WO2000018900A1 - Adn codant pour de nouveaux polypeptides - Google Patents

Adn codant pour de nouveaux polypeptides Download PDF

Info

Publication number
WO2000018900A1
WO2000018900A1 PCT/JP1999/005349 JP9905349W WO0018900A1 WO 2000018900 A1 WO2000018900 A1 WO 2000018900A1 JP 9905349 W JP9905349 W JP 9905349W WO 0018900 A1 WO0018900 A1 WO 0018900A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
polypeptide
dna
mmp
disease
oligonucleotide
Prior art date
Application number
PCT/JP1999/005349
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Motoji Seiki
Original Assignee
Motoji Seiki
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Motoji Seiki filed Critical Motoji Seiki
Priority to CA002344464A priority Critical patent/CA2344464A1/en
Priority to EP99969738A priority patent/EP1136549A4/en
Priority to AU59990/99A priority patent/AU5999099A/en
Publication of WO2000018900A1 publication Critical patent/WO2000018900A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6489—Metalloendopeptidases (3.4.24)
    • C12N9/6491—Matrix metalloproteases [MMP's], e.g. interstitial collagenase (3.4.24.7); Stromelysins (3.4.24.17; 3.2.1.22); Matrilysin (3.4.24.23)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a novel transmembrane matrix metaprotein protease polypeptide, a DNA encoding the polypeptide, a vector containing the DNA, a transformant transformed with the vector, and production of the polypeptide.
  • the present invention relates to a method for searching for an inhibitor or an activator using the polypeptide or a part thereof, or a microorganism or animal cell expressing the polypeptide, and a method for searching for a compound that regulates the gene expression of the polypeptide. . Background technology
  • MMPs and MMPs a group of enzymes (hereinafter referred to as matrix meta-mouth proteases having metal ions as active centers, Abbreviated) is involved.
  • MMPs include interstitial collagenase (MMP-1), gelatinase A (MMP-2), gelatinase B (MMP-9), stromelysin 1 (MMP-1 3), matrilysin (MMP-7 ), Neutrophil collagenase (MMP-8), stromelysin 2 (MMP-10), stromelysin 3 (MMP-11), meta-oral elastase (MMP-12), collagenase 3 ( MMP—1 3), Transmembrane MM P—1 (MT 1—MMP or MMP—14), Transmembrane MMP—2 (MT 2 -M MP or MMP—15), Transmembrane MMP—3 ( MT3—MMP or MMP—16) and transmembrane MMP—4 (MT4—MMP or MMP—17) have been reported [protein nucleic acid enzyme, ⁇ , 2386 (1997)].
  • MMP-1 interstitial collagenase
  • MMP-2 gelatinase A
  • each MMP forms a family, and each MMP consists essentially of three domains: an N-terminal propeptide domain, an active domain to which zinc ions bind, and a hemopoxin coagulase-like domain.
  • MMP-7 there is no hemopoxin clotting enzyme-like domain.
  • transmembrane type a transmembrane domain is added to the C-terminal of Have
  • the human MT4-MMP gene has already been reported [Puente: Cancer Research, 56, 944 (1996)] the nucleotide sequence of the gene does not include a translation initiation region, and is simply a domain similar to MMP. It is a gene defined as containing a nucleotide sequence having a region. Therefore, it is unlikely that the gene encodes MT4-MMP full length.
  • MT1-MMP production is promoted in patients with osteoarthritis [Am. J. Pathol, 151, 245 (1997)], and infiltration of leukocytes, which are important for immune and inflammatory responses, into tissues
  • MMPs are important (J. Immunol., 156, 1 (1996))
  • MMP inhibitors prevent hepatitis (Eur. J. Pharmacol, 3 I, 105 (1998))
  • MMP inhibitors Is known to be effective in the treatment of corneal ulcer [Journal of the Japanese Ophthalmologist, 270 (1998)].
  • MMPs are important for cancer growth, invasion and metastasis [protein nucleic acid enzyme,, 2386 (1997)], and it has been reported that MMP inhibitors have anticancer activity. (SCRIP, 2349, 20 (1998)).
  • MT4-MMP is expressed on leukocytes and is involved in leukocyte migration and infiltration.
  • MMP is associated with osteoarthritis, rheumatoid arthritis, asthma, autoimmune diseases, atopic dermatitis, psoriasis, contact dermatitis, alopecia, ischemic heart disease, and immune reactions associated with organ transplantation , Hepatitis, nephritis, nephritis, arteriosclerosis, leukemia, malignant tumor, wound, corneal ulcer, tissue injury, inflammation associated with leukocyte infiltration, and inhibitors that help prevent these diseases Can be used for treatment.
