WO2000066729A1

WO2000066729A1 - Proteine meg-3

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Publication number: WO2000066729A1
Application number: PCT/JP2000/002831
Authority: WO
Inventors: Toshio Miyata
Original assignee: Kurokawa, Kiyoshi
Priority date: 1999-04-30
Filing date: 2000-04-28
Publication date: 2000-11-09
Also published as: CN1365389A; AU4315400A; AU775409B2; KR20020011394A; EP1179590A1; CA2371702A1; NO20015277L; NO20015277D0; EP1179590A4; US20060068437A1

Description

メグ一 3タンパク質技術分野

本発明は、遺伝子工学の分野に属し、特に腎細胞の遺伝子の単離に関する。背景技術

体内の 60兆個もの様々な細胞が、本質的に同一のゲノム DNAを有している。正常な生理学的機能のために、これらの遺伝子の発現は、細胞系統、および細胞が受容するシグナルにより厳密に制御されている。従って、個々の細胞型に発現している遺伝子を解明することは極めて重要である。

メサンギゥム細胞 (mesangial cell)は、腎糸球体の構造および機能の維持に中心的な役割を果たしている。そしてメサンギゥム細胞は、各種腎炎においても中心的な病態生理学的意義を有する。例えばメサンギゥム細胞の増殖、および細胞外の糸球体間質マトリックスの蓄積は、慢性腎炎および糖尿病性腎症のような様々な糸球体疾患の患者の糸球体硬化症の重要な病理所見である。従って、メサンギゥム細胞で発現している遺伝子を見いだしその機能を明らかにすることは、メサンギゥム細胞の生物学的性質の解明、メサンギゥム細胞に関連する疾患の原因の究明、ひいては、メサンギゥム細胞に関連する疾病の治療、診断等に有効である。

メサンギゥム細胞のマーカ一としては、ラットでは Thyl抗原が知られている。しかしこの遺伝子はメサンギゥム細胞特異的ではないうえ、ヒトではメサンギゥム細胞には発現していない (Miyata T. et aし， I匪 unology (1989)； 67: 531-533; Miyata T. et al., I腿 unology (1990)： 69: 39卜 395)。また、メサンギゥム細胞は活性化されるとひ平滑筋ァクチンを発現することが知られているが、この遺伝子もメサンギゥム細胞特異的ではない。このように、メサンギゥム細胞に特徴的な遺伝子については、従来報告がなかった。

なお本発明者は、先にメサンギゥム細胞に特異的に発現しているタンパク質としてメグシンを報告している ( J . C l i n. I nves t , 1 998 Au 1 5, 1 20 : 4, 828-36) ₀ 本発明は、このメグシンとも明確に異なった構造を持つ新規なタンパク質に関する。発明の開示

本発明は、メサンギゥム細胞で高度に発現される遺伝子を単離することを課題とする。

本発明者は、ヒトメサンギゥム細胞のインビトロ培養物から mRNAを単離し、 3 '側の cDNAライブラリ一を作成した。そしてこの cDNAライブラリーに含まれる多数のクローンをランダムに選択してその塩基配列を決定した。次いで決定した塩基配列を、種々の臓器及び細胞から得られた既知の 3'側の cDNAクローンの塩基配列と比較することによって、メサンギゥム細胞で特異的に発現しているクローンを選択した。そしてメサンギゥム細胞から調製した A Z IPLoxcDNAライブラリーを、このクローンのインサートをプローブとしてスクリーニングし、ポジティブクローンの全塩基配列（3768bp)を決定して本発明を完成した。更に Kozakの翻訳開始コドンを有する最も長いオープンリーディングフレームに基づくアミノ酸配列を決定した。この推定アミノ酸配列を持つ本発明によるタンパク質を、本発明者はメグー 3 (Meg-3)と命名した。ヒト 'メグ一 3の cDNAの塩基配列を配列番号： 1に、ヒト ·メグ _ 3の推定アミノ酸配列を配列番号： 2に示した。配列番号： 1に示す塩基配列に対して相同性を持つ塩基配列は、配列番号： 1の 3'末端から 3 0 0〜5 0 0塩基に対して 9 0 %以上のホモロジ一を持つ ESTが検索された他には確認することができなかった。

このアミノ酸配列について、 Swi s sPro tデータベースのアミノ酸配列とホモ口ジ一検索を行い、メグ一 3が新規なタンパク質であることを確認した。更に本発明のメグ— 3の推定アミノ酸 J己列についてモチーフ検索を試みたところ、 N末端から数えて 5 0 0番目以降の領域において、 pro l i ne r i ch pro te i nと呼ばれる多くのタンパク質と良く似たアミノ酸配列が見出された。特に 6 2 1番目〜 7 0 1 番目に至る 8 1アミノ酸残基からなる領域は、プロリンに富み（2 7 . 2 %)、 S H3 (Src homo l ogy 3)ドメインに結合する pro l i ne r i chペプチド（PRペプチド）のアミノ酸配列（xPxxPPPFxP)に類似するアミノ酸配列（xPESPPPAxP)を 2ケ所に有する。このことから、メグ一 3タンパク質の C末端構造は、 PR ドメインとして S rcファミリーなどの細胞内シグナル伝達物質の SH3ドメインに結合できる可能性、そしてシグナル伝達系に関与する可能性が示唆された。配列番号： 2のアミノ酸配列からなる夕ンパク質の細胞質局在の可能性が高い（52. 2%)ことからも、メグ一 3がシグナル伝達に関与する可能性が大きいことが示唆される。この領域の他（N 末端から 1〜5 5 0番目のアミノ酸）では、特に相同性の高いアミノ酸配列を見出すことはできなかった。

ヒ卜の初代培養細胞においては、メグ一 3遺伝子がメサンギゥム細胞で特に高度に発現していることが特徴的である。その他の初代培養細胞では、腎皮質上皮細胞や繊維芽細胞で発現が観察され、ヒトの臍帯静脈内皮細胞や平滑筋細胞においてはわずかな発現が観察される。更にノーザンプロッティングによりメグ— 3 の組織分布をみたところ、メグ一 3は胎盤、次いで塍において高度な発現が観察される。その他、腎、肺、および心では弱い発現が見られ、肝、および骨格筋ではわずかな発現が観察されるのみである。脳では、メグ一 3の発現は検出できなレ^ 本発明はこれらの知見に基づいて完成されたものである。

すなわち、本発明は具体的には以下のタンパク質、 DNA、並びにそれらの用途に関する。

〔1〕配列番号： 2に記載のアミノ酸配列、またはこれらアミノ酸配列において 1若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加、および/または挿入されたァミノ酸配列を含み、このアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパ 00/02831

ク質。

〔2〕配列番号： 2のアミノ酸配列を含む〔1〕のタンパク質。

〔3〕〔1〕に記載のタンパク質をコードする DNA。

〔4〕配列番号： 1の塩基配列を含む〔3〕記載の DNA。

〔 5〕配列番号： 1の塩基配列を持つ DNAとストリンジェン卜な条件下でハイブリダィズし、〔 1〕に記載のタンパク質またはこれらタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする DNA。

〔6〕〔4〕に記載の DNAと特異的にハイブリダィズする DNAであって、少なくとも 1 5ヌクレオチドの鎖長を持つ駄

〔7〕〔4〕に記載の DNAもしくはその一部に対するアンチセンス DNA。

〔8〕〔3〕、〔4〕、および〔5〕のいずれかに記載の DNAを含むことを特徴とするベクター。

〔9〕〔3〕、〔4〕、および〔5〕のいずれかに記載の DNAを発現可能に保持する形質転換細胞。

〔1 0〕〔9〕に記載の形質転換細胞を培養し、〔3〕、〔4〕、および〔5〕のいずれかに記載の DNAの発現産物を回収することを特徴とする、〔 1〕に記載のタンパク質の製造方法。

〔1 1〕〔6〕の DNAを含むメサンギゥム細胞の検出用試薬

〔1 2〕〔1〕に記載のタンパク質に結合することを特徴とする抗体。

〔1 3〕配列番号： 2のアミノ酸配列から選択されたアミノ酸配列を持つタンパク質の一部を認識する〔1 2〕の抗体。

〔1 4〕抗体がモノクローナル抗体である〔1 3〕の抗体。

〔1 5〕〔1 3〕または〔1 4〕のいずれかに記載の抗体と〔2〕のタンパク質、またはその断片との免疫学的な結合に基づいて〔2〕のタンパク質またはその断片を測定する免疫学的測定方法。

〔1 6〕〔1 2〕〜〔1 4〕のいずれかに記載の抗体を含む、メサンギゥム細胞の検出用試薬。

〔1 7〕生体試料中に含まれる〔2〕のタンパク質またはその断片を測定し、正常試料から得られた測定値と比較することによってメサンギゥム増殖性腎症を検出する方法。

〔18〕メグ一 3をコードする遺伝子の発現レベルを変化させたトランスジェニック非ヒト脊椎動物。

〔1 9〕非ヒト脊椎動物がマウスである〔1 8〕のトランスジエニック非ヒト脊椎動物

〔20〕メグ— 3をコードする遺伝子の発現が抑制されたノックァゥトマウスである〔19〕のトランスジエニック非ヒト脊椎動物。

前記課題を達成するために本発明者は、 3'領域 cDNAライブラリー（3' -directe d cDNA library)を用いた。この方法により、 cDNAの大きさによって左右されるクローニング効率の変動を回避することができる。 3'領域の配列は遺伝子に特有なものであり、約 200〜300bpの配列デ一夕は、遺伝子の特徴を明らかにするのに充分である（Yasuda Y.，Miyata T.et al., Kidney Int, 1998 Jan, 53:1, 154-8)。本発明のヒト ·メグ一 3をコードする DNAは、メサンギゥム細胞から mRNAを調製した後、既知の方法により二本鎖 cDNAに変換することにより得ることができる。 mRNAの調製はグァニジンイソチオシァネート—塩化セシウム法 [Chirwin, et al.

