plsl mutant where the plasmid pAN7.1 has integrated; EcoRI ( ⁇ ); Hindlll (H); Ssp I (S); BamHI (B).
  • Figure 2 Restriction fragment overlapping the plasmid and genomic ends in the plsl mutant.
  • 421 (+) and 421 (-) indicate the positions of the primers used for reverse PCR.
  • Figure 3 Mapping of the inserts * NotI32H7 (15 kb) and Bam HI32H7 (8.5 kb) of the cosmid 32H7 cloned in the vector pCB1265 (resistance to phosphinothricin).
  • FIG. 4 Structure of the pathogenesis gene inactivated in the plsl mutant; P (Promoter), I
  • Figure 6 Comparison of the protein sequences deduced from the homologous plsl genes of Magnaporthe grisea obtained by PCR in the fungi Ascomycetes Neurospora crassa (Ncrassa), Pyricularia higginssi (P.higginss ⁇ ) and deduced from the cDNA of Botrytis cinerea (B. ciner ⁇ ) identified in Genbank (ALI 14936.1).
  • the foreign DNA is a plasmid comprising the hph gene of Escherichia coli, which allows their selection on the basis of resistance to hygromycin. It was introduced into the genome of the fungus by transformation of protoplasts.
  • rice develops a strong physiological resistance to blast during periods of high heat. This resistance can be reduced by adding nitrogen fertilizer to the plants: two waterings with an ammonium sulphate solution 5g / m ⁇ at one week intervals. The second watering takes place 2 to 3 days before inoculation.
  • M. grisea spore inoculum The conditions for sporulation and the preparation of M. grisea spore inoculum are described by Silué et al. (op. cit.). The inoculation was carried out using a wet cotton swab dipped in a suspension of spores and passed over the fragments of surviving leaves. The quantity of spores deposited was estimated by depositing a drop of the suspension on a glass slide. Symptoms were observed after 4-7 days of incubation at 24 ° C, 100% humidity. Each transformant has been tested on four fragments of rice leaf of each variety and four of barley during primary screening.
  • CIRAD of Montpellier has inoculated whole plants with the spores of this mutant.
  • the two rice cultivars susceptible to the PI.2 strain, Maratelli and Sariceltick, were sown and grown in the greenhouse.
  • Three applications of nitrogen were carried out during the first three weeks of cultivation (5, 10 and 20 days after sowing).
  • Spray inoculation of a spore suspension takes place 10 to 15 days after the last nitrogen supply, depending on the degree of maturity of the plants.
  • the spore concentration was determined by counting with a Thoma cell and adjusted to a value of 20,000 spores / ml.
  • H hygromycin
  • s sensitive to hygromycin
  • R resistant to hygromycin
  • P pathogenesis
  • M mycelium
  • GA gray and aerial mycelium
  • rc short and clear mycelium.
  • the genomic DNA was quantified with the UV transilluminator (310 nm) in comparison with a standard concentration range, after electrophoresis in a gel.
  • 25 comprising plasmid sequences were then identified by a hybridization experiment with a radioactive probe synthesized from the plasmid pAN7.1.
  • the labeling of the plasmid DNA was carried out by the random priming method in accordance with the instructions of the Megaprime kit (Pharmacia), with dCTP labeled with phosphorus 32 (Amersham).
  • the membrane prehybridization was
  • the left junction of the insertion would therefore be located between the BglIl site and the Sspl site of the gpdA promoter.
  • a double EcoRI-HmdlII digestion was carried out (not presented in FIG. 1) and gives three hybridization bands, one of which is present on the profile of the EcoRI digestion (the smallest, located around 3 kb).
  • the HindIII site is therefore conserved and located in the large fragment visible on the hybridization profile of the EcoRI digestion.
  • the mapping of this region shows (FIG. 2) that at most a 2.75 kb fragment of the plasmid was lost during integration, in particular the sequence coding for ampicillin resistance and the origin of replication (figure 2).
  • the 3 kb EcoRI digestion fragment overlapping a plasmid end, consisting of a piece of the gpdA promoter of at least 1.86 kb and a piece of genomic DNA is supposed to belong to the mutated pathogenesis gene. Furthermore, hybridization by a plasmid probe of the EcoKL / Sacl double digestion made it possible to show that there existed in this fragment only two very close S ⁇ cl sites, located approximately in the middle of the plasmid region (see the figure 2). The Reverse-PCR strategy can therefore be envisaged for the cloning of this fragment.
  • the genomic DNA of the pls1 mutant is digested with the restriction enzyme EcoRI.
  • restriction fragments were separated according to their size by agarose gel electrophoresis. After migration, the gel area containing the restriction fragments of a size close to 3 kb was cut with a scalpel. The DNA fragments it contained were recovered by desorption. These fragments were ligated in a large volume (DNA Ligation System, Amersham in 100 ⁇ l), so as to promote only the circularization of the fragments by autoligature. The DNA was precipitated with 300 ⁇ l of absolute ethanol and resuspended in 20 ⁇ l of water. The circularized fragments were digested for 1 hour at 37 ° C. with the restriction enzyme S ⁇ cl.
  • the entire digestion product was subjected to a PCR (PT ⁇ 100 MJ research) under moderately stringent conditions (30 cycles of 1 'at 95 ° C; l' at 50 ° C; l '30 "at 72 ° C) using the oligonucleotide primers 421 (+) and 421 (-) (see FIG. 2)
  • These primers were defined from their position on the sequence of the gpdA promoter and with a secondary structure compatible with a reaction of efficient PCR (OLIGO program)
  • the expected size of the PCR fragment corresponding to the border of the insertion point, deduced from the mapping made by hybridization, was 1.6 kb.
  • the amplification products were separated by electrophoresis Two very thin bands were visible, one of a size of 1 kb, the other of 1.6 kb.
  • a second amplification under the same conditions and using this first PCR product as a matrix made it possible to increase the quantity of these two PCR fragments.
  • This region was isolated in the form of a cosmid by hybridization of a replica on a nylon membrane of the cosmid library of the strain 96/0/76 of M. grisea constructed by Dioh et al. (1997 Nucleic Acids Res. 25 (24): 5130-5131).
  • the probe used was prepared from a 350 bp fragment, product of a double digestion with the EcoRI and SalI restriction enzymes of the fragment of IPCR cloned during the previous step.
  • This membrane was hybridized with the EcoRI-Sall genomic fragment of 350 bp cloned following the experiment of Inverse-PCR (conditions of digestion, separation and transfer of the restriction fragments and hybridization: op. Cit.). Two subclones of this cosmid were produced following the result of this hybridization: two overlapping restriction fragments (Notl of 15 kb and E ⁇ mHI of 8.5 kb; see FIG. 3) hybridizing with the probe used were ligated in the vector pCB1265 (Sweigard et al. (1997) Fungal Genêt. Newsl. 44: 52-53) to give the plasrnides pC421-15 and pCM421-8.5. These two plasrnids have been cloned and extracted for fungal transformations.
  • Experiment 5 Complementation of the mutation with a DNA fragment from the target genomic region for insertion into the plsl mutant.
  • the vector pCB1256 contains the bar gene under the control of fungal regulatory sequences which allows the selection of transformants of M. grisea resistant to phosphinothricin.
  • the genomic subclones isolated by hybridization with the sequence adjoining the plasmid in the genome of the plsl mutant can therefore be introduced by transformation into this mutant to find out whether they contain the complete sequence necessary for the functional complementation of the mutation.
  • Protoplates of the plsl mutant were transformed with the plasrnides pCM421-15 and pCM421-8,5 and the spores of the tran form a __..__ cs ootenus were inoculated with rice and barley leaves in survival, then with whole rice plants (conditions of preparation of protoplasts, transformation, selection and purification of transformants and pathogenesis tests: op. cit.). In both cases, at least one transformant had a level of pathogenesis similar to that of the wild strain, which indicates that the complete sequence of the altered pathogenesis gene in the pls1 mutant is contained in these two fragments.
  • the fragment cloned following the Reverse-PCR experiment was entirely sequenced from the primers Ml 3 and Reverse from the borders of the polylinker of the plasmid pGEM-T Easy. Sequencing reaction primers were then designated on the two strands of the genomic sequence of the Reverse-PCR fragment to extend the sequence data on either side of the insertion point of the plasmid pAN7.1 in the mutant plsl using plasmid pCM421-8.5.
  • the synthesis of the oligonucleotides as well as the sequencing reactions were carried out by the company Génome Express S.A. (Grenoble, France).
  • a DNA library complementary to the messenger RNAs of M. grisea was constructed and screened to locate a transcription unit corresponding to a gene in the region of genomic DNA isolated by Reverse-PCR.
  • __ 4 uement for at least 15', then centrifuged for 20 'at 4000 rpm at room temperature.
  • the aqueous phase was collected and mixed in new tubes with 2 ml of chloroform.
  • the aqueous phase was was extracted twice with 2 ml of chloroform by stirring for 10 '. It was recovered after separation by centrifugation (same conditions), then transferred to a centrifuge tube treated against RNase by autoclaving containing the same volume of 6 M LiCl treated at DEPC.
  • RNA samples were quantified by UV spectrophotometry (260 and 280 nm).
  • the poly A (+) messenger RNAs were then extracted using the Dynabeads mRNA Direct Purification Kit (Dynal) by affinity with beads grafted with an oligo (dT) 5 sequence. 5 ⁇ g of mRNA were used for the synthesis of the complementary DNAs and their ligation in an encapsidation vector with the Zap Express cDNA Synthesis Kit (Stratagene) according to the manufacturer's recommendations.
  • the cDNA bank was packaged using the Gigapack III Gold Packaging Extract kit (Stratagene), amplified and stabilized according to the manufacturer's recommendations. Screening of the library was carried out by hybridization of a replica transferred onto a nylon membrane with 1 million lysis plaques.
  • the radioactive probe used for screening was synthesized from a 1 kb Stul-Cl ⁇ restriction fragment of cosmid 32H7 (FIG. 4) hybridizing with the genomic part of the fragment recovered by Reverse-PCR (hybridization conditions: op . cit).
  • the isolated cDNA (1.9 kb in size) was then also sequenced.
  • TM4 protein superfamily or tetraspanins
  • these proteins are several proteins of this superfamily, although the degrees of identity and similarity of the amino acid sequences are low. Alignment of several proteins of this family with the Clustal X program shows, however, that it is the only family of proteins having elements of sequence identical or similar to that predicted for the protein of pathogenesis of M. grisea which have a size and topology comparable to that of this protein. This protein superfamily has no clearly established biochemical function.
  • the vector pCB1003 (Sweigard et al. (1997): op. Cit.) was digested with the restriction enzyme EcoRI to release the hygromycin resistance cassette (1 kb), constituted by the open reading frame of the hph gene (op. cit.) and promoter of the trpC D'_4 gene. nidulans. This fragment was ligated to the EcoRI site of the polylinker of the plasmid pBL to give the plasmid pBLHYG.
  • This plasmid was cloned and the orientation of the hygromycin resistance cassette controlled by restriction: the orientation of pBLHYG is such that the start of the promoter of the cassette is on the side of the Sm ⁇ 1 site.
  • This cassette was extracted from this new plasmid by a double Smal-Clal digestion.
  • Plasmid pCM421-8.5 was digested with the enzymes StuI and Cl ⁇ l.
  • Stul-Clal of 1 kb was eliminated and the other two recovered.
  • the largest (7.3 kb Stul-Clal) was ligated with the 1 kb Smal-Clal fragment containing the hygromycin resistance cassette (see above). After cloning and extraction, this plasmid was digested with
  • CM 3.5 kb
  • the plasmid obtained pRM421 was cloned and the orientation of the 3.5 kb ClaI fragment controlled by a PCR reaction using the primers hphl (5'-CAGCGAGAGCCTGACCTATTGC-3 ⁇ S ⁇ Q ID No. 15), located at the beginning of the hph gene and pos421 (5'-TCAAGACGCTCACAGAGTGC-3 ⁇ S ⁇ Q ID No.
  • the morphology of the mutant was compared to that of the wild strain according to the following criteria: pigmentation, mycelial morphology and morphology of the conidia. No particular differences were noted.
  • the radial growth rate was measured on complete or minimum agar medium.
  • the mutant is prototrophic and does not have a growth rate different from that of the wild strain.
  • the infected epidermis was peeled off by incising the upper surface just above the level of the infection with a razor blade, taking care not to completely cut the sheet, by sticking the part of the upper surface corresponding to the infected area. on a piece of double-sided adhesive tape, then very gently pulling on the part still free above the incision line.
  • the epidermis was mounted on a glass slide in a drop of water and, optionally, lactophenol blue before being observed under a microscope. Colonization of epidermal cells by the infectious hyphae of the fungus is visible between 24 and 48 hours after the droplets are deposited in the wild strain. In the case of the mutant, observations made up to 6 days after the deposition of the spore droplets did not reveal any infectious structures other than appressoria on the surface of the leaves.
  • Biological material The host plants consist of segments of barley leaves surviving on agar medium infected by depositing drops of spore suspension from _. s ss. -, ⁇ uvage or mutant). The samples are taken 24 hours after depositing the drops. A check is made with the microspcope at the time of sampling. The 2 strains have developed very abundant appressoria. A disc comprising the entire thickness of the leaf segment is cut in the deposit area and fixed for a fine cytological study.
  • the wild strain had already penetrated the cuticle and the wall of the epidermal cells and started to form an infectious hypha inside. In the case of the mutant, no penetration needle or infectious hypha could be identified. No sign of a perforation of the cuticle and the wall, however clearly visible with the wild strain, is not observable.
  • uiant plsl does not seem affected in any vegetative function, but rather in an aspect of development strictly limited to the formation and functioning of the appressorium: that seems to develop normally, but it is unable to differentiate the structure (hypha of penetration) necessary to perforate the cuticle and the wall of the epidermal cells of the barley leaf. Furthermore, its ability to adhere to the surface of the sheet is impaired.
  • Example 2 Preparation of an expression cassette for a GFP reporter gene under the control of the promoter of the plsl gene and its introduction into the genome of a wild and pathogenic strain of Magnaporthe grisea
  • the 3 kb Estl fragment of cosmid 32H7 carrying the entire coding phase of the pls1 gene was cloned into the vector pCB1265 (Sweigard et al, op. Cit.). Its orientation has been controlled by restriction, so that the coding phase of the pls1 gene is oriented in the positive direction of orientation of the plasmid.
  • the genomic DNA fragment of M. grisea located immediately 5 ′ from the coding phase of the pls1 gene was amplified by PCR with the primers Pr and GFP421, allowing the introduction of an Ncol restriction site in the sequence of this fragment located immediately upstream of the translation start signal (ATG) of the coding phase of the plsl gene.
  • the amplification fragment obtained was digested with Psfl and Ncol, then cloned into the vector p ⁇ -GFP (Clontech, USA; Haas et al, 1996, Current Biology, 6: 315-324), previously digested the same enzymes.
  • the plasmid obtained was digested with the enzymes Estl and EcoRI.
  • the DNA fragment comprising the promoter sequence piece of the pls1 gene fused to the coding phase of the GFP gene was cloned into the vector pCB1265, previously digested with the same enzymes.
  • the 3 kb Pstl fragment of cosmid 32H7 located immediately 5 ′ from that used to carry out the previous construction was cloned at the Pstl site of this construction.
  • This 3.65 kb sequence comprises the promoter region for the expression of the pis J gene (region going from the BamHI site upstream of the ATG of gene 421 to the ATG of the plsl gene).
  • the plasmid which results from this cloning was called p ⁇ M421-GFP. It was introduced by transformation of protoplasts into the genome of a wild strain P12 and pathogen of M. grisea (Mutant plsl).
  • transformants were carried out for the resistance to phosphinothricin conferred by the plasmid pCB1265 and the spores of the purified transformants obtained were analyzed for their fluorescence by light microscopy (conditions for the preparation of protoplasts, transformation, selection and purification of the transformants: op. cit.).
  • RNA samples homologous to the pls1 gene of Magnaporthe grisea have been identified and cloned in other fungi by PCR using degenerate primers. In some cases double amplification has been found necessary.
  • the amplification reaction was carried out with 100 ng of genomic DNA from two fungal species (Neurospora crassa and Pyricularia higgins ⁇ ) in the presence of dNTPs, Taq polymerase (Aplligene) and buffer (1 X) in a volume of 100 microliters .
  • the oligonucleotides T4 + (AATGCNATCTTNATCTTC) and T3- (TCYYKCTTCTTACGRTCCTT) were used for the first amplification.
  • the amplification program used comprises the first 5 cycles at a hybridization temperature of 45 ° C, followed by 30 cycles at a hybridization temperature at 50 ° C.
  • the amplification products (20 microliters) were separated by agarose gel electrophoresis and visualized by staining with ethidium bromide. A fragment of the expected size (580 bp) was observed for Pyricularia higinsi.
  • 5 microliters of this first amplification product were used for a second amplification with the oligonucleotides T4 + (AATGCNATCTTNATCTTC) and T2- (GTACTATTGWARTANCCACA) under the same experimental conditions as for the first amplification.
  • the amplification products (20 microliters) were separated by agarose gel electrophoresis and visualized by staining with ethidium bromide. A fragment of the expected size (320 bp) was then observed for Neurospora crassa.
  • the amplification products were then purified on a column and cloned into the vector pGEM-T (Promega).
  • the bacterial clones were analyzed by PCR with the forward and reverse universal oligonucleotides in order to amplify their inserts. These clones were then sequenced using universal oligonucleotides.
  • the nucleotide sequences obtained were compared with that of the pls1 gene.
  • the translation of the nucleotide sequences also made it possible to compare the genes at the level of the protein sequence of pls1 (FIG. 6). The alignments show a strong identity between these sequences both at nucleotide and protein level, showing that they belong to the same family of genes.
