WO2000044783A1 - Proteine meg 4 - Google Patents

Description

明細 ΐ メグー 4タンパク質 技術分野

本発明は、 遺伝子工学の分野に属し、 特に腎細胞の遺伝子の単離に関する, 技術

体内の 60兆個もの様々な細胞が、本質的に同一のゲノム DNAを有している。正 常な生理学的機能のために、 これらの遺伝子の発現は、 細胞系統、 および細胞が 受容するシグナルにより厳密に制御されている。 従って、 個々の細胞型に発現し ている遺伝子を解明することは極めて重要である。

メサンギゥム細胞 (mesangial cell )は、 腎糸球体の構造および機能の維持に中 心的な役割を果たしている。 そしてメサンギゥム細胞は、 各種腎炎においても中 心的な病態生理学的意義を有する。 例えばメサンギゥム細胞の増殖、 および細胞 外の糸球体間質マトリックスの蓄積は、 慢性腎炎および糖尿病性腎症のような 様々な糸球体疾患の患者の糸球体硬化症の重要な病理所見である。 従って、 メサ ンギゥム細胞で発現している遺伝子を見いだしその機能を明らかにすることは、 メサンギゥム細胞の生物学的性質の解明、 メサンギゥム細胞に関連する疾患の原 因の究明、 ひいては、 メサンギゥム細胞に関連する疾病の治療、 診断等に有効で ある。

メサンギゥム細胞のマ一カーとしては、 ラッ トでは Thyl抗原が知られている。 しかしこの遺伝子はメサンギゥム細胞特異的ではないうえ、 ヒトではメサンギゥ ム細胞には発現していない (Miyata T. et al . , Immunology( 1989) 67: 531-533; Miyata T. et al . , Immunology ( 1990) ; 69 : 39卜 395)。 また、 メサンギゥム細胞 は活性化されるとひ平滑筋ァクチンを発現することが知られているが、 この遺伝 子もメサンギゥム細胞特異的ではない。 このように、 メサンギゥム細胞に特徴的 な遺伝子については、 従来報告がなかった。

なお本発明者は、 先にメサンギゥム細胞に特異的に発現しているタンパク質と してメグシンを報告している (J. Cl in. Invest, 1998 Aug 15 , 102 : 4, 828-36)。 本発 明は、 このメグシンとも明確に異なった構造を持つ新規なタンパク質に関する。 発明の開示

本発明は、 メサンギゥム細胞で高度に発現される遺伝子を単離することを課題 とする。

本発明者は、 ヒトメサンギゥム細胞のインビトロ培養物から mRNAを単離し、 3' 側の cDNAラィブラリ一を作成した。 そして、 該 cDNAラィブラリ一の中からラン ダムに多数のクローンの配列を決定し、 該塩基配列を、 種々の臓器及び細胞から 得られた既知の 3'側の cDNAクローンの塩基配列と比較することによって、 メサ ンギゥム細胞で発現しているクローンを選択した。 そのうち、 メサンギゥム細胞 において特に出現頻度の高いクローンの一つを選択した。 更にこのクローンのィ ンサ一トをプロ一ブとしてメサンギゥム細胞から調製した人 ZIPLox cDNA ライブ ラリーをスクリーニングし、 ポジティブクローンの塩基配列を決定した。 決定さ れた cDNAの塩基配列に基づいて、最も長いオープンリーディングフレームのアミ ノ酸配列を明らかにした。 このアミノ酸配列には、 いくつかの特徴的なモチーフ を見出すことができた。 また既知のタンパク質であるマウス A T P依存性メ夕ロ プロテア一ゼ（ATP dependent metal loprotease ;ATP- MP )とのホモロジ一が確認さ れたことから、このアミノ酸配列を本発明による cDNAがコ一ドするタンパク質の アミノ酸配列であると推定した。 このアミノ酸配列を持つ本発明によるタンパク 質を、 本発明者はメグー 4 (Meg- 4)と命名した。 ヒト ·メグ— 4の cDNAの塩基配 列を配列番号： 1に、 ヒト ·メグー 4の推定ァミノ酸配列を配列番号： 2に示し た。 このアミノ酸配列について、 SwissProt データベースのアミノ酸配列とホモ口 ジー検索を行い、 メグ一 4が新規なタンパク質であり、 AAA タンパク質ファミリ — (ATPases associated with difierent cellular activities protein family) に特徴的な AAA モ チー フ （Walker, J. E.et al.EMBO J.8, 945-951, 1982, Swaffield,J.C. et al. Nature, 374, 88-91, 374, Fry,D.C. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.83， 907-911, 1997, FrohlichJ.U. et al. J. Cell. Biol. 114,443- 453, 1991)を含んでいることを確認した。 更にノーザンプロッティング によりメグ一 4の組織分布をみたところ、 メグ一 4は、 ヒトの肺や肝臓ではほと んど発現が見られず、 腎臓をはじめとして、 心臓、 脳、 胎盤、 骨格筋、 あるいは 脬臓等の組織で発現が観察された。 細胞レベルで見ると、 メサンギゥム細胞で特 に高度に発現していることが特徴的であった。 その他に、 繊維芽細胞や上皮細胞 などでの発現も観察された。 本発明はこれらの知見に基づいて完成されたもので ある。

即ち、 本発明は具体的には以下のものを含む。

〔1〕 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列、 またはこれらアミノ酸配列において 1若しくは複数個のアミノ酸が置換、 欠失、 付加、 および/または挿入された ァミノ酸配列を含み、 このアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等な夕 ンパク質。

〔2〕 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列に対して、 90%以上のホモロジ一を 持つアミノ酸配列からなる 〔1〕 に記載のタンパク質。

〔3〕 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列を含む 〔1〕 に記載のタンパク質。 〔4〕 〔1〕 に記載のタンパク質をコードする DNA。

〔5〕 配列番号： 1に記載の塩基配列に対して、 85%以上のホモロジ一を持つ 塩基配列からなる 〔4〕 に記載の DNA。

〔6〕 配列番号： 1に記載の塩基配列におけるタンパク質コード領域を含む〔5〕 に記載の DNA。 〔7〕 配列番号： 1に記載の塩基配列を持つ DNAとストリンジヱン卜な条件下 でハイブリダィズし、 〔1〕 に記載のタンパク質をコードする DNA。

〔8〕 配列番号： 1に記載の塩基配列からなる DNA、 またはその相補鎖と特異的に ハイブリダィズする DNAであって、 少なくとも 1 5ヌクレオチドの鎖長を持つ DNA。

〔9〕 〔6〕 に記載の DNAもしくはその一部に対するアンチセンス DNA。

〔10〕 〔4〕、 〔5〕、 〔6〕、 および〔7〕のいずれかに記載の DNAを含 むことを特徴とするベクタ一。

〔1 1〕 〔4〕、 〔5〕、 〔6〕、 および〔7〕のいずれかに記載の DNAを発 現可能に保持する形質転換細胞。

〔12〕 〔1 1〕 に記載の形質転換細胞を培養し、 〔4〕、 〔5〕、 〔6〕、 お よび〔7〕のいずれかに記載の DN Aの発現産物を回収することを特徴とする、 〔1〕 に記載のタンパク質の製造方法。

〔13〕 〔1〕 に記載のタンパク質に結合することを特徴とする抗体。 〔14〕 配列番号： 2のアミノ酸配列から選択されたアミノ酸配列を持つ タンパク質を認識する 〔13〕 に記載の抗体。

〔15〕 抗体がモノクローナル抗体である 〔14〕 に記載の抗体。

〔16〕 〔14〕 または 〔15〕 に記載の抗体と 〔2〕 に記載の夕ンパク 質、 またはその断片との免疫学的な結合に基づいて 〔3〕 に記載のタンパク質 またはその断片を測定する免疫学的測定方法。

〔17〕 〔14〕 または 〔15〕 に記載の抗体を含む 〔3〕 に記載のタン パク質またはその断片の免疫学的測定用試薬。

〔18〕 生体試料中に含まれる 〔3〕 に記載のタンパク質またはその断片 を測定し、 正常試料から得られた測定値と比較することによってメサンギゥム 増殖性腎症を検出する方法。

〔19〕 メグ _ 4をコ一ドする遺伝子の発現レベルを変化させたトランス ジエニック非ヒト脊椎動物。

〔2 0〕 非ヒト脊椎動物がマウスである 〔1 9〕 に記載のトランスジェニ ック非ヒト脊椎動物。

〔2 1〕 メグ— 4をコードする遺伝子の発現が抑制されたノックァゥトマ ウスである 〔2 0〕 に記載のトランスジエニック非ヒト脊椎動物。 前記課題を達成するために本発明者は、 3'領域 cDNAラィブラリ一（3' -directed cDNA l ibrary)を用いた。 この方法により、 クロ一ニング効率に及ぼす cDNAの大 きさの影響を回避することができる。 3'領域の配列は各遺伝子に特有なものであ り、約 200〜300bpの配列デ一夕は、その遺伝子の特徴を明らかにするのに充分で ある。

本発明のヒト ·メグ— 4をコードする DNAは、メサンギゥム細胞から mRNAを調 製した後、既知の方法により二本鎖 cDNAに変換することにより得ることができる。 mRNAの調製はグァニジンイソチオシァネート—塩化セシウム法 [Chirwin, et al . Biochemistr 18, 5294 ( 1979)]、 デォキシリボヌクレア一ゼ存在下に界面活性剤 処理、フエノール処理を行なう方法 [Berger&Birkenmeier, Biochemistry 18, 5143 ( 1979)] などを用いることができる。 poly(A) NA は、 オリゴ（dT)を結合した担 体 （例えばセファロ一ス、 セルロースやラテックス粒子等） を用いたァフィニテ ィ一クロマトグラフィーなどを用いて total RNAから調製することができる。 得 られた mRNAを錶型として、 3'端にある poly(A)鎖に相補的なォリゴ（dT)またはラ ンダムプライマー、 あるいはメグ一 4のァミノ酸配列の一部に相応する合成ォリ ゴヌクレオチドをプライマ一として逆転写酵素で処理すれば、 mRNAとその相補的 DNA (cDNA) からなるハイプリッ ド鎖が得られる。 その mRNA鎖を、 例えば E. coli RNase H、 E. col i DNA polymerase I、 E. coli MA Ligaseで処理し、 DNA鎖に置 換することにより、 二本鎖 cDNAを得ることができる。

ヒト 'メグー4遺伝子塩基配列をもとに合成したプライマーを用いて、 メサン ギゥム細胞 poly(A)⁺RNAを錡形にして RT- PCR法によりクローニングすることも可 能である。 また、 PCR によらず、 ヒト ·メグ— 4遺伝子塩基配列をもとにプロ一 ブを合成し、 直接 cDNAライブラリ一をスクリーニングし、 目的とする cDNAを得 ることもできる。 本発明の遺伝子は、 これらの方法により得られた遺伝子の中か ら、 その遺伝子の塩基配列を確認することにより、 選択することができる。