Biochemistry 18, 5294 (1979)]、デォキシリポヌクレアーゼ存在下に界面活性剤処理、フエノール処理を行なう方法 [Berger&Birkenmeier, Biochemistry 18,

5143 (1979)] などを用いることができる。全 RNAからの poly(A)+RNAの調製はオリゴ (dT)を結合した担体（例えばセファロース、セルロースやラテックス粒子等）を用いたァフィ二ティークロマトグラフィーなどを用いて行なうことができる。得られた mRNAを铸型として、 3'端にある poIy(A)鎖に相補的なオリゴ (dT)、ランダムプライマ一、あるいはメグ一 3のアミノ酸配列の一部に相応する合成ォリゴヌクレオチドをプライマーとして逆転写酵素で処理することによって cDNA (1 s t s t rand)を得ることができる。 mRXAとそれに相補的な cDNAとで構成されるハイブリッドの mRNAを E. Co l i RNase Hで部分的に切断し、これをプライマーとして E. Co l i DNA po lymerase Iにより cD A (2nd s t rand)が合成される。最終的に E. Co l i DNA L igaseで処理することにより、二本鎖 cDNAを得ることができる。ヒト · メグ— 3遺伝子塩基配列をもとに合成したプライマーを用いて、メサンギゥム細胞 po 1 y (A) +RNAを铸形にして RT-PCR法によりクローニングすることも可能である。また、 PCRによらず、ヒト ·メグ一 3遺伝子塩基配列をもとにプロ一ブを合成し、直接 cDNAライブラリ一をスクリーニングし、目的とする cDNAを得ることもできる。本発明の遺伝子は、これらの方法により得られた遺伝子の中から、その遺伝子の塩基配列を確認することにより、選択することができる。マウスとラット等、ヒト以外の種におけるメグ一 3のホモログについても、同様の手法により cDNAの取得が可能である。

あるいは、メグ一 3のホモログの cDNAを以下のような手法によって単離することも可能である。すなわち、前記ヒト ·メグ一 3 cDNAの塩基配列をプローブとして用い、 cDNAライブラリーをコロニーハイブリダィゼ一シヨンやプラークハイブリダィゼーシヨンによってスクリーニングして、メグ— 3のホモログをコードする cDNAを単離することができる。 cDNAライブラリ一は、マウス、ラッ卜の組織や、培養メサンギゥム細胞等から抽出した mRNAを铸型として合成することができる。あるいは、市販 cDNAライブラリ一（フナコシ製等）を用いることもできる。この他に、本発明によるヒト ·メグ一 3の cDNAをもとに、オープンリーディングフレームの前後にデイジエネレーティブプライマ一を設計し、これを利用した PC Rによってホモログの cDNAを増幅する方法を用いることもできる。

ヒト ·メグ一 3ゲノムは、ゲノミックライブラリ一のスクリーニングによって得ることができる。ゲノミックライブラリ一は、たとえばヒト Bリンパ芽球からゲノムを調製し、 Sau3で部分的に切断した DNAをファージベクターである EMBL3 に組み込むことにより合成することができる（Bl ood, vo l 83， No 11 , 1994 : pp 3126-3131 )。このようなゲノミックライブラリ一について、プラークハイブリダィゼーシヨン法（新細胞工学実験プロトコール、秀潤社、 PP79- 92、参照）を行えば、目的とするゲノムを含むクローンを取得できる。プロ一ブとしては、メグ一 3 cDNAのオープンリーディングフレーム全ての領域（2202bp)、または cDNA部分をプライマーとしてヒトゲノム DNAを PCR法を用いて増幅することにより得られた各ェキソン一イントロン部分を用ることができる。また、同時に調節領域に関しても、ヒト培養メサンギゥム細胞由来 mRNA、もしくはヒト腎臓 mRNA (Cl ontec h社より購入）を铸型として、 5' RACE法（5' -Ful l RACE Core Set (宝酒造（株）の方法に従う））を用いて 5' UTRの配列決定を行うことができる。

本発明の遺伝子は、例えばホスホアミダイド法 [Mat tencc i , M. D. &Caruthers， M. H. J. Am. Chem. Soc. 103, 3185 (1981) ]、ホスファイト ·トリエステル法 [H unkapi l ler, M. et al . Nature 310, 105 (1984) ] 等の核酸の化学合成を用いる常法に従って製造することもできる。

なお、一般に、真核生物の遺伝子はヒ卜インターフェロン遺伝子で知られているように多形現象を示すことが多い。この多形現象によって、アミノ酸配列に 1 個あるいはそれ以上のアミノ酸の置換を生じても、通常タンパク質の活性は維持される。また一般に、 1個または数個のアミノ酸の改変では、タンパク質の活性は維持される場合が多いことが知られている。従って、配列番号： 2に示されるァミノ酸配列をコードする遺伝子を人工的に改変したものを用いて得られたタンパク質をコードする遺伝子は、該タンパク質が本発明の遺伝子の特徴的な機能を有する限り、すべて本発明に含まれる。また、配列番号： 2に示されるアミノ酸配列を人工的に改変したタンパク質は、本発明のタンパク質の特徴を有する限り、すべて本発明に含まれる。

その他、本発明のタンパク質には、配列番号： 2に記載のアミノ酸配列、またはこれらアミノ酸配列において 1若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加、およびまたは挿入されたアミノ酸配列を含み、本発明によるメグ一 3と機能的に同等なタンパク質が含まれる。なお本発明において機能的に同等とは、メグ一

3と同等の生物学的特性を持つことを意味する。本発明者は、メグ一 3にたとえば以下のような生物学的な特性を見出している。

まずメグ一 3は、 SH3 ドメインとの結合性が推測される PR ドメインを備えていることから、シグナル伝達系に関与する可能性がある。 SH3 ドメインは、 Srcファミリーなどをはじめとして、各種細胞内シグナル伝達物質が有するドメインの一つである。配列番号： 2のアミノ酸配列からなるタンパク質の細胞質局在の可能性が高い（52. 2%)ことからも、メグ— 3がシグナル伝達に関与する可能性が大きいことが示唆される。

またメグ一 3は、次のような発現特性を持っている。まず、ヒトの初代培養細胞においては、メグ一 3遺伝子がメサンギゥム細胞で特に高度に発現していることが特徴的である。その他の初代培養細胞では、腎皮質上皮細胞や繊維芽細胞で発現が観察され、ヒ卜の臍帯静脈内皮細胞や平滑筋細胞においてはわずかな発現が観察される。更にノーザンプロッティングによりメグ— 3の組織分布をみたところ、メグ一 3は胎盤、次いで滕において高度な発現が観察される。その他、腎、肺、および心では弱い発現が見られ、肝、および骨格筋ではわずかな発現が観察されるのみである。脳では、メグ— 3の発現は検出できない。各組織におけるメグ— 3の発現状態は、たとえば配列番号： 1から選択された塩基配列を持つプローブによって、各組織から調製した mRNAを試料としてノーザンプロットアツセィを行うことによって知ることができる。

以上のような生物学的特性について、機能的に同等なタンパク質は、いずれも本発明によるメグ一 3を構成する。したがって、具体的に構造を明らかにしたヒトのメグ— 3のみならず、構造的にあるいは機能的に同等な他の種のホモログは本発明に含まれる。

また、本発明の DNAには、これらの機能的に同等なタンパク質をコードする DN Aが含まれる。これらのタンパク質をコードする DNAは、 cDNAのみならずゲノム DNAや合成 DMであることもできる。

また、所望のアミノ酸に対するコドンはそれ自体公知であり、その選択も任意でよく、例えば利用する宿主のコドン使用頻度を考慮して常法に従い決定できる [Grantham, R. et al. Nucleic Acids Res. 9， r43 (1981)]。従って、コドンの縮重を考慮して、 DNAを適宜改変したものもまた本発明の DNAに含まれる。所望の改変をコードする合成オリゴヌクレオチドからなるプライマーを利用した部位特異的変位導入法 (si tespeci f ic mutagenesis) [Mark, D. F. et al. Pro Nat 1. Acad. Sci. U.S.A. 81,5662 (1984)]等にしたがって、これら核酸配列のコドンを一部改変することができる。

更に、配列番号： 1に記載の塩基配列を含む DNAとハイプリダイズすることができ、かつその DNAによってコードされるタンパク質が本発明によるメグ一 3に特徴的な機能を有する限り、その DN'Aは本発明による DNAに含まれる。ストリンジェン卜な条件下で特定配列にハイプリダイズすることができる配列は、特定配列がコードするタンパク質と類似した活性を持つものが多いと考えられる。ストリンジェン卜な条件とは、一般的には以下のような条件を示すことができる。すなわち、 4XSS 65ででハイブリダィゼ一シヨンさせ、 0. 1 XSSCを用いて 65でで 1時間洗浄する。ストリンジエンシーを大きく左右するハイブリダィゼーシヨンや洗浄の温度条件は、融解温度（Tm)に応じて調整することができる。 Tm はハイブリダィズする塩基対に占める構成塩基の割合、ハイブリダィゼ一シヨン溶液組成（塩濃度、ホルムアミドゃドデシル硫酸ナトリウム濃度）によって変動する。したがって、当業者であればこれらの条件を考慮して同等のストリンジェンシーを与える条件を経験的に設定することができる。