  • oligonucleotides in order to amplify the homologous genes of plsl in other fungal species.
  • the oligonucleotides Tl + bis (CCNGCNCGIGGNTGGCTNAA), T3-bis (YTCYYGTCYTTICGRTCYTT) and T4 + bis
  • oligonucleotides have been used to amplify plsl homologs in the following fungal species: Botrytis cinerea, Mycosphaerella graminicola, Stagnospora nodorum, Blumeria graminis, Colleotrichum lindemuthianum, Puccinia graminis, Leptosphaeria maculons, Fusarium oxysearum, Fusarium oxysporum, Fusarium oxysporum
  • Ustilago maydis, Sclerotinia sclerotiorum, Neurospora crassa, Aspergillus nidulans et fumigatus, Gaeumannomyces graminis, Claviceps purpurea, Pyrenophora teres.
  • transcripts of the plsl gene was carried out by Northern hybridization using total RNA extracted either from fungal tissues of Magnaporthe grisea such as mycelium, spores and appressoria differentiated on an artificial membrane (24h) or from barley leaves. infected with Magnaporthe grisea spores collected at different times (2, 8, 16, 24, 48 and 66 hours) after inoculation.
  • the differentiation of appressoria on an artificial surface is carried out by depositing drops of 50 microliters of spores (500,000 spores per ml) of the pathogenic wild strain of M. grisea on a teflon membrane placed flat in a humid Petri dish for 24h at 26 ° C.
  • Inoculation of barley leaves is carried out with drops of 35 microliters of spores (500,000 spores per ml) of the pathogenic wild strain of M. grisea. These drops are deposited on the surface of 5 cm fragments of young barley leaves (10-15 days after germination) placed on agar water containing kinetin (2 mg / 1). Total RNA is extracted by grinding these different tissues in a mortar containing liquid nitrogen, then following the extraction protocol of total RNA with hot phenol (Ausabel, FM, Brent, R., guitarist, RE, Moore, D., D., Seidman, JG, Smith & JA, Struhl, K. (1994). Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley and Sons, NY).
  • RNAs are quantified by UN absorption. and deposited on a 1% agarose gel containing a buffer MOPS (10 micrograms per well for each condition), separated by electrophoresis under denaturing conditions (Glyoxal, DMSO and Ethidium bromide mixed with the RNA deposition buffer) for 1 hour 30 minutes at 70 volts and transferred to a membrane of
  • the expression of the pls1 gene is followed by transcriptional fusion of the promoter with reporter genes such as those coding for GFP and luciferase.
  • a 931 bp Nrwl restriction fragment comprising the open reading frame for the pls1 gene was subcloned into a vector derived from pBluescript (Stratagene) in order to facilitate the various fusions.
  • This modified vector, p ⁇ ru was obtained by replacing the entire polylinker of pBluescript with the BssH Stamm-Nrul-Bssli ⁇ l sites. Digested by the restriction enzyme Nrwl, it can receive the 931pb fragment (obtained by digestion with the restriction enzyme NruI of the plasmid pCM421-8.5 to give p421.
  • the 941 bp fragment is excised by the same restriction enzyme and reintroduced into its original context (namely between the promoter and the gene terminator, at the NruI sites).
  • the use of p421 has made it possible to introduce reporter genes downstream of the pls1 promoter.
  • Two restriction sites were added by PCR at the open reading frame of the gene.
  • An Ncol site at the level of the initiator codon (ATG) and an Xbal site at the STOP level make it possible both to remove the open reading frame of the gene by digestion of p421 (modified by PCR) with the two enzymes and to replace it by reporter genes.
  • the NruI fragment of the shuttle vector p421 comprising the various promoter 421 / reporter gene fusions is reintroduced into its original context, namely the subclone pCM421-8.5.
  • This step is again carried out by means of the ⁇ ruI restriction sites present on both sides of the open reading frame of the pls1 gene in p421 and in pCM421-8.5.
  • This vector is then used for the transformation of the PI.2 strain of Magnaporthe grisea.
  • the transformants obtained make it possible to follow the expression of the pls1 gene either by observation under a fluorescence microscope of the different stages of development (GFP), or by measuring the luciferase activity in crude protein extracts produced at the different stages.
  • GFP or Flag were fused either the ⁇ -terminus or the C-terminus of the Pls1 protein.
  • the p421 served as a template for PCR amplifications making it possible to introduce an Ncol site and an Xbal site either at the level of the initiator codon or at the level of the stop of the pls1 gene.
  • the plasrnides obtained are transformed into the strain PI.2 or the mutant ⁇ 421 of Magnaporthe grisea.
  • the purified transformants then make it possible to visualize the cellular localization of the Pls1 protein either by observation under a fluorescence microscope or by immunolocation using anti-flag M2 antibodies (Sigma).
  • the localization of the Plsl protein can in particular be studied in the appressorium by using as observation material germinated spores on artificial support (teflon, cellophane ...) which allow appressorial differentiation.
  • nucleic acid fragment comprising the promoter plsl associated with the coding sequences of the gene 421 (plsl) and of the antigenic octapeptide FLAG (Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys) allows the localization of the protein Plsl.
  • a recombinant strain comprising the above gene is used allowing the localization of the protein 421 after purification of the various cell membranes, then differential extractions of the membrane proteins by conventional biochemical methods (in particular Bordier. 1981. J. Biol. Chem. 256: 1604-1607 as well as Seigneurin-Berny et al. 1999. Plant J.
  • nucleic acid fragment comprising the promoter pis 1 associated with the coding sequences of the plsl gene and of the octapeptide FLAG allows the characterization of the proteins of the membrane complexes to which the Plsl protein would belong.
  • a recombinant strain comprising the above gene is used allowing the identification, after immunoprecipitation by the anti-FLAG M2 monoclonal antibody (Sigma) conjugated to the protein A-agarose (or sepharose), of the various components of the membrane complexes comprising the Plsl protein.
  • the characterization of the proteins of this complex will be carried out as was done during the study of animal tetraspanins (Horvath et al. 1998. J. Biol. Chem. 273: 30537-30543).

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Abstract

La présente invention concerne de nouveaux polynucléotides du gène pls1 du champignon pathogène du riz Magnaporthe grisea codant pour une protéine Pls1 dont la présence et l'intégrité sont indispensables à la pathogénie de ce champignon vis-à-vis du riz et de l'orge. Elle concerne également le promoteur de ce gène et la protéine Pls1 ainsi que leurs utilisations pour la recherche de nouvelles molécules fongicides. Elle concerne enfin les composés inhibiteurs de la pathogénie des champignons liée à l'expression du gène pls1.

Description

Gène plsl (ou gène 421) du champignon pathogène du riz Magnaporthe grisea indispensable à la pathogénie du champignon
La présente invention concerne un nouveau gène plsl (ou gène 421) indispensable à la pathogénie du champignon. L'invention a pour objet des polynucléoti des /?/,_•/, des polypetides Plsl, des organismes hôtes exprimant un polypeptide Plsl et leurs utilisations pour l'identification de nouvelles molécules antifongiques.
Le principe d'employer des gènes de champignons pathogènes, entièrement ou en partie, dans des tests pour identifier de nouvelles molécules actives contre ces champignons est connu en soi (in Antifungal Agents: Discovery and Mode of Action. Dixon GK, Coppong LG and Hollomon D W eds, BIOS Scientific publisher Ldt, Oxford, UK). Dans ce but. la connaissance du génome d'un champignon pathogène donné constitue une étape importante pour la réalisation de tels tests. Toutefois, la simple connaissance d'un gène donné n'est pas suffisante pour atteindre cet objectif, encore faut-il que le gène choisi comme cible de molécules fongicides potentielles soit essentiel à la vie du champignon, son inhibition par la molécule fongicide entraînant la mort du champignon, ou essentiel à la pathogénie du champignon, son inhibition n'étant pas létale pour le champignon mais inhibant simplement son pouvoir pathogène. Cette deuxième catégorie de gènes cibles potentielles de molécules fongicides est particulièrement importante pour le développement d'une nouvelle génération de produits fongicides plus respectueux de l'environnement, s 'attaquant de manière spécifique au seul pouvoir pathogène des champignons pathogènes. L'identification des gènes indispensables à la pathogénie du champignon est donc nécessaire au développement de nouveaux produits fongicides. La présente invention concerne l'identification et le clonage d'un nouveau gène indispensable à la pathogénie du champignon intitulé gène 421 ou gène plsl (punchless 1) codant pour un polypeptide Plsl . Un mutant pis de Magnaporthe grisea, dans lequel le gène est inactivé, n'est plus pathogène pour le riz et l'orge. L'expression du gène plsl est donc indispensable à la pathogénie du champignon. L'invention concerne également l'utilisation du gène plsl et du polypeptide Plsl pour identifier de nouvelles molécules antifongiques. Description de la liste de séquences
SEQ ID No.l : Gène plsl ou gène 421 de Magnaporthe grisea.
SEQ ID No. 2: Promoteur du gène plsl de Magnaporthe grisea. SEQID No. 3: ADNc du gène plsl de Magnaporthe grisea.
SEQ ID No. 4: Exons et introns du gène plsl de Magnaporthe grisea.
SEQ ID No. 5: Cadre ouvert de lecture du gène plsl de Magnaporthe grisea.
SEQ ID No. 6: Polypeptide Plsl de Magnaporthe grisea.
SEQ ID No. 7: ADN génomique du gène plsl de P. higginsii. SEQ ID No.8: ADNc partiel du gène plsl de P. higginsii.
SEQ ID No. 9: Fragment du polypeptide Plsl de P. higginsii.
SEQ ID No. 10: ADN génomique du gène plsl de Ncrassa.
SEQ ID No. 11 : ADNc partiel du gène plsl de Ncrassa.
SEQ ID No. 12: Fragment du polypeptide Plsl de Ncrassa. SEQ ID No. 13 : ADNc partiel du gène plsl de Botrytis.
SEQ ID No. 14: Fragment du polypeptide Plsl de Botrytis.
SEQ ID No. 15 - 24 : Amorces pour PCR.
Description de l'invention Polynucléotides
La présente invention concerne des polynucléotides comprenant un gène plsl de champignon. Le gène plsl peut être isolé chez les champignons phytopathogènes comme par exemple Botrytis cinerea. Mycosphaerella graminicola, Stagnospora nodorum, Blumeria graminis, Colleotrichum lindemuthianum, Puccinia graminis, Leptosphaeria maculons, Fusarium oxysporum, Fusarium graminearum et Venturia inaequalis. De manière avantageuse, le gène plsl est isolé chez les champignons phytopathogènes du genre Magnaporthe. De préférence, les polynucléotides de l'invention comprennent un gène plsl de Magnaporthe grisea. Préférentiellement, les polynucléotides de la présente invention comprennent la séquence codante d'un gène plsl de Magnaporthe grisea. Le terme "polynucléotides plsl" désigne l'ensemble des polynucléotides de la présente invention, de préférence, les polynucléotides de la séquence génomique de plsl, les polynucléotides de la séquence de l'ADNc de plsl, ainsi que les polynucléotides codant pour les polypeptides Plsl de la présente invention. Le terme "polynucléotides plsl" désigne également des polynucléotides recombinants comprenant les dits polynucléotides.
Selon la présente invention, on entend par "polynucléotide " une chaine nucléotidique simple brin ou son complémentaire ou une chaine nucléotidique double brin pouvant être de type ADN ou ARN. De préférence, les polynucléotides de l'invention sont de type ADN, notamment d'ADN double brin. Le terme "polynucléotide" désigne également les oligonucléotides et les polynucléotides modifiés.
Les polynucléotides de la présente invention sont isolés ou purifiés de leur environnement naturel. De préférence, les polynucléotides de la présente invention peuvent être préparés par les techniques classiques de biologie moléculaire telles que décrites par Sambrook et al. (voir Sambrook et al., Molecular Cloning : A Labratory
Manual, 1989) ou par synthèse biochimique.
L'invention concerne des polynucléotides comprenant la séquence génomique du gène plsl de Magnaporthe grisea de la SEQ ID No.l et de la Seq ID No. 4. Cette séquence génomique comprend 3 exons (positions 2363-2764, 2861-3025 et 3104-3214 de la SEQ ID NO. 1), 2 introns (positions 2765-2860 et 3026-3104 de la SEQ ID NO.l) et des séquences régulatrices en 5' et en 3'.
Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, les polynucléotides de la séquence génomique de plsl comprennent un polynucléotide choisi parmi les polynucléotides suivants: a) le polynucléotide de la SEQ ID NO.1 , b) un polynucléotide comprenant au moins un exon de la SEQ ID NO.1 ; c) un polynucléotide comprenant une combinaison d'exons de la SEQ ID NO.1. La présente invention concerne également un polynucléotide comprenant une séquence régulatrice en 5' ou en 3' du gène plsl de Magnaporthe grisea. Dans un premier mode de réalisation, l'invention concerne un polynucléotide comprennent le promoteur du gène plsl de Magnaporthe grisea dont la séquence est comprise entre la position 1 et la position 1636 de la SEQ ID NO. 1. La séquence du promoteur du gène plsl est également représentée par la SEQ ID No. 2. Dans un autre mode de réalisation, l'invention concerne un polynucléotide comprenant un fragment biologiquement actif du promoteur du gène plsl de Magnaporthe grisea de la SEQ ID NO. 2.
Par "fragment biologiquement actif on entend ci-dessus un polynucléotide ayant une activité promotrice et plus particulièrement une activité promotrice dans les champignons. Les techniques permettant d'évaluer l'activité promotrice d'un polynucléotide sont bien connues de l'homme du métier. Ces techniques impliquent classiquement l'utilisation d'un vecteur d'expression comprenant dans le sens de la transcription le polynucléotide à tester et un gène rapporteur (voir Sambrook et al., Molecular Cloning : A Labratory Manual,
5 1989).
L'invention concerne aussi des polynucléotides comprenant l'ADNc de plsl de
Magnaporthe grisea de la SEQ ID NO. 3. L'ADNc du gène plsl de Magnaporthe grisea comporte la séquence codante du gène plsl ainsi qu' une séquence régulatrice 5' UTR et une séquence régulatrice 3' UTR. L'invention concerne plus particulièrement des 0 polynucléotides comprenant la séquence codante du gène plsl de Magnaporthe grisea de la
SEQ ID No. 5.
L'invention s'étend également aux polynucléotides comprenant un polynucléotide choisi parmi les polynucléotides suivants: a) le polynucléotide de la SEQ ID NO. 1 ; 5 b) le polynucléotide de la SEQ ID NO. 2; c) le polynucléotide de la SEQ ID NO. 3; d) le polynucléotide de la SEQ ID NO. 4; e) le polynucléotide de la SEQ ID NO. 5; f) un polynucléotide homologue à un polynucléotide tel que défini en a), b), c), d) ou e); 0 g) un polynucléotide capable de s'hybrider de manière sélective à un polynucléotide tel que défini en a), b), c), d) ou e). Par " homologue " on entend selon l'invention un polynucléotide présentant une ou plusieurs modifications de séquence par rapport à la séquence de référence. Ces modifications peuvent être des délétions, des additions ou des substitutions d'un ou 5 plusieurs nucléotides de la séquence de référence. De manière avantageuse, le pourcentage d'homologie sera d'au moins 70 %, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% et de préférence d'au moins 98% et plus préférentiellement d'au moins 99% par rapport à la séquence de référence. Les méthodes de mesure et d'identification des homologies entre les séquences d'acides nucléiques sont bien connues de l'homme du métier. On peut employer par 0 exemple les programmes PILEUP ou BLAST (notamment Altschul et al., J.Mol.Evol. 36:290-300, 1993; Altschul et al., J.Mol.Biol. 215 :403-10, 1990). De préférence on utilisera les paramètres par défaut. L'invention concerne donc des polynucléotides comprenant des polynucléotides présentant au moins 70 %, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% et de préférence au moins 98% et plus préférentiellement au moins 99% d'homologie avec un polynucléotide des SEQ ID No. 1-5, 7, 8, 10, 11 oui 3. De préférence l'invention concerne un polynucléotide comprenant un polynucléotide d'au moins 50, 100, 200, 300,
400, 500, 1000 nucléotides présentant au moins 70 %, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% et de préférence au moins 98% et plus préférentiellement au moins 99% d'homologie avec un polynucléotide de SEQID NO. 1-5, 7, 8, 10, 11 oui 3 . De préférence, les polynucléotides homologues à un polynucléotide de référence conservent la fonction de la séquence de référence.
Par " séquence capable de s'hybrider de manière sélective ", on entend selon l'invention les séquences qui s'hybrident avec la séquence de référence à un niveau supérieur au bruit de fond de manière significative. Le niveau du signal généré par l'interaction entre la séquence capable de s'hybrider de manière sélective et les séquences de référence est généralement 10 fois, de préférence 100 fois plus intense que celui de l'interaction des autres séquences d'ADN générant le bruit de fond. Les conditions d'hybridation stringentes permettant une hybridation sélective sont bien connues de l'homme du métier. En général la température d'hybridation et de lavage est inférieure d'au moins 5°C au Tm de la séquence de référence à un pH donné et pour une force ionique donnée. Typiquement la température d'hybridation est d'au moins 30°C pour un polynucléotide de 15 à 50 nucléotides et d'au moins 60°C pour un polynucléotide de plus de 50 nucléotides. A titre d'exemple, l'hybridation est réalisée dans le tampon suivant: 6X SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA, 0.02% PVP, 0.02% Ficoll, 0.02% BSA, 500 μg/ml denatured salmon sperm DNA. Les lavages sont par exemple réalisés successivement à faible stringence dans un tampon 2X SSC, 0,1%SDS, à moyenne stringence dans un tampon 0,5X SSC, 01%SDS et à forte stringence dans un tampon 0,1X SSC, 0,1%SDS. L'hybridation peut bien entendu être effectuée selon d'autres méthodes usuelles bien connues de l'homme du métier (voir notamment Sambrook et al., Molecular Cloning : A Labratory Manual, 1989). L'invention concerne donc des polynucléotides comprenant un polynucléotide capable de s'hybrider de manière sélective avec un polynucléotide des SEQ ID No. 1-5, 7, 8, 10, 1 1 ou 13. De préférence, l'invention concerne un polynucléotide comprenant un polynucléotide d'au moins 50, 100, 200, 300, 400, 500, 1000 nucléotides capable de s'hybrider de manière sélective avec un polynucléotide des SEQ ID No. 1-5, 7, 8, 10, 11 ou 13. De préférence, les polynucléotides s'hybridant de manière sélective à un polynucléotide de référence conservent la fonction de la séquence de référence.
