WO2000038736A1

WO2000038736A1 - Preparations medicinales

Info

Publication number: WO2000038736A1
Application number: PCT/JP1999/007278
Authority: WO
Inventors: Yasuki Kato; Hiroko Kusano; Yuji Kawaguchi; Kunio Ito
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
Priority date: 1998-12-24
Filing date: 1999-12-24
Publication date: 2000-07-06
Also published as: AU1688099A; AU1800100A; EP1142589A4; US7067618B1; CA2358168A1; WO2000038735A1; EP1142589A1

Description

明細書

医薬製剤

技術分野

本発明は医薬化合物の生体内挙動を変化させ、効率よくその効果が得られる医療上有用な製剤に関する。

背景技術

従来、ペプチド、蛋白質の医薬品への応用が数多くなされてきた。例えば、生体内における持続性を高めるため、ペプチド、蛋白質等の医薬品をポリエチレンダリコール、デキストラン、ポリアミノ酸、アルブミン、ィヌリン等で化学修飾する方法が知られている。

一方、ペプチド、蛋白質等の医薬品の標的指向型製剤の開発も試みられている。例えば、肝臓を標的とするものとして、ァシァ口糖蛋白質のリゾチームやアルブミン [ J. C. Rogers and S. Kornfeld, Biochem. Biophys. Res. Commun. , 45, 622 (1971)] およびグル夕ミナーゼ [G. Schemer et al. , Biochem. Biophys. Acta, 538, 397 (1978)] への修飾が知られている。またラクトースでアルブミン [L. Fuime et al. , FEBS Lett. , H6, 42 (1982)、 L. Fuime et al. , Biochem. Pharmacol., 35, 967 (1986)] 、 Lーァスパラギナ一ゼ [J. W. Marsh et al. , J. Biol. Chem. , 252, 7678 (1977) ] 、リボヌクレアーゼ [G. Wilson, J. Biol. Chem. , 253, 2070 (1977)] を化学修飾することにより肝臓への集積性が認められている。これらの標的化における化学修飾方法としては、カルポジイミド法、ダル夕ルアルデヒド法、 SPDP (N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionate) 法、活性エステル法、水素化シァノホウ素ナトリゥムを用いた還元法等が挙げられる。ペプチド、蛋白質等の医薬品をこれらの化学修飾方法を用いて修飾した化合物は、生体内では徐々に分解され該医薬品を解離するが、 pH変化等によって速やかに該医薬品が解離することは望めない。

癌細胞等では間質の PHの低下（pH6. 9程度まで）が知られており、一方グルコース投与により間質の pHは 6. 9から 6. 2に低下することが知られている

[H. Kahler and W. V. Robertson, J. Natl. Cancer Inst. , 3, 495 (1943)、 P. M. Gullino et al. , J. Natl. Cancer Inst. , 34, 857 (1965)] 。また、炎症部では p H6. 5と酸性を示すことも知られている [V. Menkin, Biochemical Mechanism in Inflammation, Thomas, Springfield, III, pp.69-7 (1956)] 。さらに、ラットにおいて一過性の虚血により、虚血部位の pHが 7. 4から 6. 5に低下することが実験的に示されている [Ν· Watanabe et al. , Biochem. Pharmacol. , 38, 3477 (1989)] 。また、スチレンマレイン酸共重合体（SM) を用いたスーパ一ォキシドディスミユタ一ゼ（SOD) の pH感受性ドラッグ ·デリバリー ·システム（DD S) が知られている [Biochemistry, 28, 6619 (1989)、 Biochem. Pharmacol. , 38, 3477(1989)] 。当該 DDSでは、スチレンマレイン酸共重合体が共有結合したス一パ一ォキシドディスミユタ一ゼ（SM— SOD) が、中性付近の pHで血液中のァルブミンのヮ一ファリン結合部位に非共有結合する。 pHが低下すると SMがプロトン化されアルブミンとの結合能が低下し、 S M— S ODが解離する。