変異体も含め本発明による DNAの塩基配列は、公知の技術に基づいてさまざまな用途に利用することができる。

このようにしてクローン化されたメグ一 3をコードする遺伝子は適当な発現べクタ一 DNAに組み込むことにより、他の原核細胞または真核細胞の宿主を形質転換させることができる。さらに、これらの発現ベクターに適当なプロモー夕一および形質発現に係る配列を導入することにより、それぞれの宿主細胞において遺伝子を発現することが可能である。発現ベクターとしては、例えば大腸菌の場合は、 ET-3 [Studier & Moffalt, J. Mol. Biol. 189， 113 (1986)] 等が、 COS細胞の場合は pEF- BOS [Nucleic Acids Research 18, 5322 (1990)]、 pSV2-gpt [Mul ligan & Berg, Proに Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78， 2072 (1981)] 等が、 CH0細胞の場合は pVYl [国際公開第 89/03874号公報] 等がそれぞれ挙げられる。また、目的とする遺伝子に他のポリペプチドをコードする遺伝子を連結して融合タンパク質として発現させることにより、精製を容易にし、その後目的タンパク質を切り出すことも可能である。融合させるタンパク質としては、ヒスチジンタグ、 c- mycタグ、 MBP-タグ、あるいは GST-タグ等が知られている。これらのタグを融合させた状態でインサートを発現させることができるベクタ一は市販されている。本発明の発現系に用いる宿主のうち原核生物宿主細胞としては、例えば、大腸菌（Escherichia coli) が挙げられる。また真核生物のうち、真核微生物の宿主細胞としては、例えは'サッカロミセス 'セレピシェ一（Saccharomyces cervisia e) 等が挙げられる。一方哺乳動物由来の宿主細胞としては、例えば COS細胞、 C H0細胞、 BHK細胞等が挙げられる。なお、本発明の形質転換体の培養は、宿主細胞に適した培養条件を適宜選択して行なえばよい。

以上のようにして目的とするメグ一 3をコードする遺伝子で形質転換した形質転換体を培養し、産生されたメグ一 3は、細胞内または細胞外から分離し均一なタンパク質にまで精製することができる。なお、本発明の目的タンパク質であるメグ一 3の分離、精製は、通常のタンパク質で用いられる分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば各種クロマトグラフィー等を適宜選択し、組み合わせれば、メグ一 3を分離、精製することができる。

なお、上述の他、本発明の遺伝子、該遺伝子を含有する組換えべクタ一、該べクタ一による形質転換体および該遺伝子を用いたメグ一 3の製造過程における遺伝子操作の処理手段は、「Mo l ecu l ar C l on i ng- A Labora t ory Manua l J (Co l d Spr i ng Harbor Labora t ory, N. Y. ) に記載の常法に従って行うことができる。

この他、配列番号： 1に記載の塩基配列に基づいて、メグ一 3遺伝子を検出するためのプローブを設計することができる。あるいは、これらの塩基配列を含む DNAや RNAを増幅するためのプライマーを設計することができる。与えられた塩基配列をもとに、プローブやプライマーを設計することは当業者が日常的に行つていることである。設計された塩基配列を持つォリゴヌクレオチドは化学合成によって得ることができる。そしてそのオリゴヌクレオチドに適当な標識を付加すれば、さまざまなフォーマツ卜のハイブリダィゼーシヨンアツセィに利用することができる。あるいは、 PCRのような核酸の合成反応に利用することができる。プローブやプライマーに利用するオリゴヌクレオチドは、少なくとも 15塩基、好適には 25-50塩基の長さとするのが望ましい。

本発明によるメグ— 3遺伝子は、ィンサイチュハイブリダイゼーションの結果、腎臓の組織中では特にメサンギゥム細胞で特異的に発現している。したがって、メグー 3遺伝子に特異的にハイプリダイズする本発明に基づくォリゴヌクレオチドは、メサンギゥム細胞の特異的な検出を可能とするプローブやプライマーとして有用である。メサンギゥム細胞は腎糸球体機能と密接に関連していることから、本発明によるオリゴヌクレオチドは、腎臓の病理学的な解析において有用なッ一ルとなりうる。

更に本発明が明らかにしたメグ一 3をコ一ドする遺伝子の塩基配列に基づいて、メグ一 3の発現を制御しうるアンチセンス核酸が提供される。本発明によるアンチセンス核酸は、メグ— 3のメサンギゥム細胞における役割を明らかにするための重要なツールとなる。あるいはメグ一 3の発現亢進によってもたらされる病態の制御に有用である。アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を抑制する作用としては、以下のような複数の要因が存在する。すなわち、三重鎖形成による転写開始阻害、 RNAポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造がつくられた部位とのハイプリッド形成による転写抑制、合成の進みつつある RNAとのハイプリッド形成による転写阻害、イントロンとェキソンとの接合点でのハイプリッド形成によるスプライシング抑制、スプライソソ一ム形成部位とのハイブリツド形成によるスプライシング抑制、 DiRNAとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行抑制、キヤッピング部位やポリ（A)付加部位とのハイプリッド形成によるスプライシング抑制、翻訳開始因子結合部位とのハイブリツド形成による翻訳開始抑制、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイプリッド形成による翻訳抑制、 mR NAの翻訳領域やポリソ一ム結合部位とのハイプリッド形成によるタンパク質鎖に伸長阻止、および核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイプリッド形成による遺伝子発現抑制、などである。これらは、転写、スプライシング、または翻訳の過程を阻害して、標的遺伝子の発現を抑制する（平島および井上「新生化学実験講座 2 核酸 I V 遺伝子の複製と発現」，日本生化学会編，東京化学同人， PP. 319 -347, 1993)。

本発明で用いられるァンチセンス配列は、上記のいずれの作用で標的遺伝子の発現を抑制してもよい。一つの態様としては、遺伝子の mRNAの 5'端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的であろう。しかし、コード領域もしくは 3'側の非翻訳領域に相補的な配列も使用し得る。このように、遺伝子の翻訳領域だけでなく非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含む DNAも、本発明で利用されるアンチセンス DNAに含まれる。使用されるアンチセンス DNAは、適当なプロモータ一の下流に連結され、好ましくは 3' 側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。このようにして調製された DNA は、公知の方法で、所望の宿主へ形質転換できる。アンチセンス DNAの配列は、形質転換する宿主が持つ内在性遺伝子（あるいはその相同遺伝子）、またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に阻害できる限り、完全に相補的でなくてもよい。

DNAを铸型として転写された RNAが、標的遺伝子の転写産物に対して好ましくは 90¾、最も好ましくは 95%の相補性を有するように設計する。アンチセンス配列を用いて、効果的に標的遺伝子の発現を阻害するには、アンチセンス MAの長さは、少なくとも 15塩基以上であり、好ましくは 100塩基以上であり、さらに好ましくは 500塩基以上である。通常、用いられるアンチセンス RNAの長さは 2. 5kbよりも短い。

更に本発明が提供するメグ一 3の cDNA塩基配列に基づいて、ゲノム中に存在するメグ一 3遺伝子のプロモーター領域、ェンハンサー領域を取得することができる。具体的には、特開平 6- 181767号公報、「The Journal of Immuno logy (1995) 1 55, 2477-2486, Proc. Nat l . Acad. Sc i . USA (1995)， 92， 3561-3565」等と同様の方法でこれらの制御領域の取得が可能である。なお、本明細書において、プロモ —夕一領域とは転写開始部位の上流に存在する遺伝子の発現を制御する DNA領域を、ェンハンサ一領域とはィントロンまたは 3' UTRに存在する遺伝子の発現を制御する DNA領域をいう。

具体的には、プロモーター領域は、例えば、以下の方法によって取得することができる。

1 ) メグ _ 3の cDNAの 5'末端側をプローブとし、ヒトゲノムライブラリーよりメグ一 3のプロモーター領域をクロ一ニングする。

2 ) 制限酵素消化してメグ一 3遺伝子の翻訳開始コドンを含むその上流部分（2 〜5 kbp) のプロモーター領域を含む DNAを得、塩基配列を決定する。ヒトメサンギゥム細胞から調製した po ly (A) ⁺RNAを銬型とし、メグ— 3遺伝子の 5'末端側 c DNA配列より選択したプライマー DNAを用いたプライマー伸長法により、転写開始点（+ 1 ) を決定する。塩基配列から転写因子結合配列を検索し、プロモーター活性を有する可能性がある箇所を予想する。

3 ) 2 ) で得た DNAからメグ— 3遺伝子のコード領域を除いた DNA断片をプラスミド上にサブクロ一ニングし、この DNA断片の 2〜5 kbp下流に、レポーター遺伝子としてのクロラムフエニコ一ルァセチル転位酵素（C A T) 遺伝子、あるいは、ルシフェラ一ゼ遺伝子を連結したレポータープラスミドを構築する。同様に、プロモータ一領域の可能性がある各箇所を含むような形で、制限酵素消化により、或いは、 P C Rにより、 5'末端側及び 3'末端側を順次削ったメグ一 3遺伝子上流部分の様々な部位に該当する DNA断片を作成し、これらの下流に、レポ一夕一遺伝子としての C A T遺伝子、あるいは、ルシフェラ一ゼ遺伝子を連結したレポ一夕一プラスミドを構築する。

4 ) 3 ) で作製したレポ一タープラスミドで形質転換した動物細胞の C A T或いはルシフェラ一ゼ活性を測定することにより、メグ一 3遺伝子上流部分に存在するプロモー夕一領域を得る。

また、 3' UTR、イントロン中のェンハンサ一領域は、メグ— 3 cDNAをプローブとし、ヒトゲノムライブラリ一よりヒト ·メグ一 3のゲノム遺伝子をクローニングし、上述のプロモー夕一に関する方法と同様にして、ェンハンサー活性を有する領域を得ることができる。