De préférence, les polynucléotides de la présente invention conservent la fonction du gène plsl de Magnaporthe grisea et codent pour une tétraspanine indispensable à la pathogénie du champignon. Le gène plsl contrôle différentes fonctions biologiques de l'appressorium comme la différenciation de l'aiguille d'infection. Le gène plsl code pour un polypeptide de la famille des tetraspanines. Ces protéines membranaires font partie de complexes membranaires jouant un rôle dans la signalisation cellulaire contrôlant le mouvement des cellules animales. Les tetraspanines sont impliquées dans la réorganisation du cytosquellette et notamment du réseau d'actine et dans la signalisation cellulaire par les PKC-phosphoinositides.
Préférentiellement, les polynucléotides de la présente invention complémentent un mutant plsl de Magnaporthe grisea et restaurent sa pathogenicité pour le riz et l'orge. Un mutant plsl selon l'invention est un mutant de Magnaporthe grisea dans lequel le gène plsl de la SEQ ID No. 1 est inactivé par des techniques bien connues de l'homme du métier. La présente invention concerne également des variants allèliques du gène plsl de Magnaporthe grisea.
La présente invention concerne également l'identification et le clonage de gènes homologues au gène plsl de Magnaporthe grisea chez d'autres champignons phytopathogènes. De préférence, ces gènes homologues sont susceptibles d'être isolés ou clones à partir d'un champignon phytopathogène choisi parmi Botrytis cinerea, Mycosphaerella graminicola, Stagnospora nodorum, Blumeria graminis, Colleotrichum lindemuthianum, Puccinia graminis, Leptosphaeria maculons, Fusarium oxysporum, Fusarium graminearum et Venturia inaequalis . L'invention a ainsi pour objet l'utilisation d'un polynucléotide ou d'un fragment d'un polynucléotide de la SEQ ID NO. 1 selon l'invention pour l'identification de gènes homologues dans d'autres champignons phytopathogènes. Les techniques permettant le clonage de gènes plsl homologues chez d'autres champignons phytopathogènes sont bien connues de l'homme du métier. Le clonage s'effectue par exemple par criblage de banques d'ADNc ou de banques d'ADN génomique avec un polynucléotide ou un fragment d'un polynucléotide de la SEQ ID NO.1. Ces banques peuvent également être criblées par PCR à l'aide d'oligonucléotides spécifiques ou dégénérés dérivés de la SEQ ID No.l ou de la SEQ ID No. 3. On utilisera par exemple les amorces PCR des SEQ ID Nos. 17-22. Les techniques de construction et de criblage de ces banques sont bien connues de l'homme du métier (voir notamment
Sambrook et al., Molecular Cloning : A Labratory Manual, 1989). Des gènes plsl de champignon phytopathogène peuvent également être identifiés dans les bases de données par BLAST nucléotidique ou protéique à l'aide des SEQ ID NO. 1-6. De préférence, les gènes clones conservent la fonction du gène plsl de Magnaporthe grisea et codent pour un polypeptide de la famille des tetraspanines essentiel à la pathogénie du champignon. Les séquences des gènes clonées peuvent être analysées selon des méthodes connues afin d'établir qu'ils codent pour un polypeptide de la famille des tetraspanines. Par ailleurs, les techniques permettant d'établir qu'un gène connu est essentiel à la pathogénie d'un champignon sont connues de l'homme du métier. Par exemple, le gène étudié est inactivé dans le champignon par des techniques classiques de biologie moléculaire, on citera notamment le remplacement du gène par un gène marqueur par recombinaison homlogue. La réduction de la pathogénie du champignon comportant le gène inactivé est analysée par des tests phénotypiques. D'autres techniques bien connues de l'homme du métier peuvent être utilisées afin d'établir que les polynucléotides de l'invention conservent la fonction du gène plsl de Magnaporthe grisea. On citera notamment la complémentation de mutants pis 1 suivis de tests de restauration de la pathogénie du champignon.
La distribution du gène plsl au sein de l'espèce M. grisea a été analysée par hybridation. L'ADN génomique de cinq isolats pathogènes du riz de différentes régions du monde (Mali, Cameroun, Brésil, Japon, Chine), ainsi que celui de six isolats provenant d'autres plantes hôtes que le riz (blé, éleusine, mil, gingembre, Cyperus) a été hybridée avec une sonde correspondant à la phase codante du gène plsl en conditions d 'hybridation hétérologue (55°C, 2 SSC). Un signal d'hybridation correspondant à un gène en copie unique a été détecté chez tous les isolats analysés, dont celui d'une espèce apparentée à M. grisea (PH54, Pyricularia higginsii) pathogène des Cypéracées. Ce résultat montre que le gène plsl est fortement conservé au sein de l'espèce Magnaporthe grisea.
Une recherche dans les bases de données d'EST fongiques du domaine public a également été effectuée. Deux séquences homologues du gène plsl ont été détectées chez Botrytis cinerea qui ont de fortes identités de séquence au niveau nucléotidique (50%) et protéique (50%) (W0AA019ZD10C1 et W0AAO63ZD05C1, Base de donnée du Génoscope, Evry, France; correspondants au numéros Genbank A1114936.1-CSS01COW et AL113969.1-CNS01BA). L'utilisation d'amorces PCR dégénérées a également permis de cloner des homologues du gène plsl chez d'autres champignons phytopathogènes (voir exemple 3). Les séquences nucléotidiques et protéiques de gènes homologues au gène plsl de Magnaporthe grisea ont été clones et sont représentés par les SEQ ID Nos 7-14. La présente invention concerne également un polynucléotide comprenant un polynucléotide antisens de la séquence codante du gène plsl. Par séquence antisens on entend selon l'invention une séquence codant pour une séquence antisens totale ou partielle de la séquence codante du polypeptide Plsl.
L'expression de cette séquence dans un champignon, et en particulier Magnaporthe grisea permet d'inhiber l'expression du polypeptide Plsl et la pathogénicité du champignon. Les techniques d'inhibition de l'expression d'une protéine par un antisens sont bien connues de l'homme du métier et largement décrites dans la littérature, notamment Judelson et al. (1993, Gène 133:63-69) ainsi que Prokish et al. (1997, Mol. Gen. Genêt. 256: 104-114). L'invention a également pour objet des polynucléotides comprenant un polynucléotide codant pour un polypeptide choisi parmi les polypeptides suivants: a) le polypeptide de la SEQ ID No. 6; b) un polypeptide homologue à un polypeptide de la SEQ ID No. 6; c) un fragment biologiquement actif d'un polypeptide tel que défini en a) ou b).
Polypeptides
La présente invention concerne également des polypeptides Plsl de champignon phytopathogène et plus particulièrement de Magnaporthe grisea. Le terme "polypeptides Plsl " désigne l'ensemble des polypeptides de la présente invention ainsi que les polypeptides pour lesquels codent les polynucléotides de la présente invention. Le terme "polypeptides Plsl " désigne également des protéines de fusion, des protéines recombinantes ou des protéines chimères comprenant ces polypeptides. Dans la présente description le terme "polypeptide" désigne également des protéines et des peptides ainsi que des polypeptides modifiés. Les polypeptides de l'invention sont isolés ou purifiés de leur environnement naturel.
Les polypeptides peuvent être préparés au moyen de différents procédés. Ces procédés sont notamment la purification à partir de sources naturelles telles que des cellules exprimant naturellement ces polypeptides, la production de polypeptides recombinants par des cellules hôtes appropriées et leur purification ultérieure, la production par synthèse chimique ou, enfin, une combinaison de ces différentes approches. Ces différents procédés de production sont bien connus de l'homme du métier. Ainsi, les polypeptides Plsl de la présente invention peuvent être isolés à partir de champignons exprimant des polypeptides Plsl . De préférence, les polypeptides Plsl de la présente invention sont isolés à partir d'organisme hôtes recombinants exprimant un polypeptide Plsl hétérologue. Ces organismes sont préférentiellement choisis parmi les bactéries, les levures, les champignons, les cellules animales ou d'insectes.
La présente invention a pour objet un polypeptide comprenant un polypeptide Plsl de Magnaporthe grisea de la SEQ ID No. 6. L'invention concerne également des polypeptides comprenant un fragment biologiquement actif ou un homologue du polypeptide Plsl de la SEQ ID No. 6
Le terme "fragment" d'un polypeptide désigne un polypeptide comprenant une partie mais pas la totalité du polypeptide dont il est dérivé. L'invention concerne un polypeptide comprenant un fragment d'au moins 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 100, 200 acides aminés d'un polypeptide de la SEQ ID No. 6.
Le terme "fragment biologiquement actif désigne un fragment d'un polypeptide conservant la fontion du polypeptide dont il est dérivé. Les fragments biologiquement actifs du polypeptide de la SEQ ID No. 6 conservent ainsi la fonction du polypeptide Plsl de Magnaporthe grisea. Ces fragments biologiquement actifs ont donc une activité de tetraspanines de champignon. Préférentiellement, cette activité est essentielle à la pathogénie du champignon.
Le terme "homologue" désigne un polypeptide pouvant présenter une délétion, une addition ou une substitution d'au moins un acide aminé. L'invention a pour objet un polypeptide présentant au moins 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% et préférentiellement au moins 99% d'homologie avec un polypeptide de la SEQ ID No. 6. Les méthodes de mesure et d'identification des homologies entre polypeptides ou protéines sont connues de l'homme du métier. On peut employer par exemple le « package » UWGCG et le programme BESTFITT pour calculer les homologies (Devereux et al., Nucleic Acid Res. 12, 387-395, 1984). De préférence, on utilise les paramètres par défaut.
De préférence, ces polypeptides homologues conservent la même activité biologique que le polypeptide Plsl de Magnaporthe grisea de la SEQ ID No.6. Préférentiellement, ces polypeptides ont donc une activité de tétraspanine de champignon et contrôlent différentes fonctions biologiques de l'appressorium comme la différenciation de l'aiguille d'infection. Préférentiellement, cette activité est essentielle à la pathogénie du champignon. Dans un mode de réalisation préféré, ces polypeptides homologues sont suceptibles d'être isolés à partir de champignons phytopathogènes. L'invention a également pour objet un polypeptide de fusion comprenant un polypeptide Plsl tel que décrit ci-dessus fusionné à un polypeptide rapporteur. Le polypeptide rapporteur permet la détection rapide de l'expression d'un polypeptide Plsl dans un champignon ou dans un autre organisme hôte. Parmi les polypeptides pouvant ainsi être fusionés avec un polypeptide Plsl on citera notamment la GFP (green fluorescent protein) et la protéine GUS (β-glucuronidase).
Cassettes d'expression, vecteurs et organismes hôtes
Le gène plsl peut être exprimé dans différents organismes hôtes tels que les bactéries, les levures, les champignons, les cellules animales ou d'insectes. Le gène plsl peut être exprimé dans un organisme hôte sous le contrôle du promoteur pis 1 de la présente invention ou sous le contrôle d'un promoteur hétérologue. Cassettes d'expression
Selon un mode de réalisation de l'invention, un polynucléotide codant pour un polypeptide Plsl est inséré dans une cassette d'expression en utilisant des techniques de clonage bien connues de l'homme du métier. Cette cassette d'expression comprend les éléments nécessaires à la transcription et à la traduction des séquences codant pour le polypeptide Plsl . Avantageusement, cette cassette d'expression comprend à la fois des éléments permettant de faire produire un polypeptide Plsl par une cellule hôte et des éléments nécessaires à la régulation de cette expression. Dans un premier mode de réalisation, les cassettes d'expression selon l'invention comprennent, dans le sens de la transcription, un promoteur fonctionnel dans un organisme hôte, le gène plsl ou la séquence codante du gène plsl et une séquence terminatrice dans ledit organisme hôte.
Préférentiellement, la cassette d'expression comprend, dans le sens de la transcription, un promoteur fonctionnel dans un organisme hôte, un polynucléotide choisi parmi les polynucléotides suivants: a) un polynucléotides codant pour le polypeptide Plsl de la SEQ ID No. 6 ou pour un fragment biologiquement actif du polypeptide Plsl de la SEQ ID No. 6; b) un polynucléotide de la SEQ ID No. 1 ; c) un polynucléotide de la SEQ ID No. 3; d) un polynucléotide de la SEQ ID NO. 4; e) un polynucléotide de la SEQ ID NO. 5; f) un polynucléotide homologue à un polynucléotide tel que défini en b), c), d) ou e); g) un polynucléotide capable de s'hybrider de manière spécifique à un polynucléotide tel que défini en b), c), d) ou e); et une séquence terminatrice dans ledit organisme hôte.
Dans un autre mode de réalisation préféré de l'invention, la cassette d'expression comprend, dans le sens de la transcription, un promoteur fonctionnel dans un organisme hôte, un polynucléotide choisi parmi les polynucléotides suivants: a) un polynucléotides codant pour le polypeptide comprenant un polypeptide Plsl de la SEQ ID No. 6 ou pour un fragment biologiquement actif du polypeptide Plsl de la SEQ ID No. 6; h) un polynucléotide codant pour un polypeptide comprenant un plypeptide homologue au polypeptide Plsl de la SEQ ID No. 6; i) un polynucléotide codant pour un polypeptide comprenant un polypeptide Plsl fusionné à un polypeptide rapporteur; et une séquence terminatrice dans ledit organisme hôte.
Tout type de séquence promotrice peut être utilisée dans les cassettes d'expression selon l'invention. Le choix du promoteur dépendra notamment de l'organisme hôte choisi pour l'expression du gène d'intérêt. Certains promoteurs permettent une expression constitutive alors que d'autres promoteurs sont au contraire inductibles. Parmi les promoteurs fonctionnels dans les champignons, on citera notamment celui de glyceraldehyde-3 -phosphate deshydrogenase d Aspergillus nidulans (Roberts et al., Current Genêt. 15:177-180, 1989). Parmi les promoteurs fonctionnels dans les bactéries, on citera notamment celui de la RNA polymérase du bacteriophage T7 (Studier et al., Methods in enzymology 185:60-89, 1990). Parmi les promoteurs fonctionnels dans les levures, on citera notamment celui du gène Gall (Elledge et al., Proc Natl Acad Sciences, USA. 88:1731-1735, 1991) ou les promoteurs GAL4 et ADH de S.cerevisiae. Parmi les promoteurs fonctionnels dans les cellules d'insectes, on citera notamment le promoteur de la polyhédrine de baculovirus AcMNPN (Weyer et al., J.Gene.Nirol. 72:2967-2974, 1991). Parmi les promoteurs fonctionnels dans les cellules animales on citera le promoteur de la metallothionein et les promoteurs de virus et d'adénovirus. Tous ces promoteurs sont décrits dans la littérature et bien connus de l'homme du métier.
Le promoteur du gène plsl de Magnaporthe grisea peut être utilisé pour exprimer un gène hétérologue dans un organisme hôte et notamment dans les champignons. L'invention a donc également pour objet des cassettes d'expression comprenant le promoteur d'un gène plsl associé de manière fonctionnelle à une séquence codant pour une protéine hétérologue, permettant l'expression de ladite protéine dans les champignons.
De préférence, la cassette d'expression selon l'invention comprend, dans le sens de la transcription, un polynucléotide de la SEQ ID NO. 2 ou un fragment biologiquement actif du polynucléotide de la SEQ ID NO. 2, une séquence codant pour un polypeptide hétérologue et une séquence terminatrice fonctionnelle dans champignons.
Par séquence codant pour un polypeptide hétérologue on entend selon l'invention une séquence codant pour un polypeptide différent du polypeptide Plsl. Tout gène d'intérêt peut être exprimé dans un organisme hôte sous le contrôle d'un promoteur pis 1. De préférence, le promoteur plsl est utilisé pour l'expression d'un gène hétérologue dans les champignons. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, le promoteur plsl est associé de manière fonctionnelle à la séquence codante d'un gène rapporteur. L'activité du promoteur plsl dans différentes conditions peut ainsi être évalué à l'aide d'un gène rapporteur tel que les gènes rapporteurs GUS (β-glucuronidase), GFP (green fluorescent protein), LUC (luciferase), CAT (chloramphenicol transferase) ou β-galactosidase (lacZ). Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, le promoteur plsl est associé de manière fonctionnelle à la séquence codante d'un gène marqueur. L'expression du gène marqueur permet la sélection des organismes transformés par leur résistance aux antibiotiques ou aux herbicides par exemple. On citera notamment les séquences codantes pour un gène de tolérance à un antibiotique ou un herbicide, comme les gènes de résistance à l'hygromycine (hph : Punt et al., 1987), à la phléomycine (ble : Drocourt, 1990) ou à l'herbicide bialaphos (Bar : Pall et Brunelli, 1993).
