WO2000037093A1

WO2000037093A1 - Inhibiteur de resorption osseuse

Info

Publication number: WO2000037093A1
Application number: PCT/JP1999/007152
Authority: WO
Inventors: Kazuo Suzuki; Satoshi Yamagoe; Tooru Yamakawa
Original assignee: Japan As Represented By Secretary Of National Institute Of Infectious Diseases
Priority date: 1998-12-22
Filing date: 1999-12-20
Publication date: 2000-06-29
Also published as: WO2000037093A8; JP4378439B2; JP2000186045A; US6723696B1; CA2356765A1; EP1142579A4; EP1142579A2

Description

明細書

骨吸収抑制剤技術分野

本発明は、白血球活性化タンパク質因子又は白血球活性化タンパク質因子由来物質を有効成分とすることを特徴とする骨吸収抑制剤に関する。さらに、白血球活性化タンパク質因子又は白血球活性化タンパク質因子由来の物質を利用した骨吸収抑制剤のスクリ一ニング方法に関する。背景技術

白血球活性化タンパク質因子 [以下 LE CT 2 (L euko cyt e— d e r i v e d c hemo t ax i n 2 ) と称することもある。]は鈴木和男らにより見出された好中球走化性因子である（特開平 8— 140683公報）。ヒトおよびゥシ L E C T 2についてはクロ一ニングが行われ、その塩基配列が決定されている (S. Yamago e e t a 1. , Immuno l. L e t t . 5 Z , 9 — 13, 1 996、 S. Yamago e e t a 1 , B i o c h em. B i o phy s . Ac t a, 1396 , 105— 1 1 3， 1 998 )。ヒト LE CT 2の mRNAはシグナルべプチドと考えられる 1 8個のアミノ酸配列を含む 1 5 1アミノ酸をコードすることが明らかとなっている。ゥシおよびヒト LE CT 2のアミノ酸配列は、ニヮトリ由来の mi m— 1遺伝子産物と高いホモロジ一をもっており、この mim— 1遺伝子産物の機能は不明であるが、骨髄の前骨髄球の顆粒に含まれ、癌遺伝子の m y bが発現調節に関わっていることが知られている c 走化性因子として発見された L E CT 2の作用については、好中球を活性化することによって、がん細胞破壊反応の亢進や、イン夕一ロイキン類の分泌の促進等が誘導され、自然免疫能が高められるので、腫瘍免疫としての治療、診断、予後の判定に利用できることが示唆されている。 LE CT 2は好中球の活性化に関連する作用が知られているのみであり、骨に対する作用については全く知られていなかった (蛋白質核酸酵素 (7)， 1086， 1997)。

一方、鈴木不二男らは、ゥシ胎児軟骨より精製された分子量約 16KDaのタンパク質であるコンドロモジュリン 2を精製した（Y. Hiraki e t al， J. Bio l. Chem. 271, 22657-22662, 1996 )。コンドロモジュリン 2は軟骨細胞の増殖、分化を促進することが示されており（特開平 5— 255398号公報)、また、破骨細胞の形成促進、破骨細胞活性化作用も有することが明らかになつている（特開平 8— 27020号公報）。最近になり、ホモ口ジ一検索の結果、 L E C T 2とコンドロモジュリン 2は同一であることが明らかとなつた。

破骨細胞は骨組織で骨吸収を目的として存在し、骨のリモデリングに重要な働きをしている多核巨細胞である。破骨細胞の前駆細胞は、造血幹細胞に由来する細胞で、血流を介して骨表面に運ばれ、破骨細胞へと分化する。一方、骨芽細胞は、未分化間葉系細胞や線維芽細胞、間質細胞などの基質形成細胞系に属する前駆細胞から分化し、破骨細胞とは全く細胞系列の異なる前駆細胞から由来している。骨は、常に骨の形成と骨の吸収を繰り返し、骨リモデリングを行っている。組織学的には骨リモデリングは、破骨細胞による骨吸収が行われ、その後、吸収された部位に骨芽細胞によって骨が作られ、バランスが保たれている。加齢に伴い種々の原因でそのバランスに異常が生じると、骨量が減少し、この状態が長期間続くと骨組織が脆くなり、骨粗鬆症、骨折、腰痛等の各種骨疾患を生じることになる。

骨吸収抑制作用を有する薬剤としては、ェストロジェン、カルシトニン、ビスフォスフォネート等が知られているが、いずれも副作用が報告されている。このため破骨細胞による骨吸収を効果的に抑制することができ、しかも安全性の高い薬剤が望まれていた。発明の開示

本発明の目的は、新規な骨吸収抑制剤を提供することである。

本発明は LECT2又は LECT2由来の物質が骨吸収抑制作用を有することを見出したことを最も主要な特徴とする。そして、この知見を利用して新規な骨吸収抑制剤を提供することを実現した。

