JPH06321801A - 消化管粘膜障害の予防及び治療剤 - Google Patents
消化管粘膜障害の予防及び治療剤Info
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- JPH06321801A JPH06321801A JP6070021A JP7002194A JPH06321801A JP H06321801 A JPH06321801 A JP H06321801A JP 6070021 A JP6070021 A JP 6070021A JP 7002194 A JP7002194 A JP 7002194A JP H06321801 A JPH06321801 A JP H06321801A
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- Japan
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- csf
- therapeutic agent
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Abstract
(57)【要約】
【構成】本発明は、Ｍ−ＣＳＦを有効成分として含有す
ることを特徴とする消化管粘膜障害の予防及び治療剤を
提供するものである。 【効果】本発明によれば、新規な消化管粘膜障害の予防
及び治療剤が提供され、各種の組織障害因子に起因する
消化管粘膜障害を効果的に処置することができる。
ることを特徴とする消化管粘膜障害の予防及び治療剤を
提供するものである。 【効果】本発明によれば、新規な消化管粘膜障害の予防
及び治療剤が提供され、各種の組織障害因子に起因する
消化管粘膜障害を効果的に処置することができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はＭ−ＣＳＦ（macrophage
colony stimulating factor：マクロファージコロニー
刺激因子）の医薬用途、特に該Ｍ−ＣＳＦを有効成分と
して含有する消化管粘膜障害の予防及び治療剤に関す
る。
colony stimulating factor：マクロファージコロニー
刺激因子）の医薬用途、特に該Ｍ−ＣＳＦを有効成分と
して含有する消化管粘膜障害の予防及び治療剤に関す
る。
【０００２】
【従来技術とその課題】消化管粘膜細胞は、代謝回転が
盛んであり、種々の組織障害因子の影響を顕著に受ける
ことが知られている。之等組織障害因子の代表例として
は、治療目的で投与された薬剤の副作用を挙げることが
できる。例えば各種抗癌剤や抗生物質等の投与による消
化管粘膜障害の発現は古くからよく報告されている。イ
ンドメタシンやアスピリン等の抗炎症剤も同様であり、
之等の副作用としての種々の消化器症状の発症が知られ
ている。
盛んであり、種々の組織障害因子の影響を顕著に受ける
ことが知られている。之等組織障害因子の代表例として
は、治療目的で投与された薬剤の副作用を挙げることが
できる。例えば各種抗癌剤や抗生物質等の投与による消
化管粘膜障害の発現は古くからよく報告されている。イ
ンドメタシンやアスピリン等の抗炎症剤も同様であり、
之等の副作用としての種々の消化器症状の発症が知られ
ている。
【０００３】上記消化管粘膜障害は、またその原因とな
る組織障害因子の役割と共に、その効果的な処置法が種
々検討されてきているが、現状では、可能な限り原因と
なる組織障害因子を除くことに努力がはらわれているに
過ぎない。尚、最近之等消化管粘膜障害の予防及び治療
を積極的に図る試みとして、グルタミン添加輸液が開発
されその効果が注目、検討されている（JJPEN, Vol.14,
No.6, pp.933-940 (1992)）。
る組織障害因子の役割と共に、その効果的な処置法が種
々検討されてきているが、現状では、可能な限り原因と
なる組織障害因子を除くことに努力がはらわれているに
過ぎない。尚、最近之等消化管粘膜障害の予防及び治療
を積極的に図る試みとして、グルタミン添加輸液が開発
されその効果が注目、検討されている（JJPEN, Vol.14,
No.6, pp.933-940 (1992)）。
【０００４】一方、Ｍ−ＣＳＦは、正常骨髄細胞に作用
してマクロファージ／単球の分化増殖を促進する生物活
性を有する生体因子として知られており、例えば白血球
減少を伴う疾患及び病態の予防及び治療剤、骨髄移植の
補助剤、各種感染症の予防及び治療剤、更にある種の癌
の治療剤等としての有用性が報告されている（特開平２
−２３９１号公報参照）。また、Ｍ−ＣＳＦは、抗炎症
作用及び抗アレルギー作用を有することが明らかにさ
れ、抗炎症剤及び抗アレルギー剤としての有用性も報告