Dans un autre mode de réalisation, la cassette d'expression selon l'invention comprend dans le sens de la transcription, un promoteur fonctionnel dans un champignon, en particulier Magnaporthe grisea, la séquence antisens de la séquence codante du gène plsl et une séquence terminatrice fonctionnelle dans ledit champignon.
Les cassettes d'expression, selon la présente invention, peuvent en outre inclure toute autre séquence nécessaire à l'expression du gène plsl ou d'un gène hétérologue, comme par exemple des éléments de régulation ou des séquences signal permettant l'adressage du polypeptide Plsl. On peut notamment utiliser toute séquence de régulation permettant d'augmenter le niveau d'expression de la séquence codante insérée dans ladite cassette d'expression. Selon l'invention, on peut notamment utiliser, en association avec la séquence de régulation promotrice, d'autres séquences de régulation, qui sont situées entre le promoteur et la séquence codante, telles que des activateurs de transcription
("enhancer"). Comme signal d'adressage membranaire dans les organismes hôtes on citera notamment celui de la protéine A chez les bactéries (Nilsson et al., Methods in
Enzymology 198:3, 1991). Une grande variété de séquences terminatrices sont utilisables dans les cassettes d'expression selon l'invention, ces séquences permettent la terminaison de la transcription et la polyadénylation de l'ARNm. Toute séquence terminatrice fonctionnelle dans l'organisme hôte sélectionné peut être utilisée.
La présente invention a également pour objet un polynucléotide comprenant une cassette d'expression selon l'invention, avantageusement les cassettes d'expression selon la présente invention sont insérées dans un vecteur. Vecteurs
La présente invention concerne donc également des vecteurs de réplication ou d'expression pour la transformation d'un organisme hôte comprenant au moins un polynucléotide plsl ou une cassette d'expression selon la présente invention. Ce vecteur peut notamment être constitué par un plasmide, un cosmide, un bactériophage ou un virus dans lequel est inséré un polynucléotide plsl ou une cassette d'expression selon l'invention. Les techniques de construction de ces vecteurs et d'insertion d'un polynucléotide de l'invention dans ces vecteurs sont bien connues de l'homme du métier. De manière générale, tout vecteur capable de se maintenir, de s'autorépliquer ou de se propager dans une cellule hôte et notamment afin d'induire l'expression d'un polynucléotide ou d'un polypeptide peut être utilisé. Avantageusement, les vecteurs selon l'invention comprennent au moins une origine de réplication pour leur réplication dans un organisme hôte. De manière préférée, les vecteurs de l'invention comprennent également au moins un marqueur de sélection tel qu'un gène de résistance à un antibiotique. On citera notamment des vecteurs tels que pBluescript (Stratagene, La Jolla, Ca), pTrcHis (Invitrogen, La Jolla, Ca) et des des vecteurs d'expression dérivés de baculovirus tels que ceux dérivés du virus de la polyhédrine d'Autographica californica (AcMNPV). Un système préfère combinant un baculovirus et une cellule d'insecte est le système baculovirus pVl 11392/ cellules Sf21
(Invitrogen, la Jolla, Ca). Pour l'expression dans les cellules animales on utilise notamment des vecteurs dérivés d'adénovirus. L'homme du métier choisira les vecteurs appropriés notamment en fonction de l'organisme hôte à transformer et en fonction de la technique de transformation mise en œuvre. Les méthodes de transformation des organismes hôtes sont bien connus de l'homme du métier (Inoue et al., Gène 96:23-28,
1990; Fincham, Microbiological Reviews 53:148-170, 1989)
Les vecteurs de la présente invention sont notamment utilisés pour transformer un organisme hôte en vue de la réplication du vecteur et/ou de l'expression d'un polypeptide Plsl dans ledit organisme hôte. L'invention concerne une méthode pour préparer un polypeptide Plsl comprenant les étapes suivantes:
- on transforme un organisme hôte avec un vecteur d'expression comprenant une cassette d'expression selon l'invention,
- on cultive l'organisme hôte transformé dans des conditions permettant l'expression du polypeptide Pis 1 ,
- on isole les polypeptides Plsl produits par l'organisme hôte.
Les polypeptides Plsl recombinants produits par un organisme hôte transformé avec un polynucléotide peuvent être purifiés ou isolés selon des méthodes connues de l'homme du métier. Les polypeptides Plsl peuvent être exprimés dans un organisme hôte sous la forme de protéines de fusion. On citera notamment les vecteurs pGEX pour l'expression de protéines de fusion comprenant la glutathione S-transférase (GST). Ces protéines de fusion sont facilement purifiées par adsorption sur des billes de glutathione-agarose. Le groupement GST peut ensuite être éliminé par digestion avec la protéase Xa. D'autres systèmes pour l'expression et la purification de protéines de fusion sont connues de l'homme du métier. On citera également les protéines de fusion comprenant un polypeptide rapporteur tel que la GFP ou la protéine GUS. L'expression de ces protéines de fusion est facilement mesurée. Organismes hôtes
La présente invention a également pour objet, un procédé de transformation d'un organisme hôte par intégration dans ledit organisme hôte d'au moins un polynucléotide plsl ou d'une cassette d'expression ou d'un vecteur selon l'invention. Le polynucléotide peut être intégré dans le génome de l'organisme hôte ou se répliquer de manière stable dans l'organisme hôte. Les méthodes de transformation des organismes hôtes sont bien connus de l'homme du métier et largement décrits dans la littérature (Inoue et al., Gène 96:23-28,
1990 ; Fincham, Microbiological Reviews 53:148-170, 1989).
La présente invention concerne également un organisme hôte transformé avec un polynucléotide plsl, une cassette d'expression ou un vecteur selon l'invention. Par organisme hôte, on entend en particulier selon l'invention tout organisme mono ou pluricellulaire, inférieur ou supérieur, en particulier choisi parmi les bactéries, les levures, les champignons, les cellules animales et les cellules d'insectes. De manière avantageuse, les bactéries sont choisies parmi Escherichia coli et Bacillus subtilis, les levures sont choisies parmi Pichia pastoris et Saccharomyces cerevisae, les cellules d'insectes sont choisis parmi Spodoptera frugiperda et Drosophila melanogaster, les cellules animales sont choisis parmi les cellules CHO, HeLa et COS.
Les techniques de construction de vecteurs, de transformation d'organismes hôtes et d'expression de polynucléotides et de polypeptides hétérologues dans ces organismes sont largement décrites dans la littérature (Ausubel F. M. et al., "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes 1 et 2, Greene Publishing Associates et Wiley -Interscience, 1989;
T.Maniatis, E.F.Fritsch, J.Sambrook, Molecular Cloning A laboratory Handbook, 1982).
La présente invention concerne également l'utilisation de polynucléotides pis 1 et de polypeptides Plsl pour l'identification des gènes impliqués dans la pathogénie des champignons ou pour l'identification de nouvelles molécules fongicides inhibitrices de la pathogénie des champignons.
Identification des gènes impliqués dans la pathogénie des champignons
Le gène plsl contrôle différentes fonctions biologiques de l'appressorium comme la différenciation de l'aiguille d'infection et une croissance dans la plante infectée. La diversité des fonctions contrôlées par le gène plsl suggère qu'il agit soit dans une voie de signalisation contrôlant l'activité d'autres gènes, soit dans un processus de différenciation dont le blocage entraine de nombreux effets secondaires. Il est par exemple possible d'identifier les gènes dont l'expression dépend du gène plsl par l'étude comparative des gènes exprimés chez un mutant de M. grisea dont l'expression de la protéine aura été inhibée, notamment au moyen d'un antisens selon l'invention défini auparavant, et la souche sauvage de M. grisea. Inhibition de la pathogénie des champignons
Des champignons dans lesquels le gène plsl est inactivé ou inhibé sont incapables de différencier l'aiguille de pénétration essentielle à l'infection. L'invention concerne des procédés pour inhiber la pathogénie des champignons en inactivant ou en inhibant l'expression du gène plsl. De préférence, les champignons sont choisis parmi Botrytis cinerea, Mycosphaerella graminicola, Stagnospora nodorum, Blumeria graminis,
Colleotrichum lindemuthianum, Puccinia graminis, Leptosphaeria maculons, Fusarium oxysporum, Fusarium graminearum et Venturia inaequalis.
De manière préférée, l'invention concerne des procédés pour inhiber la pathogénie d'un champignon, les dits procédés comprenant l'inhibition de l'expression d'un polynucléotide plsl selon l'invention dans ledit champignon, ou l'inhibition de l'expression d'un polypeptide Plsl selon l'invention dans ledit champignon ou l'inhibition de l'activité biologique d'un polypeptide Plsl selon l'invention dans ledit champignon. De préférence, cette inhibition affecte spécifiquement l'expression du gène plsl et l'activité biologique du polypeptide Plsl . L'invention ne concerne donc pas les procédés comprenant l'inhibition générale de l'expression des gènes dans le champignon. On comprendra que l'inhibition de l'expression du gène plsl peut cependant entrainer l'inhibition d'autres gènes appartenant par exemple à la même voie de signalisation ou au même complexe membranaire.
Différentes méthodes bien connues de l'homme du métier peuvent être mises en œuvre pour inhiber la pathogénie des champignons en inhibant l'expression du gène plsl dans ces champignons. Dans un mode de réalisation de l'invention, le gène plsl est inactivé par mutagenèse insertionnelle ou par recombinaison homologue (techniques de remplacement de gène ou de "knock out"). Dans un autre mode de réalisation de l'invention, l'expression d'un polypeptide Plsl est inhibé par l'expression d'un polynucléotide antisens du gène plsl dans les champignons. Dans un troisième mode de réalisation de l'invention, l'expression du gène plsl est inhibée par un composé inhibiteur.
Le niveau d'expression d'un polynucléotide plsl ou d'un polypeptide PLS 1 dans les champignons peut être mesuré selon des techniques décrites dans la littérature. On citera notamment le Northern blot, la PCR et les DNA arrays (puces à ADN) pour les polynucléotides et le Western blot pour les polypeptides. Identification de nouvelles molécules fongicides inhibitrices de la pathogénie des champignons
L'inactivation du gène plsl chez Magnaporthe grisea, champignon pathogène du riz, entraine une perte de la pathogénie de ce champignon. Par ailleurs, des gènes homologues ont pu être clones chez d'autres champignons phytopathogènes. Par conséquent, des composés inhibiteurs de l'expression du gène pis 1 ou de l'activité biologique du polypeptide Plsl dans les champignons pourraient être utilisés pour inhiber la pathogénie des champignons. L'invention concerne donc des procédés pour l'identification de composés inhibant la pathogénie des champignons comprenant une étape d'identification d'un composé inhibant spécifiquement l'expression d'un polynucléotide plsl dans ledit champignon, ou une étape d'identification d'un composé inhibant l'expression d'un polypeptide Plsl dans ledit champignon ou une étape d'identification d'un composé inhibant l'activité biologique d'un polypeptide Plsl dans ledit champignon. De préférence, les champignons sont choisis parmi Botrytis cinerea, Mycosphaerella graminicola, Stagnospora nodorum, Blumeria graminis, Colleotrichum lindemuthianum, Puccinia graminis, Leptosphaeria maculons, Fusarium oxysporum, Fusarium graminearum et Venturia inaequalis.
Les polynucléotides plsl, les polypeptides Plsl, les vecteurs et les organismes hôtes de la présente invention peuvent ainsi être utilisés dans différents tests de criblage afin d'identifier de nouveaux composés antifongiques.
Identification d'inhibiteurs se fixant sur la protéine Plsl de champignon
Des molécules inhibant directement l'activité du polypeptide Plsl pourraient inhiber la pathogénie du champignon et conduire au développement de nouveaux fongicides.
L'invention concerne donc un procédé pour l'identification de composés inhibant la pathogénie des champignons comprenant les étapes suivantes:
- mettre en contact ledit composé avec un polypeptide Plsl, et
- détecter la fixation dudit composé audit polypeptide.
Préférentiellement, le procédé comprend également une étape dans laquelle on détermine si ledit composé inhibe la pathogénie des champignons. Toute méthode permettant de préparer un polypeptide Plsl et de le purifier ou de l'isoler peut être utilisée dans les procédés de la présente invention. De préférence, le polypeptide Plsl est exprimée dans un système d'expression hétérologue ( par exemple bactérie, levure, cellule animale ou d'insecte) au moyen d'un polynucléotide pis 1 selon l'invention, la purification simplifiée du polypeptide Plsl permet ensuite d'identifier de nouvelles molécules se fixant sur la protéine Plsl. De manière préférée, la protéine Plsl est sur-exprimée dans les membranes d'une cellule d'un système d'expression hétérologue puis la purification simplifiée des membranes des organismes hôtes exprimant la protéine Plsl permet d'identifier de nouvelles molécules se fixant sur la protéine Plsl . L'identification des dites molécules se fait par des méthodes bien connues de l'homme du métier, notamment des méthodes de détection physique de la fixation des composés testés sur la protéine Plsl (système BIACORE; Karlson & al., J. of Biomolecular Interaction Analysis, spécial issue Drug Discovery : 18-22). Identification d'inhibiteurs interagissant avec les complexes membranaires contenant la protéine Plsl
Les protéines de la famille des tetraspanines auxquelles appartient la protéine Plsl, interagissent avec d'autres protéines membranaires (Maecker et al., FASEB J., 11 :428-442, 1997). La première étape consiste à identifier les protéines formant un complexe membranaire avec la protéine Plsl par des méthodes moléculaires comme la méthode du double hybride (Van Aeist et al., PNAS. 90: 6213-6217, 1993) ou le clonage des gènes de M. grisea homologues des gènes codant les protéines de ces complexes connues chez les animaux comme les intégrines (Hemler, Current Opinion in Cell Biology 10:578-585, 1988), ou des méthodes biochimiques (immuno précipitation des complexes membranaires auquel appartiendrait la protéine Plsl et caractérisation des protéines de ce complexe comme cela a été réalisé dans le cas des tetraspanines animales (Horvath et al., J. Biological Chem. 273:30537-30543, 1998). La connaissance des protéines interagissant avec la protéine Plsl permet de construire un système de détection de molécules capables d'inhiber l'interaction entre ces protéines et la protéine Plsl. De tels systèmes de détection sont bien connus de l'homme du métier, notamment le système double hybride de la levure (Van Aeist et al., PNAS. 90: 6213-6217, 1993) avec des fragments de la protéine Plsl et de celles interagissant avec Plsl, ou un système de mesure de la fixation d'une des protéines du complexe à la protéine Plsl présente dans une préparation membranaire en utilisant un couple Europium-allophycocyanine, chaque élément du dispositif de fluorescence par transfert étant greffé aux protéines testées (Mathis, Clin. Chem. 39:1953-1959, 1993). Identification d'inhibiteurs des régulateurs de l'expression du gène plsl
Des molécules inhibant l'expression du gène plsl pourraient également inhiber la pathogénie du champignon et conduire au développement de nouveaux fongicides. Dans la présente invention l'expression "inhibition de l'expression du gène plsl" désigne l'inhibition de l'expression d'un polynucléotide plsl ainsi que l'inhibition de l'expression d'un polypeptide Plsl dans les organismes hôtes et préférentiellement dans les champignons phytopathogènes. L'invention a également pour objet un procédé pour l'identification de composés inhibant la pathogénie des champignons comprenant les étapes suivantes:
- mettre en contact ledit composé avec un organisme hôte transformé avec un polynucléotide ou un vecteur selon l'invention tel que cet organisme hôte exprime un gène rapporteur sous le contrôle du promoteur du gène plsl; et - détecter l'inhibition de l'expression dudit gène rapporteur.
Préférentiellement, le procédé comprend également une étape dans laquelle on détermine si ledit composé inhibe la pathogénie des champignons.
L'utilisation d'un polynucléotide selon l'invention comprenant le promoteur pis 1 associé à la séquence codante d'un gène reporteur (GUS ou GFP par exemple) permet de mesurer l'activité promotrice du promoteur plsl dans une cellule fongique ou dans une cellule hôte. Ce procédé permet d'identifier des composés inhibant l'activité du promoteur plsl et donc l'expression du gène plsl au niveau transcriptionnel. Une souche recombinée comprenant le gène ci-dessus est ainsi utilisée pour identifier des molécules inhibant l'expression du gène plsl, ce qui se manifeste par une inhibition de l'expression de la protéine rapporteur de la souche recombinée dans les conditions d'expression du gène plsl. Ce type de test est bien connu de l'homme du métier et décrit dans la littérature, notamment Axiotis et al. (1995. pp. 1-7 in Antifungal Agents: Discovery and Mode of Action. Dixon GK, Coppong LG and Hollomon DW eds, BIOS Scientific publisher Ldt, Oxford, UK). Dans un autre mode de réalisation, l'invention concerne un procédé pour l'identification de composés inhibant la pathogénie des champignons comprenant les étapes suivantes:
- mettre en contact ledit composé avec un organisme hôte transformé avec un polynucléotide selon l'invention ou un vecteur selon l'invention, ledit organisme hôte exprimant un polypeptide Plsl; et - détecter l'inhibition de l'expression dudit polypeptide Plsl .
De préférence, le polypeptide Plsl est un polypeptide de fusion comprenant un polypeptide rapporteur tel que GUS ou GFP dont l'expression est facilement mesurée. Préférentiellement, le procédé comprend également une étape dans laquelle on détermine si ledit composé inhibe la pathogénie des champignons. Ce procédé permet d'identifier des composés inhibant l'expression du gène_σ/,sJl au niveau transcriptionnel ou au niveau traductionnel. Une souche recombinée exprimant un polypeptide Plsl et de préférence un polypeptide Plsl fusionné à un rapporteur est ainsi utilisée pour identifier des molécules inhibant l'expression du gène plsl, ce qui se manifeste par une inhibition de l'expression du polypeptide Plsl de la souche recombinée dans les conditions d'expression du gène plsl.
