WO2000061744A1 - Nouveaux genes de foetus - Google Patents

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WO2000061744A1
WO2000061744A1 PCT/JP2000/002281 JP0002281W WO0061744A1 WO 2000061744 A1 WO2000061744 A1 WO 2000061744A1 JP 0002281 W JP0002281 W JP 0002281W WO 0061744 A1 WO0061744 A1 WO 0061744A1
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cells
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PCT/JP2000/002281
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Jun-Ichi Nezu
Asuka Ose
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Chugai Research Institute For Molecular Medicine, Inc.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

Definitions

  • the present invention relates to a protein encoded by a fetal gene whose expression is activated in fetal tissues and tumor cells.
  • the protein of the present invention can be used, for example, as a target molecule for drug development against cancer. Background art
  • Fetal tissue is rich in actively proliferating undifferentiated cells, highly activated cells, and neovascular endothelial cells. In fetal tissues, these are under strict control and are suppressed as the individual matures, but apart from being controlled, this is very similar to the condition in solid tumors It can be said that it is a phenomenon. Therefore, some of the genes specifically expressed in fetal tissues (fetal gene) are involved in phenomena characteristic of solid tumors such as abnormal growth, immortalization, invasion, metastasis, and angiogenesis. There is a possibility that the gene is It is also presumed that some diseases other than cancer are caused by abnormal activation of fetal genes that are suppressed in normal organisms.
  • the present invention provides a novel protein specifically or more strongly expressed in fetal tissue, a gene encoding the protein, and production and use thereof.
  • the fetal liver-derived cDNA is used as a tester, and the cDNA derived from the adult liver is used as a driver, and subtraction is performed by the subtraction subtractive hybridization method.
  • the expression of these genes specifically expressed in fetal tissues in cancer cells was examined. As a result, expression is activated in cancer cells such as colon cancer and liver cancer
  • the protein was not found in the database.c
  • the present inventors further examined in detail the tissue specificity of the expression of these genes. As a result, these genes were expressed in various cancer cells, In, we found that it was specifically expressed in tissues that are thought to contain many undifferentiated cells such as fetal tissues and actively differentiating and proliferating cells.
  • the present invention relates to novel fetal genes ⁇ fls353 '' and ⁇ ⁇ s485 '', which are expected to be involved in canceration, proteins encoded by them, and their production and use, and more specifically,
  • (d) hybridizes with a DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 3, or 5 under stringent conditions, and binds to the DNA of SEQ ID NO: 2, 4, or 6 DNA that encodes a protein that is functionally equivalent to a protein consisting of a noic acid sequence.
  • Production of the protein or peptide according to (5) comprising the step of culturing the transformed cell according to (4) and recovering the expressed protein from the transformed cell or the culture supernatant thereof.
  • nucleotide having a chain length of at least 15 bases which hybridizes with a DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 3, or 5 or a complementary strand thereof,
  • the present invention relates to novel proteins “fls353” and “fls485” whose expression is activated in fetal tissues and tumor cells.
  • the nucleotide sequence of the cDNA of the novel human embryonic gene “fls353” included in the present invention is shown in SEQ ID NO: 1, and the nucleotide sequences of the cDNAs of two novel human embryonic genes “fls485” are shown in FIG. Nos. 3 (fls485 L) and 5 (fls485 S), and the amino acid sequences of the proteins encoded by these cDNAs were assigned SEQ ID NOs: 2 (fls353), 4 (fls485 L) and 6 (fls485 S), respectively. Show.
  • these genes were specifically expressed in undifferentiated cells such as fetal tissues and tissues that are thought to contain many actively differentiating and proliferating cells.
  • undifferentiated cells such as fetal tissues and tissues that are thought to contain many actively differentiating and proliferating cells.
  • cancer cells such as colorectal cancer and liver cancer.
  • the fetal genes include survivin, aurora kinase, and LYAR are also considered to be involved in carcinogenesis, and the expression of these genes in normal tissues is high in fetal tissues, especially fetal liver, and in adult tissues, active proliferation such as testis and thymus occurs. It is reported that the expression is high in tissues where many undifferentiated cells are present, but that expression is basically not observed in other tissues (Nat Med, 3, 917-921, 1997, EMBO J, 17, 3052-3065, 1998, Genes Dev, 7, 735-748, 1993). This is almost the same expression pattern as the fetal gene of the present invention, and it is presumed that the commonity arises from the necessity for cell proliferation.
  • the fetal gene of the present invention can be used not only as a tool for purifying and cloning factors that control cell differentiation and cell proliferation, but also as a therapeutic or preventive drug for diseases such as tumors. It can be suitably used as a target for screening candidate compounds.
  • the "; fls353" and / or "fls485" gene may be applied to therapeutic treatment such as gene therapy in various tumors.
  • the invention also encompasses proteins functionally equivalent to the human “: fls353” or “fls485” proteins.
  • proteins include, for example, homologous proteins of other organisms corresponding to the human “: Hs353” or “; fls485" protein, or variants of the human “fls353j or” fls485 "protein.
  • “functionally equivalent” means that the target protein has a cancer-related function. Whether or not it has cancer-related functions depends, for example, on its high expression characteristics in cancer cell lines, fetal tissues, and other tissues containing actively proliferating cells. Can be characterized.
  • a method for introducing a mutation into a protein is known.
  • those skilled in the art can use site-directed mutagenesis (Hashimoto-Gotoh, T. et al. (1995) Gene 152, 271-275, Zoller, MJ, and Smith, M. (1983) Methods Enzymol 100, 468-500, Kramer, W. et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456, Kramer W, and Fritz HJ (1987) Methods.
  • the amino acid residue to be mutated is mutated to another amino acid in which the properties of the amino acid side chain are conserved.
  • the properties of the amino acid side chain are hydrophobic amino acids (A, I, L, M, F, P, W, Y, V), hydrophilic amino acids (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T ), An amino acid having an aliphatic side chain (G, A, V, L, I, P), an amino acid having a hydroxyl group-containing side chain (S, ⁇ , ⁇ ), an amino acid having a sulfur atom-containing side chain ( ⁇ )
  • An amino acid having a carboxylic acid and amide-containing side chain D, N, E, Q
  • an amino group having a base group-containing side chain R, ⁇ , ⁇
  • an amino acid having an aromatic-containing side chain ⁇ , F, Y,
  • the fusion protein is a fusion of the human “fls353” or “: fls485” protein with another peptide or protein, and is included in the present invention.
  • the method for producing the fusion protein is as follows: the DNA encoding the human ": fls353” or "fls485" protein of the present invention is linked to the DNA encoding the other peptide or protein so that the frames are in frame with each other. This can be introduced into an expression vector and expressed in a host, and a method known to those skilled in the art can be used.
  • Other peptides or proteins to be fused with the protein of the present invention are not particularly limited.
  • peptides to be fused with the protein of the present invention include, for example, FLAG (Hopp, TP et al., BioTechnology (1988) 6, 1204-1210), and six His (histidine) residues. 6xHis, 10xHis, influenza agglutinin (HA), human c-myc fragment, VSV-GP fragment, pl8HIV fragment, T7-tag, HSV-tag, E-tag, SV40T antigen fragment
  • Well-known peptides such as lck tag, fragment of human tubulin, B-tag, and fragment of Protein C can be used.
  • proteins to be fused with the protein of the present invention include, for example, GST (glutathione-1 S-transferase), HA (influenza agglutinin), immunoglobulin constant region, 5-galactosidase, MBP (Maltose binding protein).
  • the fusion protein can be prepared by fusing with the MA encoding the protein and expressing the prepared fusion MA.
  • Proteins functionally equivalent to these are also included in the proteins of the present invention.
  • proteins include, for example, homologs of mammals other than humans (for example, proteins encoded by genes of monkey, rat, mouse, rabbit, and rabbit).
  • isolating cDNA having high homology to DNA encoding the human “fls353” or “fls485” protein from an animal it is preferable to use fetal tissue, particularly fetal liver or kidney.
  • the conditions of hybridization for isolating DNA encoding a protein functionally equivalent to the human "fls353" or "fls485" protein can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • An example is as follows. That is, using “ExpressHyb Hybridization Solutionj (manufactured by CLONTECH), prehybridization is performed at 55.C for 30 minutes or more, and then a labeled probe is added, and the mixture is incubated at 37 ° C to 55 ° C for 1 hour. Incubate for 2 minutes at room temperature in 2 x SSC, 0.13 ⁇ 4 SDS, and then for 20 minutes at 37 ° C in lxSSC, 0.13 ⁇ 4 SDS. Wash once.
  • “ExpressHyb Hybridization Solution j (manufactured by CLONTECH)” is used. After prehybridization at 60 ° C. for 30 minutes or more, a labeled probe is added. Hybridization is performed by incubating for at least 1 hour at C. Then, wash 3 times for 20 minutes at room temperature in 2xSS 0.1% SDS, then at 50 ° in lxSSC 0.1% SDS. Wash twice with C for 20 minutes.
  • “ExpressHyb Hybridization Solution j (manufactured by CLONTECH)” is used. After performing prehybridization at 68 ° C for 30 minutes or more, the labeled probe is removed. Add and incubate for at least 1 hour at 68 ° C, then wash three times for 20 minutes at room temperature in 2xSS 0.13 ⁇ 4 SDS, then 0.1xSSC, 0.1% SDS Wash twice at 50 ° C for 20 minutes.
  • a plurality of factors such as temperature and salt concentration can be considered as factors that influence the stringency of the hybridization solution, and those skilled in the art can realize the same stringency by appropriately selecting these factors. It is possible.
  • a primer synthesized based on the sequence information of DNA SEQ ID NO: 1, 3, or 5
  • Isolation using a gene amplification method for example, polymerase chain reaction (PCR) is also possible.
  • Proteins that are functionally equivalent to the human “fls353” or “; Qs485” protein encoded by DNA isolated by these hybridization or gene amplification techniques are usually human “fls353” or “fls485” proteins. It has high homology in protein and amino acid sequence. High homology usually refers to homology of 60% or more, preferably 70% or more, more preferably 80% or more, and still more preferably 90% or more. The determination of protein homology is described in the literature (Wilbur, WJ and Lip Thigh, DJ Pro atl. Acad. Sci. USA (1983) 80, 726-730). Just follow the algorithm.
  • the protein of the present invention may differ in amino acid sequence, molecular weight, isoelectric point, presence / absence and form of sugar chains, etc., depending on the cell, host, or purification method that produces the protein as described below. However, as long as the obtained protein has a function equivalent to that of the human "fls353" or "fls485" protein of the present invention (SEQ ID NO: 2, 4, or 6), it is included in the present invention.
  • the protein of the present invention can be prepared as a recombinant protein or as a natural protein by methods known to those skilled in the art. If it is a recombinant protein, a DNA encoding the protein of the present invention (for example, a DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 3, or 5) is inserted into an appropriate expression vector, and this is inserted into an appropriate expression vector. After recovering the transformant obtained by introducing into the host cell and obtaining an extract, chromatography such as ion exchange, reverse phase, gel filtration, or affinity chromatography in which an antibody against the protein of the present invention is immobilized on a column It is possible to purify and prepare by combining them or by combining a plurality of these columns.
  • chromatography such as ion exchange, reverse phase, gel filtration, or affinity chromatography
  • the protein of the present invention is expressed in a host cell (for example, animal cell or Escherichia coli) as a fusion protein with glutathione S-transferase protein or as a recombinant protein to which a plurality of histidines are added,
  • a host cell for example, animal cell or Escherichia coli
  • the expressed recombinant protein can be purified using a glutathione column or a nickel column.
  • a region other than the target protein in the fusion protein can be cleaved with thrombin or Factor Xa and removed.
  • thrombin or Factor Xa a region other than the target protein in the fusion protein
  • an antibody that binds to a human "fls353" or "fls485" protein described below against an extract of a tissue or cell expressing the protein of the present invention Can be isolated by the action of an affinity column to which the DNA is bound.
  • Antibody is polycloth It may be a null antibody or a monoclonal antibody.
  • the present invention also includes partial peptides of the protein of the present invention.
  • the partial peptide having an amino acid sequence specific to a protein of the present invention comprises an amino acid sequence of at least 7 amino acids, preferably at least 8 amino acids, more preferably at least 9 amino acids.
  • the partial peptide can be used, for example, for producing an antibody against the protein of the present invention, screening for a compound that binds to the protein of the present invention, and for screening for a promoter or inhibitor of the protein of the present invention.
  • the partial peptide of the present invention can be produced by a genetic engineering technique, a known peptide synthesis method, or by cleaving the protein of the present invention with an appropriate peptidase.
  • a genetic engineering technique for example, any of a solid phase synthesis method and a liquid phase synthesis method may be used.
  • the present invention also relates to a DNA encoding the protein of the present invention.
  • the DNA of the present invention is used for in vivo and in vitro production of the protein of the present invention as described above, and also includes, for example, gene therapy for diseases caused by abnormalities of the gene encoding the protein of the present invention. It can also be applied to
  • the DNA of the present invention may be in any form as long as it can encode the protein of the present invention. That is, it does not matter whether it is cDNA synthesized from mRNA, genomic DNA, chemically synthesized DNA, or the like.
  • DNAs having any base sequence based on the degeneracy of the genetic code are included as long as they can encode the protein of the present invention.
  • the DNA of the present invention can be prepared by a method known to those skilled in the art.
  • a cDNA library is prepared from cells expressing the protein of the present invention, and a part of the sequence of the DNA of the present invention (for example, SEQ ID NO: 1, 3, or 5) is used as a probe for hybridization.
  • the cDNA library may be prepared, for example, by the method described in Sambrook, J. et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), or a commercially available DNA library may be used.
  • RNA is prepared from cells expressing the protein of the present invention.
  • oligo DNA is synthesized based on the sequence of the DNA of the present invention (for example, SEQ ID NO: 1, 3, or 5), and a PCR reaction is carried out using this as a primer to obtain the protein of the present invention. It can also be prepared by amplifying the encoding cDNA. Further, by determining the nucleotide sequence of the obtained cDNA, the translation region encoded by the cDNA can be determined, and the amino acid sequence of the protein of the present invention can be obtained. Genomic DNA can be isolated by screening a genomic DNA library using the obtained cDNA as a probe.
  • mRNA is isolated from cells, tissues, and organs that express the protein of the present invention (for example, fetal liver and kidney, cancer cell lines, and the like).
  • mRNA can be isolated by known methods, for example, guanidine ultracentrifugation (Chirgwin, JM et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299), AGPC (Chomczynski, P. and Sacchi, ⁇ , Anal. Prepare total RNA using Biochem. (1987) 162, 156-159) and purify mRNA from total MA using mRNA Purification Kit (Pharmacia).
  • mRNA can be directly prepared by using QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia).
  • CDNA is synthesized from the obtained mRNA using reverse transcriptase. cDNA synthesis, AMV
  • Reverse transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit (Shodaigaku Kogyo) can also be used.
  • the 5 -RACE method using the 5'-Ampli FINDER RACE Kit (manufactured by Clontech) and the polymerase chain reaction (PCR) ( Acad. Sci. USA (1988) 85, 8998-9002; Belyavsky, A. et al., Nucl eic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932)
  • PCR polymerase chain reaction
  • a target DNA fragment is prepared from the obtained PCR product and ligated to a vector DNA. Further, a recombinant vector is prepared from this, introduced into E. coli, etc., and colonies are selected to prepare a desired recombinant vector.
  • the base sequence of the target DNA is known For example, it can be confirmed by the dideoxynucleotide chain method.
  • a nucleotide sequence with higher expression efficiency can be designed in consideration of the codon usage of the host used for expression (Grantham, R. et al., Nuclear Acids Research ( 1981) 9, p43-p74) 0
  • the DNA of the present invention can be modified by a commercially available kit known in the art. Examples of the modification include digestion with a restriction enzyme, insertion of a synthetic oligonucleotide or an appropriate MA fragment, addition of a linker, insertion of a start codon (ATG) and / or a stop codon (TAA, TGA, or TAG).
  • ATG start codon
  • TAA stop codon
  • the DNA of the present invention includes a haze consisting of base A at position 472 to base C at position 2712 in the base sequence of SEQ ID NO: 1, and base A to position 1305 from base A at position 247 in the base sequence of SEQ ID NO: 3. And a DNA consisting of base A at position 254 to base G at position 1159 in the base sequence of SEQ ID NO: 5.
  • the DNA of the present invention is a DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, 3, or 5, and is functionally equivalent to the protein of the present invention. DNA encoding various proteins.
  • Stringent conditions can be appropriately selected by those skilled in the art, and include, for example, low stringent conditions. More preferably, a high stringent condition is used. These conditions are as described above.
  • the hybridizing DNA is preferably cDNA or chromosomal DNA.
  • the present invention also relates to a vector into which the DNA of the present invention has been inserted.
  • a vector of the present invention it is useful for retaining the DNA of the present invention in host cells or expressing the protein of the present invention.
  • Escherichia coli when Escherichia coli is used as a host, the vector is amplified in Escherichia coli (e.g., 9, 9, DH5, HB10 XLlBlue), etc. Escherichia coli with "ori" and transformed (For example, a drug resistance gene that can be distinguished by any drug (ampicillin, tetracycline, dynamycin, chloramphenicol)).
  • Escherichia coli with "ori” and transformed (For example, a drug resistance gene that can be distinguished by any drug (ampicillin, tetracycline, dynamycin, chloramphenicol)).
  • examples of vectors include the M13 vector, the pUC vector, pBR322, pBluescript; and pCR-Script.
  • pGEM-T, pDIRECT, pT7 and the like can be mentioned.
  • an expression vector is particularly useful.
  • an expression vector for example, when the purpose is expression in E. coli, in addition to having the above-mentioned characteristics such that the vector is amplified in E. coli, the host may be JM109, DH5, HB10U XLl-Blue, etc.
  • a promoter which can be efficiently expressed in Escherichia coli such as lacZ promoter (Ward et al., Nature (1989) 341 544-546; FASEB J.
  • the vector may contain a signal sequence for polypeptide secretion.
  • a signal sequence for protein secretion a pelB signal sequence (Lei, SP et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379) may be used for production in the periplasm of Escherichia coli.
  • the introduction of the vector into the host cell can be performed, for example, using a chloride solution method or an electroporation method.
  • expression vectors derived from mammals for example, pcDNA3 (manufactured by Invitrogen), pEGF-BOS (Nucleic Acids. Res.
  • insect cell-derived expression vectors for example, Bac-to-BAC baculovairus expression systemj (GIBC0 BE1), pBacPA K8), plant-derived expression vectors (for example, ⁇ 1, pMH2) Expression from animal viruses Vector (eg, pHSV, pMV, pAdexLcw), retrovirus-derived expression vector (eg, pZIpneo), yeast-derived expression vector (eg, “Pichia Expression Kitj (Invitrogen)”, pNVIK SP- Q01), and expression vectors derived from Bacillus subtilis (eg, pPL608, pKTH50).
  • Bac-to-BAC baculovairus expression systemj GIBC0 BE1
  • pBacPA K8 plant-derived expression vectors
  • plant-derived expression vectors for example, ⁇ 1, pMH2
  • Expression from animal viruses Vector eg, pHSV, pMV, pAdexLcw
  • retrovirus-derived expression vector e
  • the promoter required for expression in cells such as the SV40 promoter (Mulligigan et al., Nature (1979)) 277, 108), MMLV-LTR Pro Ichiyuichi, EF1 Hypopromo-Yu-(Mizushima et al., Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322), it is essential to have a CMV promoter, etc.
  • the promoter required for expression in cells such as the SV40 promoter (Mulligigan et al., Nature (1979)) 277, 108), MMLV-LTR Pro Ichiyuichi, EF1 Hypopromo-Yu-(Mizushima et al., Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322), it is essential to have a CMV promoter, etc.
  • a drug resistance gene that can be identified by a drug (neomycin, G418, etc.
  • examples of the vector having such properties include pSQL, pDR2, pBK-RSV ⁇ pBK-CMV, pOPRSV ⁇ p0P13, and the like.
  • a DHFR gene complementing the nucleic acid synthesis pathway-deficient CH0 shelf is used. Introduce a vector (eg, pCHOI) and add methotrexate
  • MTX transient expression of a gene
  • the replication mechanism of SV40 is replicated using COS cells that have a gene that expresses the SV40 T antigen on the chromosome. Transformation with a vector (such as pcD).
  • a method of expressing the DNA of the present invention in an animal body a method of incorporating the DNA of the present invention into an appropriate vector and introducing the DNA into a living body by a retrovirus method, a ribosome method, a catonic ribosome method, an adenovirus method, or the like is used. And so on.
  • fls353 or “fls485” gene of the present invention.
  • the vector used include, but are not limited to, an adenovirus vector (eg, pAdexlcw) and a retrovirus vector (eg, pZIPneo).
  • adenovirus vector eg, pAdexlcw
  • a retrovirus vector eg, pZIPneo
  • General genetic manipulations such as insertion of the DNA of the present invention into a vector can be performed according to a conventional method. (Molecular Cloning, 5.61-5.63).
  • Administration into a living body may be an ex vivo method or an in vivo method.
  • the present invention also relates to a host cell into which the vector of the present invention has been introduced.
  • the host cell into which the vector of the present invention is introduced is not particularly limited, and for example, Escherichia coli and various animal cells can be used.
  • the host cell of the present invention can be used, for example, as a production system for producing or expressing the protein of the present invention.
  • Production systems for protein production include in vitro and in vivo production systems. Examples of in vitro production systems include production systems using eukaryotic cells and production systems using prokaryotic cells.
  • animal cells for example, animal cells, plant cells, and fungal cells can be used as hosts.
  • animal cells mammalian cells, for example, CHO (J. Exp. Med. (1995) 108, 945), COS ⁇ 3T3, Kazuma Mie, BHK (baby hamster kidney) ⁇ HeLa ⁇ Vero, amphibian cells, for example African omega frog oocytes (Val le, et al., Nature (1981) 291, 358-340) or insect cells such as sf9 and sf2K Tn5 are known.