メグ一 3遺伝子の発現を制御している転写因子は、「新細胞工学実験プロトコール（秀潤社)」、「バイオマニュアルシリーズ 5転写因子研究法（羊土社)」、「DN A & Ce l l Bi o l ogy, 13, 731-742 (1994) j に記載の方法等の公知の方法、例えば、ァフィ二ティ一カラムを用いた方法、サウスウエスタン法、フットプリンティング法、ゲルシフト法、または one-hybr i d法で得ることができる。なお、本明細書において、転写因子とはメグ— 3遺伝子の転写を調節している因子で、転写の開始反応を誘導する転写開始因子と、転写を正または負に調節する転写調節因子をさす。

ァフィ二ティーカラム法を用いる場合は、前述の方法で得た、プロモ一夕一領域、ェンハンサー領域をセファロース或いはラテックスビーズに固定化したカラムに、核抽出液をかけ、カラムを洗浄後、カラムに固定化した配列と同様の配列を有する DNAを用い、結合した転写因子を溶出することによって、メグ一 3遺伝子の発現を制御している転写因子を得ることができる。また、サウスウエスタン法を用いる場合は、大腸菌の発現べクタ一（例えば t i l ) に挿入した cDNAの発現産物を標識プローブによってスクリーニングする。たとえばスクリーニングすべき cDNAを) 3—ガラクトシダーゼとの融合タンパク質として発現させ、これをニトロセルロース膜に吸着させる。次いで放射性同位元素で標識されたプロモー夕一領域ゃェンハンサー領域の DNA断片をプロ一ブにし、結合活性をもつ融合タンパク質を合成するファージを選択することによって、メグ一 3遺伝子の発現を制御している転写因子を得ることができる。

ゲルシフ卜法は、遊離の DNAがタンパク質と結合したときにポリアクリルアミドゲルによる電気泳動の移動度に差を生じる現象に基づいている。プロモーター領域やェンハンサー領域の DNA断片をプローブとし、転写因子が含まれる試料（たとえば核蛋白質抽出液）と混合して、低イオン強度の元で電気泳動分析する。転写因子の結合は、遊離の DNAとは違った移動度のバンドとして検出される。ゲルシフト法は、タンパク質の混合物から高い感度で転写因子を分離することができる。

ゲルシフト法によって得られた DNAと転写因子の複合体を、更にフットプリント法によって解析すると、転写因子の結合部位を決定することができる。フットプリント法は、 DNA上にタンパク質が結合すると DNase Iの消化から保護される現象を利用している。すなわち、末端を³² Pで標識したプロモーター領域ゃェンハンサー領域の DNAを、転写因子の共存化で DNas e Iによって部分消化し、これを塩基配列決定用の変性ポリアクリルアミドゲルで分離する。転写因子の無い状態で同様の処理を行った結果と比較すると、転写因子の結合によってバンドの消失が観察されることから、その結合部位の推定が可能となる。

本発明はまた、メグ一 3を認識する抗体を提供する。本発明の抗体には、例えば、配列番号： 2に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質に対する抗体が含まれる。メグ一 3または本発明のメグ— 3の部分ペプチドに対する抗体（例えばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体）または抗血清は、本発明のメグ一 3、本発明のメグ— 3の部分ペプチド、あるいは本発明による c-myc- (Hi s) ₆- Tag-メグー 3や MBP-メグー 3のような融合夕ンパク質を抗原として用い、公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。

本発明のメグ一 3、または本発明のメグ一 3の部分ペプチドは、温血動物に対して投与による抗体産生が可能な部位に、公知の担体や希釈剤と共に投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常 1〜6週毎に 1回ずつ、計 2 〜10回程度行われる。抗体産生に用いられる温血動物としては、例えばサル、ゥサギ、ィヌ、モルモット、マウス、ラッ卜、ヒッジ、ャギ、あるいはニヮトリ等が挙げられるが、マウスおよびゥサギが好ましく用いられる。

モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原を免疫された温血動物、例えばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の 2〜5日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイプリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば後記の標識化メグ一 3と抗血清とを反応させた後、抗体に結合した標識剤の活性を測定することによりなされる。融合操作は既知の方法、例えばケーラーとミルスタインの方法（Nature, 256, 495 (19 75) ) に従い実施できる。融合促進剤としてはポリエチレングリコール（PEG) やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくは PEGが用いられる。

骨髄腫細胞としては例えば X - 63Ag8、 NS-K P3UK SP2/0、 AP-1などが挙げられるが、 X-63Ag8が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は 1： 20〜20： 1であり、 PEG (好ましくは PEG1 000〜PEG6000)が 10〜80%程度の濃度で添加され、 20〜40°C、好ましくは 30〜37°C で 1〜10分間インキュベー卜することにより効率よく細胞融合を実施できる。抗メグ一 3抗体産生ハイプリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えばメグ— 3抗原を直接又は担体と共に吸着させた固相（例えば、マイク口プレート）にハイプリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体）が用いられる。またはプロテイン Aを加え、固相に結合した抗メグー 3モノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロプリン抗体又はプロテイン Aを吸着させた固相にハイプリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したメグ一 3を加え、固相に結合した抗メグ一 3モノクロ —ナル抗体を検出する方法などが挙げられる。

抗メグー 3モノクローナル抗体の選別およびクロ一ニングは、自体公知またはそれに準じる方法に従って行うことができる。通常 HAT (ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地で行われる。選別、クロー二ングおよび育種用培地としては、八イブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いてもよい。例えば、 1〜20%、好ましくは 10〜2 (^の牛胎児血清を含む RPMI 1640培地（大日本製薬（株)）、 1〜10%の牛胎児血清を含む GIT培地（和光純薬工業（株)）、またはハイプリドーマ培養用無血清培地（SFM-101、日水製薬 (株)）などを用いることができる。培養温度は、通常 20〜40 ：、好ましくは約 3 7でである。培養時間は、通常 5日〜 3週間、好ましくは 1週間〜 2週間である。培養は、通常 ¾炭酸ガス下で行われる。ハイプリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗メグー 3抗体価の測定と同様にして測定できる。クローニングは、通常半固体アツガー法や限界希釈法などのそれ自体公知の方法で行うことができ、クローン化されたハイプリドーマは、好ましくは無血清培地中で培養され、至適量の抗体をその上清に与える。目的のモノク口一ナル抗体は腹水化して得ることもできる。

本発明によるモノクローナル抗体は、メグ一 3に特異的なェピトープを認識するものを選択することによって他のタンパク質と交差しないものとすることができる。一般的に、そのタンパク質を構成するアミノ酸配列の中から、連続する少なくとも 7以上のアミノ酸残基、望ましくは 10- 20アミノ酸のアミノ酸配列によつて提示されるェピトープは、そのタンパク質に固有のェピト一プを示すといわれている。したがって、配列番号： 2に記載されたアミノ酸配列から選択され、かつ連続する少なくとも 7ァミノ酸残基からなるアミノ酸配列を持つぺプチドによって構成されるェピトープを認識するモノクローナル抗体は、本発明におけるメグ— 3特異的なモノクローナル抗体といえる。

抗メグ一 3モノクローナル抗体の分離精製は通常のポリクローナル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの分離精製法に従って行われる。公知の精製法としては、例えば、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、 «気泳動法、イオン交換体（例えば DEAE) による吸脱着法、超遠心法、ゲル濾過法、抗原結合固相またはプロテイン Aまたはプロテイン Gなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法のような手法を示すことができる。このようにして得られたメグ一 3を認識する本発明によるモノクローナル抗体、あるいはポリクローナル抗体は、メサンギゥム細胞に関連する疾病の診断や治療に利用することが可能である。これらの抗体を用いてメグ一 3を測定する方法としては、不溶性担体に結合させた抗体と標識化抗体とによりメグ一 3を反応させて生成したサンドイッチ錯体を検出するサンドイッチ法、また、標識ヒト 'メグ一 3と検体中のヒト由来メグ一 3を抗体と競合的に反応させ、抗体と反応した標識抗原量から検体中のヒト由来メグ一 3を測定する競合法等を示すことができる。サンドイッチ法によるメグ一 3の測定においては、まず、固定化抗体とメグ— 3とを反応させた後、未反応物を洗浄によって完全に除去し、標識化抗体を添加して固定化抗体一メグ一 3標識化抗体を形成させる 2ステップ法、もしくは固定化抗体、標識化抗体およびメグ一 3を同時に混合する 1ステップ法などを用いることができる。

測定に使用される不溶性担体は、例えばポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリエステル、ポリアクリル酸エステル、ナイロン、ポリアセタール、フッ素樹脂等の合成樹脂、セルロース、ァガロース等の多糖類、ガラス、金属などが挙げられる。不溶性担体の形状としては、例えばトレィ状、球状、粒子状、繊維状、棒状、盤状、容器状、セル、試験管等の種々の形状を用いることができる。抗体を吸着した担体は、適宜アジ化ナトリウム等の防腐剤の存在下、冷所に保存する。

抗体の固相化は、公知の化学結合法又は物理的吸着法を用いることができる。化学的結合法としては例えばダルタルアルデヒドを用いる方法、 N-スクシ二イミジル -4- (N-マレイミドメチル）シクロへキサン- 1-カルボキシレート及び N-スクシニイミジル- 2-マレイミドアセテートなどを用いるマレイミド法、卜ェチル- 3-