されている（国際公開特許ＷＯ９１／０８７５４号公報
参照）。
してマクロファージ／単球の分化増殖を促進する生物活
性を有する生体因子として知られており、例えば白血球
減少を伴う疾患及び病態の予防及び治療剤、骨髄移植の
補助剤、各種感染症の予防及び治療剤、更にある種の癌
の治療剤等としての有用性が報告されている（特開平２
−２３９１号公報参照）。また、Ｍ−ＣＳＦは、抗炎症
作用及び抗アレルギー作用を有することが明らかにさ
れ、抗炎症剤及び抗アレルギー剤としての有用性も報告
されている（国際公開特許ＷＯ９１／０８７５４号公報
参照）。
【０００５】本発明の目的は、従来知られていないＭ−
ＣＳＦの新たな医薬用途、殊に前記消化管粘膜障害の予
防及び治療のための用途を開発することにある。
ＣＳＦの新たな医薬用途、殊に前記消化管粘膜障害の予
防及び治療のための用途を開発することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、消化管粘
膜障害の予防及び治療法を種々研究する過程において、
Ｍ−ＣＳＦが従来報告されている薬理作用とは全く異な
って、上記消化管粘膜障害に対して効果的に奏効すると
いう予想できない事実を見出した。本発明はかかる新規
な知見に基づいて完成されたものである。
膜障害の予防及び治療法を種々研究する過程において、
Ｍ−ＣＳＦが従来報告されている薬理作用とは全く異な
って、上記消化管粘膜障害に対して効果的に奏効すると
いう予想できない事実を見出した。本発明はかかる新規
な知見に基づいて完成されたものである。
【０００７】本発明によれば、Ｍ−ＣＳＦを有効成分と
して含有することを特徴とする消化管粘膜障害の予防及
び治療剤が提供される。
して含有することを特徴とする消化管粘膜障害の予防及
び治療剤が提供される。
【０００８】本発明の消化管粘膜障害の予防及び治療剤
（以下単に「本発明医薬」という）の適用によれば、粘
膜障害の保護作用及び粘膜、消化管の機能改善等の薬理
効果が奏される。
（以下単に「本発明医薬」という）の適用によれば、粘
膜障害の保護作用及び粘膜、消化管の機能改善等の薬理
効果が奏される。
【０００９】本発明医薬が適用される消化管粘膜障害に
は、各種の組織障害因子に起因する種々の消化管粘膜障
害が包含される。その内特に腸管粘膜障害に対して本発
明医薬は好適に適用され、これによりその予防及び治療
効果を奏し得る。
は、各種の組織障害因子に起因する種々の消化管粘膜障
害が包含される。その内特に腸管粘膜障害に対して本発
明医薬は好適に適用され、これによりその予防及び治療
効果を奏し得る。
【００１０】上記組織障害因子には、消化管粘膜細胞の
障害を誘導する種々の因子が包括的に含まれる。その例
としては例えば前述した各種の薬剤やエタノール等の障
害性物質、長期の完全静脈栄養法（ＴＰＮ）、術後の異
化状態、酸素ストレス（oxidative stress）等を例示で
きる。之等の内で、ＴＰＮに起因する障害は、腸管の萎
縮として特徴付けられ、本発明医薬の適用できる粘膜障
害には、かかる腸管萎縮や腸管の機能低下状態等も当然
に包含され、之等の組織障害因子乃至それによる消化管
粘膜障害は当業界でよく知られている。
障害を誘導する種々の因子が包括的に含まれる。その例
としては例えば前述した各種の薬剤やエタノール等の障
害性物質、長期の完全静脈栄養法（ＴＰＮ）、術後の異
化状態、酸素ストレス（oxidative stress）等を例示で
きる。之等の内で、ＴＰＮに起因する障害は、腸管の萎
縮として特徴付けられ、本発明医薬の適用できる粘膜障
害には、かかる腸管萎縮や腸管の機能低下状態等も当然
に包含され、之等の組織障害因子乃至それによる消化管
粘膜障害は当業界でよく知られている。
【００１１】本発明医薬において有効成分とするＭ−Ｃ
ＳＦには、Ｍ−ＣＳＦの本来の生理活性、即ち正常骨髄
細胞に作用して単球、マクロファージの分化、増殖を促
進する活性（例えばScience, 236, 1229 (1987) 参照）
を有する各種の生理活性物質が包含される。該Ｍ−ＣＳ
Ｆは勿論天然体に限らず、遺伝子工学的手法によって得
られる組換え型であってもよく、更に同様の活性を有す
るそれらの誘導体であってもよい。
ＳＦには、Ｍ−ＣＳＦの本来の生理活性、即ち正常骨髄
細胞に作用して単球、マクロファージの分化、増殖を促
進する活性（例えばScience, 236, 1229 (1987) 参照）
を有する各種の生理活性物質が包含される。該Ｍ−ＣＳ
Ｆは勿論天然体に限らず、遺伝子工学的手法によって得
られる組換え型であってもよく、更に同様の活性を有す
るそれらの誘導体であってもよい。
【００１２】従って、本明細書における「Ｍ−ＣＳＦ」
なる用語は、上記天然型、組換え型及びそれらの誘導体