  • CHO cells in particular, DHfr-CHO (Proc. Natl. Acad. Sci.
  • the vector is introduced into the host cell by, for example, the calcium phosphate method, the DEAE dextran method, the method using the force ribosome D0TAP (manufactured by Behringer Mannheim), the electoral poration method, or the lipofection method. Is possible.
  • Nicotiana tabacum As plant cells, for example, cells derived from Nicotiana tabacum (Nicotiana tabacum) are known as protein production systems, which may be callus cultured.
  • Fungal cells include yeast, for example, the genus Saccharomyces, for example, Saccharomyces cerevisiae, filamentous fungi, for example, The genus Aspergillus, for example, Aspergillus niger is known.
  • bacterial cells When using prokaryotic cells, there is a production system using bacterial cells.
  • bacterial cells include Escherichia coli (E. coli), for example, JM109, DH5 and HB101, and Bacillus subtilis.
  • the culture can be performed according to a known method.
  • a culture solution of animal cells for example, DMEM, MEM, RPMI 1640, and IMDM can be used.
  • a serum replacement solution such as fetal calf serum (FCS) may be used together, or serum-free culture may be performed.
  • FCS fetal calf serum
  • the pH during culturing is preferably about 6-8. Culture is usually performed at about 30 to 40 ° C for about 15 to 200 hours, and the medium is replaced, aerated, and agitated as necessary.
  • examples of a system for producing a protein in vivo include a production system using animals and a production system using plants.
  • the target DNA is introduced into these animals or plants, and proteins are produced and recovered in the animals or plants.
  • the “host” in the present invention includes these animals and plants.
  • mice When using animals, there are production systems using mammals and insects. As mammals, goats, bushes, higgies, mice, and mice can be used (Vicki Glasser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993). When a mammal is used, a transgenic animal can be used.
  • the target DNA is prepared as a fusion gene with a gene encoding a protein that is specifically produced in milk, such as goat casein.
  • the DNA fragment containing the fusion gene is injected into a goat embryo, and the embryo is transplanted into a female goat.
  • the target protein can be obtained from milk produced by the transgenic goat born from the goat that has received the embryo or its progeny. Hormones should be translocated appropriately to increase the amount of milk containing proteins produced by the transgenic goat. It may also be used for Suziennicka (Ebert, KM et al., Bio / Technology (1994) 12, 699-702).
  • silkworms can be used as insects, for example.
  • the target protein can be obtained from the body fluid of the silkworm by infecting the silkworm with a baculovirus containing DNA encoding the target protein (Susumu,. Et al., Nature (1985) 315, 592-594).
  • tobacco when using a plant, for example, tobacco can be used.
  • the DNA encoding the protein of interest is inserted into a plant expression vector, for example, pMON530, and this vector is introduced into a bacterium such as Agrobacterium timefaciens. .
  • This bacterium is infected to tobacco, for example, Nicotiana tabacum, and the desired polypeptide can be obtained from the leaves of this tobacco (Julian K.-C. Ma et al., Eur. J. Immunol (1994) 24, 13 138).
  • the protein of the present invention thus obtained can be isolated from the inside or outside of the host cell (such as a medium) and purified as a substantially pure and homogeneous protein.
  • the separation and purification of the protein may be performed by the separation and purification methods used in ordinary protein purification, and are not limited at all. For example, chromatography chromatography, filter, ultrafiltration, salting out, solvent precipitation, solvent extraction, distillation, immunoprecipitation, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, isoelectric focusing, dialysis, recrystallization, etc.
  • the proteins can be separated and purified by selecting and combining as appropriate.
  • chromatography examples include affinity chromatography, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration, reverse phase chromatography, and adsorption chromatography (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory). Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996).
  • chromatography methods include liquid phase chromatography, for example, liquid chromatography such as HPLC and FPLC. It can be performed using phase chromatography.
  • the present invention also includes highly purified proteins using these purification methods.
  • the protein can be arbitrarily modified or partially removed by reacting the protein with an appropriate protein modification enzyme before or after purification.
  • the protein modifying enzyme for example, trypsin, chymotrypsin, lysylendopeptidase, protein kinase, glucosidase and the like are used.
  • the present invention also relates to an antibody that binds to the protein of the present invention.
  • the form of the antibody of the present invention is not particularly limited, and includes a monoclonal antibody in addition to a polyclonal antibody. Also included are antisera obtained by immunizing immunized animals such as rabbits with the protein of the present invention, polyclonal antibodies and monoclonal antibodies of all classes, as well as human antibodies and humanized antibodies obtained by genetic recombination.
  • the protein of the present invention used as a sensitizing antigen for obtaining an antibody is not limited to the animal species from which the protein is derived, but is preferably a protein derived from a mammal, for example, a human, a mouse, or a rat. preferable.
  • a human-derived protein can be obtained using the gene sequence or amino acid sequence disclosed herein.
  • the protein used as the sensitizing antigen may be a complete protein or a partial peptide of the protein.
  • partial proteins include amino (N) terminal fragments and carboxy (C) terminal fragments of proteins.
  • antibody refers to an antibody that reacts with the full length or fragment of a protein.
  • a gene encoding the protein of the present invention or a fragment thereof is inserted into a known expression vector system, and the host cell described in this specification is transformed with the vector. May be obtained by a known method, and these may be used as a sensitizing antigen. Alternatively, a cell expressing the protein, a lysate thereof, or a chemically synthesized protein of the present invention may be used as the sensitizing antigen.
  • the mammal to be immunized with the sensitizing antigen is not particularly limited, but is preferably selected in consideration of compatibility with the parent cell used for cell fusion. In general, rodents are used. Eyes, egrets, and primates are used.
  • mice for example, mice, rats, hamsters and the like are used.
  • a heronoid animal for example, a heron is used.
  • monkeys are used as primates.
  • monkeys of the lower nose old world monkeys
  • cynomolgus monkeys for example, rhesus monkeys, baboons, and chimpanzees are used.
  • Immunization of an animal with a sensitizing antigen is performed according to a known method.
  • a sensitizing antigen is injected intraperitoneally or subcutaneously into a mammal.
  • the sensitizing antigen is diluted and suspended in an appropriate amount with PBS (Phosphate-Buffered Sine) or physiological saline, and then mixed with an appropriate amount of a normal adjuvant, for example, Freund's complete adjuvant, if desired. After emulsification, it is administered to mammals. Thereafter, it is preferable to administer the sensitizing antigen mixed with an appropriate amount of Freund's incomplete adjuvant several times every 4 to 21 days.
  • a suitable carrier can be used at the time of immunization of the sensitizing antigen. Immunization is performed in this manner, and an increase in the desired antibody level in the serum is confirmed by a conventional method.
  • the blood of the mammal sensitized with the antigen is taken out.
  • the serum is separated from the blood by a known method.
  • a serum containing the polyclonal antibody may be used.
  • a fraction containing the polyclonal antibody may be further isolated from the serum and used. For example, using an affinity column to which the protein of the present invention is coupled, a fraction that recognizes only the protein of the present invention is obtained, and this fraction is further purified using a protein A or protein G column.
  • immunoglobulin G or M can be prepared.
  • immune cells may be removed from the mammal and subjected to cell fusion.
  • preferred immune cells used for cell fusion include splenocytes, in particular.
  • the other parent cell to be fused with the immune cell is preferably a mammalian myeloma cell, and more preferably a myeloma cell that has acquired the properties for selecting fused cells by a drug.
  • the cell fusion of the immune cells and myeloma cells is basically performed by a known method, for example, the method of Milstein et al. (Gal fre, G. and Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46). And so on.
  • the hybridoma obtained by cell fusion is selected by culturing it in a normal selective culture medium, for example, a HAT culture medium (a culture medium containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine). Culturing in the HAT culture solution is continued for a time sufficient to kill cells other than the target hybridoma (non-fused cells), usually for several days to several weeks. Next, a conventional limiting dilution method is performed to screen and clone a hybridoma producing the desired antibody.
  • a normal selective culture medium for example, a HAT culture medium (a culture medium containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine). Culturing in the HAT culture solution is continued for a time sufficient to kill cells other than the target hybridoma (non-fused cells), usually for several days to several weeks.
  • a conventional limiting dilution method is performed to screen and clone a hybridoma producing the desired antibody.
  • a human lymphocyte for example, a human lymphocyte infected with EB virus is treated in vitro with a protein, a protein-expressing cell or a lysate thereof.
  • the sensitized lymphocytes can be fused with human-derived myeloma cells having permanent cleavage ability, for example, U266, to obtain a hybridoma that produces a desired human antibody having protein binding activity. (JP-A-63-17688).
  • the obtained hybridomas were transplanted into a mouse intraperitoneal cavity, ascites was collected from the mice, and the obtained monoclonal antibody was subjected to, for example, ammonium sulfate precipitation, protein A, protein G column, DEAE ion exchange chromatography, It can be prepared by purifying the protein of the present invention using an affinity column to which the protein is coupled.
  • the antibody of the present invention is used for purification and detection of the protein of the present invention, and is also a candidate for an agonist and an gonist of the protein of the present invention. Also, It is also conceivable to apply this antibody to antibody therapy for diseases involving the protein of the present invention.
  • a human antibody ⁇ a human antibody is preferable in order to reduce immunogenicity.
  • a transgenic animal having a human antibody gene repository is immunized with a protein serving as an antigen, a protein-expressing cell or a lysate thereof to obtain an antibody-producing cell, which is then fused with a myeloma cell.
  • Human antibodies against the protein can be obtained using dogs (see International Publication Nos. W092-03918, W093-2227, W094-02602, W094-25585, W096-33735, and W096-34096).
  • cells in which immune cells such as sensitized lymphocytes producing antibodies are immortalized by oncogenes may be used.
  • the monoclonal antibody thus obtained can also be obtained as a recombinant antibody produced using a genetic recombination technique (for example, Borrebaeck, C. AK and Larrick, JW, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published). in the United Kingdom by MCMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990).
  • Recombinant antibodies are produced by cloning the DNA encoding them from immune cells such as hybridomas or sensitized lymphocytes that produce the antibody, incorporating the DNA into an appropriate vector, and introducing it into a host. .
  • the present invention includes this recombinant antibody.
  • the antibody of the present invention may be an antibody fragment or a modified antibody thereof as long as it binds to the protein of the present invention.
  • antibody fragments include Fab, F (ab ') 2, Fv, or a single chain Fv (scFv) in which the Fvs of the H and L chains are linked by an appropriate linker (Huston, JS et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 5879-5883).
  • an antibody is treated with an enzyme such as papain or pepsin to generate an antibody fragment, or a gene encoding these antibody fragments is constructed and introduced into an expression vector. Expression in host cells (eg, Co, MS et al., J. I.
  • modified antibody an antibody bound to various molecules such as polyethylene glycol (PEG) can be used.
  • PEG polyethylene glycol
  • the “antibody” of the present invention also includes these modified antibodies.
  • Such a modified antibody can be obtained by subjecting the obtained antibody to chemical modification. These methods have already been established in this field.
  • the antibody of the present invention can be prepared by using a chimeric antibody composed of a variable region derived from a non-human antibody and a constant region derived from a human antibody or a CDR (complementary determining region) derived from a non-human antibody using known techniques. It can be obtained as a humanized antibody composed of human antibody-derived FR (framework region) and constant region.
  • the antibody obtained as described above can be purified to homogeneity.
  • the separation and purification of the antibody used in the present invention may be performed by the separation and purification methods used for ordinary proteins. For example, if appropriate selection and combination of chromatographic columns such as affinity chromatography, filters, ultrafiltration, salting out, dialysis, SDS polyacrylamide gel electrophoresis, isoelectric focusing, etc., antibodies can be separated. (Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988), but are not limited thereto.
  • Chromatography other than affinity chromatography includes, for example, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration, reverse Phase chromatography, adsorption chromatography, and the like (Strategies fo r Protein Purification and Characterization :.. A Laboratory Course Manual Ed Daniel R. Marshak et al, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996) c These chromatographies HPLC, It can be performed using liquid phase chromatography such as FPLC.
  • Methods for measuring the antigen-binding activity of the antibody of the present invention include, for example, measurement of absorbance, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), EIA (enzyme-linked immunosorbent assay), and RIA (enzyme-linked immunosorbent assay). (Radioimmunoassay) or a fluorescent antibody method can be used.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • EIA enzyme-linked immunosorbent assay
  • RIA enzyme-linked immunosorbent assay
  • fluorescent antibody method can be used.
  • the protein of the present invention is added to a plate on which the antibody of the present invention is immobilized, and then a sample containing the target antibody, for example, a culture supernatant of antibody-producing cells or a purified antibody is added.
  • a secondary antibody that recognizes an enzyme such as an antibody labeled with alkaline phosphatase
  • an enzyme substrate such as P-ditrophenyl phosphate to measure the absorbance.
  • a fragment of the protein for example, a fragment comprising the C-terminus or a fragment comprising the N-terminus may be used as the protein.
  • BIAcore Pharmacia
  • the antibody of the present invention is brought into contact with a sample expected to contain the protein of the present invention contained in the sample, and an immune complex of the antibody and the protein is detected or measured.
  • the method for detecting or measuring the protein of the present invention can be carried out.
  • the protein detection or measurement method of the present invention can specifically detect or measure a protein, it is useful for various experiments and the like using proteins.
  • the present invention also relates to nucleotides that hybridize with DNA encoding the human "fls353" or "fls485" protein (SEQ ID NO: 1, 3, or 5) or a complement thereof and have a length of at least 15 bases.
  • the nucleotide of the present invention It is a nucleotide that specifically hybridizes to DNA encoding the protein of the present invention.
  • the term "specifically hybridize” as used herein means that under normal hybridization conditions, preferably under stringent hybridization conditions, cross-hybridization with DNA encoding other proteins is performed. Means not to occur significantly.
  • nucleotides include probes, primers, nucleotides or nucleotide derivatives (for example, antisense oligonucleotides and ribozymes) that can specifically hybridize with DNA encoding the protein of the present invention or its complementary strand. included. Such nucleotides can also be used for producing DNA chips.
  • the present invention includes, for example, an antisense oligonucleotide that hybridizes at any position in the base sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 1, 3, and 5.
  • This antisense oligonucleotide is preferably an antisense oligonucleotide to at least 15 or more consecutive nucleotides in the base sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 1, 3, and 5. More preferably, the antisense oligonucleotide described above, wherein the consecutive at least 15 or more nucleotides contain a translation initiation codon.
  • antisense oligonucleotide derivatives and modifications thereof can be used.
  • a modified product include a modified lower alkylphosphonate such as a methylphosphonate type or an ethylphosphonate type, a phosphorothioate modified product, a phosphoroamidated modified product, and the like.
  • antisense oligonucleotide means not only those nucleotides corresponding to nucleotides constituting a predetermined region of DNA or mRNA are all complementary but also that the DNA or mRNA and the oligonucleotide are represented by SEQ ID NO: 1.
  • One or more nucleotide mismatches may be present as long as they can specifically hybridize to the nucleotide sequence shown in, 3, or 5.
  • nucleotides have at least 15 contiguous nucleotide sequence regions At least 70 ° /. It preferably has at least 80%, more preferably 90%, and even more preferably 95% or more nucleotide sequence homology.
  • the algorithm described in this specification may be used as an algorithm for determining homology.
  • Such a nucleotide is useful as a probe for detecting or isolating a DNA encoding the protein of the present invention, or as a primer for amplifying, as described in Examples below.
  • the antisense oligonucleotide derivative of the present invention acts on the protein-producing cell of the present invention to inhibit its transcription or translation by binding to DNA or mRNA encoding the protein.
  • the antisense oligonucleotide derivative of the present invention can be mixed with an appropriate base material which is inactive against the derivative to prepare an external preparation such as a coating agent, a cataplasm and the like.
  • excipients may be added to tablets, splinters, granules, capsules, ribosome capsules, It can be a lyophilized agent such as a propellant, a liquid, a nasal drop and the like. These can be prepared according to a conventional method.
  • the antisense oligonucleotide derivative of the present invention is applied directly to the affected area of the patient, or is applied to the patient so as to be able to reach the affected area as a result of intravenous administration or the like.
  • an antisense-encapsulated material that enhances durability and membrane permeability can be used.
  • ribosome, poly-L-lysine, lipid, cholesterol, ribofectin or derivatives thereof can be mentioned.
  • the dose of the antisense oligonucleotide derivative of the present invention can be appropriately adjusted according to the condition of the patient, and a preferred amount can be used. For example, it can be administered in the range of 0.1 to 100 mg / kg, preferably 0.1 to 50 mg / kg.
  • Antisense oligonucleotide of the present invention inhibits expression of protein of the present invention Therefore, it is useful in suppressing the biological activity of the protein of the present invention.
  • the expression inhibitor containing the antisense oligonucleotide of the present invention is useful in that it can suppress the biological activity of the protein of the present invention.
  • the antisense oligonucleotide of the present invention is, for example, It may be used for anticancer purposes.
  • the present invention also relates to a method for screening a compound that binds to the protein of the present invention, using the protein of the present invention.
  • This screening method comprises: (a) a step of bringing a test sample into contact with the protein of the present invention or a partial peptide thereof; and (b) a step of detecting the binding activity between the protein of the present invention or a partial peptide thereof and the test sample. (C) selecting a compound that binds to the protein of the present invention or a partial peptide thereof.
  • the protein of the present invention used for screening may be a recombinant protein or a naturally-occurring protein. It may be a partial peptide.
  • the test sample is not particularly limited, and examples thereof include a cell extract, a cell culture supernatant, a fermented microorganism product, a marine organism extract, a plant extract, a purified or crude protein, a peptide, a non-peptide compound, Synthetic low molecular weight compounds and natural compounds.
  • the protein of the present invention to which a test sample is contacted may be, for example, a purified protein, a soluble protein, a form bound to a carrier, or a fusion protein with another protein, or the like. Can be contacted.
  • a method of using the protein of the present invention to screen for example, a protein that binds to the protein
  • many methods known to those skilled in the art can be used.
  • Such screening can be performed, for example, by immunoprecipitation. Specifically, it can be performed as follows.
  • a gene encoding the protein of the present invention into a vector for expressing a foreign gene such as pSV2neo, pcDNAI, or pCD8, the gene is expressed in animal cells or the like.
  • Promoters used for expression include SV40 early promoter (Rigby In Williamson i, ed.), Genetic Engl neering, Vol.3.Academic Press, London, p.83-141 (1982)), EF-1 promote r (Kim et al. Gene 91, p.217-223 (1990)), CAG promoter (Niwa et al. Gene 108, p. 193-200 (1991)), RSV LTR promoter (Cullen Methods in Enzymology 152, p. 684-704 (1987)), SR hi romoter (Takebe et al. Mol. Cell. Biol. 8, p. 466 (1988)), CMV immediate early promoter ⁇ Seed and Aruf fo Proc. Natl. Acad.
  • the protein of the present invention can be used as a fusion protein having a recognition site of the monoclonal antibody.
  • a recognition site epitope
  • Commercially available antibodies can be used as the epitope system (Experimental Medicine 1 ⁇ , 85-90 (1995)).
  • a commercially available vector that can express a fusion protein with 5-galactosidase, maltose-binding protein, glutathione S-transferase, green fluorescent protein (GFP), etc. through a multicloning site Have been.
  • polyhistidine His-tag
  • influenza agglutinin HA human c-myc
  • FLAG Vesicular stomatitis virus glycoprotein
  • VSV-GP Vesicular stomatitis virus glycoprotein
  • T7-tag human simple virus Epitopes such as viral glycoproteins (HSV-tags) and E-tags (epitopes on monoclonal phages) and monoclonal antibodies that recognize them
  • HSV-tags viral glycoproteins
  • E-tags epitopes on monoclonal phages
  • an immune complex is formed by adding these antibodies to a cell lysate prepared using an appropriate surfactant.
  • This immune complex comprises the protein of the present invention, a protein capable of binding thereto, and an antibody.
  • immunoprecipitation can be performed using an antibody against the protein of the present invention.
  • Antibodies against the protein of the present invention include, for example, introducing a gene encoding the protein of the present invention into an appropriate E. coli expression vector, expressing the gene in E. coli, purifying the expressed protein, It can be prepared by immunizing rats, goats, and chickens. Alternatively, it can be prepared by immunizing the above animal with the synthesized partial peptide of the protein of the present invention.
  • the immune complex can be precipitated using Protein in A Sepharose or Protein G Sepharose.
  • an epitope such as GST
  • a substance specifically binding to these epitopes such as glutathione-Sepharose 4B is used to prepare the protein of the present invention.
  • an immune complex can be formed.
  • SDS-PAGE is generally used to analyze immunoprecipitated proteins, and by using a gel of an appropriate concentration, it is possible to analyze proteins bound by the molecular weight of the protein.
  • the protein bound evening protein of the present invention since it is difficult to detect a Coomassie one dyeing and such silver staining of the proteins conventional staining method, a radioactive isotope 35
  • the desired protein can be purified directly from the SDS-polyacrylamide gel and sequenced.
  • Examples of a method for isolating a protein that binds to the protein using the protein of the present invention include, for example, a West Western blotting method (Skolnik, EY et al., Cell (1991) 65, 83-90). Can be performed. That is, cells, tissues, and organs (eg, fetal liver and kidney, cancer cell lines, etc.) that are expected to express a binding protein that binds to the protein of the present invention are derived from phage vectors. ZAP), and then express it on LB-agarose, immobilize the protein expressed on the filter, and purify and label the protein of the present invention with the filter on the filter. And a plaque expressing the protein bound to the protein of the present invention may be detected by labeling.
  • a West Western blotting method Skolnik, EY et al., Cell (1991) 65, 83-90.