La présente invention concerne donc un procédé pour identifier des composés inhibant la pathogénie des champignons liée à l'expression du gène plsl, ledit procédé consistant à soumettre un composé, ou un mélange de composés, à un test approprié pour l'identification des composés inhibiteurs de ladite pathogénie des champignons et à sélectionner les composés réagissant de manière positive audit test, le cas échéant à les isoler, puis à les identifier.
De manière préférentielle, le test approprié est un test tel que défini ci-dessus. De manière préférée, un composé identifie selon ces procédés est ensuite testé pour ces propriétés anti-fongiques et pour sa capacité à inhiber la pathogénie du champignon pour les plantes selon des méthodes connues de l'homme du métier. Préférentiellement, le composé est évalué à l'aide de tests phénotypiques tels que des essais de pathogénie sur feuilles ou sur plantes entières. Par composé on entend selon l'invention tout composé chimique ou mélange de composés chimiques, y compris les peptides et les protéines.
Par mélange de composés on comprend selon l'invention au moins deux composés différents, comme par exemple les (dia)stéréoisomères d'une molécule, des mélanges d'origine naturelle issus de l'extraction de matériel biologique (plantes, tissus végétaux, culture bactériennes, cultures de levures ou de champignons, insectes, tissus animaux, etc.) ou des mélanges réactionnels non purifiés ou purifiés totalement ou en partie, ou encore des mélanges de produits issus de techniques de chimie combinatoire.
La présente invention concerne enfin de nouveaux composés inhibiteurs de la pathogénie des champignons liée à l'expression du gène plsl, notamment les composés identifiées par les procédés selon l'invention et/ou les composés dérivés des composés identifiés par les procédés selon l'invention.
De manière préférentielle, les composés inhibiteurs de la pathogénie des champignons liée à l'expression du gène plsl ne sont pas des inhibiteurs généraux d'enzymes. De manière également préférentielle, les composés selon l'invention ne sont pas des composés déjà connus pour avoir une activité fongicide et/ou une activité sur la pathogénie des champignons.
L'invention a également pour objet un procédé pour traiter des plantes contre un champignon phytopathogène caractérisé en ce qu'il comprend le traitement desdites plantes avec un composé identifié par un procédé selon l'invention.
La présente invention concerne également un procédé de préparation d'un composé inhibiteur de la pathogénie des champignons, ledit procédé comprenant les étapes d'identification d'un composé inhibant la pathogénie des champignons liée à l'expression du gène plsl par le procédé d'identification selon l'invention, puis de préparation dudit composé identifié par les méthodes usuelles de synthèse chimique, de synthèse enzymatique et/ou d'extraction de matériel biologique. L'étape de préparation du composé peut être précédée le cas échéant par une étape dite d'optimisation par laquelle on identifie un composé dérivé du composé identifié par le procédé d'identification selon l'invention, ledit composé dérivé étant ensuite préparé par les méthodes usuelles.
Les exemples ci-après permettre d'illustrer l'invention, sans toutefois chercher à en limiter la portée. Toutes les méthodes ou opérations décrites ci-dessous dans ces exemples sont données à titre d'exemples et correspondent à un choix, effectué parmi les différentes méthodes disponibles pour parvenir au même résultat. Ce choix n'a aucune incidence sur la qualité du résultat et par conséquent, toute méthode adaptée peut être utilisée par l'homme de l'art pour parvenir au même résultat. La plupart des méthodes d'ingénierie des fragments d'ADN sont décrites dans "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes 1 et 2, Ausubel F.M. et al , publiés par Greene Publishing Associates et Wiley -Interscience (1989) ou dans Molecular cloning, T.Maniatis, E.F.Fritsch, J.Sambrook (1982). Les méthodes spécifiques des champignons sont décrites dans Sweigard et al.(Fungal Genetics Newletter. 44:52-53, 1997) pour les vecteurs de transformation fongiques utilisés, dans Orbach (Gène 150:159-162, 1994) pour la construction d'une banque cosmidique, dans Sweigard et al. (Fungal Genetics Newletter. 37:4-5,1990) pour la préparation d'ADN génomiques fongiques et dans Agnan et al. (Fungal Genetics and Biology 21 :292-301, 1997).
L'homme du métier sera à même de reproduire l'invention, isoler et cloner les polynucléotides selon l'invention, totalement ou en partie, notamment le promoteur plsl ou la séquence codante de la protéine Plsl sur la base des informations et séquences contenues dans la présente demande brevet, notamment au moyen des techniques de biologie moléculaire usuelles dans le domaine technique comme la PCR (revue sur l'utilisation de ces techniques chez les champignons: Agnan et al., Fungal Genetics and Biology 21 .292-301, 1997).
Description des figures
Figure la: Profil d'hybridation de digestions d'ADN génomique du mutant psll par une sonde pAN7.1.
Figure lb: Structure de la région du génome du mutant plsl où s'est intégré le plasmide pAN7.1 ; EcoRI (Ε); Hindlll (H); Ssp I (S); BamHl (B).
Figure 2: Fragment de restriction chevauchant les extrémités plasmidique et génomique chez le mutant plsl. 421(+) et 421(-) indiquent les positions des primers utilisés pour la PCR inverse.
Figure 3: Cartographie des inserts * NotI32H7 (15 kb) et Bam HI32H7 (8,5 kb) du cosmide 32H7 clones dans le vecteur pCB1265 (résistance à la phosphinothricine).
Figure 4: Structure du gène de pathogénie inactivé chez le mutant plsl; P (Promoteur), I
(site d'insertion). Figure 5: Structure hypothétique de la protéine déduite du gène plsl. Ε (extracellulaire),
PM (membrane plasmique), DT (domaine transmembranaire), C (cystéine), D (acide aspartique), Ν (asparagine), la position des acides aminés est indiqué entre parenthèses.
(142-145) indique un site de Ν-glycosilation.
Figure 6: Comparaison des séquences protéiques déduites des gènes homologues de plsl de Magnaporthe grisea obtenu par PCR chez les champignons Ascomycètes Neurospora crassa (Ncrassa), Pyricularia higginssi (P.higginssï) et déduit de l'ADNc de Botrytis cinerea (B. cinerά) identifié dans Genbank (ALI 14936.1).
Exemples
Exemple 1 : Identification et caractérisation du gène plsKou gène 421)
La stratégie employée pour parvenir à l'identification et la caractérisation du gène plsl essentiel à la pathogénie de M. grisea a comporté deux points principaux: 1) L'inactivation d'un gène essentiel à la pathogénie par l'insertion de manière aléatoire dans sa séquence nucléotidique d'un fragment d'ADN étranger (mutagenèse insertionnelle).
2) La récupération et la caractérisation de la séquence nucléotidique fongique ainsi modifiée, puis la démonstration de son implication dans la pathogénie du champignon vis- à-vis du riz et de l'orge.
Les étapes méthodologiques à franchir successivement ont été les suivantes:
1) L'obtention d'une collection d'isolats du champignon ayant intégré de manière aléatoire un fragment d'ADN étranger dans leur génome (transformants). En l'occurence, l'ADN étranger est un plasmide comportant le gène hph d' Escherichia coli, ce qui permet leur sélection sur la base de la résistance à l'hygromycine. Il a été introduit dans le génome du champignon par transformation de protoplastes.
2) La recherche de transformants non pathogènes vis-à-vis du riz et de l'orge parmi la collection (mutants de pathogénie). Le critère retenu pour la non pathogénie d'un transformant a été l'incapacité à provoquer des lésions foliaires suite à l'inoculation de spores de ce transformant à des plants de riz et d'orge.
3) La démonstration génétique de l'inactivation d'un gène de pathogénie par le plasmide chez les mutants incapables d'infecter le riz et l'orge. Il s'agissait d'établir une liaison génétique complète entre le caractère de résistance à l'hygromycine, qui traduit la présence du plasmide dans le génome du mutant, et celui de la non pathogénie, qui traduit l'inactivation d'un gène essentiel à la capacité infectieuse du champignon. Ce degré de liaison a été évalué par l'analyse de la ségrégation des caractères de résistance à l'hygromycine et de non pathogénie chez les descendants d'un croisement entre le mutant étudié et une souche sauvage, pathogène vis-à-vis du riz et de l'orge et de signe sexuel compatible avec celui du mutant.
4) La récupération de la région génomique du champignon où s'est produite l'insertion du plasmide imitateur. Le principe a consisté à isoler un fragment d'ADN du mutant comportant à la fois des séquences plasmidiques et génomiques, repérable grâce à une expérience d'hybridation avec une sonde d'origine plasmidique. La partie génomique incluse dans ce fragment peut ensuite servir à isoler la région génomique sauvage complète selon le même principe.
5) La démonstration que la région génomique avoisinant le point d'insertion du plasmide contient le gène de pathogénie. Si le gène de pathogénie recherché se trouve dans la région génomique avoisinant le point d'insertion du plasmide, son introduction dans le génome de l'isolât mutant, à l'aide d'un vecteur plasmidique comportant un autre marqueur de sélection, doit permettre de restaurer la pathogénie par complémentation de la fonction rendue déficiente par l'insertion du premier plasmide. La preuve en est donnée si les spores d'au moins un transformant obtenu par cette expérience sont capables de provoquer autant de lésions foliaires que la souche sauvage.
6) La caractérisation de la séquence génomique du champignon à proximité du point d'insertion du plasmide. Le produit du séquençage de la région génomique avoisinante au point d'insertion du plasmide a été analysé avec des logiciels de traitement de séquences, de manière à mettre en évidence une séquence nucléotidique susceptible d'être traduite en séquence protéique (cadre de lecture ouvert). Cette recherche se fait sur la base de la recherche des signaux consensus d'initiation et de terminaison de la traduction en protéine. La preuve de l'existence d'un cadre de lecture ouvert (et donc d'un gène) dans cette région a été apportée par le clonage de l'unité transcriptionnelle correspondante, grâce au criblage d'une banque d'ADN complémentaires des ARN messagers (ADNc) avec une sonde produite à partir d'un fragment de cette région. La séquence de cet ADNc a permis de déterminer avec précision la taille et la séquence primaire de la protéine correspondante, ainsi que la position d'éventuels introns dans la séquence génomique du gène.
7) La démonstration que le cadre de lecture ouvert localisé au niveau du point d'insertion du plasmide est celui du gène de pathogénie. Elle a été faite grâce à une expérience de remplacement, qui a consisté à provoquer au moyen d'une transformation la substitution de la séquence du gène étudié par un marqueur de sélection. Elle fait intervenir, au niveau des séquences génomiques situées de par et d'autre du gène, un double événement de recombinaison homologue entre le génome de la souche sauvage et un vecteur de remplacement. Ce vecteur est constitué d'un grand fragment d'ADN de séquence homologue à celle de la région contenant le gène de pathogénie supposé, à l'exception du gène lui-même, qui a été supprimé par restriction et remplacé par le gène de résistance à l'hygromycine. Les spores des transformants résistants à l'hygromycine pour lesquels il est possible de montrer par une expérience d'hybridation qu'ils ont perdu la séquence du gène étudié et qu'ils n'ont qu'une copie du gène de résistance à l'hygromycine, sont inoculés à des plants de riz et d'orge. S'ils sont tous incapables de provoquer la moindre lésion foliaire, la séquence nucléotidique étudiée est bien celle du gène de pathogénie. Expérience 1: mutagenèse insertionnelle (fabrication du mutant)
Les conditions de culture, d'obtention des protoplastes, de transformation ainsi que de purification et de stockage des transformants de Magnaporthe grisea sont décrites par
Silué et al. (1998, Physiol. Mol. plant Pathol, 53, 239-251). La transformation a été réalisée avec 1 μg de plasmide pAN7.1 (Punt et al, 1987 Gène 78: 147-156) et 107 protoplastes de la souche P1.2 de M. grisea. Cette souche provient de la collection du laboratoire de Phytopathologie du CIRAD de Montpellier. La sélection des transformants a été réalisée par incorporation d'hygromycine dans les milieux de culture géloses, aux concentrations de 240 ppm pour le milieu de sélection primaire et de 120 ppm pour celui de sélection secondaire.
Expérience 2: criblage de la collection de transformants (isolement du mutant non pathogène plsl ou mutant 421)
A) Essais de pathogénie sur feuilles en survie
Les essais de pathogénie ont été réalisés sur deux variétés de riz, Maratelli et Sariceltick, et une variété d'orge, Express. Maratelli sont des variétés très sensibles à la pyriculariose et qui ne possèdent pas de gènes de résistance à la souche PI.2. Les variétés d'orge sont extrêmement sensibles à la pyriculariose. Le riz a été cultivé à 25°C le jour, 15°C la nuit avec une hygrométrie supérieure à 70%, l'orge en conditions froides (20- 22°C). Des fragments de feuilles (2,5 cm) de riz et d'orge ont été prélevés dans la partie médiane de la plus jeune feuille de plants âgés d'une vingtaine de jours. Ces fragments ont été déposés dans des boîtes multicompartimentées contenant de l'eau gélose à 1% additionné de 2 mg / 1 de kinétine, milieu permettant leur survie durant 14 jours. Il est important de noter que le riz développe une forte résistance physiologique à la pyriculariose durant les périodes de fortes chaleurs. Cette résistance peut être atténuée par un apport de fertilisant azoté aux plants: deux arrosages avec une solution de sulfate d'ammonium 5g / m^ à une semaine d'intervalle. Le deuxième arrosage a lieu 2 à 3 jours avant l'inoculation.
Les conditions de sporulation et de la préparation d'inoculum de spores de M. grisea sont décrites par Silué et al. (op. cit.). L'inoculation a été réalisée à l'aide d'un coton tige humide trempé dans une suspension de spores et passé sur les fragments de feuilles en survie. La quantité de spores déposée a été estimée en déposant une goutte de la suspension sur une lame de verre. Les symptômes ont été observés après 4-7 jours d'incubation à 24°C, 100 % d'hygrométrie. Chaque transformant a été testé sur quatre fragments de feuille de riz de chaque variété et quatre d'orge lors du criblage primaire. Le transformant plsl ne présentant aucun symptôme de la maladie sur riz et sur orge a été inoculé une seconde fois afin de confirmer son phénotype avec une suspension de spores de concentration ajustée à 105 spores par ml. B) Essais de pathogénie sur plantes entières
De manière à confirmer le phénotype du mutant non pathogène plsl (ou mutant 421) détecté par l'inoculation de feuilles en survie, le département de Phytopathologie du
CIRAD de Montpellier a réalisé des inoculations de plantes entières avec les spores de ce mutant. Les deux cultivars de riz sensibles à la souche PI.2, Maratelli et Sariceltick ont été semés et cultivés en serre. Trois applications d'azote ont été effectuées durant les trois premières semaines de culture (à 5, 10 et 20 jours après le semis). L'inoculation par pulvérisation d'une suspension de spores a lieu 10 à 15 jours après le dernier apport d'azote, selon le degré de maturité des plantes. La concentration en spores a été déterminée par comptage avec une cellule de Thoma et ajustée à une valeur 20000 spores/ml. Les suspensions de spores du mutant plsl et de la souche PI .2 non transformée ont été pulvérisées sur trente plantes à raison de 1 ml de suspension de spores par plante avec un aérographe. Une feuille de chacune de ces plantes a été collectée pour comptage du nombre de lésions après développement de celles-ci (5 à 7 jours). Aucune lésion typique de la maladie n'est apparue sur les plantes inoculées avec les spores du mutant plsl. Expérience 3: Analyse phénotypique des descendants d'un croisement entre le mutant plsl et la souche sauvage M4 (confirmation de l'existence de la liaison génétique entre la mutation d'un gène de pathogénie et l'insertion du plasmide conférant la résistance à l'hygromycine).
Les conditions de croisement et d'isolement des ascospores produites sont décrites par Silué et al. (op. cit.). Les cultures issues de chacune des ascospores ont été repiquées sur milieu complet avec 120 mg/1 d'hygromycine et leurs spores inoculées à des feuilles d'orge et de riz en survie. Les descendants de ce croisement étaient disponibles sous la forme de cinq tétrades (7 à 8 descendants issus d'un même asque). Les résultats de l'analyse phénotypique de ces descendants figurent dans le tableau 1 ci-dessous.
Figure imgf000028_0001
Tableau 1: Analyse phénotypique des descendants du croisement M4xMutant plsl
H: hygromycine, s: sensible à l'hygromycine, R: résistant à l'hygromycine; P: pathogénie; M: mycélium, GA: mycélium gris et aérien, rc: mycélium ras et clair.
En plus des phénotypes liés à la pathogénie et à la résistance à l'hygromycine, un troisième caractère ayant trait à la morphologie du mycélium a été clairement mis en évidence chez les descendants sous la forme de deux allèles: un allèle conférant un mycélium gris et aérien (GA, théoriquement le phénotype sauvage de morphologie mycélienne des deux souches de M. grisea utilisées, P1.2 et M4) et un allèle conférant un mycélium clair et ras (rc). Cette observation s'est révélée être très précieuse pour l'interprétation des résultats de ce croisement. En effet, si aucun descendant n'a le phénotype HygR et Path+, de nombreux descendants ont le phénotype HygS et Path-. Mais par ailleurs, ce double phénotype coségrège avec rc, alors que HygS et Path+ coségrège avec GA. Cette observation, couplée au fait que l'analyse des descendants en tétrades permet de reconstituer les génotypes des parents et des descendants, permet de mettre en évidence la ségrégation de deux gènes de pathogénie indépendants. L'un, A, est étiqueté par le plasmide (son allèle muté est lié à HygR) et l'autre, B, est lié au gène contrôlant la morphologie du mycélium (phénotypes GA et rc). Il a été possible de montrer par la suite que l'allèle muté de B provenait du parent M4 utilisé lors du croisement et qui avait dérivé lors de sa multiplication végétative. Le gène A est donc étiqueté par le plasmide pAN7.1 chez le mutant plsl . Expérience 4: Récupération de la séquence génomique de M. grisea cible de l'insertion du plasmide chez le mutant plsl.