本発明者らは、鋭意検討を行った結果、 L E C T 2の骨に対する作用として、骨吸収を抑制する作用、特に破骨細胞に対する骨吸収抑制作用を見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は L E C T 2又は L E C T 2由来の物質を、骨吸収抑制に有効な量含んで成る骨吸収抑制剤に関する。

詳しくは、配列表の配列番号 1のァミノ酸番号 1〜 1 5 1番又は 1 9番〜 1 5 1 番で表されるアミノ酸配列を有する L E C T 2又は L E C T 2由来の物質を骨吸収抑制に有効な量含んで成る骨吸収抑制剤に関する。

さらに、本発明の骨吸収抑制剤は、白血球活性化タンパク質因子又は白血球活性化タンパク質因子由来の物質が破骨細胞による骨吸収を抑制する態様である骨吸収抑制剤であってもよい。

本発明はまた、白血球活性化タンパク質因子若しくは白血球活性化タンパク質因子由来の物質を出発原料とし、又はこれらを情報源として調製した骨吸収抑制剤候補化合物について、骨吸収作用についてのインビトロ試験を指標にしてスクリ一二ング試験を実施し選別することからなる骨吸収抑制剤のスクリ一二ング方法に関する。

本発明は、前記骨吸収剤のスクリ一ニング方法によつて選別された候補化合物のうち、ピットアツセィによって、 1 0〃g/m lの濃度において 8 0 %以上の骨吸収抑制作用を発揮する化合物を選別し、この化合物を有効成分とする骨吸収抑制剤に関する。

本発明の別の態様は、骨吸収抑制剤の製造における、白血球活性化タンパク質因子又は白血球活性化タンパク質因子由来の物質の使用である。

さらに本発明の別の態様は、骨吸収抑制有効量の白血球活性化夕ンパク質因子又は白血球活性化タンパク質因子由来の物質を投与することを特徴とする動物における骨吸収抑制方法である。図面の簡単な説明

図 1 ：未分画骨細胞に対するヒト LECT2 (hLE CT 2)の骨吸収抑制活性をビットアツセィで試験した結果を示す図面である。横軸は、ヒト LE CT 2濃度を、縦軸は象牙スライス 1枚あたりのビット数を示している。ヒト LECT 2は 1 g/m 1の濃度で約 50 %の骨吸収抑制活性を示し、 10 g/m 1の濃度でほぼ 100%の骨吸収抑制活性を示した。

図 2 ：精製破骨細胞に対するヒト LECT 2 (hLECT 2)の骨吸収抑制活性をビットアツセィで試験した結果を示す図面である。未分画骨細胞を用いたピットアツセィと同様に、精製破骨細胞を用いたビットアツセィにおいても、ヒト LEC T 2は 1

の濃度でほぼ 100 %の骨吸収抑制活性を示した。発明を実施するための最良の形態

本発明の LE CT 2は、白血病細胞のような細胞の培養上清からタンパク質を C M—セファロ一スで濃縮し、 DEAE—セファロース、 CM—セファロース、 HP LCによるハイドロキシァパタイト、逆相クロマトグラフィーにかけることによつて精製することができる。例えば、培養した SKW— 3などの白血病細胞を PHA 一 Pにより刺激して培養上清中に本発明の白血球活性化因子を放出させ、この上清から、カラムクロマトグラフィーなどの手法を用いて、精製することができる。また、本発明の LECT 2又は LECT 2由来の物質は、遺伝子工学的手法（特開平 8— 140683、特開平 10— 146 189) を用いて作製してもよい。例えば、 pMALTM— C又は pGEX— 3Xをべクタ一として作製した形質転換体で産生してもよい。宿主細胞としては従来公知の細菌（大腸菌など)、酵母および動物細胞を用いることができる。動物細胞としては例えば、チャイニーズハムス夕 — CHO細胞、サル CVI細胞、サル COS細胞、マウス線維芽細胞、マウス C 1 27細胞、マウス 3 T 3細胞、マウス L 929細胞およびヒト He L a細胞などがあげられる。酵母としては、パン酵母、ピキア酵母等生産系の確立したものが利用に便利である。なお、工業生産の目的からは酵母分泌系を利用することが最も簡便である。