(3-ジメチルァミノプロピル）カルポジイミド塩酸などを用いるカルポジイミド法が挙げられる。その他、マレイミドベンゾィル -N-ヒドロキシサクシニミドエステル法、 N-サクシミジル- 3- (2-ピリジルジチォ）プロピオン酸法、ビスジァゾ化ベンジジン法、ジパルミチルリジン法が挙げられる。あるいは、先に被検出物質とェピトープの異なる 2種類の抗体を反応させて形成させた複合体を、抗体に対する第 3の抗体を上記の方法で固相化させておいて捕捉することも可能である。標識物質は、免疫学的測定法に使用することができるものであれば特に限定されない。具体的には、酵素、蛍光物質、発光物質、放射性物質、金属キレート等を使用することができる。好ましい標識酵素としては、例えばペルォキシダーゼ、アルカリフォスファタ一ゼ、 j3 - D-ガラクトシダーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デル夕- 5-ステロイドイソメラ一ゼ、 α -グリセロールホスフェートデヒドロゲナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、西洋わさびパーォキシダーゼ、ァスパラギナーゼ、グルコースォキシダ一ゼ、リボヌクレアーゼ、ゥレアーゼ、力夕ラーゼ、グルコース一 6—ホスフエ一トデヒドロゲナ —ゼ、ダルコアミラーゼ、およびアセチルコリンエステラーゼ等が挙げられる。好ましい蛍光物質としては、例えばフルォレセインイソチアネート、フィコピリプロテイン、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシァニン、ァロフィコシァニン、およびオルトフタルアルデヒド等が挙げられる。好ましい発光物質としてはイソルミノール、ルシゲニン、ルミノール、芳香族ァクリジニゥムエステル、イミダゾール、ァクリジニゥム塩及びその修飾エステル、ルシフェリン、ルシフエラーゼ、およびェクオリン等が挙げられる。そして好ましい放射性物質としては、 ¹²⁵I、 ¹²⁷I、 ^{l 3}' I、 ¹⁴C、 ¾、 ³²P、あるいは³⁵ S等が挙げられる。

前記標識物質を抗体に結合する手法は公知である。具体的には、直接標識と間接標識が利用できる。直接標識としては、架橋剤によって抗体、あるいは抗体断片と標識とを化学的に共有結合する方法が一般的である。架橋剤としては、 Ν, Ν' -オルトフエ二レンジマレイミド、 4- (Ν-マレイミドメチル）シクロへキサン酸 · Ν-スクシンィミドエステル、 6-マレイミドへキサン酸 · Ν-スクシンィミドエステル、 4， 4' -ジチォピリジン、その他公知の架橋剤を利用することができる。これらの架橋剤と酵素および抗体との反応は、それぞれの架橋剤の性質に応じて既知の方法に従って行えばよい。この他、抗体にピオチン、ジニトロフエニル、ピリドキサール又はフルォレサミンのような低分子ハプテンを結合させておき、これを認識する結合成分によって間接的に標識する方法を採用することもできる。ピオチンに対してはアビジンやストレブトァビジンが認識リガンドとして利用される。一方、ジニトロフエニル、ピリドキサール又はフルォレサミンについては、これらのハプテンを認識する抗体が標識される。抗体を標識する場合、西洋わさびべルォキシダーゼを標識化酵素として用いることができる。本酵素は多くの基質と反応することができ、過ヨウ素酸法によって容易に抗体に結合させることができるので有利である。また、抗体としては場合によっては、そのフラグメント、例えば Fab'、 Fab, F (ab' ) ₂を用いる。また、ポリクロ一ナル抗体、モノクロ一ナル抗体にかかわらず同様の処理により酵素標識体を得ることができる。上記架橋剤を用いて得られる酵素標識体はァフィ二ティ一クロマトグラフィー等の公知の方法にて精製すれば更に感度の高い免疫測定系が可能となる。精製した酵素標識化抗体は、防腐剤としてチメロサール (Th imerosal)等を、そして安定剤としてグリセリン等を加えて保存する。標識抗体は、凍結乾燥して冷暗所に保存することにより、より長期にわたって保存することができる。

標識化剤が酵素である場合には、その活性を測定するために基質、必要により発色剤が用いられる。酵素としてペルォキシダーゼを用いる場合には、基質溶液として H₂0₂を用い、発色剤として 2, 2' -アジノ-ジ - [3 -ェチルベンズチアゾリンスルホン酸]アンモニゥム塩（ABTS)、 5 -ァミノサリチル酸、オルトフエ二レンジァミン、 4-ァミノアンチピリン、 3，3' , 5，5' -テトラメチルべンジジン等を使用することができる。酵素にアルカリフォスファタ一ゼを用いる場合は、基質としてォルトニトロフエニルフォスフエ一ト、パラニトロフエ二ルリン酸等を使用することができる。酵素に i3 -D-ガラクトシダ一ゼを用いる場合は基質としてフルォレセイン-ジ- D-ガラクトピラノシド）、 4-メチルゥンベリフエニル - 3 -D-ガラクトピラノシド等を使用することができる。本発明は、また、前述のモノクローナル抗体、あるいはポリクロ一ナル抗体を標識して、あるいは固相化してメグ一 3 の免疫学的測定用試薬としたもの、更にはこの試薬に標識検出用の指示薬や対照試料等をキット化したのものをも含むものである。

本発明におけるメグ一 3の測定対象は、血漿、血清、血液、尿、組織液、あるいは脳脊髄液等の体液等、メグ一 3、あるいはメグ一 3の前駆体や断片を含む生体試料であれば限定されない。

加えて本発明は、メグ— 3遺伝子の発現レベルを変化させたトランスジェニック非ヒト脊椎動物に関する。ここでメグ一 3遺伝子とは、メグ一 3をコードする cDNA、ゲノム DNAあるいは合成 DNAを含む。また、遺伝子の発現には、転写と翻訳のいずれのステップも含まれる。本発明によるトランスジエニック動物は、メグー 3の機能あるいは発現調節の研究、ヒトのメサンギゥム細胞に関連する疾患のメカニズムの解明、医薬品のスクリ一ニング ·安全性に用いる疾患モデル動物の開発に有用である。

本発明においては、メグ— 3遺伝子の発現を正常に調節しているいくつかの重要な部位（ェンハンサー、プロモーター、イントロン等）の一部に欠失、置換、挿入などの変異を起こさせることにより、本来の遺伝子の発現レベルと比較して人工的に上昇または下降するように修飾することができる。このような修飾は、メグ一 3遺伝子の転写の調節である。一方、ヱキソンの一部を欠損させたり、翻訳領域への点突然変異の導入により終止コドンへ置換することにより、タンパク質への翻訳を修飾することもできる。この変異の導入は、公知の方法により行うことができ、トランスジエニック動物を得ることができる。

トランスジエニック動物とは狭義には遺伝子組換えにより、外来遺伝子が生殖細胞に人為的に導入された動物のことをいい、広義にはアンチセンス RNAを用いて特定の遺伝子の機能を抑えたアンチセンス ' トランスジエニック動物や、胚性幹細胞（ES細胞）を用いて特定の遺伝子をノックアウトさせた動物、点突然変異 DNAを導入した動物を含み、個体発生の初期に外来遺伝子が安定して染色体に導入され、その子孫に遺伝形質として伝達され得る動物のことをいう。本明細書中でいうトランスジエニック動物とはヒト以外のすべての脊椎動物を含む。

トランスジエニック動物の作製方法は、遺伝子と卵を混合させてリン酸カルシゥムで処理する方法や、位相差顕微鏡下で前核期卵の核に、微小ピペットで遺伝子を直接導入する方法（マイクロインジェクション法、米国特許第 4873191号）、胚性幹細胞（ES細胞）を使用する方法などがある。その他、レトロウイルスべク夕一に遺伝子を挿入し、卵に感染させる方法、また、精子を介して遺伝子を卵に導入する精子べクタ一法等が開発されている。精子ベクター法とは、精子に外来遺伝子を付着またはエレクトロポレーシヨン等の方法で精子細胞内に取り込ませた後に、卵子に受精させることにより、外来遺伝子を導入する遺伝子組換え法である (M. Lavi t ranoe t ら Ce l l , 57, 71 7， 1989)。

あるいはバクテリオファージ P Iの c re/ l oxPリコンビナ一ゼ系ゃ Saccharomyce s cerev i s i aeの FLPリコンビナ一ゼ系等の i n v i voにおいて部位特異的遺伝子組み換えを用いることもできる。また、レトロウイルスを使用して、非ヒト動物へ目的タンパク質のトランスジーンを導入する方法も報告されている。マイクロインジェクション法によるトランスジエニック動物作製方法は、例えば以下に示すようにして行われる。まず、発現制御に関わるプロモーター、特定のタンパク質をコードする遺伝子、ポリ Aシグナルから基本的に構成されるトランスジ一ンが必要である。プロモーター活性により特定分子の発現様式や発現量が左右され、また、導入トランスジーンのコピー数や染色体上の導入部位により作製されたトランスジエニック動物は系統間で異なるため、各系統間で発現様式 ·発現量を確認する。非翻訳領域ゃスプライシングにより発現量が変化することが判明しているため、予めポリ Aシグナルの前にスプライシングされるイントロン配列を導入してもよい。受精卵に導入する遺伝子はできるだけ純度の高いものを使用することが重要である。使用する動物としては、受精卵採取用マウス（5 〜6週齢)、交配用雄マウス、偽妊娠雌マウス、輸精管結紮雄マウス等が用いられる。

効率よく受精卵を得るために、ゴナドトロピン等により排卵を誘発してもよレ^ 受精卵を回収し、マイクロインジェクション法にて卵の雄性前核にィンジェクションピぺット中の遺伝子を注入する。注入した卵を輸卵管に戻すための動物（偽妊娠雌マウス等）を用意し、一匹に対して約 10〜15個を移植する。その後、誕生したマウスにトランスジーンが導入されているか否か、尾の先端部からゲノム DN Aを抽出し、サザン法あるいは PCR法によりトランスジーンを検出するか、あるいは相同組み換えが起こったときのみに活性化するマーカー遺伝子を挿入したポジティブクロ一ニング法により選択することができる。さらに、トランスジーンの発現を確認するため、ノザン法もしくは RT- PCR法によりトランスジーン由来転写産物を検出する。または、タンパク質に対する特異的抗体によって、ウェス夕ンブロッティング法による検出も可能である。

