WO2000062796A1 - Agents de traitement des troubles de la fonction pancreatique - Google Patents

Agents de traitement des troubles de la fonction pancreatique Download PDF

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knee
cells
function
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neurotrophic factor
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PCT/JP2000/002264
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Yasushi Itakura
Mutsuo Taiji
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Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited
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    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics

Definitions

  • the present invention relates to an agent for protecting a knee cell or a function improving agent for a reduced function of a kidney cell containing a neurotrophic factor as an active ingredient, or a method for protecting a knee tissue or a functioning knee having a function of a neurotrophic factor as an active ingredient
  • the present invention relates to a tissue function improving agent.
  • the knee is an organ composed of an endocrine tissue called the knee island (Langerhans island) and exocrine gland tissues that secrete digestive enzymes such as amylase, lipase and proteases.
  • B cells [] 3 cells) that synthesize and secrete insulin
  • a cells ⁇ cells
  • glucagon glucagon
  • D cells ⁇ cells
  • pancrea There are pancreatic polypeptide cells that secrete and synthesize tick polypeptides (hereinafter abbreviated as “cells”), which have a significant effect on the control of blood sugar and metabolism.
  • pancreatic polypeptide cells that secrete and synthesize tick polypeptides (hereinafter abbreviated as “cells”), which have a significant effect on the control of blood sugar and metabolism.
  • These impaired endocrine and exocrine gland functions can lead to abnormal blood sugar control (diabetes, hypoglycemia, insulin shock, etc.) and reduced digestive function (fatty stool, respectively).
  • Knee dysfunction is caused by various causes, but typical causes include ⁇ inflammation and diabetes. Ophthalmitis is clinically classified as acute inflammation and chronic ophthalmitis, the former being solitary or recurrent osteoarthritis characterized by an acute abdominal pain attack accompanied by elevated knee enzymes in the blood and urine. is there. In severe cases, necrosis of the knee parenchyma, bleeding, severe renal failure or respiratory failure may occur, leading to shock and death. ? The usual treatment is to control exocrine secretion of the knee by fasting and administering ⁇ 2 blockers, and to administer protease inhibitors, antibiotics and analgesics to prevent complications.
  • Chronic knee inflammation is mainly due to alcohol overdose and is characterized by recurrent or persistent abdominal pain. It is morphologically characterized by irregular sclerosis with destruction and permanent loss of the exocrine secretory tissue of the knee, and presents with symptoms caused by deceased exocrine gland failure such as steatorrhea. Chronic About 50% of patients with knee inflammation have diabetes mellitus due to impaired endocrine function of the knee (knee diabetes). The characteristic of secondary diabetes in this chronic inflammation is the deficiency of both insulin and glucagon, and treatment often involves administration of insulin. Approximately half of the deaths of chronic knee inflammation are related to diabetes, and hypoglycemia (insulin shock) after insulin injection due to glucagon deficiency and complications of nephropathy and infection have been pointed out as the causes of death.
  • hypoglycemia insulin shock
  • sulfonylurea agents which have the action of promoting insulin secretion, are used in the treatment of diabetes.
  • an excessive burden is imposed on the knee, which results in hamster cells or knees. May cause dysfunction in organ tissues.
  • neurotrophic factor is a collective term for proteins that are supplied from target cells or nerves and glial cells and Schwann cells in vivo, and have an action such as maintaining survival of nerve cells and promoting differentiation. They are classified into many types according to their receptors and receptors. Above all, proteins known as neurotrophins have high homology to each other and form a family. Neurotrophic factors include nerve growth factor (NG)
  • BDNF brain-derived neurotrophic factor
  • NT-3 neurotrophin 3
  • NT-4 neurotrophin 4
  • NT-5 neurotrophin 5
  • NT-6 neurotrophin 6
  • CNTF ciliary neurotrophic factor
  • GDNF glial cell-derived neurotrophic factor
  • Neurotrophins are also known to act as specific ligands for the p75 and trk gene product receptors (trkA, trkB and Z or trkC).
  • a neurotrophic factor such as DNF normalizes blood glucose levels in a diabetes model animal, and discloses application to the treatment of diabetes.
  • a knee cell protector or an agent for improving a damaged knee cell an m cell function protector or an agent for improving a function of a reduced knee cell, a knee Aim fabric protector or a damaged agent.
  • an agent for improving Xue la weaving, or a function protecting agent for knee si and weaving function, or a function improving agent for knee Htm weaving is a need in the medical field for an agent for improving Xue la weaving, or a function protecting agent for knee si and weaving function, or a function improving agent for knee Htm weaving.
  • the present inventors paid attention to the fact that insulin secretion ability of a type 2 diabetes model animal to which BDNF was administered was kept high, and examined the effect of improving knee function using a type 2 diabetes model animal.
  • BDNF increased (1) increased insulin content in the knees decreased in type 2 diabetes model animals, (2) reduced the increased glucagon content, and (3) reduced Langerhans It was found that it normalizes the localization of A cells and D cells in islets, and (-4) promotes regranulation of insulin secretory granules of B cells in the islet of Langerhans and normalizes intracellular organelles.
  • the present inventors have further studied based on the discovery of the effect of improving the spleen function and the effect of protecting the knee cell of BDNF, and arrived at the present invention.
  • the invention is:
  • a protective agent for spleen cells containing a neurotrophic factor as an active ingredient or an agent for ameliorating a damaged spleen cell disorder containing a neurotrophic factor as an active ingredient or an agent for ameliorating a damaged spleen cell disorder
  • a protective agent for knee H and a ameliorating agent for impaired knee S m tissue comprising a neurotrophic factor as an active ingredient; 4.
  • a protective agent for knee tissue function containing a neurotrophic factor as an active ingredient or a function improving agent for knee tissue with reduced function;
  • knee cells are ⁇ cells (] 3 cells), ⁇ cells ( ⁇ cells), D cells ( ⁇ cells), and ⁇ or ⁇ cells in the islets of Langerhans knee ;
  • Knee endocrine function (insulin secretion, glucagon secretion and / or somatostatin secretion)
  • Protective or ameliorating agent or knee endocrine function abnormality (insulin secretion, glucagon secretion and ⁇ or somatostatin secretion)
  • the protective agent or the improving agent according to 1, 2, 5 or 6 which is an agent;
  • Knee endocrine function (insulin secretion, glucagon secretion and ⁇ or somatostatin secretion)
  • Protective or ameliorating agent or dysfunction of knee endocrine function (insulin secretion, glucagon secretion and ⁇ or somatostatin secretion)
  • Knee Protective or ameliorating agent according to 3, 4, 7, or 9, wherein the cause of impaired urn function or the cause of impairment is diabetes.
  • Sulfonylprea is the cause or impairment of knee dysfunction Protecting or improving agent according to 3, 4, 7 or 9;
  • a therapeutic agent for acute ocular inflammation or chronic knee inflammation comprising the protective or improving agent described in 1, 2, 5, 6, or 8 as an active ingredient;
  • a therapeutic agent for acute inflammatory inflammation or chronic knee inflammation comprising the protective agent or ameliorating agent according to 7, 3, 4, 7 or 9 as an active ingredient;
  • NGF nerve growth factor
  • BDNF brain-derived neurotrophic factor
  • CNTF ciliary neurotrophic factor
  • NT-3 neurotrophin 3
  • NT-4 neurotrophin 20.
  • the protective or improving agent according to any one of 1 to 19, which is trophin 4), NT-5 (neurotrophin 5) or NT-6 (neurotrophin 6);
  • BDNF brain-derived neurotrophic factor
  • CNTF ciliary neurotrophic factor
  • NT-3 neurotrophin 3
  • neurotrophic factor is NT-4 (neurotrophin 4) 1
  • NT-5 neurotrophin 5
  • the neurotrophic factor of the active ingredient is NT-6 (neurotrophin 6) 1 A protective agent or an improver according to any one of to 19;
  • NGF nerve growth factor
  • the neurotrophic factor of the active ingredient is GDNF (glial cell-derived neurotrophic factor) 1 to: The protective or ameliorating agent according to I9;
  • Protective agent means an agent that prevents injury or loss of function.
