WO2000075371A1 - Procede d'amplification d'acide nucleique potentialise - Google Patents

Procede d'amplification d'acide nucleique potentialise Download PDF

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WO2000075371A1
WO2000075371A1 PCT/JP2000/003647 JP0003647W WO0075371A1 WO 2000075371 A1 WO2000075371 A1 WO 2000075371A1 JP 0003647 W JP0003647 W JP 0003647W WO 0075371 A1 WO0075371 A1 WO 0075371A1
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rna
triphosphate
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final concentration
dna
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PCT/JP2000/003647
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Tetsuya Ishizuka
Takahiko Ishiguro
Juichi Saitoh
Tomomi Sakai
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Tosoh Corporation
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6865—Promoter-based amplification, e.g. nucleic acid sequence amplification [NASBA], self-sustained sequence replication [3SR] or transcription-based amplification system [TAS]

Definitions

  • the present invention relates to a method for amplifying a target RNA containing a specific nucleotide sequence expected to be contained in a gene mixture such as DNA and RNA, and furthermore, amplifies the target RNA and performs qualitative or quantitative analysis. On how to do it.
  • a gene mixture such as DNA and RNA
  • the present invention is useful in the field of clinical diagnosis such as genetic diagnosis, and is further useful in qualifying or quantifying microorganisms in the environment such as in food, indoors, soil, rivers, and oceans. It is.
  • PCR polymerase chain reaction
  • RNA RNA containing a specific nucleotide sequence
  • a primer which contains a promoter sequence, a reverse transcriptase and ribonuclease H for a target RNA.
  • An RNA containing a specific base sequence is generated, and thereafter, the generated RNA is caused to form a chain reaction of type II for synthesizing a double-stranded DNA containing the promoter sequence. Disclosure of the invention
  • RT-PCR method in which a reverse transcription reaction in which the RNA is ⁇ -type and a cDNA is synthesized before the PCR, must be performed, is essentially a two-step process. A process will be required.
  • PCR requires rapid temperature rise and fall, a special incubator is required, and it is not easy to apply it to automation for mass processing.
  • the RNA amplification method as described above can be easily applied to automation because it can perform a reaction at a relatively constant temperature.
  • it is necessary to further improve the amplification efficiency.
  • the present invention provides a method for amplifying a target RNA in a sample, the efficiency of which is further improved. Further, the present invention is a method for analyzing a target RNA, wherein the amplified RNA is analyzed while the target RNA in the sample is more efficiently amplified.
  • the substrate ribonucleoside triphosphate adenosine triphosphate, peridine triphosphate, cytidine triphosphate
  • ITP inosine triphosphate
  • a target RNA in a sample containing a specific nucleotide sequence is defined as a type II, and RNA having a promoter sequence and comprising the specific nucleotide sequence or a sequence complementary to the specific nucleotide sequence can be transcribed. And generating an RNA transcript consisting of the specific base sequence or a sequence complementary to the specific base sequence by RNA polymerase, and further converting the RNA transcript into type II.
  • RNA amplification step comprising the step of generating the double-stranded DNA, adenosine triphosphate, peridine triphosphate
  • This is a method for amplifying target RNA, characterized by adding ITP in addition to cytidine triphosphate and guanosine triphosphate.
  • the invention of claim 2 of the present application is directed to the invention of claim 1, wherein the RNA polymerase of phage SP6 is used as the RNA polymerase, and the final concentration of ITP is in the range of 0.5 mM to 2 mM. It is characterized by being added as much as possible.
  • the invention of claim 3 of the present application is directed to the invention of claim 2, wherein the final concentration of ITP to be added and other ribonucleoside triphosphates (adenosine triphosphate, peridine triphosphate) are added.
  • the ratio of the final concentration of the acid, cytidine triphosphate and guanosine triphosphate is in the range of 0.5 to 1.0 to 1.5 to 1.0.
  • the invention of claim 4 of the present application is directed to the invention of claim 1, wherein at least the final concentration of the tris-chloride buffer (pH 8.5 to 8.9) is 20 mM to 50 mM,
  • the final concentration of shim is between 12 mM and 20 mM, and ribonucleoside triphosphates (adenosine triphosphate, peridine triphosphate, cytidine triphosphate and guanosine triphosphate).
  • Final concentration of 3.5 mM to 5 mM contains RNA polymerase of phage T7 as RNA polymerase, and has a final concentration of 1.0 inosine triphosphate.
  • the invention of claim 5 of the present application relates to the invention of claim 4, wherein the final concentration of ITP to be added and other ribonucleoside triphosphates (adenosine triphosphate, peridine triphosphate) are added. , Cytidine triphosphate and guanosine triphosphate) in a ratio of 0.3 to 1.0 to 0.7 to 1.0.
  • the invention of claim 6 of the present application is directed to the invention of claim 1, wherein at least the final concentration of the tris-chloride buffer (pH 8.5 to 8.9) is 50 mM to 80 mM, When the final concentration of shim is between 12 mM and 20 mM, ribonucleoside triphosphates (adenosine triphosphate, peridine triphosphate, cytidine triphosphate and guanosine triphosphate) Final concentration of 2.0 mM to 3.5 mM, RNA polymerase containing phage T7 RNA polymerase, and final concentration of inosine triphosphate of 3. It is characterized in that it is added in the range of 2 mM to 4.4 mM.
  • the invention of claim 7 of the present application is directed to the invention of claim 6, wherein the final concentration of ITP to be added and other ribonucleoside triphosphates (adenosine triphosphate, peridine triphosphate, cytidine triphosphate) are determined. Acid and guanosine triphosphonic acid) in a ratio of 1.0 to 1.0 to 1.0 to 1.5.
  • the invention of claim 8 of the present application is directed to the invention of claim 1, wherein the RNA amplification step comprises a primer having a sequence complementary to the specific nucleotide sequence and a primer having a sequence homologous to the specific nucleotide sequence (where The primer is a promoter primer that has a promoter sequence for RNA polymerase on the 5th side) and generates single-stranded DNA from RNA-dependent DNA polymerase using the target RNA as type II.
  • the primer is a promoter primer that has a promoter sequence for RNA polymerase on the 5th side
  • the single-stranded DNA as type I and using a DNA-dependent DNA polymerase, it has a promoter sequence capable of transcribing RNA having a specific base sequence or a sequence complementary to the specific base sequence.
  • RNA transcript RNA transcript in the presence of the RNA polymerase, and the RNA transcript is subsequently produced by the RNA-dependent DNA polymerase. Characterized in that it is made of a single-stranded D N A generation of ⁇ .
  • the invention of claim 9 of the present application is related to the invention of claim 1, wherein the amplification step is performed in the presence of a probe labeled with an intense fluorescent dye, and the fluorescence intensity of the reaction solution is changed over time.
  • the invention of claim 10 of the present application is directed to the invention of claim 9, wherein the probe labeled with the intercalator-unique fluorescent dye is provided. However, it is characterized in that the fluorescent property is changed by the complementary binding with the RNA transcript as compared with the case where no complex is formed.
  • Figure 1 is labeled with the intercalator-unique fluorescent dye used in Examples 1-4.
  • B ⁇ ⁇ B 3 shows the nucleic acid bases.
  • Figure 2 is a graph of the initial RNA amount 1 0 6 copies / / 3 0 1 0 a final concentration of ITP in. L mM ⁇ l. 0 mM and reaction time upon the fluorescence intensity ratio were carried out in Example 1 .
  • Nega is a sample that uses only a diluent instead of an RNA sample.
  • Figure 3 is in the initial RNA amount 1 0 4 copies Z 3 0 mu 1 made in Example 1 the concentration. ITP in 1.0 to 2.0 of mM and reaction time upon the fluorescence increasing rate graph . Nega used only diluent instead of RNA samples.
  • Figure 4 is a second embodiment in KoTsuta initial RNA amount 1 0 6 copies Z 3 0 mu 1 the concentration.
  • ITP is 0. 5 mM ⁇ 3. 0 mM and graphs of the reaction time and the fluorescence increasing rate when the .
  • Nega is a sample that uses only a diluent instead of an RNA sample.
  • Figure 5 shows the oligonucleotides (Y0-271 and YO) labeled with fluorescent dyes that were complementary to each of the two RNA samples (HCV and WQ) performed in Example 3.
  • — WT is a graph of the reaction time for the detection of a specific product and the fluorescence intensity ratio. The initial RNA amount was carried out in 1 0 5 copies Z 3 0 mu 1. Nega in the table indicates a sample in which a diluent was used instead of the RNA sample. Only specific combinations (11 j ⁇ and ⁇ 0—27 1, WQ and YO—WT) showed increased fluorescence.
  • FIG. 6 is a gradation-reversed photograph showing the results of 4% agarose gel electrophoresis of the sample after the reaction in Example 3. Specific bands were detected in the samples where the RNA samples were present (lanes 1, 2, 4, and 5). Lanes 7 and 8 are samples of HCV—RNA (155 bp) and WQ—RNA (102 bp). As the molecular weight marker, XI74 / HaeIII was used.
  • RNA amount 1 0 5 copies Z 3 0 mu 1 conducted in Example 4 4 is a graph of the reaction time and the rate of increase in fluorescence when the final concentration of ITP is 2.8 mM to 4.4 mM.
  • Nega is a sample that uses only a diluent instead of an RNA sample.
  • the present invention is based on the finding that, when RNA polymerase generates RNA with DNA as a type II, the presence of ITP improves the RNA generation efficiency.
  • the following reagents (A) to (I) are prepared, and these are sequentially added to a sample expected to contain the target RNA. Two or more of these are added at once, or It is possible to carry out by adding at once ((A) to (I) do not need to be added in this order).
  • the following reagents (J) and (K) A combination of the first and second single-stranded oligonucleotides may be used.
  • (K) A second single-stranded oligonucleotide having the same nucleotide sequence as the 5, terminal sequence of the specific nucleotide sequence in the target RNA.
  • the specific base sequence is defined as the case where the first and second single-stranded oligonucleotides of (A) and (E) above are used, and the 5 ′ end is the second one of (E).
  • the portion of the base sequence present in the target RNA that begins with the sequence of (3) in the strand oligonucleotide and ends with a sequence complementary to the first single-stranded oligonucleotide of 3, terminal force s (A). is there.
