WO2000068663A1

WO2000068663A1 - Verfahren und vorrichtung zur probenaufnahme an kryosubstraten

Info

Publication number: WO2000068663A1
Application number: PCT/EP2000/004063
Authority: WO
Inventors: Günter FUHR; Rolf Hagedorn
Original assignee: Evotec Biosystems Ag
Priority date: 1999-05-07
Filing date: 2000-05-05
Publication date: 2000-11-16
Also published as: DE19921236A1; EP1177422A1; DE50008602D1; ATE282196T1; DE19921236C2; EP1177422B1; US6646238B1

Abstract

Zur Probenaufnahme an einem Kryosubstrat (100), auf dem jeweils an vorbestimmten Probenpositionen eine Vielzahl kryokonservierter Proben (300) angeordnet ist, werden einzelne Proben selektiv mechanisch oder thermisch vom Kryosubstrat (100) abgetrennt und zu einem Zielsubstrat (130) übertragen.

Description

Verfahren und Vorrichtung zur Probenaufnahme an

Kryosubstraten

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Probenaufnahme an Kryosubstraten, insbesondere ein Verfahren zur Übertragung von Proben im kryokonservierten oder aufgetauten Zustand von einem Kryosubstrat zu einem Zielsubstrat. Die Erfindung betrifft auch eine Vorrichtung zur Implementierung eines derartigen Verfahrens und ein zur Probenaufnahme funktioneil strukturiertes Kryosubstrat.

Der Betrieb von Kryobanken zur Konservierung von biologischem Zellmaterial ist m der Zellbiologie, Molekularbiologie oder Gentechnik allgemein bekannt. In einer Kryobank wird das Zellmaterial über Jahrzehnte verfugbar gehalten, wobei beispielsweise suspendierte Zellen m klemvolumigen, mit einer Kryoflussigkeit gefüllten Behaltern (Volumen im Bereich von 0.1 bis einige ml) eingefroren werden. Um die Lebensfähigkeit des Zellmaterials nach dem Auftauen zu gew hrleisten, wurden zahlreiche Prozeduren entwickelt, die sich beispielsweise auf den Zeitabiauf des Auftauens, Medienzugaben, Behalterformen und dgl . beziehen. Mit herkömmlichen Kryobanken werden beim Auftauen Uberlebensraten im Bereich weniger Prozent bis zu 90% erzielt. Obwohl dies bereits ein relativ gutes Ergebnis ist und Kryobanken weltweit Verbreitung gefunden haben, sind mit den bisher verbreiteten Kryokonservierungsprozeduren die folgenden Nachteile verbunden.

Die Lage einzelner Zellmaterialproben im Volumen der Kryoflus- sigkeit ist sowohl wahrend der Einfrier- als auch wahrend der Auftauprozeduren unbekannt. Die Materialproben sind im kryo- konservierten, ::erge:r _ renen Zustand nicr.t zugänglich. Es oe- stent jedoch ein Interesse αaran, beispielsweise einzelne Zellen vom kryo onservierten Material zu entnehmen, zu vermessen oder zu verandern. Um Zellen dennoch entnehmen zu können, muß die gesamte Probe aufgetaut werden. Dies erfordert eine aufwendige Nachkultivierung des Zellmateπals zum Ausgleich der Auftauverluste . Das kryoκonservιerte Material umfaßt dadurch im Zeitverlauf nicht mehr nur die ursprünglich konservierten Zellen, sondern ein Gemisch aus Tochterzellen der verschiedensten Generationen, wodurcn die Spezifitat und Reproduzierbarkeit von Zelluntersuchungen eingeschränkt wird. Um alle Materialproben in einem Kryooehalter dem gleichen Abkuhlverlauf auszusetzen, müssen extrem langsame Einfriervorgange vorgesehen werden, da die Abkuπlung von den Behalterwanden ausgeht und alle Proben im Kryovolumen annähernd den gleichen zeitlichen Temperaturverlauf erfahren sollen. Schließlich erschwert oder verhindert das Suspensionsmedium (Kryoflussigkeit ) die Vermessung und Bearbeitung einzelner Zellen bei tiefen Temperaturen.

Es besteht ein Interesse an neuen Kryokonservierungstechniken zur Überwindung der genannten Nachteile und zur Erschließung neuer Felder für e Zellkonservierung, insbesondere da die Untersuchungen m der Biotechnologie, Gentechnik oder Medizin zunehmend auf Einzelzellen gerichtet sind, wie z.B. bei der Hybridoma-Zellprodukticn im Zusammenhang mit der Tumorbe- kampfung, der Stammzellenkultur und der Embryogenese . Bei der Entwicklung neuer KryoKonservierungstechniken geht man von den folgenden Kenntnissen und Überlegungen aus.

Aus pnysikalischer und auch physiologischer Sicht befindet sich eine bei -196°S eingefrorene Zelle im Zustand eines Fest- korpers. Die Stoffwecnselprozesse sind bis zur molekularen Ebene vollständig zum Stillstand gekommen. Zeilveranderungen ergeben sicn lediσiicn αurch langsame Umstrukturierungen (z.B. durch Eiskristallwacnstum bei Temperaturen oberhalo -60°C) und durch Schädigung aufgrund kosmischer Strahlung. Letztere besitzt allerdings eine für praktische Anwendungen unkritische Rate von rd. 90% Schädigung nach 30 000 Jahren. Im tiefgefrorenen Zustand sollten sicn daher Zellen cnne Zeitdruck und mit höchster Präzision vermessen, behandeln, verandern, sortieren und mechanisch robust anderweitig manipulieren lassen. Dies setzt allerdings die individuelle Handhabbarkeit der Zellen im Kryomedium und die Verfugßarkeit von Werkzeugen zur Zellmani- pulierung voraus.

Die physikalischen und chemischen Vorgange beim Einfrieren oder Auftauen biologischen Materials werden beispielsweise m der Publikation von F. Franks "Biophysics and biochemistry of low temperature and freezmg" m "Effects of Low Temperatures on Biological Membranes" (Herausgeber G. J. Morris et al . , Academic Press, London, 1981) oder P. Mazur m "Ann. N.Y. Acad. Sei.", Band 541, 1988, S. 514 ff. beschrieben. Entscheidend für eine Gefrierkonservierung über lange Zeiträume und ein Auftauen mit möglichst großer Uberlebensrate ist die Verhinderung der Bildung von mtra- oder extrazellularen Eis- kπstallen und einer übermäßigen Dehydrierung der Zellen. Dabei sind aus physikalischer Sicht die folgenden Besonderheiten beim Einfrieren und Auftauen zu beachten. Es ist zwar bekannt, sogenanntes vitriflziertes Wasser durch extrem hohe Einfriergeschwindigkeiten zu erzeugen, bei denen jegliche Eiskristall- bildung unterbunden wird. Dies ist jedoch auf ein schonendes und lagedefiniertes Einfrieren von Zeilmaterial nicht anwendbar, da die Große der interessierenden biologischen Zellen und die Warmeleitung die Einfriergeschwindigkeit auf Werte unterhalb von einigen 10 000 Grad pro Sekunde oeschranken. Deshalb ist im mikroskopischen Maßstab und unter physiologischen Bedingungen m der Regel eine Entmischung, d.h. eine Bildung eu- tektischer Phasen, die auch reine Eisdomanen umfassen, beobacntbar. Zur Minimierung der Entmischung naben msoesonde- re zu Beginn der Abk hlung (bis -30°C) zellspeziflsche Einfrierprogramme die besten Ergebnisse geliefert (s. auch S. P. Leibo et al . in "Cryobiol.", Band 8, 1971, S. 447 ff.). In diesem Temperaturintervall haben sich Abkuhlraten von einigen Grad pro Minute günstiger als schnelle Temperatursprunge erwiesen. Es wird daher davon ausgegangen, daß die Abkuhl- und Auftauprozeduren mit einem biologisch bestimmten, zeitlichen Temperaturprofll durchzufuhren sind.

Sobald Temperaturen erreicht werden, bei denen die Eisbildung einsetzt, sind jedoch höhere Abkuhlraten sinnvoll, da damit das migratoπsche Wachstum großer Eisdomanen auf Kosten kleinerer verhindert werden kann. Bei Temperaturen unterhalb des Bereiches von -80°C erfolgt kein weiteres Eiskristallwachstum, so daß eine Zellagerung ber lange Zeiträume möglich ist. Üblicherweise erfolgt die Lagerung der Behalter mit Zellmate- rial, das m einer Kryoflussigkeit suspendiert ist, m flüssigen Stickstoff (bei -196°C) . Da die Probenbehalter verschlossen sind, ist kein direkter Kontakt mit der flussigen Kuhlphase gegeben. Für das Auftauen des Zellmatenals werden vergleichbare Temperaturablaufe eingestellt.