を包括的に含む広い意味で用いられるものとする。本発
明に利用できる上記Ｍ−ＣＳＦの具体例としては、例え
ば欧州特許公開第２６１５９２号公報、同３２８０６１
号、国際公開公報ＷＯ９１／０６５６７号等に開示のヒ
ト起源のものを例示できる。之等Ｍ−ＣＳＦの個々につ
いては、便宜上、上記各公報に記載された５５４アミノ
酸からなる前駆体のアミノ酸配列を基準として、その３
３番目のアミノ酸Ｇｌｕを１位とする表記に従って示す
ものとする。本発明に利用するＭ−ＣＳＦとしては、上
記各公報に記載のヒト起源のものが好ましいが、之等の
内でも１位Ｇｌｕから５位Ｇｌｕの領域にＮ末端を有し
且つ１４５位Ｇｌｕから２１４位Ｐｒｏ、殊に１５３位
Ｔｈｒから２１４位Ｐｒｏ、の領域にＣ末端を有するア
ミノ酸一次配列のＭ−ＣＳＦが好適であり、特に３位Ｖ
ａｌ又は４位Ｓｅｒから１５３位Ｔｈｒまでのアミノ酸
一次配列を有するＭ−ＣＳＦが本発明医薬としての適用
に最も適している。
なる用語は、上記天然型、組換え型及びそれらの誘導体
を包括的に含む広い意味で用いられるものとする。本発
明に利用できる上記Ｍ−ＣＳＦの具体例としては、例え
ば欧州特許公開第２６１５９２号公報、同３２８０６１
号、国際公開公報ＷＯ９１／０６５６７号等に開示のヒ
ト起源のものを例示できる。之等Ｍ−ＣＳＦの個々につ
いては、便宜上、上記各公報に記載された５５４アミノ
酸からなる前駆体のアミノ酸配列を基準として、その３
３番目のアミノ酸Ｇｌｕを１位とする表記に従って示す
ものとする。本発明に利用するＭ−ＣＳＦとしては、上
記各公報に記載のヒト起源のものが好ましいが、之等の
内でも１位Ｇｌｕから５位Ｇｌｕの領域にＮ末端を有し
且つ１４５位Ｇｌｕから２１４位Ｐｒｏ、殊に１５３位
Ｔｈｒから２１４位Ｐｒｏ、の領域にＣ末端を有するア
ミノ酸一次配列のＭ−ＣＳＦが好適であり、特に３位Ｖ
ａｌ又は４位Ｓｅｒから１５３位Ｔｈｒまでのアミノ酸
一次配列を有するＭ−ＣＳＦが本発明医薬としての適用
に最も適している。
【００１３】本発明医薬は、通常有効成分としてのＭ−
ＣＳＦの薬理有効量を薬学的に許容される通常の無毒性
担体と共に含有する医薬組成物の製剤形態に調製され、
該形態に応じて各種投与経路にて投与される。該製剤形
態としては、液状形態、例えば溶液、懸濁液、乳濁液等
が一般的であり、有利に採用できる。之等は一般には経
口、静脈内、皮下、皮内、筋肉内等に投与される。上記
各医薬形態への調製は、通常の方法により行なうことが
でき、得られる製剤中への有効成分の配合量は、通常約
０．００１〜１００ｍｇ蛋白量程度の範囲とされるのが
適当である。
ＣＳＦの薬理有効量を薬学的に許容される通常の無毒性
担体と共に含有する医薬組成物の製剤形態に調製され、
該形態に応じて各種投与経路にて投与される。該製剤形
態としては、液状形態、例えば溶液、懸濁液、乳濁液等
が一般的であり、有利に採用できる。之等は一般には経
口、静脈内、皮下、皮内、筋肉内等に投与される。上記
各医薬形態への調製は、通常の方法により行なうことが
でき、得られる製剤中への有効成分の配合量は、通常約
０．００１〜１００ｍｇ蛋白量程度の範囲とされるのが
適当である。
【００１４】本発明医薬は勿論上記液状形態に限らず、
他の通常採用される経口、非経口投与に適した各種の製
剤形態に調製することもできる。また該医薬製剤は使用
前に適当な水溶性担体の添加により液状となし得る乾燥
品形態に調製されてもよい。
他の通常採用される経口、非経口投与に適した各種の製
剤形態に調製することもできる。また該医薬製剤は使用
前に適当な水溶性担体の添加により液状となし得る乾燥
品形態に調製されてもよい。
【００１５】本発明医薬の投与量は、所望の薬理効果、
患者の年齢、性別、障害の程度等に応じて適宜決定さ
れ、特に限定されるものではないが、通常成人に対して
有効成分が蛋白量として約０．００１〜５０ｍｇ／ｋｇ
／日程度となる量とするのがよく、該製剤は１日１回又
は複数回に分けて投与、或は点滴静注による持続投与す
ることができる。特に本発明医薬はこれを点滴静注して
持続投与するための、適当な輸液剤や通常の輸液に希釈
できる用時調整剤とするのが、その効果上好ましい。
患者の年齢、性別、障害の程度等に応じて適宜決定さ
れ、特に限定されるものではないが、通常成人に対して
有効成分が蛋白量として約０．００１〜５０ｍｇ／ｋｇ
／日程度となる量とするのがよく、該製剤は１日１回又
は複数回に分けて投与、或は点滴静注による持続投与す
ることができる。特に本発明医薬はこれを点滴静注して
持続投与するための、適当な輸液剤や通常の輸液に希釈
できる用時調整剤とするのが、その効果上好ましい。
【００１６】尚、本発明医薬には、所望により他の薬理
有効成分を配合することもでき、例えばアラニルグルタ
ミン等のグルタミン成分はかかる配合剤として有効であ