  • the first and second single-stranded oligonucleotides of (J) and (K) above are used, the 5 ′ end is replaced with the second single-stranded oligonucleotide of (K).
  • Base sequence present in the target RNA that begins with the same sequence and ends at the 3 'end with a sequence complementary to the sequence of (3) in the first single-stranded oligonucleotide (J) It is. It is important that the specific base sequence can be determined arbitrarily, and that the target RNA contains a specific sequence portion to the extent that target RNA can be distinguished from other nucleic acids.
  • the reagent (A) is a first single-stranded oligonucleotide having a sequence complementary to the 3 ′ end of the specific base sequence.
  • the reagent complements the target RNA and is subsequently In the presence of the reagents (B) and (C) described above, when cDNA synthesis using the RNA-dependent DNA polymerase to convert the target RNA into type II is performed, the 5′-terminal of the cDNA is synthesized. This is for positioning a sequence complementary to the 3 ′ end of the specific base sequence.
  • Reagent (B) is an RNA-dependent DNA polymerase, and reagent (C) is deoxyribonucleoside triphosphate as its substrate.
  • reagents (A) to (C) cDNA having a sequence complementary to the 3 ′ end of the specific base sequence in the target RNA at the 5 ′ end is synthesized. This cDNA is in a state of forming a DNA-RNA double strand with the ⁇ -type RNA.
  • the reagent (D) is ribonuclease H having an activity of cleaving RNA in the above-mentioned DNA-RNA double-stranded chain, but an enzyme having an equivalent RNA-degrading activity can also be used.
  • Reverse transcriptase represented by avian myoblastoma virus reverse transcriptase (hereinafter, AMV reverse transcriptase) has the activity of cleaving RNA in DNA-RNA duplex, and this type of enzyme For example, it can be used.
  • the reagent (E) contains, in order from the 5 ′ end, (1) the promoter sequence of the DNA-dependent RNA polymerase, (2) the enhancer sequence of the promoter, and (3) the same sequence as the 5 ′ end sequence of the specific base sequence. It is a second single-stranded oligonucleotide having a base sequence. In the second oligonucleotide, the portion (3) binds to the 3 'end of cDNA, which is synthesized in the presence of the reagents (A) to (D).
  • the cDNA is converted into a type II from the 3 'end of the second oligonucleotide, and at the same time, the cDNA is converted from the 3' end of the second oligonucleotide.
  • the two oligonucleotides as type I their complementary strands are synthesized by DNA-dependent DNA polymerase, and a complete double-stranded DNA having a transcriptable promoter sequence is obtained. Synthesized.
  • Reagent (F) is a DNA-dependent DNA polymerase.
  • AMV reverse transcriptase Some reverse transcriptases represented by DNA have a DNA-dependent DNA polymerase activity, and such enzymes may be used.
  • the reagent (G) is a DNA-dependent RNA polymerase, and the reagents (H) and (I) are ribonucleoside triphosphate and ITP as its substrates.
  • the double-stranded DNA synthesized by the coexistence of the reagents (C), (E) and (F) has a promoter region of the DNA-dependent RNA polymerase at the end. Therefore, in the presence of reagents (G) and (H), the synthesis of single-stranded RNA consisting of a specific base sequence is started immediately after the synthesis of the DNA.
  • the coexistence of the reagent (I) can dramatically increase the synthesis amount of the RNA.
  • Specific examples of the DNA-dependent RNA polymerase in the reagent (G) include, for example, T7RNA polymerase, T3RNA polymer, and SP6RNA polymerase.
  • the single-stranded RNA synthesized by the coexistence of reagents (G) to (I) is an RNA consisting of a specific base sequence (partially substituted by ITP). Therefore, when these are synthesized and coexist with the reagents (A) to (F), the above-described series of reactions repeatedly occurs.
  • a double-stranded DNA having a promoter region as described above is synthesized based on a trace amount of target RNA present in a sample, and this is a single-stranded DNA comprising a specific base sequence. It is a source of RNA synthesis.
  • the synthesized single-stranded RNA contributes to the synthesis of new double-stranded DNA, and as a result, the amount of single-stranded RNA composed of a specific base sequence increases dramatically over time.
  • the analysis method of the present invention is a method for analyzing target RNA, for example, including the step of adding a reagent (L) and measuring the fluorescence intensity of a reaction solution in the above-described RNA amplification step.
  • (L) a third primer that has a sequence complementary to the specific base sequence and is labeled so as to emit a measurable fluorescent signal when bound to a nucleic acid having the sequence.
  • Chain age Rigonucleotide a third primer that has a sequence complementary to the specific base sequence and is labeled so as to emit a measurable fluorescent signal when bound to a nucleic acid having the sequence.
  • the third oligonucleotide may be, for example, a DNA to which an intercalating fluorescent dye is bound.
  • the DNA portion is preferably 6 to 100 nucleotides, more preferably 10 to 30 nucleotides, for specific analysis of a specific nucleotide sequence. Needless to say, it is important that the DNA portion is a sequence existing in the specific nucleotide sequence and is a sequence complementary to a sequence portion that can be sufficiently distinguished from nucleic acids other than the target nucleic acid.
  • the DNA portion forms a complementary bond with the single-stranded RNA consisting of the synthesized specific base sequence, it acts as an RNA-dependent DNA polymerase in the already added reagent (C).
  • C RNA-dependent DNA polymerase
  • the 3 'end must be added with a non-complementary sequence to the specific base sequence, or the 3' end must be chemically modified so that extension from the 3 'end does not occur. Is preferred.
  • Intercalator-unique fluorescent dyes change their fluorescent properties by intercalating into a double-stranded portion when the DNA portion forms a complementary bond with another nucleic acid.
  • the intercalating fluorescent dye can be linked to DNA via an appropriate molecular length linker that does not interfere with the interaction between the two strands.
  • the linker is not particularly limited as long as it is a molecule that does not prevent the intercalator fluorescent dye from intercalating into the double-stranded portion.
  • a linker molecule selected from bifunctional hydrocarbons having a functional group at both ends is convenient and preferable for modification to an oligonucleotide.
  • a commercially available reagent set C6-Thiolmodifier, trade name, manufactured by Clontechech
  • C6-Thiolmodifier trade name, manufactured by Clontechech
  • the intercalating fluorescent dye is not particularly limited as long as its fluorescence characteristics change, for example, the emission wavelength fluctuates by intercalating into two strands. From the viewpoint of ease of measurement, etc. Those having the property of increasing the fluorescence intensity by intercalation are particularly preferred. More specifically, thiazole orange, oxazole yellow or a derivative thereof having a remarkable change in fluorescence intensity can be exemplified as particularly preferred intercalating fluorescent dyes.
  • the position at which the intercalating fluorescent dye is bound to DNA via a linker is at the 5'-end, 3'-end, or the center of the DNA, such as at the intercalation position of the intercalating fluorescent dye to the double strand.
  • the curation is not hindered and the complementary binding between the DNA portion and the RNA is not inhibited.
  • the amount of single-stranded RNA synthesized by reagents (G) to (I) using double-stranded DNA having a promoter sequence as type I increases with time. Therefore, the reagent (L) is allowed to coexist with at least the reagents (A) to (I) in a sample expected to contain the target RNA, and the single-stranded RN A is measured as the fluorescence signal.
  • the synthesized single-stranded RNA and the third oligonucleotide of the reagent (L) form a complementary bond and emit a fluorescent signal, this RNA is not contained in the reagents (A) to (A).
  • the reagents (J) and (K) are used instead of the reagents (A) and (E), the following (M) can be used instead of the reagent (L). It is possible to analyze a specific nucleic acid.
  • (M) a third single strand having a sequence identical to a specific base sequence in the target RNA and labeled so as to emit a measurable fluorescent signal when bound to a nucleic acid having a sequence complementary to the sequence Ori Gonuk Leotide.
  • Reagent U was prepared in the following order from the 5 'end: (1) DNA-dependent RNA (1) a single-stranded oligonucleotide having a sequence complementary to the 3′-terminal sequence of the specific base sequence in the single-stranded RNA; (2) an enhancer sequence of the promoter; Leotide.
  • the part (3) of the reagent is complementary to the 3 'end of the specific nucleotide sequence, and the presence of the reagents (B), (C) and (D) is the same as when the reagent (A) is used. Underneath, a cDNA complementary to the target RNA is synthesized.
  • the reagent (K) is a single-stranded oligonucleotide having a complementary sequence at the 5 ′ end of the specific base sequence of the cDNA.
  • the reagent (K) complementarily binds to the 5′-end of the cDNA in the specific nucleotide sequence, and then co-exists with the reagent (C) and the reagent (F) to promote the promotion of RNA polymerase.
  • the double-stranded DNA having the sequence is synthesized.
  • a second single-stranded RNA complementary to the specific base sequence is synthesized by the coexistence of the reagents (G) to (H).
  • the coexistence of the reagent (I) dramatically increases the amount of the single-stranded RNA synthesized.
  • the 3 ′ end of the second RNA is complementary-bound to the reagent (K), and the second cDNA of the second RNA is bound in the presence of the reagents (B) to (D).
  • the second cDNA complementarily binds to the portion (3) of the reagent (J), and a double-stranded DNA containing a promoter sequence is synthesized by the reagent (C) and the reagent (F).
  • the second RNA is synthesized by (G) to (I).
  • the synthesized second RNA which is complementary to the specific nucleotide sequence, becomes a source of synthesis of a new double-stranded DNA, and as a result of a series of reactions, as a result, the second RNA Increases dramatically.
  • the second RNA obtained here has a sequence complementary to the specific base sequence in the target RNA.
  • a reagent (M) that is a third single-stranded oligonucleotide having the same sequence as the specific base sequence and labeled with an intercalating fluorescent dye
  • the fluorescence intensity increases in proportion to the amount of the synthesized second RNA.
  • the measurement of the fluorescence signal in the present invention is preferably performed immediately after the addition of the reagents (A) to (I) and the reagent (L) or the reagent (M), or after a lapse of a predetermined time after the addition. .
  • the third DNA of the reagent (L) or the reagent (M) repeatedly binds and dissociates with the synthesized RNA during the process of single-stranded RNA synthesis, but the fluorescence signal measured at the time of binding is In order to reflect the abundance of the RNA, it is possible to follow the increase in single-stranded RNA over time.