また、表皮細胞成長因子（EGF) 受容体は偏平上皮癌に過剰発現することが知られており [S. Ogawa et al. , J n. J. Cancer Res. , 79, 1201 (1988)] 、これを利用して抗 EGF受容体抗体を用いた制癌剤のターゲティング療法が試みられている [E. A. Pirak et al. , Pro atl. Acad. Sci. USA, 86, 3778 (1989)] 。土屋らはリポソ一ム表面に EGFを結合させ、 EGF受容体を介した癌細胞へのリポソームの取り込みを見出している [S. Tsuchiya et al. , Drug Delivery System, 4, 193 (1989)] 。し力 ^しながら、 EGF受容体は正常細胞にも発現しており、病変部のみをターゲットとすることは困難である。

発明の開示

本発明の目的は、アミノ酸誘導体、ペプチド、蛋白質、酵素等の遊離のアミノ基を有する化合物と還元性を有する糖類とを反応させることにより、病巣部における PH変化により遊離のアミノ基を有する化合物を速やかに解離させることができる製剤（PH応答型製剤）を提供することにある。本発明の製剤は、遊離のアミノ基を有する種々の化合物を p Hに応答して解離させることができ、炎症部位や腫瘍部位等の pHが低下した標的部位で特異的に当該化合物を解離してその効果を発揮させ、また、標的部位以外で当該化合物の解離がされない結果、副作用の軽減等の効果が期待される。また、本発明の製剤を生体内に投与すると、未修飾薬物に比べ体内動態が変化し、例えば血中持続性が向上する等の効果が期待される。また、付加する糖によっては、例えばガラクトース受容体等に特異的に認識された後、細胞にエンドサイト一シスされた後に形成されるエンドソーム内の pH低下により糖が解離し遊離薬物が細胞内に放出されること等も期待される。

本発明は、遊離のアミノ基を有する化合物と還元性を有する糖類とを反応させることにより得ることができる化合物を含有してなる医薬製剤に関する。

本発明で用いられる遊離のアミノ基を有する化合物としては、とくに限定はないが、例えば、ブラジキニン、アンジォテンシン、アントリオぺプチン、ォキシトシン、バソプレシン、アドレノコルチコトロピン（ACTH) 、カルシトニン、インシュリン、グルカゴン、コレシストキニン、 /3—エンドルフィン、メラノサイト阻害因子、メラノサイト刺激ホルモン、ガストリンアン夕ゴニスト、ニューロテンシヨン、ソマトス夕チン、ブルシン、シクロスポリン、エンケフアリン、トランスフエリン、 RGDペプチド、甲状腺ホルモン、成長ホルモン、ゴナトロピン、性腺刺激ホルモン、黄体形成ホルモン（LHRH) 、ァスパラギナーゼ、アルギナーゼ、ゥリカ一ゼ、カルボキシぺプチダ一ゼ、グルタミナーゼ、 SOD、組織プラスミノ —ゲンァクチべ一夕一（t一 PA) 、ストレプトキナーゼ、イン夕一ロイキン、ィンタ一フエロン、ムラミルジペプチド、サイモポェチン、顆粒球コロニー刺激因子

(G-C S F) 、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM— CSF) 、エリスロポェチン（EPO) 、トロンポポェチン（TPO) 、トリプシンインヒビ夕一、リゾチーム、 EGF、インスリン様成長因子（I GF) 、神経成長因子（NGF) 、血小板由来成長因子（PDGF) 、形質転換成長因子（TGF) 、内皮細胞成長因子（ECGF) 、フイブロブラスト（繊維芽細胞）成長因子（FGF) 、グリア細胞成長因子（GGF) 、サイモシン、特異抗体（例えば、抗 EGF受容体抗体等が挙げられる）等のペプチド、蛋白質および酵素、ドキソルビシン誘導体 [例えば、 3，一 (D-Va 1 -Le u-Ly s) -doxo r ub i s i n] 、 5—フルォロウラシル誘導体 [例えば、 L_A l a— 2— (5- f l uo r ou r a c i l -