  • Examples of the method for labeling the protein of the present invention include a method using the binding property of biotin and avidin, the protein of the present invention, or a peptide or polypeptide fused to the protein of the present invention (eg, GST).
  • a method using an antibody that specifically binds to a protein a method using a radioisotope, a method using fluorescence, and the like.
  • a 2-hybrid system using cells (Fields, S., and Sternglanz, R., rends. Genet. (1994) 10, 10, 286-292)
  • the method is performed using
  • the protein of the present invention is fused with the SRF DNA-binding region or GAL4 DNA-binding region and expressed in yeast cells, and VP16 or GAL4 is obtained from cells expected to express the protein that binds to the protein of the present invention.
  • Prepare a cDNA library that expresses in a form fused with the transcription activation region introduce it into the above yeast cells, isolate cDNA from the library from the detected positive clones, introduce it into E.
  • the repo overnight gene besides the HIS3 gene, the Ade2 gene, LacZ gene, CAT gene, Lucifer Xase gene and the like can be used.
  • Screening for a protein that binds to the protein of the present invention can also be performed using affinity chromatography.
  • the protein of the present invention is immobilized on a carrier of an affinity column, and a test sample which is expected to express a protein that binds to the protein of the present invention is applied here.
  • the test sample in this case include a cell extract, a cell lysate, and the like. After applying the test sample, the column is washed to prepare a protein bound to the protein of the present invention.
  • the obtained protein is analyzed for its amino acid sequence, oligo DNA is synthesized based on the amino acid sequence, and a cDNA library is screened using the DNA as a probe to obtain a DNA encoding the protein.
  • a biosensor utilizing the surface plasmon resonance phenomenon can be used as a means for detecting or measuring the bound compound. Biosensors using surface plasmon resonance can observe the interaction between the protein of the present invention and the test compound in real time as a surface plasmon resonance signal using a small amount of protein and without labeling. (For example, BIAcore, manufactured by Pharmacia). Therefore, it is possible to evaluate the binding between the protein of the present invention and a test compound by using a biosensor such as BIAcore.
  • the method for isolating not only proteins but also compounds (including agonists and angonists) that bind to the protein of the present invention includes, for example, immobilized proteins of the present invention, synthetic compounds, and natural product banks. Or a method for screening a molecule that binds to the protein of the present invention by using a random phage peptide display library, or a screening method using a hybrid input by combinatorial chemistry technology (Wrighton NC; Farrel FX).
  • the compound that can be isolated by screening is a candidate for a drug for promoting or inhibiting the activity of the protein of the present invention in the prevention or treatment of a disease or tumor caused by a protein dysfunction or the like of the present invention.
  • a gene encoding the protein of the present invention or its expression control region is used. Then, it is conceivable to screen for a compound that can suppress or promote the expression (including transcription and translation) of these genes in vivo. This screening is used, for example, as a screening for candidate compounds for cancer therapeutic or prophylactic agents.
  • This screening comprises: (a) a step of bringing a test sample into contact with a cell expressing the gene of the present invention; (b) a step of detecting the expression of the gene of the present invention in the cell; Selecting a compound that reduces or increases the expression of the gene of the present invention as compared to the case where the sample is not brought into contact with the cells (control).
  • appropriate cell lines expressing the s353 or fls485 gene are cultured with the test sample, and the expression (including transcription and translation) of these genes is analyzed by Northern analysis or RT. -Detection by mRNA method such as PCR method, protein detection method such as stamp lotting, or an improved method of these methods.
  • the desired compound can be screened by selecting a compound that increases or decreases the expression of the gene.
  • This screening comprises the steps of (a) providing a cell into which a vector containing a repo overnight gene operably linked downstream of the expression control region of the gene of the present invention has been introduced; (b) (C) detecting the reporter activity in the cells, and (d) reducing the reporter activity as compared with (d) not contacting the test sample with the cells (control). Or a step of selecting a compound to be increased.
  • “functionally linked” means that the expression control region and the repo gene are expressed so that the repo overnight gene linked downstream thereof can be expressed in response to activation of the expression control region. Yuichi Indicates that the gene is linked.
  • the expression control region (promoter, enhancer, etc.) of the gene of the present invention is cloned by screening a genomic DNA library using the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 3 or 5 or a part thereof as a probe. Then, an expression vector in which this is inserted upstream of an appropriate reporter gene (eg, chloramphenicol acetyltransferase gene, luciferase gene, etc.) is produced, and this is introduced into mammalian cells. Then, a test sample is brought into contact with the cell line, the repot overnight activity is detected, and a compound that increases or decreases reporter activity is compared with the reporter activity in cells not contacted with the test sample.
  • an appropriate reporter gene eg, chloramphenicol acetyltransferase gene, luciferase gene, etc.
  • a depression compound that suppresses or promotes the expression of the gene of the present invention in vivo can be screened.
  • This screening is characterized by being simpler than direct detection such as the Northern analysis described above, since the expression of the gene of the present invention is detected using repo overnight activity as an index.
  • Compounds that promote or suppress the expression of the gene of the present invention are candidates for pharmaceuticals for various diseases caused by abnormal expression of the gene.
  • it is expected to be used as a drug for preventing or treating diseases such as cancer.
  • a substance obtained by using the above-described screening method which partially converts the structure of the compound that promotes or suppresses the expression of the gene of the present invention by addition, deletion and / or substitution, is also a substance of the present invention Included in compounds obtained using screening methods.
  • Compounds obtained using the screening method of the present invention can be used in humans, mammals, for example, mice, rats, guinea pigs, egrets, chicks, cats, dogs, sheep, hijji, buyu, sea lions, monkeys, baboons, and chimpanzees.
  • the isolated compound itself may be administered directly to a patient, or may be formulated into a known pharmaceutical method and administered.
  • sugar-coated tablets, capsules, elixirs, and microcapsules as needed, orally or in water Alternatively, it can be used parenterally in the form of a sterile solution with other pharmaceutically acceptable liquids, or in the form of a suspension for injection.
  • pharmacologically acceptable carriers or vehicles specifically, sterile water or saline, vegetable oils, emulsifiers, suspending agents, surfactants, stabilizers, flavors, excipients, vehicles, It may be formulated by combining with preservatives, binders, etc. as appropriate and mixing in the unit dosage form required for generally accepted pharmaceutical practice.
  • the amount of the active ingredient in these preparations is such that an appropriate dose in the specified range can be obtained.
  • Excipients that can be incorporated into tablets and capsules include, for example, binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, and alginic acid.
  • binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, gum arabic
  • excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, and alginic acid.
  • a leavening agent such as magnesium stearate
  • a sweetening agent such as sucrose, lactose or saccharin
  • a flavoring agent such as peppermint, cocoa oil or tea
  • the preparation unit form is forcepsel
  • the above materials may further contain a liquid carrier such as oil and fat.
  • Sterile compositions for injection can be formulated according to normal pharmaceutical practice using a vehicle such as distilled water for injection.
  • Aqueous solutions for injection include, for example, saline, isotonic solutions containing dextrose and other adjuvants, such as D-sorbitol, D-mannose, D-mannitol, sodium chloride, and the like. It may be used in combination with adjuvants, for example, alcohols, specifically, ethanol, polyalcohols, for example, propylene glycol, polyethylene glycol, nonionic surfactants, for example, polysorbate 80 (TM), HCO-50.
  • Oily liquids include sesame and soybean oils, and may be used in combination with solubilizers such as benzyl benzoate and benzyl alcohol.
  • a buffer for example, a phosphate buffer, a sodium acetate buffer, a soothing agent, for example, proforce hydrochloride, a stabilizer, for example, benzyl alcohol, phenol, or an antioxidant may be blended.
  • the prepared injection solution is usually filled into an appropriate ampoule.
  • Administration to patients includes, for example, intra-arterial injection, intravenous injection, subcutaneous injection, etc. Intracavitary, transbronchial, intramuscular, or orally can be performed by methods known to those skilled in the art.
  • the dose varies depending on the weight and age of the patient, the administration method, and the like, but those skilled in the art can appropriately select an appropriate dose.
  • the compound can be encoded by DNA, the DNA may be incorporated into a gene therapy vector to perform gene therapy.
  • the dose and administration method vary depending on the patient's weight, age, symptoms, and the like, but can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the dose of a compound that binds to the protein of the present invention or a compound that inhibits the activity of the protein of the present invention varies depending on the condition.
  • oral administration in general, in adults (with a body weight of 60 kg), It is about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg per day.
  • the single dose varies depending on the subject of administration, target organ, symptoms, and administration method.
  • parenteral injections usually for adults (with a body weight of 60 kg)
  • the dose can be administered in terms of weight per 60 kg.
  • FIG. 1 is a photograph showing the result of examining the expression of fls353 by Northern analysis.
  • FIG. 2 is a photograph showing expression of s353 in a clinical sample of E. coli. The results of analysis by RT-PCR are shown. Continue to Figure 3.
  • Figure 3 is a continuation of Figure 2.
  • FIG. 4 is a diagram showing the nucleotide sequence of fls353 and the predicted amino acid sequence. Amino acids that match the consensus sequence at the ATP / GT P binding site are indicated by solid lines. Figure 5 TC.
  • FIG. 5 is a continuation of FIG.
  • FIG. 6 is a photograph showing the result of examining the expression of fls485 by Northern analysis.
  • FIG. 7 is a photograph showing the expression of fls485 and hypoprotein in various cultured cells. The results of analysis by RT-PCR are shown.
  • FIG. 8 is a diagram showing the nucleotide sequence of fls485 and the predicted amino acid sequence.
  • fls485 S the underlined region does not exist, and it is expected that methionine (M) surrounded by ⁇ is used as the initiation codon.
  • the sequence shown in a solid square is an amino acid sequence that matches the sequence consisting of Cys-Xaa-Xaa-Cys-Xaa-Gly-Xaa-Gly, and the sequence shown in a dotted box is Cys- This amino acid sequence matches the sequence consisting of Xaa-Xaa-Cys-Xaa-Gly.
  • FIG. 9 is a photograph showing the results of RT-PCR using a primer set sandwiching the entire coding region of fls485. Human fetal liver-derived cDNA was used as type I. The box shown with diagonal lines in the above schematic diagram represents the coding region of fls485.
  • FIG. 10 is a photograph showing the result of examining the expression of s353, fls485, and photoprotein in clinical liver cancer isolates by Northern analysis.
  • FIG. 11 is a photograph showing the result of examining the expression of fls353 and fls485 in a clinical lung cancer sample by Northern analysis. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • Example 1 Preparation of fetal gene subtract library
  • cDNA derived from fetal liver was used as a tester and cDNA derived from adult liver was used as a driver.
  • a subtractive library consisting of the fetal gene (feta 1 gene) that is specifically or more strongly expressed in fetal liver was prepared.
  • the subtraction library was prepared using the PCR-Select TM cDNA Subtraction kit (CLONT ECH) according to the method of Luda Diatchenko et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 93, 6025-6030, 1996).
  • Double-stranded cDNA was synthesized by Mazuhi Bok fetal liver-derived polyA + RNA (CLONTECH) and human adult liver-derived polyA + RNA (CL0NTECH) than using MMLV reverse transcriptase standard methods.
  • the cDNA end was blunt-ended with T4 DNA polymerase, and further cut with Rsal.
  • a portion of the fetal liver-derived cDNA (tester) was split into two parts, and adapter 1 and adapter 2 were separately ligated.
  • 120-fold amount of cDNA (driver) derived from an adult liver was added, and after heat denaturation, primary hybridization was performed at 68 ° C for 8 hours.
  • PCR was performed using Nested PCR primers 1 and 2, which are primers located further inside PCR primers 1 and 2, to obtain a product with further increased selectivity.
  • This product was purified using the QIAquick PCR Purification kit (QIAGEN), and cloned into the pT7Blue-T vector (Novagen) by the TA cloning method to obtain a subtraction library.
  • Table 1 shows adapters 1 and 2, primers 1 and 2, and nested PCR primers 1 and 2.
  • PCR primer 2 5 'TGTAGCGTGAAGACGACAGAA 3' (SEQ ID NO: 12)
  • the clones extracted from the library prepared in Example 1 were randomly sequenced to construct an EST comprising a fetal gene.
  • Sequencing is performed using plasmid DNA prepared by the alkaline SDS method or PCR products such as colony PCR as type III, using ABI PRISM TM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit With AmplyTaq DNA Polymerase, FS It was performed by the cycle sequencing method used, and was decoded by ABI 377 DNA Sequencer.
  • Colony PCR was performed using the M13 P4-22 primer (5, CCAGGGT TTTCCCAGTCACGAC 3, / SEQ ID NO: 15) and the M13 P5-2 primer (5, TCACACAGGA AACAGCTATGAC 3 '/ SEQ ID NO: 16), which are vector-primers. Recombinant in PCR reaction solution containing This was done by directly suspending the colonies. After the PCR reaction, unreacted primers, nucleotides, and the like were removed from the amplified DNA by gel filtration or the like, and used as a sequencing type II.
  • primer sets specific to each of the 84 types of ESTs with novel sequences were prepared, and the expression of each gene was determined by RT-PCR. Screening was performed on lung, brain, and adult liver, kidney, lung, brain, bone marrow, and testis.
  • RNA From P olyA + RNA (CLONTECH) or total RNA, by synthesizing a single-stranded cDNA by standard methods using SUPERSCRIPT TM II RNase H- Revers e Transcriptase (GIBCO BRL), a part of the RT-PCR Atsusi It was used as type ⁇ . PCR was basically performed under the following conditions.
  • Table 2 shows the primer pairs used to amplify “: Hs353” and “: fls485” in RT-PCR and G3PDH used as a control.
  • FLS485 SI primer GAGGGGGATCAGCTCAATGGTCTG 3, (SEQ ID NO: 19) FLS485 A1 primer 5, ACCCCATCGTGGACTTCCCTCTGC 3, (SEQ ID NO: 20)
  • HG3 S1 Primer 5 TCATCATCTCTGCCCCCTCTGCTG 3, (SEQ ID NO: 21)
  • HG3 A1 Primer 1 GACGCCTGCTTCACCACCTTCTTG 3 '(SEQ ID NO: 22)
  • a 5'-stretch pius cDNA library derived from human fetal liver (CLONTECH) was screened by the plaque hybridization method. About 5xl0 5 pieces of several of the positive clones where plaques were screened were obtained. The inserts of these clones were amplified by PCR and sequenced by direct sequencing. By searching the public DNA overnight base using the obtained sequence, some ESTs corresponding to the 3 'side of fls353 were found.
  • the FLS353 E2 primer (5 ′ CTGGTGCAGT TGGTGAGGTTTTCT 3, / SEQ ID NO: 23) and the FLS353 R1 primer (5, CAATCACCG TCCCCAAGTCACCAG 3 '/ SEQ ID NO: 24) was prepared, and the 3' fragment of the fls353 gene was amplified by PCR using human fetal liver-derived cDNA as type III. The amplified fragment was subcloned into pT7BlueT vector (Novagen), and multiple subclones were sequenced to determine the sequence of the 3'-side fragment containing the stop codon of the fls353 gene.
  • the 5 side of the fls353 gene was cloned by the 5, RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) method.
  • RACE Rapid Amplification of cDNA Ends
  • human fetal liver-derived Marathon TM Ready cDNA CLONTE CH
  • the 5S fragment (about 1.3kbp) of fls353 gene was amplified by PCR using FLS353 SI primer and API primer (CLONTECH), and pT7BlueT vector First, it was subcloned. Multiple subclones were sequenced and the 5 'sequence including the start codon was determined.
  • CDNA containing the entire coding region was obtained by PCR using FLS353 WN1 primer (5, AGTCGCGGCCGCC GGTATGCAGAGAAGAGGACAGAA 3, / SEQ ID NO: 25) and FLS353 WN2 primer (5, AGTCGCGGCCGCAAAAGGGGTGAAAGAGAAGATTGC 3 '/ SEQ ID NO: 26). Amplified from fetal liver-derived cDNA.
  • cDNA library (CLONTECH) was plated on a plate in a usual manner and transferred to a Nymouth membrane (Hybond N +). The membrane was cut into fragments that were thought to contain about 200 plaques, and the phage on the membrane was extracted into lambda dilution buffer (SM). The thus obtained cDNA pool was designated as type III, and a pool containing a positive clone was identified by screening by PCR using the above-mentioned FLS485 S1 primer and FLS485 A1 primer.
  • This pool was designated as type III, and the fragment of this positive clone was obtained by PCR using the above FLS4 85 A1 primer and GT10 S1 primer 1 (5, CTTTTGAGCAAGTTCAGCCT3, / SEQ ID NO: 27) which is a vector primer of the library (AgtlO vector). Approximately 800 bp) was amplified. After confirming the sequence, this fragment was used as a probe, and a 5-stretch plus cDNA library derived from human fetal liver (CLONTECH) was screened by a plaque hybridization method. About 10 Screening of 6 plaques yielded 8 positive clones. The inserts of these clones were amplified by PCR and sequenced by direct sequencing.
  • an FLS485 A4 primer (5, TTGAAATGTCCACTCGCTTATCCT 3 '/ SEQ ID NO: 28) was prepared, and the 5, side fragment was cloned by the RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) method. I did one ning.
  • a human fetal liver-derived Marathon TM Ready cDNA (CLONTECH) as type I, a 5 'fragment (about 600 bp) of the fls485 gene was amplified by PCR using the FLS485 A4 primer and the API primer (CL0NTECH). The amplified fragment was subcloned into a pT7BlueT vector (Novagen), and the sequence on the 5 'side including the initiation codon was determined by sequencing a plurality of subclones.
  • the cDNA containing the entire coding region was amplified from human fetal liver cDNA and cloned by PCR using a combination of the 5, side sense primer and the 3, side antisense primer shown in Table 3.
  • fls353 The expression distribution of fls353 in normal tissues was examined by Northern analysis. Non - 32 P] by the original clone of fls353 Ready-to Go DNA labelling beads random primer one method using (Pharmacia) was labeled with dCTP, was used as a probe. Multiple Tissue Northern (MTN) Blot-Using Human, Human II, Human III, Human Fetal II, Human Cancer Cell Line (CLONTECH), ExpressHyb Hybridization Solution (CLONTECH) at 68 ° C according to manufacturer's recommendations Hybridization was performed. The final wash was performed at 0.1 X SSC, 0.1 SDS, 50 ° C. Figure 1 shows the results.
  • fls353 is strongly expressed in fetal liver, kidney, lung, and brain However, almost no expression was observed in the corresponding adult organs. In other adult organs, relatively strong expression was found in the thymus and testis, but otherwise only very weak expression was found.
  • fls353 encodes a protein consisting of 747 amino acids (FIGS. 4 and 5).
  • the nucleotide sequence of the determined fls353 cDNA is shown in SEQ ID NO: 1, and the amino acid sequence of the encoded protein is shown in SEQ ID NO: 2.
  • a search of the database was performed using this amino acid sequence, but no protein showing significant homology was found.
  • the structural features include the ATP / GTP binding consensus sequence (52-59, [Ala / Gly] -Xaa-Xaa-Xa a-Xaa-Gly-Lys- [Ser / Thr], where Xaa represents an arbitrary amino acid), and the ratio of basic amino acid lysine is high (13.2%), indicating that it is a basic protein.
  • fls485 is highly selective for organs that are rich in undifferentiated cells, such as fetal liver and kidney, and adult testis and small intestine, and that are undergoing active cell differentiation and proliferation. It is clear that the gene is
  • liver cancer-derived cell line is in good agreement with the pattern of expression of the liver cancer tumor marker hypeprotein, and the expression of s485 in a cell line that better reflects the characteristics of cancer cells in adults. Were considered to be correlated. No fls485 expression was observed in adult normal liver, either at the Northern level or at the more sensitive RT-PCR level.
  • fls485 was activated along with the canceration of liver cells.
  • a database search revealed that four ESTs that were considered to be derived from fls485 were registered on a public data base. Three of them are derived from colorectal cancer cells (AA308814, AA305159-colorectal adenoma cell line Caco2, AA622964-colorectal cancer RER +). This suggests that fls485 is produced in some types of colorectal cancer. It is suggested that the present is activated.
  • fls485 in clinical liver cancer samples and clinical lung cancer samples was examined by Northern analysis (FIGS. 10 and 11). As a result, it was revealed that its expression was activated in cancer tissues. These results suggested that the expression of the s485 gene was activated in various cancer types and was involved in the development of those cancers.
  • s485 was a gene capable of encoding a protein consisting of 353 amino acids (FIG. 8).
  • the nucleotide sequence of the determined full-length fls485 cDNA is shown in SEQ ID NO: 3, and the amino acid sequence of the encoded protein is shown in SEQ ID NO: 4. This amino acid sequence had the following characteristics.
  • the C-terminal sequence corresponds to the consensus sequence of the Cys-Aaa-Aaa-Xaa box.
  • C (Aaa mainly represents aliphatic amino acids.) This motif is commonly found in ras and other G-terminals. It is said that Cys is a motif necessary for the mechanism of localization inside the cell membrane when modified by lipids. No other intracellular localization signals are found.
  • the C-terminal sequence also applies to the (Ser / Thr) -Xaa-Val motif, which is said to bind to a characteristic domain structure called the PDZ (DHR) domain, which was recently revealed.
  • DHR PDZ
  • This binding mode is observed in the binding of APC, a causative gene of familial polyposis, to the human homologue of the Drosophila tumor suppressor gene, DLG. Is being recognized as an important and fundamental mode of binding in signaling. ⁇ ⁇ Overall hydrophilic, no transmembrane domain, no secretion signal, etc. Homologous search revealed that proteins similar to some proteins in the zinc finger-like domain were not found in the database, although they were found to have significant homology.
  • the zinc finger domain is a common structural domain in many transcription factors, the zinc finger uniform domain of s485 differs from that of such typical transcription factor types, and fls485. No sequence considered to be a nuclear translocation signal was found in the amino acid sequence.