  • the measurement itself may be continuous or intermittent at regular intervals.
  • the fluorescence signal measuring device does not constitute a part of the present invention, but any device can be used as long as it can continuously or intermittently measure the fluorescence signal in one or more reaction tubes.
  • the fluorescence signal measurement time may include the time when the fluorescence intensity of the test section containing a certain amount of target RNA increases significantly compared to the test section containing no target RNA. This is the time required for the fluorescence intensity of the test section containing the target RNA to become almost constant, approximately 4 hours, and 1 hour under suitable conditions.
  • RNA 11 13 to 267 (Kato et al., Proc. Natl. Sci., USA, 1990, 87, 952 4- 925) was used as a standard RNA sample, quantified by UV absorption at 260 nm, and then diluted with RNA (10 mM Tris-HC1 (pH 8.0), 0. I mM E DTA, 0. 5 U /, "1 RN ase I nhibitor) was diluted 1 0 6, 1 0 4 copies / 4/1 to become so used. Control This setup roll test group in (N ega) is Only the RNA dilution was used.
  • ITP at various concentrations (0.2 mM, 1.0 mM, 2. O mM, 3. O mM, 4.0 mM)
  • the second oligonucleotide having the MM SP6 promoter sequence (SEQ ID NO: 2; the portion from the first “A” at the 5 ′ end to the 17th “A” in the sequence is (SP6 promoter sequence, and the portion from the 18th "G” to the 25th “A” is an enhancer sequence.)
  • An intercalating fluorescent dye is labeled between the "C” and the sixth "G", and its 3, terminal is modified with glycolic acid, hereinafter abbreviated as Y0_271 )
  • FIG. 2 RNA sample concentration 1 0 6 copies the time course of / test, ITP final concentration 0. I mM ⁇ ;. I 0 mM ), shown in FIG. 3 (RNA sample concentration 1 0 4 copies Z test, 1 chome final concentration 1. 0 m M ⁇ 2. 0 mM) Was.
  • RNA diluent 10 mM Tris-HCI (H8.0), 0. 1 mM EDTA, 0. 5 UZ 1 RN ase I nhibitor
  • RNA diluent 10 mM Tris-HCI (H8.0), 0. 1 mM EDTA, 0. 5 UZ 1 RN ase I nhibitor
  • a second oligonucleotide having an M T7 promoter sequence (SEQ ID NO: 5; the portion from the first “A” at the 5 ′ end to the second “A” at the second end in the sequence is T (7) The promoter sequence, and the portion from the 23rd “G” to the 28th "A” is the enhancer sequence)
  • a third oligonucleotide (SEQ ID NO: 6; labeled “A” at the 5′-end 14 in the sequence) labeled with a 0.049 M intercalating fluorescent dye (FIG. 1) Intercalator-unique fluorescent dye is labeled between the 5th and 15th “C”, and its 3 ′ end is modified with glycolic acid, hereafter abbreviated as Y0-HC1b)
  • RNA diluent 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0. 1 mM ED TA, with 0. 5 UZ / l RN ase I nhibitor
  • RNA diluent 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0. 1 mM ED TA, with 0. 5 UZ / l RN ase I nhibitor
  • reaction solution of the following composition 15.2, "1 is a commercially available 0.5: « 1 volume tube 1 ⁇ tube Product name: Gene Amp Thin-Wailed Reaction Tubes, PerkinElma was added to the above RNA sample 41, and then mineral oil 10 Q ⁇ 1 was overlaid.
  • Composition of reaction solution
  • Figure 5 shows the time-dependent change in the fluorescence intensity ratio (fluorescence intensity value at a given time ⁇ background fluorescence intensity value) for each sample, with the time of addition of the enzyme solution being 0 minutes.
  • Figure 6 shows the results of 4% agarose electrophoresis of the sample. As shown in FIG. 5, an increase in fluorescence was observed only when the target RNA was used and the oligonucleotide labeled with its complementary fluorescent dye (HCV and YO_271, WQ and YO-WT). According to Fig. 6, specific bands were detected in the samples in which the R ⁇ ⁇ sample was present (lanes 1, 2, 4, and 5). From the above, it was shown that even when ITP was added, the obtained fluorescence intensity reflected only the amplification of the specific product.
  • RNA diluent 10 mM Tris-HC 1 (pH 8.0), 0. ImM EDTA, 0.5 UZ, "1 RNase Inhibitor, 5.0 mM DTT) 105 copies / 5 i In the control test group (Nega), only the RNA diluent was used.
  • composition of reaction solution concentration is final concentration of reaction system after addition of enzyme solution
  • oligonucleotide for cleavage SEQ ID NO: 10; oligonucleotide for cleaving target R ⁇ at the 5 'end of the specific sequence, overlapping with the 5' end of the specific sequence It has a sequence complementary to the adjacent region, forms RNA-DNA duplex with target RNA, and then cleaves RNA-DNA duplex by reverse transcriptase RNase H activity Oligonucleotides, 3'-ends so that they do not function as oligonucleotide primers Has been aminated.
  • Oligonucleotide probe (Y0-2771) labeled with 25.0 nM intercalating fluorescent dye ( Figure 1) (SEQ ID NO: 3; modified at 3 'end with glycolic acid) Has been)
  • FIG. 7 shows the time-dependent change of the fluorescence intensity ratio of the sample (the fluorescence intensity value at a predetermined time / the fluorescence intensity value of the background), with the time of addition of the enzyme being 0 minutes.
  • the time when the fluorescence intensity ratio exceeded 1.2 was taken as the rise time, and the relationship between the rise time and the ITP concentration was shown in FIG.
  • the single-stranded RNA containing the specific base sequence in the sample is substantially constant without repeating the operation of rapidly raising and lowering the temperature of the reaction solution.