る。
有効成分を配合することもでき、例えばアラニルグルタ
ミン等のグルタミン成分はかかる配合剤として有効であ
る。
【００１７】
【実施例】以下に、試験例を挙げて、本発明をより詳し
く説明する。
く説明する。
【００１８】試験例１ Ｍ−ＣＳＦとして国際公開公報ＷＯ９１／０６５６７号
に記載の方法に従って大腸菌を用いて製造したＭ−ＣＳ
Ｆ（４位Ｓｅｒから１５３位Ｔｈｒまでのアミノ酸配列
を有するポリペプチドからなる活性体）を用いた。
に記載の方法に従って大腸菌を用いて製造したＭ−ＣＳ
Ｆ（４位Ｓｅｒから１５３位Ｔｈｒまでのアミノ酸配列
を有するポリペプチドからなる活性体）を用いた。
【００１９】消化管障害に対するＭ−ＣＳＦの効果を、
木戸らの方法〔JJPEN, Vol.14, No.6, pp.933-940 (199
2)〕に従い、メトトレキセート（ＭＴＸ）障害ラットを
用いて以下の通り試験した。
木戸らの方法〔JJPEN, Vol.14, No.6, pp.933-940 (199
2)〕に従い、メトトレキセート（ＭＴＸ）障害ラットを
用いて以下の通り試験した。
【００２０】即ち、体重約２００ｇのウイスター系雄ラ
ット（日本ＳＬＣ、Std Wistar/ST）に、静脈カテーテ
ルを留置し、ＭＴＸを含む下記組成の輸液を７日間施行
して消化管障害モデル（コントロール群）とした（ＭＴ
Ｘ投与量：０．３ｍｇ／ｋｇ／日）。
ット（日本ＳＬＣ、Std Wistar/ST）に、静脈カテーテ
ルを留置し、ＭＴＸを含む下記組成の輸液を７日間施行
して消化管障害モデル（コントロール群）とした（ＭＴ
Ｘ投与量：０．３ｍｇ／ｋｇ／日）。
【００２１】 〈輸液組成〉 ＧＥ−３（薬理と治療，20巻，増刊号２，645-655 頁，1992年） １４０ ｍｌ アミパレン（登録商標、大塚製薬社製） ８９．２ｍｌ オーツカＭＶ注（大塚製薬社製） ０．１ｍｌ ＭＴＸ（武田薬品社製） ０．３ｍｌ 蒸留水（大塚製薬社製） 総量２７０ｍｌとなる量 試験群として、上記輸液に前記Ｍ−ＣＳＦの１００又は
２５０μｇを加えた輸液の投与群（Ｍ−ＣＳＦ輸液群、
Ｍ−ＣＳＦ投与濃度毎にｎ＝６匹とする）を設け、各Ｍ
−ＣＳＦ輸液群と、対照とするＭ−ＣＳＦ無添加の上記
輸液投与群（対照輸液群、ｎ＝６）のそれぞれにつき、
組織学的検査を行ない、Ｍ−ＣＳＦの投与による効果を
評価した。
２５０μｇを加えた輸液の投与群（Ｍ−ＣＳＦ輸液群、
Ｍ−ＣＳＦ投与濃度毎にｎ＝６匹とする）を設け、各Ｍ
−ＣＳＦ輸液群と、対照とするＭ−ＣＳＦ無添加の上記
輸液投与群（対照輸液群、ｎ＝６）のそれぞれにつき、
組織学的検査を行ない、Ｍ−ＣＳＦの投与による効果を
評価した。
【００２２】尚、組織学的検査は、通常の方法に従い作
成した組織切片のヘマトキシリンエオジン（ＨＥ）染色
及び核内増殖抗原（ＰＣＮＡ）に対する抗体を用いた免
疫染色により行なった。
成した組織切片のヘマトキシリンエオジン（ＨＥ）染色
及び核内増殖抗原（ＰＣＮＡ）に対する抗体を用いた免
疫染色により行なった。
【００２３】上記ＨＥ染色法は、常法に従い組織切片を
脱パラフィン後、流水水洗し、ヘマトキシリン染色液で
核染色し、流水中にて色出しし、次にエオジン染色液で
細胞質を染色し、アルコール脱水、キシレン透徹をへて
マリノールで封入して実施した。
脱パラフィン後、流水水洗し、ヘマトキシリン染色液で
核染色し、流水中にて色出しし、次にエオジン染色液で
細胞質を染色し、アルコール脱水、キシレン透徹をへて
マリノールで封入して実施した。
【００２４】また上記抗ＰＣＮＡを用いる免疫染色は、
次の通り実施した。即ちまず組織切片を脱パラフィン
後、０．３％Ｈ2 Ｏ2 メタノール溶液（メタノール１５
０ｍｌに３０％Ｈ2 Ｏ2 １．５ｍｌを加えたもの（用時
調製））に室温下に３０分間浸漬して内因性ペルオキシ
ダーゼを失活させ、アルコール処理して水に移し、ＰＢ
Ｓになじませた。上記切片にブロッキング試薬（１０％
正常ウシ血清、生化学工業）を加え、室温で３０分間浸
漬した後、余分な水分をとり、洗浄せずに一次抗体とし
て抗ヒトＰＣＮＡモノクローナルマウス抗体（ＤＡＫＯ
−ＰＣＮＡ、ＰＣ１０ダコ（Dako）社製）を加え、室温
で１時間浸漬した。ネガチブコントロールには、上記一
次抗体の代わりにブロッキング試薬を用いた。次にＰＢ
Ｓで洗浄後、二次抗体（ビオチン標識抗マウスＩｇＧ＋
ＩｇＡ＋ＩｇＭ、生化学工業）を加え、室温で３０分間
浸漬した。ＰＢＳにて洗浄後、ＤＡＢ−Ｈ2 Ｏ2 溶液
（３，３′−ジアミノベンチジン−４ＨＣｌ（和光純
薬）３０ｍｇ、蒸留水１３５ｍｌ、０．５ＭトリスＨＣ
ｌ緩衝液（ｐＨ７．６）１５ｍｌ及び２．５％Ｈ2 Ｏ2
水溶液０．３ｍｌを用時混和したもの）に５〜１０分程
度浸漬して発色させた。尚、ブロッキング試薬、二次抗