1— y l) — G l y] 、ダウノルビシン、イダルビシン、ネオカルチノスタチン等の制癌剤、ドパミン等のアミノ酸誘導体、ァモキシシリン、アンピシリン、塩酸ァマン夕ジン、塩酸ェピルビシン、塩酸ドキソルビシン、塩酸ドパミン、塩酸バンコマイシン、塩酸タラアンピシリン、塩酸バカアンピシリン、サイクロセリン、シクラシリン、セファクロル、セファトリジン、セフアドロキシル、セファレキシン、セファラジン、セファロキサジン、トラネキサム酸、ノルェピネフリン、メチルドパ、メルファラン、リオテロニンナトリウム、硫酸ァストロマイシン、硫酸イセパマイシン、硫酸カナマイシン、硫酸シクロノマイシン、硫酸シソマイシン、硫酸ジベカシン、硫酸スルべカシン、硫酸ネオマイシン、硫酸ネチルマイシン、硫酸パロモマイシン、硫酸ブレオマイシン、レポドパ、抗体医薬 [例えば、人血清免疫グロブリン（人血清免疫グロブリンをペプシン処理したもの、プラスミン処理したもの、

3 -プロピオラクトン処理したもの、 S -アルキル化したもの、 S -スルホ化したもの、ポリエチレングリコール処理したもの）、マウス ·モノクローナル抗体、ヒト *モノクローナル抗体、キメラ抗体、抗イデオタイブ抗体および可変領域のみの F a b 等] 等の医薬化合物等が挙げられる。

遊離のアミノ基を有する化合物として好ましいのは、インシュリン、トランスフエリン、ァスパラギナーゼ、 S O D、 t - P A, イン夕一フエロン、特異抗体等のペプチド、蛋白質および酵素、塩酸ドキソルビシン、塩酸ェピルビシン、硫酸ブレォマイシン等の医薬化合物である。

本発明の製剤に用いる糖類としては、還元性を有するものであれば何れでもよく、例えば、グルコース、ラク！ ^一ス、フコシルグルコース、ガラクトシルラクトース、フコシルラク 1 ^一ス、ラクトー N—テトラオース、ラクトー N—へキサオース、ラクトー N—ネオへキサオース、ジマンノシル—N—ァセチルダルコサミン、 3 ' - シァリルラク 1 スまたは 6 ' —シァリルラク 1 スのようなシァリルラクトース、ジシァリルラクト一ス、 N， O—ジァセチルノイラミニルラク 1 ス、 3 ' —シァリルラクトース 6 ' —硫酸、ラクトース 6，一硫酸、ラクト一ス 3 ' —リン酸、ジシァリルラクトー N—テトラオース、および糖脂質等が挙げられる。また、これらの化合物の還元性のアルデヒド基から生じる水酸基（へミアセタール部分の水酸基）以外の水酸基に、ポリオキシエチレン、ポリグルタミン酸、ポリビニルピロリドン等の高分子を化学結合させたものも本発明の製剤に用いる糖類として使用することができる。還元性を有する糖類の糖鎖中の還元性を有するアルデヒド基は、遊離のアミノ基を有する化合物のァミノ基と反応することにより、遊離のアミノ基を有する化合物のアミノ基部分に糖鎖が結合された化合物を与える。糖類として好ましいのは、シァリルラクトース、ラクト一ス、グルコース、ジァリルラクト一ス等である。

遊離のアミノ基を有する化合物と還元性を有する糖類とを反応させることにより得ることができ、 p H変化により速やかに遊離のアミノ基を有する化合物を解離することができる化合物としては、例えばシッフ塩基、アミナ一ル等が挙げられる。また、リボソーム、リピッドエマルジヨン、マイクロエマルジヨン、ポリマ一ミセル、マイクロカプセル、マイクロスフェア一、磁性体微粒子等の薬物運搬体でァミノ基を有する化合物、還元性を有する糖類、またはアミノ基を有する化合物と還元性を有する糖類とを反応させることにより得ることができる化合物を修飾することもできる。アミノ基を有する化合物、還元性を有する糖類、またはアミノ基を有する化合物と還元性を有する糖類とを反応させることにより得ることができる化合物は薬物運搬体に封入されていてもよい。薬物運搬体で修飾される該ァミノ基を有する化合物、薬物運搬体に封入される該ァミノ基を有する化合物としては、前記の医薬化合物以外に、アミノ基を有する化合物であれば特に薬理活性を示さない化合物であってもよい。また薬物運搬体には、前記の医薬化合物等の遊離のアミノ基を有する化合物のほか、薬理活性を示す如何なる化合物も封入させることができる。薬物運搬体として好ましいのは、リボソーム、リピッドエマルジヨン、ポリマーミセル等である。