その他、 たとえば実施例 8において示すように、 ヒト ·メサンギゥム細胞の cD NAライブラリーを錡型として、 配列番号： 7に示したようなメグ一 4フエノ夕ィ プを単離することができる。 このようなフエノタイプは、 本発明のメグ一 4に含 まれる。 あるいはマウスやラット等、 ヒト以外の種におけるメグ一 4のホモログ についても、 同様の手法により cDNAの取得が可能である。

更に、メグ一 4のホモ口グの cDNAを以下のような手法によつて単離することも 可能である。 すなわち、 前記ヒト ·メグ— 4 cDNAの塩基配列をプローブとして用 い、 cDNAライブラリ一をコロニーハイブリダイゼーションゃプラークハイプリダ ィゼ一シヨンによってスクリ一ニングして、 メグー 4のホモログをコ一ドする cD NAを単離することができる。 cDNAライブラリ一は、 マウス、 ラッ 卜の組織や、 培 養メサンギゥム細胞等から抽出した mRNAを錡型として合成することができる。あ るいは、 市販 cDNAライブラリー （フナコシ製等） を用いることもできる。 この他 に、 本発明によるヒト ·メグ一 4の cDNAをもとに、 0RFの前後にデイジエネレー ティブプラィマーを設計し、これを利用した PCRによってホモ口グの cDNAを増幅 する方法を用いることもできる。

AAAタンパク質フアミリーは、 AAAモチーフを共有するものの、 その他の領域に おいては必ずしも類似の配列を示すとは限らない。 しかしながら、 たとえば後に 述べるマウス ATP- MPのようなホモログにおいては、 AAAモチーフ以外の領域にお いてもある程度の類似性があり、 PCRによる増幅が可能である。 マウスのほか、 ラヅ卜においてもディジエネレーティブプライマ一によってメグー 4ホモログの cDNA断片の増幅が可能であることを、 本発明者は確認している。 ヒト ·メグ— 4ゲノムは、 ゲノミックライブラリーのスクリ—二ングによって 得ることができる。 ゲノミックライブラリ一は、 たとえばヒト B リンパ芽球から ゲノムを調製し、 Sau3で部分的に切断した DNAをファ一ジベクタ一である EMBL3 に組み込むことにより合成することができる （Blood, vol 83, No 11, 1994: pp 3126-3131)。 このようなゲノミックライブラリーについて、 プラークハイブリダ ィゼーシヨン法 （新細胞工学実験プロトコール、 秀潤社、 pp79- 92、 参照） を行え ば、 目的とするゲノムを含むクローンを取得できる。 プローブとしては、 メグ一 4 cDNAのオープンリーディングフレーム全ての領域（2322bp)、 または cDNA部分 をプライマ一としてヒトゲノム MAを PCR法を用いて増幅することにより得られ た各ェキソン一イントロン部分を用ることができる。 後に述べるように、 メグ一 4遺伝子は 1 0番染色体の短腕 10pl 1.23- 12.1.にマッピングされていることか ら、 この領域を含むゲノミッククローンからヒト ，メグ一 4ゲノムを容易に単離 することができる。

また、 同時に調節領域に関しても、 ヒト培養メサンギゥム細胞由来 mRNA、 もし くはヒト腎臓 mRNA (Clontech社より購入） を銪型として、 5' RACE法 （5' -Full R ACE Core Set (宝酒造（株）の方法に従う）） を用いて 5' UTRの配列決定を行うこ とができる。

本発明の遺伝子は、例えばホスホアミダイ ド法 [Mattencci， M. D. &Caruthers， M. H. J. Am. Chem. Soc. 103, 3185( 1981 )]、ホスフアイ ト ' トリエステル法 [H unkapiller, M. et al . Nature 310, 105 ( 1984)] 等の核酸の化学合成を用いる 常法に従って製造することもできる。

なお、 一般に、 真核生物の遺伝子はヒトインターフヱロン遺伝子で知られてい るように多形現象を示すことが多く、 この多形現象によって 1個あるいはそれ以 上のアミノ酸が置換される場合もあるが、 通常タンパク質の活性は維持される。 また、 一般に、 1個または数個のアミノ酸配列の改変によって、 タンパク質の活 性が維持される場合が多いことが知られている。 従って、 配列番号： 2に示され るァミノ酸配列をコードする遺伝子を人工的に改変したものを用いて得られた夕 ンパク質をコ一ドする遺伝子は、 該タンパク質が本発明の遺伝子の特徴的な機能 を有する限り、 すべて本発明に含まれる。 また、 配列番号： 2に示されるァミノ 酸配列を人工的に改変したタンパク質は、 本発明のタンパク質の特徴を有する限 り、 すべて本発明に含まれる。

その他、 本発明のタンパク質には、 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列、 また はこれらァミノ酸配列において 1若しくは複数個のァミノ酸が置換、欠失、付加、 および/または挿入されたアミノ酸配列を含み、 本発明によるメグ— 4と機能的 に同等なタンパク質が含まれる。 なお本発明において機能的に同等とは、 メグ一 4と同等の生物学的特性を持つことを意味する。 本発明者は、 メグ— 4にたとえ ば以下のような生物学的な特性を見出している。

まず、 メグ一 4はその構造上 AAAタンパク質ファミリ一に属する。 ここで、 AA Aタンパク質ファミリ一とは、 Mg²⁺依存性の ATPase活性を持ち、 高度に保存され た 2 3 0— 2 5 0塩基からなる AAAモチーフ （ATP結合モチーフ、 最小 AAAタン パク質モチーフ、 および walker Bモチーフを含む）、 並びに金属結合モチーフ（H EXXH )を持ったタンパク質である。 いくつかの ATP- MPが、 AAAタンパク質として 知られている。 しかし、 それらの細胞局在はまちまちである。 また機能的にも、 セルサイクルの制御、 タンパク質の分解、 オルガネラ生合成、 あるいはタンパク 質輸送など幅広 、機能が報告されている。

またメグ— 4の発現特性として、腎メサンギゥム細胞で高度に発現している他、 腎、 心、 脳、 胎盤、 骨格筋、 あるいは脬等の組織で発現が観察され、 肺と肝にお いては発現が弱い。 更に培養癌細胞株においては、 メグ一 4の顕著な発現は観察 されない。 各組織におけるメグ一 4の発現状態は、 たとえば配列番号： 1から選 択された塩基配列を持つプローブによって、各組織から調製した mRNAを試料とし てノ一ザンブロットアツセィを行うことによつて知ることができる。

以上のような生物学的特性について、 機能的に同等なタンパク質は、 いずれも WO 00/44783 Q PCT/JPOO/00413

本発明によるメグ一 4を構成する。 したがって、 具体的に構造を明らかにしたヒ 卜のメグ一 4のみならず、 構造的にあるいは機能的に同等な他の種のホモ口グは 本発明に含まれる。

本発明において、 配列番号： 2で表されるアミノ酸配列に対して 1若しくは複 数個のアミノ酸が置換、 欠失、 付加、 および/または挿入されたアミノ酸配列と は、 好ましくは配列番号： 2で表されるアミノ酸配列に対して全体として 9 0 % 以上のホモ口ジ一を持つ配列を挙げることができる。 ァミノ酸配列のホモ口ジー は、 FASTAによって求められる。 より具体的には、 配列番号： 2に記載のァミノ 酸配列において、 1— 5 0個、 好ましくは 1一 1 0個のアミノ酸が他のァミノ酸 で置換された配列、 欠失した配列、 付加された配列、 あるいは挿入された配列を 示すことができる。

また、 本発明の DNAには、 これらの機能的に同等なタンパク質をコードする DN Aが含まれる。 これらのタンパク質をコードする DNAは、 cDNAのみならずゲノム DNAや合成 DNAであることもできる。

また、 所望のアミノ酸に対するコドンはそれ自体公知であり、 その選択も任意 でよく、 例えば利用する宿主のコドン使用頻度を考慮して常法に従い決定できる [Grantham, R. et al . ucleic Acids Res. 9, r43 ( 1981 )]。従って、 コドンの 縮重を考慮して、 MAを適宜改変したものもまた本発明の DNAに含まれる。 所望 の改変をコ一ドする合成ォリゴヌクレオチドからなるプライマーを利用した部位 特異的変 1—、丄導入法 (.sitespecif ic mutagenesis) [Mark, D. F. et al . Proc. Nat 1. Acad. Sci . U. S.A. 81 , 5662 ( 1984) ]等にしたがって、 これら核酸配列のコド ンを一部改変することができる。

更に、 配列番号： 1に記載の塩基配列を含む DNAとハイブリダィズすることが でき、 かつその DNAによってコードされる夕ンパク質が本発明によるメグ一 4に 特徴的な機能を有する限り、 その DNAは本発明による DNAに含まれる。 ストリン ジェントな条件下で特定配列にハイブリダイズすることができる配列は、 特定配 列がコードするタンパク質と類似した活性を持つものが多いと考えられる。 スト リンジェン卜な条件とは、 一般的には以下のような条件を示すことができる。 す なわち、 4 x SSC、 6 5 °Cでハイブリダィゼ一シヨンさせ、 0 . 1 X SSCを用いて 6 5 °Cで 1時間洗浄する。 ストリンジエンシーを大きく左右するハイブリダィゼ ーシヨンや洗浄の温度条件は、 融解温度（ )に応じて調整することができる。 Tm はハイブリダイズする塩基対に占める構成塩基の割合、 ハイブリダイゼーシヨン 溶液組成 （塩濃度、 ホルムアミ ドゃドデシル硫酸ナトリウム濃度） によって変動 する。 したがって、 当業者であればこれらの条件を考慮して同等のストリンジェ ンシ一を与える条件を経験的に設定することができる。 あるいは本発明の MAに は、 配列番号： 1に示す塩基配列に対して、 F A S T Aや BLASTによるホモロジ 一検索によって好ましくは 85%以上、より好ましくは 95 以上のホモロジ一を持つ 塩基配列からなる DNAが含まれる。