  • MT 4—MMP [Cancer Research, 56, 944 (1996)] contains a domain that does not contain a transcription initiation site and is found in transmembrane MMPs such as the conventionally known MT 1—MMP. This sequence encodes an unnatural peptide that has no structure and is not expressed in vivo.
  • the present invention provides a novel physiologically active transmembrane matrix meta-oral protease polypeptide (hereinafter sometimes abbreviated as MT4-MMP (2)), unlike conventionally reported MT4-MMP.
  • MT4-MMP (2) novel physiologically active transmembrane matrix meta-oral protease polypeptide
  • Encoding the meta-oral protease polypeptide The present invention provides a method for producing a DNA, a method for producing the meta-oral protease polypeptide, a method for screening an inhibitor or an activator using the meta-oral protease polypeptide and DNA, and the like.
  • the present invention provides a novel transmembrane matrix meta-protein protease polypeptide (hereinafter abbreviated as MT51-MMP) of a physiologically active human or mouse, which encodes the metalloprotease polypeptide.
  • MT51-MMP transmembrane matrix meta-protein protease polypeptide
  • DNA a method for producing the meta-oral protease polypeptide, and a method for screening inhibitors or activators using the meta-oral protease polypeptide and DNA. Disclosure of the invention
  • the present inventors have conducted intensive studies based on the presumption that the known human MT4-MMP is not a protein having the original activity but a true MT4-MMP having the activity, and completed the present invention. I came to.
  • the present inventor has conducted intensive studies based on the presumption that useful new transmembrane MMPs exist in addition to known transmembrane MMPs that are considered to be useful for pharmaceutical use.
  • the invention has been completed. That is, the present invention relates to the following (1) to (32).
  • a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence of the polypeptide according to the above (1), and having a metalloprotease activity.
  • deletion, substitution or addition of the amino acids (2) and (4) can be performed by site-directed mutagenesis, which is a well-known technique before filing the application. Can be deleted, substituted or added by site-directed mutagenesis Mean number of amino acids.
  • Such a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added, and having a meta-oral protease activity is known as Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989) (hereinafter abbreviated as Molecular Cloning, 2nd edition), Current Protocols in Molecular Biology, Supplements 1-38, John Wiley & Sons (1987-1997) (hereinafter abbreviated as Current 'Protocols 1-38) Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982), Gene, 34, 315 (1985), Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985), Proc. Natl. Acad. Sci.
  • a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6.
  • a DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 from No. 86 to 1846 or SEQ ID NO: 4 from 100 to 1917 or a DNA which hybridizes with the DNA under stringent conditions, and DNA encoding a polypeptide having oral protease activity.
  • DNA that hybridizes under stringent conditions A colony hybridization method, a plaque hybridization method, or a DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 from No. 86 to 1846 or SEQ ID NO: 4 from No. 100 to 1917 is used as a probe.
  • SSC saline-sodiumcitrate
  • Hybridization is described in experiments such as Molecular Cloning 2nd Edition, Current Protocol in Molecular Biology, DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University Press (1995), etc. It can be performed according to the method.
  • a hybridizable DNA is a DNA having at least 80% or more homology with the nucleotide sequence of Nos. 86 to 1846 of SEQ ID NO: 3 or 100 to 1917 of SEQ ID NO: 4. And preferably, DNA having a homology of 95% or more.
  • DNA consisting of the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 7 at positions 75 to 1 928 or SEQ ID NO: 8 or 1 to 1935 or hybridizing with the DNA under stringent conditions, and having a metaprotease DNA encoding a polypeptide having an activity.
  • ⁇ DNA that hybridizes under stringent conditions '' refers to a DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 from 75 to 1 928 or SEQ ID NO: 8 from 1 to 1935, as a probe.
  • a DNA having at least 80% or more homology with the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 7 at positions 75 to 1928 or SEQ ID NO: 8 at positions 1 to 1935 is preferable.
  • a transformant having a recombinant DNA obtained by incorporating a DNA encoding the polypeptide according to any one of (1) to (8) above into a vector is cultured in a culture medium.
  • a method for producing the polypeptide comprising culturing, producing and accumulating the polypeptide in the culture, and collecting the polypeptide from the culture.
  • an oligonucleotide having the same sequence as the contiguous 5 to 60 bases in the nucleotide sequence of the DNA according to any one of (9) and (11), and a sequence complementary to the oligonucleotide; And oligonucleotides selected from oligonucleotide derivatives of these oligonucleotides.
  • oligonucleotide having the same sequence as the contiguous 5 to 60 bases in the base sequence of the DNA according to any of (10) or (12), a sequence complementary to the oligonucleotide; And oligonucleotides selected from oligonucleotide derivatives of these oligonucleotides.