本発明の医薬製剤は、遊離のアミノ基を有する化合物（該遊離のアミノ基を有する化合物は薬物運搬体で修飾されていてもよい）の 1重量部に対し、還元性を有する糖類を 1〜 1 0， 0 0 0重量部、好ましくは 1 0〜1 , 0 0 0重量部加え、 p H 7〜1 4、好ましくは p H 7 . 5〜 1 0の水溶液中、 0〜： L 0 0 、好ましくは 2 0〜5 0 °Cで 1分間〜 1力月間、好ましくは 1〜9 6時間放置して、反応させることにより製造することができる。 p Hの調節に用いるものとしては、特に限定するものではないが、例えばリン酸緩衝液、水酸化ナトリウム等が挙げられる。

本発明の製剤としては、上記製造法で得られたものをそのまま使用できる。また使用目的、保存条件等によりマンニトール、ラクト一ス、グリシン等の賦形剤を加え凍結乾燥して使用することもできる。凍結保存する際には、グリセリン等の凍結保護剤を加えることもできる。本発明の医薬製剤は注射剤として用いるのが一般的であるが、経口剤、点鼻剤、点眼剤、経皮剤、坐剤、吸入剤等として加工して使用することもできる。

本発明の製剤は、生体内に投与すると、未修飾薬物に比べ体内動態が変化し、例えば血中持続性が向上したり、肝臓におけるガラクトース受容体に特異的に結合させることができる等の効果がある。また抗腫瘍活性を有する化合物を用いた製剤の場合、腫瘍の病巣部近傍では PHが低下しているため、腫瘍の病巣付近で当該抗腫瘍活性を有する化合物が糖から解離し、腫瘍細胞以外の細胞を傷つけることなく抗腫瘍活性を有する化合物を腫瘍細胞に直接作用させることができ、当該化合物の副作用の発生を防止することができる。また、抗 EG F受容体抗体を用いた本発明の製剤の場合は、抗 EG F受容体抗体が糖で修飾されているため正常細胞の EG F受容体とは結合しないが、腫瘍周辺の pHが低いことから、腫瘍周辺では本発明の製剤から糖が解離し、抗 E G F受容体抗体が遊離して腫瘍細胞に効果を発揮することができる。

以下に本発明の実施例および試験例を示す。

発明を実施するための最良の形態

実施例 1

0. 2mgのゥシ滕臓由来インシュリン（和光純薬社製）を 2mmo l_ L塩酸水溶液 lmLに溶解した液、 32 Omgの無水 /3—ラクトース（ナカライテスク社製）を 2 mLの蒸留水に溶解した液、および 20 Ommo 1 ZLリン酸緩衝液（p H8. 4) lmLを試験管中で混合したところ、 pHは 8. 1付近であった。この試験管を 40°Cの恒温水槽中に入れて反応を行い、 0時間、 5時間および 24時間後にサンプリングし、反応液中のインシユリンとラクト一スとの反応生成物を以下の条件で高速液体クロマトグラフィー（HPLC) により調べた。

カラム； YMC— Pa c k 〇DS— Aまたは YMC— P a c k 〇DS— AM， 6. 0X 150 mm

移動相； 0. 001 %トリトン X— 100含有 10 Ommo 1 /Lリン酸緩衝液 (PH8. 0) : 0. 001 %トリトン X— 100含有ァセトニトリル =25容量部： 9容量部