Abkuhlprozeduren sind auch aus der Praparation für elektronen- mikroskopische Aufnahmen bekannt (s. D. G. Robinson et al. in "Praparationsmethodik in der Elektronenmikros opie" , Springer- Verlag, Berlin, 1985) . Im Unterschied zur Kryokonservierung mit dem Ziel des Vitalitatserhalts der Zellen spielt bei der Elektronenmikroskopie die möglichst unveränderte molekulare Position der Zellkomponenten die entscheidende Rolle. Daher werden bei dieser Praparation besonders schnelle Einfriertechniken realisiert, die z.B. ein Einschießen der Probe in flussige oder unterkühlte Gase oder ein Emspruhen von Tropfen in eine unterkühlte Atmosphäre und Flüssigkeiten umfassen. Dabei werden Abkuhlraten von mehr als 10 000 Grad pro Sekunde er- reicht, die allerdings wegen des Zellvolumens, der endlichen

Wärmeleitfähigkeit und der Benetzbarkeit des Materials einen Grenzwert darstellen.

Ein generelles Problem bei der Kryokonservierung besteht darin, daß sich nicht alle Zellarten in gleicher Weise kryokon- servieren lassen. Insbesondere größere Objekte (Zellhaufen oder dgl . ) oder auch stark vakuolenhaltige Zellen, wie sie speziell bei pflanzlichem Probenmaterial auftreten, lassen sich nur schwer oder überhaupt nicht revitalisieren. Auf diese Probleme ist die Entwicklung neuer Mikromjektions- und Zell- handhabungstechniken sowie neuer Kryoprotektiva gerichtet. Eine von der oben erläuterten Konservierung m Behaltern abweichende Technik basiert auf dem Einfrieren bzw. Auftauen des zu konservierenden Zellmaterials m adharierter Form auf gekühlten Oberflachen (s. z.B. T. Ohno et al . m "Cryotechnol . " , Band 5, 1991, S. 273 ff.) .

Die Kryokonservierung an gekühlten Oberflachen ist zwar schwieriger zu handhaben als das Suspensionsprinzip, hat sich jedoch vorteilhaft bei der Untersuchung der bei der Kryokonservierung stattfindenden Prozesse und bei der Erzielung hoher Überlebensraten beim Auftauen erwiesen. Die Kryokonservierung auf Substratoberflachen erlaubt es, daß Randbedingungen der jeweiligen Prozedur, wie z.B. Oberflachentemperatur, Warmelei- tung, Zeil- oder Tropfengroße u. dgl., genauer und variabler als m der Suspension eines Kryomediums eingestellt und erfaßt werden können. Dies wird insbesondere bei der Kryomikroskopie ausgenutzt, wobei biologische Zellen, die in Losungsmitteltropfen eingeschlossen sind, auf tiefgekühlte Oberflachen aufgenebelt oder aufgesprüht werden (s. H. Plattner et al . m "Freeze-etchmg . Techniques and Application", Herausgeber E. L. Benedetti et al . , "Soc. Franc. Microsc. Electronique" , Paris 1973, S. 81 ff., und PCT/US94/01156) . Ein Nachteil der zunächst entwickelten Kryokonservierung an Substratoberflachen besteht darin, daß beim Aufnebeln oder Aufsprühen die Position und Anordnung der Zellen nicht steuerbar ist und daß sogar mehrere Tropfen- und Zellenlagen übereinander abgelegt werden.

Eine Verbesserung der Kryokonservierung auf Substratoberflachen wird m EP 804 073 beschrieben. Biologische Zellen werden von einer Umhullungslosung umgeben mit einer Mikrotropfen- schußeinrichtung m vorbestimter Weise auf temperierbaren Substraten plaziert. Die Mikrotropfenschußemπchtung, die nach Art eines Tintenstrahldruckers ansteuerbar ist, erlaubt eine hochgenaue und reproduzierbare Positionierung einzelner Materialproben auf dem Kryosubstrat. Aus EP 804 073 ist auch bekannt, das Kryosubstrat durch matrixartig angebrachte Ausnehmungen zu strukturieren, um bestimmte Prozeduren bei der Kryokonservierung bzw. beim Auftauen des Substrats zu ermöglichen. So sind die Ausnehmungen insbesondere für ein gerichtetes Ablegen der Zellen ausgelegt. Zur Bereitstellung von Testchips, mit denen die Wechselwirkung verschiedenartiger Zellen im aufgetauten Zustand untersucht werden sollen, werden verschiedene Zellarten m oder zwischen den Ausnehmungen abgelegt. Des weiteren ist aus EP 804 073 bekannt, an den Ausnehmungen Elektroden zur Implementierung hochfrequenter elektrischer Felder vorzusehen, unter deren Wirkung eine Untersuchung der Zellen im aufgetauten Zustand durchgeführt wird.

Die Kryokonservierung an gekühlten Oberflachen besitzt bisher den Nachteil, daß nach der Aufbringung auf das Kryosubstrat eine probenspezifische Handhabung einzelner Zellen nur im tiefgefrorenen oder aufgetauten Zustand am Kryosubstrat möglich war. Falls eine Bearbeitung im aufgetauten Zustand vorgesehen war, so mußte das gesamte Substrat erwärmt werden. Für eine Verbesserung der Untersuchungstechniken und eine erhöhte Ausnutzung kryokonservierter Probenbestande ist es jedoch wichtig, die einzelnen Materialproben einer spezifischen Handhabung zugänglich zu machen. Die Aufgabe der Erfindung besteht m der Schaffung eines verbesserten Verfahrens zur Probenaufnahme an Kryosubstraten, das insbesondere eine selektive Aufnahme vorbestimmter Proben oder Probengruppen von einem Kryosubstrat erlaubt. Die Aufgabe der Erfindung ist es auch, Vorrichtungen zur Implementierung eines derartigen Verfahrens anzugeben.

Diese Aufgaben werden durch ein Verfahren bzw. Vorrichtungen mit den Merkmalen gemäß den Patentanspr che 1, 11 bzw. 18 gelost. Vorteilhafte Aus fuhrungsformen und Verwendungen der Erfindung ergeben sich aus den abhangigen Ansprüchen.

Erfmdungsgemaß erfolgt an einem Kryosubstrat mit einer Vielzahl von Proben, die an vorbestimmten Probenpositionen angeordnet sind, eine vorbestimmte, selektive Probenaufnahme durch eine positionsspezifische, mechanische oder thermische Abtrennung der Proben vom Kryosubstrat und eine Übertragung der freigegebenen Proben auf ein Zielsubstrat. Unter Probenaufnahme wird hierbei allgemein ede Form der Auf- oder Entnahme von Proben, gegebenenfalls mit bestimmten Substratteilen, verstanden.

Als Kryosubstrat (oder: Tragersubstrat, Substrat) wird hier jede Einrichtung bezeichnet, die sich als Trager für an gekühlten Oberflachen eingefrorene Proben eignet. Es dient der Probenkonservierung oder -lagerung. Das Kryosubstrat besteht aus einem Tragermaterial zur linien- oder flachenformigen Probenanordnung mit einer unten im einzelnen erläuterten funktioneilen Oberflachenstrukturierung. Gemäß einer bevorzugten Ausfuhrungsform besteht das Tragermaterial aus einem inerten, mit an sich bekannten mechanischen oder chemischen Bearbeitungsmitteln strukturierbaren Material, wie z.B. Kunststoff, Keramik, Metall oder Halbleitermaterial . Das Kryosubstrat bildet vorzugsweise einen starren, flächigen, ebenen oder gekrümmten Korper, der m an sich bekannter Weise mit einer Temperierungseinrichtung verbunden ist. Alternativ kann das Kryosubstrat aber auch aus einem flexiblen, folienartigen Tragermaterial, z.B. aus Kunststoff, bestehen.

Das Tragermateπal ist mit der Oberflachenstrukturierung vorzugsweise emstuckig ausgebildet, kann aber auch bei bestimmten Ausfuhrungsformen eine Zusammensetzung aus den genannten Materialen umfassen. Diese Zusammensetzung kann beispielsweise ein elektrisch isolierendes Grundmaterial mit bestimmten Ober- flachenbeschichtungen, beispielsweise aus Metall, darstellen. Unter einer funktioneilen Oberflachenstrukturierung zur Realisierung der vorliegenden Erfindung wird allgemein jede Art der geometrischen oder stofflichen Veränderung des Kryosubstrats verstanden, durch die entsprechend den Probenpositionen auf dem Kryosubstrat örtlich begrenzte Ablagebereiche geschaffen werden, von denen die jeweilige Probe oder Proben selektiv abnehmbar sind, ohne daß das gesamte Kryosubstrat erwärmt werden muß. Die erfmdungsgemaße Probenaufnahme erfolgt demnach vorzugsweise an Kryosubstraten im tiefgekühlten Betriebszustand.