  • “Improvement agent” means an agent that brings a disordered or impaired state closer to or to a normal state.
  • Neurotrophic factor means that in the living body, it is secreted from cells that are the target of nerve growth, or by autocrine or paracrine to help the growth, differentiation and survival of nerves (neurons) to form neural circuits (synapses). Means a physiologically active substance.
  • Neurotrophic factors include, for example, nerve growth factor (hereinafter abbreviated as NGF), brain-derived neurotrophic factor (hereinafter abbreviated as BDNF), neurotrophin 3 (hereinafter abbreviated as NT-3), neurotooral fin 4 ( Neurotrophins such as NT-4, neurotrophin 5 (hereinafter abbreviated as NT-5), neurotrophin 6 (hereinafter abbreviated as NT-6), and ciliary neurotrophic factor (hereinafter abbreviated as NT-4) , CNTF), glial cell-derived neurotrophic factor (hereinafter abbreviated as GDNF) and the like.
  • NGF nerve growth factor
  • BDNF brain-derived neurotrophic factor
  • NT-3 neurotrophin 3
  • neurotooral fin 4 Neurotrophins such as NT-4, neurotrophin 5 (hereinafter abbreviated as NT-5), neurotrophin 6 (hereinafter abbreviated as NT-6), and ciliary neurotrophic factor (her
  • Recombinant neurotrophic factor variants prepared by substituting, deleting, or adding a part of the natural sequence of a neurotrophic factor by a known method also have the same meaning as described in the present specification as long as they have the same physiological activity.
  • Keee dysfunction refers to a condition in which endocrine or exocrine gland function of the knee is reduced or abnormally enhanced.
  • Endocrine gland function is mainly the ability to secrete insulin, glucagon and / or somatostatin
  • exocrine gland function is mainly the ability to secrete knee enzymes (amylase, protease and Z or lipase) into serum. These secretions are already widely used in clinical practice, such as measuring blood insulin levels. It can be evaluated by the method used.
  • “Kneee cell protection” refers to the action of protecting the endocrine gland cells and exocrine gland cells of the knee from degeneration due to various causes, and can be evaluated by microscopic observation of a knee tissue section.
  • B cells (cells) of the islet of Langerhans of the knee are immunostained with insulin
  • a cells ( ⁇ cells) are immunostained with glucagon
  • D cells ( ⁇ Cells) can be specifically stained by somatostatin immunostaining, and the morphology can be observed. It can also be evaluated by observing the structure of intracellular organelles using an electron microscope.
  • Kee tissue protection refers to the action of protecting the knee endocrine gland tissue and exocrine gland tissue from degeneration due to various causes, and can be evaluated by microscopic observation of a slice of a kidney tissue. The morphology of the tissue can be observed by general cell staining methods such as hematoxylin and eosin staining, and anoredaldehyde fuchsin staining. It can also be evaluated by observing the structure of intracellular organelles using an electron microscope.
  • Trk A, trk B and Z or trk C receptor agonist refers to trk A, trk B or trk C, which binds to trk A, trk B or trk C, among the trk gene expression products known as “two eurotrophin” receptors. It is a general term for substances that activate receptors and express their effects. Specific examples of known neurotrophins include NGF that binds to trkA, BDNF that binds to trkB, NT-4, and NT-3 that binds to trkC.
  • This concept includes trk A, trk B or trk B, as well as variants of each neurotrophin (amino acid substitutions, deletions, additions, glycosylation), as well as lower molecular weight peptides and organic compounds. as long as it has the ability to bind and activate the trk C receptor, such as phosphorylation of tyrosine residues.
  • sulfonyliderea agent examples include tolptamide, acetohexamide, chlorpropamide, glicloviramide, tolazamide, gliclazide, glibenclamide, dalibazole, grimidine and the like.
  • FIG. 1 is an optical micrograph of a tissue stained image of a spleen.
  • A Aldehyde fuchsin Staining images
  • B insulin immunostaining images
  • C glucagon immunostaining images
  • D somatostatin immunostaining images.
  • db db (vehicle) represents a diabetic control mouse
  • dbZdb (BDNF) represents a diabetic BDNF-administered mouse
  • dbZm no rma 1
  • Figure 2 is an electron micrograph of a knee B cell of a diabetic control mouse (830 magnification).
  • Fig. 3 is an electron micrograph (magnification: 8300x) of rat spleen B cells administered with BDNF.
  • Fig. 4 is an electron micrograph (magnification: 8300x) of knee B cells of a normal mouse.
  • Fig. 5 shows an electron micrograph of a knee B cell of a diabetic control mouse (magnification: 160).
  • Fig. 6 is an electron micrograph (magnification: 16000x) of knee B cells of mice administered with BDNF.
  • Figure 7 is an electron micrograph (magnification: 16000x) of knee mouse B cells from a normal mouse.
  • the neurotrophic factor of the active ingredient of the present invention can be produced by commercially available power or the following method.
  • neurotrophic factor of the active ingredient of the present invention those prepared by various methods can be used as long as they are purified so that they can be used as pharmaceuticals. It is also possible to obtain neurotrophic factors by culturing primary cultured cells or cell lines that produce neurotrophic factors and separating and purifying them from cultures (culture supernatants, cultured cells, etc.). Alternatively, a gene encoding a neurotrophic factor is inserted into an appropriate vector by a genetic engineering technique, inserted into an appropriate host and transformed, and the desired recombinant neurotrophic cell is obtained from the culture supernatant of the transformant. Factor can be obtained.
  • the host cell is not particularly limited, and various host cells conventionally used in genetic engineering techniques, for example, Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast, filamentous fungi, plant or animal cells, and the like can be used.
  • a part of the amino acid sequence is deleted or replaced by another amino acid, or another amino acid sequence is partially substituted. Inserted, 1 or 2 at N-terminus and Z or C-terminus It also includes those in which the above amino acids are bound or in which the sugar chain is similarly deleted or substituted.
  • the gene encoding BDNF is inserted into an appropriate vector, inserted into an appropriate host, and transformed to obtain the desired recombinant BDNF from the culture supernatant of this transformant.
  • Sci. USA, vol. 88, p. 961 (1991), Biochem. Biophys. Res. Comm un. vol. 186, p. 1553 (1992)) which is suitable for producing a homogeneous and large amount of BDNF.
  • the host cell is not particularly limited, and various host cells conventionally used in genetic engineering techniques, for example, Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast, plant or animal cells can be used.
  • NT-3 like BDNF, can be expressed and produced in various host cells.
  • 4, 767-773 (1990) or Japanese Patent Application Laid-Open No. 5-16493 (WO 91/3659) discloses its production method and Atsey method.
  • NT-4 like BDNF, can be expressed and produced in various host cells.
  • CNTF can be expressed in various host cells and mass-produced.
  • Tokuhyohei 4—502916 (W09 / 73341) discloses a recombinant production method and a purification method.
  • the agent for protecting or improving the function of knee cells or the agent for improving or improving the function of knee tissue containing the neurotrophic factor of the present invention as an active ingredient can be administered parenterally or orally.
  • the exact dosage and dosage regimen for the above agents of the present invention will need to be determined by the amount required, the type of treatment, the illness or the need, and, of course, the judgment of the physician.
  • the dosage and frequency of parenteral administration vary depending on symptoms, age, body weight, dosage form, etc.For example, when subcutaneously or intravenously administered as an injection, adult patients weigh 1 kg / day The dose is selected from the range of about 1 to about 250 ⁇ g, preferably about 10 to about 500 / zg.
  • the weight of the adult patient is kg, ranging from about 1 / ig to about 2500 / xg per day, preferably from about 10 to about 500 g.