  • Osteoarthritis rheumatoid arthritis, asthma, autoimmune disease, atopic dermatitis, psoriasis, contact dermatitis, hair loss containing the polypeptide according to any one of (5) to (8) above Disease, ischemic heart disease, immune response associated with organ transplantation, hepatitis, nephritis, Tengitis, arteriosclerosis, leukemia, malignant tumor, wound, corneal ulcer, tissue injury, inflammation associated with infiltration of leukocytes, brain damage during stroke, A diagnostic, therapeutic or prophylactic agent for Alzheimer's disease, dementia, multiple sclerosis, Parkinson's disease or brain tumor.
  • a compound that regulates gene expression is detected by measuring the amount of mRNA encoding the polypeptide according to any one of (1) to (8) above.
  • Figure 1 compares the amino acid sequences of human MT5-MMP and mouse MT5-MMP with those of human MT1-MMP, MT2-MMP, MT3-MMP and human MT4-MMP (2).
  • FIG. 1 compares the amino acid sequences of human MT5-MMP and mouse MT5-MMP with those of human MT1-MMP, MT2-MMP, MT3-MMP and human MT4-MMP (2).
  • FIG. 7 is a diagram showing the result of examining the ability to perform.
  • RNA or mRNA To prepare a DNA library, prepare total RNA or mRNA from appropriate cells or tissues.
  • guanidine thiocyanate-cesium trifluoroacetate method As methods for preparing total RNA, guanidine thiocyanate-cesium trifluoroacetate method [Methods in Enzymology, 154, 3 (1987)], acid guanidine thiocyanate phenol clonal form (AGPC) method [Analytical Biochemistry, 162] , 156 (1987), Experimental Medicine, 1937 (1991)].
  • MRNA can also be prepared directly from tissues or cells using the kit.
  • the type of cDNA library containing the ESTs etc. of the DNA encoding MT4—MMP found in the database was used. It is preferable to use the cells or tissues used for examining and constructing the library, or cell lines derived from the tissues. In the case of MT5-MMP, it is preferable to use a tissue such as brain or kidney, or a cell line derived from the tissue, as an appropriate cell or tissue.
  • a cDNA library is prepared by an ordinary method.
  • Methods for preparing DNA libraries include methods described in Molecular Cloning, 2nd Edition, Current Protocols 1-38, DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University Press (1995), etc. Or a commercially available kit, for example, Superscript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning (superscript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning; manufactured by Gibco BRL) ⁇ Zap-c DNA 'Synthesis. Kit (ZAP-cDNA Synthesis Kit, manufactured by Stratagene) and the like.
  • any phage vector or plasmid vector can be used as long as it can replicate autonomously in the E. coli K12 strain.
  • any microorganism that belongs to Escherichia coli can be used. Specifically, Escherichia coli XLl-Blue MRF '(Stratagene, Strategies, 81 (1992)), Escherichia coli C600 [Genetics, 39, 440 (1954)], Escherichiacoli Y1088 (Science, 222, 778 ( 1983)), E_scheri_chia coli Y1090 [Science, 222, 778 (1983)], Escherichiacoli 522 [J. Mol. Biol., 166'1 (1983)], Escherichia coli K802 [J. Mol.
  • a commercially available cDNA library can also be used.
  • cDNA libraries examples include cDNA libraries of various organs derived from humans, mice, rats, rats, and egrets, such as Clonetech and Lifetech Oriental.
  • a cDNA clone having the DNA of the present invention was cloned using colony-hybridization method or plaque-hybridase method using an isotope or fluorescently labeled probe. It can be selected by the Chillon method [Molecular cloning second edition].
  • MT4-MMP (2) an oligonucleotide based on the nucleotide sequence of DNA encoding MT4-MMP, which has been partially identified, can be used.
  • MT 5—MMP copy MT 3—MMP.
  • Oligonucleotides based on the base sequence of the DNA to be loaded can be used. From the target clone obtained by the above method, mRNA is obtained by the above method, and cDNA is synthesized.
  • An adapter is added to both ends of the cDNA, and PCR is performed with primers based on the nucleotide sequence partially identifiable to the nucleotide sequence of this adapter.5'-RACE (rapid amplification of cDNA ends) and 3 ' -RACE [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85,
  • DNA fragments can be obtained.
  • the nucleotide sequence of the DNA obtained by the above method can be obtained by digesting the DNA fragment as it is or by using an appropriate restriction enzyme or the like and then incorporating the DNA fragment into a vector by a conventional method. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977)] or PerkinElmer (373A DNA sequencing), Pharmacia, Lycoa (LI-C0R), etc. Can be determined by analysis using a base sequence analyzer.
  • cells expressing the polypeptide of the present invention ie, MT4-MMP (2), for example, monocytic THP-1 cells, etc.
  • MT5-MMP for example, brain Chromosomal DNA, such as DNA and kidney, is digested with a restriction enzyme, and the digested fragment is cloned using an ordinary plasmid vector or phage vector to prepare a genomic library.