  • the mRNA of fls485 was found to contain a sequence consisting of 146 bp on the 5 'side and a form that skips (fls485 L / SEQ ID NO: 3) (fls485 S / SEQ ID NO: 5) These two types were found to exist (Fig. 9). This region is estimated
  • -Fls485 L can encode a protein 51 amino acids longer than fls485 S (the amino acid sequence of fls485 L protein is SEQ ID NO: 4).
  • the amino acid sequence of fls485 S protein is shown in SEQ ID NO: 6).
  • Northern analysis revealed that testes had longer transcripts than were found in other tissues. However, analysis by PCR showed that this transcript had the same coding region as other tissues, which differed in length in the 3 'untranslated region (UTR) (possibly due to differences in polyA-added sites). It is considered to be derived from Industrial applicability
  • a novel protein specifically or strongly expressed in fetal tissue and a gene encoding the protein have been provided.
  • the gene is strongly expressed in tumor cells, and is expected to be involved in canceration of the cells. Therefore, it is expected that the fetal gene expression inhibitor of the present invention can be an anticancer agent.
  • the fetal gene of the present invention and the protein encoded by the gene may be purified or cloned from new factors involved in cell proliferation, immortalization, invasion, metastasis, angiogenesis, etc.
  • the present invention can be used as a tool for drug development for various diseases caused by abnormal activation of the gene expression of the present invention. By designing a drug or the like targeting the gene of the present invention, it is considered that a drug with a new mechanism of action can be developed.

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Description

明細 Ϊ 新規胎児性遺伝子 技術分野
本発明は、 胎児組織や腫瘍細胞で発現が活性化している胎児性遺伝子がコード するタンパク質に関する。 本発明のタンパク質は、 例えば、 癌に対する医薬品開 発の標的分子として利用しうる。 背景技術
胎児組織には、 活発に増殖を行っている未分化細胞、 高度に活性化されている 細胞、 また新生血管内皮細胞等が多く含まれている。 胎児組織におけるこれらは 厳密な制御下にあり、 個体の成熟に応じて抑制されていくわけだが、 制御を受け るかどうかという点をのそけば、 これは固形腫瘍における状態に非常に類似した 現象であるといえる。 従って、 胎児組織に特異的に発現している遺伝子 （fetal gene/胎児性遺伝子） の一部は、 異常増殖性や、 不死化、 浸潤、 転移、 血管新生 といった固形腫瘍に特徴的な現象に関与する遺伝子である可能性が存在する。 ま た癌以外の疾病についても、 正常な生体では抑制されている胎児性遺伝子が、 異 常に活性化されることにより起こるものが存在することが推測される。 よって、 胎児性遺伝子を単離し、 それらを解析することによって、 癌をはじめとする様々 な疾病に関与する遺伝子を探索でき得ると考えられる。 さらに、 その遺伝子を夕 ーゲッ 卜にした薬剤等を設計することにより、 新たな作用機序による医薬品の開 発が可能であると考えられる。
癌化に関与していることが推測される胎児性遺伝子として、 survivin( Nat Med, 3， 917-921 , 1997)、 auroraキナ一ゼ（EMBO J, 17, 3052-3065 , 1998)、 LYAR( Ge nes Dev, 7, 735-748, 1993 )といった遺伝子が最近報告されている。 いずれも大 腸癌や白血病細胞などにおいてその発現が活性化されており、 癌化に対して重要 な寄与をしているものと考えられている。 実際その生理的機能として、 survivin はアポト一シス阻害活性を持つことが、また auroraキナーゼは細胞周期の調節に 関与していることが示されており、 いずれも癌細胞にとってその機能獲得が有利 に働いていると予想される。 発明の開示
本発明は、 胎児組織に特異的あるいはより強く発現している新規なタンパク質 および該タンパク質をコードする遺伝子、 並びにそれらの製造および用途を提供 する。
これまでに癌化に関連する遺伝子を単離する方法として、 癌細胞と正常細胞を 直接比較し発現量の異なる遺伝子を同定するという戦略は数多く試みられてきて いる。 しかしこの様な方法には、 癌細胞の特徴の一つである遺伝子発現制御の乱 れにより癌化には直接関係ない多数の遺伝子がノイズとなって単離されてしまい、 重要な遺伝子の単離には至らないという問題があった。 そこで、 本発明者らは、 まず生理的な必要性から生理的に発現が制御されている遺伝子を選び出し、 それ が癌という非生理的な状態において再活性化されていないかを探るという戦略を 立てた。 これに基づき、 生理的な必要性から生理的に発現が制御されている遺伝 子として胎児組織に特異的に発現する遺伝子に着目し、 その単離および解析を行 つた。
具体的には、 まず、 サブレヅシヨンサブトラクティブハイブリダィゼ一シヨン 法により、 胎児肝臓由来 cDNAをテスター、 成体肝臓由来 cDNAをドライバ一とし たサブトラクシヨンを行い、 胎児肝臓に特異的あるいはより強く発現している胎 児性遺伝子の探索を行った。 その結果、 複数の遺伝子を単離するに至った。 次い で、 これら胎児組織特異的に発現する遺伝子について癌細胞における発現を検討 した。 その結果、 大腸癌や肝臓癌などの癌細胞において発現が活性化されている 新規遺伝子 「fls353」 および 「fls485」 を同定することに成功した。 これらの全 長 cDNAのクローニングを行いその構造を決定したところ、これらがコ一ドする夕 ンパク質のアミノ酸配列にはいくつかの特徴的なドメイン構造は存在するものの、 特に有意なホモロジ一を示すタンパク質はデータベース中に見いだされなかった c 本発明者らは、 さらに詳細にこれら遺伝子の発現の組織特異性の検討を行った結 果、 これら遺伝子は種々の癌細胞において発現し、 また、 正常組織においては、 胎児組織をはじめとする未分化な細胞や活発に分化増殖する細胞が多く含まれて いると考えられる組織に特異的に発現していることを見出した。
これらの事実から、 新規な胎児性遺伝子である 「； Hs353」および「； Hs485」せ、 細胞の癌化に関与していることが予想された。 従って、 これら胎児性遺伝子の発 現阻害剤は抗癌剤となりうることが期待されるほか、 本発明の胎児性遺伝子およ び該遺伝子がコードするタンパク質は、 腫瘍に対する医薬品開発のためのツール として利用することが可能である。
本発明は、 癌化への関連が予想される新規胎児性遺伝子 「fls353」 および 「Π s485」、 ならびにそれらがコードするタンパク質、並びにそれらの製造及び用途に 関し、 より具体的には、
1 . 下記 （a ) から （d ) のいずれかに記載の DNA、
( a ) 配列番号： 2、 4、 または 6に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質を コードする DNA。
( b ) 配列番号： 1、 3、 または 5に記載の塩基配列のコード領域を含む DNA。
( c ) 配列番号： 2、 4、 または 6に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複 数のアミノ酸が置換、 欠失、 挿入、 および/または付加したアミノ酸配列からな り、 配列番号： 2、 4、 または 6に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機 能的に同等な夕ンパク質をコードする DNA。
( d ) 配列番号： 1、 3、 または 5に記載の塩基配列からなる DNAとストリ ェントな条件下でハイブリダィズし、 配列番号： 2、 4、 または 6に記載のァ ノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするする DNA。
2. 配列番号： 2、 4、 または 6に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の部 分ぺプチドをコードする DNA、
3. ( 1 ) または （2) に記載の DNAが挿入されたベクター、
4. ( 1) 若しくは （2) に記載の MAまたは （3) に記載のベクタ一を保持 する形質転換細胞、
5. ( 1 ) または （2) に記載の DNAによりコードされるタンパク質またはぺ プチド、
6. (4) に記載の形質転換細胞を培養し、 該形質転換細胞またはその培養上 清から発現させたタンパク質を回収する工程を含む、 （5)に記載のタンパク質ま たはべプチドの製造方法、
7. ( 5) に記載のタンパク質に対する抗体、
8. 配列番号： 1、 3、 または 5に記載の塩基配列からなる DNAまたはその相 補鎖とハイブリダィズし、 少なくとも 1 5塩基の鎖長を有するヌクレオチド、
9. ( 5) に記載のタンパク質に結合する化合物のスクリーニング方法であつ て、
(a) 該タンパク質またはその部分べプチドに被検試料を接触させる工程、
(b) 該タンパク質またはその部分べプチドと被検試料との結合活性を検出する 工程、
(c) 該タンパク質またはその部分べプチドに結合する活性を有する化合物を選 択する工程、 を含む方法、
10. (9) に記載の方法により単離されうる、 （5) に記載のタンパク質に結 合する化合物、
1 1. ( 1) に記載の DNAの発現を抑制または促進する化合物をスクリーニン グする方法であって、
(a) 該 DNAを発現する細胞に被検試料を接触させる工程、 (b) 該細胞内における該 DNAの発現を検出する工程、 および
(c) 被検試料を細胞に接触させない場合 （対照） と比較して、 該 DNAの発現を 減少または増加させる化合物を選択する工程、 を含む方法、
12. ( 1) に記載の DNAの発現を抑制または促進する化合物をスクリーニン グする方法であって、
(a) ( 1)に記載の DNAの発現制御領域の下流に機能的に結合されたレポ一夕一 遺伝子を含むベクターが導入された細胞を提供する工程、
(b) 該細胞に被検試料を接触させる工程、
(c) 該細胞内におけるレポーター活性を検出する工程、 および
(d) 被検試料を細胞に接触させない場合 （対照） と比較して、 該レポ一夕一活 性を減少または増加させる化合物を選択する工程、 を含む方法、
13. ( 1 1) または （ 12) に記載の方法により単離しうる、 （ 1) に記載の DNAの発現を抑制または促進する化合物、
を提供するものである。
本発明は、 胎児組織および腫瘍細胞で発現が活性化している新規なタンパク質 「fls353」 および 「fls485」 に関する。 本発明に含まれる、 新規ヒト胎児性遺伝 子 「fls353」 の cDNAの塩基配列を配列番号： 1に、 また、 2種類の新規ヒト胎児 性遺伝子「fls485」 の cDNAの塩基配列を、 それそれ配列番号： 3 (fls485 L) お よび 5 (fls485 S)に、 これらの cDNAによりコードされるタンパク質のアミノ酸 配列をそれそれ配列番号： 2 (fls353)、 4 (fls485 L) および 6 (fls485 S) に 示す。
正常組織においてこれらの遺伝子は、胎児組織をはじめとする未分化な細胞や、 活発に分化増殖する細胞が多く含まれていると考えられる組織に特異的に発現し ていた。 また、 癌細胞における発現を調べたところ、 大腸癌や肝臓癌などの癌細 胞において発現が活性化されていることが判明した。
胎児性遺伝子としては、 survivin、 auroraキナーゼ、 および LYARが、 いずれ も癌化に関与していることが推測されおり、 それらの遺伝子の正常組織における 発現は、 胎児性組織、 特に胎児肝臓に高く、 また成体組織においては、 精巣や胸 腺といった活発な増殖を行っている未分化な細胞が多く存在する組織に高いがそ れ以外の組織においては基本的に発現がほとんどみられないといったパターンを 示すことが報告されている (Nat Med, 3, 917-921 , 1997、 EMBO J, 17, 3052-30 65， 1998、 Genes Dev， 7, 735-748, 1993)。 これは本発明の胎児性遺伝子にほぼ 共通した発現パターンであり、 細胞の増殖に対する必要性からその共通性が生じ ていることが推測される。
癌細胞がそのような自己の増殖に有利に働く遺伝子を再び活性化させる機構に ついては不明であるが、 auroraキナーゼの場合は癌細胞において遺伝子重複が高 頻度で起こっていることが示されており、 これが遺伝子発現活性化の重要な原因 であると予想される。 これらの事実から、 本発明の胎児性遺伝子も、 遺伝子重複 による活性化あるいはまた DNAのメチル化などにより、 細胞の癌化に関与してい る可能性が考えられる。
従って、 本発明の胎児性遺伝子ゃ該遺伝子がコードするタンパク質は、 細胞分 化や細胞増殖を制御する因子の精製やクローニングのためのツールとしての他、 腫瘍などの疾患の治療薬や予防薬の候補化合物のスクリーニングなどの標的とし て好適に利用しうる。 また、 「； fls353」および/または「fls485」遺伝子には、 各 種腫瘍などにおける遺伝子治療などの治療への応用も考えられる。
本発明は、 また、 ヒト 「： fls353」 または 「f ls485」 タンパク質と機能的に同等 なタンパク質を包含する。 このようなタンパク質には、 例えば、 ヒト 「： Hs353」 または「； fls485」 タンパク質に対応する他の生物のホモログタンパク質ゃヒト 「f ls353j または 「fls485」 タンパク質の変異体が含まれる。
本発明において 「機能的に同等」 とは、 対象となるタンパク質が癌に関連した 機能を有することを指す。 癌に関連した機能を有するか否かは、 例えば、 癌細胞 株、 胎児性組織、 その他活発な増殖を行う細胞を含む組織での高い発現特性によ り特徴付けることができる。
あるタンパク質と機能的に同等なタンパク質を調製するための、 当業者によく 知られた方法としては、 タンパク質に変異を導入する方法が知られている。 例え ば、 当業者であれば、 部位特異的変異誘発法 （Hashimoto-Gotoh, T. et al. (19 95) Gene 152, 271-275, Zoller, MJ, and Smith, M.(1983) Methods Enzymol. 100， 468-500, Kramer, W. et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12， 9441-9456、 Kramer W， and Fritz HJ(1987) Methods. Enzymol. 154, 350 - 367、 Kunkel,TA(l 985) Proc Natl Acad Sci U S A. 82， 488-492、 Kunkel (1988) Methods Enzymo 1. 85， 2763-2766) などを用いて、 ヒト 「： Hs353」 または 「： fls485」 タンパク質 のアミノ酸に適宜変異を導入することによりヒト 「fls353」 または 「fls485」 夕 ンパク質と機能的に同等なタンパク質を調製することができる。 また、 アミノ酸 の変異は自然界においても生じうる。 このように、 ヒト 「： Hs353」 または 「 s4 85」 タンパク質のアミノ酸配列において 1もしくは複数のアミノ酸が異なるアミ ノ酸配列を有し、 ヒト 「fls353」 または 「fls485」 タンパク質と機能的に同等な 夕ンパク質もまた本発明のタンパク質に含まれる。 このような変異体において、 変異するアミノ酸数は、 通常、 10アミノ酸以内であり、 好ましくは、 5アミノ酸 以内であり、 さらに好ましくは、 3アミノ酸以内であると考えられる。
あるアミノ酸配列に対する 1又は複数個のアミノ酸残基の欠失、 付加及び/又 は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するタンパク質が その生物学的活性を維持することはすでに知られている （Mark， D. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81， 5662-5666、 Zoller, M. J. & Smith, M. Nucleic Acids Research (1982) 10, 6487-6500、 Wang, A. et al., Scien ce 224, 1431-1433、 Dalbadie-McFarland, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sc i. USA (1982) 79, 6409-6413)。
また、 変異するアミノ酸残基においては、 アミノ酸側鎖の性質が保存されてい る別のアミノ酸に変異されることが望ましい。 例えばァミノ酸側鎖の性質として は、 疎水性アミノ酸 （A、 I、 L、 M、 F、 P、 W、 Y、 V)、 親水性アミノ酸 （R、 D、 N、 C、 E、 Q、 G、 H、 K、 S、 T)、 脂肪族側鎖を有するアミノ酸 （G、 A、 V、 L、 I、 P)、 水酸基含有側鎖を有するアミノ酸 （S、 Τ、 Υ)、 硫黄原子含有側鎖を有するァミノ 酸 （ Μ)、 カルボン酸及びアミ ド含有側鎖を有するアミノ酸 （D、 N、 E、 Q)、 塩 基含有側鎖を有するアミノ離 （R、 Κ、 Η)、 芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Η、 F、 Y、 )を挙げることができる （括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す） c ヒト 「fls353」 または 「fls485」 タンパク質のアミノ酸配列 （配列番号： 2、 4、 または 6 )に 1又は複数個のアミノ酸残基が付加されたタンパク質としては、 例えば、 ヒト 「fls353」 または 「fls485」 タンパク質を含む融合タンパク質が挙 げられる。 融合タンパク質は、 ヒト 「fls353」 または 「： fls485」 タンパク質と他 のペプチド又はタンパク質とが融合したものであり、 本発明に含まれる。 融合夕 ンパク質を作製する方法は、 本発明のヒト 「： fls353」 または 「fls485」 タンパク 質をコードする DNAと他のぺプチド又はタンパク質をコードする DNAをフレーム がー致するように連結してこれを発現べクタ一に導入し、 宿主で発現させればよ く、 当業者に公知の手法を用いることができる。 本発明のタンパク質との融合に 付される他のベプチド又はタンパク質としては、 特に限定されない。
本発明のタンパク質との融合に付される他のペプチドとしては、 例えば、 FLAG (Hopp, T. P. et al .， BioTechnology ( 1988) 6, 1204- 1210)、 6個の His (ヒス チジン） 残基からなる 6 xHis、 10 x His、 インフルエンザ凝集素 （HA)、 ヒト c - m yc の断片、 VSV- GPの断片、 pl8HIVの断片、 T7- tag、 HSV-tag, E- tag、 SV40T 抗 原の断片、 lck tag, ひ- tubul inの断片、 B-tag、 Protein Cの断片等の公知のぺ プチドを使用することができる。 また、 本発明のタンパク質との融合に付される 他のタンパク質としては、 例えば、 GST (グル夕チオン一 S—トランスフェラーゼ）、 HA (インフルエンザ凝集素）、 ィムノグロブリン定常領域、 5—ガラクトシダーゼ、 MBP (マルトース結合タンパク質） 等が挙げられる。
市販されているこれらべプチドまたはタンパク質をコ一ドする DNAを本発明の タンパク質をコードする MAと融合させ、 これにより調製された融合 MAを発現 させることにより、 融合タンパク質を調製することができる。
また、 あるタンパク質と機能的に同等なタンパク質を調製する当業者によく知 られた他の方法としては、 ハイブリダィゼ一シヨン技術 （Sambrook,J et al . , M olecular Cloning 2nd ed. , 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. press, 198 9) を利用する方法が挙げられる。 即ち、 当業者であれば、 ヒト 「： Hs353」 または 「fls485」 タンパク質をコードする DNA配列 （配列番号： 1、 3、 または 5 ) も しくはその一部を基に、 これと相同性の高い DNAを単離して、該 DNAからヒト 「f ls353j または「fls485」タンパク質と機能的に同等なタンパク質を単離すること も通常行いうることである。 このように、 ヒト 「fls353」 または 「fls485」 タン パク質をコードする DNAもしくはその一部からなる DNAとハイプリダイズする DN A がコードするタンパク質であって、 ヒト 「fls353」 または 「fls485」 タンパク 質と機能的に同等なタンパク質もまた本発明のタンパク質に含まれる。 このよう なタンパク質としては、 例えば、 ヒ 卜以外の哺乳動物のホモログ（例えば、 サル、 ラヅト、 マウス、 ゥサギ、 ゥシの遺伝子がコードするタンパク質） が挙げられる。 ヒト 「fls353」 または 「fls485」 タンパク質をコードする DNAと相同性の高い cD NAを、 動物から単離する場合、 特に胎児組織、 特に胎児の肝臓や腎臓を用いるこ とが好ましいと考えられる。
ヒト 「fls353」 または 「fls485」 タンパク質と機能的に同等なタンパク質をコ 一ドする DNAを単離するためのハイプリダイゼ一ションの条件としては、 当業者 であれば適宜選択することができる。一例を示せば、以下の如くである。即ち、「E xpressHyb Hybridization Solutionj (CLONTECH社製）を用い、 55。Cで 30分以上 プレハイブリダィゼーシヨンを行った後、 標識したプローブを添加し、 37°Cから 55°Cで 1時間以上保温することによりハイプリダイゼーシヨンを行う。その後、 2 xSSC、 0. 1¾ SDS中、 室温で 20分の洗浄を 3回、 次いで、 lxSSC、 0. 1¾ SDS中、 3 7°Cで 20分の洗浄を 1回行う。 より好ましい条件 （よりストリンジェントな条件） としては、 「ExpressHyb Hy bridization Solution j (CLONTECH社製）を用い、 60°Cで 30分以上プレハイプリ ダイゼーシヨンを行った後、 標識したプローブを添加し、 60°Cで 1時間以上保温 することによりハイブリダィゼーシヨンを行う。 その後、 2xSS 0. 1% SDS 中、 室温で 20分の洗浄を 3回、 次いで、 lxSSC、 0. 1% SDS中、 50°Cで 20分の洗浄を 2 回行う。