流速； 1. SmLZ分検出波長； 210 nm

この結果、ラクトースとインシュリンとの反応により 3つの反応生成物が生成することがわかった。その生成物を HP LC上の保持時間の短いものから生成体— 3、生成体一 2、生成体一 1と名付けた。なお、インシュリンの保持時間は最も長かつた。結果を第 1表に示す。第 1表インシユリンへのラクトースの付加インシュリン生成体一 1 生成体— 2 生成体— 3

0時間 100% 0% 0% 0%

5時間 56% 35% 6% 4%

24時間 21% 32% 11% 36%

第 1表は、ラク！ ^一スが pH8. 1の弱アルカリ溶液中、 40°Cにおいてインシュリンと経時的に反応することを示している。 5時間においては生成体一 1の生成が多いが、 24時間では生成体一 3の割合が増加した。実施例 2

0. 2mgのゥシ塍臓由来インシュリン（和光純薬社製）を Immo lZL塩酸水溶液 ImLに溶解した。約 25mgの純度 75 %シァリルラクトース（ベーリンガ一 ·マンハイム社製、該シァリルラクト一スは 3 ' —シァリルラクト一スおよび 6 ' ーシァリルラク！スの混合物である）に 0. ImLの 60 Ommo 1 ZLリン酸ニナトリウム水溶液を加え溶解した。インシュリン溶液 0. ImLとシァリルラクトース溶液 0. ImLを試験管中で混合したところ、 pHは 7. 8付近であつた。この試験管を 40°Cの恒温水槽に入れて 3日間反応させた。反応液から、経時的にサンプリングし、 3000 r pm、 20分間遠心分離して不溶物を除去した。反応後 0時間、 1日および 3日後の反応液中のインシュリンとシァリルラクトースとの反応生成物の分析を、以下の条件で HPLCにより行った。

カラム； YMC— Pa c k ODS-AP, 4. 6X 150 mm

移動相； 0. 00 1 %トリトン X— 100含有 2 Ommo 1 ZLリン酸緩衝液 ( H 8. 0) : 0. 001 %トリトン X— 100含有ァセトニトリル =41 1容量部： 140容量部

流速； 1. 3mLZ分

検出波長； 220 nm

この結果、シァリルラクト一スとインシュリンとの反応により、 3つの反応生成物が得られることが判明した。このインシュリンとの反応により生成した生成物を、 HP LC上の保持時間の短いものから生成体一 6、生成体— 5、生成体— 4と名付けた。なお、インシュリンの保持時間は最も長かった。結果を第 2表に示す。

第 2表インシユリンへのシァリルラク ] スの付加インシュリン生成体一 4 生成体一 5 生成体一 6

0時間 100% 0% 0% 0%

1日 50% 12% 36% 2%

30 31% 15% 52% 3%

第 2表は、シァリルラクト一スが pH 7. 8の弱アルカリ溶液中、 40°Cにおいてインシュリンと経時的に反応することを示している。生成体— 4、生成体— 5、生成体— 6の中では、 1日目、 3日目とも生成体一 5の生成が多く、経時的に、その割合は増加した。実施例 3

0. lmgのゥシ滕臓由来インシュリン（シグマ社製）を 20mmo lZL塩酸水溶液 ImLに溶解した液、 16 Omgの無水 /3—ラクトース（ナカライテスク社製）を ImLの蒸留水に溶解した液、および 10 Ommo 1/Lリン酸緩衝液 (pH8. 4) 0. 9mLを試験管中で混合し、 37°Cで、 24時間反応を行った。実施例 4

0. lmgのゥシ滕臓由来インシュリン（シグマ社製）を 20mmo lZL塩酸水溶液 0. ImLに溶解した。これに 60 Ommo 1 ZLリン酸水素ニナトリウム水溶液 0. 9 mLを加え試験管中で混合しインシュリン.溶液とした。約 25mgの純度 75 %シァリルラクト一ス（ベ一リンガ一'マンハイム社製、該シァリルラク 1 スは 3' —シァリルラク！スおよび 6，ーシァリルラク！スの混合物である）に 0. 13mLの蒸留水を加え溶解し、インシュリン溶液 0. 13mLとシァリルラクト一ス溶液 0. 13mLとを試験管中で混合し、 37°Cで 24時間反応を行った。比較例 1