  • the polynucleotide of the present invention is obtained.
  • a clone having a genomic gene encoding a peptide can be obtained.
  • the nucleotide sequence of the genomic gene can be determined by the method described above. Can be.
  • the desired DNA can also be prepared by chemical synthesis using a DNA synthesizer.
  • the DNA synthesizer include a DNA synthesizer manufactured by Shimadzu Corporation using the thiophosphite method and a DNA synthesizer m0de1392 manufactured by Perkin'Elma Inc. using the phosphoramidite method.
  • nucleotide sequence database such as GenBank, EMBL and DDBJ using a homology search program such as BLAST.
  • search for amino acid sequence databases such as GenPept, PIR and Swiss-Prot using a homology search program such as FASTA or FrameSearch.
  • the DNA encoding MT4-MMP (2) which is a polypeptide of the present invention having a novel nucleotide sequence confirmed by the method, has, for example, a sequence represented by SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4. DNA etc. can be mentioned.
  • the pmMT4 / P BSSK as plasmid having a DNA comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3, as the plasmid having a DNA comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4 can be mentioned phMT4 / pBSIIKS .
  • Escherichia coli pmMT4 / pBSSK containing plasmid pmMT4 / pBSSK is FERM BP-6528
  • Escherichia coli phMT4 / pBSIIKS containing plasmid phMT4 / pBSIIKS is FERM BP-6530, September 1998. It has been deposited with the Institute of Biotechnology and Industrial Technology, the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology on 25th, 1-3 1-3 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan (zip code 305-8566).
  • DNA having the sequence represented by SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 8 and the like can be given.
  • the plasmid having the DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7 includes pmMT5 / pBSSK
  • the plasmid having the DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 8 includes phMT5 / pGEM.
  • Escherichia coli pmMT5 / pBSSK containing plasmid pmMT5 / pBSSK was designated as FE RM BP-6529
  • Escherichia coli phMT5 / pGEM containing plasmid phMT5 / pGEM was designated as FERM BP-6531. It has been deposited with the Institute of Biotechnology and Industrial Technology, the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology on March 25, 1-3 1-3 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan (zip code 305-8566).
  • ⁇ Oligonucleotides such as oligonucleotides can be prepared.
  • oligonucleotide examples include DNA having the same sequence as 5 to 60 consecutive nucleotides in the nucleotide sequence of the DNA or DNA having a sequence complementary to the DNA.
  • MT4-MMP (2) has a DNA having the same sequence as 5 to 60 contiguous bases in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 4, or a sequence complementary to the DNA DNA can be given.
  • MT5-MMP a DNA having the same sequence as 5 to 60 consecutive nucleotides in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7 or 8, or a DNA having a sequence complementary to the DNA Can be given.
  • Tm melting temperature
  • the number of bases of both do not extremely change are preferable.
  • oligonucleotide can also be used as the oligonucleotide of the present invention.
  • oligonucleotide derivative examples include an oligonucleotide derivative in which a phosphodiester bond in an oligonucleotide is converted into a phosphorothioate bond, and a phosphodiester bond in an oligonucleotide in which an N 3 ′ —P 5 ′ phosphoramide -Oligonucleotide derivative converted to glycan bond, oligonucleotide derivative where ribose and phosphodiester bond in oligonucleotide are converted to peptide nucleic acid bond, Peracyl in oligonucleotide substituted with C-15 propynylperacyl Oligonucleotide derivative in which peracyl in the oligonucleotide is substituted with C-5 thiazylperacyl, oligonucleotide derivative in which cytosine in the oligonucleotide is substituted with C-5 propynylcytosine,
  • a transformant that expresses the polypeptide of the present invention is prepared by preparing a recombinant vector in which the DNA of the present invention is inserted downstream of the promoter of an appropriate expression vector and introducing it into host cells. Obtainable.
  • any cell that can express the gene of interest such as bacteria, yeast, animal cells, and insect cells, can be used.
  • those capable of autonomous replication in the above-described host cell or integration into the chromosome, and containing a promoter at a position where the DNA of the present invention can be transcribed are used.
  • the polypeptide gene expression vector of the present invention is capable of autonomous replication in a prokaryote, and has a promoter, a liposome binding sequence, and a DNA of the present invention.
  • a recombination vector composed of a transcription termination sequence It is preferably one.
  • a gene that controls the promoter may be included. Examples of expression vectors include PKK233-2 (Pharmacia), PSE280 (Invitrogen), pGEMEX-1 (Promega), pQE-8 (Qiagen) , PKYP10 (JP-A-58-110600), pKYP200 (Agri Biol.
  • any promoter can be used as long as it can be expressed in host cells such as Escherichia coli and Bacillus subtilis.