体及び標準試薬としては、ヒストファイン染色キット構
成試薬（生化学工業）を用いた。
次の通り実施した。即ちまず組織切片を脱パラフィン
後、０．３％Ｈ2 Ｏ2 メタノール溶液（メタノール１５
０ｍｌに３０％Ｈ2 Ｏ2 １．５ｍｌを加えたもの（用時
調製））に室温下に３０分間浸漬して内因性ペルオキシ
ダーゼを失活させ、アルコール処理して水に移し、ＰＢ
Ｓになじませた。上記切片にブロッキング試薬（１０％
正常ウシ血清、生化学工業）を加え、室温で３０分間浸
漬した後、余分な水分をとり、洗浄せずに一次抗体とし
て抗ヒトＰＣＮＡモノクローナルマウス抗体（ＤＡＫＯ
−ＰＣＮＡ、ＰＣ１０ダコ（Dako）社製）を加え、室温
で１時間浸漬した。ネガチブコントロールには、上記一
次抗体の代わりにブロッキング試薬を用いた。次にＰＢ
Ｓで洗浄後、二次抗体（ビオチン標識抗マウスＩｇＧ＋
ＩｇＡ＋ＩｇＭ、生化学工業）を加え、室温で３０分間
浸漬した。ＰＢＳにて洗浄後、ＤＡＢ−Ｈ2 Ｏ2 溶液
（３，３′−ジアミノベンチジン−４ＨＣｌ（和光純
薬）３０ｍｇ、蒸留水１３５ｍｌ、０．５ＭトリスＨＣ
ｌ緩衝液（ｐＨ７．６）１５ｍｌ及び２．５％Ｈ2 Ｏ2
水溶液０．３ｍｌを用時混和したもの）に５〜１０分程
度浸漬して発色させた。尚、ブロッキング試薬、二次抗
体及び標準試薬としては、ヒストファイン染色キット構
成試薬（生化学工業）を用いた。
【００２５】上記試験の結果を図１乃至図８に示す。
【００２６】各図より、以下のことが明らかである。即
ち、ＭＴＸの小腸上皮細胞障害として、粘膜細胞の膨潤
と細胞質の空胞形成、上皮細胞の剥離、血漿の腸管腔内
への漏出、粘膜下層への白血球浸潤、最後には腸管の全
長に亘る重篤な剥離性腸炎を起こすことが知られてい
る。本試験においても、ＭＴＸを含む輸液を７日間行な
うと（対照群）、空腸の重篤な剥離性腸炎が認められた
（図１及び図４参照）。
ち、ＭＴＸの小腸上皮細胞障害として、粘膜細胞の膨潤
と細胞質の空胞形成、上皮細胞の剥離、血漿の腸管腔内
への漏出、粘膜下層への白血球浸潤、最後には腸管の全
長に亘る重篤な剥離性腸炎を起こすことが知られてい
る。本試験においても、ＭＴＸを含む輸液を７日間行な
うと（対照群）、空腸の重篤な剥離性腸炎が認められた
（図１及び図４参照）。
【００２７】しかるに、このＭＴＸを含む輸液にＭ−Ｃ
ＳＦを１００μｇ又は２５０μｇ加えた輸液を７日間行
なうと（Ｍ−ＣＳＦ輸液群）、全例において、空腸絨毛
及び陰窩の構造が保持され、ＭＴＸによる剥離性腸炎を
効果的に処置することができた（図２、図３、図５及び
図６参照）。また、上記Ｍ−ＣＳＦの空腸に対する効果
は、十二指腸及び回腸においても同様に認められた。
ＳＦを１００μｇ又は２５０μｇ加えた輸液を７日間行
なうと（Ｍ−ＣＳＦ輸液群）、全例において、空腸絨毛
及び陰窩の構造が保持され、ＭＴＸによる剥離性腸炎を
効果的に処置することができた（図２、図３、図５及び
図６参照）。また、上記Ｍ−ＣＳＦの空腸に対する効果
は、十二指腸及び回腸においても同様に認められた。
【００２８】尚、対照輸液群では、ＰＣＮＡ陽性細胞が
殆ど認められなかったのに対して、Ｍ−ＣＳＦ輸液群で
はＰＣＮＡ陽性細胞が陰窩細胞に認められた（図７及び
図８参照）。
殆ど認められなかったのに対して、Ｍ−ＣＳＦ輸液群で
はＰＣＮＡ陽性細胞が陰窩細胞に認められた（図７及び
図８参照）。
【００２９】試験例２ この試験は、ラットにメトトレキセートを投与して作成
した小腸粘膜障害モデルにおいて、Ｍ−ＣＳＦが小腸粘
膜保護作用を有することを立証するものである。
した小腸粘膜障害モデルにおいて、Ｍ−ＣＳＦが小腸粘
膜保護作用を有することを立証するものである。
【００３０】Ｍ−ＣＳＦの上記小腸粘膜保護作用メカニ
ズムとしては、Ｍ−ＣＳＦによる小腸上皮細胞に対する
増殖作用が考えられる。即ち、小腸上皮細胞は、陰窩部
の未分化細胞に由来し、この陰窩細胞が増殖分裂した
後、管腔に向かって移動する間に機能細胞である小腸表
層細胞に分化する。その後、３〜４日で絨毛頂から脱落
していく。このため、小腸粘膜の維持は陰窩細胞の増殖
に大きく依存している。Ｍ−ＣＳＦによる小腸粘膜保護
作用が小腸陰窩細胞の増殖刺激作用によることを確認す
るために、ラットの小腸陰窩細胞由来の小腸上皮細胞株
であるＩＥＣ−６細胞を用いて、以下のインビトロ試験
を行なった。
ズムとしては、Ｍ−ＣＳＦによる小腸上皮細胞に対する
増殖作用が考えられる。即ち、小腸上皮細胞は、陰窩部
の未分化細胞に由来し、この陰窩細胞が増殖分裂した
後、管腔に向かって移動する間に機能細胞である小腸表
層細胞に分化する。その後、３〜４日で絨毛頂から脱落
していく。このため、小腸粘膜の維持は陰窩細胞の増殖
に大きく依存している。Ｍ−ＣＳＦによる小腸粘膜保護
作用が小腸陰窩細胞の増殖刺激作用によることを確認す