変異体も含め本発明による DNAの塩基配列は、 公知の技術に基づいてさまざま な用途に利用することができる。

このようにしてクローン化されたメグ一 4をコードする遺伝子は適当な発現べ ク夕一 DNAに組み込むことにより、 他の原核細胞または真核細胞の宿主を形質転 換させることができる。 さらに、 これらの発現べクタ一に適当なプロモーターお よび形質発現に係る配列を導入することにより、 それぞれの宿主細胞において遺 伝子を発現することが可能である。 発現べクタ一としては、 例えば大腸菌の場合 は、 pET-3 [Studier & Moffatt, J. Mol . Biol . 189, 113( 1986 )] 等が、 COS細 胞の場合は pEF- BOS [Nucleic Acids Research 18, 5322 ( 1990)]、 pSV2-gpt [Mul ligan & Berg, Proc. Natl . Acad. Sci . U. S.A. 78, 2072 ( 1981 )] 等が、 CH0細 胞の場合は pVYl [国際公開第 89/03874号公報]等がそれぞれ挙げられる。また、 目的とする遺伝子に他のポリべプチドをコ一ドする遺伝子を連結して融合タンパ ク質として発現させることにより、 精製を容易にし、 その後目的タンパク質を切 り出すことも可能である。 融合させるタンパク質としては、 ヒスチジンタグ、 c- mycタグ、 MBP—夕グ、 あるいは GST -タグ等が知られている。 これらのタグを融合 させた状態でィンサ一トを発現させることができるベクターは市販されている。 本発明の発現系に用いる宿主のうち原核生物宿主細胞としては、 例えば、 大腸 菌 （Escherichia coli) が挙げられる。 また真核生物のうち、 真核微生物の宿主 細胞としては、 例えばサヅカロミセス 'セレビシェ一 （Saccharomyces cervisia e)等が挙げられ、哺乳動物由来の宿主細胞としては、例えば COS細胞、 CH0細胞、 BHK細胞等が挙げられる。 なお、 本発明の形質転換体の培養は、 宿主細胞に適し た培養条件を適宜選択して行なえばよい。

以上のようにして目的とするメグ一 4をコードする遺伝子で形質転換した形質 転換体を培養し、 産生されたメグ一 4は、 細胞内または細胞外から分離し均一な タンパク質にまで精製することができる。 なお、 本発明の目的タンパク質である メグ— 4の分離、 精製は、 通常のタンパク質で用いられる分離、 精製方法を使用 すればよく、 何ら限定されるものではない。 例えば各種クロマトグラフィー等を 適宜選択し、 組み合わせれば、 メグ— 4を分離、 精製することができる。

なお、 上述の他、 本発明の遺伝子、 該遺伝子を含有する組換えベクター、 該べ クタ一による形質転換体および該遺伝子を用いたメグ— 4の製造過程における遺 伝子操作の処理手段は、 「Molecular Cloning- A Laboratory Manual j (Cold Spri ng Harbor Laboratory, N.Y. ) に記載の常法に従って行うことができる。

この他、 配列番号： 1に記載の塩基配列に基づいて、 メグ一 4遺伝子を検出す るためのプローブを設定することができる。 あるいは、 これらの塩基配列を含む DNAや RNAを増幅するためのプライマ一を設定することができる。 与えられた配 列をもとに、 プローブやプライマーを設定することは当業者が日常的に行ってい ることである。 設定された塩基配列を持つォリゴヌクレオチドは化学合成によつ て得ることができる。そしてそのオリゴヌクレオチドに適当な標識を付加すれば、 さまざまなフォーマットのハイブリダィゼーシヨンアツセィに利用することがで きる。 あるいは、 PCRのような核酸の合成反応に利用することができる。 プロ一 ブゃプライマーに利用するォリゴヌクレオチドは、少なくとも 15塩基、好適には 25 - 50塩基の長さとするのが望ましい。

更に本発明が明らかにしたメグ— 4をコードする遺伝子の塩基配列に基づいて、 メグ一 4の発現を制御しうるアンチセンス核酸が提供される。 本発明によるアン チセンス核酸は、 メグ _ 4のメサンギゥム細胞における役割を明らかにするため の重要なツールとなる。 あるいはメグ一 4の発現亢進によってもたらされる病態 の制御に有用である。 アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を抑制する作用とし ては、 以下のような複数の要因が存在する。 すなわち、 三重鎖形成による転写開 始阻害、 RNAポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造がつくられた部位と のハイプリッ ド形成による転写抑制、 合成の進みつつある Aとのハイプリヅド 形成による転写阻害、 イントロンとェキソンとの接合点でのハイブリッド形成に よるスプライシング抑制、 スプライソソーム形成部位とのハイブリヅド形成によ るスプライシング抑制、 mRNAとのハイプリヅ ド形成による核から細胞質への移行 抑制、 キヤッピング部位ゃポリ（ A )付加部位とのハイブリッド形成によるスプラ ィシング抑制、翻訳開始因子結合部位とのハイプリッド形成による翻訳開始抑制、 開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイプリッド形成による翻訳抑制、 mR NAの翻訳領域やポリゾーム結合部位とのハイプリッド形成によるタンパク質鎖 に伸長阻止、 および核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリツド形成に よる遺伝子発現抑制、 などである。 これらは、 転写、 スプライシング、 または翻 訳の過程を阻害して、標的遺伝子の発現を抑制する（平島および井上「新生化学実 験講座 2核酸 I V 遺伝子の複製と発現」，日本生化学会編，東京化学同人 , pp.319 -347, 1993 )。

本発明で用いられるアンチセンス配列は、 上記のいずれの作用で標的遺伝子の 発現を抑制してもよい。 一つの態様としては、 遺伝子の mRNAの 5'端近傍の非翻 訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、 遺伝子の翻訳阻害に効果的で あろう。 しかし、 コード領域もしくは 3'側の非翻訳領域に相補的な配列も使用し 得る。 このように、 遺伝子の翻訳領域だけでなく非翻訳領域の配列のアンチセン ス配列を含む DNAも、 本発明で利用されるアンチセンス DNAに含まれる。 使用さ れるアンチセンス DNAは、 適当なプロモーターの下流に連結され、 好ましくは 3' 側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。 このようにして調製された MA は、 公知の方法で、 所望の宿主へ形質転換できる。 アンチセンス DNAの配列は、 形質転換する宿主が持つ内在性遺伝子（あるいはその相同遺伝子）、 またはその一 部と相補的な配列であることが好ましいが、 遺伝子の発現を有効に阻害できる限 り、 完全に相補的でなくてもよい。

アンチセンス DNAを錶型として転写された RNAが、 標的遺伝子の転写産物に対 して好ましくは 90%、最も好ましくは 95%の相補性を有するように設計する。ァ ンチセンス配列を用いて、 効果的に標的遺伝子の発現を阻害するには、 アンチセ ンス MAの長さは、少なくとも 15塩基以上であり、好ましくは 100塩基以上であ り、 さらに好ましくは 500塩基以上である。 通常、 用いられるアンチセンス UNA の長さは 2.5kbよりも短い。

更に本発明が提供するメグ一 4の cDNA塩基配列に基づいて、ゲノム中に存在す るメグ— 4遺伝子のプロモー夕一領域、 ェンハンサ一領域を取得することができ る。 in situハイブリダィゼ一シヨンの結果、 メグ— 4遺伝子は 1 0番染色体の 短腕 10pll .23- 12. 1. (図 4 ) の領域にマッピングされた。 したがって、 メグ— 4遺伝子のプロモー夕一領域ゃェンハンサー領域は、 この領域の上流を含むゲノ ミッククローンから公知の方法に基づいて得ることができる。

具体的には、 特開平 6- 181767号公報、 「The Journal of Immunology ( 1995 ) 1 55， 2477-2486, Proc . Natl . Acad. Sc i . USA ( 1995 ) , 92, 356卜 3565」等と同様の 方法でこれらの制御領域の取得が可能である。 なお、 本明細書において、 プロモ 一夕一領域とは転写開始部位の上流に存在する遺伝子の発現を制御する DNA領域 を、 ェンハンサ一領域とはイントロンまたは 3' UTRに存在する遺伝子の発現を制 御する DNA領域をいう。 具体的には、 プロモ一夕一領域は、 例えば、 以下の方法によって取得すること ができる。

1 ) メグ一 4の cDNAの 5， 末端側をプローブとし、 ヒトゲノムライブラリーより メグ一 4のプロモ一夕一領域をクロ一ニングする。

2) 制限酵素消化してメグ一 4遺伝子の翻訳開始コドンを含むその上流部分 （2 〜5kbp)のプロモー夕一領域を含む DNAを得、 塩基配列を決定する。 ヒトメサン ギゥム細胞から調製した poly(A) NAを錡型とし、 メグー 4遺伝子の 5'末端側 c DNA配列より選択したブラィマ一 DNAを用いたプライマー伸長法により、転写開始 点 （+ 1) を決定する。 塩基配列から転写因子結合配列を検索し、 プロモ一夕一 活性を有する可能性がある箇所を予想する。

3) 2) で得た DNAからメグ— 4遺伝子のコード領域を除いた DNA断片をプラス ミ ド上にサブクローニングし、 この DNA断片の 2〜5kbp下流に、 レポーター遺 伝子としてのクロラムフエニコ一ルァセチル転位酵素 （CAT) 遺伝子、 あるい は、ルシフヱラ一ゼ遺伝子を連結したレポ一夕一プラスミ ドを構築する。同様に、 プロモーター領域の可能性がある各箇所を含むような形で、制限酵素消化により、 或いは、 P CRにより、 5'末端側及び 3'末端側を順次削ったメグ一 4遺伝子上流 部分の様々な部位に該当する DNA断片を作成し、 これらの下流に、 レポ一夕一遺 伝子としての CAT遺伝子、 あるいは、 ルシフェラ一ゼ遺伝子を連結したレポ一 夕一プラスミ ドを構築する。

4) 3) で作製したレポ一夕一プラスミ ドで形質転換した動物細胞の CAT或い はルシフェラーゼ活性を測定することにより、 メグ一 4遺伝子上流部分に存在す るプロモー夕一領域を得る。

また、 3， UTR、 イントロン中のェンハンサー領域は、 メグ一4 cDNAをプロ一 ブとし、 ヒトゲノムライブラリ一よりヒト ·メグ一 4のゲノム遺伝子をクロー二 ングし、 上述のプロモーターに関する方法と同様にして、 ェンハンサ一活性を有 する領域を得ることができる。 メグ一 4遺伝子の発現を制御している転写因子は、 「新細胞工学実験プロ トコ ール （秀潤社)」、 「バイオマニュアルシリーズ 5転写因子研究法 （羊土社)」、 「DN A & Cell Biology, 13， 731-742 ( 1994)」に記載の方法等の公知の方法、例えば、 ァフィ二ティーカラムを用いた方法、 サウスウエスタン法、 フットプリンティン グ法、 ゲルシフト法、 または one-hybrid法で得ることができる。 なお、 本明細書 において、 転写因子とはメグ一 4遺伝子の転写を調節している因子で、 転写の開 始反応を誘導する転写開始因子と、 転写を正または負に調節する転写調節因子を さす。

ァフィ二ティーカラム法を用いる場合は、 前述の方法で得た、 プロモーター領 域、 ェンハンサ一領域をセファロース或いはラテックスビーズに固定化したカラ ムに、 核抽出液をかけ、 カラムを洗浄後、 カラムに固定化した配列と同様の配列 を有する DNAを用い、 結合した転写因子を溶出することによって、 メグ— 4遺伝 子の発現を制御している転写因子を得ることができる。