  • the amplification efficiency can be dramatically improved by adding ITP It can be improved.
  • a double-stranded DNA having a promoter region of a DNA-dependent RNA polymerase at the end thereof is synthesized based on a target RNA in a sample, and this is used as a source of a large amount of single-stranded RNA.
  • the amount of synthesized single-stranded RNA increases dramatically, and the increase in fluorescence due to complementary binding of the probe labeled with the intercalator-unique fluorescent dye to the generated single-stranded RNA.

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Description

明細書
増強された核酸増幅法
技術分野
本発明は、 D N Aや R N A等の遺伝子混合物中に含まれると予想される 特定塩基配列を含む標的 R N Aの増幅方法に関するものであり、 更には、 標的 R N Aを増幅し、 定性的又は定量的に分析する方法に関するものであ る。本発明は遺伝子診断等の臨床診断分野での利用に有用であ り、更には、 食品中、 室内、 土壌中、 河川中、 海洋中等の環境中の微生物の定性又は定 量を行う際に有用である。
背景技術
一般的に、 ウィルス感染症の診断では、 臨床試料中の核酸 （ウィ ルス核 酸） が極微量であることが多いため、 高感度かつ良好な再現性の測定を実 現するために信号強度を向上し高感度化する目的で、 標的核酸を増幅する 方法がとられる。 例えば核酸中の特定の DNA配列を増幅する方法と して、 ポリ メ レースチェイ ンリ アク ショ ン （ P C R ) 法が知られている。 この方 法は、 特定の DNA配列の両末端部に相補的なプライマー及び相同なプライ マーからなる一組のプライマーと熱耐性 DNAポリメ レースを用いて、 熱変 性、 プライマー · ァニール、 伸長反応からなるサイクルを繰り返し行う こ とによ り特定の DNA配列を増幅する ものである。
特定塩基配列を含む R N A (標的 R N A ) の増幅法と しては、 N A S B A法や 3 S R法等が知られている。 この方法は、 標的 R N Aに対してプロ モータ一配列を含むブライマ一と逆転写酵素及びリボヌ ク レエース Hを用 いて、 プロモーター配列を含む 2本鎖 D N Aを生成し、 R N Aポリメ レー スによ り、 特定塩基配列を含む R N Aを生成し、 以後は、 該生成された R N Aを前記プロモータ一配列を含む 2本鎖 D N A合成の铸型とする連鎖反 応を生じさせるものである。 発明の開示
一般に、 P C Rで R N Aを増幅する場合、 P C Rに先だって R N Aを铸 型とする逆転写反応を行い、 一旦 c D N Aを合成する、 いわゆる R T— P C R法を行わなければならず、 実質的に 2段階の工程が要求されること と なる。 また P C Rは急激な昇温、 降温を必要とするため、 特殊なインキュ ベ一ターを必要と し、 大量処理を目的と した自動化への適用が容易ではな いという課題もある。
一方、 前記したような R N Aの増幅法は、 比較的一定温度での反応が可 能であるため自動化への適用が容易である。 しかし、 試料中に存在する極 微量の標的 R N Aをよ り高感度かつ再現性良く検出するためには、 増幅効 率を更に向上させる必要がある。
本発明は、 更に効率が向上された、 試料中の標的 R N Aの増幅方法を提 供するものである。 また本発明は、 試料中の標的 R N Aを更に効率的に増 幅しつつ、 増幅された R N Aを分析する、 標的 R N Aの分析方法である。 本発明者らは、 R N Aポリ メ レースを用いる R N Aの増幅工程において、 その基質である リボヌ ク レオシ ド三リ ン酸 （アデノシン三リ ン酸、 ゥ リ ジ ン三リ ン酸、 シチジン三リ ン酸及びグアノ シン三リ ン酸） に加え、 更にィ ノ シン三リ ン酸 （以下、 「 I T P」 と略する） を特定量添加することで、 増 幅効率を向上し得ることを見出し本発明を完成するに至った。
本願請求項 1の発明は、 特定塩基配列を含む試料中の標的 R N Aを铸型 と して、 プロモーター配列を有し前記特定塩基配列又は前記特定塩基配列 と相補的な配列からなる R N Aを転写可能な 2本鎖 D N Aを生成し、 R N Aポリメ レースによつて前記特定塩基配列又は前記特定塩基配列に相補的 な配列からなる R N A転写産物を生成し、 更に、 該 R N A転写産物を铸型 と して前記 2本鎖 D N Aを生成する工程からなる R N A増幅工程において、 R N Aポリ メ レースの基質と してアデノ シ ン三リ ン酸、ゥ リ ジン三リ ン酸、 シチジン三リ ン酸、 グァノ シン三リ ン酸に加え、 I T Pを添加するこ と を 特徴とする標的 R N Aの増幅方法である。
本願請求項 2の発明は、 請求項 1の発明に係り、 R N Aポリ メ レース と してフ ァージ S P 6の R N Aポリ メ レースを用い、 I T Pを終濃度が 0. 5 mM〜 2 mMの範囲となる よ う に添加するこ と を特徴とする。 本願請求 項 3の発明は、 請求項 2の発明に係り、 添加する I T Pの終濃度と、 それ 以外のリ ボヌ ク レオシ ド三リ ン酸 （アデノ シン三リ ン酸、 ゥ リ ジン三リ ン 酸、 シチジン三リ ン酸及びグアノ シン三リ ン酸） の終濃度の比率が 0. 5 対 1 . 0〜 1. 5対 1. 0の範囲であるこ と を特徴とする。
本願請求項 4の発明は、 請求項 1の発明に係り 、 少な く と も、 ト リス塩 酸緩衝液 （ pH8. 5〜 8. 9 ) の終濃度が 2 0 mM〜 5 0 mM、 塩化マグネ シゥムの終濃度が 1 2 mM〜 2 0 mM、およびリ ボヌ ク レオシ ド三リ ン酸（ァ デノ シン三リ ン酸、 ゥ リ ジン三リ ン酸、 シチジン三リ ン酸及びグァノ シン 三リ ン酸） の終濃度が 3. 5 mM〜 5 mM、 R NAポリ メ レース と してフ ァージ T 7の R N Aポリ メ レース を含み、イ ノ シン三リ ン酸を終濃度が 1 . 0 mM〜 2. 7 mMの範囲となる よ う に添加する こ と を特徴とする。 本願 請求項 5の発明は、 請求項 4の発明に係り、 添加する I T Pの終濃度と、 それ以外のリボヌ ク レオシ ド三リ ン酸 （アデノ シン三リ ン酸、 ゥ リ ジン三 リ ン酸、シチジン三リ ン酸及びグァノ シン三リ ン酸）の終濃度の比率が 0. 3対 1. 0〜 0. 7対 1 . 0の範囲であるこ と を特徴とする。
本願請求項 6の発明は、 請求項 1 の発明に係り 、 少な く と も、 ト リス塩 酸緩衝液 （ pH8. 5〜 8. 9 ) の終濃度が 5 0 mM〜 8 0 mM、 塩化マグネ シゥムの終濃度が 1 2 mM〜 2 0 mM、 リボヌ ク レオシ ド三リ ン酸 （アデノ シン三リ ン酸、 ゥリ ジン三リ ン酸、 シチジン三リ ン酸及びグァノシン三リ ン酸） の終濃度が 2. 0 mM〜 3. 5 mM, R NAポリ メ レース と してフ ァージ T 7の R N Aポリ メ レース を含み、イ ノ シン三リ ン酸を終濃度が 3. 2 m M〜 4 . 4 m Mの範囲となるよう に添加することを特徴とする。 本願 請求項 7の発明は、 請求項 6 の発明に係り、 添加する I T Pの終濃度と、 それ以外のリボヌク レオシ ド三リ ン酸 （アデノシン三リ ン酸、 ゥリジン三 リ ン酸、シチジン三リ ン酸及びグァノシン三リ ン酸）の終濃度の比率が 1 . 0対 1 . 0〜 1 . 0対 1 . 5の範囲であることを特徴とする。
本願請求項 8 の発明は、請求項 1 の発明に係り、前記 R N A増幅工程が、 特定塩基配列に相補的な配列を有するプライマー及び特定塩基配列に相同 的な配列を有するプライマー （ここで一方のプライマーは、 5， 側に R N Aポリメ レースのプロモ一ター配列を有するプロモータープライマ一であ る） を用い、 標的 R N Aを铸型と して R N A依存性 D N Aポリメ レースに よ り 1本鎖 D N Aを生成し、 該 1本鎖 D N Aを鍩型と して D N A依存性 D N Aポリメ レースを用いるこ とで、 特定塩基配列又は特定塩基配列に相補 的な配列からなる R N Aを転写可能なプロモー夕一配列を有する 2本鎖 D N Aを生成すること、 そして、 該 2本鎖 D N Aが R N Aポリメ レース存在 下で R N A転写産物を生成し、 該 R N A転写産物が引き続き前記 R N A依 存性 D N Aポリメ レースによる 1本鎖 D N A生成の铸型となるものである ことを特徴とする。
本願請求項 9の発明は、 請求項 1 の発明に関連し、 その増幅工程をイン 夕一力レー夕一性蛍光色素で標識されたプローブの存在下で実施し、 反応 液の蛍光強度を経時的に測定することからなる標的核酸の分析方法である そして本願請求項 1 0の発明は、 請求項 9の発明に係り、 前記イ ン ター力 レータ一性蛍光色素で標識されたプロ一ブが、 R N A転写産物との相補結 合によって、 複合体を形成していない場合と比較して蛍光特性が変化する ものであることを特徴とする。
図面の簡単な説明
図 1 は実施例 1〜 4で用いたインターカレータ一性蛍光色素で標識され たオリ ゴヌ ク レオチ ドのイ ンターカ レータ一性蛍光色素部分の化学構造で ある。 B ^〜 B 3は核酸塩基を示す。
図 2 は実施例 1 で行った初期 R N A量 1 0 6コピー/ / 3 0 1 において I T Pの終濃度を 0 . l mM〜 l . 0 mMと した際の反応時間と蛍光強度 比のグラフである。 N e g a とは R N A試料の代わりに希釈液のみを用い たサンプルのこ とである。
図 3 は実施例 1 で行った初期 R N A量 1 0 4コピー Z 3 0 μ 1 において. I T Pの濃度を 1 . 0 〜 2 . 0 mMと した際の反応時間と蛍光増加率のグ ラフである。 N e g aは R N A試料の代わり に希釈液のみを用いた。
図 4 は実施例 2で行つた初期 R N A量 1 0 6コピー Z 3 0 μ 1 において. I T Pの濃度を 0 . 5 mM〜 3 . 0 mMと した際の反応時間と蛍光増加率 のグラフである。 N e g a とは R N A試料の代わりに希釈液のみを用いた サンプルのこ とである。
図 5は実施例 3で行った、 2種類の R N A試料 （H C Vと WQ ) のそれ ぞれに相補的な、 蛍光性色素で標識したオリ ゴヌ ク レオチ ド （ Y 0— 2 7 1 と Y O— WT) による特異産物の検出の反応時間と蛍光強度比のグラフ である。 初期 R N A量は 1 0 5コピー Z 3 0 μ 1 で実施した。 表中の N e g a とは R N A試料の代わりに希釈液を用いたサンプルのことを表してい る。 特異的な組み合わせ （11じ ¥と ¥ 0— 2 7 1 、 WQと Y O— WT ) の み蛍光増加が見られた。