Das erfmdungsgemaße Verfahren kann mit beliebigen Proben implementiert werden, die tiefgefroren (z.B. bei der Temperatur von flussigem Stickstoff) auf einem Kryosubstrat angebracht sind. Vorzugsweise bestehen die Proben aus biologischen Materialien, wie z.B. biologische Zellen oder Zellgruppen oder Zellbestandteile, ggf. jeweils mit einem Umhullungsmedium. Die Erfindung ist aber auch mit synthetischen Materialien, wie z.B. Vesikeln, oder mit Zusammensetzungen aus biologischen und synthetischen Materialien anwendbar.

Die erfmdungsgemaße Probenaufnahme und -Übertragung erfolgt auf ein Zielsubstrat, mit dem allgemein ede Art einer Einrichtung zur weiteren Handhabung oder Manipulierung der Probe bezeichnet wird. Beim Zielsubstrat erfolgt beispielsweise eine Lagerung, eine mechanische oder chemische Bearbeitung oder eine Untersuchung der Probe. Das Zielsubstrat Kann somit auch ein Kryosubstrat eines weiteren Konservierungssystems sein.

Eine positionsselektive mechanische Abtrennung von Proben vom Kryosubstrat umfaßt ein Abtrennen vorbestimmter Ablageelemente mit den jeweiligen Proben oder Probengruppen vom Substrat. Diese Abtrennung erfolgt mit einem geeigneten Werkzeug vorzugsweise unter Beibehaltung des kryokonservierten Zustands der Proben. Es kann jedoch auch eine mechanische Abtrennung im aufgetauten Probenzustand vorgesehen sein. Eine thermische Abtrennung erfolgt gemäß einer ersten Aus fuhrungs form der Erfindung durch eine positionsspezifische Erhöhung der Substrattemperatur derart, daß die entsprechende Probe aufgetaut und mit einem geeigneten Werkzeug (z.B. Mikropipette, Pickmgsnadel ) abgenommen wird, oder daß positionsspezifisch Ablageelemente mit konservierten Proben thermisch vom Substrat abgetrennt werden. Zur thermischen Abtrennung wird eine elektrische Widerstandserwarmung oder eine Strahlungserwar ung (Laser, Mikrowellen oder dgl.) an der gewünschten Probenposition verwendet. Bei einer alternativen Form einer thermischen Probenabtrennung ist ein Anfrieren der gewünschten Proben an ein strukturiertes Werkzeug vorgesehen, das eine stärkere Haftung der angefrorenen Proben im Vergleich zur Haftung an einem Pro- bentrager bereitstellt.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Probenaufnahme- oder Probenhandhabungssystem zur Aufnahme und/oder Übertragung von Proben von einem Kryosubstrat auf ein Zielsubstrat, wobei ein derartiges System insbesondere ein funktionell strukturiertes Kryosubstrat, eine Abtrenneinrichtung und eine Steuereinrichtung umfaßt. Die Abtrenneinrichtung dient als Trenneinrichtung und/oder als Aufnehmer für die abgetrennte oder freigegebene Probe . Gemäß einem besonders wichtigen Gesichtspunkt der Erfindung wird ein Kryosubstrat mit einer funktionell strukturierten Oberflache ausgestattet, die eine Vielzahl von Ablageelementen (z.B. Ablageplatten, Ablagefolien) umfaßt, die zur Aufnahme jeweils einer Materialprobe und zur selektiven mechanischen oder thermischen Abtrennung der Probe, gegebenenfalls mit einem Teil des Ablageelements, vom Kryosubstrat ausgebildet sind. Die Dimensionierung der Ablageelemente ist anwendungsab- hangig gewählt. Ein Ablageelement kann charakteristische Dimensionen der Größenordnung von 1 cm" bis 1 mm oder auch darunter besitzen. Es kann auch die Abtrennung ganzer Probengruppen vom Kryosubstrat vorgesehen sein.

Die Erfindung besitzt den Vorteil, daß erstmalig die Beschrankungen der Kryokonservierung an temperierten Substratoberflachen überwunden und eine selektive Bearbeitung einzelner Proben ermöglicht werden. Damit wird die Effektivität der Emzel- zellenkryokonservierung wesentlich erhöht. Die Gestaltung eines erfmdungsgemaßen Kryosubstrats basiert auf an sich bekannten, gut beherrschbaren Struktuπerungsmethoden. Die Kryo- substrate können aus kostengünstigem Material als Einweg- Produkte hergestellt werden. Ein weiterer Vorteil betrifft die Automatisierungsfahigkeit des Gesamtsystems. Durch die Kombination der Probenaufnahme mit einem Bildverarbeitungssystem kann eine Probenubertragung von einem Kryosubstrat auf e n oder mehrere Zielsubstrate operatorunabhangig und automatisch durchgeführt werden.

Weitere Vorteile und Einzelheiten der Erfindung werden aus den im folgenden unter Bezug auf die beigefugten Zeichnungen beschriebenen Ausfuhrungsbeispielen ersichtlich. Es zeigen:

Fig. 1 eine schematische Übersichtsdarstellung einer erf dungsgemaßen Vorrichtung zur Probenaufnahme an Kryosubstraten, Fig. 2 em erfmdungsgemaßes Kryosubstrat mit mechanisch abtrennbaren Ablageelementen,

Fig. 3 eine vergoßerte Perspektivdarstellung eines

Ablageelements gemäß Fig. 2,

Fig. 4 eine Illustration der Übertragung einzelner

Proben von einem Kryosubstrat entsprechend einer Ausfuhrungsform des erfmdungsgemaßen Verfahrens,

Fig. 5 em weiteres erfmdungsgemaßes Kryosubstrat mit mechanisch abtrennbaren Ablageelementen,

Fig. 6 eine vergrößerte Perspektivansicht von vier Ablageelementen gemäß Fig. 5,

Fig. 7 em weiteres erfmdungsgemaßes Kryosubstrat, das zur simultanen Abtrennung einer Vielzahl von Proben ausgebildet ist,

Fig. 8 em weiteres erfmdungsgemaßes Kryosubstrat m Form einer flexiblen Folie,

Fig. 9 em weiteres erfmdungsgemaßes Kryosubstrat, das zur thermischen Probenabtrennung ausgebildet ist,

Fig. 10 eine vergrößerte Darstellung eines Heizelements gemäß Fig. 9, Fig. 11 eine Illustration einer weiteren Ausfuhrungsform der erfmdungsgemaßen Verfahrensweise bei Verwendung des Kryosubstrats gemäß Fig. 9,

Fig. 12 eine schematische Schnittansicht einer weiteren Aus fuhrungsform eines erfmdungs- gemaßen Kryosubstrats mit thermischer Abtrennung von Ablageelementen,

Fign. 13, 14 weitere Oberflachenstrukturierungen an

Kryosubstraten,

Fig. 15 eine schematische Schnittansicht eines erfmdungsgemaßen Kryosubstrats mit einzeln beweglichen Ablageelementen,

Fig. 16 Oberflachenstrukturen zur Beeinflussung der Haftfähigkeit der Proben an Kryosubstraten, und

Fig. 17 eine Illustration einer weiteren Verfahrensweise zur erfmdungsgemaßen Probenaufnahme .

Die Erfindung wird im folgenden unter Bezug auf die Handhabung von Proben beschrieben, die beispielhaft aus einer oder mehreren biologischen Zellen mit einem Umhullungslosungstropfen bestehen und bei der Temperatur des flüssigen Stickstoffs kryo- konserviert worden sind. Die Erfindung ist in entsprechender Weise mit den oben genannten weiteren Probenmaterialien lmple- mentierbar. Eine Beschrankung auf einen bestimmten Temperaturbereich oder em bestimmtes Temperaturregime beim Einfrieren, Lagern und Auftauen der Proben ist nicht gegeben. Einzelheiten dieser Prozeduren sind an sich bekannt und können vom Fachmann anwendungsabhangig realisiert werden.