るために、ラットの小腸陰窩細胞由来の小腸上皮細胞株
であるＩＥＣ−６細胞を用いて、以下のインビトロ試験
を行なった。
【００３１】（１）方法 ＩＥＣ−６細胞は、ＡＴＣＣより購入し、５％牛胎児血
清（ＦＣＳ）、０．１Ｕ／ｍｌインスリン、０．１ｍｇ
／ｍｌストレプトマイシン及び１００Ｕ／ｍｌペニシリ
ンＧを含むＤＭＥＭ培地で継代培養し、本実験には２０
〜２５継代の細胞を使用した。
清（ＦＣＳ）、０．１Ｕ／ｍｌインスリン、０．１ｍｇ
／ｍｌストレプトマイシン及び１００Ｕ／ｍｌペニシリ
ンＧを含むＤＭＥＭ培地で継代培養し、本実験には２０
〜２５継代の細胞を使用した。
【００３２】細胞増殖の実験は、２４穴の培養プレート
に１穴当り４×１０4 個を低血清培地（上記培養培地の
ＦＣＳを０．１％にしたもの）で１２時間培養した。ト
リプシン・ＥＤＴＡ溶液で細胞を剥離し、ヘモサイトメ
ーターで細胞数を数え、この細胞数を０日目の細胞数と
した。更に種々の濃度の前記Ｍ−ＣＳＦ、上皮細胞増殖
因子（ＥＧＦ：マウス、レセプターグレー；ベクトン・
ディキンソン社）、インスリン（牛膵臓由来；シグマ
社）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ：ヒト；オ
ンコジーン・サイエンス社）及びインターロイキン１β
（ＩＬ−１β；菊本ら，Biochem. Biophys. Res. Commu
n, 147，315-321 (1987)）のそれぞれを加え、２日目と
５日目の細胞数を同様して測定した。更に、Ｍ−ＣＳＦ
の中和抗体（特開平５−９５７９４号公報記載のモノク
ローナル抗体ＡＮＯＣ５７３：１．２ｍｇ／ｍｌ）を種
々の濃度で添加して同一実験を繰り返した。
に１穴当り４×１０4 個を低血清培地（上記培養培地の
ＦＣＳを０．１％にしたもの）で１２時間培養した。ト
リプシン・ＥＤＴＡ溶液で細胞を剥離し、ヘモサイトメ
ーターで細胞数を数え、この細胞数を０日目の細胞数と
した。更に種々の濃度の前記Ｍ−ＣＳＦ、上皮細胞増殖
因子（ＥＧＦ：マウス、レセプターグレー；ベクトン・
ディキンソン社）、インスリン（牛膵臓由来；シグマ
社）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ：ヒト；オ
ンコジーン・サイエンス社）及びインターロイキン１β
（ＩＬ−１β；菊本ら，Biochem. Biophys. Res. Commu
n, 147，315-321 (1987)）のそれぞれを加え、２日目と
５日目の細胞数を同様して測定した。更に、Ｍ−ＣＳＦ
の中和抗体（特開平５−９５７９４号公報記載のモノク
ローナル抗体ＡＮＯＣ５７３：１．２ｍｇ／ｍｌ）を種
々の濃度で添加して同一実験を繰り返した。
【００３３】（２）結果 図９に０．１％ＦＣＳを含むＤＭＥＭで培養した細胞数
をコントロールとして、最も強い増殖作用を示すＥＧＦ
（０．１μｇ／ｍｌ）による増殖作用と、代表的な増殖
因子であるインスリン（０．１ ＩＵ／ｍｌ）によるそ
れと、Ｍ−ＣＳＦ（１μｇ／ｍｌ）によるそれとを比較
した結果を示す。尚、各結果の値は平均値±ＳＤ（ｎ＝
９）で示される。
をコントロールとして、最も強い増殖作用を示すＥＧＦ
（０．１μｇ／ｍｌ）による増殖作用と、代表的な増殖
因子であるインスリン（０．１ ＩＵ／ｍｌ）によるそ
れと、Ｍ−ＣＳＦ（１μｇ／ｍｌ）によるそれとを比較
した結果を示す。尚、各結果の値は平均値±ＳＤ（ｎ＝
９）で示される。
【００３４】該図より、Ｍ−ＣＳＦは、ＥＧＦの作用の
約半分の効力があり、インスリンとほぼ同程度の増殖作
用を示すことが明らかである。
約半分の効力があり、インスリンとほぼ同程度の増殖作
用を示すことが明らかである。
【００３５】更に之等の増殖因子に加えて、Ｍ−ＣＳＦ
によるマクロファージの活性化に伴って、マクロファー
ジにより放出されるｂＦＧＦとＩＬ−１βの増殖作用に
ついても併せて検討した。即ち、上記と同様の方法で、
ＥＧＦ、インスリン、Ｍ−ＣＳＦ、ｂＦＧＦ及びＩＬ−
１βを種々の濃度で添加し、５日目の細胞数を測定し
た。尚、ｂＦＧＦに関しては、至適濃度（０．０１μｇ
／ｍｌ）を用いて、ｂＦＧＦの安定化作用を有するヘパ
リンを添加し、その増殖作用についても同様の細胞数の
測定を行なった。得られた結果（平均値±ＳＤ（ｎ＝
９））を図１０に示す。
によるマクロファージの活性化に伴って、マクロファー
ジにより放出されるｂＦＧＦとＩＬ−１βの増殖作用に
ついても併せて検討した。即ち、上記と同様の方法で、
ＥＧＦ、インスリン、Ｍ−ＣＳＦ、ｂＦＧＦ及びＩＬ−
１βを種々の濃度で添加し、５日目の細胞数を測定し
た。尚、ｂＦＧＦに関しては、至適濃度（０．０１μｇ
／ｍｌ）を用いて、ｂＦＧＦの安定化作用を有するヘパ
リンを添加し、その増殖作用についても同様の細胞数の