本細胞の培養、培養上清からの本発明のタンパク質の精製、組換えプラスミドの作製、形質転換の方法、さらに形質転換からの精製は公知の方法によって実施することができる。

本発明で用いる LECT 2由来の物質は、骨吸収を抑制するものであれば、特に限定されない。公知の LE CT 2アミノ酸配列中に 1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付力！]、挿入若しくは誘導といった任意の変異を有し、骨吸収を抑制するものも含まれる（U lme r， K. M.， Sc ience, _2_19 , 6 66， 1983)。さらに、 LECT 2由来の物質には、キメラタンパク質、融合タンパク質、部分欠失、部分配列および化学的に修飾されたものも含まれる。さらに、 L E C T 2の各種たんばく質情報（一次、二次、三次構造および立体表面構造）をもとにして創薬されるべプチドあるいは低分子化合物も候補化合物になりうる（特開平 5— 255398、特開平 8— 140683、 WO/16177) (L 1 e t a丄., Bi oorgani c & Medi cal Chemi s t ry, _4, 1421 - 1427, 1996) (S.Yamago e e t a l.， B. B. R. C.， 237, 116 - 120, 1997： Mono c 1 o n a 1 Ant ibody t o a Re comb inant LECT 2)o なお、その由来となる LECT 2は骨吸収抑制活性を有する限り、その動物種を問わないが、抗原性を考慮すればヒト由来のものを使用するのが好ましい。本発明において、 LECT2又は LECT2由来の物質の骨吸収抑制活性は、例えば次のようにして測定される。ゥサギより単離した破骨細胞を象牙片上に播種し、翌日に形成されたピットの数を計測する骨吸収活性を見るァッセィ系に、 L E C T 2若しくは LECT2由来の物質又はこれら物質の情報をもとにして創製された修飾化合物を添加し、形成されるピット数の減少により、候補化合物の骨吸収の抑制活性を測定することができる（T ak e d a e t a 1 , Bone and Mineral 1 _, 347 - 359, 1992 ) (亀田ら，日薬理誌丄 09， 75 - 84, 1997)。この測定による抑制率を指標にして、骨吸収抑制剤の候補化合物をスクリ一ニングし、例えば、抑制率 8 0 %を 1 0 g/m lの濃度で発揮する化合物が選択される。

本発明の骨吸収抑制剤を使用することのできる骨疾患の例としては、骨粗鬆症、高カルシウム血症、副甲状腺機能亢進症、ページエツト病等があげられる。

本発明の骨吸収抑制剤を治療薬剤として投与する場合には、通常成人 1日あたり

0 . 0 0 5〜： L O m g/k g、好ましくは、 0 . 0 1〜 3 m g/k gを 1日 1〜 3 回に分けて投与すればよく、これらの投与量は、用いる化合物、年齢、症状等により適宜増減することが可能である。

本発明の骨吸収抑制剤はその投与ルートについては所望により経口的、非経口的、あるいは局所的に投与することができる。経口投与剤としてはタンパク質又はぺプチドの場合における消化分解、腸内吸収の問題を考慮して、散剤、顆粒剤、カプセル剤、錠剤などの固形製剤あるいはシロップ剤、エリキシル剤などの液状製剤とすることができる。また、非経口投与剤として注射剤、点滴用剤、又は粘膜若しくは皮膚吸収の問題を考慮して粘膜投与剤若しくは外用剤とすることができる。

剤形についても所望により、必要に応じて、公知の担体等を併用して、錠剤、力プセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、腸溶解性製剤等の経口投与剤、又は、注射剤（静脈内、筋肉内、皮下、腹腔等)、点滴剤、坐剤等による非経口剤等に製剤化されるものである。これらの各種製剤は、常法に従って主薬に賦形剤、着色剤、安定化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味剤、溶解補助剤、粘着剤、乳化剤、リポソーム製剤、 p H調整剤、懸濁剤、コーティング剤、腸吸収促進剤、除放性製剤などの医薬の製剤技術分野において通常使用しうる既知の補助剤を用いて製剤化することができる。実施例

以下に実施例をもって、本発明をさらに具体的に説明するが、これらは実施の一例として示すものであり、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。実施例 1

( 1 ) 未分画骨細胞の調製

ジェチルエーテルを用いた深麻酔により 10日齢、 110 g前後の仔ゥサギを屠殺し、四肢長管骨を採取した。軟組織を取り除いた後、 5%仔ゥシ胎児血清（FB S)を含むアルファ最小必須培地（ひ— MEM)の中でハサミを用いて細切した。充分に細切した骨片と培養液を回収し、 V 0 r t e Xミキサ一を用いて骨片に付着している細胞を剥離させ、 2分間静置した後上清を回収することにより未分画骨細胞を調製した。

( 2 ) ピットアツセィ

20〜40〃m厚の象牙スライスを直径 6 mmの円盤状に切断し、 70%ェ夕ノール中で超音波処理することにより滅菌を行った。各象牙スライスを PB S、ひ— MEMにて洗浄後、 200〃1の培養液（5%FBS含有ひ一 MEM)と共に 96 穴プレートのゥエルに移し、 C〇₂インキュベータ一内（5%C 0₂/95 %Ai r) にて、 37°C、 2時間保温した。 2時間後にゥヱル内の培養液を完全に取り除き、各濃度のヒト LE CT 2を含む培養液および 5 X 10⁵個の未分画骨細胞を添加した後、さらに C0₂インキュベータ一内（ 5 %C 0₂/95 %A i r) にて、 37°C、 18時間保温した。 18時間後、ラバ一ポリスマンを用いて象牙スライスに付着している骨細胞を完全に取り除き、酸性へマトキシリン溶液にて数分間染色し、顕微鏡下で象牙スライス 1枚あたりのピット数を計測することにより破骨細胞の骨吸収活性を求めた。