  • Dosage regimens include daily or intermittent dosing or a combination thereof.
  • the dose and frequency of oral administration vary depending on the symptoms, age, weight, dosage form, etc.For example, adult patient weight lkg, range from about 5 to about 250 ⁇ g per day The dosage is preferably selected from the range of about 10 to about 1000 ⁇ g.
  • Pharmaceutical compositions comprising admixing a neurotrophic factor with a pharmaceutically acceptable non-toxic carrier can be prepared. When such a composition is prepared for parenteral administration (subcutaneous injection, intramuscular injection or intravenous injection), it is particularly preferable to use a solution form or suspension form, and particularly for vaginal or rectal administration, Semisolid dosage forms such as creams or suppositories are preferred, especially for nasal administration being powders, nasal drops or aerosol dosage forms.
  • compositions can be administered in unit dosage form and are well-known in the pharmaceutical arts, for example, as described in Remington's Pharmaceutical Sciences (Mac Publishing Company, Wiston, PA, 1970). Can be prepared by any known method. Injectable preparations may contain, as a pharmaceutical carrier, plasma-derived proteins such as albumin, amino acids such as glycine, and sugars such as mannitol. When used in the form of an injection, a buffer, a solubilizing agent, an isotonic agent and the like can be further added. When used as an aqueous solution or lyophilized product, T wee It is preferable to add a surfactant such as n80 (registered trademark) and Tween 20 (registered trademark).
  • n80 registered trademark
  • Tween 20 registered trademark
  • Parenteral dosage forms other than those for injection may contain distilled water or physiological saline, polyalkylene glycol such as polyethylene glycol, oil of plant origin, hydrogenated naphthalene, and the like.
  • Formulations for vaginal or rectal administration for example suppositories, contain, as common excipients, for example, polyalkylene glycols, cellulose, cocoa oil and the like.
  • Vaginal preparations may contain absorption enhancers such as bile salts, ethylenediamine salts and citrate salts.
  • Formulations for inhalation may be solid, may contain excipients such as ratatose, and nasal drops may be water or oily solutions.
  • the dosage form may contain a neurotrophic factor as such or a low soluble, pharmaceutically acceptable salt of a neurotrophic factor in body fluids.
  • a neurotrophic factor as such or a low soluble, pharmaceutically acceptable salt of a neurotrophic factor in body fluids.
  • such salts include: (1): acid addition salts such as phosphoric acid, sulfuric acid, citric acid, tartaric acid, tannic acid, pamoic acid, alginic acid, polyglutamic acid, naphthalene mono- or disulfonic acid, polygalataturonic acid, etc. , (2): salts or complexes with polyvalent metal cations such as zinc, calcium, bismuth, barium, nickel or (1)
  • the neurotrophic factor is preferably converted to a poorly water-soluble salt, which is then mixed with a gel, for example, aluminum monostearate gel and sesame oil, to obtain a suitable injection.
  • a gel for example, aluminum monostearate gel and sesame oil
  • Particularly preferred salts in this case are zinc salts, zinc tannate salts, pamoate salts and the like.
  • Another dosage form of an injectable sustained release formulation converts a neurotrophic factor, preferably to a poorly water soluble salt, which is slow to disintegrate, such as a polylactic acid Z polydalicholate polymer or a copolymer thereof. Some are encapsulated in non-toxic, non-antigenic polymers.
  • Particularly preferred in this case are salts of zinc, zinc tannate, pamoate and the like.
  • neurotrophic factor or a salt thereof is microencapsulated together with lecithin, cholesterol, and free fatty acids, and then encapsulated in a gelatin capsule.
  • the preparation may contain, for example, an absorption enhancer, a stabilizing agent, a surfactant and the like.
  • the function protecting agent or improving agent for knee cell of the present invention or the function protecting agent or improving agent for knee tissue of the present invention includes: It can be administered alone or in combination with insulin preparations to patients with impaired knee function. Knee inflammation-Prevents knee function decline in cancer patients and facilitates control of blood sugar and metabolism.
  • the dose When used in combination with insulin, the dose is equivalent to 4 to 100 units Z-human / day in terms of human insulin.
  • the daily dose of neurotrophic factor to be administered simultaneously or in advance is determined for adult patients.
  • the dosage is selected from the range of about 1 to about 2500 ⁇ g per day, preferably about 10 to about 500 ⁇ g per kg of body weight.
  • Example 1 Improvement effect of BDNF on knee histology in diabetic model animals
  • BDNF was purchased and used from Rigieneron (USA). The other reagents used were commercial grade reagents.
  • mice Male C57BL / Ks-db ⁇ dbJc1 mouse (SPF standard) was purchased from CLEA Japan. As normal mice, male C57BLZKsJ-dbmJc1 mice (SPF standard) were purchased from CLEA Japan. After preliminary rearing, they were used for the experiment at the age of 11 weeks. The temperature of the mouse is set at 23 ⁇ 2 ° C, the humidity is set at 55 ⁇ 10%, and the lighting is on from 8:00 to 20:00.
  • the animals were bred in a room set to a cycle of 0:00 to 8:00 extinguishing. During preliminary breeding, they were allowed to freely take solid feed (CE-2, CLEA Japan) and sterilized tap water.
  • BDNF solution is a phosphate solution containing 1% mannitol and 0.01% Tween 80.
  • the solution was diluted to 2 OmgZm1 with an acid buffer (10 mM phosphoric acid, 15 OmM sodium chloride, ⁇ 7.0 ⁇ 0.2) and used for the experiment.
  • the administration was subcutaneous once daily, the administration amount was ZOmgZkgZ days, and the administration period was 3 weeks.
  • the spleen side of the knee was excised, weighed, homogenized in ethanol, left at -4 ° C, centrifuged, and the supernatant was brought to 20 ° C. Stored.
  • the insulin concentration in the extract was measured by the sandwich ELISA (Levis Insulin-Mouse EL ISA Kit, Shibayagi Co., Ltd.), and the glucagon concentration in the extract was determined by the competitive RIA method (Glucagon RIA kit, Linkori Research). It was measured. The content was calculated from the concentration in the extract and the tissue weight. The results are shown in Table 1 and Table 2, respectively.
  • a paraffin block was prepared according to a conventional method. Section slides of 3 ⁇ were prepared from paraffin blocks and stained with aldehyde fuchsin, insulin immunostaining, glucagon immunostaining, and somatostatin immunostaining.
  • tissue staining of the kidney was performed in the same manner for the normal mouse and the uremic mouse as controls.
  • FIG. 1 A is an aldehyde-fuchsin stained image
  • B is an insulin immunostained image
  • C is a glucagon immunostained image
  • D is a somatostatin immunostained image.
  • d bZd b (v e h i c le) is a diabetic control mouse
  • d bZd b rBDNF is a diabetic BDNF-administered mouse
  • d b no m no m (no rma
  • BDNF administration group In these cases, these cells are present at the periphery of the islets of Langerhans, as in normal control mice, and the improvement of knee function by BDNF not only increases the insulin content in insulin-positive cells, but also functions of glucagon-positive cells. It was suggested in the histological image that normalization was mediated.
  • mice were administered with BDNF for 6 weeks from the age of 8 weeks, the spleen side of the knee was excised, pre-fixed with 2.5% dtaltaraldehyde solution, and then 2% osmium. Post-fixed using acid, dehydrated and embedded in epoxy resin. After staining the ultrathin sections with uranium acetate and lead citrate, the islets of Langerhans B cells were examined by transmission electron microscopy (JEM120 OEX II, JEOL) (magnifications of 83,000 and 160,000). (0x). The photographs are shown in Figs.