また、 サウスウエスタン法を用いる場合は、 大腸菌の発現べクタ一、 例えば入 g tilに cDNAを揷入し、 ガラクトシダーゼとの融合タンパク質を合成させ、 二 トロセルロース膜に該融合タンパク質を吸着させて、 放射性同位元素で標識され たプロモーター領域、 ェンハンサ一領域の DNA断片をプローブにし、 結合活性を もつ融合タンパク質を合成するファ一ジを選択することによって、 メグ一 4遺伝 子の発現を制御している転写因子を得ることができる。

ゲルシフト法は、 遊離の DNAがタンパク質と結合したときにポリアクリルアミ ドゲルによる電気泳動の移動度に差を生じる現象に基づいている。 プロモーター 領域ゃェンハンサー領域の DNA断片をプローブとし、転写因子が含まれる試料（た とえば核タンパク質抽出液）と混合して、低イオン強度の元で電気泳動分析する。 転写因子の結合は、 遊離の DNAとは違った移動度のバンドとして検出される。 ゲ ルシフト法は、 タンパク質の混合物から高い感度で転写因子を分離することがで きる。 ゲルシフ卜法によって得られた DNAと転写因子の複合体を、 更にフッ トフ。リン ト法によって解析すると、 転写因子の結合部位を決定することができる。 フット プリント法は、 DNA上にタンパク質が結合すると DNase Iの消化から保護される 現象を利用している。 すなわち、 末端を³² Pで標識したプロモーター領域ゃェン ハンサ一領域の DNAを、 転写因子の共存化で DNase Iによって部分消化し、 これ を塩基配列決定用の変性ポリアクリルアミ ドゲルで分離する。 転写因子の無い状 態で同様の処理を行った結果と比較すると、 転写因子の結合によってバンドの消 失が観察されることから、 その結合部位の推定が可能となる。

本発明はまた、 メグ— 4を認識する抗体を提供する。 本発明の抗体には、 例え ば、 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質に対する抗体が含ま れる。 メグ一 4または本発明のメグ— 4の部分ペプチドに対する抗体 （例えばポ リク口一ナル抗体、 モノクローナル抗体） または抗血清は、 本発明のメグ一 4、 本発明のメグ— 4の部分べプチド、 あるいは本発明による C- myc- (His ^-Tag -メ グー 4や MBP-メグー 4のような融合夕ンパク質を抗原として用い、 自体公知の抗 体または抗血清の製造法に従って製造することができる。 より具体的には、 他の AAAフアミリーとの相同性が低く、 かつ親水性を有する領域のアミノ酸配列を含 むペプチドは、 免疫原として有用である。 実施例で確認しているとおり、 配列番 号： 2に示すアミノ酸配列において、 574- 593位に相当するアミノ酸配列 KDKILMG PERRSVEIDNKNK (配列番号： 9 ) を免疫原として用いることにより、 メグ一 4特異 的な抗体が得られている。 その他、 本発明のモノクローナル抗体は、 後述の方法 に従って製造することができる。

本発明のメグ一 4、 または本発明のメグ一 4の部分ペプチドは、 温血動物に対 して投与による抗体産生が可能な部位に、公知の担体や希釈剤と共に投与される。 投与に際して抗体産生能を高めるため、 完全フロイントアジュバントゃ不完全フ 口イントアジュバントを投与してもよい。投与は通常 1〜6週毎に 1回ずつ、 計 2 〜： 10回程度行われる。 抗体産生に用いられる温血動物としては、 例えばサル、 ゥ サギ、 ィヌ、 モルモッ ト、 マウス、 ラッ ト、 ヒッジ、 ャギ、 あるいはニヮトリ等 が挙げられるが、 マウスおよびゥサギが好ましく用いられる。

モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、 抗原を免疫された温血動物、 例えばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の 2〜5日後に脾臓 またはリンパ節を採取し、 それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合さ せることにより、 モノクローナル抗体産生ハイプリ ドーマを調製することができ る。 抗血清中の抗体価の測定は、 例えば後記の標識化メグ一 4と抗血清とを反応 させた後、 抗体に結合した標識剤の活性を測定することによりなされる。 融合操 作は既知の方法、 例えばケ一ラ一とミルスタインの方法 （Nature, 256, 495 ( 19 75 ) ) に従い実施できる。 融合促進剤としてはポリエチレングリコール （PEG) や センダイウィルスなどが挙げられるが、 好ましくは PEGが用いられる。

骨髄腫細胞としては例えば X- 63Ag8、 NS- 1、 P3U1、 SP2/0、 AP-1などが挙げられ るが、 X-63Ag8が好ましく用いられる。 用いられる抗体産生細胞 （脾臓細胞） 数 と骨髄腫細胞数との好ましい比率は 1 : 20〜20： 1であり、 PEG (好ましくは PEG1 000〜PEG6000) が 10〜80%程度の濃度で添加され、 20〜40°C、 好ましくは 30〜3 7°Cで 1〜 10分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。 抗メグ— 4抗体産生ハイプリ ドーマのスクリーニングには種々の方法が使用でき るが、 例えばメグ— 4抗原を直接又は担体と共に吸着させた固相 （例えば、 マイ クロプレート） にハイブリ ド一マ培養上清を添加し、 次に放射性物質や酵素など で標識した抗免疫グロプリン抗体 （細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、 抗マウス免疫グロブリン抗体） が用いられる。 またはプロテイン Aを加え、 固相 に結合した抗メグー 4モノクローナル抗体を検出する方法、 抗免疫グロプリン抗 体又はプロテイン Aを吸着させた固相にハイプリ ドーマ培養上清を添加し、 放射 性物質や酵素などで標識したメグー 4を加え、 固相に結合した抗メグー 4モノク 口一ナル抗体を検出する方法などが挙げられる。

抗メグ— 4モノクローナル抗体の選別およびクローニングは、 自体公知または それに準じる方法に従って行うことができる。 通常 HAT (ヒポキサンチン、 アミ ノプテリン、 チミジン） を添加した動物細胞用培地で行われる。 選別、 クロー二 ングおよび育種用培地としては、 ハイプリ ドーマが生育できるものならばどのよ うな培地を用いてもよい。 例えば、 1〜20%、 好ましくは 10〜20%の牛胎児血清 を含む RPMI 1640培地 （大日本製薬 （株))、 1〜10%の牛胎児血清を含む GIT培地 (和光純薬工業 （株））、 またはハイプリ ドーマ培養用無血清培地（SFM-101、 日水 製薬 （株）） などを用いることができる。 培養温度は、 通常 20〜40°C、 好ましく は約 37°Cである。 培養時間は、 通常 5日〜 3週間、 好ましくは 1週間〜 2週間で ある。 培養は、 通常 5%炭酸ガス下で行われる。 ハイプリ ドーマ培養上清の抗体 価は、 上記の抗血清中の抗メグー 4抗体価の測定と同様にして測定できる。 クロ 一二ングは、 通常半固体ァッガ一法や限界希釈法などのそれ自体公知の方法で行 うことができ、 クローン化されたハイプリ ドーマは、 好ましくは無血清培地中で 培養され、 至適量の抗体をその上清に与える。 目的のモノクローナル抗体は好ま しくは腹水化して得ることもできる。

本発明によるモノクローナル抗体は、 メグ一 4に特異的なェピトープを認識す るものを選択することによって他のタンパク質と交差しないものとすることがで きる。 一般的に、 そのタンパク質を構成するアミノ酸配列の中から、 連続する少 なくとも 7以上のァミノ酸残基、 望ましくは 10-20アミノ酸のァミノ酸配列によ つて提示されるェピトープは、 そのタンパク質に固有のェピト一プを示すといわ れている。 したがって、 配列番号： 2に記載されたアミノ酸配列から選択され、 かつ連続する少なくとも 7アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を持つぺプチドに よって構成されるェピトープを認識するモノクローナル抗体は、 本発明における メグ一 4特異的なモノクローナル抗体といえる。

抗メグー 4モノクローナル抗体の分離精製は通常のポリクロ一ナル抗体の分離 精製と同様に免疫グ口ブリンの分離精製法に従って行われる。 公知の精製法とし ては、 例えば、 塩析法、 アルコール沈殿法、 等電点沈殿法、 電気泳動法、 イオン 交換体 （例えば DEAE) による吸脱着法、 超遠心法、 ゲル濾過法、 抗原結合固相ま たはプロティン Aまたはプロテイン Gなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、 結合を解離させて抗体を得る特異的精製法のような手法を示すことができる。 このようにして得られたメグ一 4を認識する本発明によるモノクローナル抗体 並びにポリクロ一ナル抗体は、 メサンギゥム細胞に関連する疾病の診断や治療に 利用することが可能である。 これらの抗体を用いてメグ一 4を測定する方法とし ては、 不溶性担体に結合させた抗体と標識化抗体とによりメグ— 4を反応させて 生成したサンドィツチ錯体を検出するサンドィツチ法、 また、 標識ヒト ·メグ一 4と検体中のヒト由来メグ— 4を抗体と競合的に反応させ、 抗体と反応した標識 抗原量から検体中のヒト由来メグ— 4を測定する競合法等を示すことができる。 サンドイッチ法によるメグー4の測定においては、 まず、 固定化抗体とメグ一 4とを反応させた後、 未反応物を洗浄によって完全に除去し、 標識化抗体を添加 して固定化抗体一メグー 4標識化抗体を形成させる 2ステップ法、 もしくは固定 化抗体、 標識化抗体およびメグ一 4を同時に混合する 1ステップ法などを用いる ことができる。

測定に使用される不溶性担体は、 例えばポリスチレン、 ポリエチレン、 ポリプ ロピレン、 ポリ塩化ビニル、ポリエステル、ポリアクリル酸エステル、ナイロン、 ポリァセタール、フッ素樹脂等の合成樹脂、セルロース、ァガロース等の多糖類、 ガラス、 金属などが挙げられる。 不溶性担体の形状としては、 例えばトレィ状、 球状、 粒子状、 繊維状、 棒状、 盤状、 容器状、 セル、 試験管等の種々の形状を用 いることができる。 抗体を吸着した担体は、 適宜アジ化ナトリウム等の防腐剤の 存在下、 冷所に保存する。