本発明のノックァゥトマウスは、マウスメグ一 3遺伝子の機能が失われるように処理されたものである。ノックァゥトマウスとは相同組換え技術で任意の遺伝子を破壊し、機能を欠損させたトランスジエニックマウスをいう。胚性幹細胞を用いて相同組換えを行い、一方の対立遺伝子を改変 ·破壊した胚性幹細胞を選別し、ノックアウトマウスを作製することができる。例えば、受精卵の胚盤胞や 8 細胞期胚に遺伝子を操作した胚性幹細胞を注入して、胚性幹細胞由来の細胞と胚由来の細胞が混ざったキメラマウスを得る。このキメラマウス（キメラとは、 2 個以上の受精卵に基づいた体細胞で形成される単一個体をいう）と正常マウスを交配すると、一方の対立遺伝子の全てが改変 ·破壊されたへテロ接合体マウスを作製することができる。さらに、ヘテロ接合体マウス同士を交配することで、ホモ接合体マウスが作製できる。本発明によるトランスジエニック動物は、これらヘテロ接合体と、ホモ接合体のいずれをも含むものである。

相同組換えとは、遺伝子組換え機構で塩基配列が同じ、または非常に類似している 2つの遺伝子間で起こる組換えのことをいう。相同組換えを起こした細胞の選別には PCRを使用することができる。挿入遺伝子の一部と挿入が期待される領域の一部をプライマ一として使った PCR反応を行い、増幅産物ができた細胞で相同組換えを起こしていることが判明する。また、胚幹細胞で発現している遺伝子に相同組み換えを起こさせる場合には、導入遺伝子にネオマイシン耐性遺伝子を結合させておき、導入後に細胞をネオマイシン耐性にさせることにより選択することができる等、公知の方法およびそれらの変法を用いて容易に選択することができる。図面の簡単な説明

図 1は、抗メグ— 3抗体によるウエスタンブロット解析の結果を示す写真である。各レーンは、次の抗原に対応している。

レーン 1 ： MBP

レーン 2 ： MBP-メグ一 3

レーン 3 ：ゥサギ網状赤血球を用いて i n vi t ro t ranscr i pt i on and t rans l at i on にて発現させたルシフェラーゼ蛋白（Promega) レーン 4 ： 3末端 c-myc付加メグ— 3

図 2は、 3末端 c-myc付加メグ一 3を高発現させた CHO細胞の、共焦点レーザ一顕微鏡による検鏡結果を示す写真である。中央で青色に染色されているのが核を、その周囲で緑色に蛍光染色されている部分がメグー 3の局在を示す。発明を実施するための最良の形態

以下本発明を実施例として更に具体的に説明するが、本発明は該実施例に限定されるものではない。

[実施例 1] ヒトメサンギゥム細胞の初代培養

58才の男性から摘出した正常なヒト腎臓から、ヒト糸球体腎臓メサンギゥム細胞を単離した。腎皮質を、無菌条件下で分離し、細分化し、いくつかの篩を通過させた。用いる篩は、段階的に孔径を小さくしていった。 75〜200^mの孔径の篩に捕捉された糸球体を、洗浄し、 100 zg/mL のコラゲナーゼ（Washington Biochemical社製）と共に 37でで 20分間ィンキュベ一トした。洗浄後、糸球体を、 25mMHEPES、 10¾ Nu-serum (Col laborat ive Biomedical Products ¾, Bedford, MA) および抗生物質（10 /g/mLのペニシリン、ストレプトマイシン、およびファンギゾン）を含む培地 199 (Gibco BRL社， Gai thersburg, MD) に再懸濁させ、 5%C0₂ インキュベーター内でインキュベートした。 3 継代目に、メサンギゥム細胞を、典型的な形態学的特徴、トリプシン、ピューロマイシンおよび D-バリンに対する而性、ァクチン (Zymed Laboratories ¾, San Francisco, CA)、 m VLA(,very late antigen)-l,3, 5 (I誦 unotech) の免疫染色に対して陽性を示すこと、ならびに第 VIII因子（Dako社， CA) の免疫染色に陰性を示すことなどの一連の基準により同定した。

[実施例 2] ヒト培養メサンギゥム細胞からの mRNAの単離

6継代目に、グァニジンイソチオシァネート（GTC) 法を用いて、全 RNAをヒトメサンギゥム細胞から単離した。即ち、実施例 1の細胞の血清を含む培養液中のメサンギゥム細胞コンフルェント培養物をリン酸緩衝生理食塩水（PBS)で洗浄し、 5.5mM GTC溶液中で溶解させた。 DNAは 18ゲージの針を通過させることにより除去した。核およびその他の細胞破片は 5， OOOXgで 90秒間遠心分離することにより沈殿させた。上清をセシウムトリフルォロアセテート（CsTFA)層に注意深く載せ、 15°C、 125， OOOXgで 24時間遠心分離した。 RNAペレットを TEバッファーに溶解させた。オリゴ dTセルロースカラム（フアルマシア社）により、 poly(A)⁺RNA を分離した。

[実施例 3] 3'領域 cDNAライブラリ一の構築

poly(A) ⁺R Aを铸型として、 pUC19を基礎とするベクタ一プライマ一 [Norrander J.,et al.,Gene, 26， 101-106 (1983)]を用いた cDNA合成を行った。このベクタープライマー DNAは、 HincII末端、および Tテールをもつ Pstl末端を有し、 Mbol部位（GATC) でダム ·メチル化（dam- methylated) されていた。第 2鎖の合成の後、 cDNA配列、およびベクターの lacZ遺伝子内の単一 BamHI部位を、それぞれ Mbol および BamHIで切断し、次に、低 DNA濃度で環状化およびライゲ一シヨンを行つた。ライゲーシヨン混合物のうちの一部を大腸菌に形質転換した。得られた形質転換体をランダムに選択し、簡単に加熱することにより個別に溶解させた。 cDNA 挿入配列を、 PUC19 クロ一ニンダサイトに隣接するプライマー（5'- TGTAAAACGACGGCCAGT-3' /配列番号： 3および 5' -ACCATGATTACGCCAAGCTTG-3' /配列番号： 4) を用いたペア一ド PCRにより増幅させた。得られた短い二本鎖 DNAを、サイクル配列決定反応に用い、自動配列決定機で解析した。

[実施例 4] メサンギゥム細胞で特異的に発現している遺伝子の単離

メサンギゥム細胞で特異的に発現している遺伝子を同定するため、本発明者は、大規模な DNA配列決定およびコンピュータによるデータ処理を行った。このことにより、様々な異なる細胞および臓器における転写産物を同時に比較することがでさた (Y. Yasuda et al. , Kidney Internatinal 53:154-158, 1998; K. Matsubara et al., Gene. 135, 265 (1993)； K. Okubo et al., Nat. Gen. 2, 173 (1992))。ヒト培養メサンギゥム細胞の 3'領域 cDNAライブラリ一の大規模 DNA配列決定を行い、ランダムに選択した 1836個のクローンの部分配列を決定した。クローンの配列相同性を、相互に比較し、さらに FASTAプログラムを用いて DNAデータバンク GenBankと比較した。様々な臓器および細胞からの mRNAをドットプロット解析することにより、メサンギゥム細胞で特異的に発現しているクローンが選択された。その結果、本発明者のメサンギゥム細胞 cDNAライブラリーにおいてきわめて高い頻度で検出されるいくつかのクローンが得られた。

[実施例 5] ヒト ·メサンギゥム細胞 AZIPLox cDNA ライブラリーのスクリーニング

実施例 2にしたがつて調製した全 mRNAから、オリゴ dTプライマーとランダムプライマーとを用いて AZIPLox cDNA ライブラリ一を合成した。ライブラリーの合成には市販の λ zip lox (Gibco BRL社製、商品名 AZIPLox EcoRI Arms) を利用した。実施例 4で得たメサンギゥム細胞 cDNAライブラリ一で特に高頻度に検出される特定のクローンについて、そのィンサートをプローブとして、この AZIPLox cDNAライブラリーをスクリーニングした。ポジティブクローンについて、挿入された遺伝子断片の塩基配列をジデォキシ夕一ミネ一シヨン法により決定した。予想される開始コドン ATGの位置が、コンセンサス配列と一致し、最長のォ一プンリーディングフレーム（「the first ATG rule」を満足する）を与えた。メグ一 3 cDNA の塩基配列を配列番号： 1に、メグ一 3の推定アミノ酸配列を配列番号： 2に示す。

[実施例 6] メサンギゥム特異的遺伝子の機能解析（1)

SwissProtデータベースで FASTAプログラムによりアミノ酸ホモロジ一検索を行ったところ、高い相同性を持った公知のアミノ酸配列はなく、メグ一 3が新規なタンパク質であることを確認した。

続いてメグ— 3のアミノ酸配列をモチーフ検索した。検索には、 PSORT WWW ServerOittp：〃 psort.nibb.ac. jp:8800/)を利用した。その結果、 N末端から数えて 500番目以降の領域において、 proline rich proteinと呼ばれる多くのタンパク質と良く似たアミノ酸配列が見出された。特に 62 1番目〜 701番目に至る 8 1アミノ酸残基からなる領域は、プロリンに富み（2 7. 2 %)、 SH3(Src homology 3)ドメインに結合する proline richペプチド（PRペプチド）のァミノ酸配列（xPxxPPPFxP)に類似するアミノ酸配列（xPESPPPAxP)を 2ケ所に有する。その他、メグ— 3には次に示すようなリン酸化酵素によるリン酸化モチーフの存在が確認された。また 2つの N-ミリストイル化部位が認められた。更に推測される細胞質局在は 52.2%であった。これらの事実は、メグ— 3がシグナル伝達因子であることを強く示唆する。