図 1の横軸は本アツセィ系に用いたヒト LE CT 2濃度を、縦軸は象牙スライス 1枚あたりのピヅト数を示している。ヒト LECT2は 1〃g/mlの濃度で約 50 %の骨吸収抑制活性を示し、 10〃 g/m 1の濃度でほぼ 100 %の骨吸収抑制活性を示した。実施例 2

( 1 ) 破骨細胞の分離精製実施例 1の方法に従って調製した未分画骨細胞をコラーゲンゲル（新田ゼラチン、 ce l l mat r ix t pe I ) でコートしたシャーレに播種し、 C0₂ インキュベータ一内（5%C0₂/95 %Air)にて、 37° 2時間保温した。 2時間後、シャーレ内の培地を完全に取り除いた後、広口ビぺットを用い、 10m

1の P B Sにて 3回洗浄することによりゲル上から細胞を洗い流した。さらに 0. 001% プロナ一ゼ E/0. 02% EDTA溶液を添加し、室温 15分静置した後、再び 1 Omlの PB Sにて 3回洗浄を行った。最後に、 0. 01% コラゲナ一ゼ溶液を添加し、室温 5分静置、 1 Omlの PB Sによる 3回の洗浄を行うことによつて破骨細胞以外の細胞をゲル上から完全に取り除いた。ゲル上に残った破骨細胞は、 0. 1% コラゲナ一ゼ溶液を添加し、室温 10分静置することにより細胞の足場ごと溶解し、破骨細胞のみを含む細胞浮遊液を回収した。

( 2 ) ピットアツセィ

実施例 1で用いた象牙スライス、培養液を用意し、実施例 1と同様の方法でピットアツセィを行った。ただし、ここでは未分画骨細胞の代わりに、 1ゥエルあたり 3000個の精製破骨細胞を用いた。図 2には本アツセィ系を用いてヒト LECT 2の骨吸収抑制活性について調べた結果を示したが、未分画骨細胞を用いたピゾトアツセィと同様に、ヒト LECT2は 10〃 /1111の濃度でほぼ100 %の骨吸収抑制活性を示した。実施例 3

(急性毒性試験）

配列番号 19番から 151番のアミノ酸配列からなる化合物を公知の手法によつて調製し、このものを体重 20± 1 gの dd系マウスの一群 5匹に 0. lmg/ gを尾静脈より投与した。投与 7日後まで観察し死亡例は確認できなかった。産業上の利用の可能性

本発明により、 L E C T 2が骨吸収活性を抑制することが判明した。本発明により、高カルシウム血症、骨粗鬆症等に対して有効な治療法を提供することができる。さらに、 LECT2由来の物質について、骨吸収抑制剤のスクリーニング法が提供できた。

Claims

請求の範囲

1. 白血球活性化タンパク質因子又は白血球活性化タンパク質因子由来の物質を、骨吸収抑制に有効な量含んで成る骨吸収抑制剤。

2. 白血球活性化夕ンパク質因子が配列表の配列番号 1のァミノ酸番号 1番〜 1 5 1番又は 1 9番〜 1 5 1番で表されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項 1記載の骨吸収抑制剤。

3. 白血球活性化タンパク質因子又は白血球活性化タンパク質因子由来の物質が破骨細胞による骨吸収を抑制する請求項 1および 2に記載の骨吸収抑制剤。

4. 白血球活性化タンパク質因子若しくは白血球活性化タンパク質因子由来の物質を出発原料とし、又はこれらを情報源として調製した骨吸収抑制剤候補化合物について、骨吸収作用についてのインビトロ試験を指標にしてスクリーニング試験を実施し選別することからなる骨吸収抑制剤のスクリ一二ング方法。

5, 請求項 4に記載の方法によって選別された候補化合物のうち、ピットアツセィによって、 1 Ο g/m lの濃度において 8 0 %以上の骨吸収抑制作用を発揮する化合物を選別し、この化合物を有効成分とする骨吸収抑制剤。

6. 骨吸収抑制剤の製造における、白血球活性化タンパク質因子又は白血球活性化

'質因子由来の物質の使用。

7. 骨吸収抑制有効量の白血球活性化タンパク質因子又は白血球活性化タンパク質因子由来の物質を投与することを特徴とする動物における骨吸収抑制方法。