  • C57BLNO6N mice (SPF standard) were used as normal control animals from Japan's Charles River, and were sampled at the age of 14 weeks without drug administration, and were sampled at the age of 14 weeks. Islet B cells were observed with a transmission electron microscope (magnifications 83,000 and 16000), and the photographs are shown in FIGS. 4 and 7. In addition, the same diabetic mice as those used in Example 1 were used as the diabetic control mice, and electron micrographs (magnifications 83,000 and 16000) are shown in FIGS. 2 and 5 in the same manner.
  • the drug of the present invention containing a neurotrophic factor as an active ingredient is effective in improving dysfunction of the knee caused by various causes, protects cells and tissues of the knee, and decreases in function due to the damage. It has the effect of improving the function of cells and tissues of the knee, and is useful as an agent for protecting and improving knee dysfunction.

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Description

明 細 書 膝臓機能障害改善剤 技術分野
本発明は、 神経栄養因子を有効成分とする膝臓細胞保護剤もしくは機能低下し た鸱臓細胞の機能改善剤、 または神経栄養因子を有効成分とする膝臓組織保護剤 もしくは機能低下した膝臓組織の機能改善剤に関する。
背景技術
膝臓は膝島 （ランゲルハンス島 （ラ氏島） ） と呼ばれる内分泌 織と、 アミ ラーゼ、 リパーゼ、 プロテア一ゼなどの消化酵素の分泌を行う外分泌腺組織によ つて構成される器官である。 ランゲルハンス島にはインスリンなどを合成 ·分泌 する B細胞 （]3細胞） 、 グルカゴンなどを合成 ·分泌する A細胞 （α細胞） 、 ソ マトスタチンなどを合成 ·分泌する D細胞 （δ細胞） 、 パンクレアティックポリ ペプチドを合成 '分泌するパンクレアティックポリペプチド細胞 （以下、 Ρ Ρ細 胞と略す） などが存在し、 血糖や代謝の制御に大きな影響を及ぼしている。 これ らの内分泌腺、 外分泌腺機能の障害は、 それぞれ、 血糖値コントロールの異常 (糖尿病、 低血糖症、 インスリンショックなど） や消化機能低下 （脂肪便など） を引き起こす。
膝臓機能障害は様々な原因によって起きるが、 代表的な原因疾患としては、 鸱 炎や糖尿病が挙げられる。 鸱炎は臨床的には急性鸱炎と慢性眸炎に分類され、 前 者は、 血中や尿中の膝酵素の上昇を伴う急性腹痛発作によって特徴づけられる、 単発あるいは反復性の膝炎である。 重症の場合、 膝実質の壊死 '出血、 重篤な腎 不全や呼吸不全を併発し、 ショックに陥って死亡することもある。 ？台療方法とし ては、 絶食と Η 2ブロッカーの投与によって膝臓外分泌を抑制し、 プロテアーゼ 抑制剤、 抗生物質、 鎮痛剤を投与して合併症を防ぐのが一般的である。
慢性膝炎は、 主にアルコール過剰摂取に由来し、 反復または持続する腹部疼痛 を特徴とする。 膝臓外分泌組織の破壊や永久的な消失を伴う不規則な硬化を形態 学的特徴とし、 脂肪便のような降臓外分泌腺不全に起因する症状を呈する。 慢性 膝炎においては膝臓内分泌機能の障害により約 50%の患者で糖尿病の合併が認 められる （膝性糖尿病） 。 この慢性鸱炎における二次性糖尿病の特徴はインスリ ンおよびグルカゴン両者の欠乏であり、 治療にはィンスリン投与を伴う場合が多 い。 慢性膝炎の死因の約半数は糖尿病に関するものであり、 グルカゴンの欠乏か らインスリン注射後の低血糖 （ィンスリンショック） や、 腎症 ·感染症の合併症 が死因として指摘されている。
また、 糖尿病の治療にィンスリンの分泌促進作用を持つスルホニルゥレア剤が 用いられているが、 膝臓に対しインスリンの分泌促進を働きかけることにより、 過度の負担をかけることになり膝臓細胞または膝臓組織に機能障害を引き起こす ことがある。
現在のところ、 膝臓機能障害に対しては原因となる病態あるいは因子を取り除 くことで、 ！？1能の自然回復を促す治療法が用いられているが （ 「膝臓病学」 、 編者：竹内 正、 発行：株式会社南光堂、 1 993年 8月 1日発行） 、 いったん 低下した膝臓の機能を積極的に回復させる治療方法や薬剤はいまだ知られておら ず、 用いられていない。
一方、 神経栄養因子は、 生体内で標的細胞あるいは神経およびグリア細胞 ·シ ュワン細胞から供給され、 神経細胞の生存維持、 分化促進などの作用を示す蛋白 質の総称であり、 作用する神経の種類や受容体によって、 多くの種類に分類され ている。 中でも、 ニューロトロフィンとして知られる蛋白群は互いに相同性が高 く、 ファミリーを形成している。 神経栄養因子には、 神経成長因子 （以下、 NG
Fと略す） 、 脳由来神経栄養因子 （以下、 BDNFと略す） 、 ニューロトロフィ ン 3 (以下、 NT— 3と略す） 、 ニューロトロフィン 4 (以下、 NT— 4と略 す） 、 ニューロトロフィン 5 (以下、 NT— 5と略す） またはニューロトロフィ ン 6 (以下、 NT— 6と略す） 等のニューロトロフィン、 毛様体神経栄養因子 (以下、 CNTFと略す） 、 グリア細胞由来神経栄養因子 （以下、 GDNFと略 す） 等がある。 また、 ニューロトロフィンは、 p 75および t r k遺伝子産物で ある受容体 （t r kA、 t r kBおよび Zまたは t r kC) の特異的リガンドと して作用することが知られている （野々ネす健、 畠中寛；実験医学第 13卷、 3 76頁 （1995年） ） 。 ニューロトロフィンは従来より、 神経変性疾患に対する治療剤としての医薬用 途が研究されており、 S o c i e t y f o r Ne u r o s c i e n c e, v o 1. 21, p. 1535 (1995) A. P. M i z i s i n他、 には、 糖尿病 性の末梢神経障害に対する B D N Fの薬効が示されている。 この文献は B D N F 力 Sインビボに於ける運動神経伝達速度の低下を軽減するという知見から、 ニュー ロバチ一への効果を示唆したものである。 また、 WO 98 32458には、 B
D N Fなどの神経栄養因子が、 糖尿病モデル動物の血糖値を正常化することが記 載され、 糖尿病治療への適用が開示されている。
発明の開示