2 Ommo 1 /L塩酸水溶液 0. lmL、蒸留水 ImLおよび 10 Ommo 1 / Lリン酸緩衝液（pH8. 4) 0. 9mLを試験管中で混合し、 37でで24時間処理した。比較例 2

0. lmgのゥシ塍臓由来インシュリン（シグマ社製）を 20mmo l ZL塩酸水溶液 0. ImLに溶解した液、蒸留水 ImL、および 100 mm o 1 ZLリン酸緩衝液（pH8. 4) 0. 9mLを試験管中で混合し、 37 °Cで 24時間処理した。比較例 3

16 Omgの無水) 3—ラクト一ス（ナカライテスク社製）を ImLの蒸留水に溶解した液、 2 Ommo 1 /L塩酸水溶液 0. 1 mL、および 100 mm o 1 ZLリン酸緩衝液（pH 8. 4) 0. 9mLを試験管中で混合し、 37°Cで 24時間処理した。本液を A液（ラクト一ス溶液）とした。

比較例 2と同様に、 0. lmgのゥシ滕臓由来インシュリン（シグマ社製）を 2 Ommo 1 ZL塩酸水溶液 0. 1 mLに溶解した液と蒸留水 1 mL、および 100 mmo 1 /Lリン酸緩衝液（pH8. 4) 0. 9 mLを試験管中で混合し、 37 °C で 24時間処理した。本液を B液（インシュリン溶液）とした。試験例 1

0. 2mgのゥシ塍臓由来インシュリン（和光純薬社製）を 2mmo lZL塩酸水溶液 lmLに溶解した液、 32 Omgの無水 3—ラクトース（ナカライテスク社製）を 2 mLの蒸留水に溶解した液、および 200 mmo 1ZLリン酸緩衝液（p H8. 4) lmLを試験管中で混合し、 40 °Cで 24時間反応させた。この溶液 3 mLに 5 Ommo 1 ZLのクェン酸水溶液 0. 5mLを加え pH6. 7にした後、 40°Cで反応させた。反応後 0分、 30分後に反応液中のインシュリンとラクトースとの反応生成物の分析を実施例 1と同様に HP L Cにより行った。その結果を第 3表に示す。第 3表溶液の pHを 6. 7に低下させたときのラクト一スの解離インシュリン生成体一 1 生成体一 2 生成体一 3

0分 25% 42% 13% 20%

30分 45% 18% 25% 12%

第 3表に示したように、溶液の pHを 8. 1から 6. 7に低下させた場合、生成体からラク 1 ^一スが解離し、ラク ] ^一スが結合していない遊離のインシユリンが増加した。試験例 2

0. 2mgのゥシ滕臓由来インシュリン（和光純薬社製）を 2mmo l/L塩酸水溶液 lmLに溶解した液、 32 Omgの無水 ;3—ラクト一ス（ナカライテスク社製）を 2mLの蒸留水に溶解した液、および 20 Ommo 1ZLリン酸緩衝液（p H8. 4) lmLを試験管中で混合し、 40°Cで 24時間反応させた。この溶液 3 mLに 10 Ommo 1 ZLのクェン酸水溶液 0. 5mLを加え pH5. 9にした後、 40°Cで反応させ、経時的に反応液中のインシユリンとラクト一スとの反応生成物の分析を実施例 1と同様に HPLCにより行った。その結果を第 4表に示す。第 4表溶液の pHを 5. 9に低下させたときのラク！ ^一スの解離インシュリン生成体一 1 生成体一 2 生成体— 3