  • trp promoter Ptrp
  • lac promoter PL promoter
  • PR promoter PR promoter
  • T7 promoter etc.
  • promoters derived from Escherichia coli or phage SP01 promoter, SP02 promoter, penP promoter, etc.
  • a promoter in which two Ptrps are connected in series Ptrpx 2
  • a tac promoter a lacT7 promoter
  • a promoter artificially designed and modified such as a let I promoter, or the like can also be used.
  • the ribosome binding sequence it is preferable to use a plasmid in which the distance between the Shine-Dalgarno sequence and the initiation codon is adjusted to an appropriate distance (for example, 6 to 18 bases).
  • a transcription termination sequence is not always necessary for expression of the DNA of the present invention, but it is preferable to arrange a transcription termination sequence immediately below a structural gene.
  • Host cells include microorganisms belonging to the genus Escherichia, Serratia, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium, Pseudomonas, etc., such as Escherichia coli XLl-Blue, Escherichia coli XL2-Blue, Escherichia coli DH1, Escherichia col i MC1000, Escherichia col i KY3276, Escherichia col i W1485, Escherichia col i JM109, Escherichia col i Thigh 01, Escherichia col i No.49, Escherichia col i W3110, Escherichia col i NY49, ariaratic Serratia font i col a.Serratia 1 iquefaciens, Serratia marcescens, Baci 1 lus subti 1 is, Baci 1 lus amylol iquefaciens, Bre
  • pCDM8 (Nature, 329, 840 (1987)), pcDNAl / Amp (manufactured by Invitrogen), REP4 (manufactured by Invitrogen), AGE103 [Journal of Biochemistry, Cycle, 1307 (1987)] and the like are used.
  • any promoter can be used as long as it can be expressed in animal cells.
  • the enhancer of the IE gene of human CMV may be used together with the promoter.
  • animal cells examples include Namaiwa cells, which are human cells, HEK293 cells (ATCC: CRL-1573), COS cells, which are monkey cells, CH0 cells, which are Chinese hamster cells, and HBT5637 (see 63- 299).
  • any method can be used as long as it introduces DNA into animal cells.
  • electro-boration method Catotechnology, 3, 133 (1990)
  • Calcium Phosphate Method Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-227075
  • Lipofection Method Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987), Virology, 52, 456 (1973)].
  • insect cells When insect cells are used as hosts, for example, Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, WH Freeman and Company, New York (1992), Current Protocols 1-38, Bio Technology, 6, 47 (1988), etc.
  • the polypeptide can be expressed by the method described in (1).
  • the recombinant gene transfer vector and the baculovirus are co-transfected into insect cells to obtain the recombinant virus in the insect cell culture supernatant, and then the recombinant virus is infected into the insect cells to transform the polypeptide. Can be expressed.
  • Examples of the gene transfer vector used in the method include pVL1392, pVL1393, pBlueBacIII (all manufactured by Invitrogen) and the like.
  • Examples of baculoviruses include viruses that infect insects belonging to the night roth moth family, such as Atographa, California, Nuclea, Polyhedrosis, and virus (Autographa cal ifornica nuclear polyhedrosis virus). You.
  • Examples of the method for co-transferring the above-described recombinant gene transfer vector and the above baculovirus into insect cells for preparing a recombinant virus include the calcium phosphate method (Japanese Patent Laid-Open No. 2-227075), the lipofection method (Pro Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)].
  • a sugar or a sugar chain-added polypeptide When expressed by yeast, animal cells or insect cells, a sugar or a sugar chain-added polypeptide can be obtained.
  • the polypeptide of the present invention can be produced by culturing the transformant obtained as described above in a medium, producing and accumulating the polypeptide of the present invention in the culture, and collecting from the culture. it can.
  • the polypeptide of the present invention is returned to the living body by introducing the polypeptide of the present invention into the patient's living body. It can also be expressed.
  • the method for culturing the transformant of the present invention in a medium can be performed according to a usual method used for culturing a host.
  • a culture medium for culturing a transformant obtained by using a prokaryote such as Escherichia coli or a eukaryote such as yeast as a host contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and the like which can be used by the organism. Either a natural medium or a synthetic medium can be used as long as the transformant can be cultured efficiently.
  • the carbon source may be any one that can be assimilated by the organism, such as glucose, fructose, sucrose, molasses, starch or starch hydrolyzate containing these.
  • Carbohydrates such as pulverized products, organic acids such as acetic acid and propionic acid, and alcohols such as ethanol and propanol can be used.
  • Nitrogen sources include ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium phosphate, and other ammonium or inorganic salts of organic acids, other nitrogen-containing compounds, and peptone, meat extract, yeast extract, and corn starch. 1. Casein hydrolyzate, soybean meal and soybean meal hydrolyzate, various fermented cells, digested products thereof, and the like can be used.