抗体の固相化は、 公知の化学結合法又は物理的吸着法を用いることができる。 化学的結合法としては例えばグル夕ルアルデヒドを用いる方法、 N-スクシニイミ ジル- 4- (N-マレイミ ドメチル） シクロへキサン-卜カルボキシレート及び N-スク シニイミジル- 2-マレイミ ドアセテートなどを用いるマレイミ ド法、 卜ェチル- 3 - (3 -ジメチルァミノプロピル） カルボジィミ ド塩酸などを用いるカルボジィミ ド 法が挙げられる。その他、マレイミ ドベンゾィル -N-ヒドロキシサクシニミ ドエス テル法、 N-サクシミジル- 3- (2-ピリジルジチォ） プロピオン酸法、 ビスジァゾ化 ベンジジン法、 ジパルミチルリジン法が挙げられる。 あるいは、 先に被検出物質 とェピト一プの異なる 2種類の抗体を反応させて形成させた複合体を、 抗体に対 する第 3の抗体を上記の方法で固相化させておいて捕捉することも可能である。 標識物質は、 免疫学的測定法に使用することができるものであれば特に限定さ れない。 具体的には、 酵素、 蛍光物質、 発光物質、 放射性物質、 金属キレート等 を使用することができる。好ましレ、標識酵素としては、例えばペルォキシダ一ゼ、 アルカリフォスファターゼ、 5 -D-ガラクトシダ一ゼ、リンゴ酸デヒドロゲナ一ゼ、 プドウ球菌ヌクレア一ゼ、 デル夕- 5-ステロイ ドイソメラ一ゼ、 ひ-グリセロール ホスフヱートデヒドロゲナ一ゼ、 トリオ一スホスフヱ一トイソメラーゼ、 西洋わ さびパーォキシダ一ゼ、 ァスパラギナ一ゼ、 グルコースォキシダ一ゼ、 リボヌク レア一ゼ、 ゥレア一ゼ、 力夕ラーゼ、 グルコース一 6—ホスフエ一トデヒドロゲナ —ゼ、 グルコアミラ一ゼ、 およびアセチルコリンエステラーゼ等が挙げられる。 好ましい蛍光物質としては、 例えばフル才レセインイソチアネート、 フィコピリ プロテイン、 ローダミン、 フィコエリ トリン、 フィコシァニン、 ァロフィコシァ ニン、 およびオルトフタルアルデヒド等が挙げられる。 好ましい発光物質として はイソルミノール、 ルシゲニン、 ルミノール、 芳香族ァクリジニゥムエステル、 イミダゾール、 ァクリジニゥム塩及びその修飾エステル、 ルシフェリン、 ルシフ エラ一ゼ、 およびェクオリン等が挙げられる。 そして好ましい放射性物質として は、 ¹²⁵ I、 ¹²⁷I、 ¹³¹ I、 ¹⁴C、 ¾、 ³²Ρ、 あるいは³⁵ S等が挙げられる。

前記標識物質を抗体に結合する手法は公知である。 具体的には、 直接標識と間 接標識が利用できる。 直接標識としては、 架橋剤によって抗体、 あるいは抗体断 片と標識とを化学的に共有結合する方法が一般的である。 架橋剤としては、 Ν, Ν' -オルトフェニレンジマレイミ ド、 4- (Ν-マレイミ ドメチル） シクロへキサン酸 . N -スクシンィ ミ ドエステル、 6-マレイ ミ ドへキサン酸 · N-スクシンィ ミ ドエステ ル、 4，4' -ジチオビリジン、 その他公知の架橋剤を利用することができる。 これら の架橋剤と酵素および抗体との反応は、 それぞれの架橋剤の性質に応じて既知の 方法に従って行えばよい。 この他、 抗体にピオチン、 ジニトロフエニル、 ピリ ド キサール又はフルォレサミンのような低分子ハプテンを結合させておき、 これを 認識する結合成分によって間接的に標識する方法を採用することもできる。 ピオ チンに対してはアビジンゃストレプ卜アビジンが認識リガンドとして利用される 一方、 ジニトロフヱニル、 ピリ ドキサール又はフルォレサミンについては、 これ らのハプテンを認識する抗体が標識される。 抗体を標識する場合、 西洋わさびべ ルォキシダーゼを標識化酵素として用いることができる。 本酵素は多くの基質と 反応することができ、 過ヨウ素酸法によって容易に抗体に結合させることができ るので有利である。 また、 抗体としては場合によっては、 そのフラグメント、 例 えば Fab'、 Fab, F (ab' ) ₂を用いる。 また、 ポリクロ一ナル抗体、 モノクローナ ル抗体にかかわらず同様の処理により酵素標識体を得ることができる。 上記架橋 剤を用いて得られる酵素標識体はァフィ二ティ一クロマトグラフィ一等の公知の 方法にて精製すれば更に感度の高い免疫測定系が可能となる。 精製した酵素標識 化抗体は、 防腐剤としてチメロサール（Thimerosal )等を、 そして安定剤としてグ リセリン等を加えて保存する。 標識抗体は、 凍結乾燥して冷暗所に保存すること により、 より長期にわたって保存することができる。

標識化剤が酵素である場合には、 その活性を測定するために基質、 必要により 発色剤が用いられる。 酵素としてペルォキシダ一ゼを用いる場合には、 基質溶液 として ¾0₂を用い、発色剤として 2, 2， -アジノ-ジ- [3-ェチルベンズチアゾリンス ルホン酸]アンモニゥム塩 （ABTS)、 5-ァミノサリチル酸、 オルトフエ二レンジァ ミン、 4-ァミノアンチピリン、 3，3，，5, 5，-テトラメチルベンジジン等を使用する ことができる。 酵素にアルカリフォスファターゼを用いる場合は、 基質としてォ ルトニトロフエニルフォスフエ一ト、 パラ二トロフエニルリン酸等を使用するこ とができる。酵素に 3 -D-ガラク トシダ一ゼを用いる場合は基質としてフルォレセ イン-ジ- （ 5 -D-ガラクトビラノシド）、 4-メチルゥンベリフエニル- 5 -D-ガラク トピラノシド等を使用することができる。 本発明は、 また、 前述のモノクローナ ル抗体、 あるいはポリクロ一ナル抗体を標識して、 あるいは固相化してメグ一 4 の免疫学的測定用試薬としたもの、 更にはこの試薬に標識検出用の指示薬や対照 試料等をキット化したのものをも含むものである。

本発明におけるメグ一 4の測定対象は、 血漿、 血清、 血液、 尿、 組織液、 ある いは脳脊髄液等の体液等、 メグ— 4、 あるいはメグ一 4の前駆体や断片を含む生 体試料であれば限定されない。

加えて本発明は、 メグ一 4遺伝子の発現レベルを変化させたトランスジェニッ ク非ヒト脊椎動物に関する。 ここでメグ一 4遺伝子とは、 メグ一 4をコードする cDNA、 ゲノム DNAあるいは合成 DNAを含む。 また、 遺伝子の発現には、 転写と翻 訳のいずれのステップも含まれる。 本発明によるトランスジエニック動物は、 メ グー 4の機能あるいは発現調節の研究、 ヒトのメサンギゥム細胞に関連する疾患 のメカニズムの解明、 医薬品のスクリーニング ·安全性に用いる疾患モデル動物 の開発に有用である。

本発明においては、 メグー 4遺伝子の発現を正常に調節しているいくつかの重 要な部位 （ェンハンサ一、 プロモーター、 イントロン等） の一部に欠失、 置換、 挿入などの変異を起こさせることにより、 本来の遺伝子の発現レベルと比較して 人工的に上昇または下降するように修飾することができる。 このような修飾は、 メグ— 4遺伝子の転写の調節である。 一方、 ェキソンの一部を欠損させたり、 翻 訳領域への点突然変異の導入により終止コドンへ置換することにより、 タンパク 質への翻訳を修飾することもできる。 この変異の導入は、 公知の方法により行う ことができ、 トランスジエニック動物を得ることができる。

卜ランスジエニック動物とは狭義には遺伝子組換えにより、 外来遺伝子が生殖 細胞に人為的に導入された動物のことをいい、 広義にはアンチセンス RNAを用い て特定の遺伝子の機能を抑えたアンチセンス · トランスジヱニック動物や、 胚性 幹細胞 （ES細胞） を用いて特定の遺伝子をノックアウトさせた動物、 点突然変異 DNAを導入した動物を含み、 個体発生の初期に外来遺伝子が安定して染色体に導 入され、 その子孫に遺伝形質として伝達され得る動物のことをいう。 本明細書中 でいう トランスジエニック動物とはヒト以外のすべての脊椎動物を含む。

トランスジヱニック動物の作製方法は、 遺伝子と卵を混合させてリン酸カルシ ゥムで処理する方法や、 位相差顕微鏡下で前核期卵の核に、 微小ピぺッ卜で遺伝 子を直接導入する方法 （マイクロインジェクション法、 米国特許第 4873191号）、 胚性幹細胞 （ES細胞） を使用する方法などがある。 その他、 レ トロウイルスべク 夕一に遺伝子を挿入し、 卵に感染させる方法、 また、 精子を介して遺伝子を卵に 導入する精子べクタ一法等が開発されている。 精子べクタ一法とは、 精子に外来 遺伝子を付着またはエレクト口ポレーション等の方法で精子細胞内に取り込ませ た後に、 卵子に受精させることにより、 外来遺伝子を導入する遺伝子組換え法で ある (M. Lavitranoet ら Cell , 57, 717, 1989)。

あるいはバクテリオファージ PIの cre/loxPリコンビナ一ゼ系ゃ Saccharomyce s cerevisiaeの FLPリコンビナ一ゼ系等の in vivoにおいて部位特異的遺伝子組 み換えを用いることもできる。 また、 レトロウイルスを使用して、 非ヒト動物へ 目的タンパク質のトランスジーンを導入する方法も報告されている。

マイクロインジェクション法によるトランスジエニック動物作製方法は、 例え ば以下に示すようにして行われる。 まず、 発現制御に関わるプロモーター、 特定 のタンパク質をコードする遺伝子、 ポリ Aシグナルから基本的に構成されるトラ ンスジーンが必要である。 プロモーター活性により特定分子の発現様式や発現量 が左右され、 また、 導入トランスジーンのコピー数や染色体上の導入部位により 作製されたトランスジヱニック動物は系統間で異なるため、 各系統間で発現様 式 ·発現量を確認する。 非翻訳領域ゃスプライシングにより発現量が変化するこ とが判明しているため、 予めポリ Aシグナルの前にスプライシングされるィント ロン配列を導入してもよい。 受精卵に導入する遺伝子はできるだけ純度の高いも のを使用することが重要である。使用する動物としては、 受精卵採取用マウス （5 〜6週齢)、 交配用雄マウス、 偽妊娠雌マウス、 輸精管結紮雄マウス等が用いられ る。

効率よく受精卵を得るために、ゴナドトロピン等により排卵を誘発してもよい。 受精卵を回収し、 マイクロインジェクシヨン法にて卵の雄性前核にィンジヱクシ ヨンピぺット中の遺伝子を注入する。 注入した卵を輸卵管に戻すための動物（偽 妊娠雌マウス等） を用意し、 一匹に対して約 10〜15個を移植する。 その後、 誕生 したマウスにトランスジーンが導入されているか否か、尾の先端部からゲノム DN Aを抽出し、 サザン法あるいは PCR法により トランスジーンを検出するか、 ある レ、は相同組み換えが起こったときのみに活性化するマ一力一遺伝子を挿入したポ ジティブクロ一ニング法により選択することができる。 さらに、 トランスジーン の発現を確認するため、ノザン法もしくは RT-PCR法により トランスジーン由来転 写産物を検出する。 または、 タンパク質に対する特異的抗体によって、 ウェス夕 ンブロッテイング法による検出も可能である。