A) Préparation d'ADN génomique de M. grisea
Le protocole d'extraction et de purification employé est celui décrit par Sweigard et 5 al. (1990 Fungal Genêt. Newsl 37:4)
B) Cartographie de la région d'insertion du plasmide chez le mutant plsl par hybridation
L'ADN génomique a été quantifié au transilluminateur UV (310 nm) en comparaison avec une gamme étalon de concentration, après électrophorèse dans un gel de
10 tampon TAE (40 mM Tris; 40 mM acétate; ImM EDTA; pH8,3) à 0,7% d'agarose et 0,2 mg/1 de bromure d'éthidium. Des aliquotes de 5 μg d'ADN ont été digérés pendant une nuit à 37°C avec les enzymes de restriction EcoRI, Sspl, Bglll, Sacl et HwdlII (Boehringer Mannheim) dans au moins 20 μl d'eau avec le tampon approprié. Les fragments de restriction obtenus ont été séparés par une électrophorèse d'une nuit, sous une tension de
15 35 V et dans un gel TAΕ à 0,7% d'agarose et 0,2 mg/1 de BΕT. Après migration, le gel d'électrophorèse est placé sur une membrane de nylon (Ηybond N+, Amersham), l'ensemble reposant sur un plateau poreux relié à une pompe à vide (réglée à 35mm d'Ηg). Le transfert des fragments d'ADN génomique sur la membrane est précédé d'un traitement du gel par une solution de 0,25 M ΗC1 (deux fois 4mn), une solution dénaturante (NaOΗ
20 0,5 M, NaCl 1,5 M; 20 mn) puis une solution neutralisante (Tris-ΗCl 0.5M, ΕDTA ImM, NaCl 1,5 M, pΗ 7,2; deux fois 4mn). Le transfert sous vide a été réalisé dans un tampon SSC 20X pendant 20 mn. La membrane a été séchée à 37°C puis enveloppée dans un film de Saran-wrap. L'ADN a été fixé de façon covalente à la membrane par une exposition de 5 mn aux UV (310 nm). Les fragments de restriction de l'ADN génomique du mutant
25 comportant des séquences plasmidiques ont ensuite été repérés par une expérience d'hybridation avec une sonde radioactive synthétisée à partir du plasmide pAN7.1. Le marquage de l'ADN plasmidique a été réalisé par la méthode d'amorçage aléatoire (random priming) conformément aux instructions du kit Megaprime (Pharmacia), avec du dCTP marqué au phosphore 32 (Amersham). La préhybridation de la membrane a été
30 effectuée dans une solution SDS 0,5%, SSC 6X (NaCl et citrate trisodique 0,9M), Denhardt's 5X (Ficoll 0,1%, polyvinylpyrolidone 0,1%, sérum d'albumine bovine fraction V 0,1%), durant 30 mn à lh à 65°C (four à hybridation Appligène). La sonde radioactive a été dénaturée par chauffage 5 mn à 95°C puis ajoutée au tampon de préhybridation. Le mélange a été placé 15 h à 65°C. La membrane a été lavée à 65°C une première fois dans un tampon SSC 2X SDS 0,1% (deux fois 30 mn), puis dans un tampon SSC 0,2x, SDS
0,1%. (lh). La membrane a été enveloppée dans un film de Saran-wrap puis placée à -80°C au contact d'un film photographique (Hyperfilm MP, Amersham) entre deux écrans amplificateurs.
Les deux bandes d'hybridation avec la sonde plasmidique obtenues par la digestion
EcoRI (figure 1) ne correspondent à aucun des fragments d'une digestion témoin du plasmide: il s'agit donc de l'insertion d'une copie unique du plasmide, avec perte du site
EcoRI situé à l'extrémité du promoteur gpdA (l'autre site, situé dans le gène de structure hph, ne pouvant être perdu car situé dans la séquence nécessaire pour la sélection du transformant). L'hybridation de la digestion Sspl donne également deux bandes, dont l'une correspond au fragment Sspl de 4 kb interne au plasmide. Les deux sites Sspl sont donc conservés et l'intégration a eu lieu dans le fragment de 2,75 kb situé entre ces deux sites (soit la région comprenant AmpR, ORI et le début du promoteur gpdA). La digestion par BgRl donne une bande unique d'hybridation de très haut poids moléculaire, témoignant de la perte de ce site. La jonction gauche de l'insertion serait donc située entre le site Bglïl et le site Sspl du promoteur gpdA. Une double digestion EcoRI-HmdlII a été réalisé (non présentée dans la figure 1 ) et donne trois bandes d'hybridation, dont l'une est présente sur le profil de la digestion EcoRI (la plus petite, située vers 3 kb). Le site Hindlïl est donc conservé et situé dans le grand fragment visible sur le profil d'hybridation de la digestion EcoRI. La cartographie de cette région montre (figure 2) qu'au maximum un fragment de 2,75 kb du plasmide a été perdu lors de l'intégration, en particulier la séquence codant pour la résistance à l'ampicilline et l'origine de réplication (figure 2). Le fragment de digestion EcoRI de 3 kb chevauchant une extrémité plasmidique, constitué d'un morceau du promoteur gpdA d'au moins 1,86 kb et d'un morceau d'ADN génomique est sensé appartenir au gène de pathogénie muté. Par ailleurs, l'hybridation par une sonde plasmidique de la double digestion EcoKL/Sacl a permis de montrer qu'il n'existait dans ce fragment que deux sites Sαcl très proches, situés à peu près au milieu de la région plasmidique (voir la figure 2). La stratégie d'Inverse-PCR est donc envisageable pour le clonage de ce fragment.
C) Récupération et clonage d'un fragment d'ADN génomique du mutant plsl contenant une partie génomique et une partie plasmidique par Inverse-PCR Le "-' -r- αe ceπe expérience est décrit par Ochmann et al. (1988 Genetics 120:
621-623). L'ADN génomique du mutant plsl est digéré par l'enzyme de restriction EcoRI.
Les fragments de restriction ont été séparés selon leur taille par une électrophorèse en gel d'agarose. Après migration, la zone du gel contenant les fragments de restriction d'une taille voisine de 3 kb a été découpée au scalpel. Les fragments d'ADN qu'elle contenait ont été récupérés par désorption. Ces fragments ont fait l'objet d'une ligature dans un grand volume (DNA Ligation System, Amersham dans 100 μl), de manière à ne favoriser que le circularisation des fragments par autoligature. L'ADN a été précipité avec 300 μl d'éthanol absolu et resuspendu dans 20 μl d'eau. Les fragments circularisés ont été digérés pendant 1 heure à 37°C par l'enzyme de restriction Sαcl. La totalité du produit de digestion a fait l'objet d'une PCR (PTΕ 100 MJ research) en conditions moyennement stringentes (30 cycles de 1 ' à 95°C; l' à 50°C; l '30" à 72°C) à l'aide des amorces oligonucléotidiques 421 (+) et 421 (-) (voir la figure 2). Ces amorces ont été définies à partir de leur position sur la séquence du promoteur gpdA et avec une structure secondaire compatible avec une réaction de PCR performante (programme OLIGO). La taille attendue du fragment de PCR correspondant à la bordure du point d'insertion, déduite de la cartographie faite par hybridation, était de 1 ,6 kb. Les produits d'amplification ont été séparés par électrophorèse. Deux bandes très ténues étaient visibles, l'une d'une taille de 1 kb, l'autre de 1,6 kb. Une deuxième amplification dans les mêmes conditions et en prenant comme matrice ce premier produit de PCR a permis d'augmenter la quantité de ces deux fragments de PCR. Le transfert sur membrane de nylon de ces deux fragments séparés par électrophorèse, suivi de l'hybridation par une sonde synthétisée à partir du fragment de restriction Bglîl-Sacl du promoteur du gène gpdA, ont pu démontrer qu'ils portent tous les deux des séquences homologues à cette sonde (conditions d'hybridation: op. cit.). Ils ont alors été extraits du gel et ont fait l'objet d'une ligature dans un vecteur de clonage des produits de PCR (pGΕM-T Easy, Promega). Les produits de ligation ont été utilisé pour transformer des bactéries compétentes selon le protocole décrit par Inoue et al. (1990 Gène 96: 23-28). Des minipréparations d'ADN plasmidique et des digestions de contrôle ont permis de confirmer que le fragment amplifié de 1,6 kb était bien celui déduit de la cartographie. Une expérience d'hybridation avec une sonde plasmidique du fragment de PCR transféré sur membrane de nylon après électrophrèse en gel d'agarose, a permis de montrer qu'une partie de sa.séquence est homologue à celle du plasmide pAN7.1 (conditions de transfert et d'hybridation: op. cit.). TN " .s4h- αe la région génomique cible de l'insertion du plasmide chez le mutant plsl.
Cette région a été isolée sous la forme d'un cosmide par hybridation d'une réplique sur membrane de nylon de la banque cosmidique de la souche 96/0/76 de M. grisea construite par Dioh et al. (1997 Nucleic Acids Res. 25(24): 5130-5131). La sonde utilisée a été préparée à partir d'un fragment de 350 bp, produit d'une double digestion par les enzymes de restriction EcoRI et Sali du fragment d'IPCR clone lors de l'étape précédente
(voir figure 2 et 3: 421C1), de manière à ne conserver qu'une séquence strictement génomique et homologue à celle recherchée dans la banque cosmidique. Le site Sali de la portion génomique du fragment d'IPCR a été identifié lors de digestions de contrôle sur ce fragment (conditions d'hybridation op. cit.). La colonie bactérienne du cosmide 32H7 de cette banque hybridant avec cette sonde a été multipliée et l'ADN cosmidique extrait et purifié grâce au Plasmid Midi Kit (QIAGΕN). Après quantification de l'ADN extrait par spectrophotométrie dans l'UV (260 nm), le cosmide a été cartographie par restriction. L'ADN du cosmide a été digéré par plusieurs enzymes de restriction, les produits de digestion séparés par électrophorèse en gel d'agarose et transférés sur membrane de nylon. Cette membrane a été hybridée avec le fragment génomique EcoRl-Sall de 350 bp clone suite à l'expérience d'Inverse-PCR (conditions de digestion, séparation et transfert des fragments de restriction et hybridation: op. cit.). Deux sous-clones de ce cosmide ont été réalisés suite au résultat de cette hybridation: deux fragments de restriction chevauchants (Notl de 15 kb et EαmHI de 8,5 kb; voir la figure 3) hybridant avec la sonde utilisée ont été ligaturés dans le vecteur pCB1265 (Sweigard et al. (1997) Fungal Genêt. Newsl. 44: 52- 53) pour donner les plasrnides pC421-15 et pCM421-8,5. Ces deux plasrnides ont été clones et extraits en vue de transformations fongiques. Expérience 5: Complémentation de la mutation avec un fragment d'ADN de la région génomique cible de l'insertion chez le mutant plsl.
Le vecteur pCB1256 contient le gène bar sous contrôle de séquences régulatrices fongiques qui permet la sélection de transformants de M. grisea résistants à la phosphinothricine. Les sous-clones génomiques isolés par hybridation avec la séquence jouxtant le plasmide dans le génome du mutant plsl peuvent donc être introduits par transformation chez ce mutant pour savoir s'ils contiennent la séquence complète nécessaire à la complémentation fonctionnelle de la mutation. Des protoplates du mutant plsl ont été transformés avec les plasrnides pCM421-15 et pCM421-8,5 et les spores des tran forma __..__cs ootenus ont été inoculés à des feuilles de riz et d'orge en survie, puis à des plantes entières de riz (conditions de préparation des protoplastes, de transformation, de sélection et de purification des transformants et d'essais de pathogénie: op. cit.). Dans les deux cas, au moins un transformant présentait un niveau de pathogénie semblable à celui de la souche sauvage, ce qui indique que la séquence complète du gène de pathogénie altéré chez le mutant plsl est contenue dans ces deux fragments.
Expérience 6: Localisation et caractérisation de la séquence nucléotidique du gène de pathogénie muté
A) Séquençage de l'ADN génomique au voisinage du point d'insertion du plasmide chez le mutant pis 1.
Le fragment clone suite à l'expérience d'Inverse-PCR a été entièrement séquence à partir des amorces Ml 3 et Reverse des bordures du polylinker du plasmide pGEM-T Easy. Des amorces de réactions de séquençage ont ensuite été désignées sur les deux brins de la séquence génomique du fragment d'Inverse-PCR pour étendre les données de séquences de part et d'autre du point d'insertion du plasmide pAN7.1 chez le mutant plsl grâce au plasmide pCM421-8,5. La synthèse des oligonucléotides ainsi que les réactions de séquençage ont été réalisées par la société Génome Express S.A. (Grenoble, France).
B) Isolement et séquençage de l'ADN complémentaire
Une banque d'ADN complémentaires des ARN messagers de M. grisea a été construite et criblée pour localiser une unité transcriptionnelle correspondant à un gène dans la région de l'ADN génomique isolée par Inverse-PCR.
Un inoculum de M. grisea préparé par broyage dans de l'eau stérile de petits fragments de culture sur milieu riz gélose a été ajouté à 200 ml de milieu complet liquide en erlenmeyer de 11 (composition: voir Silué et al. (op. cit.). Le champignon a ensuite été cultivé à 26°C avec une agitation de 150 tpm pendant une nuit. Le mycélium a été alors récupéré par centrifugation puis à nouveau broyé dans de l'eau stérile. La moitié du broyât a été ajouté à 200 ml de milieu complet et cultivé dans les mêmes conditions. Le lendemain, le mycélium a été recueilli et lavé à l'eau stérile sur de la toile à bluter, partiellement essoré et finement broyé avec un mortier en porcelaine dans de l'azote liquide. La poudre obtenue a été répartie en tubes de polypropylène à vis de 15 ml à raison de 3 ml de poudre par tube. Les tubes avaient préalablement été remplis d'un mélange de 2 ml de phénol:chloroforme:alcool isoamylique (25:24:1) et de 3 ml de tampon d'homogénéisation (50 mM TrisHCl pH8,0; 0,25 M EDTA pH8,0; 5% SDS). Les tubes ont été ? "'*-~- . __4uement pendant au moins 15', puis centrifugés pendant 20' à 4000 tpm à température ambiante. La phase aqueuse a été récupérée et mélangée dans de nouveaux tubes avec 2 ml de chloroforme. La phase aqueuse a été extraite deux fois avec 2 ml de chloroforme par agitation pendant 10'. Elle a été récupérée après séparation par centrif gation (mêmes conditions), puis transférée dans un tube à centrifugation traité contre les RNase par autoclavage contenant le même volume de 6 M LiCl traité au DEPC.
Les ARN totaux ont été précipités une nuit à 4°C. Les tubes ont été ensuite centrifugés 20' à 10000 tpm à 4°C. Le surnageant éliminé a été et les culots resuspendus dans 50-100 μl de
TE (10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA; pH8,0) traité au DEPC. Les ARN totaux ont été quantifiés par spectrophotométrie dans l'UV (260 et 280 nm). Les ARN messagers poly A(+) ont été ensuite extraits au moyen du kit Dynabeads mRNA Direct Purification Kit (Dynal) par affinité avec des billes greffées avec une séquence oligo (dT) 5. 5 μg d'ARNm ont été utilisés pour la synthèse des ADN complémentaires et leur ligature dans un vecteur d'encapsidation avec le kit Zap Express cDNA Synthesis Kit (Stratagene) selon les recommandations du fabricant. La banque d' ADNc a été encapsidée grâce au kit Gigapack III Gold Packaging Extract (Stratagene), amplifiée et stabilisée selon les recommandations du fabricant. Le criblage de la banque a été réalisée par l'hybridation d'une réplique transférée sur membrane de nylon de 1 million de plages de lyse. La sonde radioactive utilisée pour le criblage a été synthétisée à partir d'un fragment de restriction Stul-Clά de 1 kb du cosmide 32H7 (figure 4) hybridant avec la partie génomique du fragment récupéré par Inverse-PCR (conditions d'hybridation: op. cit). L'ADNc isolé (d'une taille de 1,9 kb) a ensuite été également séquence.