カゼィン ·カイネース II リン酸化部位： 14

プロテインカイネース Cリン酸化部位： 9

チロシンカイネースリン酸化部位： 1

また、これらの事実に基づいて、 733アミノ酸残基からなる上記推定アミノ酸配列がメグー 3のァミノ酸配列であることが確認された。このアミノ酸配列からなるタンパク質の、計算上の分子量は約 83kDa、 p iの理論値は 5. 72である。

[実施例 7] メグ一 3の機能解析（2) —組織分布

メグ一 3のノーザンプロット解析は、以下のようにして行った。 3'領域 cDNA ライブラリー（実施例 3) のポジティブクローンのインサートを、ランダム DNA ラベリングによって RI標識しプローブとして用いた。試料として以下の細胞から単離した poly(A)⁺RNA (2 g) を、 2.2Mホルムアミドを含むァガロースゲルで分離し、ニトロセルロースフィル夕一へ転写した。フィルターを Rapid Hyb溶液 (Amersham社， Arlington Heights, ID 中でハイブリダィズさせた。ハイブリダイズ後に、 60でで、 0.1XSSPE/0.1%SDS という最終ストリンジエンシーで洗浄した。

ヒ卜の複数の初代培養細胞および組織のノーザンブロット、ヒ卜の癌細胞株のノーザンプロットのための試料は、 Clontech (Palo Alto, CA) から購入した。初代培養細胞としては、ヒトメサンギゥム細胞、ヒト皮膚繊維芽細胞、ヒト腎皮質上皮細胞、ヒト臍帯静脈内皮細胞、およびヒト平滑筋細胞の初代培養細胞由来の 2 xgの Poly(A)+RNAを試料とした。ヒトの癌細胞株のノーザンブロットには、前骨髄球白血病 HL-60、 HeLa細胞 S3、慢性骨髄性白血病 K-562、リンパ芽球白血病 MOLT- 4、 Burkitt リンパ腫 Raji、大腸腺癌 SW480、肺癌 A549、および黒色腫 G361 由来の 2 gの P0ly(A)+RNAを試料とした。組織のノーザンブロットには、心、脳、胎盤、肺、肝、骨格筋、腎、および勝由来の 2 gの poly(A)⁺RNAを試料とした。ハイブリダィゼーションおよび洗浄は上記と同様にして行った。結果は表 1 _ 3 に示すとおりである。

表 1

初代培養細胞

ヒトメサンギゥム細胞 + + +

ヒト皮膚繊維芽細胞 + +

ヒト腎皮質上皮細胞 + +

ヒト臍帯静脈内皮細胞 +

ヒト平滑筋細胞 +

表 2

ヒト癌細胞株

前骨髄球白血病 HL - 60

HeLa細胞 S3

慢性骨髄性白血病 K-562 +

リンパ芽球白血病 M0LT-4

Burkitt リンパ腫 Raj i

大腸腺癌 SW480 + + +

肺癌 A549 + +

黒色腫 G361 + 表 3

ヒト組織

心 +

脳

胎盤 +++

肺 +

肝 +

骨格筋 +

+

塍 + +

メグ一 3 cDNAプローブを用いたノーザンプロット解析で、メサンギゥム培養細胞に単一の転写産物（約 4.0kb) が検出された。ヒトの初代培養細胞においては、メグー 3遺伝子がメサンギゥム細胞で特に高度に発現していることが特徴的であった。その他の初代培養細胞では、腎皮質上皮細胞や皮膚繊維芽細胞で発現が観察され、ヒトの臍帯静脈内皮細胞や平滑筋細胞においてはわずかな発現が観察された。組織間の比較においては、ヒ卜の胎盤、次いで膝で高度な発現が観察された。その他に、心、肺、あるいは腎等の組織で発現が観察され、肝と骨格筋においては発現が弱く、脳での発現は検出できなかった。培養癌細胞株においては HeLa細胞 S3と大腸腺癌 SW480で強い発現が、また肺癌 A549でも発現が見られたが、その他の細胞株では顕著な発現は観察されなかった。

[実施例 8] メグ一 3の機能解析（3) —インサイチュハイブリダィゼーション

ィンサイチュハイブリダィゼーション（in situ hybridization,以下 ISHと省略する）により、ヒト正常腎組織で、メグ— 3 mRNA発現を評価した。 ISHは、公知の方法により行った（Kidney Int. 52, 111 (1997))。ヒト ·メグ— 3 cDNAの 404-433位の塩基配列（配列番号： 5) をプローブとして用いた。糸球体内で、メグ一 3転写産物はメサンギゥム細胞に局在化していた。シグナルの特異性を評価するため、ハイブリダィゼーシヨンの前に RNaseで組織を前処理すると、メグ一 3プローブで検出されるシグナルの大部分が除去された。また、 100倍過剰の同種または無関係の未標識オリゴヌクレオチドで競合実験を行ったところ、メグ一 3のプローブに由来するシグナルは、同じ塩基配列を持つオリゴヌクレオチドでは消失したが、非同種オリゴヌクレオチドでは消失しなかった。これらの結果から、配列番号： 1に示した塩基配列を持つメグ一 3遺伝子は、メサンギゥム細胞で特異的に発現していることが確認できた。

[実施例 9 ] メグ一 3蛋白質の発現

メグー 3の翻訳領域を含む遺伝子を得るために、ヒト培養メサンギゥム組胞 po ly(A)⁺RNA (Q. g/ \) I.O Iを铸型とし、翻訳領域をコードするように設計したプライマ一、すなわち、開始コドンを含み 5'端に制限酵素 EcoRI認識配列を加えたプライマー (5' -CGGAATTCATGGGGTGGATGGG-3' /配列番号： 6 ) 及びストップコドンと EcoRI認識配列を加えたプライマー（5' -GCGAATTCTAGAACTCAGTCTGCACCC CTGC-37配列番号： 7) で PCR反応をおこなった。反応条件は、 lOXEx Taqバッファー 5 1、 dNTP混合物（2.5mM) 8 K PCRプライマー（配列番号： 6、 20pmo 0.5 K 一次 PCR Alプライマー（配列番号： 7、 20pmol/ l) 0.5 K T aKaRa Ex TaqTM (10U/ 1) 0.5/ K 滅菌水で全量を 50 1 とした。「Takara PCR Thermal Cyclerj にセットし、 94で1分、 60で2分、 72で 2分を 30サイクル反応させた。 0.75 %ァガロースゲル電気泳動法でバンドが得られていることを確認し、反応溶夜中から 1 1を orginal TA Cloning Kitj (Invi trogen社) を用いてサブクローニングし、得られたプラスミドを meg3/pCR2とした。このプラスミドを EcoRIで切断し、 EcoRIで切断したマルトース結合蛋白質融合蛋白質発現用べクタ ―、 MAL-c2 (New England Biolab社）と、 T4リガ一ゼを用い結合し、大腸菌 JM 109を形質転換した。 18時間後、アンピシリン耐性株を 3mlの LB培養液に植え、 18時間培養後、ミニプレ法にょリプラスミドを抽出し、制限酵素で確認し、発現ベクター、 pMALc2/meg3を得た。

pMALc2/meg3で形質転換した大腸菌 XL1—Blueを lOO/ig/ml になるようにアンピシリンを加えた 10ml の LB培地で 37°C、 18時間振とう培養し、この培養液を 11の Rich培地（1 L中に lOg トリプトン、 5g酵母抽出物、 5gNaCし 2gダルコ一スを含みアンピシリンを lOO g/mlになるように加えたもの）に加え 37°Cで振とう培養した。濁度計にて約 0.80D (A600)になったところで 0.1M IPTG (isopropyl- i3-D-thiogalactoside 1.41gを水 50mlに溶解したもの） 3mlを加え、続けて 37でで振とう培養した。 2時間後、遠心操作（4000gX20分）により菌体を集め、 50ml の溶解バッファー (ΙΟπιΜ Na₂HP0₄, 30mM NaCl、 0.25% Tween20, pH7.0) を加えた。よく懸濁し、 —80^で 18 時間凍結後、ソニケーシヨン（BRANSON 社： SONIFIER250) し、菌体を粉砕した。 0.5M になるように NaCl を加え、遠心操作 (10000gX30分）により上清を集めた。上清に 200mlの 0.25% Tween20Zカラムバッファーを加え、あらかじめ 0.25% Tween20Zカラムバッファー（0.25% Tween20 lOmM リン酸、 0.5M NaCl, pH7.2) で平衡化したアミロース樹脂 30ml を充填したカラムにロードした。 1ml/分の流速で、 100mlの 0.25% Tween20Z力ラムバッファー、次に 150mlのカラムバッファ一で洗った後、マル! スを 10mM になるように加えたカラムバッファー、 50mlでアミロース樹脂に結合した融合蛋白質を溶出した。これを限外濾過器（Amicon stirred- cell concentrator) で約 lmg/mlまで濃縮し濃縮融合蛋白質 MBP-メグ一 3とした。

融合しているマルトース結合蛋白質は以下の方法で酵素により切断除去できる。蛋白質溶液を透析チューブ（分画分子量 3， 500) に入れファクター Xaバッファ一 (20mM Tris-CK lOOmM NaCK 2mM CaCl₂, lmM アジ化ナトリウム）に対して透析する。透析した溶液 (lmg/ml) に 10 1 のファクター Xa

を加え、 24時間、室温で反応することにより、マルトース結合蛋白質と目的とする蛋白質との結合部位を特異的に切断する。切断後、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィーなどで精製をおこなうことにより目的とする蛋白質が得られる。

[実施例 1 0] MBP-メグ一 3に対するポリクロ一ナル抗体の製造

実施例 9で得られた濃縮融合蛋白質 MBP-メグ— 3 (lOmM リン酸ナトリウム、 0.5M NaCl, lOmM マル！ ^一ス）を等量のフロインド完全アジュバントと混合し、充分乳化した。この乳液 0.5m 1を、ニュージーランドホワイトゥサギ（雌、約 4000g) の皮下に投与した（20j^g/匹）。 1回目免疫後、フロインド不完全アジュバントと混合した MBP-メグ一 3で、 3週間後（50wg/匹）、 5週間後（50 ig/匹）、 7週間後