0 24% 36% 13% 27%

2分 35% 27% 22% 17%

10分 59% 5% 33% 3%

30^ 76% 0% 25% 0%

60 75% 0% 25% 0%

第 4表に示したように、 pHを 8. 1から 5. 9に低下させることにより速やかに生成体— 1および生成体一 3からラクトースが解離した。試験例 3

0. 2mgのゥシ塍臓由来インシュリン（和光純薬社製）を 2mmo lZL塩酸水溶液 lmLに溶解した液、 32 Omgの無水 0—ラクト一ス（ナカライテスク社製）を 2 mLの蒸留水に溶解した液、および 200mmo 1 ZLリン酸緩衝液（p H8. 4) lmLを試験管中で混合し、 40 °Cで 24時間反応させた。この溶液 3 mLに 15 Ommo 1 /Lのクェン酸水溶液 0. 5mLを加え pH5. 0にした後、 40°Cで反応させ、経時的に反応液をサンプリングし、インシュリンとラクトースとの反応生成物の分析を実施例 1と同様に HP L Cにより行った。その結果を第 5 表に示す。

第 5表溶液の pHを 5. 0に低下させたときのラク ] ^一スの解離インシュリン生成体- 生成体一 2 生成体一 3

0分 21% 35% 13% 32% 2分 60% 8% 27% 5% 10分 83% 0% 17% 0%

30分 93% 0% 7% 0%

60分 95% 0% 5% 0%

第 5表に示したように、 pHを 8. 1から 5. 0に低下させることにより速やかに全ての生成体からラクトースが殆ど完全に解離した。試験例 4

0. 2mgのゥシ鸱臓由来インシュリン（和光純薬社製）を Immo l ZL塩酸水溶液 lmLに溶解し、約 25mgの純度 75 %シァリルラクト一ス（ベ一リンガ一 ·マンハイム社製、該シァリルラクト一スは 3 ' —シァリルラクトースおよび 6 ' —シァリルラクト一スの混合物である）〖こ 0. lmLの 60 Ommo 1 ZLリン酸水素ニナトリウム水溶液を加えて溶解し、インシュリン溶液 0. lmLとシァリルラクトース溶液 0. lmLを試験管中で混合した。この溶液の pHは 7. 8付近であった。この溶液を 40°Cで 3日間反応させ、反応後、 3000 r pmで 20 分間遠心分離し、上清 40 ^ Lに 5 Ommo 1 ZLのクェン酸水溶液 0. 04mL を加えて溶液の pHを 6. 4に調整した。この溶液を 40°Cで反応させ、経時的に反応液をサンプリングし、ィンシュリンとシァリルラクトースとの反応生成物の分析を実施例 2と同様に H P L Cにより行った。その結果を第 6表に示す。

第 6表溶液の pHを 6. 4に低下させたときのシァリルラクト一スの解離インシュリン生成体一 4 生成体一 5 生成体— 6

0分 31% 15% 52% 3%

10 ^ 44% 9% 43% 4%

30分 50% 6% 41% 3%

試験例 5

0. 2mgのゥシ滕臓由来インシュリン（和光純薬社製）を Immo lZL塩酸水溶液 lmLに溶解し、約 25mgの純度 75 %シァリルラクトース（ベーリンガ一 'マンハイム社製、該シァリルラクト一スは 3 ' —シァリルラクトースおよび 6 ' ーシァリルラク ] スの混合物である）に 0. lmLの 60 Ommo 1 /Lリン酸水素ニナトリウム水溶液を加えて溶解した。インシュリン溶液 0. lmL、シァリルラクト一ス溶液 0. lmLを試験管中で混合したところ、溶液の pHは 7. 8付近であった。この溶液を 40°Cで 3日間反応させ、反応後 3000 r pmで 2 0分間遠心分離した。この上清 40 に 1 O Ommo 1 /Lのクェン酸水溶液 0. 04mLを加えて溶液の pHを 5. 3に調整し、 40°Cで反応させ、経時的にサンプリングを行い、反応液中のインシユリンとシァリルラクト一スとの反応生成物の分析を実施例 2と同様に H P L Cにより行つた。その結果を第 7表に示す。第 7表溶液の pHを 5. 3に低下させたときのシァリルラクトースの解離インシュリン生成体一 4 生成体 _5 生成体一 6