本発明のノックアウトマウスは、 マウスメグ— 4遺伝子の機能が失われるよう に処理されたものである。 ノックァゥトマウスとは相同組換え技術で任意の遺伝 子を破壊し、 機能を欠損させたトランスジエニックマウスをいう。 胚性幹細胞を 用いて相同組換えを行い、 一方の対立遺伝子を改変 ·破壊した胚性幹細胞を選別 し、 ノックアウトマウスを作製することができる。 例えば、 受精卵の胚盤胞や 8 細胞期胚に遺伝子を操作した胚性幹細胞を注入して、 胚性幹細胞由来の細胞と胚 由来の細胞が混ざったキメラマウスを得る。 このキメラマウス （キメラとは、 2 個以上の受精卵に基づいた体細胞で形成される単一個体をいう） と正常マウスを 交配すると、 一方の対立遺伝子の全てが改変 ·破壊されたへテロ接合体マウスを 作製することができる。 さらに、 ヘテロ接合体マウス同士を交配することで、 ホ モ接合体マウスが作製できる。 本発明によるトランスジエニック動物は、 これら 口接台体と、 ホモ接合体のいずれをも含むものである。

相同組換えとは、 遺伝子組換え機構で塩基配列が同じ、 または非常に類似して いる 2つの遺伝子間で起こる組換えのことをいう。 相同組換えを起こした細胞の 選別には PCRを使用することができる。 挿入遺伝子の一部と挿入が期待される領 域の一部をプライマ一として使つた PCR反応を行い、 増幅産物ができた細胞で相 同組換えを起こしていることが判明する。 また、 胚幹細胞で発現している遺伝子 に相同組み換えを起こさせる場合には、 導入遺伝子にネオマイシン耐性遺伝子を 結合させておき、 導入後に細胞をネオマイシン耐性にさせることにより選択する ことができる等、 公知の方法およびそれらの変法を用いて容易に選択することが できる。 図面の簡単な説明

図 1は、 メグ一 4の PSORT I I (PSORT WWW Server, http://psort. nibb. ac. jp: 8800/)によるモチーフ検索の結果をまとめた図である。 DNAの塩基は、 翻訳開始 位置を 1として示した。

図 2は、 メグ— 4ぺプチド抗体によるウエスタンブロッ ト解析の結果を示す写 真である。 各レーンは、 次の抗原に対応している。 Mは分子量マーカーを示す。 レーン 1 ： MBP発現大腸菌の細胞破砕液 （抗メグ— 4ぺプチド I g G )

レーン 2 ： MBP-メグー 4発現大腸菌の細胞破砕液 （抗メグ— 4ぺプチド I g G ) レーン 3 ：発現大腸菌の細胞破砕液 （正常ゥサギ I g G )

レーン 4 ： MBP-メグ— 4発現大腸菌の細胞破碎液 （正常ゥサギ I g G )

図 3は、 メグ— 4 c D N Aをプローブとする F I S H法による染色体の解析結 果を示す蛍光顕微鏡写真である。 白い矢印で示した部分が、 メグ一 4 c D N Aに よつて検出されたシグナルである。

図 4は、 メグ一 4遺伝子の局在部位である lOpll .23- 12. 1.の位置を示すイデォ グラムである。 いずれのィデォグラムも国際命名法に基づいてレ、る。 発明を実施するための最良の形態

以下本発明を実施例として更に具体的に説明するが、 本発明は該実施例に限定 されるものではない。

[実施例 1 ] ヒトメサンギゥム細胞の初代培養

58才の男性から摘出した正常なヒト腎臓から、 ヒト糸球体腎臓メサンギゥム細 胞を単離した。 腎皮質を、 無菌条件下で分離し、 細分化し、 いくつかの篩を通過 させた。 用いる篩は、 段階的に孔径を小さくしていった。 75〜200 /mの孔径の篩 に捕捉された糸球体を、 洗浄し、 100〃g/ml のコラゲナ一ゼ （Washington Biochemical社製）と共に 37°Cで 20分間ィンキュベ一トした。洗浄後、糸球体を、 25mM HEPESヽ 10% Nu-serum (Collaborative Biomedical Products社， Bedford, MA) および抗生物質 （10〃g/mlのペニシリン、 ストレプトマイシン、 およびファ ンギゾン） を含む培地 199 (Gibco BRL社， Gaithersburg， MD) に再懸濁させ、 5% (¾₂ィンキュベー夕一内でィンキュベ一トした。 3継代目に、メサンギゥム細胞を、 典型的な形態学的特徴、 トリプシン、 ピュ一ロマイシンおよび D-パリンに対する 耐性、 ァクチン (Zymed Laboratories ¾：, San Francisco, CA)_X ォ几 VLA( very late antigen)- 1, 3， 5 ( Immunotech) の免疫染色に対して陽性を示すこと、 ならびに第 VI I I因子（Dako社， CA) の免疫染色に陰性を示すことなどの一連の基準により同 定した。

[実施例 2 ] ヒト培養メサンギゥム細胞からの mRNAの単離

6継代目に、 グァニジンイソチオシァネート （GTC)法を用いて、 全 MAをヒト メサンギゥム細胞から単離した。 即ち、 実施例 1の細胞の血清を含む培養液中の メサンギゥム細胞コンフルェント培養物をリン酸緩衝生理食塩水 (PBS)で洗浄し、 o.5mM GTC溶液中で溶解させた。 DNAは 18ゲージの針を通過させることにより除 去した。 核およびその他の細胞破片は 5，000 x gで 90秒間遠心分離することによ り沈殿させた。上清をセシウムトリフルォロアセテート （CsTFA)層に注意深く載 せ、 15。C、 125，000 x gで 24時間遠心分離した。 RNAペレットを TEバッファ一に 溶解させた。オリゴ dTセルロースカラム（フアルマシア社）により、 poly(A)+RNA を分離した。

[実施例 3 ] 3'領域 cDNAラィブラリ一の構築

poly(A)⁺RNAを錶型として、 pUC19を基礎とするベクタ一プライマ一 [Norrander J.，et al .，Gene，26, l(U- 106 ( 1983 ) ]を用いた cDNA合成を行った。このべクタ一プ ライマ一 DNAは、 Hind i末端、 および Tテールをもつ Pstl末端を有し、 Mbol部 位（GATC)でダム ·メチル化（dam- methylated) されていた。第 2鎖の合成の後、 cDNA配列、 およびべクタ一の lacZ遺伝子内の単一 BamHI部位を、 それぞれ bol および BamHIで切断し、 次に、 低 DNA濃度で環状化およびラィゲーシヨンを行つ た。 ライゲ一シヨン混合物のうちの一部を大腸菌に形質転換した。 得られた形質 転換体をランダムに選択し、 簡単に加熱することにより個別に溶解させた。 cDNA 揷入配列を、 PUC19 ク ロ ーニ ン グサイ 卜 に隣接す る プラ イ マー ( 5' -TGTAAAACGACGGCCAGT-3' / 配 列 番 号 ： 3 お よ び 5， -ACCATGATTACGCCAAGCTTG-3' /配列番号： 4 ) を用いたペア一ド PCRにより増幅 させた。 得られた短い二本鎖 DNAを、 サイクル配列決定反応に用い、 自動配列決 定機で解析した。

[実施例 4 ] メサンギゥム細胞で特異的に発現している遺伝子の単離

メサンギゥム細胞で特異的に発現している遺伝子を同定するため、本発明者は、 大規模な DNA配列決定およびコンピュータによるデ一夕処理を行った。 このこと により、 様々な異なる細胞および臓器における転写産物を同時に比較することが できた （Y. Yasuda et al . , Kidney Internatinal 53 : 154-158, 1998; K. Matsubara et al . , Gene . 135 , 265 ( 1993 ) ; K. Okubo et al " Nat. Gen. 2, 173 ( 1992 ) )。 ヒト培養メサンギゥム細胞の 3'領域 cDNAラィブラリ一の大規模 DNA配列決定を 行い、 ランダムに選択した 1836個のクローンの部分配列を決定した。クローンの 配列相同性を、 相互に比較し、 さらに FASTAプログラムを用いて DNAデータバン ク GenBankと比較した。様々な臓器および細胞からの m Aをドットプロット解析 することにより、 メサンギゥム細胞で特異的に発現しているクローンが選択され た。その結果、本発明者のメサンギゥム細胞 cDNAライブラリーにおいてきわめて 高い頻度で検出されるいくつかのクローンが得られた。

[実施例 5 ] ヒト 'メサンギゥム細胞人 ZIPLox cDNA ライブラリーのスクリ一二 ング

実施例 2にしたがって調製した全 mRNAから、 オリゴ dTプライマーとランダム プライマ一とを用いて入 ZIPLox cDNA ライブラリ一を合成した。 ライブラリ一の 合成には市販の人 ZIPLox (Gibco BRL社製、 商品名人 ZIPLox EcoRI Arms) を利 用した。実施例 4で得たメサンギゥム細胞 cDNAラィブラリ一で特に高頻度に検出 される特定のクローンについて、そのィンサ一トをプローブとして、この入 ZIPLox cDNAライプラリーをスクリーニングした。 ポジティブクローン （2クローン） に ついて、 挿入された遺伝子断片の塩基配列をジデォキシ夕一ミネ一シヨン法によ り決定した。

配列決定の結果、 単離された 2つのクローンのうちの 1つは 0RF の一部と 3' UTR- poly(A)を含み、 もう一つが 0RFの一部と 5， UTRを含むものであった。両者 の塩基配列は一部で重複しており、 ァライメントにより配列番号： 1に示す塩基 配列を cDNAの塩基配列として決定した。 また、 この cDNAの塩基配列において最 も長い 0RFに基づく 7 7 3アミノ酸残基を遺伝子産物の推定アミノ酸配列とした。 このアミノ酸配列を持つタンパク質を本発明者はメグ一 4 (Meg- 4)と名づけた。 [実施例 6 ] メサンギゥム特異的遺伝子の機能解析 （1)

SwissProtデ一夕ベースで FASTAプログラムによりアミノ酸ホモロジ一検索を 行ったところ、 このメグ一 4が新規なタンパク質であることを確認した。 またホ モロジ一を持つタンパク質としては、マウスの ATP- MPが確認された。メグ一 4と ATP-MPは、 ァミノ酸配列において 89.8% cDNAの塩基配列においては 81 , 7%のホ モロジ一を持つ。また ATP- MPのアミノ酸配列における 5 5 - 5 8位に対して、メ グー 4では 5 8ァミノ酸残基（5 6— 1 1 5 ) が挿入されていた。 ATP- MPはマウ スにおけるメグ一 4のホモログであることが推測された。