C) Analyse informatique des séquences nucléotidiques
L'analyse des séquences de l'ADN génomique et de l'ADN complémentaire grâce au programme DNA Strider 1.2 ont permis de localiser le cadre ouvert de lecture d'un gène de 675 bp interrompu par deux introns de 77 et 96 bp (figure 4). Les programmes BLAST (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410; Gish et al. (1993) Nαt. Genêt 3: 266- 272; Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402) et FASTA (Pearson et Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444-2448) n'ont pas permis de trouver de séquences de gènes déjà caratérisés présentant des homologies significatives au niveau nucléotidique avec celui-ci. La traduction in silico du gène prédit l'existence d'une protéine de 225 acides aminés (figure 5). Les programmes de prédiction de la topologie des protéines (Profil d'hydropathie selon Kytes et Doolittle de DΝA Strider 1.2; Predict- Protêt ^ -44. 1993) J. Mol. Biol. 232: 584-599); PSORT ; Scan Prosite du serveur internet ExPASy) indiquent l'existence probable de quatre domaines transmembranaires et d'au moins un site de N-glycosylation pour cette protéine. Le programme Profile Scan
(serveur internet de 1TSREC) l'inclut dans la superfamille de protéines TM4 (ou tetraspanines). De même, parmi les protéines identifiées grâce au programmes blastp et fasta3, figurent plusieurs protéines de cette superfamille, bien que les degrés d'identité et de similarité des séquences en acides aminés soient faibles . Un alignement de plusieurs protéines de cette famille avec le programme Clustal X montre cependant qu'il s'agit de la seule famille de protéines présentant des éléments de séquences identiques ou similaires à celle prédite pour la protéine de pathogénie de M. grisea qui ont une taille et une topologie comparables à celles de cette protéine. Cette superfamille de protéines n'a pas de fonction biochimique clairement établie. Ses membres n'ont jusqu'alors été identifiés que dans le Règne Animal (chez les Mammifères et le Schisostome), le plus souvent comme marqueurs immunologiques de la différenciation cellulaire ou tissulaire (Horejsi et Nlcek (1991) FEBS Letters 288(1,2): 1-4. Le seul autre mutant connu pour un gène codant pour l'une de ces protéines est un mutant de la drosophile affecté dans la différenciation des synapses (Kpoczynski et al. (1996) Science 271 (5257): 1867-1870). Une protéine de cette famille pour laquelle les données expérimentales sont un peu plus complètes est l'uroplakine I des Mammifères: cette protéine est associée avec au moins deux autres types de protéines au niveau de la membrane plasmique de l'épithélium de la vessie (Wu et al. (1994) J. Biol. Chem. 269 (18): 13716-13724). Ces complexes tapissent la paroi de vésicules membranaires (Severs et Hicks (1979) J. Ultrastruct. Res. 69: 279-296), en réserve dans le cytoplasme lorsque la vessie est vide. Ces vésicules sont tractées passivement vers la membrane plasmique par un réseau de microfilaments qui se tend lorsque la vessie se gonfle (Sarikas et Chlapowski (1989) Cell Tissue Res. 258: 393-401). Ces vésicules auraient à la fois pour rôle d'augmenter la surface de l'épithélium et de le renforcer, grâce aux complexes protéiques qui les tapissent (Wu et al. (1994): op. cit.). D'une manière plus générale, une hypothèse biochimique avancée dans plusieurs autres publications attribuerait à ce type de protéine le rôle de faciliter l'intégration et la stabilisation au niveau de la membrane plasmique d'autres protéines impliquées dans la signalisation pour un grand nombre de processus cellulaires, comme l'activation, la prolifération, l'adhésion, la mobilité, la différenciation et le cancer (Maecker et al. (1997 Mai) FASEBJ. 11 (6): 428-442). -. icnce 7: Remplacement du gène interrompu par le plasmide pAN7.1 chez le mutant plsl
A) Construction du vecteur de remplacement
Le vecteur pCB1003 (Sweigard et al. (1997): op. cit.) a été digéré par l'enzyme de restriction EcoRI pour en libérer la cassette de résistance à l'hygromycine (1 kb), constituée du cadre ouvert de lecture du gène hph (op. cit.) et du promoteur du gène trpC D'_4. nidulans. Ce fragment a été ligaturé au site EcoRI du polylinker du plasmide pBL pour donner le plasmide pBLHYG. Ce plasmide a été clone et l'orientation de la cassette de résistance à l'hygromycine contrôlée par restriction: l'orientation de pBLHYG est telle que le début du promoteur de la cassette se trouve du côté du site Smαl. Cette cassette a été extraite de ce nouveau plasmide par une double digestion Smal-Clal.
Le plasmide pCM421-8,5 a été digéré par les enzymes StuI et Clάl. Le fragment
Stul-Clal de 1 kb a été éliminé et les deux autres récupérés. Le plus grand (Stul-Clal de 7,3 kb) a été ligaturé avec le fragment Smal-Clal de 1 kb contenant la cassette de résistance à l'hygromycine (voir ci-dessus). Après clonage et extraction, ce plasmide a été digéré par
Clal, déphosphorylé par la Shrimp Alkaline Phosphatase (Amersham) selon les recommandations du fabricant et ligaturé avec le troisième fragment (CM de 3,5 kb) issu de la double digestion Stul-Clal de pCM421-8,5. Le plasmide obtenu pRM421 a été clone et l'orientation du fragment Clal de 3,5 kb contrôlée par une réaction de PCR à l'aide des amorces hphl (5'-CAGCGAGAGCCTGACCTATTGC-3\ SΕQ ID No. 15), située au début du gène hph et pos421 (5'-TCAAGACGCTCACAGAGTGC-3\ SΕQ ID No. 16), située sur le fragment Clal de 3,5 kb, au niveau du signal de terminaison de la traduction du cadre ouvert de lecture du gène de pathogénie supposé (programme de 30 cycles déjà cité avec une température d'hybridation de 60°C). 10 μg de ce plasmide ont été digérés par l'enzyme BamHl. Après séparation par électrophorèse dans un gel d'agarose LMP (Sea
Plaque GTG, Tebu) à 1 % dans du tampon TAΕ, le fragment de 8,5 kb de région génomique contenant le gène de pathogénie remplacé par la cassette de résistance à l'hygromycine a été extrait avec le kit GΕLase (Tebu) selon le protocole du fabricant. Le produit d'extraction a été quantifié par spectrophotométrie dans l'UN. B) Transformation et sélection d'un mutant de pathogénie par remplacement du gène interrompu par le plasmide pAΝ7.1 chez le mutant plsl.
10^ protoplastes de la souche sauvage pi.2 ont été transformés avec 1 μg de vecteur de remplacement pRM421 préparé selon le protocole décrit ci-dessus. 47 transformants - .. . i.ygromycine obtenus ont été analysés par un test de pathogénie; 26 d'entre eux, qui n'étaient pas pathogènes, ont ensuite été analysés par hybridation de digestions EαmHI de l'ADN génomique à l'aide de sondes synthétisées à partir des fragments génomiques EαmHI de 8,5 kb et Stul-Clal de 0,7 kb. Il a pu être démontré par ces deux expériences que 24 des transformants non pathogènes obtenus étaient dépourvus du fragment Stul-Clal de 0,7 kb et ne comportaient qu'un seul fragment EαmHI hybridant avec le fragment d'ADN génomique de même taille ayant servi à la construction du vecteur pRM421 : le phénotype de non pathogènie résulte donc bien de la délétion de la quasi- totalité de la séquence du gène interrompu par le plasmide pAN7.1 chez le mutant plsl et non de l'intégration ectopique du vecteur de remplacement pRM421 dans la séquence d'un autre gène de pathogénie.
Expérience 8: Caractérisation phénotypique du mutant
Les preuves que la région de l'ADN génomique de Magnaporthe grisea cible de l'insertion du plasmide pAN7.1 chez le mutant plsl est bien celle d'un gène indispensable à la pathogénie du champignon vis-à-vis du riz et de l'orge sont établies. Cependant, la séquence de la protéine pour laquelle coderait ce gène ne renseigne pas sur la fonction biochimique qu'elle contrôlerait. Une analyse phénotypique à la fois plus large et plus complète du mutant de ce gène est donc indispensable si l'on veut pouvoir préciser ce point. A) Phénotypes de mycologie générale
La morphologie du mutant a été comparée à celle de la souche sauvage selon les critères suivants: pigmentation, morphologie mycélienne et morphologie des conidies. Aucune différence particulière n'a été relevée.
Le rythme de croissance radiale a été mesuré sur milieu gélose complet ou minimum. Le mutant est prototrophe et n'a pas un rythme de croissance différent de celui de la souche sauvage.
B) Phénotypes en relation avec l'infection
Les taux de germination des conidies et de différenciation des appressoria ont été mesurés pour le mutant et la souche sauvage suite à des dépôts sur lames de verre et de PNC (Rinzl) de gouttelettes de suspensions de spores à 5.10^ spores/ml et observées toutes les trois heures jusqu'à 9 heures après dépôt. Les taux de germination sont similaires. Ceux de différenciation des appressoria le sont 9 heures après dépôt, mais le rythme de différenciation semble plus rapide chez le mutant. f i sion de turgescence des appressoria a été évaluée selon la méthode de de
Jong et al. (1997 Nature 389: 244-245). Elle n'est pas réduite de manière significative chez le mutant.
Un test de pathogénie sur feuilles de riz et d'orge en survie préalablement abrasées selon le protocole de Surieux (1998, Rapport de Maîtrise de Sciences de la Vie de
L'Université de Lyon) a été réalisé avec des suspensions de spores du mutant et de la souche sauvage à 10^ spores/ml. Aucune lésion typique de la maladie ne se sont développées sur les feuilles infectées par les spores du mutant, contrairement à la souche sauvage. Un test de pénétration de cellules épidermiques de la face inférieure de feuilles d'orge (cultivar Baraka) a été réalisé comme suit: des gouttelettes de suspension de spores à 5.10^ spores/ml ont été déposées sur la face inférieure de feuilles d'orge récoltées sur des plants au stade 3 feuilles cultivées en conditions identiques à celles des plantes utilisées pour les tests de pathogénie sur feuilles en survie). Ces feuilles ont été déposées sur de le gélose à % et incubées à 23°C et une humidité relative de 75% pendant 1-6 jours. L'épiderme infecté a été décollé en incisant la face supérieure juste au dessus du niveau de l'infection avec une lame de rasoir en prenant garde de ne pas trancher complètement la feuille, en collant la partie de la face supérieure correspondante à la zone infectée sur un morceau de ruban adhésif à double face, puis en tirant très délicatement sur la partie encore libre au dessus de la ligne d'incision. L'épiderme a été monté sur une lame de verre dans une goutte d'eau et, éventuellement, du bleu de lactophénol avant d'être observé au microscope. La colonisation des cellules épidermiques par les hyphes infectieux du champignon est visible entre 24 et 48 heures après le dépôt des gouttelettes chez la souche sauvage. Dans le cas du mutant, les observations faites jusqu'à 6 jours après le dépôt des gouttelettes de spores n'ont pas permis de mettre en évidence d'autres structures infectieuses que les appressoria à la surface des feuilles.
La formation de l'aiguille d'infection a été recherchée sur des coupes de feuilles d'orge infectées dans les mêmes conditions que celles de test de pénétration des cellules épidermiques. Les fragments de feuilles infectés ont été prélevés 24 heures après le dépôt des gouttelettes de spores. La fixation du matériel biologique et l'inclusion dans la résine durcissante LR White ont été réalisées selon le protocole suivant :
Matériel biologique : Les plantes hôtes sont constituées par des segments de feuilles d'orge en survie sur milieu gélose infecté par dépôt de gouttes de suspension de spores de _ . s ss . -,αuvage ou mutant). Les prélèvements sont faits 24 heures après dépôt des gouttes. Un contrôle est fait au microspcope au moment du prélèvement. Les 2 souches ont développé de très abondants appressoria. Un disque comportant toute l'épaisseur du segment de feuille est découpé dans la zone du dépôt et fixé pour une étude cytologique fine.
Préparation des échantillons : Les disques de feuilles de quelques milimètres sont fixés dans un mélange de glutaraldéhyde à 2% et de paraformaldéhyde à 0,5 % dans un tampon de Mcllvaine 0,1 M à pH 7 pendant 4 heures à température ambiante (environ
20°C). Les échantillons sont ensuite rincés dans le tampon Mcllvaine 0,2M puis une partie est post fixée pat le tétroxyde d'osmium à 0,5 % dans le tampon pendant 15 heures et incluse à l'épon. Des coupes d'une épaisseur de 0,4 μm sont effectuées puis collées sur lames de verre et la résine est extraite au méthoxyde de sodium saturé dilué au 1/3 pendant 3 minutes. Elles sont colorées selon la technique de Richardson (bleu de méthylène-Azur 2) à 80°C. Les coupes ont été faites avec un ultramicrotome à des épaisseurs comprises entre 1 et 0,4 μm. Elles ont été observées avec un microscope NIKKON Optipot sur des coupes débarassées de la résine par un trempage dans de la soude méthanolique et une coloration par un mélange de Bleu Azur et de Bleu de Méthylène. 24 heures après le dépôt des gouttelettes, la souche sauvage a déjà pénétré la cuticule et la paroi des cellules épidermiques et commencé à former un hyphe infectieux à l'intérieur. Dans le cas du mutant, aucune aiguille de pénétration, ni aucun hyphe infectieux n'a pu être mis en évidence. Aucun signe d'une perforation de la cuticule et de la paroi, pourtant nettement visible avec la souche sauvage, n'est observable.
L'observation de coupes sériées a pu montrer que certains appressoria mutants présentaient un décollement de la zone périphérique de leur base normalement rendue adhérente à la surface de la feuille par le dépôt d'un anneau d'une substance de composition inconnue. Ce dépôt semblait être présent chez le mutant, mais non adhérent à la surface de l'épiderme foliaire. Ce type de décollement est aussi observé chez la souche sauvage, mais en moindre proportion. La mélanisation de la paroi des appressoria du mutant ne semble pas être affectée, mais 40 % des appresoria formés à la surface de la feuille sont déformés (applatissement, écrassement). Dans le cas de la souche sauvage seuls 10% des appressoria formés à la surface de la feuille sont déformés. __ . ...uiant plsl ne semble affecté dans aucune fonction végétative, mais plutôt dans un aspect du développement strictement restreint à la formation et au fonctionnement de l'appressorium: celui semble se développer normalement, mais il est incapable de différencier la structure (hyphe de pénétration) nécessaire à perforer la cuticule et la paroi des cellules épidermiques de la feuille d'orge. Par ailleurs, sa capacité d'adhésion à la surface de la feuille est altérée.
Exemple 2: Préparation d'une cassette d'expression d'un gène rapporteur GFP sous le contrôle du promoteur du gène plsl et son introduction dans le génome d'une souche sauvage et pathogène de Magnaporthe grisea
Le fragment Estl de 3 kb du cosmide 32H7 portant la totalité de la phase codante du gène plsl a été clone dans le vecteur pCB1265 (Sweigard et al, op. cit.). Son orientation a été contrôlée par restriction, de manière à ce que la phase codante du gène plsl se trouve orienté dans le sens positif d'orientation du plasmide. Le fragment d'ADN génomique de M. grisea se trouvant immédiatement en 5' de la phase codante du gène plsl a été amplifié par PCR avec les amorces Pr et GFP421, permettant l'introduction d'un site de restriction Ncol dans la séquence de ce fragment située immédiatement en amont du signal de démarrage de la traduction (ATG) de la phase codante du gène plsl. Le fragment d'amplification obtenu a été digéré par Psfl et Ncol, puis clone dans le vecteur pΕ-GFP (Clontech, USA; Haas et al, 1996, Current Biology, 6: 315-324), préalablement digéré les mêmes enzymes. Le plasmide obtenu a été digéré par les enzymes Estl et EcoRI. Le fragment d'ADN comprenant le morceau de séquence promotrice du gène plsl fusionné à la phase codante du gène GFP a été clone dans le vecteur pCB1265, préalablement digéré par les mêmes enzymes. Le fragment Pstl de 3 kb du cosmide 32H7 situé immédiatement en 5' de celui ayant servi à réaliser la construction précédente a été clone au site Pstl de cette construction. Son orientation a été contrôlée de manière à maintenir la continuité entre la séquence de ce fragment et celle du fragment de PCR clone devant le gène GFP telle qu'elle existe dans le cosmide 32H7. Cette séquence de 3,65 kb comporte la région promotrice de l'expression du gène pis J (région allant du site BamHl en amont de l'ATG du gène 421 à l'ATG du gène plsl). Le plasmide qui résulte de ce clonage a été appelé pΕM421-GFP. Il a été introduit par transformation de protoplastes dans le génome d'une souche sauvage P12 et pathogène de M. grisea (Mutant plsl). La sélection des transformants a été réalisée pour la résistance à la phosphinothricine conférée par le plasmide pCB1265 et les spores des transformants purifiés obtenus ont été analysés pour leur fluorescence en microscopie photonique (conditions de préparation des protoplastes, de transformation, de sélection et de purification des transformants: op. cit.).
Exemple 3: Clonage de gènes homologues au gène plsl de Ma naporthe grisea chez d'autres champignons
Des gènes homologues au gène plsl de Magnaporthe grisea ont été identifiés et clones chez d'autres champignons par PCR en utilisant des amorces dégénérées. Dans certains cas une double amplification s'est avérée nécessaire. La réaction d'amplification a été réalisée avec 100 ng d'ADN génomique de deux espèces fongiques (Neurospora crassa et Pyricularia higginsï) en présence de dNTPs, de Taq polymerase (Aplligene) et de tampon (1 X) dans un volume de 100 microlitres. Les oligonucléotides T4+ (AATGCNATCTTNATCTTC) et T3- (TCYYKCTTCTTACGRTCCTT) ont été utilisés pour la première amplification. Le programme d'amplification utilisé comprend 5 premiers cycles à une température d'hybridation de 45°C, suivis par 30 cycles à une température d'hybridation à 50°C. Les produits d'amplification (20 microlitres) ont été séparés par électrophorèse en gel d'agarose et visualisés par coloration au bromure d'éthidium. Un fragment de la taille attendue (580 bp) a été observé pour Pyricularia higinsi. Dans le cas de Neurospora crassa, 5 microlitres de ce premier produit d'amplification ont été utilisés pour une deuxième amplification avec les oligonucléotides T4+ (AATGCNATCTTNATCTTC) et T2- (GTACTATTGWARTANCCACA) dans les même conditions expérimentales que pour la première amplification. Les produits d'amplification (20 microlitres) ont été séparés par électrophorèse en gel d'agarose et visualisés par coloration au bromure d'éthidium. Un fragment de la taille attendue (320 bp) a alors été observé pour Neurospora crassa.