0分 31% 15% 52% 3%

10分 58% 3% 35% 4%

30 ^ 80% 5% 12% 3%

試験例 6

SD系雄性ラットを予め 16から 20時間絶食させた後、 5 Omg/k gのペントバルビタールナトリゥムを腹腔内投与して麻酔し、大腿静脈および頸動脈に力二ユレーシヨン処置を施した。さらに気管にも力二ユレーシヨン処置を施し気道を確保した。薬液投与 5分前に頸動脈力ニューレより 0. 4mL採血し、'へパリン処理したプラスチック製試験管に移した。採血後 0. 4mLの生理的食塩水を頸動脈力ニューレより注入した。実施例 3、実施例 4、比較例 1および比較例 2で得られた反応液をラット 100 g当たり 20 tL大腿静脈に装着した力ニューレより静脈内投与した。また、比較例 3で得られた A液をラット 100 g当たり 20 L大腿静脈に装着した力ニューレより静脈内投与し、その直後に B液を同様に静脈内投与した。投与後 5、 10、 30、 60および 120分後に頸動脈力ニューレより 0. 4 mLずつ採血し、へパリン処理したプラスチック製試験管に移した。各時点で採血後 0. 4mLの生理的食塩水を頸動脈力ニューレより注入した。採血した血液を 5°Cにおいて 10， 000 r pmで 5分間遠心分離し血漿を採取した。得られた血漿中のインシュリン濃度をダラザィム I n s u l i n— E I A Te s t (和光純薬社製）を用いた酵素免疫法により測定した。その結果を第 8表に示す。第 8表血漿中のインシュリンの濃度推移（単位： U/mL ) 時間（分）比較例 1 比較例 2 比較例 3 実施例 3 実施例 4

- 5 23 11 13 17

5 31 476 506 603 589

10 42 185 186 255 242 30 22 16 13 46 56

60 34 8 4 27 23 120 24 17 15 36 20

第 8表に示したように、実施例 3および実施例 4の製剤を使用した場合、比較例 1から比較例 3の製剤を使用した場合に比べて血漿中ィンシュリン濃度が高く推移した。また、比較例 2と比較例 3の製剤の差がないことから、解離したラクトースは血漿中のィンシユリンの消失には影響を与えるものでないことが示された。

産業上の利用可能性

本発明により、アミノ酸誘導体、ペプチド、蛋白質、酵素等の遊離のアミノ基を有する化合物を病巣部における P H変化により速やかに解離させることができる製剤が提供される。本発明の製剤は、化合物の生体内での持続性を向上させ、種々の化合物を p H変化に応答して解離させることができ、標的部位で特異的に当該化合物を作用させることができる。

Claims

請求の範囲

1 . 遊離のアミノ基を有する化合物と還元性を有する糖類とを反応させることにより得ることができ、 p H変化により速やかに遊離のアミノ基を有する化合物を解離することができる化合物を含有してなる医薬製剤。

2 . 遊離のアミノ基を有する化合物が、医薬化合物である請求の範囲 1記載の製剤。

3 . 遊離のアミノ基を有する化合物が、ペプチド、蛋白質、酵素およびアミノ酸誘導体から選ばれる化合物である請求の範囲 1記載の製剤。

4. ぺプチドがィンシュリンである請求の範囲 3記載の製剤。

5 . 遊離のアミノ基を有する化合物、還元性を有する糖類、または遊離のァミノ基を有する化合物と還元性を有する糖類とを反応させることにより得ることができる化合物が、薬物運搬体で修飾されているか、または薬物運搬体に封入されている請求の範囲 1記載の製剤。

6 . 薬物運搬体が、リポソ一ム、リピッドエマルジヨン、マイクロエマルジヨン、ポリマーミセル、マイクロカプセル、マイクロスフェア一および磁性体微粒子から選ばれるものである請求の範囲 5記載の製剤。

7 . 薬物運搬体に、遊離のアミノ基を有する化合物を封入させた請求の範囲 5または 6記載の製剤。

8 . 薬物運搬体に、医薬化合物を封入させた請求の範囲 5または 6記載の製剤。