測定を行なった。得られた結果（平均値±ＳＤ（ｎ＝
９））を図１０に示す。
【００３６】該図１０より、Ｍ−ＣＳＦは、ＥＧＦの約
半分の増殖作用を示し、至適濃度は１μｇ／ｍｌである
ことが判る。
半分の増殖作用を示し、至適濃度は１μｇ／ｍｌである
ことが判る。
【００３７】また該図より、Ｍ−ＣＳＦは、インスリン
やｂＦＧＦと同等か或はそれ以上の増殖作用を有するこ
とが確認された。尚、ＩＬ−１βではこの増殖作用は認
められなかった。
やｂＦＧＦと同等か或はそれ以上の増殖作用を有するこ
とが確認された。尚、ＩＬ−１βではこの増殖作用は認
められなかった。
【００３８】更に、Ｍ−ＣＳＦの上記増殖作用を、中和
抗体を用いた阻害実験により確認した。即ち、上記と同
様の方法で、０．１μｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦを添加した
細胞に、それぞれ最終濃度として１０、５０、１００倍
希釈した抗体を添加し、５日目の細胞数を同様にして求
めた。ポジティブコントロールとして、１μｇ／ｍｌＥ
ＧＦを添加して得られた細胞数をも求めた。その結果
（平均値±ＳＤ（ｎ＝９））を図１１に示す。
抗体を用いた阻害実験により確認した。即ち、上記と同
様の方法で、０．１μｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦを添加した
細胞に、それぞれ最終濃度として１０、５０、１００倍
希釈した抗体を添加し、５日目の細胞数を同様にして求
めた。ポジティブコントロールとして、１μｇ／ｍｌＥ
ＧＦを添加して得られた細胞数をも求めた。その結果
（平均値±ＳＤ（ｎ＝９））を図１１に示す。
【００３９】該図１１より、Ｍ−ＣＳＦは中和抗体（５
０倍希釈以上の濃度）の共存下で、そのＩＥＣ−６細胞
の増殖作用が完全に阻害されることが明らかである。
０倍希釈以上の濃度）の共存下で、そのＩＥＣ−６細胞
の増殖作用が完全に阻害されることが明らかである。
【００４０】以上の通り、インビボで認められるＭ−Ｃ
ＳＦの小腸粘膜保護効果は、インビトロの試験で、該Ｍ
−ＣＳＦが小腸陰窩細胞に直接作用してその増殖を促す
ことによるものであることが実証され、ＥＧＦを添加し
た増殖をポジティブコントロールとして用いた場合、常
に約半分の力価を有することも確認された。之等のこと
より、Ｍ−ＣＳＦが上皮系細胞の増殖を促進し、これが
種々の原因による消化管粘膜の障害に対する保護に有効
であることが明らかとなった。
ＳＦの小腸粘膜保護効果は、インビトロの試験で、該Ｍ
−ＣＳＦが小腸陰窩細胞に直接作用してその増殖を促す
ことによるものであることが実証され、ＥＧＦを添加し
た増殖をポジティブコントロールとして用いた場合、常
に約半分の力価を有することも確認された。之等のこと
より、Ｍ−ＣＳＦが上皮系細胞の増殖を促進し、これが
種々の原因による消化管粘膜の障害に対する保護に有効
であることが明らかとなった。
【００４１】
【発明の効果】本発明によれば、新規な消化管粘膜障害
の予防及び治療剤が提供され、各種の組織障害因子に起
因する消化管粘膜障害を効果的に処置することができ
る。
の予防及び治療剤が提供され、各種の組織障害因子に起
因する消化管粘膜障害を効果的に処置することができ
る。
【図１】対照輸液群におけるＨＥ染色後の組織切片の顕
微鏡写真（×４０倍）（生物の形態を示す図面に代わる
写真）である。
微鏡写真（×４０倍）（生物の形態を示す図面に代わる
写真）である。
【図２】Ｍ−ＣＳＦ輸液群（１００μｇ／ｋｇ）におけ
るＨＥ染色後の組織切片の顕微鏡写真（×４０倍）（生
物の形態を示す図面に代わる写真）である。
るＨＥ染色後の組織切片の顕微鏡写真（×４０倍）（生
物の形態を示す図面に代わる写真）である。
【図３】Ｍ−ＣＳＦ輸液群（２５０μｇ／ｋｇ）におけ
るＨＥ染色後の組織切片の顕微鏡写真（×４０倍）（生
物の形態を示す図面に代わる写真）である。
るＨＥ染色後の組織切片の顕微鏡写真（×４０倍）（生
物の形態を示す図面に代わる写真）である。
【図４】対照輸液群におけるＨＥ染色後の組織切片の顕
微鏡写真（×１００倍）（生物の形態を示す図面に代わ
る写真）である。
微鏡写真（×１００倍）（生物の形態を示す図面に代わ
る写真）である。
【図５】Ｍ−ＣＳＦ輸液群（１００μｇ／ｋｇ）におけ
るＨＥ染色後の組織切片の顕微鏡写真（×１００倍）
（生物の形態を示す図面に代わる写真）である。
るＨＥ染色後の組織切片の顕微鏡写真（×１００倍）
（生物の形態を示す図面に代わる写真）である。
【図６】Ｍ−ＣＳＦ輸液群（２５０μｇ／ｋｇ）におけ
るＨＥ染色後の組織切片の顕微鏡写真（×１００倍）
（生物の形態を示す図面に代わる写真）である。
るＨＥ染色後の組織切片の顕微鏡写真（×１００倍）