  • potassium potassium phosphate potassium potassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, calcium carbonate, and the like can be used.
  • the cultivation is usually carried out under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration stirring culture.
  • the culture temperature is preferably 15 to 40 ° C, and the culture time is usually 16 to 96 hours.
  • the pH is maintained at 3.0 to 9.0.
  • the pH is adjusted using an inorganic or organic acid, an alkaline solution, urea, calcium carbonate, ammonia, or the like.
  • an antibiotic such as ampicillin or tetracycline may be added to the medium during the culture.
  • an inducer may be added to the medium as necessary.
  • an inducer may be added to the medium as necessary.
  • indoleacrylic acid or the like may be added to the medium.
  • RPM 11640 medium The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)
  • Eagle's MEM medium The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)
  • DMEM medium DMEM medium
  • 199 medium Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)
  • fetal bovine serum An added medium or the like can be used.
  • the culture is usually performed under conditions such as pH 6 to 8, 30 to 40 ° C, and the presence of 5% C Perform for 7 days.
  • antibiotics such as kanamycin, penicillin and streptomycin may be added to the medium during the culturing.
  • TNM-FH medium manufactured by Pharmingen
  • Sf-900 II SFM medium Life Technology
  • ExCe l400 ExCe 1 1405
  • ExCe 1 1405 all manufactured by JRH Biosciences
  • Grace's Insect Med ium (Nature, 195, 788 (1962)) Etc.
  • the cultivation is usually performed under conditions of pH 6 to 7 and 25 to 30 ° C for 1 to 5 days.
  • an antibiotic such as gentamicin may be added to the medium during the culture.
  • an ordinary enzyme isolation and purification method may be used.
  • the polypeptide of the present invention when expressed in a lysed state in cells, after culturing, the cells are collected by centrifugation, suspended in an aqueous buffer, and then sonicated with a sonicator, French press, and mantongaurin. Crush cells with a homogenizer, dynomill, etc. to obtain a cell-free extract.
  • a normal enzyme isolation and purification method that is, a solvent extraction method, a salting out method using ammonium sulfate, a desalting method, a precipitation method using an organic solvent, or the like is used.
  • a solvent extraction method that is, a solvent extraction method, a salting out method using ammonium sulfate, a desalting method, a precipitation method using an organic solvent, or the like is used.
  • S-Sepharose FF Pulsepharose FF (Pharmacia) Chromatography using resins such as butyl-sepharose and phenylsepharose, gel filtration using molecular sieve, affinity chromatography
  • resins such as butyl-sepharose and phenylsepharose
  • gel filtration using molecular sieve affinity chromatography
  • a purified sample can be obtained by using techniques such as chromatofocusing and electrophoresis such as isoelectric focusing alone or in combination.
  • the polypeptide When the polypeptide is expressed in an insoluble form in cells, it is similarly expressed in detail.
  • the cells are collected, crushed, and the polypeptide is recovered from the precipitate fraction obtained by centrifugation in a usual manner, and the insoluble form of the polypeptide is solubilized with a protein denaturant. After diluting or dialyzing the solubilized solution to a solution containing no protein denaturing agent or a diluting concentration of the protein denaturing agent such that the protein is not denatured, and then constructing the polypeptide into a normal three-dimensional structure.
  • a purified sample can be obtained by the same isolation and purification method as described above.
  • the derivative such as the polypeptide or a sugar chain adduct thereof can be recovered in the culture supernatant. That is, a soluble fraction is obtained by treating the culture by a method such as centrifugation as described above, and a purified sample is obtained from the soluble fraction by using the same isolation and purification method as described above. be able to.
  • the membrane fraction of the cultured cells is dissolved with a surfactant to obtain a soluble fraction.
  • a purified sample can be obtained from the fraction by using the same isolation and purification method as described above.
  • the polypeptide of the present invention can also be produced by a chemical synthesis method such as the Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) and the tBoc method (t-butyloxycarbonyl method).
  • Fmoc method fluorenylmethyloxycarbonyl method
  • tBoc method t-butyloxycarbonyl method
  • Advanced ChemTech, Perkin Elma, Pharmacia and Protein 'Technology' Prote in Technology Instrument soil, Synthece léle vega -Vega), PerSeptive, Shimadzu, etc. can also be used for chemical synthesis using peptide synthesizers.
  • the protease activity of the polypeptide of the present invention obtained by the method described in the above [2] can be determined by measuring peptide or protein degradation products by electrophoresis or column chromatography, or by using fluorescent labeling or isotopic labeling. It is measured by degradation of the peptide or protein. It can also be detected by measuring the activation state of the enzyme that is activated by cleavage of the peptide. In the same manner as used for gelatin zymography, a gel containing a peptide degraded by the enzyme is used. Can also be measured.