(50 g/匹）、 9週間後（100/ g/匹）、 11週間後（200 g/匹）に追加免疫した。 3 回目の免疫後、 1週間後に試験採血を行い、抗体価を測定した結果、 204800倍に上昇していることを確認した。抗体価の測定は、抗原 50ng/ゥエルを固相化した 96穴プレートを用いた E I Aによって行った。連続的に希釈した抗血清を各ゥエルに 100 /zlづっ加えて一次反応を行い、上清除去、洗浄後、抗ゥサギ IgGFab'-HRP

(IBL、日本）を反応させ、洗浄後、 OPD (Sigma, USA) で発色して測定した。また、得られた抗血清は、ウェスタンプロットにより、 MBP-メグ— 3と特異的に反応することを確認した。

[実施例 1 1] ゥサギポリクロ一ナル抗 MBP-メグ一 3 I gGの反応性の検討 MBP-メグ一 3、 3末端 c-myc付加メグ一 3、並びに MBP単独発現大腸菌破砕液を抗原として用い、 MBP-メグ一 3を免疫原とするゥサギ I gGの反応性を確認した。

MBP-メグ一 3には、 pMALc2/meg3で形質転換した大腸菌 JM109の細胞破壊液を用いた。また 3末端 c-myc付加メグ一 3の発現には、アンチセンスプライマーとして PCRA1プライマーに代えてストップコドンを除いて EcoRI認識配列を加えたプライマ一（5' -GCGMTTCGAACTCAGTCTGCACCCCTGC- 37配列番号： 8) を用い、実施例 9と同様の操作で合成した断片を用いた。この断片を、 EcoRI で消化したほ乳類細胞発現用 PCDNA3.1 (Invitrogen) に挿入し、プラスミドとゥサギ網状赤血球を用レて in vitro transcription and translation (Promega) によって発現させて c-myc付加メグー 3とした。

それぞれのタンパク質溶液を等量のサンプルバッファー（0.25%トリスー H C l、 2%SDS、 30%グリセリン、 1 0 % 3—メルカプトエタノール、 0. 025 %ブロモフエノールブル一）（第一化学薬品製）で処理し、 5分間 95 で加熱して試料とした。得られた試料を、ゲル濃度 4— 20%のグラジェントゲル (第一化学薬品製）を用いて SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（SD S-PAGE) (Lae誦 li，U.K.， Nature, 第 227巻， 680 - 685頁， 1970年）により分離した。

SDS— PAGEで分離したタンパク質を、ブロッティング溶液（25mMトリス一 HC 1、 192mM グリシン、 20 %メタノール、 pH 8.3) を用いて 10 0Vの定電圧で 1時間、ポリビニリデンジフルオリド（PVDF) 膜（バイオ，ラッド製）にブロッテイングした。ブロッテイングした PVDF膜を蒸留水で洗浄後、 5 %ブロックエースの TTB S溶液中で 3時間ブロッキングした。次に、 PVDF膜を TTBS (20mMトリス、 500mMの NaC l、 0. 05 %Twe e n 20、 pH7.5)で洗浄した後、 T T B Sで希釈した 1次抗体であるゥサギポリクロール抗 MBP-メグ— 3 I gGの溶液と 4でで一夜反応させた。次に、アンプリファイドアルカリフォスファターゼイミユンブロットキット（バイオ · ラッド製）を用いて検出した。すなわち、 TTBSで希釈したピオチン標識ャギ抗ゥサギ I gGと室温で 1時間インキュベートした後、あらかじめ室温でストレプトァビジンとピオチン標識アル力リフォスファタァ一ゼを 1時間ィンキュペートして調製したストレブトアビジン一ピオチン標識アル力リフォスファ夕ァーゼのコンプレックスを反応させた。 P VDF膜を TTB Sで洗浄し、基質（ni 0 blue tetrazol iumと 5 - bromo - 4- chloro - 3 - indolyl phosphate, p - toluidine塩の溶液) と室温で約 30分間インキュベートすることにより、 1次抗体に結合された抗体を可視化した。蒸留水で十分反応させることにより、反応を停止させた。

結果を図 1に示した。実施例 10で得た本発明による MBP-メグ— 3に対するポリク口一ナル抗体で、 MBP-メグ一 3に相当するバンドが確認できた。したがってこのポリクロ一ナル抗体は、メグ一 3を特異的に認識する抗体であることが示された。 [実施例 1 2 ] メグ一 3の細胞内局在

EcoR I断片メグ一 3の ORFフラグメントを挿入した前記 pcDNA3.1を CHO に形質転換し、 3末端 c-myc付加メグ一 3を高発現させた。その 2日後の細胞を 4%パラホルムアルデヒド、 0.5% Triton X-100で固定し、抗マウス c-myc抗体と反応させ、 FITC標識抗マウス抗体を反応させた。更にへキスト 33341で核染色し、共焦点レーザー顕微鏡で検鏡した。

結果は図 2に示した。アミノ酸配列の解析で推測されたとおりメグ一 3は細胞質に局在することが確認された。産業上の利用の可能性

本発明により、メサンギゥム細胞に高頻度に発現している DNAと、この DNAがコードするタンパク質等が提供された。これらはメサンギゥム細胞に特異的な生理活性に深く関与していると推測され、メサンギゥム細胞の同定、メサンギゥム細胞の異常の検出などに有用である。更に、該タンパク質の機能からメサンギゥム細胞の機能が明らかになり、メサンギゥム細胞に関連する疾患の原因究明への展開が期待される。また、メサンギゥム細胞に関連する疾病の治療、診断等への応用が期待される。

具体的には、たとえばメグ一 3の人為的な調節によって、糸球体腎炎の発症や進展を制御できる可能性がある。あるいはメサンギゥム細胞や体液中のメグ一 3 夕ンパク質や mRNAの定量によつて、糸球体腎炎などの腎疾患の診断が可能となることが期待できる。糸球体腎炎ではメサンギゥム領域の機能異常が見られ、メサンギゥム細胞の増殖、あるいは細胞からのマトリックス基質の産生亢進が起きている。これらの病態にメグ一 3が関与している可能性は十分に考えられる。本発明によるメグ— 3は、メサンギゥム細胞で高度に発現しているという点では、本発明者が先に報告したメグシンと共通の特徴を備えている。しかしながら本発明によるメグ— 3は prol ine r i chドメインを有する細胞内シグナル伝達系物質である可能性が示唆されるのに対して、メグシンはプロテアーゼインヒビ夕一である SERPINスーパーファミリ一との相同性を持つタンパク質である。また本発明によるメグ一 3が比較的広範囲な組織において発現が観察されている点は、メグシンのメサンギゥム細胞に特異的に発現しているという特徴と相違する。したがって本発明によるメグ— 3は、メサンギゥム細胞の機能を支える重要なタンパク質である可能性を持っている。このような重要なタンパク質の存在を明らかにした本発明の意義は大きい。

Claims

請求の範囲配列番号： 2に記載のアミノ酸配列、またはこれらアミノ酸配列において 1若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加、および Zまたは挿入されたアミノ酸配列を含み、このアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等な夕ンパク質。配列番号： 2のアミノ酸配列を含む請求項 1のタンパク質。請求項 1に記載のタンパク質をコードする DNA。配列番号： 1の塩基配列を含む請求項 3記載の DNA。配列番号： 1の塩基配列を持つ DNAとストリンジェン卜な条件下でハイブリダィズし、請求項 1に記載のタンパク質またはこれらタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする DNA。請求項 4に記載の DNAと特異的にハイブリダィズする DNAであって、少なくとも 1 5ヌクレオチドの鎖長を持つ DNA。. 請求項 4に記載の DNAもしくはその一部に対するアンチセンス DNA。. 請求項 3、請求項 4、および請求項 5のいずれかに記載の DNAを含むことを特徴とするベクター。. 請求項 3、請求項 4、および請求項 5のいずれかに記載の DNAを発現可能に保持する形質転換細胞。0 . 請求項 9に記載の形質転換細胞を培養し、請求項 3、請求項 4、および請求項 5のいずれかに記載の DNAの発現産物を回収することを特徴とする、請求項 1に記載のタンパク質の製造方法。

1 . 請求項 6の DNAを含むメサンギゥム細胞の検出用試薬。

2 . 請求項 1に記載のタンパク質に結合することを特徴とする抗体。

3 . 配列番号： 2のアミノ酸配列から選択されたアミノ酸配列を持つタンパク質の一部を認識する請求項 1 2の抗体。

4 . 抗体がモノクローナル抗体である請求項 1 3の抗体。

5 . 請求項 1 3または請求項 1 4のいずれかに記載の抗体と請求項 2のタンパク質、またはその断片との免疫学的な結合に基づいて請求項 2のタンパク質またはその断片を測定する免疫学的測定方法。

6 . 請求項 1 2〜請求項 1 4のいずれかに記載の抗体を含む、メサンギゥム細胞の検出用試薬。

7 . 生体試料中に含まれる請求項 2のタンパク質またはその断片を測定し、正常試料から得られた測定値と比較することによってメサンギゥム増殖性腎症を検出する方法。

8 . メグ一 3をコードする遺伝子の発現レベルを変化させたトランスジェニック非ヒト脊椎動物。

9 . 非ヒト脊椎動物がマウスである請求項 1 8のトランスジエニック非ヒト脊椎動物。

0 . メグ一 3をコ一ドする遺伝子の発現が抑制されたノックァゥトマウスである請求項 1 9のトランスジエニック非ヒト脊椎動物。