Fig. 1 ist eine schematische Ubersichtsdarstellung einer er- fmdungsgemaßen Vorrichtung zur Probenaufnahme an einem Kryosubstrat. Die Vorrichtung umfaßt im einzelnen das Kryosubstrat 100 mit einer Vielzahl von Ablageelementen 200, die jeweils für eine kryofixierte Lagerung einer Probe 300 ausgelegt sind, eine Abtrenneinrichtung 400, eine Bildaufnahmeeinrichtung 500 und em Steuerungssystem 600. Das Kryosubstrat 100, dessen Gestaltungsformen im einzelnen unten erläutert werden, ist mit einem Kühl- bzw. Heizaggregat 101 m an sich bekannter Weise temperierbar und gegebenenfalls mit einem (nicht dargestellten) Mechanismus m eine Lagerungseinrichtung beweglich angeordnet. Die Abtrenneinrichtung 400 ist zum mechanischen oder thermischen Abtrennen von Proben vom Kryosubstrat 100 und zur Übertragung der abgetrennten Proben auf em oder mehrere Zielsubstrate 130 ausgelegt. Zur Bewegung der Abtrenneinrichtung 400 ist eine Antriebseinheit 401 vorgesehen. Anwendungsabhangig kann die Abtrenneinrichtung 400 jedoch auch manuell betätigt werden. Die Bereitstellung der Antriebseinheit 401 ist em fakultatives Merkmal der Erfindung, das jedoch insbesondere bei automatisierten Probenaufnahmevorgangen am Kryosubstrat mit Vorteil implementiert wird. Die Bildaufnahmeemrich- tung 500 ist zur Aufnahme einer Abbildung der Oberflache des Kryosubstrats 100 ausgebildet. Im Steuersystem 600 ist eine an sich bekannte Bildauswertung vorgesehen, mit der das aufgenommene Oberflachenbild m Bezug auf die Positionen der aufzunehmenden Proben ausgewertet wird. In Abhängigkeit von den ermittelten Probenpositionen kann dann die Ansteuerung der Antriebseinheit 401 erfolgen. Die Steuereinheit 600 ist ferner mit dem Kühl- bzw. Heizaggregat 101, dem Kryosubstrat 100 (bei thermischer Probenabtrennung) , einem Display 601 und gegebenenfalls mit den Zielsubstraten 130 verbunden. Anstelle oder zusätzlich zur Bildaufnahmeeinrichtung 500 kann em Beobach- tungssystem, z.B. em Mikroskop, zur visuellen Betrachtung der

Substratoberflache vorgesehen sein.

Gemäß einer bevorzugten Ausfuhrungsform der Erfindung ist mindestens eine Abtrenneinrichtung wie em Pipetten- oder Nadelkopf eines Pickmg-Roboters über dem Kryosubstrat verfahrbar und an den gewünschten Probenpositionen betatigbar. Es können auch eine Vielzahl von Abtrenneinrichtungen matrixartig wie eine Pipettenmatrix bei einem Pickmg-Roboter angeordnet und betätigt werden.

Eine erste Ausfuhrungs form des erf dungsgemaßen Kryosubstrats 100 ist vergrößert m schematischer Perspektivansicht m Fig. 2 dargestellt. Das Kryosubstrat 100 umfaßt einen Substratkorper 110 mit einer durch die Ablageelemente 200 gebildeten Oberflachenstrukturierung. Der Substratkorper 110 bildet einen starren, ebenen Korper und besteht aus Kunststoff (z.B. PMMA) , Keramik (z.B. Alummiumoxid und andere Sinterkeramiken), Metall (z.B. Titan, Silber) oder einem Halbleitermaterial (z.B. Silizium) . Keramik und Halbleitermateπalien besitzen den Vorteil guter thermischer Eigenschaften, wobei insbesondere für eine effektive Kühlung eine hohe Wärmeleitfähigkeit angestrebt wird.

Die Ablageelemente 200 sind matrixartig reihen- und spaltenweise angeordnet. Anwendungsabhangig sind abgewandelte Geometrien der Anordnung (z.B. kreisförmig, gruppenweise oder dgl.) implementierbar. Bei der dargestellten Ausfuhrungs form werden die Ablageelemente 200 durch Ablageplatten 210 gebildet. Einzelheiten einer Ablageplatte 210 sind m Fig. 3 illustriert.

Die Ablageplatten besitzen die Gestalt eines Stempels oder Pilzes und umfaßt einen vom Substratkorper 110 ausgehenden Trager 211 geringen Querschnitts, der auf seiner vom Substratkorper 210 abgewandten Seite e Ablageplattchen 212 größerer Querschnitts tragt. Das Ablageplattchen 212 besitzt eine mit- tig angeordnete Ausnehmung 213 zur Aufnahme der Probe 300, die im dargestellten Beispiel einen gefrorenen Umhullungslosungs- tropfen 310 mit einer Zelle 320 umfaßt. Das Bezugszeichen 321 bezieht sich auf den schematisch illustrierten Zellkern der Zelle 320.

Die Gestalt und Dimensionen der Ablageplatte 210 werden anwen- dungsabhangig, insbesondere unter Berücksichtigung der Gestalt der Abtrenneinrichtung (s. unten) gewählt. Der Trager 211 wird mit einem derart geringen Querschnitt ausgeführt, daß er beim erfmdungsgemaßen Abtrennen der Probe 300 vom Kryosubstrat eine mechanische Sollbrucnstelle bildet. Demgegenüber wird das Ablageplattchen 212 dicker und breiter ausgeführt, so daß beim Trennen des Tragers 211 keine Beschädigung des Ablageplatt- chens 212 erfolgt.

Das Ablageplattchen besitzt bei Verwendung einer gabelförmigen Abtrenneinrichtung (s. Fig. 4) vorzugsweise die dargestellte rechteckige Form. Es kann aber auch eine runde Form vorgesehen sein, insbesondere falls eine kapillarformige Abtrenneinrichtung zur Probenaufnahme verwendet wird.

Die Ablageelemente 200 werden vorzugsweise emstuckig mit dem Substratkorper 110 durch em geeignetes Strukturierungsverfah- ren ausgebildet. Bei einem Kryosubstrat auf Siliziumbasis wird dabei beispielsweise wie folgt vorgegangen. Zunächst wird der Substratkorper 110 mit einer Dicke von rd. 0.1 mm bis 1.5 mm, z.B. auf der Basis eines Wafer-Materials, gebildet und mit einer Sι0₂-Schιcht (Dicke rd. 0.1 μ bis 5 μm) versehen. Diese Sιθ2~Schιcht wird entsprechend den beabsichtigten Abstanden der Ablageplattchen 212 (s. Fig. 2) selektiv geatzt, so daß das Si-Material des Substratkorpers 110 entsprechend der Reihen- und Spaltenform zwischen den Ablageelementen 200 freiliegt. In diesen freiliegenden Bereichen erfolgt em Unteratzen der Deckschicht, so daß sich die dargestellte Stempelform ausbildet.

In Fig. 4 ist die erfmdungsgemaße Probenaufnahme vom Kryosubstrat 100 schematisch illustriert. Die ausschnittsweise dargestellte Abtrenneinrichtung 400 besitzt an ihrem zum Kryosubstrat 100 weisenden Ende einen Ausleger 410 mit einem gabelförmigen Trennwerkzeug 411. Die Abtrenneinrichtung 400 kann manuell oder mit der Antriebseinheit 401 (s. Fig. 1) m Bezug auf das Kryosubstrat 100 m allen drei Raumrichtungen verfahren werden. Der Ausleger 410 ist senkrecht oder schräg zur Substratoberflache ausgerichtet. Das Trennwerkzeug 411 erstreckt sich im wesentlichen parallel zur Substratoberflache und umfaßt zwei zinkenartige Vorsprunge, die dazu ausgebildet sind, jeweils eine Ablageplatte 210 zu untergreifen und bei Ausübung einer bestimmten Zug- oder Scherkraft vom Substratkorper 110 abzutrennen (abzubrechen) . Die Abtrennkraft kann wie dargestellt durch eine mechanische Hebelkraft oder alternativ auch durch Ausübung eines Unterdrucks auf das jeweilige Ablageelement, z.B. mit einer Mikropipette, erzeugt werden.

Im einzelnen erfolgt die Probenaufnahme mit den Schritten Anfahren der Abtrennvorrichtung 400 an die gewünschte Substrat- position (Pfeil A) , Abbrechen oder Abtrennen der Ablageplatte 210 (Pfeil B) , Übertragung der aufgenommenen Proben (mit dem Ablageelement) zum Zielsubstrat 130 (Pfeil C) und Lagerung und/oder weitere Manipulierung der Probe auf dem Zielsubstrat 130. Im Kryosubstrat 100' ergibt sich entsprechend der entnommenen Probe eine Lücke 113.

Damit die Probe 300 bei der Übertragung im kryokonservierten Zustand bleibt, kann vorgesehen sein, daß die Abtrenneinrichtung 400 selbst gekühlt ist und/oder die Übertragung unter Aufblasen eines kalten StickstoffStroms erfolgt. Bei einer abgewandelten (nicht dargestellten) Gestaltunα der Abtrennein- richtung 400 besitzt diese em hulsenformiges Trennwerkzeug

(z.B. Spitze einer Mikropipette) , das von oben über die gewünschte Ablageplatte 210 fahrt und diese durch eine geringfügige Scherbewegung abbricht.