上述のように、 膝臓細胞保護剤もしくは障害を受けた膝臓細胞の改善剤、 m 細胞機能保護剤もしくは機能低下した膝臓細胞の機能改善剤、 膝 Aim織保護剤も しくは障害を受けた薛 l a織の改善剤、 または膝 si且織機能保護剤もしくは機能 低下した膝 Htm織の機能改善剤が医療現場で求められている。
本発明者らは、 BDNFを投与された 2型糖尿病モデル動物のインスリン分泌 能が高く保たれることに注目し、 2型糖尿病モデル動物を用いて、 膝臓機能改善 作用について検討した。 その結果、 BDNFは、 （1) 2型糖尿病モデル動物に おいて低下している膝臓のインスリン含量を增加し、 （2) 増加しているグルカ ゴン含量を低下し、 （3) 膝臓ランゲルハンス島における A細胞 · D細胞の局在 を正常化し、 （-4) 膝臓ランゲルハンス島における B細胞のインスリン分泌顆粒 の再顆粒化を促し、 細胞内小器官を正常化するということを見いだした。 この B DNFの脾臓機能改善作用および膝臓細胞保護作用の発見を基に更に検討を重ね、 本発明に到った。
詳しくは、 本発明は：
1. 神経栄養因子を有効成分とする脾臓細胞保護剤または障害を受けた薛臓細 胞障害の改善剤；
2. 神経栄養因子を有効成分とする膝臓細胞機能保護剤または機能低下した眸 臓細胞の機能改善剤；
3. 神経栄養因子を有効成分とする膝 H 且織保護剤または障害を受けた膝 S m 織障害の改善剤； 4 . 神経栄養因子を有効成分とする膝臓組織機能保護剤または機能低下した膝 臓組織の機能改善剤；
5 . 隊臓細胞が膝臓ランゲルノ、ンス島 B細胞 （]3細胞） 、 A細胞 （α細胞） 、 および Ζまたは D細胞 （δ細胞） である 1または 2記載の保護剤または機能改善 剤；
6 . 膝臓細胞が膝臓ランゲルハンス島 Β細胞 （]3細胞） 、 Α細胞 （α細胞） 、 D細胞 （δ細胞） および Ζまたは Ρ Ρ細胞である 1または 2記載の保護剤または 機能改善剤；
7 . 膝騰且織が膝臓ランゲルハンス島 （ラ氏島） である 3または 4記載の膝臓 組織機能保護剤または機能低下した膝臓組織の機能改善剤；
8 . 膝臓内分泌機能 （インスリン分泌能、 グルカゴン分泌能および/またはソ マトスタチン分泌能） 保護剤もしくは改善剤または膝臓内分泌機能異常 （インス リン分泌能、 グルカゴン分泌能および Ζまたはソマトスタチン分泌能） 改善剤で ある 1、 2、 5または 6記載の保護剤または改善剤；
9 . 膝臓内分泌機能 （インスリン分泌能、 グルカゴン分泌能および Ζまたはソ マトスタチン分泌能） 保護剤もしくは改善剤または膝臓内分泌機能異常 （インス リン分泌能、 グルカゴン分泌能および Ζまたはソマトスタチン分泌能） 改善剤で ある 3、 4または 7記載の保護剤または改善剤；
1 0 . 膝臓細胞機能低下の原因または障害の原因が糖尿病である 1、 2、 5、 6または 8記載の保護剤または改善剤；
1 1 . 膝) urn織機能低下の原因または障害の原因が糖尿病である 3、 4、 7ま たは 9記載の保護剤または改善剤；
1 2 . 膝臓細胞機能低下の原因または障害の原因が急性鸱炎または慢性膝炎で ある 1、 2、 5、 6または 8記載の保護剤または改善剤；
1 3 . 膝臓組織機能低下の原因または障害の原因が急性膝炎または慢性膝炎で ある 3、 4、 7または 9記載の保護剤または改善剤；
1 4 . 脖臓細胞機能低下の原因または障害の原因がスルホニルゥレア剤である 1、 2、 5、 6または 8記載の保護剤または改善剤；
1 5 . 膝 且織機能低下の原因または障害の原因がスルホニルゥレア剤である 3、 4、 7または 9記載の保護剤または改善剤；
16. 1、 2、 5、 6または 8記載の保護剤または改善剤を有効成分とする急 性眸炎または慢性膝炎治療剤；
1 7. 3、 4、 7または 9記載の保護剤または改善剤を有効成分とする急性脖 炎または慢性膝炎治療剤；
16. 神経栄養因子を有効成分とする膝臓内分泌組織保護剤または障害を受け た膝臓内分泌組織の改善剤；
1 7. 神経栄養因子を有効成分とする膝臓内分泌組織機能保護剤または機能低 下した鸱臓内分泌組織機能の改善剤；
1 8. 神経栄養因子を有効成分とする膝臓外分泌組織保護剤または障害を受け た膝臓外分泌組織の改善剤；
1 9. 神経栄養因子を有効成分とする瞎臓外分泌組織機能保護剤または機能低 下した膝臓外分泌組織機能の改善剤；
20. 有効成分の神経栄養因子が NGF (神経成長因子） 、 BDNF (脳由来 神経栄養因子） 、 CNTF (毛様体神経栄養因子） 、 NT— 3 (ニューロトロフ イン 3) 、 NT— 4 (ニューロ トロフィン 4) 、 NT— 5 (ニューロ トロフィン 5) または NT— 6 (ニューロトロフィン 6) である 1〜19記載の保護剤また は改善剤；
21. 有効成分の神経栄養因子が BDNF (脳由来神経栄養因子） である 1〜 19記載の保護剤または改善剤；
22. 有効成分の神経栄養因子が C NT F (毛様体神経栄養因子） である 1〜 19記載の保護剤または改善剤；
23. 有効成分の神経栄養因子が NT— 3 (ニューロトロフィン 3) である 1 〜1 9記載の保護剤または改善剤；
24. 有効成分の神経栄養因子が NT— 4 (ニューロトロフィン 4) である 1
〜1 9記載の保護剤または改善剤；
25. 有効成分の神経栄養因子が NT— 5 (ニューロトロフィン 5) である 1 〜 1 9記載の保護剤または改善剤；
26. 有効成分の神経栄養因子が NT— 6 (ニューロトロフィン 6) である 1 〜1 9記載の保護剤または改善剤；
2 7 . 有効成分の神経栄養因子が N G F (神経成長因子） である 1〜1 9記載 の保護剤または改善剤；
2 8 . 有効成分の神経栄養因子が G D N F (グリア細胞由来神経栄養因子） で ある 1〜： I 9記載の保護剤または改善剤；
2 9 . 有効成分の神経栄養因子が t r k A、 t r k Bおよびノまたは t r k C 受容体ァゴニストである 1〜 1 9記載の保護剤または改善剤；
に関する。
以下、 本明細書における用語の意味あるいは定義について述べる。
「保護剤」 とは、 障害または機能低下を防ぐ薬剤を意味する。
「改善剤」 とは、 障害を受けた状態または機能低下の起こった状態を正常の状 態に近づけるまたは正常の状態にする薬剤を意味する。
「神経栄養因子」 とは、 生体では、 神経成長の標的となる細胞から分泌され、 または自己分泌や傍分泌により神経 （ニューロン） の成長、 分化、 生存を助けて、 神経回路 （シナプス） を形成させる生理活性物質を意味する。 神経栄養因子には 例えば、 神経成長因子 （以下、 N G Fと略す） 、 脳由来神経栄養因子 （以下、 B D N Fと略す） 、 ニューロトロフィン 3 (以下、 N T— 3と略す） 、 ニューロト 口フィン 4 (以下、 N T— 4と略す） 、 ニューロトロフィン 5 (以下、 N T— 5 と略す） 、 ニューロトロフィン 6 (以下、 N T— 6と略す） 等のニューロトロフ イン、 毛様体神経栄養因子 （以下、 C N T Fと略す） 、 グリア細胞由来神経栄養 因子 （以下、 G D N Fと略す） 等が含まれる。 なお、 公知の手法にて、 神経栄養 因子天然配列の一部を置換、 欠失あるいは付加して作成した組換神経栄養因子改 変体も、 同様の生理活性を有する限り、 本明細書における 「神経栄養因子」 に含 まれる。
「膝臓機能障害」 とは、 膝臓の内分泌腺機能あるいは外分泌腺機能が低下ある いは異常に亢進した病態を意味する。 内分泌腺機能とは、 主としてインスリン、 グルカゴンおよび またはソマトスタチンの分泌能、 外分泌腺機能とは、 主とし て膝臓酵素 （アミラーゼ、 プロテアーゼおよび Zまたはリパーゼ） の鸱液への分 泌能である。 これらの分泌能は、 血中インスリン濃度測定など、 既に臨床で繁用 される手法で評価できる。