図 6は実施例 3で反応させた後のサンプルの 4 %ァガロースゲル電気泳 動の結果を示す、 階調反転写真である。 R N A試料が存在していたサンプ ル （レーン 1 、 2 、 4 、 5 ) では特異的なバン ドが検出された。 レーン 7 、 8は H C V— R N A ( 1 5 5 b p ) と WQ— R N A ( 1 0 2 b p ) の標品 である。 分子量マーカ一には X I 7 4 /H a e I I I を使用した。
図 7は実施例 4で行った初期 R N A量 1 0 5コピー Z 3 0 μ 1 において、 I T Pの終濃度を 2 . 8 mM〜 4 . 4 mMと した際の反応時間と蛍光増加 率のグラフである。 N e g a とは R N A試料の代わりに希釈液のみを用い たサンプルのこ とである。
図 8 は実施例 4で行った初期 R N A量 1 0 5コピー Z 3 0 μ 1 において Ι Τ Ρの終濃度を 2 . 8 mM〜 4 . 4 mMと した際の立上り時間 （蛍光強 度比 ： N e g a とは R N A試科の代わり に希釈液のみを用いたサンプルの こ とである。
発明を実施するための最良の形態
本発明は、 R N Aポリメ レースが D N Aを铸型と して R N Aを生成する 際に、 I T Pが存在すると R N A生成効率が向上するという知見に基づく ものである。
本発明は、 例えば以下 （A ) 〜 （ I ) の試薬を用意し、 標的 R N Aを含む と予想される試料にこれらを順次添加するカヽ これらの 2以上を一度に添 加するか、 又はこれらを一度に添加する操作によ り実施することが可能で ある （（A) 〜 （ I ) は、 この順に添加することを要しない）。
(A ) 前記 1本鎖 R N A中の特定塩基配列の 3 ' 側末端配列に相補的な 配列を有する第 1 の 1本鎖ォリ ゴヌ ク レオチ ド、
( B ) R N A依存性 D N Aポリメ レース、
( C ) デォキシリボヌ ク レオシ ド三リ ン酸
( D ) リボヌクレエース Hまたは同等の R N A分解活性を有する酵素、
( E ) 5 ' 末端側から順に （ 1 ) D N A依存性 R N Aポリメ レースのプ 口モーター配列、 （ 2 ) 該プロモーターのェンハンサー配列及び （ 3 ) 前記 1本鎖 R N A中の特定塩基配列の 5 ， 末端配列と同一の塩基配列を有する 第 2の 1本鎖オリ ゴヌ ク レオチ ド、
( F ) D N A依存性 D N Aポリメ レース、
(G) D A依存性 R N Aポリメ レ一ス、 (H) リボヌ ク レオシ ド三リ ン酸 （アデノ シン三リ ン酸、 ゥ リ ジン三リ ン酸、 シチジン三リ ン酸、 グアノ シン三リ ン酸）、
( I ) I T P。
また例えば、 また、 上記試薬 （ A ) 及び試薬 （ E ) の、 第 1及び第 2の 1本鎖オリ ゴヌク レオチ ドの組み合わせを用いる以外に、 以下の試薬 （ J ) 及び試薬 （K) の第 1 及び第 2の 1本鎖オリ ゴヌ ク レオチ ドの組み合わせ を用いてもよい。
( J ) 5 ' 末端側から順に （ 1 ) D N A依存性 R N Aポリメ レースのプ 口モータ一配列、 （ 2 ) 該プロモー タ一のェンハンサー配列及び （ 3 ) 標的 R N A中の特定塩基配列の 3 ' 側末端配列に相補的な配列を有する第 1の 1本鎮ォリゴヌク レオチド、
(K) 標的 RN A中の特定塩基配列の 5， 側末端配列と同一の塩基配列 を有する第 2の 1本鎖ォリ ゴヌクレオチド。
上記において特定塩基配列とは、 上記 （A) および （E) の第 1 及び第 2の 1本鎖オリ ゴヌ ク レオチ ドを使用した場合、 5 ' 末端が (E) の第 2 の 1本鎖オリゴヌクレオチドにおける （ 3 ) の配列で始ま り、 3， 末端力 s (A) の第 1の 1本鎖オリゴヌ ク レオチ ドと相補的な配列で終わる、 標的 R N A中に存在する塩基配列部分である。 また上記 （ J ) 及び （K) の第 1及び第 2の 1本鎖ォリ ゴヌク レオチ ドを使用した場合には、 5 ' 末端が (K) の第 2の 1本鎖オリ ゴヌク レオチ ドと同一な配列で始ま り、 3 ' 末 端が ( J ) の第 1の 1本鎖オリ ゴヌク レオチ ドにおける （ 3 ) の配列に相 補的な配列で終わる、 標的 R N A中に存在する塩基配列部分である。 特定 塩基配列は任意に決定することができるせ、 標的 R N Aを他の核酸から区 別し得る程度に特異的な配列部分を含むよう にすることが重要である。
試薬 （A) は、 特定塩基配列の 3 ' 末端に相補的な配列を有する第 1の 1本鎖オリ ゴヌクレオチドである。 該試薬は標的 R N Aに相補結合し、 後 述する試薬 （B) 及び （C) の共存下で、 R N A依存性 D N Aポリメ レ— スによる標的 RN Aを铸型とする c D N A合成が行われる際に、 該 c DN Aの 5 ' 側末端に特定塩基配列の 3 ' 末端と相補的な配列が位置するよう にするためのものである。
試薬 （ B ) は R N A依存性 D N Aポリメ レースであり、 試薬 （ C ) はそ の基質となるデォキシリボヌクレオシ ド三リ ン酸である。試薬（A)〜（C) の共存下で、 標的 R N A中の特定塩基配列の 3 ' 末端に相補的な配列を 5 ' 末端に持つ c D N Aが合成される。 この c DNAは、 铸型となった RN A と、 DNA— RNA 2本鎖を形成した状態である。
試薬 （D) は、 上記 DN A— RN A 2本鎖中の RN Aを切断する活性を 有するリボヌ ク レエース Hであるが、 同等の R N A分解活性を有する酵素 を用いること もできる。 トリ筋芽細胞腫ウィルス逆転写酵素 （以下、 AM V逆転写酵素） に代表される逆転写酵素は、 DNA— RNA 2本鎖中の R N Aを切断する活性を有しており、 この種の酵素を用いることが例示でき る。
試薬 （E) は、 5 ' 末端側から順に （ 1 ) D N A依存性 R N Aポリメ レ ースのプロモーター配列、 （ 2 ) 該プロモーターのェンハンサー配列及び ( 3 ) 特定塩基配列の 5 ' 末端配列と同一の塩基配列を有する第 2の 1本 鎖オリ ゴヌ ク レオチ ドである。 第 2のオリ ゴヌ ク レオチ ドにおいて、 （ 3 ) の部分は試薬 （A) 〜 （D) が共存するこ とで合成される c D N Aの 3 ' 末端に結合する。 従って試薬 （C) と （F) の共存によ り、 第 2のオリゴ ヌ ク レオチ ドの 3 ' 末端から該 c DNAを铸型と して、 また同時に該 c D N Aの 3 ' 末端から該第 2のオリ ゴヌ ク レオチ ドを铸型と して、 D N A依 存性 DN Aポリメ レースによ りそれぞれの相補鎖が合成され、 転写可能な プロモータ一配列を有する完全な 2本鎖 DN Aが合成される。
試薬 （F) は DN A依存性 DN Aポリメ レースである。 AMV逆転写酵 素に代表される逆転写酵素には、 D N A依存性 D N Aポリメ レース活性を 有するものがあり、 この種の酵素を用いてもよい。
試薬 （G) は、 DN A依存性 RN Aポリメ レースであり、 試薬 （H) と ( I ) はその基質となるリボヌク レオシ ド三リ ン酸及び I T Pである。 試 薬 （ C )、 (E) 及び （ F ) の共存によ り合成される 2本鎖 D N Aは、 D N A依存性 R N Aポリ メ レースのプロモーター領域を末端に有する。 このた め、 試薬 （G) 及び （H) の共存下では該 DN A合成後、 直ちに特定塩基 配列からなる 1本鎖 RN Aの合成が開始される。 ここで、 前述の通り、 試 薬 （ I ) を共存させるこ と によ り該 R N Aの合成量を飛躍的に増大するこ とができる。 試薬 （ G ) における D N A依存性 RNAポリメ レ一スと して は、 具体的に例えば T 7 R N Aポリメ レースゃ T 3 R N Aポリメ レ一 ス、 S P 6 RN Aポリメ レース等を例示することができる。
試薬 （G) 〜 （ I ) の共存によ り合成される 1本鎖 R N Aは特定塩基配 列からなる R N Aである （一部 I T Pに置換されている）。 従って、 これら が合成されて試薬 （A) 〜 （F) と共存することによ り、 上述した一連の 反応が繰り返し生じること となる。 このよ う に、 本発明では試料中に存在 する極微量の標的 R N Aをも とにして前記の如きプロモータ領域を末端に もつ 2本鎖 DN Aが合成され、 これが特定塩基配列からなる 1本鎖 RN A の合成源となる。 合成された 1本鎖 R N Aは新たな 2本鎖 D N Aの合成に 寄与し、 結果と して時間の経過と と もに特定塩基配列からなる 1本鎖 RN A量は飛躍的に増大する。
本発明の分析方法は、 例えば前記のような R N Aの増幅工程において、 試薬 （L) を添加し、 反応液の蛍光強度を測定する工程を含む、 標的 RN Aの分析方法である。
(L) 前記特定塩基配列に相補的な配列を有し、 該配列を有する核酸と 結合した場合に測定可能な蛍光信号を発するよう に標識された第 3の一本 鎖才 リ ゴヌ ク レオチ ド。
この第 3のオリ ゴヌクレオチドは、 例えばインターカレーター性蛍光色 素が結合された DN Aであれば良い。 該 DNA部分は、 特定塩基配列の特 異的分析のため、 6〜 1 0 0ヌク レオチド、 更に好ま しく は 1 0〜 3 0ヌ クレオチドとすることが好ま しい。 むろん該 DN A部分は、 特定塩基配列 中に存在する配列であって、 標的核酸以外の核酸と十分に区別可能な配列 部分と相補的な配列であることが重要である。 また、 DN A部分は合成さ れた特定塩基配列からなる 1本鎖 RN Aと相補結合を形成した場合に、 既 に添加されている試薬 （ C ) における R N A依存性 D N Aポリメ レースせ 作用してその 3 ' 末端からの伸長が生じないよう に、 該 3 ' 末端が特定塩 基配列と非相補的な配列が付加されているか、 または、 その 3 ' 末端が化 学的に修飾されていることが好ま しい。
インターカ レータ一性蛍光色素は、 D N A部分が他の核酸と相補結合を 形成すると 2本鎖部分にイ ンターカ レ一シヨ ンして蛍光特性が変化するも のである。 この目的のためには、 イ ン ターカ レーター性蛍光色素を、 2本 鎖部分へのィ ンタ一力 レシ ヨ ンを妨げない程度の適当な分子長リ ンカ一を 介して D N Aと結合することが例示できる。 かかるリ ンカ一と しては、 ィ ン夕一力レーター性蛍光色素が 2本鎖部分にイ ンターカレーシヨ ンするこ とを妨げない分子であれば特に制限はない。 特に両末端に官能基を有する 二官能性炭化水素から選択されるリ ンカー分子は、 ォリ ゴヌク レオチ ドへ の修飾を行う上で簡便で好ま しい。 また、 例えば、 市販の試薬セッ ト （C 6 -T h i o l m o d i f i e r , 商品名、 C l o n t e c h製） 等を使 用すること もできる。
イ ンターカ レーター性蛍光色素と しては、 2本鎖にイ ンターカ レーシ ョ ンすることで、 例えば発する蛍光波長が変動したりする等、 その蛍光特性 が変化するものであれば特に制限はないが、 測定の容易さ等の観点からィ ンターカレーシヨ ンによ り蛍光強度が増加する性質を有するものが特に好 ま しい。よ り具体的には特に蛍光強度の変化が著しいチアゾールオレンジ、 ォキサゾールイエロー又はそれらの誘導体を特に好ま しいイ ンターカ レー 夕一性蛍光色素と して例示できる。
イ ンタ一カレ一タ一性蛍光色素をリ ンカーを介して D N Aに結合させる 位置は、 DNAの 5 ' 末端、 3 ' 末端又は中央部等、 イ ンターカ レーター 性蛍光色素の 2本鎖へのインターカレーシヨ ンが妨げられず、 かつ、 DN A部分と RN Aとの相補結合を阻害しない限り特に制限はない。