Eine Abwandlung der m den Fign. 2 bis 4 erläuterten Aufnahme von Proben mit Teilen des Kryosubstrats ist durch die folgende, nicht dargestellte Gestaltung gegeben. Die funktionell strukturierte Oberflache des Kryosubstrats weist als Ablageelemente linien- oder matrixartig angeordnete Kunststoffolien- stucke auf, die jeweils wie em Klebestreifen flachig auf den Substratkorper aufgeklebt sind. Die Folienstucke besitzen eine anwendungsabhangig gewählte Große wie beispielsweise die Ablageplatten 210 gemäß Fig. 2. Zur Probenaufnahme wird em geeignetes Abstreifwerkzeug mit einer Schneide oder Klinge verwendet, die das gewünschte Folienstuck am Rand untergreift und mit der Probe vom Kryosubstrat abzieht. Die Folie ist mit einem geeigneten Klebstoff auf den Substratkorper geklebt. Em adharentes Anhaften der Folie ohne einen Klebstoff ist aber auch möglich. Alternativ kann auch der gesamte Substratkorper mit einer flachigen Folie bedeckt sein, von der zur selektiven Probenaufnahme einzelne Stucke ausgeschnitten werden, wie dies unter Bezug auf Fig. 8 erläutert wird.

Fig. 5 illustriert eine weitere Ausfuhrungsform eines erfin- dungsgemaßen Kryosubstrats 100 mit einem oberflachenstrukturierten Substratkorper 110, m dessen Oberflache derart reihenweise Ausnehmungen 112 mit keilförmigem Querschnitt emge- bzw. unteratzt sind, daß als Ablageplatten 210 freitragende Ablagezungen 214 gebildet werden. Jede Ablagezunge ist zur Aufnahme von einer oder (wie dargestellt) mehreren Proben 300 ausgebildet. Eine vergrößerte Darstellung der Ablagezungen 214 ist in Fig. 6 dargestellt. Jede Ablagezunge ist jeweils mit drei Ausnehmungen 213 strukturiert, m denen jeweils eine Zellprobe 320 angeordnet ist. Die Ablagezungen 214 besitzen an ihrem zum Substratkorper 110 weisenden Ende eine Sollbruchstelle, an der wiederum die Abtrennung bei Einsatz eines geeigneten Werkzeugs erfolgt. Die Abtrenneinrichtung ist m diesem Fall vorzugsweise wiederum mit einem gabelförmigen Trennwerkzeug oder auch mit einem Greif- oder Klemmwerkzeug oder einer Saugemπchtung zur Aufnahme der Ablagezungen 214 ausgestattet.

Die Herstellung eines Kryosubstrats entsprechend der m den Fign. 5 und 6 illustrierten Ausfuhrungsform erfolgt bei Einsatz von Halbleitermaterial wiederum vorzugsweise durch anisotropes Atzen der Ausnehmungen 112 (Unteratzen der Ablagezungen 214) .

Die Buchstaben A-D m Fig. 6 weisen auf eine Markierungsmog- lichkeit für die einzelnen Ablageelemente des Kryosubstrats hm. Die Markierung erleichtert die Orientierung des Operators bei der Betrachtung des Kryosubstrats durch em Mikroskop und gegebenenfalls auch eine Abbildungsauswertung m dem Steuersystem 600 (s. Fig. 1) .

Die gruppenweise Aufnahme jeweils einer Probe oder einer Mehrzahl von Proben von einem Kryosubstrat 100 ist m Fig. 7 m schematischer Seitenansicht (oberer Teil der Abbildung) und Draufsicht (unterer Teil der Abbildung) illustriert. Das Kryosubstrat 100, z.B. m Form eines Wafers tragt auf semer Oberflache eine Strukturierung m Form lmienhafter Verjüngungen 215, die die Substratoberflache m reihen- und spaltenweise angeordnete Segmente 216 unterteilen. Wiederum bilden die Verjüngungen 215 Sollbruchstellen, die e selektives Abtrennen von einzelnen Proben oder Probengruppen m Reihen- oder Spaltenanordnung erlauben. Die schwarz ausgefüllten Flachen illustrieren schematisch Vertiefungen 213 entsprechend den obengenannten Vertiefungen 213 der Ablageplattchen 212 bzw. der Ablagezungen 214. Jede Vertiefung 213 ist wiederum zur

Aufnahme einer Probe im kryokonservierten Zustand vorgesehen.

Die Ausbildung der Verjüngungen 215 erfolgt je nach Substrat- mateπal durch em geeignetes Struktuπerungsverfahren, z.B. durch Atzen, Fräsen oder dgl. Das Bezugszeichen 217 bezieht sich auf einen schematisch eingezeichneten Bereich, der für die Kryokonservierung auf dem Kryosubstrat 100 verwendet wird.

Eine weitere Ausfuhrungsform, bei der em mechanisches Abtrennen eines Substratteiles vorgesehen ist, auf dem eine Probe abgelegt ist, wird m Fig. 8 illustriert. Das Kryosubstrat 100 wird durch eine Substratfolie 120 gebildet. Die (nicht dargestellte) Oberflachenstrukturierung der Substratfolie 120 umfaßt an jeder vorgesehenen Probenposition eine kreis- oder rahmenformige Trennlinie, an der em bevorzugtes Durchtrennen der Substratfolie 120 erfolgt, und/oder em gittertormiges Markierungsnetz durch Aufdruck von Probenpositionen. Bei dieser Gestaltung ist zur erfmdungsgemaßen Probenaufnahme vorgesehen, mit der Abtrenneinrichtung 400 die Substratfolie 120 um die gewünschte Probe herum zu trennen und die Probe mit dem Ausschnitt der Substratfolie zum Zielsubstrat zu übertragen. Die Abtrenneinrichtung 400 ist eine Schneideinrichtung oder, wie beispielhaft dargestellt, em optisches Mittel m Form eines auf die Substratfolie 120 fokussierten Laserstrahls 413. Der Laserstrahl 413 erlaubt wie eine mechanische Schneidem- πchtung em Durchtrennen des Substrats entlang der Schnittlinie 121. Das ausgeschnittene Substratteil wird mit einem Aufnehmer, z.B. mit einer mit einem Unterdruck beaufschlagten Mikropipette, aufgenommen und zum Zielsubstrat übertragen.

Im folgenden wird unter Bezug auf die Fign. 9 bis 14 em Ausfuhrungsformen der erfmdungsgemaßen Probenaufnahme beschrieben, bei der eine thermische Abtrennung der gewünschten Proben (gegebenenfalls mit Teilen des Substrats) erfolgt. Dabei sind verschiedene Gestaltungen vorgesehen, die es erlauben, die

Proben m tiefgefrorenem Zustand oder auch im aufgetauten Zustand aufzunehmen.

Bei der Ausfuhrungsform gemäß Fig. 9 tragt das Kryosubstrat 100 Ablageelemente 200 m Form einer Vielzahl von reihen- und spaltenweise angeordneten Heizelementen 230, die jeweils einen Heizbereich 231, einen für alle Heizelemente 230 gemeinsam ausgeführten Masseanschluß 232 und einen Steueranschluß 233 aufweisen. Der Heizbereich 231, der Masseanschluß 232 und der Steueranschluß 233 sind m Fig. 10 vergrößert dargestellt. Diese Komponenten bilden auf der Oberflache der Kryosubstrats 100 wiederum eine funktionelle Strukturierung, bei der eine Probenablage an bestimmen Probenpositionen entsprechend der Lage der Heizbereiche 231 und eine thermische Probenabtrennung bei elektrischem Stromfluß durch das jeweilige Heizelemente 230 vorgesehen sind. Das Substratmaterial besteht beispielsweise aus Kunststoff oder Keramik. Die Heizelemente 230 können aus jedem geeigneten, vorzugsweise inerten leitfahigen Material (z.B. Platin) gebildet sein. Die reihenweise Massenan- schlusse 232 sind vorzugsweise über eine das gesamte Kryosubstrat 100 umgebende Masseleitung 234 elektrisch miteinander verbunden.