「膝臓細胞保護」 とは、 膝臓内分泌腺細胞、 外分泌腺細胞を種々の原因による 変性から保護する作用を意味し、 膝臓組織切片の顕微鏡観察により評価すること が出来る。 内分泌腺細胞の場合、 アルデヒド ·フクシン染色など一般的な細胞染 色法の他、 膝臓ランゲルハンス島 B細胞 （ 細胞） はインスリン免疫染色、 A細 胞 （α細胞） はグルカゴン免疫染色、 D細胞 （δ細胞） は、 ソマトスタチン免疫 染色で特異的に染色でき、 形態を観察できる。 また、 細胞内小器官の構造を電子 顕微鏡により観察することによって評価可能である。
「膝臓組織保護」 とは、 膝臓内分泌腺組織、 外分泌腺組織を種々の原因による 変性から保護する作用を意味し、 鸱臓組織切片の顕微鏡観察により評価すること が出来る。 へマトキシリン 'ェォジン染色、 ァノレデヒド ·フクシン染色など一般 的な細胞染色法で、 組織の形態を観察できる。 また、 細胞内小器官の構造を電子 顕微鏡により観察することによって評価可能である。
「 t r k A、 t r k Bおよび Zまたは t r k C受容体ァゴニスト」 とは、 「二 ユーロトロフィン」 の受容体として知られる t r k遺伝子発現産物のうち、 t r k A、 t r k Bまたは t r k Cに結合してこれらの受容体を活性化させ、 作用を 発現させる物質の総称である。 具体的には既知のニューロトロフィンとして t r k Aに結合する N G F、 t r k B結合する B D N F、 N T— 4、 t r k Cに結合 する N T— 3等が挙げられる。 この概念には、 それぞれの 「ニューロトロフィ ン」 の改変体 （アミノ酸置換、 欠失、 付加改変体、 糖鎖改変） のみならず、 より 低分子のぺプチド、 有機化合物も t r k A、 t r k Bまたは t r k C受容体に対 する結合能および活性化能、 例えばチロシン残基のリン酸化などを有する限り、
「 t r k A、 t r k Bおよび Zまたは t r k C受容体ァゴニスト」 の概念に含ま れる。
「スルホニルゥレア剤」 としては、 例えばトルプタミド、 ァセトへキサミド、 クロルプロパミド、 グリクロビラミド、 トラザミド、 グリクラジド、 グリベンク ラミ ド、 ダリブゾール、 グリミジン等が挙げられる。
図面の簡単な説明
図 1は降臓の組織染色像の光学顕微鏡写真である。 A ：アルデヒド一フクシン 染色像、 B ：インスリン免疫染色像、 C：グルカゴン免疫染色像、 D： ソマトス タチン免疫染色像を示す。 db db (v e h i c l e) は糖尿病コントロール マウスを、 d bZd b (BDNF) は糖尿病 BDNF投与マウスを、 d bZm (n o rma 1 ) は正常コントロールマウスを表す。
図 2は糖尿病コント口一ルマゥスの膝臓 B細胞の電子顕微鏡写真 （倍率 830
0倍） である。
図 3は BDNF投与マウスの藤臓 B細胞の電子顕微鏡写真 （倍率 8300倍） である。
図 4は正常マウスの膝臓 B細胞の電子顕微鏡写真 （倍率 8300倍） である。 図 5は糖尿病コント口一ルマゥスの膝臓 B細胞の電子顕微鏡写真 （倍率 160
00倍） である。
図 6は B D N F投与マゥスの膝臓 B細胞の電子顕微鏡写真 （倍率 16000 倍） である。
図 7は正常マウスの膝臓 B細胞の電子顕微鏡写真 （倍率 16000倍） である。 発明を実施するための最良の形態
本発明の有効成分の神経栄養因子は市販されている力、 または以下の方法で製 造することができる。
本発明の有効成分の神経栄養因子は、 医薬品として使用できるよう精製されて いれば、 種々の方法で調製されたものを用いることができる。 神経栄養因子を産 生する初代培養細胞や株化細胞を培養し、 培養物 （培養上清、 培養細胞等） から 分離精製して神経栄養因子を得ることもできる。 あるいは遺伝子工学的手法によ り神経栄養因子をコードする遺伝子を適切なベクターに組み込み、 これを適当な 宿主に挿入して形質転換し、 この形質転換体の培養上清から目的とする組み換え 神経栄養因子を得ることができる。 上記の宿主細胞は特に限定されず、 従来から 遺伝子工学的手法で用いられている各種の宿主細胞、 例えば大腸菌、 枯草菌、 酵 母、 糸状菌、 植物または動物細胞などを用いることができる。
上記方法で得られる神経栄養因子は、 各々実質的に同じ作用を持つ限り、 その ァミノ酸配列の一部が欠失または他のァミノ酸により置換されていたり、 他のァ ミノ酸配列が一部挿入されていたり、 N末端および Zまたは C末端に 1または 2 以上のァミノ酸が結合していたり、 あるいは糖鎖が同様に欠失または置換されて いるものをも含む。
BDNFの製造方法：
遺伝子工学的手法を用いる場合、 BDNFをコードする遺伝子を適切なベクタ 一に組み込み、 これを適切な宿主に挿入して形質転換し、 この形質転換体の培養 上清から目的とする組み換え BDNFを得ることができ （例えば、 P r o c. N a t 1. Ac a d. S c i . USA, v o l . 88， p. 961 (1991) 、 B i o c h em. B i o p h y s. R e s. Co mm u n . v o l . 186, p. 1553 (1 992) ) 、 均質かつ大量の B D N Fの生産に好適である。 上記宿 主細胞は特に限定されず、 従来から遺伝子工学的手法で用いられている各種の宿 主細胞、 例えば大腸菌、 枯草菌、 酵母、 植物または動物細胞を用いることができ る。
NT— 3の製造方法：
NT— 3は BDNFと同様に、 種々の宿主細胞で発現させ、 生産することがで きる。 Ne u r o n, Vo l . 4, 767-773 (1990) 、 あるいは特開 平 5— 16 1493 (WO 91/3659) にその製法、 アツセィ法が開示され ている。
NT— 4の製造方法：
NT— 4は BDNFと同様に、 種々の宿主細胞で発現させ、 生産することがで きる。 P r o c. Na t l . Ac a d. S c i . VSA, Vo l . 89， P. 3
060— 3064 (1992. 4) 、 特表平 7— 509600 (WO 93/25 684) 、 あるいは特表平 6— 501 61 7 (WO 92/5254) に組換え N T一 4発現方法およびァッセィ方法が記載されている。
CNTFの製造方法：
C NT Fは BDNFと同様に、 種々の宿主細胞で発現させ、 大量生産すること 力、できる。 B i o c h i m i c a e t B i o p h y s i c a Ac t a, V o 1. 1090, P. 70— 80 (1 991) 、 J . Ne u r o c h em i s t r y, VO l . 57, P. 1003- 1012 (1 991) に、 組換え CNTF発 現方法おょぴアツセィ方法が記載されている。 また、 特表平 4— 502916 (W0 9 0 / 7 3 4 1 ) には、 組換え製法と精製方法が開示されている。
本発明の神経栄養因子を有効成分とする膝臓細胞の機能保護剤もしくは改善剤 または膝臓組織の機能保護剤もしくは改善剤は、 非経口的または経口的に投与で さる。