続いてメグ— 4のアミノ酸配列をモチーフ検索した。 検索には、 PSORT 画 Server(http： //psort . nibb. ac. jp： 8800/ )を利用した。検索結果を図 1にまとめた _c 図 1に示すように、メグ一 4は AAAタンパク質フアミリー（S.Patel，M.Latterich, trends in CELL BIOLOGY, Vol , 8, 65-71, 1998)のモチーフを含んでいることが明ら かとなつた。 具体的には、 以下の部分に AAAタンパク質ファミリーに共通の複数 のモチーフの存在が確認された。

3 7 9 - 3 8 6 ： ATP結合モチーフ

4 7 6 - 4 9 4 ：最小 AAAタンパク質モチーフ

4 3 4 - 4 3 8 ： walker Bモチーフ

6 0 0 - 6 0 3 ： Zn結合モチーフ

また、 これらの事実に基づいて、 上記推定アミノ酸配列がメグ— 4のアミノ酸 配列であることが確認された。

Aタンパク質に特徴的な AAAモチーフは、 植物、 バクテリア、 そして哺乳類 と多くの種属で保存されたアミノ酸配列である。 そのため、 AAA タンパク質ファ ミリーは基本的な細胞機能を支える重要な機能を持ったタンパク質であると推測 される。 したがって前記のような特性を持つメグ一 4がメサンギゥム細胞で高度 に発現しているということは、 このタンパク質が腎臓細胞の形態や機能維持に重 要な役割を果たしていることを示唆している。 一方、 腎メサンギゥム細胞ではいくつかのプロテア一ゼが産生されており、 そ れらが細胞機能の一部を担っていると考えられる。 メグ— 4は、 その遺伝子構造 の特性からプロテアーゼ活性を有する可能性が考えられる。 この事実も、 腎メサ ンギゥム細胞の生理や病態生理にメグ— 4が深く関与する可能性を示している。

AAA タンパク質としては、 ヒ トではミ トコンドリア ' メタ口プロテア一ゼ (Casari G.etal. Cell, Vol.93,973-983, 1998)が報告されているが、 メグ一 4とは AAA タンパク質モチーフ以外に相同性がほとんどみられない。 その他、 原核細胞 ( E.coli ) に 由 来 す る FtsH ( Santos and Almeida, J.Bacteriol.124, 1502-1507， 1975)や、 酵母（S. cerevisiae)から単離された YMEKThorsness P.E., Mol.Cell Biol.5418- 5426, 1993)も AAAタンパク質として 報告されている。 メグ一 4は、 これらのタンパク質のヒトにおけるホモログの一 つと言うこともできる。 しかしいずれのタンパク質に対しても、 アミノ酸配列上 では AAAモチーフ以外では相同性の有る配列を見出すことはできない。

[実施例 7] メグ— 4の機能解析 （2) —組織分布

メグ— 4のノーザンブロヅ 卜解析は、 以下のようにして行った。 3'領域 cDNA ライブラリ一 （実施例 3) のポジティブクローンのインサートを、 ランダム MA ラベリングによって RI標識しプローブとして用いた。試料として以下の細胞から 単離した poly(A)+RNA (2 ig) を、 2.2Mホルムアミ ドを含む 1%ァガロースゲル で分離し、 ニトロセルロースフィル夕一へ転写した。 フィルターを Rapid Hyb溶 液 （Amersham社， Arlington Heights, IL) 中でハイブリダィズさせた。 ハイブ リダィズ後に、 60°Cで、 0.1xSSPE/0.1%SDSという最終ストリンジヱンシ一で洗 浄した。

ヒトの複数の初代培養細胞および組織のノーザンプロット、 ヒトの癌細胞株の ノーザンブロットのための試料は、 Clontech (Palo Alto, CA) から購入した。 初 代培養細胞としては、 メサンギゥム細胞、 ヒト皮膚上皮細胞、 ヒト腎皮質上皮細 胞、 ヒト臍帯静脈内皮細胞、 およびヒ ト平滑筋細胞の初代培養細胞由来の 2 zg の poly(A)⁺RNAを試料とした。 ヒトの癌細胞株のノーザンプロットには、 前骨髄 球白血病 HL- 60、 HeLa細胞 S3、慢性骨髄性白血病 K- 562、リンパ芽球白血病 MOLT- 4、 Burkittリンパ腫 Raj i、 大腸腺癌 SW480, 肺癌 A549、 および黒色腫 G361由来の 2 〃gの poly(A)⁺RNAを試料とした。組織のノーザンブロッ卜には、 心、 脳、 胎盤、 肺、 肝、 骨格筋、 腎、 および脬由来の 2 /gの poly(A) NAを試料とした。 ハイブ リダイゼ―ションおよび洗浄は上記と同様にして行った。 結果は表 1― 3に示す とおりである。

表 1

初代培養細胞

メサンギゥム細胞

ヒト皮膚上皮細胞 + +

ヒト腎皮質上皮細胞 +

ヒト臍帯静脈内皮細胞 士

ヒト平滑筋細胞 士

表 2

ヒト癌細胞株

前骨髄球白血病 HL-60 士

HeLa細胞 S3 +

慢性骨髄性白血病 K- 562 +

リンパ芽球白血病 MOLT - 4 士

Burkittリンパ腫 Raj i

大腸腺癌 SW480 +

肺癌 A549 +

黒色腫 G361 表 3

ヒ ト組織

心 +

脳 +

胎盤 +

肺 土

肝

骨格筋 + +

腎 +

脬 +

メグ— 4 cDNA プローブを用いたノーザンブロット解析で、 メサンギゥム培養 細胞に単一の転写産物 （約 4kb) が検出された。 組織間の比較においては、 ヒト の腎、 心、 脳、 胎盤、 骨格筋、 あるいは滕等の組織で発現が観察され、 肺と肝に おいては発現が弱く、 逆にメサンギゥム細胞で特に高度に発現していることが確 認された。 培養癌細胞株においては顕著な発現は観察されなかった。

[実施例 8 ] メグ— 4フエノ夕ィプの解析

実施例 6において、 本発明のメグ一 4タンパク質が、 AAA タンパク質の一つと して報告された大腸菌 FtsHや酵母 YME 1Lのヒ トにおけるホモログである可能性を 指摘した。 ところが、本出願の出願後にヒト FtsHとして報告されたアミノ酸配列 (AF070656 )は、 メグ一 4の 2 2 5位の Metから開始していた。 更にその 3'末端に おいては翻訳フレームがずれていた。 また、 やはり本出願の出願後に報告された マウス FtsHのアミノ酸配列の 5 5 - 5 8位に相当する領域 sse- PV- lnlrにおいて、 本発明のメグ— 4では 5 9ァミノ酸の挿入と置換 sse- (59aaの揷入と置換）- lnlr が見られた。 これらの情報に基づいて、 ヒトにおけるメグ一 4のフエノタイプの 単離を試みた。

すなわち、 実施例 5で得たヒト ·メサンギゥム細胞人 ZIPLox cDNA ライブラリ —をテンプレートとして、次のプライマ一セヅトを用いて PCR法による cDNAの増 幅を行った。 このプライマ一セッ トは、 メグ一 4のアミノ酸配列 （配列番号： 2 ) における 5 6〜1 1 6位をコードする塩基配列の増幅を行うように設計されてい る。

センスプライマ一（5，- end )

5， -atgttttcct tgtcgagcac ggtgcaaccc c—3， /西己列番号： 5

アンチセンスプラィマ一（AS754 )

5' -tctcggaggt agactggaga cgtcgtgtcc t一 3， _/ /酉己歹 U番号： 6

その結果、 得られた増幅生成物に、 配列番号： 7に示す塩基配列からなる cDNA の存在が確認された。 この塩基配列によってコードされる推定アミノ酸配列を配 列番号： 8に示した。 配列番号： 8のアミノ酸配列では、 メグ— 4の 5 6〜1 1 6位に相当する領域のアミノ酸配列が sse- PS- lnlrとなっていた。 更に、 本願の 出願後に報告された ヒ ト YMElL(Homo sapiens mRNA for ATP- dependent metal loprotease YMEIL . )のアミノ酸配列（AJ132637)は、 配列番号： 2に示すメグ —4と 9 8 . 3 %の相同性を持ち、 配列番号： 8における 5 5 - 5 8位に相当する 部分のァミノ酸配列が sse- PS- lnlrであることが明らかとなった。 これらの知見 をまとめると、 一連のアミノ酸配列の関係を、 次のように示すことができる。 配列番号： 2 (メグ— 4 ) sse- - -59aa- -lnlr

マウス FtsH sse- PV -lnlr

配列番号： 8 (メグ一 4フヱノタイプ） sse- PS - lnlr

ヒト YME1L(AJ132637) sse- PS - lnlr

以上のことから、 本発明のヒト ·メグ一 4は、 YME1L と同様の機能を持つこと が推定される。

[実施例 9 ] メグ— 4の合成べプチドに対するポリクローナル抗体の製造 他の AAAフアミリーとの相同性が低く、 かつ親水性を有する領域を免疫原とし て利用し、 メグ— 4に対するポリクロ一ナル抗体を製造した。 以下のアミノ酸配 列からなるぺプチドの N末端または C末端にシスティンを含有するべプチドを固 相ぺプチド法により合成した。

N末端からの位置 ァミノ酸配列

574-593 KDKILMGPERRSVEIDNKNK (配列番号： 9 )

各合成ペプチドとアジュバン卜 （D i f c o製） と充分混和し乳化させ、 ゥサ ギ皮下に投与した。 初回免疫 （2 0〃g/羽） 後 3週間後に 2回目 （5 0 /g/羽） の免疫を行い、 以後 2週間毎に 4回免疫 （5 0、 1 0 0、 2 0 0 /g/羽） を行つ た。 アジュバントは初回のみフロインド完全アジュバントで、 2回目以降はフロ ィンド不完全アジュバントを用いた。 4 1日後、 5 5日後、 採血で得た血清が合 成ペプチドと反応することを確認するため、 血清の抗体価を酵素免疫測定法 （E L I S A) により評価した。 抗原 5 0 ng/well を固相化した 9 6穴プレートに連 続的に希釈した抗血清を各ゥエルに 1 0 0〃L 加えて一次反応を行い、 洗浄後、 二次反応として H R P結合ャギ抗ゥサギ I g G (カッペルプロダクト製） を反応 させた。 洗浄後、 基質としてオルトフエ二レンジァミン （和光純薬製） を加えて 発色させ吸光度 4 9 2 nmで測定し、 抗体価が上昇していることを確認した。

[実施例 1 0 ] メグ一 4の合成ペプチドに対するポリクロ一ナル抗体の精製法 メグー4の合成ペプチドに対するポリクロ一ナル抗体は、 公知の方法 （細胞ェ 学別冊 実験プロトコールシリーズ 抗ペプチド実験プロトコ一ル、 秀潤社） に 従ってァフィ二ティクロマトグラフィーにより精製した。 操作は、 次のとおりで ある。