さらに好ましい条件 （さらにストリンジヱン卜な条件） としては、 「ExpressHy b Hybridization Solution j (CLONTECH社製）を用い、 68°Cで 30分以上プレハイ ブリダイゼーシヨンを行つた後、 標識したプロ一ブを添加し、 68°Cで 1時間以上 保温することによりハイブリダィゼ一シヨンを行う。 その後、 2xSS 0. 1¾ SDS 中、 室温で 20分の洗浄を 3回、 次いで、 0. 1xSSC、 0. 1% SDS中、 50°Cで 20分の 洗浄を 2回行う。
但し、 ハイプリダイゼ一シヨンのストリンジエンシーに影響する要素としては 温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、 当業者であればこれら要素を適宜選択 することで同様のストリンジエンシーを実現することが可能である。 また、 ハイ ブリダィゼーシヨンにかえて、 ヒト 「fls353」 または 「fls485」 タンパク質をコ —ドする DNA (配列番号： 1、 3、 または 5 ) の配列情報を基に合成したプライ マーを用いる遺伝子増幅法、 例えば、 ポリメラーゼ連鎖反応（PCR)法を利用して 単離することも可能である。
これらハイプリダイゼ一シヨン技術または遺伝子増幅技術により単離される D NAがコードするヒト 「fls353」 または 「； Qs485」 タンパク質と機能的に同等な夕 ンパク質は、 通常、 ヒト 「fls353」 または 「f ls485」 タンパク質とアミノ酸配列 において高い相同性を有する。 高い相同性とは、 通常、 60%以上の相同性、 好ま しくは 70%以上の相同性、 さらに好ましくは 80%以上、 さらに好ましくは 90% 以上の相同性を指す。 タンパク質の相同性を決定するには、 文献（Wi lbur, W. J. and Lip腿， D. J. Pro atl . Acad. Sci . USA ( 1983 ) 80, 726-730) に記載 のァルゴリズムにしたがえばよい。
本発明の夕ンパク質は、 後述するそれを産生する細胞や宿主あるいは精製方法 により、 アミノ酸配列、 分子量、等電点又は糖鎖の有無や形態などが異なり得る。 しかしながら、 得られたタンパク質が、 本発明のヒト 「fls353」 または「fls485」 タンパク質 （配列番号： 2， 4， または 6 ) と同等の機能を有している限り、 本 発明に含まれる。
本発明のタンパク質は、 当業者に公知の方法により、 組み換えタンパク質とし て、 また天然のタンパク質として調製することが可能である。 組み換えタンパク 質であれば、 本発明のタンパク質をコードする DNA (例えば配列番号： 1、 3、 ま たは 5に記載の塩基配列を有する DNA)を、 適当な発現ベクターに組み込み、 これ を適当な宿主細胞に導入して得た形質転換体を回収し、 抽出物を得た後、 イオン 交換、 逆相、 ゲル濾過などのクロマトグラフィー、 あるいは本発明のタンパク質 に対する抗体をカラムに固定したァフィニティ一クロマトグラフィ一にかけるこ とにより、 または、 さらにこれらのカラムを複数組み合わせることにより精製し、 調製することが可能である。
また、 本発明のタンパク質をグル夕チオン S トランスフェラーゼタンパク質と の融合タンパク質として、 あるいはヒスチジンを複数付加させた組み換えタンパ ク質として宿主細胞（例えば、 動物細胞や大腸菌など）内で発現させた場合には、 発現させた組み換えタンパク質はグル夕チオンカラムあるいはニッケルカラムを 用いて精製することができる。
融合タンパク質の精製後、 必要に応じて融合タンパク質のうち目的のタンパク 質以外の領域を、 トロンビンまたはファクター Xaなどにより切断し、 除去するこ とも可能である。 天然のタンパク質であれば、 当業者に周知の方法、 例えば、 本 発明のタンパク質を発現している組織や細胞の抽出物に対し、 後述するヒト 「f l s353」 または 「fls485」 タンパク質に結合する抗体が結合したァフィ二ティー力 ラムを作用させて精製することにより単離することができる。 抗体はポリクロー ナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。
本発明は、 また、 本発明のタンパク質の部分ペプチドを包含する。 本発明の夕 ンパク質に特異的なアミノ酸配列からなる部分べプチドは、 少なくとも 7ァミノ 酸、 好ましくは 8ァミノ酸以上、 さらに好ましくは 9ァミノ酸以上のアミノ酸配 列からなる。 該部分ペプチドは、 例えば、 本発明のタンパク質に対する抗体の作 製、 本発明のタンパク質に結合する化合物のスクリーニングや、 本発明のタンパ ク質の促進剤や阻害剤のスクリーニングに利用し得る。
本発明の部分ペプチドは、 遺伝子工学的手法、 公知のペプチド合成法、 あるい は本発明のタンパク質を適切なぺプチダ一ゼで切断することによって製造するこ とができる。 ペプチド合成法としては、 たとえば固相合成法、 液相合成法のいず れによっても良い。
また、 本発明は、 本発明のタンパク質をコードする DNAに関する。 本発明の DN Aは、上述したような本発明のタンパク質の in vivoや in vitroにおける生産に 利用される他、 例えば、 本発明のタンパク質をコードする遺伝子の異常に起因す る疾患の遺伝子治療などへの応用も考えられる。 本発明の DNAは、 本発明のタン パク質をコードしうるものであれば、 いかなる形態でもよい。 即ち、 mRNAから合 成された cDNAであるか、 ゲノム DNAであるか、化学合成 DNAであるかなどを問わ ない。 また、 本発明のタンパク質をコードしうる限り、 遺伝暗号の縮重に基づく 任意の塩基配列を有する DNAが含まれる。
本発明の DNAは、 当業者に公知の方法により調製することができる。 例えば、 本発明のタンパク質を発現している細胞より cDNAライブラリーを作製し、本発明 の DNAの配列 （例えば、 配列番号： 1、 3、 または 5 ) の一部をプローブにして ハイブリダイゼ一シヨンを行うことにより調製できる。 cDNAラィブラリ一は、 例 えば Sambrook, J. et al . , Molecular Cloning、 Cold Spring Harbor Laborator y Press ( 1989 )に記載の方法により調製してもよいし、 市販の DNAライブラリー を用いてもよい。 また、 本発明のタンパク質を発現している細胞より RNAを調製 し、 本発明の DNAの配列 （例えば、 配列番号： 1、 3、 または 5 ) に基づいてォ リゴ DNAを合成し、 これをプライマ一として用いて PCR反応を行い、 本発明の夕 ンパク質をコードする cDNAを増幅させることにより調製することも可能である。 また、得られた cDNAの塩基配列を決定することにより、それがコードする翻訳 領域を決定でき、本発明のタンパク質のアミノ酸配列を得ることができる。また、 得られた cDNAをプローブとしてゲノム DNAライブラリーをスクリーニングするこ とにより、 ゲノム DNAを単離することができる。
具体的には、 次のようにすればよい。 まず、 本発明のタンパク質を発現する細 胞、 組織、 臓器 (例えば、 胎児の肝臓や腎臓、 癌細胞株など） から、 mRNA を単離 する。 mRNAの単離は、 公知の方法、 例えば、 グァニジン超遠心法（Chirgwin， J. M. et al .， Biochemistry ( 1979 ) 18, 5294- 5299)、 AGPC法（Chomczynski, P . an d Sacchi , Ν·， Anal . Biochem. ( 1987) 162, 156- 159 )等により全 RNAを調製し、 mRNA Purification Kit(Pharmacia)等を使用して全 MAから mRNAを精製する。ま た、 QuickPrep mRNA Purification Kit(Pharmacia)を用いることにより mRNAを直 接調製することもできる。
得られた mRNAから逆転写酵素を用いて cDNAを合成する。 cDNAの合成は、 AMV
Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit (生ィ匕学工業)等を用 いて行うこともできる。 また、 本明細書に記載されたプライマ一等を用いて、 5' -Ampl i FINDER RACE Kit(Clontech 製）およびポリメラ一ゼ連鎖反応 (polymerase chain reaction ； PCR) を用いた 5， -RACE法（Frohman, M. A. et al . , Proc. N atl . Acad. Sci . U. S.A. ( 1988) 85, 8998-9002 ； Belyavsky, A. et al . , Nucl eic Acids Res. ( 1989 ) 17， 2919- 2932)にしたがい、 cDNAの合成および増幅を行 うことができる。
得られた PCR産物から目的とする DNA断片を調製し、ベクター DNAと連結する。 さらに、 これより組換えベクターを作製し、 大腸菌等に導入してコロニーを選択 して所望の組換えベクターを調製する。 目的とする DNAの塩基配列は、 公知の方 法、 例えば、 ジデォキシヌクレオチドチェイン夕一ミネ一シヨン法により確認す ることができる。
また、 本発明の DNAにおいては、 発現に使用する宿主のコドン使用頻度を考慮 して、 より発現効率の高い塩基配列を設計することができる （Grantham, R. et al . , Nucel ic Acids Research ( 1981 ) 9, p43-p74)0 また、 本発明の DNAは、 巿 販のキッ トゃ公知の方法によって改変することができる。改変としては、例えば、 制限酵素による消化、合成ォリゴヌクレオチドや適当な MAフラグメントの挿入、 リンカーの付加、 開始コドン （ATG) 及び/又は終止コドン （TAA、 TGA、 又は TAG) の挿入等が挙げられる。
本発明の DNAは、 具体的には、 配列番号： 1の塩基配列において 472位の塩基 Aから 2712位の塩基 Cからなる霞、 配列番号： 3の塩基配列において 247位の 塩基 Aから 1305位の塩基 Gからなる DNA、 および配列番号： 5の塩基配列におい て 254位の塩基 Aから 1159位の塩基 Gからなる DNA、 を包含する。
本発明の DNAはまた、 配列番号： 1、 3、 または 5に示す塩基配列からなる DN Aとストリンジェン卜な条件下でハイブリダィズする DNAであり、 且つ上記本発 明のタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする DNAを含む。
ストリンジヱン卜な条件としては、 当業者であれば適宜選択することができる が、 例えば低ス卜リンジェン卜な条件が挙げられる。 またより好ましくは、 高ス トリンジエンドな条件が挙げられる。 これらの条件は、 前記の通りである。 上記 のハイブリダィズする DNAは、 好ましくは cDNAまたは染色体 DNAである。
また、 本発明は、 本発明の DNAが挿入されたベクターに関する。 本発明のべク 夕一としては、 宿主細胞内において本発明の DNAを保持したり、 本発明のタンパ ク質を発現させるために有用である。
ベクターとしては、 例えば、 大腸菌を宿主とする場合には、 ベクタ一を大腸菌 (例えば、 届 9、 DH5ひ、 HB10 XLlBlue) などで大量に増幅させ大量調製する ために、 大腸菌で増幅されるための「ori」 をもち、 さらに形質転換された大腸菌 の選抜遺伝子 （例えば、 なんらかの薬剤 （アンピシリンやテトラサイクリン、 力 ナマイシン、 クロラムフエ二コール） により判別できるような薬剤耐性遺伝子） を有すれば特に制限はない。ベクタ一の例としては、 M13系べクタ一、 pUC系べク 夕一、 pBR322, pBluescript；、 pCR- Scriptなどが挙げられる。 また、 cDNAのサブ クローニング、 切り出しを目的とした場合、 上記ベクターの他に、 例えば、 pGEM - T、 pDIRECT, pT7などが挙げられる。 本発明のタンパク質を生産する目的におい てベクターを使用する場合には、 特に、 発現ベクターが有用である。 発現べクタ 一としては、 例えば、 大腸菌での発現を目的とした場合は、 ベクタ一が大腸菌で 増幅されるような上記特徴を持つほかに、 宿主を JM109、 DH5ひ、 HB10U XLl-Blu e などの大腸菌とした場合においては、 大腸菌で効率よく発現できるようなプロ モー夕一、 例えば、 lacZプロモー夕一（Wardら， Nature ( 1989) 341 , 544-546 ； FASEB J. ( 1992) 6， 2422-2427), araBプロモーター (Betterら， Science ( 198 8) 240, 104卜 1043)、または T7プロモ一夕一などを持っていることが不可欠であ る。 このようなベクターとしては、 上記ベクターの他に pGEX- 5X- 1 (Pharmacia 社製）、 rQiAexpress systemj (Qiagen社製)、 pEGFP、 または pET (この場合、 宿主 は T7 RNAポリメラ一ゼを発現している BL21が好ましレ、）などが挙げられる。 また、 ベクタ一には、 ポリべプチド分泌のためのシグナル配列が含まれていて もよい。 タンパク質分泌のためのシグナル配列としては、 大腸菌のペリプラズム に産生させる場合、 pelBシグナル配列（Lei， S. P. et al J. Bacteriol . ( 1987) 169， 4379) を使用すればよい。 宿主細胞へのベクターの導入は、 例えば塩化力 ルシゥム法、 エレクトロポレーシヨン法を用いて行うことができる。
大腸菌以外にも、 例えば、 本発明のタンパク質を製造するために、 哺乳動物由 来の発現ベクター (例えば、 pcDNA3( Invitrogen社製) や、 pEGF-BOS(Nucleic Ac ids. Res.1990, 18( 17) , p5322 )、 pEF、 pCDM8)、 昆虫細胞由来の発現ベクター (例 えば厂 Bac - to-BAC baculovairus expression systemj (GIBC0 BE1社製)、 pBacPA K8)、 植物由来の発現ベクター （例えば ρΜΗ1、 pMH2)、 動物ウィルス由来の発現べ クタ一（例えば、 pHSV、 pMV、 pAdexLcw), レトロウィルス由来の発現べクタ一（例 えば、 pZIpneo)、 酵母由来の発現ベクター（例えば、 「Pichia Expression Kitj ( I n vitrogen社製）、 pNVIK SP-Q01)、 枯草菌由来の発現べクタ一 （例えば、 pPL60 8、 pKTH50) が挙げられる。
CHO細胞、 COS細胞、 NIH3T3細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、 細胞内で発現させるために必要なプロモ一夕一、 例えば SV40プロモータ一 （Mul liganら， Nature ( 1979) 277， 108)、 MMLV- LTRプロ乇一夕一、 EF1ひプロモー夕 ― (Mizushimaら， Nucleic Acids Res. ( 1990 ) 18， 5322)、 CMVプロモーターな どを持っていることが不可欠であり、 細胞への形質転換を選抜するための遺伝子
(例えば、 薬剤 （ネオマイシン、 G418など） により判別できるような薬剤耐性遺 伝子） を有すればさらに好ましい。 このような特性を有するベクターとしては、 例えば、 p讓、 pDR2、 pBK- RSVヽ pBK- CMV、 pOPRSVヽ p0P13などが挙げられる。 さらに、 遺伝子を安定的に発現させ、 かつ、 細胞内での遺伝子のコピー数の増 幅を目的とする場合には、核酸合成経路を欠損した CH0棚胞にそれを相補する DH FR遺伝子を有するベクタ一 （例えば、 pCHOIなど） を導入し、 メ ト トレキセート
(MTX) により増幅させる方法が挙げられ、 また、 遺伝子の一過性の発現を目的と する場合には、 SV40 T抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つ COS細胞を用いて SV40の複製機転を持つベクター （pcDなど） で形質転換する方法が挙げられる。 一方、 動物の生体内で本発明の DNAを発現させる方法としては、 本発明の DNA を適当なベクターに組み込み、 レトロウイルス法、 リボソーム法、 カチォニック リボソーム法、 アデノウィルス法などにより生体内に導入する方法などが挙げら れる。 これにより、 本発明の 「fls353」 または 「fls485」 遺伝子の変異に起因す る疾患に対する遺伝子治療を行うことが可能である。 用いられるベクターとして は、 例えば、 アデノウイルスベクタ一 （例えば pAdexlcw) ゃレ トロウィルスべク ター（例えば pZIPneo) などが挙げられるが、 これらに制限されない。 ベクタ一へ の本発明の DNAの挿入などの一般的な遺伝子操作は、 常法に従って行うことが可 能である (Molecular Cloning ，5.61-5.63)。 生体内への投与は、 ex vivo法であ つても、 in vivo法であってもよい。
また、 本発明は、 本発明のベクターが導入された宿主細胞に関する。 本発明の ベクターが導入される宿主細胞としては特に制限はなく、 例えば、 大腸菌や種々 の動物細胞などを用いることが可能である。 本発明の宿主細胞は、 例えば、 本発 明のタンパク質の製造や発現のための産生系として使用することができる。 タン パク質製造のための産生系は、 in vitroおよび in vivoの産生系がある。 in vit roの産生系としては、真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が 挙げられる。
真核細胞を使用する場合、 例えば、 動物細胞、 植物細胞、 真菌細胞を宿主に用 いることができる。 動物細胞としては、 哺乳類細胞、 例えば、 CHO (J. Exp. Med. ( 1995) 108, 945)、 COSヽ 3T3、 ミエ口一マ、 BHK (baby hamster kidney)ヽ HeLaヽ Vero、 両生類細胞、 例えばアフリカヅメガエル卵母細胞 （Val le, et al . , Natur e ( 1981 ) 291， 358-340)、 あるいは昆虫細胞、 例えば、 sf9、 sf2K Tn5が知られ ている。 CHO細胞としては、 特に、 DHFR遺伝子を欠損した CH0細胞である dhfr - C HO (Proc . Natl . Acad. Sci . USA ( 1980 ) 77, 4216-4220) や CHO K-1 (Proc . Na tl . Acad. Sci . USA ( 1968) 60, 1275) を好適に使用することができる。 動物細 胞において、 大量発現を目的とする場合には特に CH0細胞が好ましい。 宿主細胞 へのベクターの導入は、 例えば、 リン酸カルシウム法、 DEAEデキストラン法、 力 チォニックリボソーム D0TAP (ベ一リンガーマンハイム社製） を用いた方法、 ェ レク 卜口ポーレーシヨン法、 リポフエクシヨンなどの方法で行うことが可能であ る。
植物細胞としては、 例えば、 ニコチアナ '夕バカム （Nicotiana tabacum) 由来 の細胞がタンパク質生産系として知られており、 これをカルス培養すればよい。 真菌細胞としては、 酵母、 例えば、 サッカロミセス （Saccharomyces) 属、 例えば、 サッカロミセス 'セレビシェ (Saccharomyces cerevisiae)、 糸状菌、 例えは、 ァ スペルギルス （Aspergi l lus) 属、 例えば、 ァスペルギルス ·二ガー （Aspergi l l us niger) が知られている。
原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、 大腸菌 （E. col i )、 例えば、 JM109、 DH5ひ、 HB101 等が挙げられ、 その他、 枯草 菌が知られている。
これらの細胞を目的とする MAにより形質転換し、形質転換された細胞を in V itroで培養することによりタンパク質が得られる。 培養は、 公知の方法に従い行 うことができる。 例えば、 動物細胞の培養液として、 例えば、 DMEM、 MEM, RPMI 1 640、 IMDMを使用することができる。 その際、 牛胎児血清 （FCS) 等の血清補液を 併用することもできるし、 無血清培養してもよい。 培養時の pHは、 約 6〜8であ るのが好ましい。 培養は、 通常、 約 30〜40°Cで約 15〜200時間行い、 必要に応じ て培地の交換、 通気、 攪拌を加える。
一方、 in vivo でタンパク質を産生させる系としては、 例えば、 動物を使用す る産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。 これらの動物又は植物に目的と する DNAを導入し、 動物又は植物の体内でタンパク質を産生させ、 回収する。 本 発明における 「宿主」 とは、 これらの動物、 植物を包含する。
動物を使用する場合、 哺乳類動物、 昆虫を用いる産生系がある。 哺乳類動物と しては、 ャギ、 ブ夕、 ヒッジ、 マウス、 ゥシを用いることができる （Vicki Glas er， SPECTRUM Biotechnology Appl ications, 1993)。 また、 哺乳類動物を用いる 場合、 トランスジエニック動物を用いることができる。
例えば、 目的とする DNAを、 ャギ ?カゼインのような乳汁中に固有に産生され るタンパク質をコードする遺伝子との融&遺伝子として調製する。 次いで、 この 融合遺伝子を含む DNA断片をャギの胚へ注入し、 この胚を雌のャギへ移植する。 胚を受容したャギから生まれるトランスジエニックャギ又はその子孫が産生する 乳汁から、 目的のタンパク質を得ることができる。 トランスジエニックャギから 産生されるタンパク質を含む乳汁量を増加させるために、 適宜ホルモンをトラン スジエニックャギに使用してもよい （Ebert, K.M. et al . , Bio/Technology ( 19 94) 12， 699-702)。
また、 昆虫としては、 例えばカイコを用いることができる。 カイコを用いる場 合、 目的のタンパク質をコードする DNAを揷入したバキュロウィルスをカイコに 感染させることにより、 このカイコの体液から目的のタンパク質を得ることがで きる (Susumu, . et al . , Nature ( 1985) 315， 592-594)。
さらに、 植物を使用する場合、 例えばタバコを用いることができる。 タバコを 用いる場合、 目的とするタンパク質をコードする DNAを植物発現用ベクター、 例 えば pMON 530に挿入し、 このべクタ一をァグロバクテリゥム ·ッメファシエンス (Agrobacterium timefaciens)のようなバクテリアに導入する。このバクテリア をタバコ、 例えば、 ニコチアナ '夕バカム （Nicotiana tabacum) に感染させ、 本 タバコの葉より所望のポリペプチドを得ることができる （Julian K. -C. Ma et a l .， Eur. J. Immunol . ( 1994) 24, 13卜 138)。
これにより得られた本発明のタンパク質は、 宿主細胞内または細胞外 （培地な ど）から単離し、実質的に純粋で均一なタンパク質として精製することができる。 タンパク質の分離、 精製は、 通常のタンパク質の精製で使用されている分離、 精 製方法を使用すればよく、 何ら限定されるものではない。 例えば、 クロマトグラ フィ一力ラム、 フィルター、 限外濾過、 塩析、 溶媒沈殿、 溶媒抽出、 蒸留、 免疫 沈降、 SDS-ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動、 等電点電気泳動法、 透析、 再結晶 等を適宜選択、 組み合わせればタンパク質を分離、 精製することができる。