  • Test samples include synthetic compounds, naturally occurring proteins, artificially synthesized proteins, peptides, carbohydrates, lipids, their modified forms and derivatives, and mammals (eg, mice, rats, guinea pigs, hamsters). Urine, body fluids, tissue extracts, cell culture supernatants, cell extracts, urine, pigs, sheep, wedges, pests, pomas, dogs, cats, monkeys, humans, etc., as well as non-peptide compounds, fermentative production And extracts of plants, plants and other organisms.
  • mammals eg, mice, rats, guinea pigs, hamsters.
  • Urine body fluids, tissue extracts, cell culture supernatants, cell extracts, urine, pigs, sheep, wedges, pests, pomas, dogs, cats, monkeys, humans, etc., as well as non-peptide compounds, fermentative production And extracts of plants, plants and other organisms.
  • a random peptide library can be used.
  • peptide systems on phage peptides on phage
  • PCT Patent Application No. 96/40189 on plasmid (US Patent No. 5,270,170; US Patent No. 5,338, 665).
  • the peptide of the present invention that binds to MT4-MMP (2) can be obtained by screening using a random peptide library.
  • the random peptide library includes peptide on phage systems (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 6378 (1990); PCT Patent Application No. 96/40189), and peptides on plasmids. Systems (peptides on plasmids) (US Patent No. 5,270,170; US Patent No. 5,338,665).
  • RNA extracted from human tissue-human-derived cells in the same manner as in [1] (2) is subjected to Northern hybridization to obtain its DNA.
  • the mRNA of the polypeptide gene of the present invention in cells or cells can be detected or quantified.
  • the tissue expression distribution of the polypeptide of the present invention can be known by comparing the mRNA expression levels in various tissues.
  • oligonucleotide of the present invention was used as a specific primer of the DNA of the present invention to extract RNA extracted from human tissue ⁇ human-derived cells in the same manner as [1] (2) by RT-PCR.
  • reverse transcription PCR; PCR Protocols (1990) can also be used to detect and quantify mRNA.
  • the importance of the gene product in the disease state can be clarified.
  • a drug can be evaluated by comparing the expression level of the polypeptide mRNA with or without the drug.
  • the oligonucleotide of the present invention or the oligonucleotide having the same nucleotide sequence or a complementary nucleotide sequence as a part of the nucleotide sequence of the DNA can be used as a probe in human tissue sections in situ.
  • finer expression distribution such as identification of expression cells of the polypeptide of the present invention in tissues can be known.
  • mutation of the gene encoding the polypeptide of the present invention is detected by performing Southern hybridization (molecular cloning, second edition) on the genomic DNA. be able to. Detecting mutations allows for the diagnosis of diseases that may be caused by mutations in the gene. Disconnection can be made.
  • MT4—MMP (2) for example, osteoarthritis, rheumatoid arthritis, asthma, autoimmune diseases, atopic dermatitis, psoriasis, contact dermatitis, alopecia, emptiness Diagnosis of diseases such as ischemic heart disease, immune reaction associated with organ transplantation, hepatitis, nephritis, knee inflammation, arteriosclerosis, leukemia, malignant tumor, and inflammation associated with leukocyte infiltration can be performed.
  • diseases such as ischemic heart disease, immune reaction associated with organ transplantation, hepatitis, nephritis, knee inflammation, arteriosclerosis, leukemia, malignant tumor, and inflammation associated with leukocyte infiltration.
  • osteoarthritis for example, osteoarthritis, rheumatoid arthritis, asthma, autoimmune diseases, atopic dermatitis, psoriasis, contact dermatitis, alopecia, ischemic heart disease, immune reactions associated with organ transplantation, hepatitis, nephritis
  • diseases such as knee inflammation, arteriosclerosis, leukemia, malignant tumor, cerebral dysfunction during stroke, Alzheimer's disease, dementia, multiple sclerosis, Parkinson's disease, brain tumor, and inflammation associated with leukocyte infiltration can be performed. .
  • the antisense oligonucleotide (RNA / DNA) of the present invention can be obtained by inhibiting the transcription of the gene encoding the polypeptide of the present invention or the translation of mRNA [Chem. 46, 681 (1991); Technology, 9, 358 (1992)], and is expected to be applied to treatment or prevention in which the gene may be involved in the pathogenesis.
  • diseases include, for example, osteoarthritis, rheumatoid arthritis, asthma, autoimmune diseases, atopic dermatitis, psoriasis, contact dermatitis, alopecia, and emptiness.
  • the above-mentioned antisense 'oligonucleotide is based on a partial nucleotide sequence of DNA encoding the polypeptide of the present invention, preferably a nucleotide sequence complementary to 10 to 50 nucleotides in the translation initiation region.