プロモータ一配列を有する 2本鎖 D N Aを錶型と して試薬 （ G ) 〜 （ I ) によ り合成される 1本鎖 R N A量は経時的に増加する。 そこで、 試薬 （ L ) を、 上記標的 RN Aを含むと予想される試料に、 少なく と も試薬 （A) 〜 ( I )とと もに共存させ、増加する特定塩基配列からなる 1本鎖 RN Aを、 蛍光信号と して測定する。 ここで、 合成された 1本鎖 RN Aと試薬 （L) の第 3のオリ ゴヌクレオチドが相補結合を形成し、 蛍光信号を発した場合 であっても、 この RN Aは試薬 （A) 〜 （C) 共存下での DN A合成にお ける铸型と して機能することが明らかとなった。 即ち本発明では、 各試薬 の共存状態において R N Aからの c D N A合成、 2本鎖 DN Aの合成、 2 本鎖 D N Aからの R N A合成という一連の現象が、 第 3のオリ ゴヌク レオ チド共存下で生じ、 R N Aの増加に比例して蛍光強度が増加する。
本発明で、 上記試薬 （A) 及び （E) に代えて試薬 （ J ) 及び （K) を 用いるのであれば、 前記試薬 （L) に代えて以下の （M) を用いることに よ り、 特定核酸を分析することが可能である。
(M) 標的 RNA中の特定塩基配列に同一な配列を有し、 該配列と相補 的配列を有する核酸と結合した場合に測定可能な蛍光信号を発するよう に 標識された第 3の 1本鎖ォリ ゴヌク レオチド。
試薬 U ) は、 5 ' 側末端から順に （ 1 ) D N A依存性 R N Aポリメ レ ースのプロモーター配列、 （ 2 ) 該プロモーターのェンハンサー配列及び ( 3 ) 前記 1本鎖 R N A中の特定塩基配列の 3 ' 側末端配列に相補的な配 列を有する第 1の 1本鎖オリゴヌ ク レオチ ドである。 該試薬の （ 3 ) の部 分は特定塩基配列中の 3 ' 側末端に相補結合し、 試薬 （A) を用いた場合 と同様に、 試薬 （B) および （C) および （D) の存在下で、 標的 R NA に相補的な c DN Aが合成される。 試薬 （K) は、 該 c DNAの特定塩基 配列中の 5 ' 側末端に相補的配列を有する 1本鎖オリ ゴヌクレオチドであ る。 該試薬 （K) は、 該 c DN Aの特定塩基配列中の 5 ' 側末端に相補的 結合をした後、 試薬 （C ) および試薬 （F) の共存によ り、 RNAポリメ レースのプロモ一ター配列を有する 2本鎖 D N Aが合成される。 更に該 2 本鎖 DNAは、 試薬 （G) 〜 （H) の共存によ り、 特定塩基配列に相補的 な第 2の 1本鎖 R N Aが合成される。 更に試薬 （ I ) を共存させることに よ り、 該 1本鎖 R N Aの合成量は飛躍的に増大する。
更に、該第 2の RN Aの 3 ' 側末端は試薬 （K) と相補結合し、試薬 （B) 〜 （D) の共存下で、 該第 2の R NAの第 2の c DN Aが合成される。 該 第 2の c D N Aは試薬 （ J ) の （ 3 ) 部分と相補結合し、 試薬 （ C ) およ び試薬（ F )によ り プロモータ ー配列を含有する 2本鎖 D N Aが合成され、 試薬 （G) 〜 （ I ) によ り該第 2の R N Aが合成される。 合成された特定 塩基配列に相補的な該第 2の R N Aは、 新たな 2本鎖 D N Aの合成源とな り、 一連の反応が繰り返し生じることによ り、 結果と して該第 2の R N A の量は飛躍的に増大する。
ここで得られた該第 2の R NAは、 標的 R N A中の特定塩基配列と相補 的な配列を有する。 特定塩基配列と同一な配列を有し、 かつインタ一カ レ 一夕一性蛍光色素で標識された第 3の 1本鎖ォリ ゴヌク レオチドである試 薬 （M) を共存させることによ り、 合成された該第 2の R N A量に比例し て蛍光強度が増加する。 本願発明における蛍光信号の測定は、 好ま し く は試薬 （A) 〜 （ I ) お よび試薬 （L) または試薬 （M) の添加直後から、 又は、 添加後所定時間 経過後から経時的に行う。 試薬試薬 （L ) 又は試薬 （M) の第 3の DNA は、 1本鎖 R N Aの合成過程において、 合成された R N Aと結合 · 解離を 繰り返すが、 結合時に測定される蛍光信号は各測定時における該 R N Aの 存在量を反映するため、 1本鎖 RN Aの増加する様子を経時的に追跡する ことが可能である。 なお、 測定自体は連続的なものであっても一定時間毎 の間欠的なものであっても良い。 また、 蛍光信号の測定装置は、 本願発明 の一部を構成しないが、 1本以上の反応管中の蛍光信号を連続的または一 定時間毎の間欠的に測定できる ものであれば如何なる装置を用いても良い 蛍光信号の測定時間は、 一定量の標的 R N Aを含んだ試験区の蛍光強度 が増加する時間が標的 R N Aを含まない試験区と有為に差の見られる時間 を含み、 一定量の標的 R N Aを含んだ試験区の蛍光強度がほぼ一定になる までの時間で、 概ね 4時間、 好適条件では 1時間である。
以下、 本発明を実施例によ り更に詳細に説明する力 本発明はこれら実 施例によ り限定されるものではない。
実施例 1
標的核酸増幅における I T P添加 （終濃度 0. l mM〜 2. 0 mM) の 効果を検討した。
( 1 ) ヒ ト C型肝炎ゥィルス R N Aの塩基番号 1 1 3〜 2 6 7 (加藤ら、 P r o c . N a t l . S c i .、 U S A、 1 9 9 0年、 8 7、 9 5 2 4〜 9 5 2 8 ) を標準 RN A試料と し、 2 6 0 n mの紫外部吸収によ り定量後、 R NA希釈液 （ 1 0 mM T r i s— H C 1 ( p H 8. 0 ), 0. I mM E DTA、 0. 5 U/," 1 R N a s e I n h i b i t o r ) を用い 1 06、 1 04コピー / 4 / 1 となるよう希釈した。 コ ン ト ロール試験区 （ N e g a ) には、 前記 R N A希釈液のみを用いた。 ( 2 ) 以下の組成の反応液 1 5. 2 μ 1 を市販の 0. 5 m l容 P C R用 チューブ (商品名 ； G e n e Am p T h i n— Wa l l e d R e a c t i o n T u b e s、 パーキンエルマ一社製） に分注し、 これに上記 R N A試料 4 1 を添加後、 ミ ネラルオイル 1 0 0 1 を重層した。
反応液の組成
5 9. 2 mM T r i s—酢酸緩衝液 （ p H 8. 1 )
1 3. 2 mM 酢酸マグネシウム
1 2 3. 7 mM 酢酸力 リ ウム
1 5. 8 % ソルビ トール
1 9. 7 mM D T T
各 1. O mMの d A T P、 d C T P、 d G T P、 d T T P
各 2. O mMの A T P、 C T P、 G T P、 U T P
各種濃度 （ 0. 2 mM、 1 . 0 mM、 2. O mM, 3. O mM, 4. 0 mM) の I T P
0. 4 Mの第 1のオリ ゴヌ ク レオチ ド （配列番号 1 )
0. 4 ,« Mの S P 6 プロモーター配列を有する第 2のオリゴヌクレ ォチ ド （配列番号 2 ；該配列中の 5 ' 端 1番目の 「A」から 1 7番目の 「 A」 までの部分は S P 6プロモータ配列であり、 また 1 8番目の 「 G」 から 2 5番目の 「A」 までの部分はェンハンサー配列である）
0. 0 4 9 / Mのイ ンターカ レー夕一性蛍光色素 （図 1 ) で標識さ れた第 3のオリゴヌ ク レオチ ド （配列番号 3 ； 該配列中の 5 ' 端から 5番 目の 「C」 と 6番目の 「G」 の間にイ ンターカレーター性蛍光色素が標識 されており、 またその 3， 末端はグリ コール酸で修飾されている、 以後、 Y 0 _ 2 7 1 と略する）
6 0ユニッ ト リボヌ ク レエース イ ン ヒ ビター （宝酒造 （株） 製） 3. 9 % DM S 0 容量調製用蒸留水
( 3 ) 上記の反応液を、 5 0 °Cで 5分間保温後、 以下の組成の酵素液 1 0. 8 a 1 を添加した。
酵素液の組成
8 3. 3 mM T r i s 酢酸緩衝液 （ p H 8. 1 )
1 8. 5 mM 酢酸マグネシウム
1 7 4. 1 mM 酢酸力リウム
2 2. 2 % ソルビ トール
4 2ユニッ ト AM V逆転写酵素 （宝酒造 （株） 製）
1 7 1ユニッ ト S P 6 RNAポリ メ レース （宝酒造 （株） 製）
Ζ μ g 牛血清アルブミ ン
容量調製用蒸留水
(4 ) 引き続き P C Rチューブを直接測定可能な温調機能付蛍光分光光 度計を用い、 5 0 °Cに保温して、 励起波長 4 9 0 n m、 蛍光波長 5 1 0 η mで、 P C Rチューブ内の反応溶液の蛍光強度を 5分間隔で測定した。 酵素液添加時の時刻を 0分と して、 サンプルの蛍光強度比 （所定時刻の 蛍光強度値 ÷バックグラン ドの蛍光強度値） の経時変化を図 2 (RNAサ ンプル濃度 1 06コ ピー/テス ト、 I T P終濃度 0. I mM〜 ； I . 0 mM)、 図 3 (R N Aサンプル濃度 1 04コピー Zテス ト、 1 丁 終濃度 1. 0 m M〜 2. 0 mM) に示した。
これらのこ とから、 RNAポリ メ レ一スと して S P 6 RNAポリ メ レ —スを用いた場合、 終濃度が 0. 5 mM〜 2 mMとなる I T Pを反応系内 に添加するこ とによつて特定核酸の増幅効率は飛躍的に向上することが示 された。 また、 陰性 （N e g a ) のと きには蛍光強度の増加が見られてい ないことから、 蛍光強度の増加は特定塩基配列の増加を反映していること が示された。 実施例 2
標的核酸増幅における I T P添加 （終濃度 0 . 5 mM〜 3 . 0 mM) の 効果を検討した。
( 1 ) 前記ヒ ト C型肝炎ウィルス R N Aを標準 R N A試料と し、 2 6 0 n mの紫外部吸収によ り定量後、 R N A希釈液 （ 1 0 mM T r i s - H C I ( H 8 . 0 )、 0 . 1 mM E D T A、 0 . 5 U Z 1 R N a s e I n h i b i t o r ) を用い 1 0 6コピー Z 2 . 5 μ 1 となるよう希 釈した。 コン トロール試験区 （N e g a ) には、 希釈液のみを用いた。
( 2 ) 以下の組成の反応液 2 1 . 0 1 を市販の 0 . 5 m 1容 P C R用 チューブ （商品名 ； G e n e Am p T h i n — W a l l e d R e a c t i o n T u b e s、 ノ ーキンエルマ一社製） に分注し、 これに上記 R N A試料 2 . 5 1 を添加後、 ミネラルオイル 1 0 0 1 を重層した。
反応液の組成
4 7. 6 mM T r i s —塩酸緩衝液 （ p H 8 . 5 )
1 7 . 1 mM 塩化マグネシゥム
1 8 5 . 7 mM 塩化力リウム
1 . 4 mM D T T
各 0 . 7 mMの d A T P、 d C T P、 d G T P、 d T T P
各 5 . 4 mMの A T P、 C T P、 G T P、 U T P
0 . 7、 1 . 4、 2 . 1 、 2 . 9、 3 . 6 、 3 . 9又は 4 . 3 mM の I T P
1 . 1 Mの第 1 のオリ ゴヌ ク レオチ ド （配列番号 4 )
1 . 1 ," Mの T 7プロモータ配列を有する第 2のオリ ゴヌクレオチ ド （配列番号 5 ； 該配列中の 5 ' 端 1番目の 「A」 から 2 2番目の 「A」 までの部分は T 7プロモータ配列であり、 また 2 3番目の 「 G」 から 2 8 番目の 「A」 までの部分はェンハンサー配列である） 0 . 0 4 9 Mのイ ンターカ レー夕一性蛍光色素 （図 1 ) で標識さ れた第 3のオリゴヌ ク レオチ ド （配列番号 6 ； 該配列中の 5 ' 端 1 4番目 の 「A」 と 1 5番目の 「C」 の間にイ ンターカレータ一性蛍光色素が標識 されており、 またその 3 ' 末端はグリ コール酸で修飾されている、 以後 Y 0— H C 1 b と略する）
4 0ユニッ ト リ ボヌ ク レエース イ ン ヒ ビター （宝酒造 （株） 製）
2 1. 4 % DM S 0
容量調製用蒸留水
( 3 ) 上記の反応液を、 4 1 °Cで 5分間保温後、 以下の組成の酵素液 6.