（生物の形態を示す図面に代わる写真）である。
【図７】対照輸液群におけるＰＣＮＡ染色後の組織切片
の顕微鏡写真（×４００倍）（生物の形態を示す図面に
代わる写真）である。
の顕微鏡写真（×４００倍）（生物の形態を示す図面に
代わる写真）である。
【図８】Ｍ−ＣＳＦ輸液群（２５０μｇ／ｋｇ）におけ
るＰＣＮＡ染色後の組織切片の顕微鏡写真（×４００
倍）（生物の形態を示す図面に代わる写真）である。
るＰＣＮＡ染色後の組織切片の顕微鏡写真（×４００
倍）（生物の形態を示す図面に代わる写真）である。
【図９】後記試験例２に示す上皮細胞増殖因子（ＥＧ
Ｆ）、Ｍ−ＣＳＦ及びインスリンのそれぞれのＩＥＣ−
６細胞に対する増殖効果を調べたグラフである。
Ｆ）、Ｍ−ＣＳＦ及びインスリンのそれぞれのＩＥＣ−
６細胞に対する増殖効果を調べたグラフである。
【図１０】後記試験例２に示すＥＧＦ、塩基性線維芽細
胞成長因子（ｂＦＧＦ）、Ｍ−ＣＳＦ、インスリン、ヘ
パリン及びＩＬ−１βのそれぞれのＩＥＣ−６細胞増殖
効果を調べたグラフである。
胞成長因子（ｂＦＧＦ）、Ｍ−ＣＳＦ、インスリン、ヘ
パリン及びＩＬ−１βのそれぞれのＩＥＣ−６細胞増殖
効果を調べたグラフである。
【図１１】後記試験例２に示すＥＧＦのＩＥＣ−６細胞
増殖効果をコントロールとして、Ｍ−ＣＳＦの同効果が
その中和抗体により阻害されることを示すグラフであ
る。
増殖効果をコントロールとして、Ｍ−ＣＳＦの同効果が
その中和抗体により阻害されることを示すグラフであ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 向井 淨 徳島県板野郡松茂町広島字丸須１−９ (72)発明者 高橋 真行 徳島県鳴門市大津町木津野字仲ノ越79−７
Claims (6)
- 【請求項１】 薬理有効量のＭ−ＣＳＦを薬学的に許容
される無毒性担体と共に含有することを特徴とする消化
管粘膜障害の予防及び治療剤。 - 【請求項２】 Ｍ−ＣＳＦが１位Ｇｌｕから５位Ｇｌｕ
のいずれかにＮ末端を有し且つ１４５位Ｇｌｕから２１
４位ＰｒｏのいずれかをＣ末端とするアミノ酸一次配列
を有するものである請求項１に記載の消化管粘膜障害の
予防及び治療剤。 - 【請求項３】 Ｍ−ＣＳＦが３位Ｖａｌから１５３位Ｔ
ｈｒのアミノ酸一次配列を有するものである請求項１に
記載の消化管粘膜障害の予防及び治療剤。 - 【請求項４】 Ｍ−ＣＳＦが４位Ｓｅｒから１５３位Ｔ
ｈｒのアミノ酸一次配列を有するものである請求項１に
記載の消化管粘膜障害の予防及び治療剤。 - 【請求項５】 消化管粘膜保護剤及び消化管機能改善剤
である請求項１に記載の消化管粘膜障害の予防及び治療
剤。 - 【請求項６】 薬理有効量が０．００１〜５０ｍｇ蛋白
量／ｋｇ／日の投与量である請求項１に記載の消化管粘
膜障害の予防及び治療剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6070021A JP2688733B2 (ja) | 1993-03-17 | 1994-03-14 | 消化管粘膜障害の予防及び治療剤 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5-83966 | 1993-03-17 | ||
| JP8396693 | 1993-03-17 | ||
| JP6070021A JP2688733B2 (ja) | 1993-03-17 | 1994-03-14 | 消化管粘膜障害の予防及び治療剤 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06321801A true JPH06321801A (ja) | 1994-11-22 |
| JP2688733B2 JP2688733B2 (ja) | 1997-12-10 |
Family
ID=26411192
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6070021A Expired - Lifetime JP2688733B2 (ja) | 1993-03-17 | 1994-03-14 | 消化管粘膜障害の予防及び治療剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2688733B2 (ja) |
-
1994
- 1994-03-14 JP JP6070021A patent/JP2688733B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2688733B2 (ja) | 1997-12-10 |
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