クロマトグラフィーとしては、 例えばァフィ二ティークロマトグラフィー、 ィ オン交換クロマトグラフィー、 疎水性クロマトグラフィー、 ゲル濾過、 逆相クロ マトグラフィー、 吸着クロマトグラフィー等が挙げられる （Strategies for Pro tein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual . Ed D aniel R. Marshak et al . , Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996)。これ らのクロマトグラフィ一は、 液相クロマトグラフィー、 例えば HPLC、 FPLC等の液 相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。 本発明は、 これらの精製方法 を用い、 高度に精製されたタンパク質も包含する。
なお、 タンパク質を精製前又は精製後に適当なタンパク質修飾酵素を作用させ ることにより、任意に修飾を加えたり部分的にペプチドを除去することもできる。 タンパク質修飾酵素としては、 例えば、 トリプシン、 キモトリブシン、 リシルェ ンドぺプチダーゼ、 プロテインキナーゼ、 グルコシダーゼなどが用いられる。 また、 本発明は、 本発明のタンパク質と結合する抗体に関する。 本発明の抗体 の形態には、 特に制限はなく、 ポリクローナル抗体の他、 モノクローナル抗体も 含まれる。 また、 ゥサギなどの免疫動物に本発明のタンパク質を免疫して得た抗 血清、 すべてのクラスのポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、 さらに ヒト抗体や遺伝子組み換えによるヒト型化抗体も含まれる。
抗体取得の感作抗原として使用される本発明のタンパク質は、 その由来となる 動物種に制限されないが哺乳動物、 例えばヒト、 マウス又はラッ ト由来のタンパ ク質が好ましく、 特にヒト由来のタンパク質が好ましい。 ヒト由来のタンパク質 は、 本明細書に開示される遺伝子配列又はアミノ酸配列を用いて得ることができ る。
本発明において、 感作抗原として使用されるタンパク質は、 完全なタンパク質 であってもよいし、 また、 タンパク質の部分ペプチドであってもよい。 タンパク 質の部分ペプチドとしては、 例えば、 タンパク質のアミノ基（N)末端断片やカル ボキシ （C) 末端断片が挙げられる。 本明細書で述べる 「抗体」 とはタンパク質の 全長又は断片に反応する抗体を意味する。
本発明のタンパク質又はその断片をコードする遺伝子を公知の発現べクタ一系 に挿入し、 該ベクターで本明細書で述べた宿主細胞を形質転換させ、 該宿主細胞 内外から目的のタンパク質又はその断片を公知の方法で得て、 これらを感作抗原 として用いればよい。 また、 タンパク質を発現する細胞又はその溶解物あるいは 化学的に合成した本発明のタンパク質を感作抗原として使用してもよい。 感作抗原で免疫される哺乳動物としては、 特に限定されるものではないが、 細 胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、 一般的に は、 げっ歯目、 ゥサギ目、 霊長目の動物が使用される。
げっ歯目の動物としては、 例えば、 マウス、 ラッ ト、 ハムスター等が使用され る。 ゥサギ目の動物としては、 例えば、 ゥサギが使用される。 霊長目の動物とし ては、 例えば、 サルが使用される。 サルとしては、 狭鼻下目のサル （旧世界ザル）、 例えば、 力二クイザル、 ァカゲザル、 マントヒヒ、 チンパンジー等が使用される。 感作抗原を動物に免疫するには、 公知の方法にしたがって行われる。 一般的方 法としては、 感作抗原を哺乳動物の腹腔内又は皮下に注射する。 具体的には、 感 作抗原を PBS (Phosphate-Buffered Sal ine)や生理食塩水等で適当量に希釈、 懸 濁したものに対し、 所望により通常のアジュバント、 例えば、 フロイント完全ァ ジュバントを適量混合し、 乳化後、 哺乳動物に投与する。 さらに、 その後、 フロ イント不完全アジュバントに適量混合した感作抗原を、 4〜21 日毎に数回投与す ることが好ましい。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することができる。 このように免疫し、 血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを常法により確認す る。
ここで、 本発明のタンパク質に対するポリクローナル抗体を得るには、 血清中 の所望の抗体レベルが上昇したことを確認した後、 抗原を感作した哺乳動物の血 液を取り出す。 この血液から公知の方法により血清を分離する。 ポリクローナル 抗体としては、 ポリクローナル抗体を含む血清を使用してもよいし、 必要に応じ この血清からポリクロ一ナル抗体を含む画分をさらに単離して、 これを使用して もよい。 例えば、 本発明のタンパク質をカップリングさせたァフィ二ティーカラ ムを用いて、 本発明のタンパク質のみを認識する画分を得て、 さらにこの画分を プロテイン Aあるいはプロティン Gカラムを利用して精製することにより、 免疫 グロプリン Gあるいは Mを調製することができる。
モノクロ一ナル抗体を得るには、 上記抗原を感作した哺乳動物の血清中に所望 の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、 哺乳動物から免疫細胞を取り出し、 細胞融合に付せばよい。 この際、細胞融合に使用される好ましい免疫細胞として、 特に脾細胞が挙げられる。 前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としては、 好 ましくは哺乳動物のミエローマ細胞、 より好ましくは、 薬剤による融合細胞選別 のための特性を獲得したミエ口一マ細胞が挙げられる。
前記免疫細胞とミエローマ細胞の細胞融合は基本的には公知の方法、 例えば、 ミルスティンらの方法（Gal fre, G. and Mi lstein, C . , Methods Enzymol . ( 198 1 ) 73 , 3- 46 )等に準じて行うことができる。
細胞融合により得られたハイプリ ドーマは、 通常の選択培養液、 例えば、 HAT 培養液 （ヒポキサンチン、 アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液） で培養 することにより選択される。 当該 HAT培養液での培養は、 目的とするハイブリ ド —マ以外の細胞 （非融合細胞） が死滅するのに十分な時間、 通常、 数日〜数週間 継続して行う。 次いで、 通常の限界希釈法を実施し、 目的とする抗体を産生する ハイプリ ドーマのスクリーニングおよびクローニングを行う。
また、 ヒ ト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイプリ ドーマを得る他に、 ヒ ト リンパ球、例えば EBゥィルスに感染したヒ卜リンパ球を in vitroでタンパク質、 タンパク質発現細胞又はその溶解物で感作し、 感作リンパ球をヒ卜由来の永久分 裂能を有するミエローマ細胞、例えば U266と融合させ、 タンパク質への結合活性 を有する所望のヒ 卜抗体を産生するハイプリ ドーマを得ることもできる （特開昭 63 - 17688号公報）。
次いで、 得られたハイプリ ドーマをマウス腹腔内に移植し、 同マウスより腹水 を回収し、 得られたモノクローナル抗体を、 例えば、 硫安沈殿、 プロテイン A、 プロティン Gカラム、 DEAEイオン交換クロマ卜グラフィ一、 本発明のタンパク質 をカップリングしたァフィ二ティ一カラムなどにより精製することで調製するこ とが可能である。 本発明の抗体は、 本発明のタンパク質の精製、 検出に用いられ る他、 本発明のタンパク質のァゴニス トやアン夕ゴニス トの候補になる。 また、 この抗体を本発明のタンパク質が関与する疾患の抗体治療へ応用することも考え られる。 得られた抗体を人体に投与する目的 （抗体治療） で使用する場合には、 免疫原性を低下させるため、 ヒト抗体ゃヒト型抗体が好ましい。
例えば、 ヒト抗体遺伝子のレバ一トリーを有するトランスジエニック動物に抗 原となるタンパク質、 タンパク質発現細胞又はその溶解物を免疫して抗体産生細 胞を取得し、 これをミエローマ細胞と融合させたハイプリ ド一マを用いてタンパ ク質に対するヒト抗体を取得することができる （国際公開番号 W092- 03918、 W093 -2227、 W094-02602, W094- 25585、 W096- 33735および W096- 34096参照）。
ハイプリ ドーマを用いて抗体を産生する以外に、 抗体を産生する感作リンパ球 等の免疫細胞を癌遺伝子（oncogene)により不死化させた細胞を用いてもよい。 このように得られたモノクローナル抗体はまた、 遺伝子組換え技術を用いて産 生させた組換え型抗体として得ることができる （例えば、 Borrebaeck, C . A. K. and Larrick, J. W.， THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Publ ished in the United Kingdom by MCMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990 参照）。組換え型抗体は、 それをコ一ドする D N Aをハイプリ ドーマ又は抗体を産生する感作リンパ球等の 免疫細胞からクロ一ニングし、 適当なベクターに組み込んで、 これを宿主に導入 し産生させる。 本発明は、 この組換え型抗体を包含する。
さらに、 本発明の抗体は、 本発明のタンパク質に結合する限り、 その抗体断片 や抗体修飾物であってよい。 例えば、 抗体断片としては、 Fab、 F(ab' )2、 Fv 又 は H鎖と L鎖の Fvを適当なリンカーで連結させたシングルチェイン Fv( scFv) (H uston, J. S. et al . , Proc. Natl . Acad. Sci . U. S. A. ( 1988) 85, 5879-5883 ) が挙げられる。 具体的には、 抗体を酵素、 例えば、 パパイン、 ペプシンで処理し 抗体断片を生成させるか、 又は、 これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、 これを発現べクタ一に導入した後、 適当な宿主細胞で発現させる （例えば、 Co， M. S. et al . , J. I腦 unol . ( 1994) 152, 2968-2976 ； Better, M. and Horwitz, A. H. , Methods Enzymol . ( 1989) 178, 476-496 ； Pluckthun, A. and Skerra, A. , Methods Enzymol . ( 1989 ) 178， 497-515 ； Lamoyi , E.， Methods Enzymol . ( 1986 ) 121 , 652-663 ； Rousseaux, J. et al . , Methods Enzymol . ( 1986 ) 121， 663-669 ； Bird, R. E. and Walker, B . W. , Trends Biotechnol . ( 1991 ) 9， 1 32 - 137参照）。
抗体修飾物として、 ポリエチレングリコール（PEG)等の各種分子と結合した抗 体を使用することもできる。 本発明の 「抗体」 にはこれらの抗体修飾物も包含さ れる。 このような抗体修飾物を得るには、 得られた抗体に化学的な修飾を施すこ とによって得ることができる。 これらの方法はこの分野にお 、て既に確立されて いる。
また、 本発明の抗体は、 公知の技術を使用して非ヒ ト抗体由来の可変領域とヒ ト抗体由来の定常領域からなるキメラ抗体又は非ヒト抗体由来の CDR (相補性決 定領域） とヒト抗体由来の FR (フレームワーク領域） 及び定常領域からなるヒ卜 型化抗体として得ることができる。
前記のように得られた抗体は、 均一にまで精製することができる。 本発明で使 用される抗体の分離、 精製は通常のタンパク質で使用されている分離、 精製方法 を使用すればよい。 例えば、 ァフィ二ティークロマトグラフィー等のクロマトグ ラフィーカラム、 フィルター、 限外濾過、 塩析、 透析、 SDS ポリアクリルアミ ド ゲル電気泳動、 等電点電気泳動等を適宜選択、 組み合わせれば、 抗体を分離、 精 製することができる (Antibodies ： A Laboratory Manual . Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)が、これらに限定されるものでは ない。
ァフィ二ティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、 プロテイン A力 ラム、 プロテイン Gカラムが挙げられる。 例えば、 プロテイン Aカラムを用いた カラムとして、 Hyper D, P0R0S, Sepharose F . F , (Pharmacia)等が挙げられる。 ァフィニティ一クロマトグラフィ一以外のクロマトグラフィ一としては、 例え ば、 イオン交換クロマトグラフィー、 疎水性クロマトグラフィー、 ゲル濾過、 逆 相クロマトグラフィー、 吸着クロマトグラフィー等が挙げられる（Strategies fo r Protein Purification and Characterization ： A Laboratory Course Manual . Ed Daniel R. Marshak et al . , Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996 ) c これらのクロマトグラフィーは HPLC、FPLC等の液相クロマトグラフィ一を用いて 行うことができる。
また、 本発明の抗体の抗原結合活性を測定する方法として、 例えば、 吸光度の 測定、 酵素結合免疫吸着検定法（Enzyme-linked immunosorbent assay； EL ISA), E IA (酵素免疫測定法）、 RIA (放射免疫測定法） あるいは蛍光抗体法を用いること ができる。 ELISA を用いる場合、 本発明の抗体を固相化したプレートに本発明の タンパク質を添加し、 次いで目的の抗体を含む試料、 例えば、 抗体産生細胞の培 養上清や精製抗体を加える。 酵素、 例えば、 アルカリフォスファターゼ等で標識 した抗体を認識する二次抗体を添加し、 プレートをインキュベーションし、 次い で洗浄した後、 P-二トロフエニル燐酸などの酵素基質を加えて吸光度を測定する ことで抗原結合活性を評価することができる。 タンパク質としてタンパク質の断 片、例えばその C 末端からなる断片あるいは N 末端からなる断片を使用してもよ い。本発明の抗体の活性評価には、 BIAcore(Pharmacia製）を使用することができ る。
これらの手法を用いることにより、 本発明の抗体と試料中に含まれる本発明の タンパク質が含まれると予想される試料とを接触せしめ、 該抗体と該タンパク質 との免疫複合体を検出又は測定することからなる、 本発明のタンパク質の検出又 は測定方法を実施することができる。
本発明のタンパク質の検出又は測定方法は、 タンパク質を特異的に検出又は測 定することができるため、 タンパク質を用いた種々の実験等に有用である。
本発明はまた、 ヒト 「fls353」 または 「fls485」 タンパク質をコードする DNA (配列番号： 1、 3、 または 5 ) またはその相補鎖とハイブリダィズし、 少なく とも 15塩基の鎖長を有するヌクレオチドに関する。本発明のヌクレオチドは、 本 発明の夕ンパク質をコードする DNAに特異的にハイプリダイズするヌクレオチド である。 ここで 「特異的にハイブリダィズする」 とは、 通常のハイブリダィゼ一 シヨン条件下、好ましくはストリンジェン卜なハイプリダイゼーシヨン条件下で、 他の夕ンパク質をコードする DNAとのクロスハイプリダイゼーションが有意に生 じないことを意味する。 このようなヌクレオチドには、 本発明のタンパク質をコ 一ドする DNA又はその相補鎖と特異的にハイプリダイズし得るプローブやプライ マー、 ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体 （例えばアンチセンスオリゴヌクレ ォチドゃリボザィム等） が含まれる。 また、 このようなヌクレオチドは、 DNA チ ップの作製に利用することも考えられる。
本発明は、 例えば、 配列番号： 1、 3、 または 5のいずれか一つに示される塩 基配列中のいずれかの箇所にハイプリダイズするアンチセンスォリゴヌクレオチ ドを含む。 このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、 好ましくは配列番号： 1、 3、または 5のいずれか一つに示される塩基配列中の連続する少なくとも 15個以 上のヌクレオチドに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。 さらに好ま しくは、前記連続する少なくとも 15個以上のヌクレオチドが翻訳開始コ ドンを含 む、 前記のアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、 それらの誘導体や修飾体を使用す ることができる。 このような修飾体として、 例えばメチルホスホネート型又はェ チルホスホネー卜型のような低級アルキルホスホネート修飾体、 ホスホロチォェ 一ト修飾体又はホスホロアミデー卜修飾体等が挙げられる。
ここでいう 「アンチセンスオリゴヌクレオチド」 とは、 DNA又は mRNAの所定の 領域を構成するヌクレオチドに対応するヌクレオチドが全て相補的であるものの みならず、 DNA または mRNAとオリゴヌクレオチドとが配列番号： 1、 3、 または 5に示される塩基配列に特異的にハイブリダィズできる限り、 1 又は複数個のヌ クレオチドのミスマッチが存在していてもよい。
このようなヌクレオチドは、少なくとも 15個の連続したヌクレオチド配列領域 で、 少なくとも 70°/。 、 好ましくは少なくとも 80% 、 より好ましくは 90% 、 さら に好ましくは 95% 以上の塩基配列上の相同性を有する。相同性を決定するための アルゴリズムは本明細書に記載したものを使用すればよい。 このようなヌクレオ チドは、 後述の実施例に記載するように本発明のタンパク質をコードする DNAを 検出若しくは単離するためのプローブとして、 又は増幅するためのプライマ一と して有用である。
本発明のアンチセンスォリゴヌクレオチド誘導体は、 本発明の夕ンパク質の産 生細胞に作用して、該タンパク質をコ一ドする DNA又は mRNAに結合することによ り、 その転写又は翻訳を阻害したり、 mRNAの分解を促進したりして、 本発明の夕 ンパク質の発現を抑制することにより、 結果的に本発明のタンパク質の作用を抑 制する効果を有する。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は、 それらに対して不活性な 適当な基剤と混和して塗布剤、 ノ；ップ剤等の外用剤とすることができる。
また、 必要に応じて、 賦形剤、 等張化剤、 溶解補助剤、 安定化剤、 防腐剤、 無 痛化剤等を加えて錠剤、 散財、 顆粒剤、 カプセル剤、 リボソームカプセル剤、 注 射剤、 液剤、 点鼻剤など、 さらに凍結乾燥剤とすることができる。 これらは常法 にしたがって調製することができる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は患者の患部に直接適用する か、 又は血管内に投与するなどして結果的に患部に到達し得るように患者に適用 する。 さらには、 持続性、 膜透過性を高めるアンチセンス封入素材を用いること もできる。 例えば、 リボソーム、 ポリ- L- リジン、 リピッ ド、 コレステロール、 リボフヱクチン又はこれらの誘導体が挙げられる。
本発明のアンチセンス才リゴヌクレオチド誘導体の投与量は、 患者の状態に応 じて適宜調整し、 好ましい量を用いることができる。 例えば、 0. 1 〜100mg/kg、 好ましくは 0 . 1 〜50mg/kg の範囲で投与することができる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは本発明のタンパク質の発現を阻害 し、 従って本発明のタンパク質の生物学的活性を抑制することにおいて有用であ る。 また、 本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する発現阻害剤は、 本発明のタンパク質の生物学的活性を抑制することが可能である点で有用である 本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、 例えば、 抗癌の目的に用いること が考えられる。
また、 本発明は、 本発明のタンパク質を利用する、 本発明のタンパク質に結合 する化合物のスクリーニング方法に関する。このスクリーニング方法は、 （a )本 発明のタンパク質またはその部分ペプチドに被検試料を接触させる工程、 （ b )本 発明のタンパク質またはその部分べプチドと被検試料との結合活性を検出するェ 程、 （c )本発明のタンパク質またはその部分べプチドに結合する化合物を選択す る工程、 を含む。
スクリーニングに用いられる本発明の夕ンパク質は組換えタンパク質であって も、 天然由来のタンパク質であってもよい。 また部分ペプチドであってもよい。 被検試料としては特に制限はなく、 例えば、 細胞抽出物、 細胞培養上清、 発酵微 生物産生物、 海洋生物抽出物、 植物抽出物、 精製若しくは粗精製タンパク質、 ぺ プチド、 非ペプチド性化合物、 合成低分子化合物、 天然化合物が挙げられる。 被 検試料を接触させる本発明の夕ンパク質は、例えば、精製したタンパク質として、 可溶型タンパク質として、 担体に結合させた形態として、 また、 他のタンパク質 との融合タンパク質として、 被検試料に接触させることができる。
本発明のタンパク質を用いて、 例えば該タンパク質に結合するタンパク質をス クリーニングする方法としては、 当業者に公知の多くの方法を用いることが可能 である。 このようなスクリーニングは、 例えば、 免疫沈降法により行うことがで きる。 具体的には、 以下のように行うことができる。 本発明のタンパク質をコー ドする遺伝子を、 pSV2neo， pcDNA I , pCD8などの外来遺伝子発現用のベクターに 挿入することで動物細胞などで当該遺伝子を発現させる。 発現に用いるプロモー 夕一としては SV40 early promoter (Rigby In Wi l l iamson i, ed. ) , Genetic Engl neering, Vol.3. Academic Press, London, p.83-141(1982)), EF-1 ひ promote r(Kim ら Gene 91, p.217-223 (1990)), CAG promoter(Niwa et al. Gene 108, p.193-200 (1991)), RSV LTR promoter(Cullen Methods in Enzymology 152, p. 684-704 (1987), SR ひ romoter(Takebe et al. Mol. Cell. Biol. 8, p.466 (1988))， CMV immediate early promoter^ Seed and Aruf fo Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 84, p.3365-3369 (1987)), SV40 late promoter(Gheysen and Fiers
J. Mol . Appl . Genet. 1, p.385-394 (1982)), Adenovirus late promoter(Kau fman et al. Mol. Cell. Biol. 9, p. 946 (1989)), HSV TK promoter等の一般 的に使用できるプロモーターであれば何を用いてもよい。 動物細胞に遺伝子を導 入することで外来遺伝子を発現させるためには、エレク トロポレ一シヨン法（Chu，
G. et al. Nucl. Acid Res. 15, 1311-1326 (1987))、 リン酸カルシウム法（Che n, C and Okayama, H. Mol. Cell. Biol. 7, 2745-2752 ( 1987) )、 DEAEデキスト ラン法（Lopata, M. A. et al. Nucl. Acids Res. 12, 5707-5717 (1984); Sussm an, D. J. and Milman, G. Mol. Cell. Biol. 4, 1642-1643 (1985))、 リポフエ クチン法（Derijard, B. Cell 7, 1025-1037 (1994); Lamb, B. T. et al. Natur e Genetics 5, 22-30 (1993); Rabindran, S. K. et al. Science 259, 230-234