5 μ 1 を添加した。
酵素液の組成
3 0. 8 mM T r i s—塩酸緩衝液 （ p H 8. 5 )
7. 8 % ソルビ トール
2 9ユニッ ト A MV逆転写酵素 （宝酒造 （株） 製）
1 4 2ユニッ ト T 7 R NAポリメ レース （東洋紡 （株） 製）
？ > μ g 牛血清アルブミ ン
容量調製用蒸留水
( 4 ) 引き続き P C Rチューブを直接測定可能な温調機能付蛍光分光光 度計を用い、 4 1 °Cに保温して、 励起波長 4 9 0 n m、 蛍光波長 5 1 0 η mで、 P C Rチューブ内の反応溶液の蛍光強度を 5分間隔で測定した。
酵素液添加時の時刻を 0分と して、 サンプルの蛍光強度比 （所定時刻の 蛍光強度値 ÷バックグラ ン ドの蛍光強度値） の経時変化を図 4 (R NAサ ンプル濃度 1 0 6コピー/テス ト、 1 丁？終濃度 0. 5 mM〜 3. 0 mM) に示した。
これよ り、 T 7 R N Aポリメ レースを用いた場合、 I T Pを終濃度力？ 0. 5 mMとなるよう に添加した場合よ り 1 . 0 mM〜 2. 7 mMとなる よう に添加した場合の方が特定核酸の増幅効率は飛躍的に向上することが 示された c また、 陰性 （N e g a ) の場合には蛍光強度の増加が見られて いないことから、 特定塩基配列の RN Aを検出していることが示された。 実施例 3
インタ一カレーター性蛍光色素 （図 1 ) で標識された第 3のオリ ゴヌク レオチドおよび第 4のオリ ゴヌクレオチ ドによる特異産物の検出を検討し た。
( 1 ) 前記標準 R NA (H C V - R N A) と合成 R NA (WQ— R NA、 配列番号 7 ) を、 R N A希釈液 （ 1 0 mM T r i s—H C l ( p H 8. 0 )、 0. 1 mM E D TA、 0. 5 UZ/ l R N a s e I n h i b i t o r ) を用い、 1 05コピー Z 4 / l となるよう希釈した。 コン トロー ル試験区 （N e g a ) には、 希釈液のみを用いた。
( 2 ) 以下の RN Aサンプル、 イ ンターカ レーター性蛍光色素 （図 1 ) で標識されたオリゴヌクレオチ ドの組み合わせになるよう に （ 3 ) で溶液 を調整した。
R Ν Αサンプル 蛍光色素標識ォリ ゴヌ ク レオチ ド
① H C V R N A 第 3オリ ゴヌ ク レオチ ド （Y O— 2 7 1 )
② WQ— RNA 第 3オリ ゴヌ ク レオチ ド （Y O— 2 7 1 )
③ N e g a 第 3オリ ゴヌ ク レオチ ド （ Y 0— 2 7 1 )
④ WQ— RNA 第 4オリ ゴヌ ク レオチ ド （Y O— WT)
⑤ H C V R A 第 4オリ ゴヌ ク レオチ ド （YO—WT)
⑥ N e g a 第 4オリ ゴヌ ク レオチ ド （Y〇一 WT)
( 3 ) 以下の組成の反応液 1 5. 2 ," 1 を市販の 0. 5 :« 1容？じ 1^用 チューブ 商品名 ； G e n e Amp T h i n -W a i l e d R e a c t i o n T u b e s、 パーキンエルマ一社製） に分注し、 これに上記 R N A試料 4 1 を添加後、 ミ ネラルオイル 1 0 Q μ 1 を重層した。 反応液の組成
5 9. 2 mM T r i s —酢酸緩衝液 （ p H8. 1 )
1 3. 2 mM 酢酸マグネシゥム
1 2 3. 7 mM 酢酸力 リ ウム
1 5. 8 % ソルビ トール
1 9. 7 mM D T T
各 1. O mMの d A T P、 d C T P、 d G T P、 d T T P
各 2. O mMの AT P、 C T P、 G T P、 U T P
2. 5 mMの I T P
0. 4 Mの第 1 のオリ ゴヌ ク レオチ ド （配列番号 1 )
0. 4〃 Μの S P 6プロモータ配列を有する第 2のオリ ゴヌクレオ チド （配列番号 2 )
0. 0 4 9 Mのイ ンターカ レ一ター性蛍光色素 （図 1 ) で標識さ れた第 3のオリ ゴヌ ク レオチ ド （Y 0— 2 7 1 ) 又はイ ンターカ レーター 性蛍光色素 （図 1 ) で標識された、 Y 0— 2 7 1 とは異なる第 4のオリ ゴ ヌ ク レオチ ド （配列番号 8 ； 該配列中の 5 ' 端 1 0番目の 「A」 と 1 1番 目の 「G」 の間にイ ン タ一カ レーター性蛍光色素が標識されており 、 その 3 ' 末端はグリコール酸で修飾されている、 以後 Y 0— W Tと略する）
6 0ユニッ ト リ ボヌ ク レエース イ ンヒ ビター
3. 9 % DM S 0
容量調製用蒸留水
( 4 ) 上記の反応液を、 5 0 で 5分間保温後、 以下の組成の酵素液 1
0 . 8 μ I を添加した。
酵素液の組成
8 3. 3 mM T r 1 s 一酢酸緩衝液 （ p H 8. 1 )
1 8. 5 mM 酢酸マグネシゥム 1 7 4 . 1 mM 酢酸力 リ ウム
2 2 . 2 % ソルビ トール
4 2ユニッ ト AM V逆転写酵素 （宝酒造 （株） 製）
1 7 1ユニッ ト S P 6 R N Aポリメ レース （宝酒造 （株） 製）
3 μ g 牛血清アルブミ ン
容量調製用蒸留水
( 5 ) 引き続き P C Rチューブを直接測定可能な温調機能付蛍光分光光 度計を用い、 5 0 °Cに保温して、 励起波長 4 9 0 n m、 蛍光波長 5 1 0 η mで、 P C Rチューブ内の反応溶液の蛍光強度を 5分間隔で測定した。
酵素液添加時の時刻を 0分と して、 各サンプルの蛍光強度比 （所定時刻 の蛍光強度値 ÷バックグラン ドの蛍光強度値） の経時変化を求めた結果を 図 5に、 増幅後のサンプルの 4 %ァガロース電気泳動の結果を図 6 に示し た。 図 5 よ り標的 R N Aと、 その相補的な蛍光色素で標識したオリゴヌ ク レオチ ド （H C Vと Y O _ 2 7 1 、 WQ と Y O— WT ) を用いた時のみ、 蛍光増加が観測された。図 6 よ り、 R Ν Α試料が存在していたサンプル（レ ーン 1 、 2、 4、 5 ) は特異的なバン ドが検出された。 以上のことよ り、 I T P添加した際にも、 得られた蛍光強度は特異的産物の増幅のみを反映 しているこ とが示された。
実施例 4
実施例 2の反応条件を更に最適化した条件において、 標的核酸増幅にお ける添加 I T P濃度 （終濃度 2 . 8 mM〜 4 . 4 mM) の最適値を検討し た。
( 1 ) ヒ ト C型肝炎ウィ ルス R N Aの塩基番号 1 〜 1 4 8 7 (加藤ら、 P r 0 c . N a t 1 . S c i .、 U S A、 1 9 9 0年、 8 7、 9 5 2 4 〜 9 5 2 8 ) を含む全長 1 5 4 9 m e rのリ コンビナン トの R N Aを標準 R N A試料と し、 2 6 0 n mの紫外部吸収によ り定量後、 R N A希釈液 （ 1 0 mM T r i s - H C 1 ( p H 8. 0 ), 0. I mM E D TA、 0. 5 UZ," 1 R N a s e I n h i b i t o r , 5. 0 mM DTT) を用 い 1 05コピー / 5 i となるよう希釈した。 コ ン ト ロール試験区 （ N e g a ) には、 前記 R N A希釈液のみを用いた。
( 2 ) 以下の組成の反応液 2 0. を市販の 0. 5 m 1容 P C R用 チューブ （商品名 ； G e n e Amp T h i n— Wa l l e d R e a c t i o n T u b e s、 ノ、 'ーキンエルマ一社製） に分注し、 これに上記 R N A試料 5 μ 1 を添加した。
反応液の組成 （濃度は酵素溶液添加後の反応系の最終濃度）
6 0. 0 mM T r i s—塩酸緩衝液 （pH8. 6 )
1 3. 0 mM 塩化マグネシウム
9 0. 0 mM 塩化力 リ ウム
1. 0 mM DTT
各 0. 2 5 mM d AT P、 d C T P、 d GT P、 d TT P 各 3. 0 mM AT P、 C T P、 UT P、 GT P
2. 8、 3. 2、 3. 6、 4. 0、 4. 4 mMの I T P
1. 0 / M 第 1のオリゴヌク レオチ ド （配列番号 1 )
1. 0 M 第 2のオリ ゴヌク レオチ ド （配列番号 9 ； 該配列中の 5 ' 端 1番目の 「A」 から 2 8番目の 「A」 までの部分は T 7ポリメ レー スのプロモータ配列と して付加した配列である。）