本発明の上記薬剤の正確な投与量および投与計画は、 個々の治療対象毎の所要 量、 治療方法、 疾病または必要性の程度、 および、 当然医師の判断によることが 必要である。 非経口的投与する場合の投与量、 投与回数は症状、 年齢、 体重、 投 与形態等によって異なるが、 例えば注射剤として皮下または静脈に投与する場合、 成人の患者の体重 1 k g、 一日あたり約 1〜約 2 5 0 0 μ gの範囲、 好ましくは 約 1 0〜約 5 0 0 /z gの範囲から投与量が選択され、 例えば噴霧剤として気管に 投与する場合、 成人の患者の体重 1 k g、 一日あたり約 1 /i g〜約 2 5 0 0 /x g の範囲、 好ましくは約 1 0〜約 5 0 0 gから選択される。 投与計画としては、 連日投与または間欠投与またはその組み合わせがある。
経口的投与する場合の投与量、 投与回数は症状、 年齢、 体重、 投与形態等によ つて異なる力 例えば、 成人の患者の体重 l k g、 一日あたり約 5〜約 2 5 0 0 μ gの範囲、 好ましくは約 1 0〜約 1 0 0 0 μ gの範囲から投与量が選択される。 神経栄養因子を薬学的に許容しうる非毒性の担体と混和することから成る医薬 組成物を製造することができる。 このような組成物を、 非経口投与用 （皮下注射、 筋肉注射、 または静脈注射） に調製する場合は、 特に溶液剤型または懸濁剤型が よく、 膣または直腸投与用の場合は、 特にクリームまたは坐薬のような半固形型 剤型がよく、 経鼻腔投与用の場合特に粉末、 鼻用滴剤、 またはエアロゾル剤型が よい。
組成物は一回量投与剤型で投与することができ、 また例えばレミントンの製薬 科学 （マック .パブリッシング ·カンパニー、 ィーストン、 P A、 1 9 7 0年） に記載されているような製薬技術上よく知られているいずれかの方法によって調 製できる。 注射用製剤は医薬担体として、 例えば、 アルブミン等の血漿由来蛋白、 グリシン等のアミノ酸、 マンニトール等の糖を加えることができる。 注射剤型で 用いる場合には更に緩衝剤、 溶解補助剤、 等張剤等を添加することもできる。 ま た、 水溶液製剤、 凍結乾燥製剤として使用する場合、 凝集を防ぐために T w e e n 8 0 (登録商標） 、 T w e e n 2 0 (登録商標） などの界面活性剤を添加す るのが好ましい。 また注射用以外の非経口投与剤型は、 蒸留水または生理食塩液、 ポリエチレングリコールのようなポリアルキレングリコール、 植物起源の油、 水 素化したナフタレン等を含有しても良い。 例えば坐薬のような膣または直腸投与 用の製剤は、 一般的な賦形剤として例えばポリアルキレングリコール、 ヮセリン、 カカオ油脂等を含有する。 膣用製剤では胆汁塩、 エチレンジァミン塩、 クェン酸 塩等の吸収促進剤を含有しても良い。 吸入用製剤は固体でもよく、 賦形剤として 例えばラタトースを含有してもよく、 また経鼻腔滴剤は水または油溶液であって ちょい。
一回の投与により、 長期間、 例えば一週間ないし一年間、 この発明の化合物を 対象に与え続ける剤型が特に望ましい。 種々の徐放剤型、 デポ剤型または埋め込 み投与剤型が利用できる。 例えば、 投与剤型は神経栄養因子そのまままたは体液 に溶解性の低レ、薬学的に許容しうる神経栄養因子の塩を含有しても良い。 このよ うな塩の例としては、 （1 ) ： リン酸、 硫酸、 クェン酸、 酒石酸、 タンニン酸、 パモ酸、 アルギン酸、 ポリグルタミル酸、 ナフタレンモノまたはジスルホン酸、 ポリガラタツロン酸等のような酸付加塩、 （2 ) ：亜鉛、 カルシウム、 ビスマス、 バリウム、 ニッケルのような多価金属カチオンとの塩または錯体または （1 ) と
( 2 ) との組み合わせ、 例えばタンニン酸亜鉛塩等である。 神経栄養因子を、 好 ましくは水難溶性塩に変換し、 それをゲル、 例えばアルミニウムモノステアレー トゲルとごま油等と調合して好適な注射剤としてもよい。 この場合特に好ましい 塩は亜鉛塩、 タンニン酸亜鉛塩、 パモ酸塩等である。 注射用徐放性製剤のもう一 つの剤型は、 神経栄養因子を、 好ましくは水難溶性塩に変換し、 それをポリ乳酸 Zポリダリコール酸の重合体またはその共重合体のような崩壊性の遅い非毒性、 非抗原性のポリマーに封入して含有させたものがある。 この場合特に好ましレ、塩 は亜鉛塩、 タンニン酸亜鉛塩、 パモ酸塩等である。 その他、 神経栄養因子または その水難溶性塩をコレステロールマトリクスまたはコラーゲンマトリタス中に封 入して持続性製剤化することが可能である。
経口剤としては神経栄養因子またはその塩を、 レシチン、 コレステロール、 遊 離脂肪酸と共にマイクロカプセル化したもの、 それをゼラチンカプセルに封入し た製剤等、 神経栄養因子またはその塩を腸溶性カプセルに封入した製剤等が挙げ られる。 該製剤は例えば吸収促進剤、 安定化剤、 界面活性化剤等を含んでも良い また、 本発明の膝臓細胞の機能保護剤もしくは改善剤または膝臓組織の機能保 護剤もしくは改善剤は、 単独で、 あるいはインスリン製剤と併用して、 膝臓機能 障害の患者に投与できる。 膝炎ゃ瞵癌患者の膝臓機能低下を防止し、 血糖や代謝 のコントロールを容易にする。 また、 インスリンと併用する場合、 投与量は、 ヒ トインスリンに換算して、 4〜100単位 Zヒ ト/日相当、 同時にあるいは予め 投与される神経栄養因子の一日用量は、 成人の患者の体重 l k g、 一日あたり約 1〜約 2500 μ gの範囲、 好ましくは約 10〜約 500 μ gの範囲から投与量 が選択される。
(毒性）
神経栄養因子、 特に BDNFの場合、 ラットおよび力二クイザルで、 それぞれ を l O Omg/k g 6 Omg/k gの皮下投与を 4週間実施したが、 死亡例は なく、 また、 急性毒性の点にっレ、ても、 ラットおよび力二クイザルで 200 m g /k gの投与量でも死亡の発現は無く安全性は高い。
以下、 本発明を実施例にて説明する。
実施例 1 ：糖尿病モデル動物における膝組織像に対する BDNFの改善効果
(1) 実験材料と方法
試薬： BDNFはリジエネロン社 （米国） より購入して使用した。 その他の試 薬は市販の特級試薬を用いた。
実験動物：糖尿病マウスは雄性 C 57 B L/K s - db^db J c 1マウ ス （SPF規格） を日本クレアより購入した。 正常マウスは雄性 C 57BLZK s J - d b m J c 1マウス （SPF規格） を日本クレアより購入した。 予備 飼育の後、 1 1週齢で実験に使用した。 マウスは飼育環境として温度は 23 ± 2°C、 湿度は 55± 10%に設定され、 照明は 8 ： 00〜20 ： 00点灯、 2
0 ： 00〜8 ： 00消灯のサイクルに設定された部屋で飼育した。 予備飼育中は 固形飼料 （CE— 2、 日本クレア） および滅菌水道水を自由摂取させた。
(2) BDNF投与液の調製および投与
BDNF投与液は 1%マンニトールと 0. 01%Twe e n 80を含むリン 酸緩衝液 （ 10 mMリン酸、 15 OmM塩化ナトリウム、 ρΗ7. 0±0· 2) で 2 OmgZm 1に希釈し、 実験に供した。 投与は 1日 1回の皮下投与とし、 投 与量は ZOmgZkgZ日、 投与期間は 3週間とした。
(3) 膝臓抽出液の作成とインスリン含量おょぴグルカゴン含量の測定
3週間の BDNF投与後に膝臓の脾臓側を摘出し、 重量を測定した後、 酸エタ ノール中でホモジナイズし、 ー晚 4°Cにて放置した後に遠心し、 上清を一 20°C にて保管した。 抽出液中のインスリン濃度はサンドイッチ EL I SA法 （レビス インスリン一マウス EL I SAキット、 株式会社シバヤギ） で測定し、 抽出液中 のグルカゴン濃度は競合 R I A法 （グルカゴン R I Aキット、 リンコリサーチ 社） で測定した。 含量は抽出液中の濃度と組織重量から算出した。 結果をそれぞ れ表 1および表 2に示す。