(1993))等の方法があるが、 いずれの方法によってもよい。 特異性の明らかとな つているモノクローナル抗体の認識部位 （ェピトープ） を本発明のタンパク質の N 末または C末に導入することにより、モノクローナル抗体の認識部位を有する 融合夕ンパク質として本発明のタンパク質を発現させることができる。 用いるェ ピトーブー抗体系としては市販されているものを利用することができる （実験医 学 1^， 85-90 (1995))。 マルチクローニングサイ トを介して、 5—ガラク トシダ —ゼ、 マルトース結合タンパク質、 グル夕チオン S—トランスフェラ一ゼ、 緑色 蛍光タンパク質（GFP)などとの融合タンパク質を発現することができるベクタ一 が市販されている。
融合夕ンパク質にすることにより本発明のタンパク質の性質をできるだけ変化 させないようにするために数個から十数個のアミノ酸からなる小さなェピトープ 部分のみを導入して、融合タンパク質を調製する方法も報告されている。例えば、 ポリヒスチジン （His- tag)、 ィンフルェンザ凝集素 HA、 ヒト c- myc、 FLAG, Vesi cular stomatitis ウィルス糖タンパク質 （VSV- GP)、 T7 gene 10 タンパク質 （T7 -tag), ヒト単純へルぺスウィルス糖タンパク質 （HSV- tag)、 E-tag (モノクロ一 ナルファージ上のェピトープ） などのェピト一プとそれを認識するモノク口一ナ ル抗体を、 本発明のタンパク質に結合するタンパク質のスクリーニングのための ェピトープ—抗体系として利用できる （実験医学 ^, 85-90 ( 1995 ) )。
免疫沈降においては、 これらの抗体を、 適当な界面活性剤を利用して調製した 細胞溶解液に添加することにより免疫複合体を形成させる。 この免疫複合体は本 発明のタンパク質、 それと結合能を有するタンパク質、 および抗体からなる。 上 記ェピトープに対する抗体を用いる以外に、 本発明の夕ンパク質に対する抗体を 利用して免疫沈降を行うことも可能である。本発明のタンパク質に対する抗体は、 例えば、 本発明のタンパク質をコードする遺伝子を適当な大腸菌発現べクタ一に 導入して大腸菌内で発現させ、 発現させたタンパク質を精製し、 これをゥサギや マウス、 ラッ 卜、 ャギ、 ニヮ トリなどに免疫することで調製することができる。 また、 合成した本発明のタンパク質の部分べプチドを上記の動物に免疫すること によって調製することもできる。
免疫複合体は、 例えば、 抗体がマウス IgG 抗体であれば、 Prote in A Sepharo se や Protein G Sepharose を用いて沈降させることができる。 また、 本発明の タンパク質を、 例えば、 GST などのェピトープとの融合タンパク質として調製し た場合には、 グル夕チオン- Sepharose 4B などのこれらェピトープに特異的に結 合する物質を利用して、 本発明のタンパク質の抗体を利用した場合と同様に、 免 疫複合体を形成させることができる。
免疫沈降の一般的な方法については、 例えば、 文献（Harlow, E. and Lane, D.： Antibodies, pp.511-552, Cold Spring Harbor Laboratory publ i cations, New York ( 1988) ) 記載の方法に従って、 または準じて行えばよい。
免疫沈降されたタンパク質の解析には SDS- PAGE が一般的であり、 適当な濃度 のゲルを用いることでタンパク質の分子量により結合していたタンパク質を解析 することができる。 また、 この際、 一般的には本発明のタンパク質に結合した夕 ンパク質は、 クマシ一染色や銀染色といったタンパク質の通常の染色法では検出 することは困難であるので、 放射性同位元素である 35S -メチォニンや 35S -シス ティンを含んだ培養液で細胞を培養し、 該細胞内のタンパク質を標識して、 これ を検出することで検出感度を向上させることができる。 夕ンパク質の分子量が判 明すれば直接 SDS-ポリァクリルアミ ドゲルから目的の夕ンパク質を精製し、 その 配列を決定することもできる。
また、 本発明のタンパク質を用いて、 該タンパク質に結合するタンパク質を単 離する方法としては、 例えば、 ウェストウエスタンブロッテイング法 （Skolnik, E. Y. et al . , Cel l ( 1991 ) 65， 83- 90)を用いて行うことができる。すなわち、 本発明のタンパク質と結合する結合タンパク質を発現していることが予想される 細胞、 組織、 臓器 (例えば、 胎児の肝臓や腎臓、 癌細胞株など） よりファージべク 夕一 （え gtll , ZAPなど） を用いた cDNAライブラリーを作製し、 これを LB-ァガ ロース上で発現させフィル夕一に発現させたタンパク質を固定し、 精製して標識 した本発明のタンパク質と上記フィル夕一とを反応させ、 本発明のタンパク質と 結合したタンパク質を発現するプラークを標識により検出すればよい。 本発明の タンパク質を標識する方法としては、 ピオチンとアビジンの結合性を利用する方 法、 本発明の夕ンパク質又は本発明の夕ンパク質に融合したぺプチド又はポリぺ プチド （例えば GSTなど） に特異的に結合する抗体を利用する方法、 ラジオアイ ソトープを利用する方法又は蛍光を利用する方法等が挙げられる。
また、本発明のスクリーニング方法の他の態様としては、細胞を用いた 2-ハイ ブリツドシステム (Fields, S.， and Sternglanz, R. , rends. Genet . ( 1994) 1 0, 286-292) を用いて行う方法が挙げられる。 本発明のタンパク質を SRF DNA結合領域または GAL4 DNA結合領域と融合させて 酵母細胞の中で発現させ、 本発明のタンパク質と結合するタンパク質を発現して いることが予想される細胞より、 VP16 または GAL4転写活性化領域と融合する形 で発現するような cDNAライブラリ一を作製し、 これを上記酵母細胞に導入し、検 出された陽性クローンからライブラリー由来 cDNA を単離して大腸菌に導入して 発現させる （酵母細胞内で本発明のタンパク質と結合するタンパク質が発現する と、 両者の結合によりレポーター遺伝子が活性化され、 陽性のクローンが確認で きる） 「twoハイブリッ ドシステム」 （「MATCHMARKER Two-Hybrid Systemj , 「Ma腿 alian MATCHMAKER Two-Hybrid Assay Kit」，「MATCHMAKER One-Hybrid Systemj (い ずれも Clontech社製）、 厂 HybriZAP Two-Hybrid Vector System j (Stratagene社 製）、 文献 「Dalton S， and Treisman R ( 1992)Characterization of SAP- 1， a protein recruited by serum response factor to the c-fos serum response e lement. Cell 68, 597- 612」）を利用して、本発明のタンパク質に結合するタンパ ク質またはその遺伝子を調製することも可能である。
レポ一夕—遺伝子としては、 HIS3遺伝子の他、 Ade2遺伝子、 LacZ遺伝子、 CAT 遺伝子、 ルシフ Xラーゼ遺伝子等を用いることができる。
本発明のタンパク質と結合するタンパク質のスクリーニングは、 ァフィ二ティ クロマトグラフィーを用いて行うこともできる。 例えば、 本発明のタンパク質を ァフィ二ティーカラムの担体に固定し、 ここに本発明のタンパク質と結合する夕 ンパク質を発現していることが予想される被検試料を適用する。 この場合の被検 試料としては、 例えば細胞抽出物、 細胞溶解物等が挙げられる。 被検試料を適用 した後、 カラムを洗浄し、 本発明のタンパク質に結合したタンパク質を調製する ことができる。
得られたタンパク質は、 そのアミノ酸配列を分析し、 それを基にオリゴ DNAを 合成し、該 DNAをプローブとして cDNAライブラリーをスクリーニングすることに より、 該タンパク質をコードする DNAを得ることができる。 本発明において、 結合した化合物を検出又は測定する手段として表面ブラズモ ン共鳴現象を利用したバイオセンサーを使用することもできる。 表面プラズモン 共鳴現象を利用したバイオセンサーは本発明のタンパク質と被検化合物との間の 相互作用を微量のタンパク質を用いてかつ標識することなく、 表面プラズモン共 鳴シグナルとしてリアルタイムに観察することが可能である （例えば BIAcore、 P harmacia製）。 したがって、 BIAcore等のバイオセンサーを用いることにより本発 明のタンパク質と被検化合物との結合を評価することが可能である。
また、 タンパク質に限らず、 本発明のタンパク質に結合する化合物 （ァゴニス ト、 およびアン夕ゴニストを含む） を単離する方法としては、 例えば、 固定した 本発明のタンパク質に、 合成化合物、 天然物バンク、 もしくはランダムファージ ぺプチドディスプレイライブラリーを作用させ、 本発明のタンパク質に結合する 分子をスクリーニングする方法や、 コンビナトリアルケミス卜リ一技術によるハ イスル一プットを用いたスクリーニング方法 （Wrighton NC ; Farrel l FX; Chang R; Kashyap AK; Barbone FP ; Mulcahy LS; Johnson DL ; Barrett RW; Jol l iffe LK; Dower WJ. , Small peptides as potent mimetics of the protein hormone erythropoietin, Science (UNITED STATES) Jul 26 1996, 273 p458 - 64、 Verdin e GL. , The combinatorial chemistry of nature. Nature (ENGLAND) Nov 7 199 6， 384 piト 13、 Hogan JC Jr. , Directed combinatorial chemistry. Nature (EN GLAND ) Nov 7 1996, 384 pl7-9) が当業者に公知である。
スクリーニングにより単離され得る化合物は、 本発明の夕ンパク質の機能異常 などに起因する疾患や腫瘍などの予防や治療において、 本発明のタンパク質の活 性を促進または阻害するための薬剤の候補となる。 本発明のスクリーニング方法 を用いて得られる、 本発明のタンパク質に結合する活性を有する化合物の構造の 一部を、 付加、 欠失及び/又は置換により変換される物質も、 本発明のスクリー ニング方法を用いて得られる化合物に含まれる。
また、 本発明のタンパク質をコードする遺伝子またはその発現制御領域を利用 して、 生体内においてこれら遺伝子の発現 （転写および翻訳を含む） を抑制また は促進しうる化合物をスクリーニングすることも考えられる。 このスクリーニン グは、 例えば、 癌の治療薬や予防薬の候補化合物のスクリーニングとして利用し る。
このスクリーニングは、 （a )本発明の遺伝子を発現する細胞に被検試料を接触 させる工程、 （b )該細胞内における本発明の遺伝子の発現を検出する工程、およ び （c ) 被検試料を細胞に接触させない場合 （対照） と比較して、 本発明の遺伝 子の発現を減少または増加させる化合物を選択する工程、 を含む方法により実施 しうる。
例えば、 s353、 または f ls485遺伝子を発現している適当な細胞株（Hela S3、 Hep G2など） を被検試料と共に培養し、 これらの遺伝子の発現 （転写および翻訳 を含む） をノーザン解析や RT- PCR法などの mRNAを検出する方法、 あるいはゥェ スタンプロッティングなどのタンパク質を検出する方法、 またはこれらを改良し た方法により検出し、 被検試料を添加しない場合と比較して、 これらの遺伝子の 発現を増加あるいは低下させる化合物を選択することにより、 目的の化合物スク リーニングすることができる。
また、 本発明の遺伝子の発現制御領域の活性化または不活性化を指標とする方 法によって、 生体内において本発明の遺伝子の発現を抑制または促進しうる化合 物をスクリーニングすることも考えられる。このスクリーニングは、 （a )本発明 の遺伝子の発現制御領域の下流に機能的に結合されたレポ一夕一遺伝子を含むベ クタ一が導入された細胞を提供する工程、 （b )該細胞に被検試料を接触させるェ 程、 （c ) 該細胞内におけるレポーター活性を検出する工程、 および （d )被検試 料を細胞に接触させない場合 （対照） と比較して、 該レポーター活性を減少また は増加させる化合物を選択する工程、 を含む方法により実施しうる。
ここで 「機能的に結合された」 とは、 発現制御領域の活性化に応答して、 その 下流に結合されたレポ一夕一遺伝子が発現しうるように、 発現制御領域とレポ一 夕一遺伝子が結合していることを指す。
例えば、 配列番号： 1、 3または 5に記載の塩基配列若しくはその一部をプロ —ブとしたゲノム DNAライブラリーのスクリーニングにより、 本発明の遺伝子の 発現制御領域 （プロモーター、 ェンハンサーなど） をクローニングし、 これを適 当なレポーター遺伝子 （クロラムフヱニコールァセチル卜ランスフヱラーゼ遺伝 子、 ルシフヱラーゼ遺伝子など） の上流に挿入した発現ベクターを作製し、 これ を哺乳動物細胞に導入する。 次いで、 被検試料を該細胞株に接触させ、 レポ一夕 一活性を検出し、 被検試料を接触させない細胞におけるレポータ一活性と比較し て、 レポーター活性を増加または減少させる化合物を選択することにより、 生体 内において本発明の遺伝子の発現を抑制あるいは促進しうつ化合物をスクリー二 ングすることができる。 このスクリーニングは、 本発明の遺伝子の発現を、 レポ 一夕一活性を指標として検出するため、 上記したノーザン解析などの直接的な検 出と比較して、 簡便であるという特徴を有する。
これらスクリーニングにより単離された、 本発明の遺伝子の発現を促進または 抑制する化合物は、 該遺伝子の発現異常に起因する種々の疾患に対する医薬品の 候補となる。 特に、 癌などの疾患を予防または治療する薬剤としての利用が期待 される。 なお、 上記のスクリーニング方法を用いて得られる、 本発明の遺伝子の 発現を促進または抑制する化合物の構造の一部を、 付加、 欠失及び/又は置換に より変換される物質も、 本発明のスクリ一ニング方法を用いて得られる化合物に 含まれる。
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物をヒトゃ哺乳動物、 例え ばマウス、 ラヅ ト、 モルモッ ト、 ゥサギ、 ニヮトリ、 ネコ、 ィヌ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 サル、 マントヒヒ、 チンパンジーの医薬として使用する場合には、 単離さ れた化合物自体を直接患者に投与する以外に、 公知の製剤学的方法により製剤化 して投与を行うことも可能である。 例えば、 必要に応じて糖衣を施した錠剤、 力 プセル剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤として経口的に、 あるいは水もし くはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、 又は懸濁液剤の注射剤の 形で非経口的に使用できる。 例えば、 薬理学上許容される担体もしくは媒体、 具 体的には、 滅菌水や生理食塩水、 植物油、 乳化剤、 懸濁剤、 界面活性剤、 安定剤、 香味剤、 賦形剤、 べヒクル、 防腐剤、 結合剤などと適宜組み合わせて、 一般に認 められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化する ことが考えられる。 これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容 量が得られるようにするものである。
錠剤、 カプセル剤に混和することができる添加剤としては、 例えばゼラチン、 コーンスターチ、 トラガン トガム、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セル口 ースのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸のような膨化剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖又はサッカリンのよう な甘味剤、 ぺパ一ミント、 ァカモノ油又はチヱリーのような香味剤が用いられる。 調剤単位形態が力プセルである場合には、 上記の材料にさらに油脂のような液状 担体を含有することができる。 注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のような べヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水溶液としては、 例えば生理食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬を含 む等張液、 例えば D-ソルビトール、 D-マンノース、 D-マンニトール、 塩化ナト リ ゥムが挙げられ、 適当な溶解補助剤、 例えばアルコール、 具体的にはエタノール、 ポリアルコール、 例えばプロピレングリコール、 ポリエチレングリコ一ル、 非ィ オン性界面活性剤、 例えばポリソルベート 80 (TM)、 HCO-50と併用してもよい。 油性液としてはゴマ汕、 大豆油があげられ、 溶解補助剤として安息香酸ベンジ ル、 ベンジルアルコールと併用してもよい。 また、 緩衝剤、 例えばリン酸塩緩衝 液、 酢酸ナトリウム緩衝液、 無痛化剤、 例えば、 塩酸プロ力イン、 安定剤、 例え ばべンジルアルコール、 フヱノール、 酸化防止剤と配合してもよい。 調製された 注射液は通常、 適当なアンプルに充填させる。
患者への投与は、 例えば、 動脈内注射、 静脈内注射、 皮下注射などのほか、 鼻 腔内的、 経気管支的、 筋内的、 または経口的に当業者に公知の方法により行いう る。 投与量は、 患者の体重や年齢、 投与方法などにより変動するが、 当業者であ れば適当な投与量を適宜選択することが可能である。 また、 該化合物が DNAによ りコードされうるものであれば、 該 DNAを遺伝子治療用ベクターに組込み、 遺伝 子治療を行うことも考えられる。 投与量、 投与方法は、 患者の体重や年齢、 症状 などにより変動するが、 当業者であれば適宜選択することが可能である。
例えば、 本発明のタンパク質と結合する化合物や本発明のタンパク質の活性を 阻害する化合物の投与量は、 症状により差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的 に成人 （体重 60kgとして） においては、 1日あたり約 0. 1から 100mg、 好ましく は約 1. 0から 50mg、 より好ましくは約 1 .0から 20mgである。
非経口的に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投 与方法によっても異なるが、 例えば注射剤の形では通常成人 （体重 60kgとして） においては、 1 日あたり約 0. 01から 30mg、 好ましくは約 0. 1から 20mg、 より好 ましくは約 0. 1から lOm 程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の 動物の場合も、 体重 60kg当たりに換算した量を投与することができる。 図面の簡単な説明
図 1は、 fls353の発現をノーザン解析によって調べた結果を示す写真である。 図 2は、 大腸菌臨床サンプルにおける s353の発現を示す写真である。 RT- PC Rによる解析の結果を示す。 図 3に続く。
図 3は、 図 2の続きの写真である。
図 4は、 fls353の塩基配列と予想されるアミノ酸配列を示す図である。 ATP/GT P 結合部位のコンセンサス配列に合致するアミノ酸を実線で囲って示した。 図 5 TCく。
図 5は、 図 4の続きである。
図 6は、 f ls485の発現をノーザン解析によつて調べた結果を示す写真である。 図 7は、各種培養細胞における fls485およびひフエ 卜プロティンの発現を示す 写真である。 RT- PCRによる解析の結果を示す。
図 8は、 fls485の塩基配列と予想されるアミノ酸配列を示す図である。 fls485 S においては下線で示した領域が存在せず、 〇で囲ったメチォニン（M)が開始コ ドンとして用いられていると予想される。実線の四角で囲って示した配列は Cys- Xaa-Xaa-Cys-Xaa-Gly-Xaa-Gly からなる配列に合致するァミノ酸配列であり、 点 線の四角で囲って示した配列は Cys- Xaa- Xaa- Cys- Xaa-Glyからなる配列に合致す るアミノ酸配列である。
図 9は、 fls485の全コーディング領域を挟むプライマーセッ トを用いた RT - PC Rの結果を示す写真である。 ヒ 卜胎児肝臓由来 cDNAを銪型として用いた。上の模 式図において斜め線で示したボックスは fls485のコ一ディング領域を表す。 図 1 0は、臨床肝臓癌サンブルにおける s353、 fls485およびひフヱトプロテ ィンの発現をノーザン解析により調べた結果を示す写真である。
図 1 1は、 臨床肺癌サンプルにおける fls353および fls485の発現をノーザン 解析により調べた結果を示す写真である。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を実施例により具体的に説明するが、 本発明はこれら実施例に制 限されるものではない。
[実施例 1 ] 胎児性遺伝子 （fetal gene) サブトラクトライブラリーの作製 サブレッシヨンサブトラクティブハイブリダイゼ一ション法により、 胎児肝臓 由来 cDNAをテス夕一、 成体肝臓由来 cDNAをドライバ一としたサブトラクシヨン を行い、 胎児肝臓に特異的、 あるいはより強く発現している胎児性遺伝子 （feta 1 gene) からなるサブトラクトライブラリーを作製した。
サブトラクシヨンライブラリ一は PCR- Select™ cDNA Subtraction kit (CLONT ECH)を用い、 Luda Diatchenkoらの方法 (Proc. Natl . Acad. Sci . USA, Vol .93, 6025-6030, 1996 )に基本的に従って作製した。
まずヒ 卜胎児肝臓由来 polyA+ RNA(CLONTECH)及びヒ ト成体肝臓由来 polyA+ RNA (CL0NTECH)より MMLV逆転写酵素を用いた標準的な方法で二本鎖 cDNAを合成した。 つぎに T4 DNAポリメラーゼによりこの cDNA末端を平滑化し、さらに Rsalにより 切断した。 胎児肝臓由来 cDNA (テスター）の一部を 2分割し、 アダプター 1 とァダ プ夕ー 2 をそれそれ別々にライゲートした。 これにそれそれ 120倍量の成体肝臓 由来 cDNA(ドライバー）を加え、熱変性を行ったあと 68°Cで 8時間の 1次ハイプリ ダイゼーシヨンを行った。 つぎにこれを熱変性せずに混合し、 さらに熱変性した 過剰量のドライバーを加え 68°Cで約 16時間の 1次ハイプリダイゼーシヨンを行 つた。 これを希釈用バッファ一にて希釈し、 75°Cで 7分インキュベートし、 ァダ プ夕一の短い方の鎖を取り除いたものを PCRの錡型として用いた。 アダプターに 対応するプライマーである PCRプライマ一 1、 2を用いた PCRを行うことにより、 両端に異なるァダプ夕一を持った cDNA (サブトラク トされた cDNA)のみを選択的 に増幅した （サブレッシヨン PCR)。 これの一部を銪型とし、 PCRプライマー 1、 2 のさらに内側に位置するプライマーである Nested PCRプライマー 1と 2を用いた PCRを行うことにより、 さらに選択性を増した生成物を得た。 この生成物を QIAq uick PCR Purification kit(QIAGEN )を用いて精製し、 pT7Blue-Tベクター（Novag en)に TAクローニング法によりクロ一二ングし、 サブトラクシヨンライブラリ一 とした。