0. 1 6 μ Μの切断用ォリ ゴヌク レオチ ド （配列番号 1 0 ； 標的 R Ν Αを特定配列の 5 '末端で切断するためのオリ ゴヌク レオチド、 特定配列 の 5 '末端に重複して隣接する領域に対して相補的な配列を有し、 標的 R N Aと RNA— DNA 2本鎖を形成した後、 逆転写酵素の R N a s e H 活性によ り RNA— DNA 2本鎖の RNAを切断するためのオリゴヌク レオチ ド、 オリ ゴヌク レオチ ドプライマーと して機能しないよう に 3 '末端 はァミ ノ化処理されている）
2 5 . 0 n Mのィ ン ターカ レー夕一性蛍光色素 （図 1 ) で標識され たオリ ゴヌク レオチ ドプローブ （ Y 0— 2 7 1 ) (配列番号 3 ； 3 ' 末端は グリ コール酸で修飾されている）
3 9ユニッ ト リボヌ ク レエース イ ン ヒ ビター （宝酒造 （株） 製） 1 5 . 0 % D M S 0
容量調製用蒸留水
( 3 ) 上記の反応液を、 4 1 °Cで 5分間保温後、 以下の組成で、 かつ、 予め 4 1 °Cで 2分間保温した酵素液 4 . 2 μ 1 を添加した。
酵素液の組成 （反応時の最終濃度）
1 . 7 % ソルビ トール
8ユニッ ト AM V逆転写酵素 （宝酒造 （株） 製）
1 4 2ユニッ ト Τ 7 R N Aポリ メ レ一ス （ G I B C O社製）
3 μ g 牛血清アルブミ ン
容量調製用蒸留水
( 4 ) 引き続き P C Rチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光 光度計を用い、 4 1 °Cに保温して、 励起波長 4 7 0 n m、 蛍光波長 5 1 0 n mで、 反応溶液の蛍光強度を経時的に測定した。
酵素添加時の時刻を 0分と して、 サンプルの蛍光強度比 （所定時刻の蛍 光強度値 ÷バックグラン ドの蛍光強度値） の経時変化を図 7に示した。 ま た、 蛍光強度比が 1 . 2 を超えた時間を立上り時間と し、 立上り時間と I T P濃度との関係を図 8に示した。
図 7、 図 8 よ り、 立上り時間が最も早く なる I T Pの最終濃度は 3 . 2 mMから 4 . 4 mMに最適値があることが示された。 このよう に、 好適な 条件では、 I T Pを添加するこ と によ って、 1 0 5コピー/テス トの R N Aが 1 7分で検出され、 高効率な増幅系の構築ができたことが示された。 陰性 （N e g a ) のと きには蛍光強度の増加が見られていないことから、 特定塩基配列の R N Aを検出していることが示された。
産業上の利用可能性
以上の説明から明らかなように、 本発明によれば、 試料中の特定塩基配 列を含む 1本鎖 R N Aについて、 反応液を急激に昇温 · 降温するという操 作を繰り返すことなく、 概ね一定温度で、 反応開始時に行う 1段階の手動 操作のみで、 かつ、 迅速に試料中に元来存在した特定 R N A配列を増幅す る方法において、 ITPを添加することによつて増幅効率を飛躍的に向上さ せるこ とが可能となる。
また、 本発明では、 試料中の標的 R N Aをも と にして、 D N A依存性R N Aポリメ レースのプロモーター領域を末端にもつ 2本鎖 D N Aが合成さ れ、 これが多量の 1本鎖 R N Aの合成源になり、 さらに合成された 1本鎖 R N A量は飛躍的に増大し、 イ ン タ ーカレータ一性蛍光色素で標識された プロ一ブが、 生成した 1本鎖 R N Aと相補結合するこ とによる蛍光増加を 測定する工程において、 蛍光強度が増加する過程を解析するこ と によ り、 簡便かつ、 迅速に初期 R N A量を決定する方法を提供することができる。

Claims

請求の範囲
1. 特定塩基配列を含む試料中の標的 R N Aを铸型と して、 プロモーター 配列を有し前記特定塩基配列又は前記特定塩基配列と相補的な配列からな る R N Aを転写可能な 2本鎖 D N Aを生成し、 R N Aポリ メ レースによつ て前記特定塩基配列又は前記特定塩基配列に相補的な配列からなる R N A 転写産物を生成し、 更に、 該 R N A転写産物を铸型と して前記 2本鎖 DN Aを生成する工程からなる R N A増幅工程において、 R N Aポリ メ レース の基質と してアデノ シン三リ ン酸、ゥ リ ジン三リ ン酸、シチジン三リ ン酸、 グァノ シン三リ ン酸に加え、 イ ノ シン三リ ン酸を添加する、 前記標的 R N Aの増幅方法。
2. 前記増幅工程において、 R N Aポリ メ レース と してファージ S P 6の R N Aポリ メ レースを用い、 イ ノシン三リ ン酸を終濃度が 0. 5 m M〜 2 mMの範囲となる よ う に添加するこ と を特徴とする、 請求項 1 に記載の増 幅方法。
3. 添加するイ ノ シン三リ ン酸の終濃度と、 それ以外のリボヌ ク レオシ ド 三リ ン酸 （アデノ シン三リ ン酸、 ゥ リ ジン三リ ン酸、 シチジン三リ ン酸及 びグアノ シン三リ ン酸） の終濃度の比率が 0. 5対 1 . 0〜 1 . 5対 1. 0の範囲であるこ と を特徴とする請求項 2 に記載の増幅方法。
4. 前記増幅工程において、 少な く と も、 ト リ ス塩酸緩衝液 （ p H 8. 5〜 8. 9 ) の終濃度が 2 0 mM〜 5 0 mM、 塩化マグネシウムの終濃度が 1 2 mM〜 2 0 mM、 リ ボヌク レオシ ド三リ ン酸 （アデノ シン三リ ン酸、 ゥ リ ジ ン三リ ン酸、 シチジン三リ ン酸及びグァノ シン三リ ン酸） の終濃度が 3.
5 mM〜 5. 0 mM、 R N Aポリ メ レース と してフ ァージ T 7の R N Aポリ メ レ一スを含み、 イ ノ シン三リ ン酸を終濃度が 1 . 0 mM〜 2. 7 mMの 範囲となる よ う に添加する こ と を特徴とする、請求項 1 に記載の増幅方法。 5. 添加するイ ノ シン三リ ン酸の終濃度と、 それ以外のリ ボヌ ク レオシ ド 三リ ン酸 （アデノ シン三リ ン酸、 ゥ リ ジン三リ ン酸、 シチジン三リ ン酸及 びグァノシン三リ ン酸） の終濃度の比率が 0. 3対 1. 0〜 0. 7対 1. 0の範囲であることを特徴とする請求項 4に記載の増幅方法。
6. 前記増幅工程において、 少な く と も、 ト リ ス塩酸緩衝液 （ pH8. 5〜 8. 9 ) の終濃度が 5 0 mM〜 8 0 mM、 塩化マグネシウムの終濃度が 1 2 mM〜 2 0 mM、 リボヌ ク レオシ ド三リ ン酸 （アデノ シン三リ ン酸、 ゥ リ ジ ン三リ ン酸、 シチジン三リ ン酸及びグアノシン三リン酸） の終濃度が 2 m M〜 3. 5 mM、 RNAポリ メ レース と してフ ァージ T 7の RNAポリ メ レースを含み、 イノシン三リ ン酸を終濃度が 3. 2 mM〜 4. 4 mMの範 囲となるよう に添加することを特徴とする、 請求項 1 に記載の増幅方法。
7. 添加するイノシン三リ ン酸の終濃度と、 それ以外のリボヌクレオシド ミリ ン酸 （アデノシン三リ ン酸、 ゥリジン三リ ン酸、 シチジン三リ ン酸及 びグアノシン三リ ン酸） の終濃度の比率が 1. 0対 1. 0〜 1. 0対 1.
5の範囲であることを特徴とする請求項 6に記載の増幅方法。
8. 前記 RN A増幅工程は、 特定塩基配列に相補的な配列を有するプライ マー及び特定塩基配列に相同的な配列を有するプライマ一 （ここで一方の プライマーは、 5， 側に R N Aポリメ レースのプロモーター配列を有する プロモータープライマーである） を用い、 標的 R NAを鍩型と して RN A 依存性 D N Aポリメ レースによ り 1本鎖 D N Aを生成し、 該 1本鎖 D N A を铸型と して DNA依存性 D N Aポリメ レースを用いることで、 特定塩基 配列又は特定塩基配列に相補的な配列からなる R N Aを転写可能なプロモ 一ター配列を有する 2本鎖 D N Aを生成すること、 そして、 該 2本鎖 DN Aが RN Aポリメ レース存在下で R N A転写産物を生成し、 該 RN A転写 産物が引き続き前記 R N A依存性 D N Aポリ メ レースによる 1本鎖 D N A 生成の铸型となるものであるこ とを特徴とする、 請求項 1 に記載の増幅方 法。
9 . 請求項 1 に記載の増幅工程をィンターカ レーター性蛍光色素で標識さ れたプロ一ブの存在下で実施し、 反応液の蛍光強度を経時的に測定するこ とからなる、 標的核酸の分析方法。
1 0 . 前記イ ン タ ーカ レーター性蛍光色素で標識されたプローブが、 R N A転写産物との枏補結合によって、 複合体を形成していない場合と比較し て蛍光特性が変化するものであることを特徴とする、 請求項 9に記載の分 析方法。
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