Figure imgf000015_0001
a Pく 0. 05 v s 正常コントロ一ル （Tu r k e yの検定） b P< 0. 01 v s 正常コントロール （Tu r k e yの検定） c P<0. 01 v s 糖尿病マウス +溶媒投与 （Tur keyの検定）
(4) 膝臓の組織染色
3週間の BDNF投与後に膝臓の十二指腸側を摘出し、 ブアン液を用いて固定 化した後に常法に従いパラフィンブロックを作成した。 パラフィンプロックより 3 μπιの切片スライ ドを作成し、 アルデヒ ド一フクシン染色、 インスリン免疫染 色、 グルカゴン免疫染色、 ソマトスタチン免疫染色を行った。
なお、 コントロールとして正常マウスおよひ 尿病マウスについても同様にし て鸱臓の組織染色を行った。
上記染色した組織について光学顕微鏡写真を撮影した （サイズバ一は 200 mを示す） 。 それらを図 1に示す。 図 1中、 Aはアルデヒド一フクシン染色像、 Bはインスリン免疫染色像、 Cはグルカゴン免疫染色像、 Dはソマトスタチン免 疫染色像を示す。 d bZd b (v e h i c l e) は糖尿病コントロールマウスを、 d bZd b rBDNF) は糖尿病 BDNF投与マウスを、 d bノ m (n o rma
1 ) は正常コントロールマウスを表す。
(5) 結果
( i ) BDNF投与による膝臓インスリン含量および膝臓グルカゴン含量の改善 前記表 1および表 2に示される結果から明らかなように、 糖尿病コントロール マウスでは正常コントロールマウスと比較して、 膝臓インスリン含量は約 25 % に滅少し、 膝臓グルカゴン含量は約 3倍に増加していた。 それに対して、 該糖尿 病マウスに 3週間 BDNF投与したマウスでは膝臓インスリン含量は糖尿病コン トロールマウスの約 10倍に増加した。 その一方で、 同 BDNF投与マウスにお ける脖臓グルカゴン含量は糖尿病コント口ールマウスの約 50 %に減少した。 こ の結果から、 BDNFは糖尿病マウスの膝臓に対し、 インスリン含量を増加させ、 グルカゴン含量を減少させることで、 膝臓の機能を正常化していることが明らか になった。
( i i ) BDNF投与による膝 ¾且織像の改善
図 1に示されるアルデヒド一フクシン染色の結果から、 糖尿病コントロールマ ウスの膝臓では正常マウスの If臓と比較して、 明らかなインスリン顆粒の脱落が 認められた。 一方、 BDNFを投与した群では顕著な再顆粒化が認められた。 ィ ンスリン免疫染色においても同様の結果が認められた。 グルカゴンおよびソマト スタチンの免疫染色では、 糖尿病コントロールマウスにおいてグルカゴン陽性細 胞およびソマトスタチン陽性細胞の内在化が認められた。 一方、 BDNF投与群 においてはこれらの細胞は正常コントロールマウスと同様にランゲルハンス島の 辺縁部に存在しており、 B D N Fによる膝臓機能の改善がインスリン陽性細胞に おけるインスリン含量の増加だけでなく、 グルカゴン陽性細胞の機能正常化など を介していることが組織像においても示唆された。
：ランゲルハンス島 B細胞の電子顕微鏡による観察
( 1 ) 実施例 1の方法にしたがって マウス 8週齢より、 6週間 B D N Fを投与した後に膝臓の脾臓側を摘出し、 2 . 5 %ダルタルアルデヒド液で前固 定した後、 2 %オスミウム酸を用いて後固定し、 脱水後、 エポキシ樹脂に包埋し た。 超薄切切片を酢酸ウランおよびクェン酸鉛にて染色した後、 ランゲルハンス 島 B細胞を透過型電子顕微鏡 （J EM 1 2 0 O E X II、 日本電子） （倍率 8 3 0 0倍および 1 6 0 0 0倍） にて観察した。 その写真を図 3および図 6に示す。 正常コントローノレ動物として C 5 7 B Lノ 6 Nマウス （S P F規格） を日本チ ヤールズリバーから、 瞻入し、 薬物投与などを行わず 1 4週齢でサンプリングし、 上記 B D N F投与マウスと同様に、 ランゲルハンス島 B細胞を透過型電子顕微鏡 にて観察 （倍率 8 3 0 0倍および 1 6 0 0 0倍） し、 その写真を図 4および図 7 に示す。 また糖尿病コントロールマウスとして実施例 1で用いたものと同じ糖尿 病マウスを用い、 同様にして電子顕微鏡写真 （倍率 8 3 0 0倍および 1 6 0 0 0 倍） を図 2および図 5に示す。
( 2 ) 結果
図 4および図 7に示されるとおり、 正常コントロールの C 5 7 B Lマウスの B 細胞には細胞質内に多数のィンスリン分泌顆粒が存在し、 ミ トコンドリァゃゴル ジ装置が散在性に見られた。 粗面小胞体は乏しく、 明らかでなかった。
一方、 糖尿病コントロールの ノ ί ώマウスにおいては、 図 2および図 5か ら明らかなように、 分泌顆粒の減少が著明に認められた。 また粗面小胞体の増加、 ゴルジ装置の拡張、 ミ トコンドリアの大型化 （肥大） も認められ、 膝臓 Β細胞の 内分泌機能の低下を示していた。
それに対して、 B D N Fを投与した 6マウスにおいては、 図 3および 図 6に示されるように、 分泌顆粒の再貯留が認められた。 また粗面小胞体の増加、 ゴルジ装置の拡張、 ミ トコンドリアの大型化といった所見はほとんど認められず、 正常 C 57 BLマウスと同様の 像であった。
以上の結果から、 BDNFの投与により i/ b_/^bマウスの膝臓内分 能が 正常化していることが明らかになった。
産業上の利用の可能性
本発明の、 神経栄養因子を有効成分とする薬剤は、 種々の原因で起こる膝臓機 能障害の改善に効果を有し、 膝臓の細胞や組織を保護し、 また障害を受けて機能 低下した膝臓の細胞や組織の機能を改善する効果を有するものであって、 膝臓機 能障害保護剤および改善剤として有用である。

Claims

請 求 の 範 囲
1. 神経栄養因子を有効成分とする膝臓細胞機能保護剤または機能低下した鸱 臓細胞の機能改善剤。
2. 神経栄養因子を有効成分とする膝臓組織機能保護剤または機能低下した膝 臓組織の機能改善剤。
3. 膝臓細胞が薛臓ランゲルハンス島 B細胞 （]3細胞） 、 A細胞 （α細胞） 、 および Ζまたは D細胞 （δ細胞） である請求項 1記載の保護剤または改善剤。
4.膝 stm織が膝臓ランゲルハンス島 （ラ氏島） である請求項 2記載の保護剤 または改善剤。
5. 請求項 1または 3記載の保護剤または改善剤を有効成分とする膝臓内分泌 機能保護剤もしくは改善剤または薛臓内分泌機能異常改善剤。
6. 請求項 2または 4記載の保護剤または機能改善剤を有効成分とする膝臓内 分泌機能保護剤もしくは改善剤または膝臓内分泌機能異常改善剤。
7. 有効成分の神経栄養因子が NGF (神経成長因子） 、 BDNF (脳由来神 経栄養因子） 、 CNTF (毛様体神経栄養因子） 、 NT— 3 (ニューロトロフィ ン 3) 、 NT— 4 (ニューロ トロフィン 4) 、 NT- 5 (ニューロ トロフィン 5) または NT— 6 (ニューロトロフィン 6) である請求項 1〜 5記載の保護剤 または改善剤。
8. 有効成分の神経栄養因子が t r k A、 t r k Bおよび Zまたは t r k C受 容体ァゴニストである請求項 1〜 5の保護剤または改善剤。
9. 神経栄養因子の膝臓細胞または組織の機能保護剤または機能改善剤の調製 のための使用。
10. 膝臓機能が低下している患者に、 治療に必要な量の神経栄養因子を投与 することを特徴とする、 膝臓機能障害を治療する方法。
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