アダプタ一 1および 2、 プライマ一 1および 2、 Nested PCRプライマ一 1および 2を表 1に示す。 表 1 アダプタ一 1
5， CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT 3，（配列番号： 7 )
3， GGCCCGTCCA 5' (配列番号： 8 ) アダプター 2
5， TGTAGCGTGAAGACGACAGAAAGGGCGTGGTGCGGAGGGCGGT 3，（配列番号： 9 )
3， GCCTCCCGCCA 5' (配列番号 : 1 0 )
PCRプライマ一 1 5， CTAATACGACTCACTATAGGGC 3，（配列番号： 1 1 )
PCRプライマー 2 5' TGTAGCGTGAAGACGACAGAA 3' (配列番号： 1 2 )
Nested PCRプライマー 1 5， TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT 3， (配列番号 : 1 3 )
Nested PCRプライマ一 2 5， AGGGCGTGGTGCGGAGGGCGGT 3，（配列番号 : 1 4 )
[実施例 2 ] 胎児性遺伝子 ESTの構築
実施例 1で作製したライブラリーより抽出したクローンをランダムにシークェ ンスすることにより、 胎児性遺伝子からなる ESTを構築した。
シークェンシングは、 アルカリ SDS法によって調製したプラスミ ド DNA、 また はコロニー PCRなどの PCR産物を錄型とし、 ABI PRISM™ Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit With AmplyTaq DNA Polymerase, FS(Perkin Elm er)を用いたサイクルシークェンシング法により行い、 ABI 377 DNA Sequencerに より解読した。
コロニー PCRは、ベクタ一プライマ一である M13 P4-22プライマー（5， CCAGGGT TTTCCCAGTCACGAC 3，/配列番号： 1 5 )及び M13 P5-2 プライマー（5， TCACACAGGA AACAGCTATGAC 3' /配列番号： 1 6 )を含む PCR反応溶液の中に、組み換え体を持つ コロニーを直接懸濁することにより行った。 PCR反応後、増幅されたィンサ一ト D NAから、 ゲル濾過法などにより未反応のプライマー、 ヌクレオチド等を除き、 シ —クェンシングの錶型として用いた。
[実施例 3 ] RT- PCRアツセィ
シークェンシングによる EST構築の結果、配列が新規である 84種類の ESTに対 してそれそれ特異的なプライマーセッ トを作製し、 RT- PCR法によって各遺伝子の 発現を、 胎児の肝臓、 腎臓、 肺、 脳、 及び成体の肝臓、 腎臓、 肺、 脳、 骨髄、 精 巣について調べるスクリーニングを行った。
PolyA+ RNA(CLONTECH)あるいは全 RNAより、 SUPERSCRIPT™ I I RNase H— Revers e Transcriptase(GIBCO BRL )を用いた標準的な方法により 1本鎖 cDNAを合成し、 その一部を RT-PCRアツセィの铸型として用いた。 PCRは基本的に以下の条件で行 つた。
反応液組成
TaKaRa Taq (TaKaRa) 0.24〃1
TaqStart™ Antibody (CLONTECH) 0.24 1
lOxPCRバッファー (TaKaRa) 3〃1
2.5mM dNTPs (TaKaRa) 2.4 z l
20 Mプライマー 各 0.6〃1
銃型 DNA 6〃1
/全量 30〃1
反応条件
94。C、 2分 （94°C、 30秒 50°C〜60°C、 1分 72°C、 1分） x 28〜35サイク ル→72°C、 3分
より胎児性組織に特異的な発現パターを示した 63個のクローンを選択し、次に 大腸癌臨床サンプル、 および各種癌細胞株における発現を調べていった。 その結 果、 癌細胞において発現が活性化されている胎児性遺伝子として 「 s353」 およ び 「fls485」 が選択された。
なお、 RT- PCR における 「： Hs353」、 「： f ls485」、 および対照として用いた G3PDH を増幅するために用いたプライマー対を表 2に示す。
表 2 fls353
FLS353 SI プライマ一 5' GATGCTTTCGTAGTTCAGATGTAA 3，（配列番号 : 1 7 )
FLS353 A1 プライマー 5， AATGCAGCAAGAGGTGGTGGAGAT 3，（配列番号 : 1 8 ) fls485
FLS485 SI プライマー 5， GAGGGGGATCAGCTCAATGGTCTG 3，（配列番号 : 1 9 ) FLS485 A1プライマー 5， ACCCCATCGTGGACTTCCCTCTGC 3，（配列番号： 2 0 )
G3PDH
HG3 S1 プライマー 5， TCATCATCTCTGCCCCCTCTGCTG 3，（配列番号 : 2 1 ) HG3 A1 プライマ一 5， GACGCCTGCTTCACCACCTTCTTG 3' (配列番号： 2 2 )
[実施例 4 ] fls353全長 cDNAのクロー：
fls353ォリジナルクローンをプローブとし、 ヒト胎児肝臓由来 5' - stretch pi us cDNA ライブラリ一（CLONTECH)をプラークハイブリダィゼ一シヨン法によりス クリーニングした。 約 5xl05個のプラークをスクリーニングしたところ数個の陽 性クローンが得られた。 これらクローンのィンサ一トを PCRによって増幅し直接 シークェンシングすることにより配列を決定した。 得られた配列を用いてパブリ ックデ一夕ベースをサーチすることにより、 fls353の 3'側に一致する ESTをいく つか見いだした。 これらの ESTの配列から FLS353 E2プライマ一（5' CTGGTGCAGT TGGTGAGGTTTTCT 3， /配列番号： 2 3 )および FLS353 R1プライマー（5， CAATCACCG TCCCCAAGTCACCAG 3' /配列番号： 2 4 )を作製し、 ヒト胎児肝臓由来 cDNAを铸型と した PCRによって fls353遺伝子の 3'側断片を増幅した。増幅断片を pT7BlueTベ ク夕一（Novagen)にサブク口一二ングし、複数のサブクローンをシークェンシング することにより fls353遺伝子のストップコドンを含む 3'側断片の配列を決定し た。 また、 fls353遺伝子の 5，側は 5， RACE (Rap id Ampl ification of cDNA Ends) 法によってクローニングした。 ヒト胎児肝臓由来 Marathon™ Ready cDNA(CLONTE CH)を銬型とし、 FLS353 SIプライマーと APIプライマ一（CLONTECH)を用いた PCR により fls353遺伝子の 5'側断片 （約 1.3kbp) を増幅し、 pT7BlueTベクタ一にサ ブクローニングした。 複数のサブクローンをシークェンシングし、 開始コドンを 含む 5'側の配列を決定した。
全コーディング領域を含む cDNAは、 FLS353 WN1プライマ一（5， AGTCGCGGCCGCC GGTATGCAGAGAAGAGGACAGAA 3，/配列番号： 2 5 )および FLS353 WN2プライマー（5， AGTCGCGGCCGCAAAAGGGGTGAAAGAGAAGATTGC 3' /配列番号： 2 6 )を用いた PCRによ り、 胎児肝臓由来 cDNAなどから増幅した。
[実施例 5 ] fls485全長 cDNAのクロ一ニング
ヒト精巣 cDNAライブラリ一（ CLONTECH )を通常の方法でプレートに蒔き、ナイ口 ンメンブラン（Hybond N+ )へ写し取った。このメンブレンを約 200プラークを含む と考えられる断片に切り分け、メンブラン上のファージをラムダ希釈バッファ一 (SM)中へ抽出した。 このようにして得た cDNAプールを鎵型とし、 上記 FLS485 S1 プライマ一及び、 FLS485 A1 プライマ一による PCRでスクリ一ニングを行うこと により陽性クローンを含むプールを同定した。 このプールを鎵型とし、 上記 FLS4 85 A1プライマーとライブラリー（ AgtlOベクター）のベクタープライマーである GT10 S1プライマ一（5， CTTTTGAGCAAGTTCAGCCT 3， /配列番号： 2 7 )による PCRで この陽性クローンの断片（約 800 bp)を増幅した。 シークェンスを確認した後、 こ の断片をプローブとし、ヒト胎児肝臓由来 5，- stretch plus cDNAライブラリー（C L0NTECH)をプラークハイプリダイゼ一シヨン法によりスクリーニングした。約 10 6個のプラークをスクリーニングしたところ、 8個の陽性クローンが得られた。 こ れらクローンのィンサ一トを PCRによって増幅し直接シークェンシングすること により配列を決定した。 こうして得られた配列をもとに FLS485 A4プライマー（5 ， TTGAAATGTCCACTCGCTTATCCT 3' /配列番号： 2 8 )を作製し、 5， RACE(Rapid Amp l if ication of cDNA Ends )法により 5，側断片のクロ一ニングを行った。ヒト胎児 肝臓由来 Marathon™ Ready cDNA(CLONTECH)を錶型とし、 FLS485 A4プライマーと APIプライマー（CL0NTECH)を用いた PCRにより f ls485遺伝子の 5'側断片（約 600 bp )を増幅した。増幅断片を pT7B lueTベクター（ Novagen )にサブクローニングし、 複数のサブクローンをシークェンシングすることにより開始コドンを含む 5'側 の配列を決定した。
全コーディング領域を含む cDNAは、 表 3に記載の 5，側センスプライマーと 3， 側アンチセンスプライマーの組み合わせを用いた PCR によりヒト胎児肝臓 cDNA などから増幅しクローニングした。
表 3
5，側センスプライマ一
S1プライマー
5， AGTCGCGGCCGCGCTAAGCAGGTGCGGAGGGGAGTC 3' (配列番号 : 29) S2プライマー
5， AGTCGCGGCCGCCAGATATTCTTCCCACCTTTGGAG 3， (配列番号 : 30)
3，側アンチセンスプライマ一
A1プライマー
5， AGTCGCGGCCGCGAGGAGCTGTATAAGGGGTTGGAG 3， (配列番号 : 3 1 ) A2プライマー
5， AGTCGCGGCCGCTGCCAGGGTTTGTATGTGATTGTC 3， (配列番号： 32)
[実施例 6 ] fls353についての解析
<6-1> 正常組織における発現分布
fls353 の正常組織における発現分布をノーザン解析によって調べた。 fls353 のオリジナルクローンを Ready-to Go DNA labelling beads(Pharmacia)を用い たランダムプライマ一法により [ひ-32 P]dCTPでラベルし、プローブとして用いた。 Multiple Tissue Northern (MTN) Blot - Human, Human II， Human III, Human Fetal II, Human Cancer Cell Line(CLONTECH)を用い、 ExpressHyb Hybridizati on Solution(CLONTECH)中で、 メーカー推奨の方法に従い、 68°Cでハイブリダィゼ ーシヨンを行った。 最終的な洗浄は、 0.1 X SSC, 0.1¾ SDS、 50°Cで行った。 その結果を図 1に示す。 fls353は胎児の肝臓、 腎臓、 肺、 脳に強い発現がみら れるが、それそれ対応する成体の臓器においてはほとんど発現はみられなかった。 他の成体の臓器においては胸腺と精巣に比較的強い発現がみられるが、 それ以外 は非常に弱い発現がみられるのみであつた。
<6-2> 癌細胞株における発現
まず癌細胞株における発現を上記と同様のノーザンハイブリダィゼーシヨンに より解析したところ、調べた 8つの癌細胞株のうち 7つの株において fls353の強 い発現が観察された （図 1 )。 次に大腸癌臨床サンプルにおける発現を RT-PCRに より調べた （図 2、 3)。 その結果、 12種類のサンプルのうち 10種の腫瘍において fls353遺伝子の発現が認められた。これらのうち 6種については同一の患者から 採取した正常組織における発現も同時に調べたが、 ほとんど発現はみられず、 大 腸組織細胞が癌化することにより s353 の発現が活性化されていることが示唆 された。
く 6 - 3〉 臨床癌サンプルにおける発現
臨床肝臓癌サンプル及び臨床肺癌サンプルにおける f ls353 の発現をノーザン 解析により調べた （図 10、 11 )。 その結果、 癌組織においてその発現が活性化さ れていることが明らかとなった。 これらの結果から、 fls353遺伝子は様々な癌種 において発現が活性化され、それらの癌の進展に関与していることが示唆された。 く 6 - 4〉 構造解析
プラークハイブリダィゼ一シヨン法による cDNA ライブラリーのスクリーニン グ、 および RACE法などによって fls353遺伝子の全コ一ディング領域をカバーす る cDNAをクロ一ニングし配列を決定した。 その結果、 fls353は 747アミノ酸か らなるタンパク質をコードしていることが明らかとなった （図 4および 5)。決定 された fls353 cDNAの塩基配列を配列番号： 1に、 また、 コードされるタンパク 質のアミノ酸配列を配列番号： 2に示す。 このアミノ酸配列を用いデータベース の検索を行ったが、 有意な相同性を示すタンパク質は見いだされなかった。 構造 の特徴としては、 ATP/GTP結合コンセンサス配列 (52-59、 [Ala/Gly] -Xaa-Xaa-Xa a - Xaa-Gly- Lys- [Ser/Thr]、 Xaa は任意のアミノ酸を表す）を有することと、 塩基 性アミノ酸であるリジンの比率が多く （13.2%)、 塩基性のタンパク質であると予 想される点 （計算上の等電点 pl=9.62) が挙げられるが、 タンパク質の機能を予 測できる様なモチーフ等は見あたらなかった。
[実施例 7 ] fls485についての解析
<7-1> 正常組織における発現分布
fls485の正常組織における発現をノーザン解析により調べた（図 6)。ノーザン 解析は、 fls485のオリジナルクローンをプローブに用い、 上記 fls353 と同様に 仃つた。
その結果、 f ls485は胎児の肝臓、 腎臓、 および成体の精巣、 小腸といった、 未 分化な細胞を多く含み、 活発な細胞の分化や増殖が行われている臓器に非常に選 択性が高く発現している遺伝子であることが明らかとなった。
<7-2> 腫瘍細胞株における発現
培養細胞における発現を RT- PCR解析により検討したところ、 fls485の発現は 正常細胞である初代培養肺繊維芽細胞には見られないものの、 いくつかの肝臓癌 由来細胞株- HepG2， HuH7, PLC/PRF5(Alexander)には存在することが明らかとな つた （図 7)。 肝臓癌由来細胞株における fls485発現のパターンは、 肝臓癌腫瘍 マーカーであるひフエトプロティンの発現のパターンとよく一致しており、 成体 における癌細胞の性質をよりよく反映する細胞株に s485 の発現は相関してい ると考えられた。成体の正常肝臓にはノーザンレベルにおいてもより高感度な RT - PCRのレベルにおいても、 全く fls485の発現は認められなかった。 このことか ら、肝臓細胞の癌化に伴い fls485の発現が活性化されていることが示唆された。 また、データべ一ス検索によりパブリックデ一夕ベースに fls485由来であると 考えられる ESTが 4つ登録されていることを見いだした。 それらのうち 3っは大 腸癌細胞由来である （AA308814、 AA305159 - 大腸腺腫細胞株 Caco2由来、 AA622 964 - 大腸癌 RER+由来）。 このことから、 ある種の大腸癌においても fls485の発 現が活性化していることが示唆された。
<7-3> 臨床癌サンプルにおける発現
臨床肝臓癌サンプル及び臨床肺癌サンプルにおける f ls485 の発現をノーザン 解析により調べた （図 10、 11 )。 その結果、 癌組織においてその発現が活性化さ れていることが明らかとなった。 これらの結果から、 s485 遺伝子は様々な癌 種において発現が活性化され、 それらの癌の進展に関与していることが示唆され た。
<7-4> 構造解析
全コーディング領域をカバーする cDNAのクローニングを行ったところ、 s48 5は 353 アミノ酸からなるタンパクをコードし得る遺伝子であることが明らかと なった （図 8)。 決定された fls485全長 cDNAの塩基配列を配列番号： 3に、 また、 コードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号： 4に示す。 このアミノ酸配 列は、 以下にあげる特徴を有していた。
① 中央部に C4タイプ様の Zincフィンガードメインと考えられる配列が存在す る。 このドメインは、 Cys- Xaa- Xaa- Cys- Xaa-Gly- Xaa- Glyからなる配列を 2回、 ついで Cys- Xaa- Xaa_Cys- Xaa- Glyからなる配列を 1回というュニッ トを 2回繰り 返す形となっている。
② C末端の配列は Cys- Aaa- Aaa- Xaaボックスのコンセンサス配列に当てはまる c (Aaaは主に脂肪族のアミノ酸を表す。）このモチーフは rasをはじめとする Gプ 口ティンなどによく見られ、 Cys が脂質により修飾されることにより、 細胞膜内 側へ局在する機構に必要なモチーフであるとされている。 この他の細胞内局在化 シグナルは見あたらない。
③ さらに C末端の配列は、 最近明らかとなった PDZ( DHR )ドメインと呼ばれる 特徴的なドメイン構造に結合するとされる（Ser/Thr )- Xaa- Val モチーフにも当て はまる。 この結合様式は、 家族性ポリポ一シスの原因遺伝子である APCとショウ ジヨウバエの癌抑制遺伝子 DLGのヒトホモローグとの結合等に見られ、 細胞内で のシグナル伝達における重要かつ基本的な結合様式であると認識されつつある。 ④ 全体的に親水性であり、 膜貫通領域、 分泌シグナルなどは見られない。 ホモロジ一サーチを行ったところ、 zincフィンガー様ドメインの部分で、 いく つかのタンパク質と類似性が見られるものの、 有意な相同性を持つと考えられる タンパク質はデータベース中には見いだされなかった。
zinc フィンガードメインは多数の転写調節因子中によく見られる構造ドメィ ンであるが、 s485の zinc フィンガ一様ドメインはそのような典型的な転写調 節因子タイプのものとは異なっており、また fls485アミノ酸配列中には核移行シ グナルと考えられる配列も見出だされなかった。
また、 PCRによる解析から、 f ls485の mRNAは、 5'側に存在する 146bpからなる 配列を含む形と（fls485 L /配列番号： 3 )それをスキップする形（fls485 S /配列 番号： 5 )の 2種類が存在することが判明した （図 9)。 この領域は推定されるコ
、
-丁イング領域の N末端に相当しており、 fls485 L は、 f ls485 S よりも 51ァヽ ノ酸長いタンパク質をコ一ドし得ることになる（fls485 Lタンパク質のアミノ酸 配列を配列番号： 4に、 fls485 S夕ンパク質のアミノ酸配列を配列番号： 6に示 す）。さらにノーザン解析からは、精巣には他の組織に見られるものより長い転写 産物が存在することが判明した。 しかし PCRによる解析から、 この転写産物は他 の組織と同じコーディング領域を持つことが示され、 これは 3'非翻訳領域 (UTR) における長さの相違 （ポリ A添加サイ 卜の違いである可能性がある） に由来する ものであると考えられた。 産業上の利用の可能性
本発明により、 胎児組織に特異的、 あるいはより強く発現している新規なタン パク質および該タンパク質をコードする遺伝子が提供された。 該遺伝子は、 腫瘍 細胞で強く発現しており、細胞の癌化に関与していることが予想される。従って、 本発明の胎児性遺伝子の発現阻害剤は抗癌剤となりうることが期待される。また、 本発明の胎児性遺伝子および該遺伝子がコードするタンパク質は、細胞増殖性や、 不死化、 浸潤、 転移、 血管新生などに関与する新たな因子の精製やクローニング、 さらには生体内の発現調節異常により本発明の遺伝子発現が異常に活性化される ことにより起こる様々な疾病に対する医薬品開発のためのッールとして利用する ことが可能である。 本発明の遺伝子をターゲッ トにした薬剤等を設計することに より、 新たな作用機序による医薬品の開発が可能であると考えられる。

Claims

請求の範囲
1 . 下記 （a ) から （d ) のいずれかに記載の DNA。
( a ) 配列番号： 2、 4、 または 6に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質を コ一ドする DNA。
( b ) 配列番号： 1、 3、 または 5に記載の塩基配列のコード領域を含む DNA。
( c ) 配列番号： 2、 4、 または 6に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複 数のアミノ酸が置換、 欠失、 挿入、 および/または付加したアミノ酸配列からな り、 配列番号： 2、 4、 または 6に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機 能的に同等な夕ンパク質をコードする DNA。
( d ) 配列番号： 1、 3、 または 5に記載の塩基配列からなる DNAとストリンジ ェントな条件下でハイブリダィズし、 配列番号： 2、 4、 または 6に記載のアミ ノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコ一ドする MA。
2 . 配列番号： 2、 4、 または 6に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の部 分ぺプチドをコードする DNA。
3 . 請求項 1または 2に記載の DNAが挿入されたべクタ一。
4 . 請求項 1若しくは 2に記載の MAまたは請求項 3に記載のベクターを保持 する形質転換細胞。
5 . 請求項 1または 2に記載の DNAによりコードされるタンパク質またはぺプ チド。
6 . 請求項 4に記載の形質転換細胞を培養し、 該形質転換細胞またはその培養 上清から発現させたタンパク質を回収する工程を含む、 請求項 5に記載のタンパ ク質またはべプチドの製造方法。
7 . 請求項 5に記載のタンパク質に対する抗体。
8 . 配列番号： 1、 3、 または 5に記載の塩基配列からなる DNAまたはその相 補鎖とハイブリダィズし、 少なくとも 1 5塩基の鎖長を有するヌクレオチド。
9. 請求項 5に記載の夕ンパク質に結合する化合物のスクリーニング方法であ つて、
(a) 該タンパク質またはその部分べプチドに被検試料を接触させる工程、
( b ) 該タンパク質またはその部分ペプチドと被検試料との結合活性を検出する 工程、
(c) 該タンパク質またはその部分べプチドに結合する活性を有する化合物を選 択する工程、 を含む方法。
10. 請求項 9に記載の方法により単離されうる、 請求項 5に記載のタンパク 質に結合する化合物。
1 1. 請求項 1に記載の DNAの発現を抑制または促進する化合物をスクリー二 ングする方法であって、
(a) 該 DNAを発現する細胞に被検試料を接触させる工程、
(b) 該細胞内における該 DNAの発現を検出する工程、 および
(c) 被検試料を細胞に接触させない場合 （対照） と比較して、 該 DNAの発現を 減少または増加させる化合物を選択する工程、 を含む方法。
12. 請求項 1に記載の MAの発現を抑制または促進する化合物をスクリー二 ングする方法であって、
(a) 請求項 1に記載の DNAの発現制御領域の下流に機能的に結合されたレポ一 夕一遺伝子を含むベクターが導入された細胞を提供する工程、
(b) 該細胞に被検試料を接触させる工程、
(c) 該細胞内におけるレポーター活性を検出する工程、 および
(d) 被検試料を細胞に接触させない場合 （対照） と比較して、 該レポ一夕ー活 性を減少または増加させる化合物を選択する工程、 を含む方法。
13. 請求項 1 1または 12に記載の方法により単離しうる、 請求項 1に記載 の DNAの発現を抑制または促進する化合物。
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