Jedes der Heizelemente 230 besitzt wiederum charakteristische Dimensionen im cm- bis mm-Bereich, kann aber auch wesentlich kleiner bis m den um-Bereich ausgeführt sein. Der jeweilige Heizbereich 231 wird durch einen schmalen, vorzugsweise aan- derformigen Leiterstreifen gebildet, der sich bei Stromdurchfluß zwischen dem Steueranschluß 233 und dem Masseanschluß 232 erwärmt. Der Steueranschluß 233 ist als Tastpad ausgeführt, das durch Aufsetzen einer beweglichen Elektrode (s. unten) mit einer Spannung zur Erzielung des gewünschten Heizstroms durch den Heizbereich 211 beaufschlagbar ist. Die selektive thermische Probenabtrennung ist auch m der schematischen Perspektivansicht gemäß Fig. 11 illustriert. Fig. 11 zeigt wiederum das Substrat 100 mit dem Substratkorper 110, der die reihen- und spaltenweise angeordneten Heizelemente 230 tragt. Die Masseanschlüsse 232 sind sämtlich mit dem Minus-Pol einer Heizstromquelle 421 verbunden. Der Plus-Pol der Heizstromquelle 421 ist mit einer Tastelektrode 422 der im übrigen nur schematisch gestrichelt dargestellten Abtrenneinrichtung 420 zur positionsselektiven thermischen Freigabe von Proben vom Kryosubstrat 100 verbunden. Die Tastelektrode 422 ist mit der Abtrenneinrichtung 420 oder getrennt von dieser m Bezug auf das Kryosubstrat 100 beweglich. Das Aufsetzen der Tastelektrode 422 auf jeweils einen Steueranschluß 234 eines Heizelements 230 liefert einen Stromfluß und damit eine Erwärmung des Heizbereiches 231, so daß die auf dem Heizbereich 231 positionierte Probe (nicht dargestellt) vom Substrat her teilweise oder vollständig auftaut und mit der Abtrenneinrichtung 420 aufgenommen werden kann. Diese besitzt vorzugsweise die Gestalt einer Mikropipette .

Das m Fig. 11 illustrierte Tastprinzip kann wie folgt modifiziert werden. Es kann vorgesehen sein, daß anstelle der einzelnen Tastspitze 422 eine Gruppe von Tastspitzen zur Freigabe einer Gruppen von Proben entsprechend einem vorbestimmten Muster aufgesetzt wird. Ferner kann anstelle des Tastprinzips em Steckerprinzip realisiert werden. Es ist auch möglich, für ede Heizelementreihe einen gemeinsamen, von den Anschlüssen der übrigen Reihen getrennten Massenanschluß und für jede Heizelementspalte einen gemeinsamen, von den Anschlüssen der übrigen Spalten getrennten Steueranschluß vorzusehen. Bei dieser Gestaltung erfolgt die Probenfreigabe derart, daß mit einer Steuereinrichtung die Heizstromquelle 421 mit einem Reihen-Spalten-Paar verbunden wird, dessen Kreuzungspunkt gerade der Position der gewünschten Probe entspricht. Fig. 12 stellt eine abσewandelte Ausfuhrungsform der erfm- dungsgemaßen thermische- Probenaufnahme dar, bei der jeweils mit der Probe auch em Teil des Ablageelements vom Kryosubstrat getrennt wird. Das Kryosubstrat 100 umfaßt den Substratkorper 110 und als Oberflachenstrukturierung die Ablageelemente 200 m Form von elektrisch ablösbaren Ablageplatten 220. Jede Ablageplatte 220 umfaßt einen Trager 221 und em Ablageplattchen 222. Das Ablageplattchen 222 ist wie bei den oben beschriebenen Ausfuhrungsformen mit einer Ausnehmung 223 zur Aufnahme der Probe 300 versehen. Jeder Trager 221 umfaßt em Trennelement 224 und ein Anschlußelement 225, das durch das Trennelement 224 vom Substratkorper 110 getrennt ist. Das Trennelement 224 besteht beispielsweise aus elektrisch leitfa- higen Bauteilen, das be Erwärmung infolge Stromdurchfluß schmilzt oder sich zersetzt oder zumindest eine Abtrennung des Ablageplattchens 222 vom Substratkorper 110 erlaubt.

Der Substratkorper 110 besteht vollständig oder teilweise aus Metall und ist mit einem elektrischen Anschluß 117 versehen, der substratseitig mit sämtlichen Trennelementen 224 elektrisch verbunden ist. Jedes Anschlußelement 225 ist mit einem eigenen elektrischen Steueranschluß 226 versehen. Wird nun em Anschlußpaar 117, 226 eines bestimmten Ablageelements 220 mit einer Spannung beaufschlagt, so bewirkt der Stromfluß durch das Trennelement 224 dessen Schmelze oder Erweichung, so daß das betroffene Ablageelement 200 mit einem geeigneten Werkzeug (s. beispielsweise Fig. 4) aufgenommen und zum Zielsubstrat transportiert werden kann. Dieses ist im unteren Teil von Fig. 12 illustriert.

Das Trennelement 224 besteht vorzugsweise aus einem sich durch den Stromfluß veränderndes (z.B. auflosendes) Material, wie z.B. e unedles Metall (Aluminium oder dgl.), em Gel etc. und besitzt eine Dicke von weniger als 0.5 mm. Der Vorteil der Anordnung gemäß Fig. 12 besteht darin, daß trotz der thermischen Probenaufnahme die Probe 300 im kryokon- servierten Zustand verbleiben kann.

Abwandlungen eines funktionellen Kryosubstrats mit ober- flachenintegrierten, entsprechend den Probenpositionen einzeln ansteuerbaren Heizelementen sind m den Fign. 13 und 14 m schematischer Draufsicht illustriert. Gemäß Fig. 13 tragt der Substratkorper 110 des Kryosubstrats 100 gerade Elektroden- Streifen 240, die abwechselnd Bereiche verminderter elektrischer Leitfähigkeit 241 und Bereiche erhöhter elektrischer Leitfähigkeit 242 umfassen. Die Elektrodenstreifen besitzen eine charakteristische Breite, die der typischen Querdimension der Ablageflache der kryokonservierten Proben entspricht. Die Proben 300 sind m den Bereichen 241 verminderter elektrischer Leitfähigkeit angeordnet. Die Bereiche erhöhter elektrischer Leitfähigkeit 242 hingegen bilden Tastanschlusse bzw. Emspei- sungspunkte für einen Heizstrom.

Mit zwei beweglichen Tastspitzen analog zu der Tastelektrode 422 m Fig. 10 oder mit einer geeigneten Leitungsbeschaltung ist zur erfmdungsgemaßen Probenaufnahme vorgesehen, jeweils zwei Bereiche erhöhter elektrischer Leitfähigkeit 242 mit einer Heizspannung zu beaufschlagen. Der Stromfluß zwischen den beiden angesteuerten Bereichen liefert eine Erwärmung im Bereich verminderter elektrischer Leitfähigkeit 241 zwischen den angesteuerten Bereichen 242, so daß die dort gelegene Probe freigegeben wird. Dabei können auch mehrere Probenbereiche eingeschlossen werden, wie dies durch die Pfeile 243, 244 illustriert ist, die zwei elektrische Tastelektroden darstellen, die jeweils mit den Anschlüssen einer Heizstromquelle verbunden sind. Damit ermöglicht die Streifengestaltung gemäß Fig. 13 auch die Freigabe von reihenweise angeordneten Probengruppen. Die Probenaufnahme erfolgt dann wiederum mit einem geeigneten Werkzeug, wie beispielsweise einer Mikropipette oder einer Pickmg-Nadel , an deren Spitze die Probe anhaftet.

Fig. 14 zeigt eine Abwandlung des dargestellten Prinzips der Ablage der Proben auf Substratbereichen geringerer elektrischer Leitfähigkeit, die elektrisch mit benachbarten Bereichen erhöhter elektrischer Leitfähigkeit verbunden sind, am Beispiel eines Kryosubstrats 100 mit einer Vielzahl von Durchbru- chen 115 im Substratkorper 100. Die Positionen der Durchbruche entsprechen den gewünschten Probenablagepositionen. Die Durchbruche 115 besitzen einen im Vergleich zu den charakteristischen Querschnittsdimensionen der abzulegenden Proben geringeren Durchmessers (z.B. zur Ablage biologischer Zellen geringer als 100 μm) . Auf beiden Seiten des Substratkorpers 100 sind die Durchbruche 115 mit einer Beschichtung versehen, die einen Bereich verminderter elektrischer Leitfähigkeit 246 bildet. Die Beschichtungen auf beiden Substratseiten sind elektrisch miteinander verbunden. Im übrigen ist der Substratkorper 100 auf beiden Seiten des Substrats mit einer Beschichtung versehen, die einen oder mehrere Bereiche erhöhter elektrischer Leitfähigkeit 247 bildet. Die Bereiche 247 erlauben eine An- steuerung einzelner Ablagepositionen (247a) oder von Probengruppen (247b) . Hierzu wird die elektrisch leitfahige, vorzugsweise metallische Beschichtung zur Bildung der Bereiche 247 an den gewünschten Positionen (z.B. bei 248) anwendungsab- hangig durchtrennt (Anbringung von schlitzförmigen Unterbrechungen o . dgl . ) .