すなわち、 メグ一 4を免疫し抗体価の上昇したゥサギ血清を P B S (—） で希 釈したのち、 IgG精製用 protein Gカラムを用いてァフィ二ティ一精製した。 得 られた精製抗体はウエスタンプロットによりメグー 4夕ンパク質融合夕ンパク質 と反応することを確認し、メグ一 4に特異的であることを証明した（実施例 1 1 )。

[実施例 1 1 ] ゥサギポリクローナル抗メグ— 4ぺプチド I g Gの反応性の検討 M B P—メグ— 4、 並びに MBP単独発現大腸菌破砕液を抗原として用い、 メグ 一 4ぺプチドを免疫原とするゥサギ I gGの反応性を確認した。 MBP—メグ— 4は次のように調製した。 すなわち、 まず配列番号： 1に示すメグシン遺伝子の 塩基配列に基づいてそのコード領域を P C Rによって増幅した。この増幅産物を、 マルトース結合タンパク質融合タンパク質発現用べクタ一、 pMAL- c (New England B io lab社）に組み込むことによって M B Pとメグシンタンパク質との融合タンパ ク質を発現するベクターを得た。 このベクターで大腸菌を形質転換し、 その細胞 破壊液を MB P—メグ一 4とした。

それぞれのタンパク質溶液を等量のサンプルバッファ一（0.25%トリスー H Cl、 2%SDS、 30%グリセリン、 10% ?_メルカプトエタノール、 0. 025%プロモフヱノールブルー） （第一化学薬品製）で処理し、 5分間 100°C で加熱して試料とした。 得られた試料を、 ゲル濃度 4— 20%のグラジェントゲ ル （第一化学薬品製） を用いて SDS—ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動法 （S DS— PAGE) (Lae画 li,U.K.， Nature,第 227卷， 680- 685頁， 1970年） によ り分離した。

SD S— PAGEで分離したタンパク質を、 プロッティング溶液（25mMトリ ス一 HC 1、 192mM グリシン、 20%メタノール、 pH 8.3)を用いて 10 0Vの定電圧で 1時間、 ポリビニリデンジフルオリ ド （PVDF)膜 （バイオ ' ラッド製） にプロヅティングした。 ブロヅティングした P VD F膜を蒸留水で洗 浄後、 5%ブロックエースの TTBS溶液中で 3時間ブロッキングした。 次に、 ? 0 膜を丁丁83 (20mMトリス、 500mMの NaCl、 0. 05 %Twe en20、 pH7.5)で洗浄した後、 T T B Sで希釈した 1次抗体であるゥサギ ポリクロ一ル抗メグ— 4ペプチド I gGの溶液と 4 °Cで一夜反応させた。 次に、 アンプリファイ ドアルカリフォスファターゼィミユンプロヅトキット （バイオ · ラッ ド製） を用いて検出した。 すなわち、 TTBSで希釈したピオチン標識ャギ 抗ゥサギ I gGと室温で 1時間ィンキュベートした後、 あらかじめ室温でストレ プ卜アビジンとピオチン標識アル力リフォスファタァーゼを 1時間ィンキュベー トして調製したストレブトアビジン一ピオチン標識アル力リフォスファタァーゼ のコンプレックスを反応させた。 0 膜を1¹ 1¹ 8 3で洗浄し、 基質 （nitro blue tetrazoliumと 5 - bromo- 4 - chloro - 3 - indolyl phosphate, p - toluidine塩の 溶液） と室温で約 3 0分間インキュベートすることにより、 1次抗体に結合され た抗体を可視化した。 蒸留水で十分反応させることにより、 反応を停止させた。 結果を図 2に示した。 実施例 1 0で得た本発明によるメグ一 4に対するポリク 口ーナル抗体で、 M B P _メグ一 4に相当するバンドが確認できた。 したがって このポリクロ一ナル抗体は、 メグ— 4を特異的に認識する抗体であることが示さ れた。

[実施例 1 2 ] FISH法によるメグ一 4遺伝子の染色体における局在の解析 クローン F 9 6 0の D N Aを、 ニックトランスレーション法によってジゴキシ ゲニン dUTP で標識した。 クロ一ン F 9 6 0は、 ヒトゲノムの Bac (bacterial artifical chromosome)ライブラリ一を、 メグ一 4特異プローブでスクリ一ニング して得られた陽性クロ一ンである。 Bac ライブラリ一のスクリーニングに用いた メグ _ 4特異プローブは、 cDNA の 5，-領域 （0-644 nt)をインサートとして含む ZIPLoxcDNAクローンの kpn-I /Sea I消化断片に相当する断片である。

標識プローブを切断したヒト DNAで処理し、 次いで正常な中期のヒト染色体と ハイブリダィズさせた。 ヒト染色体は、 PHA刺激した末梢血リンパ球を、 50%ホル ムアミ ド、 10%デキストラン硫酸、および 2 X S S Cを含む溶液で処理することに よって得た。 ハイブリダィゼ一シヨンシグナルは、 DAPIによるカウンタースティ ニングの後に、 フルォレセイン結合抗ジゴキシゲニン抗体を反応させることによ り検出した。

この実験により、 サイズ、 形態上の特徴、 あるいはバンドパターンに基づいて 1 0番染色体と思われるグループ C染色体の短腕に特異的なシグナルが観察され た （図 3 )。

次に、 1 0 q 2 2 (長腕） にマツビングされている anonymousプローブ、 1 0 番染色体のセントロメァ特異プローブ、 およびクローン F 9 6 0との共染色を行 つた。 この実験によって、 長腕と短腕に特異的なシグナルを比較することができ る。 1 0番染色体特異的な 1 0のプローブを用いた解析によれば、 F 9 6 0は染 色体 1 0 pのセントロメァからテロメァに対して 2 3 %の距離にマッピングされ た。 この領域は lOpll .23-12.1.に相当する。 全部で 8 0の中期細胞を解析し、 う ち 7 5で F 9 6 0に特異的なシグナルが観察された。 産業上の利用の可肯 生

本発明により、 メサンギゥム細胞に高頻度に発現している DNA、 該 DNAのコー ドするタンパク質、 該タンパク質に結合する抗体等が提供された。 これらはメサ ンギゥム細胞に特異的な生理活性に深く関与していると推測され、 メサンギゥム 細胞の同定、 メサンギゥム細胞の異常の検出などに有用である。 更に、 該タンパ ク質の機能からメサンギゥム細胞の機能が明らかになり、 メサンギゥム細胞に関 連する疾患の原因究明への展開が期待される。 また、 メサンギゥム細胞に関連す る疾病の治療、 診断等への応用が期待される。

具体的には、 たとえばメグ一 4の人為的な調節によって、 糸球体腎炎の発症や 進展を制御できる可能性がある。 あるいはメサンギゥム細胞や体液中のメグ一 4 タンパク質や mRNAの定量によって、糸球体腎炎などの腎疾患の診断が可能となる ことが期待できる。 糸球体腎炎ではメサンギゥム領域の機能異常が見られ、 メサ ンギゥム細胞の増殖、 あるいは細胞からのマトリックス基質の産生亢進が起きて いる。 これらの病態にメグ— 4が関与している可能性は十分に考えられる。 本発明によるメグ— 4は、 メサンギゥム細胞で高度に発現しているという点で は、 本発明者が先に報告したメグシンと共通の特徴を備えている。 しかしながら 本発明によるメグ一 4は AAAタンパク質フアミリー中の ATP- MP群に属すると考え られるに対して、メグシンはプロテア一ゼィンヒビ夕一である SERPINスーパ一フ アミリーとの相同性を持つタンパク質である。 また本発明によるメグ一 4が比較 的広範囲な組織において発現が観察されている点は、 メグシンのメサンギゥム細 胞に特異的に発現しているという特徴と相違する。 したがって本発明によるメグ —4は、 メサンギゥム細胞の機能を支える重要なタンパク質である可能性を持つ ている。 このような重要なタンパク質の存在を明らかにした本発明の意義は大き い。

Claims

請求の範囲

1. 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列、 またはこれらアミノ酸配列において 1若しくは複数個のアミノ酸が置換、 欠失、 付加、 および/または挿入された アミノ酸配列を含み、 このアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等な夕 ンパク質。

2. 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列に対して、 90%以上のホモロジ一を 持つアミノ酸配列からなる請求項 1に記載の夕ンパク質。

3. 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列を含む請求項 1に記載のタンパク質。

4. 請求項 1に記載のタンパク質をコードする DNA。

5. 配列番号： 1に記載の塩基配列に対して、 85%以上のホモロジ一を持つ 塩基配列からなる請求項 4に記載の D N A。

6. 配列番号： 1に記載の塩基配列におけるタンパク質コード領域を含む請求 項 5記載の DNA。

7. 配列番号： 1に記載の塩基配列を持つ DNAとストリンジヱン卜な条件下 でハイブリダィズし、 請求項 1に記載のタンパク質をコードする DNA。

8. 配列番号： 1に記載の塩基配列からなる DNA、 またはその相補鎖と特異的に ハイブリダィズする DNAであって、 少なくとも 1 5ヌクレオチドの鎖長を持つ DNA。

9. 請求項 6に記載の MAもしくはその一部に対するアンチセンス DNA。

10. 請求項 4、 請求項 5、 請求項 6、 および請求項 7のいずれかに記載の DN Aを含むことを特徴とするベクター。

1 1. 請求項 4、 請求項 5、 請求項 6、 および請求項 7のいずれかに記載の DN Aを発現可能に保持する形質転換細胞。

12. 請求項 1 1に記載の形質転換細胞を培養し、 請求項 4、 請求項 5、 請求項 6、 および請求項 7のレ、ずれかに記載の D N Aの発現産物を回収することを特 徴とする、 請求項 1に記載のタンパク質の製造方法。

3 . 請求項 1に記載のタンパク質に結合することを特徴とする抗体。

4 . 配列番号： 2のアミノ酸配列から選択されたアミノ酸配列を持つタンパク 質を認識する請求項 1 3に記載の抗体。

5 . 抗体がモノクローナル抗体である請求項 1 4に記載の抗体。

6 . 請求項 1 4または請求項 1 5に記載の抗体と請求項 2に記載のタンパク質、 またはその断片との免疫学的な結合に基づいて請求項 3に記載のタンパク質 またはその断片を測定する免疫学的測定方法。

7 . 請求項 1 4または請求項 1 5に記載の抗体を含む請求項 3に記載の夕ンパ ク質またはその断片の免疫学的測定用試薬。

8 . 生体試料中に含まれる請求項 3に記載のタンパク質またはその断片を測定 し、 正常試料から得られた測定値と比較することによってメサンギゥム増殖性 腎症を検出する方法。

9 . メグ— 4をコードする遺伝子の発現レベルを変化させたトランスジェニッ ク非ヒト脊椎動物。

0 . 非ヒト脊椎動物がマウスである請求項 1 9に記載のトランスジヱニック非 ヒト脊椎動物。

1 . メグ一 4をコードする遺伝子の発現が抑制されたノックァゥトマウスであ る請求項 2 0に記載のトランスジエニック非ヒト脊椎動物。