Les produits d'amplification ont ensuite été purifiés sur une colonne et clones dans le vecteur pGEM-T (Promega). Les clones bactériens ont été analysés par PCR avec les oligonucléotides universels forward et reverse afin d'amplifier leurs inserts. Ces clones ont ensuite été séquences a l'aide des oligonucléotides universels. Les séquences nucléotidiques obtenues ont été comparées à celle du gène plsl. La traduction des séquences nucléotidiques a également permis de comparer les gènes au niveau de la séquence protéique de plsl (figure 6). Les alignements montrent une forte identité entre ces séquences aussi bien au niveau nucléotidique que protéique, montrant quelles appartiennent à la même famille de gènes. A partir de cet aligment de séquences protéiques, nous avons choisi de nouveaux oligonucléotides dégénérés afin d'amplifier les gènes homologues de plsl dans d'autres espèces fongiques. Les oligonucléotides Tl+bis (CCNGCNCGIGGNTGGCTNAA), T3-bis (YTCYYGTCYTTICGRTCYTT) et T4+bis
(GTNAAYGCNATITTYATNTT) ont été synthétisés. Ces oligonucléotides permettent d'amplifier des fragments de 580 bp (T1/T3) et 630 bp (T3/T4) chez Magnaporthe grisea.
Ces oligonucléotides ont été utilisé pour amplifier des homologues de plsl chez les espèces fongiques suivantes: Botrytis cinerea, Mycosphaerella graminicola, Stagnospora nodorum, Blumeria graminis, Colleotrichum lindemuthianum, Puccinia graminis, Leptosphaeria maculons, Fusarium oxysporum, Fusarium graminearum, Venturia inaequalis,
Pseudocercosporella herpotrichoide, Rhizoctonia solani et oryzae, Rhychosporium secalis,
Ustilago maydis, Sclerotinia sclerotiorum, Neurospora crassa, Aspergillus nidulans et fumigatus, Gaeumannomyces graminis, Claviceps purpurea, Pyrenophora teres.
Exemple 4: Expression du gène plsl
La détection des transcrits du gène plsl a été réalisé par hybridation de Northern en utilisant des ARN totaux extraits soit de tissus fongiques de Magnaporthe grisea tels que du mycélium, des spores et des appressoria différenciés sur membrane artificielle (24h) ou de feuilles d'orge infectées par des spores de Magnaporthe grisea prélevées à différents moments (2, 8, 16, 24, 48 et 66 heures) après l'inoculation. La différentiation des appressoria sur une surface artificielle est réalisée en déposant des gouttes de 50 microlitres de spores (500 000 spores par ml) de la souche sauvage pathogène de M. grisea sur une membrane de téflon disposée à plat dans une boite de Pétri humide pendant 24h à 26°C. L'inoculation des feuilles d'orge est réalisée avec des gouttes de 35 microlitres de spores (500 000 spores par ml) de la souche sauvage pathogène de M. grisea. Ces gouttes sont déposées à la surface de fragments de 5 cm de jeunes feuilles d'orge (10-15 jours après germination) disposées sur de l'eau gélosée contenant de la kinétine (2 mg/1). L'ARN total est extrait en broyant ces différents tissus dans un mortier contenant de l'azote liquide, puis en suivant le protocole d'extraction d'ARN totaux au phénol chaud (Ausabel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D., D., Seidman, J. G., Smith & J. A., Struhl, K. (1994). Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley and Sons, NY). Les ARN totaux sont quantifiés par absorption UN. et déposés sur un gel d'agarose à 1% contenant un tampon MOPS (10 microgrammes par puits pour chaque condition), séparés par électrophorèse en conditions dénaturantes (Glyoxal, DMSO et Bromure d'éthidium mélangés au tampon de dépôt des ARN) pendant 1 heure 30 minutes à 70 volts et transférés sur une membrane de
Nylon (Hybond N+). Après migration le gel est observé sous un transilluminateur UN. et la fluorescence est quantifiée par une caméra haute définition (FluoroS Imager, Biorad). La quantification des AR ribosomiques 18S et 28S situés à 1.8 et 2.8 kb, permet d'estimer la quantité réelle d'ARΝ dans chaque piste de migration. Cette membrane est hybridée avec une sonde de 600 bp correspondant à la phase codante du gène plsl obtenu par amplification à l'aide des oligonuléotides 39+ (CCTGATGCTGGGCTTCTC) et 548- (ACARGCCGAAAACACCAG) en utilisant le kit d'hybridation Ultrahyb (Ambion, USA). Ce protocole d'hybridation permet d'amplifier les signaux d'hybridation Northern en tampon formamide (50 %) à 42°C sans augmenter le bruit de fond. Les membranes sont lavées deux fois à 42°C avec un tampon 2 SSC / 0.1 % SDS pendant 5 à 15 minutes, et mises en cassettes d'exposition pour Phosphoimager de 3h à 72h, puis révélées. Des signaux d'hybridation correspondant à un ARN messager de 1.9 kb (taille identique à celle des ADNc clones) ont été détectées en 3h dans toutes les conditions analysées (mycélium cultivé in vitro, spores, appressorium différentié in vitro, feuilles d'orge infectée). Ce résultat montre que le gène plsl est exprimé constitutivement par les différents tissus du champignon (mycélium, spore, appressorium). Dans le cas des feuilles d'orge infectée, les ARN totaux ne contiennent que très peu d'ARN fongique (moins de
1% 24 heures après l'inoculation). Les signaux d'hybridation obtenus dans le cas des feuilles d'orge infectée 24 heures après l'inoculation sont aussi important que ceux obtenus avec des ARN extraits de mycélium. Ce résultat suggère que le gène plsl est surexprimé au cours de l'infection par rapport au mycélium cultivé sur milieu synthétique.
Exemple 5: Vecteurs permettant la visualisation de l'expression du gène plsl
L'expression du gène plsl est suivie par fusion transcriptionelle du promoteur avec des gènes rapporteurs tels que ceux codant pour la GFP et la luciférase.
Un fragment de restriction Nrwl de 931 pb comprenant le cadre ouvert de lecture du gène plsl a été souscloné dans un vecteur dérivé du pBluescript (Stratagene) afin de faciliter les différentes fusions. Ce vecteur modifié, le pΝru, a été obtenu par remplacement de l'intégralité du polylinker du pBluescript par les sites BssHîl-Nrul-Bssliïl. Digéré par l'enzyme de restriction Nrwl, il peut recevoir le fragment de 931pb (obtenu par digestion par l'enzyme de restriction NruI du plasmide pCM421-8.5 pour donner le p421. Après modification, le fragment de 941 pb est excisé par la même enzyme de restriction et réintroduit dans son contexte d'origine (à savoir entre le promoteur et le terminateur du gène, au niveau des sites NruI). L'utilisation du p421 a permis d'introduire des gènes rapporteurs en aval du promoteur de plsl. Deux sites de restriction ont été ajoutés par PCR au niveau du cadre ouvert de lecture du gène. Un site Ncol au niveau du codon initiateur (ATG) et un site Xbal au niveau du STOP permettent à la fois d'enlever le cadre ouvert de lecture du gène par digestion du p421 (modifié par PCR) par les deux enzymes et de le remplacer par les gènes rapporteurs. Ceux-ci ont été excisés par les même enzymes de restriction de vecteurs commerciaux (pEGFP pour la GFP et pGL3-Basic pour la Luciférase, Clontech).
Une fois modifiée, le fragment NruI du vecteur navette p421 comportant les différentes fusions promoteur 421 /gène reporter est réintroduit dans son contexte d'origine à savoir le souscloné pCM421-8.5. Cette étape est à nouveau effectuée au moyen des sites de restrictions ΝruI présents à la fois de part et d'autre du cadre ouvert de lecture du gène plsl dans le p421 et dans le pCM421-8.5. Ce vecteur est alors utilisé pour la transformation de la souche PI.2 de Magnaporthe grisea. Les transformants obtenus permettent de suivre l'expression du gène plsl soit par observation au microscope à fluorescence des différents stades de développement (GFP), soit par mesure de l'activité luciférase dans des extraits protéiques bruts réalisés aux différents stades.
Exemple 6: Vecteurs permettant la localisation de la protéine Plsl dans les cellules fongiques
Suivant le même mode opératoire que pour les fusions transcriptionelles, différents vecteurs permettant la localisation cellulaire de la protéine Plsl ont été réalisées. Ces vecteurs permettent d'obtenir des protéines de fusion entre Plsl et la GFP ou l'épitope tag
Flag. La GFP ou le Flag ont été fusionnés soit l'extrémité Ν-terminale soit à l'extrémité C- terminale de la protéine Plsl.
Le p421 a servi de matrice pour des amplifications PCR permettant d'introduire un site Ncol et un site Xbal soit au niveau du codon initiateur soit au niveau du stop du gène plsl.
Après digestion des plasrnides obtenus par les deux enzymes de restriction, la GFP
(obtenue par digestion du plasmide pEGFP,clontech, par les enzymes de restriction Ncol et
Xbal) ou le Flag (obtenu de grâce à deux oligonucléotides comportant la séquence du Flag aux extrémités de laquelle ont été rajoutés les séquences des sites de restriction employés, synthétisés et appariés et digérés par les deux enzymes de restriction) ont été ajoutés soit en
5' soit en 3' du cadre ouvert de lecture du gène plsl.
Le fragment de digestion Nrwl du p421 modifié, comportant les différentes fusions protéine 421 /GFP ou Flag, a été réintroduit comme plus haut dans le sous-clone pCM421- 8.5 au niveau des sites de restriction NruI.
Les plasrnides obtenus sont transformés dans la souche PI.2 ou le mutant Δ421 de Magnaporthe grisea. Les transformants purifiés permettent alors de visualiser la localisation cellulaire de la protéine Plsl soit par observation au microscope à fluorescence soit par immunolocalisation au moyen des anticorps anti-flag M2 (Sigma). La localisation de la protéine Plsl peut en particulier être étudiée dans l'appressorium en utilisant comme matériel d'observation des spores germées sur support artificiel (téflon, cellophane...) qui permettent la différentiation appressoriale.
Exemple 7: Localisation de la protéine 421 (Plsl)
L'utilisation d'un fragment d'acide nucléique comprenant le promoteur plsl associé aux séquences codantes du gène 421 (plsl) et de l'octapeptide antigénique FLAG (Asp- Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys) permet la localisation de la protéine Plsl. Une souche recombinante comprenant le gène ci-dessus est utilisée permettant la localisation de la protéine 421 après purification des différentes membranes cellulaires, puis extractions différentielles des protéines membranaires par des méthodes biochimiques classiques (notamment Bordier. 1981. J. Biol. Chem. 256: 1604-1607 ainsi que Seigneurin- Berny et al. 1999. Plant J. 19: 217-228). Cette localisation est effectuée, après séparation des protéines extraites sur SDS-PAGE et transfert de celles-ci sur membrane, par immuno détection de la protéine recombinante par l'anticorps monoclonal anti-FLAG M2 (Sigma), puis par détection de l'anticorps par une protéine A couplée à la phosphatase alcaline (PA). La mise en évidence de la PA se fait par une réaction colorimétrique ou de chémiluminescence . Exemple 8: Identification des composants des complexes comprenant la protéine 421 par immuno précipitation
L'utilisation d'un fragment d'acide nucléique comprenant le promoteur pis 1 associé aux séquences codantes du gène plsl et de l'octapeptide FLAG permet la caractérisation des protéines des complexes membranaires auxquels appartiendrait la protéine Plsl .
Une souche recombinante comprenant le gène ci-dessus est utilisée permettant l'identification, après immuno précipitation par l'anticorps monoclonal anti-FLAG M2 (Sigma) conjugué à la protéine A-agarose (ou sépharose), des différents composants des complexes membranaires comprenant la protéine Plsl. La caractérisation des protéines de ce complexe sera effectuée comme cela a été fait lors de l'étude des tetraspanines animales (Horvath et al. 1998. J. Biol. Chem. 273: 30537-30543).
Ces techniques d'immuno précipitation permettent également la purification de la protéine recombinante et l'analyse de celle-ci. Cette analyse permettra le choix d'un fragment de la protéine Plsl pour la production d'anticorps spécifiquement dirigés contre celui-ci.

Claims

REVENDICATIONS
1) Polynucléotide caractérisé en ce qu'il comprend un polynucléotide choisi parmi les polynucléotides suivants: a) le polynucléotide de la SEQ ID No. 1 ; et b) le polynucléotide de la SEQ ID No. 3; et c) le polynucléotide de la SEQ ID No. 4; et d) le polynucléotide de la SEQ ID No. 5.
2) Polynucléotide caractérisé en ce qu'il comprend un polynucléotide choisi parmi les polynucléotides suivants: a) un polynucléotide capable de s'hybrider de manière sélective à un polynucléotide selon la revendication 1 ; et b) un polynucléotide homologue à au moins 80% à un polynucléotide selon la revendication 1.
3) Polynucléotide selon la revendication 2 caractérisé en ce qu'il code pour une tétraspanine indispensable à la pathogénie du champignon.
4) Polynucléotide caractérisé en ce qu'il comprend un polynucléotide codant pour le polypeptide de la SEQ ID NO. 3 ou pour un fragment biologiquement actif du polypeptide de la SEQ ID NO. 3.
5) Polynucléotide caractérisé en ce qu'il comprend le promoteur du gène plsl de la SEQ ID No. 2 ou un fragment biologiquement actif du promoteur du gène plsl de la SEQ ID
No. 2.
6) Polypeptide caractérisé en ce qu'il comprend le polypeptide Plsl de la SEQ ID No. 6 ou un fragment biologiquement actif du polypeptide Plsl de la SEQ ID No. 6.
7) Polypeptide caractérisé en ce qu'il comprend un polypeptide homologue à au moins 80% au polypeptide Plsl de la SEQ ID No.6. 8) Polypeptide selon la revendication 7 caractérisé en ce qu'il comprend une tétraspanine de champignon indispensable à la pathogénie du champignon.
9) Polypeptide de fusion comprenant un polypeptide selon l'une des revendications 6-8 fusionné à un polypeptide rapporteur.
10) Cassette d'expression caractérisée en ce qu'elle comprend dans le sens de la transcription: a) un promoteur fonctionnel dans un organisme hôte; et b) un polynucléotide selon l'une des revendications 1-4; et c) une séquence terminatrice dans ledit organisme hôte.
11) Cassette d'expression caractérisée en ce qu'elle comprend dans le sens de la transcription: a) un promoteur fonctionnel dans un organisme hôte; et b) un polynucléotide codant pour un polypeptide selon l'une des revendications 6-9; et c) une séquence terminatrice dans ledit organisme hôte.
12) Cassette d'expression caractérisée en ce qu'elle comprend dans le sens de la transcription: a) le promoteur du gène pis 1 ou un fragment biologiquement actif du promoteur du gène plsl selon la revendication 5; et b) un gène rapporteur; et c) une séquence terminatrice.
13) Vecteur comprenant un polynucléotide selon l'une des revendications 1- 5 et 10-12.
14) Organisme hôte transformé avec un polynucléotide selon l'une des revendications 1- 5 et 10-13.
15) Procédé de transformation d'un organisme hôte par intégration dans ledit organisme hôte d'au moins un polynucléotide selon l'une des revendications 1- 5 et 10-13. 16) Procédé pour inhiber la pathogénie d'un champignon caractérisé en ce qu'il comprend l'inhibition de l'expression d'un polynucléotide selon l'une des revendications 1 -3 dans ledit champignon, ou l'inhibition de l'expression d'un polypeptide selon l'une des revendications 5-7 dans ledit champignon ou l'inhibition de l'activité biologique d'un polypeptide selon l'une des revendications 5-7 dans ledit champignon.
17) Procédé pour l'identification de composés inhibant la pathogénie des champignons comprenant les étapes suivantes: a) mettre en contact ledit composé avec un polypeptide selon l'une des revendications 6-9; et b) détecter la fixation dudit composé audit polypeptide.
18) Procédé pour l'identification de composés inhibant la pathogénie des champignons comprenant les étapes suivantes: a) mettre en contact ledit composé avec un organisme hôte transformé avec un polynucléotide selon l'une des revendications 5 et 12 ou un vecteur selon la revendication 13, ledit organisme hôte exprimant un gène rapporteur sous le contrôle du promoteur du gène plsl; et b) détecter l'inhibition de l'expression dudit gène rapporteur.
19) Procédé pour l'identification de composés inhibant la pathogénie des champignons comprenant les étapes suivantes: a) mettre en contact ledit composé avec un organisme hôte transformé avec un polynucléotide selon l'une des revendications 1-4, 10 et 11 ou un vecteur selon la revendication 13, ledit organisme hôte exprimant un polypeptide Plsl; et b) détecter l'inhibition de l'expression dudit polypeptide Plsl .
20) Procédé pour l'identification de composés inhibant la pathogénie des champignons comprenant une étape d'identification d'un composé inhibant spécifiquement l'expression d'un polynucléotide selon l'une des revendications 1-4 dans ledit champignon, ou une étape d'identification d'un composé inhibant l'expression d'un polypeptide selon l'une des revendications 6-8 dans ledit champignon ou une étape d'identification d'un composé inhibant l'activité biologique d'un polypeptide selon l'une des revendications 6-8 dans ledit champignon.
21) Procédé selon l'une des revendications 17-20 comprenant une étape dans laquelle on détermine si ledit composé inhibe la pathogénie du champignon.
22) Procédé pour traiter des plantes contre un champignon phytopathogène caractérisé en ce qu'il comprend le traitement desdites plantes avec un composé identifié par un procédé selon l'une des revendications 17-21.
23) Utilisation d'un polynucléotide, d'un organisme hôte ou/et du polypeptide Plsl selon l'une des revendications 1-14, pour l'identification des gènes impliqués dans la pathogénie des champignons ou pour l'identification de nouvelles molécules fongicides inhibitrices de la pathogénie des champignons.
24) Composés inhibiteurs de la pathogénie des champignons identifiés par un procédé selon l'une des revendications 17-21.
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