Durch Beaufschlagung der auf der Substratruckseite durchgehenden Beschichtung hoher Leitfähigkeit einerseits und des gewünschten Bereiches 247 entsprechend einer vorbestimmten Probe mit einer elektrischen Heizspannung fließt über die sich erwärmenden Bereiche 246 der gewünschte Heizstrom, der em zumindest teilweise Antauen der Probe und damit deren Freigabe bewirkt . Eine weitere Ausfuhrungs form eines funktionell strukturierten Kryosubstrats 100 zur selektiven Probenentnahme ist vergrößert m schematischer Seitenansicht m Fig. 15 dargestellt. Der Substratkorper 110 des Kryosubstrats weist eine Vielzahl von Duchbruchen 115 auf, die entsprechend der gewünschten Probenablage z.B. matrixartig reihen- und spaltenweise angeordnet sind. Die Ablageelemente 200 werden bei dieser Aus fuhrungsform durch bewegliche Ablagestoßel 250 gebildet, die jeweils m einem der Durchbruche verschiebbar angeordnet sind. Jeder Ablagestoßel 250 besteht aus einem Tragerstab 251 und einem Ablageplattchen 252, das gegebenenfalls mit einer Ausnehmung (entsprechend der Ausnehmung gemäß 213 gemäß Fig. 2 oder 3) oder mit einer Oberflachenstrukturierung gemäß Fig. 16 (s. unten) versehen ist. Die Ablageplattchen 252 sind zur Aufnahme der kryokonservierten Proben 300 vorgesehen, die beim dargestellten Beispiel wiederum einen Umhullungslosungstropfen 310 mit einer biologischen Zelle 320 umfassen.

Im Ausgangszustand bzw. im Lagerzustand des Kryosubstrats bei tiefen Temperaturen sitzen alle Ablagestoßel 250 m den entsprechenden Durchbruchen 115 derart, daß die Ablageplattchen 252 auf der Oberflache des Substratkorpers 110 ruhen. Die Lange der Stabelemente 251 ist großer als die Dicke des Substratkorpers 110, so daß die Stabelemente 251 im Ausgangszustand auf der Unterseite des Substrats herausragen.

Zur selektiven (probenspezifischen) oder gruppenweisen Probenentnahme werden nun einzelne oder Gruppen von Ablagestoßeln 250 von der Ruckseite des Kryosubstrats 100 her mechanisch von der Substratebene abgehoben. Dieser Zustand ist für vier Ablagestoßel im unteren Teil von Fig. 15 illustriert. Die vorgeschobenen Ablagestoßel 250 können dann mit einem geeigneten Abtrenn- oder Greif-Werkzeug, wie dies beispielsweise oben unter Bezug auf Fig. 4 beschrieben wurde, abgehoben und zum Zielsubstrat übertragen werden. Dabei kann der kryokonservier- te Zustand der Proben erhalten werden.

Für die verschiedenen Probenaufnahmeprozeduren an Kryosubstraten kann es vorteilhaft sein, die Proben mit einer höheren oder einer geringeren Ruckhaltekraft am Kryosubstrat zu verankern. Hierzu wird das Substrat an den Probenablagepositionen strukturiert, so daß der Kontaktbereich zwischen dem Substrat und der Probe vergrößert oder modifiziert wird, um die gewünschten Ruckhaltekrafte einzustellen. Beispiele für derartige Strukturen sind m Fig. 16 zusammengestellt.

Gemäß der Struktur a ist auf der Oberflache des Substratkorpers 110 eine nano- oder mikrostrukturierte Aufrauhung 261 vorgesehen. Diese Aufrauhung 261 wird beispielsweise durch eine chemische Behandlung oder eine Laserbehandlung des Substrats erzeugt und dient der besseren Haftung der Probe 300. Entsprechend dem Teilbild b ist eine extrem glatte Oberflache vorgesehen, die beispielsweise durch einen polierten Bereich 262 gebιlde_ wird. Innerhalb des polierten ggf. partiell hydrophobierten Bereiches 262 kann die Probe 300 auch im tiefgefrorenen Zustand leicht verschoben oder vom Substrat abgetrennt werden. Dies erleichtert eine Positionsanderung bzw. Aufnahme der Probe am Kryosubstrat. Gemäß Teilbild c wird die Probe 300 m einer Mulde 263 abgelegt, die sowohl einer verbesserten Verankerung am Substrat als auch einem Schutz beispielsweise gegenüber den Werkzeugen bei Abtrennung benachbarter Proben dient. Die Struktur 260 des Substrats kann auch einen profilierten Durchbruch 264 gemäß Teilbild d umfassen. Der Durchbruch 264 besitzt einen geringeren Durchmesser als die m der Probe 300 enthaltene biologische Zelle 320. Da jedoch beim Einfriervorgang der Umhullungslosungstropfen 310 den Durchbruch 264 zumindest teilweise durchdringen kann, ergibt sich eine besonders feste Verankerung der Probe im kryokonservierten Zustand. Das Teilbild e illustriert weitere Substratprofl- lierungen m Napf- oder Grabenform, die dazu dienen, beim Einfriervorgang die Tropfenform zu beeinflussen und/oder die Probe am Substrat fest zu verankern.

Fig. 17 zeigt eine weitere Variante einer erfmdungsgemaßen Probenaufnahme an Kryosubstraten, die insbesondere zur Erzeugung von Probenmustern auf dem Kryosubstrat dient. Im obersten Bild von Fig. 17 ist em beliebiger Probentrager 140 gezeigt, die bei Normaltemperatur (flussiger Zustand der Proben 300) eine Vielzahl von Proben 300 tragt. Jede Probe 300 besteht beispielsweise aus einem Umhullungslosungstropfen 310 und zwei Zellen 320. Das Probenmuster auf dem Probentrager 140 wird beispielsweise mit einem Pickmg-Roboter mit Hilfe von Mikropipetten erzeugt.

Nach Fertigstellung des Musters wird em tiefgekühltes Kryosubstrat 100 auf die Proben 300 aufgesetzt (mittleres Bild m Fig. 17), so daß die Proben 300 gefrieren. Das Kryosubstrat 100 besitzt auf der zu den Proben hinweisenden Oberflache Strukturen 260 zur Haftungsvergroßerung, wie sie beispielsweise in Fig. 16 erläutert sind. Der Probentrager 140 hingegen besitzt eine glatte, vorzugsweise polierte Oberflache. Beim Einfriervorgang haften daher die Proben 300 starker am Kryosubstrat 100 als am Probentrager 140 und können damit mit dem Kryosubstrat 100 abgehoben werden (unterster Teil von Fig. 17) .

Das m Fig. 17 illustrierte Verfahren besitzt den Vorteil eines definierten Einfriervorgangs (Kryoprozedur) für sämtliche Proben. Außerdem besitzen die Tropfen nach dem Anhaften am Kryosubstrat eine planare Oberflache, was insbesondere für eine mikroskopische Beobachtung von Vorteil ist.

Die oben erläuterten Ausfuhrungsformen der erfmdungsgemaßen mechanischen und/oder thermischen Probenaufnahme durch Abtren- nung von einzelnen oder mehreren Proben (gegebenenfalls mit Substratteilen) vom Kryosubstrat kann anwendungsabhangig, insbesondere für bestimmte Kryosubstratfor en (z.B. Zylmderober- flachen) oder für bestimmte Abtrennwerkzeugformen modifiziert werden. Es kann ferner vorgesehen sein, die erfmdungsgemaße Probenaufnahme mit einem Meßverfahren zu kombinieren, bei dem die kryokonservierten Proben auf dem Kryosubstrat m Bezug auf bestimmte Eigenschaften untersucht und dann automatisch vom Kryosubstrat entnommen werden.

E erfmdungsgemaßes Kryosubstrat kann anwendungsabhangig in Bezug auf sein Material, Form, Große und Oberflachengestaltung an bestimmte Meßaufgaben angepaßt sein. So ist es für NMR- Untersuchungen beispielsweise vorgesehen, daß das Kryosubstrat aus einem für NMR-Untersuchungen geeigneten, inerten Material besteht und m Große und Form an die jeweiligen verfugbaren NMR-Meßemrichtungen angepaßt ist. Des weiteren kann eine Markierung von Kryosubstraten oder von deren Teilen, z.B. m Form von Barcodes, Farbcodes, optisch detektierbaren Mustern oder elektro-magnetischen Markierungen (Transponder ) vorgesehen sein. Dies ermöglicht vorteilhafterweise eine automatische Erfassung vorbestimmter Proben an bestimmten Ablageelementen bzw. die Erfassung der spezifischen Positionen, von denen Proben aufgenommen werden sollen.

Gemäß einer weiteren Ausfuhrungsform erfmdungsgemaßer Kryo- substrate können Ablageelemente, die zur positionsspezifischen Abtrennung von Kryosubstrat ausgelegt sind, e magnetisches Material enthalten. Magnetische Ablageelemente können einfach mit einem Magneten am Ende einer entsprechenden Aufnahmevorrichtung erfaßt und zum jeweiligen Zielsubstrat überfuhrt werden. Die m der vorstehenden Beschreibung, den Zeichnungen und den Ansprüchen offenbarten Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln als auch m beliebiger Kombination für die Verwirklichung der Erfindung m ihren verschiedenen Ausgestaltungen von Bedeutung sein.

Claims

PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Probenaufnahme an einem Kryosubstrat (100), auf dem jeweils an vorbestimmten Probenpositionen eine Vielzahl kryokonservierter Proben (300) angeordnet ist, dadurch gekennzeichnet, daß einzelne Proben selektiv mechanisch oder thermisch vom Kryosubstrat (100) abgetrennt und zu einem Zielsubstrat (130) übertragen werden.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem zum mechanischen Abtrennen der Proben Ablageelemente (200), auf denen jeweils eine Probe (300) angeordnet ist, selektiv mit einer Abtrenneinrichtung (400) durch Ausübung mechanischer Zug- oder Scherkräfte vom Substratkorper (110) des Kryosubstrats (100) abgelost und die damit jeweils aufgenommene Probe gemeinsam mit dem Ablageelement zum Zielsubstrat (130) übertragen werden.

3. Verfahren gemäß Anspruch 2, bei dem das Ablosen der Ablageelemente (200) em Abbrechen von Ablageplatten (210) , die über Sollbruchstellen mit dem Substratkorper (110) verbunden sind, oder e Abziehen von Ablagefolien umfaßt.

4. Verfahren gemäß Anspruch 2, bei dem das Ablösen der Ablageelemente (200) em selektives Verschieben von Ablagestoßeln

(250) und Aufnehmen der verschobenen Ablagestoßel (250) mit einer Greifemrichtung umfaßt.

5. Verfahren gemäß Anspruch 2, bei dem das Ablosen der Ablageelemente (200) em selektives Ausschneiden von Ablagebereichen aus einem Foliensubstrat (120) und eine Aufnahme der ausgeschnittenen Bereiche mit einer Greifemrichtung umfaßt.

6. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem zum thermischen Abtrennen der Proben Ablageelemente (200), auf denen jeweils eine Probe (300) angeordnet ist und die durch Heizelemente (230) gebildet werden, em selektives, zumindest teilweises

Auftauen der jeweiligen Probe mit dem Heizelement (230) erfolgt .

7. Verfahren gemäß Anspruch 6, bei dem die Heizelemente (230) jeweils einen Steueranschluß (234) aufweisen und die selektive Probenaufnahme em Aufsetzen einer Tastelektrode (422) auf den Steueranschluß (234) zur selektiven Erwärmung der entsprechenden Probe und eine Aufnahme der Probe mit einer Atrenn- trennemrichtung (400) umfaßt.

8. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem zum mechanischen Abtrennen der Proben Ablageelemente (200) , auf denen jeweils eine Probe (300) angeordnet ist, selektiv mit einer Abtrenneinrichtung (400) durch Ausübung einer thermischen Zersetzung vom Substratkorper (110) des Kryosubstrats (100) abgelost und die damit jeweils aufgenommene Probe gemeinsam mit dem Ablageelement zum Zielsubstrat (130) übertragen werden.

9. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem wahrend der selektiven Probenaufnahme das Kryosubstrat (100) im Bereich der auf dem Kryosubstrat verbleibenden Proben im gekühlten Zustand bei der Kryotemperatur verbleibt.

10. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 2 bis 9, bei dem selektiv Probengruppen aufgenommen werden.

11. Vorrichtung zur Probenaufnahme an Kryosubstraten (100), die umfaßt:

- em funktionell oberflachenstrukturiertes Kryosubstrat (100) mit einer Vielzahl von Ablageelementen (200) für kryokonser- vierte Proben (300), wobei die Ablageelemente (200) für eine selektive mechanische oder thermische Abtrennung der Proben vom Kryosubstrat (100) ausgebildet sind, und

- eine Abtrenneinrichtung (400), die zum Abtrennen und Aufnehmen der Proben (300) vom Kryosubstrat (100) ausgebildet ist.

12. Vorrichtung gemäß Anspruch 11, bei der die Ablageelemente (200) Ablageplatten (210) umfassen, die jeweils über eine Sollbruchstelle mit einem Substratkorper (110) des Kryosubstrats (100) verbunden sind.

13. Vorrichtung gemäß Anspruch 11, bei der die Ablageelemente (200) Ablagestoßel (250) umfassen, die im Substratkorper (110) des Kryosubstrats (100) senkrecht zu dessen Oberflache verschiebbar angeordnet sind.

14. Vorrichtung gemäß Anspruch 12 oder 13, bei der die Abtrenneinrichtung (400) em gabelförmiges Trennwerkzeug (411), em Greifwerkzeug, em Klemmwerkzeug oder eine Saugemrichtung aufweist .

15. Vorrichtung gemäß Anspruch 11, bei der die Ablageelemente (200) Heizelemente (230) umfassen, die zum zumindest teilwei- sen Auftauen der jeweils abgelegten Probe (300) ausgebildet sind.

16. Vorrichtung gemäß Anspruch 15, bei der die Heizelemente (230) jeweils einen Heizbereich (231) aufweisen, der mit einem

Masseanschluß (232) und einem Steueranschluß (233) verbunden ist, wobei alle Masseanschlüsse (232) der Heizelemente (230) elektrisch miteinander verbunden und die Steueranschlusse (233) selektiv voneinander elektrisch getrennt und zur Beaufschlagung der Heizelemente (230) mit einer Heizspannung beaufschlagbar sind.

17. Vorrichtung gemäß Anspruch 11, bei der die Ablageelemente (200) elektrisch ablösbare Ablageplatten (220) umfassen, bei denen jeweils em Trennelement (224) vorgesehen ist, das bei Beaufschlagung mit einer elektrischen Spannung eine Abtrennung der Probe mit der Ablageplatte (220) vom Substratkorper (110) durch Schmelzen oder Zersetzung des Trennelements (224) ermöglicht.

18. Kryosubstrat (100), das einen Trager für eine Vielzahl von Proben (300) bildet, die an der Oberflache des Kryosubstrats (100) im gefrorenen Zustand angeordnet sind, dadurch gekennzeichnet, daß die Oberflache eine Vielzahl von Ablageelementen (200) zur Aufnahme jeweils einer Probe (300) aufweist, wobei jedes Ablageelement zur selektiven Abtrennung der jeweiligen Probe vom Kryosubstrat ausgelegt ist.

19. Kryosubstrat gemäß Anspruch 18, bei dem die Ablageelemente (200) Ablageplatten (210) umfassen, die über Sollbruchstellen mit einem Substratkorper (110) des Kryosubstrats (100) verbunden sind.

20. Kryosubstrat gemäß Anspruch 18, bei dem die Ablageelemente (200) Heizelemente (230) umfassen, die zum zumindest teilweisen Auftauen der jeweils abgelegten Probe ausgelegt sind.

21. Kryosubstrat gemäß Anspruch 18, bei dem die Ablageelemente (200) Ablagestoßel (250) umfassen, die im Substratkorper (110) des Kryosubstrats (100) senkrecht zu dessen Oberflache verschiebbar sind.

22. Kryosubstrat gemäß Anspruch 18, bei dem als Ablageelemente (200) Folienstucke vorgesehen sind, die im gekühlten Zustand des Kryosubstrats (100) vom Substratkorper (110) abziehbar sind.

23. Kryosubstrat gemäß Anspruch 18, bei dem die Ablageelemente (200) oder die Substratobeflache eine Oberflachenmodiflzierung zur Beeinflussung der Probenhaftung m Form einer Oberflachen- aufrauhung, einer Polierung, einer Ausnehmung, eines Durchbruchs oder eines Verankerungsgrabens umfassen.

24. Kryosubstrat gemäß Anspruch 18, bei dem die Ablageelemente (200) zumindest teilweise aus magnetischen Materialien bestehen.

25. Kryosubstrat gemäß Anspruch 18, auf dessen Oberflache optische oder elektro-magnetische Markierungen zur Kennzeichnung des Kryosubstrats und/oder einzelner Ablageelemente auf dem Kryosubstrat vorgesehen sind.