  • Design ⁇ Prepare and administer in vivo.
  • the drug containing the DNA of the present invention uses the same method as the drug containing the polypeptide of the present invention shown below, except that the DNA of the present invention is used instead of the polypeptide of the present invention. Prepared or administered.
  • the DNA of the present invention is used to obtain the polypeptide of the present invention by the method described in [2]. Can be obtained.
  • the polypeptides of the present invention may be used in the case of MT4-MMP (2), such as osteoarthritis, rheumatoid arthritis, asthma, autoimmune diseases, atopic dermatitis, psoriasis, and contact dermatitis. , Alopecia, ischemic heart disease, organ transplantation, hepatitis, nephritis, knee inflammation, arteriosclerosis, leukemia, malignant tumor, inflammation associated with leukocyte infiltration, etc., and a therapeutic or preventive agent are considered.
  • MT 5-MMP osteoarthritis, rheumatoid arthritis, asthma, autoimmune disease, atopic dermatitis, psoriasis, contact dermatitis, alopecia, ischemic heart disease, organ transplantation Diagnostics for hepatitis, nephritis, nephritis, arteriosclerosis, leukemia, malignant tumors, brain damage during stroke, Alzheimer's disease, dementia, multiple sclerosis, Parkinson's disease, brain tumors, inflammation associated with leukocyte infiltration A therapeutic or prophylactic drug could be considered.
  • the drug containing the polypeptide of the present invention can be administered alone as a diagnostic or therapeutic agent, but usually the polypeptide is one or more pharmacologically acceptable.
  • a carrier it is desirable to mix it with a carrier and provide it as a pharmaceutical preparation produced by any method well known in the technical field of pharmaceutics.
  • a sterile solution dissolved in water or an aqueous carrier such as an aqueous solution of salt, glycine, glucose, human albumin or the like is used.
  • pharmacologically acceptable additives such as buffering agents and tonicity agents to bring the formulation solution closer to physiological conditions, e.g., sodium acetate, sodium chloride, sodium lactate, potassium chloride, quencher Sodium acid or the like can also be added. It can also be freeze-dried for storage and dissolved in an appropriate solvent before use.
  • a parenteral route such as a subcutaneous, intramuscular, intravenous, or respiratory route is used.
  • the DNA of the present invention may be a single-stranded or double-stranded virus vector such as a retrovirus, an adenovirus, or an adeno-associated virus. It can be incorporated into other vectors to make a vector for gene therapy, and used for gene therapy.
  • virus vector such as a retrovirus, an adenovirus, or an adeno-associated virus. It can be incorporated into other vectors to make a vector for gene therapy, and used for gene therapy.
  • Example 1 Cloning of mouse MT4—MMP-related protein [; MT4-MMP (2)] gene
  • the mouse attached to the kit using the ZAP-cDNA Synthesis Kit (Stratagene) was used for the mouse 17-day embryo brain cDNA library. Created according to.
  • a human brain cDNA library (manufactured by Clontech) was screened using the sequence encoding the N-terminal part corresponding to the signal peptide of the mouse MT4-MMP (2) gene obtained in Example 1 as a probe. The gene could not be isolated. Therefore, the 5 'region of the transcript was analyzed by the 5' RACE method.
  • Cells were derived from THP-1 (ATCC) derived from monocytes in which MT4—MMP mRNA expression was confirmed.
  • TIB-202 American Type Culture Collection
  • cDNA was prepared using superscript II (manufactured by Gibco BRL) using poly (A) + RNA isolated from human THP-1 cells and a human MT4-MMP selective primer (SEQ ID NO: 9).
  • a single-stranded oligonucleotide adapter (SEQ ID NO: 10) was ligated to the obtained cDNA by T4 RNA ligase, and MT4-MMP selective primer (SEQ ID NO: 9) and adapter selective primer (SEQ ID NO: 11) was subjected to PCR using GC buffer and LA Taq (Takara Shuzo). After the PCR, PCR was performed using other primers (SEQ ID NO: 12) which are gene selective and primers which are selective for adapter (SEQ ID NO: 13).
  • the gene sequence of the H97792 clone of the EST clone was almost identical to the MT4-MMP reported by Puente (Cancer Research, 56, 944 (1996): SEQ ID NO: 17), but the sequence of the catalytic region was The EST clone H97792 was more conserved with the mouse MT4—MMP (2) . The entire sequence was newly determined, and the MT4—MMP reported by Puente was already MT4—MMP (2) also showed a different sequence in the clarified part.
  • Mouse and human MT4—MMP (2) are well conserved with each other, with 87, 87, 78, and 96% of the domains of the propeptide, the catalyst, the hinge, and the hemopoxin-clotting enzyme-like domain, respectively. Had the homology of The similarity between the signal peptide and the transmembrane site was relatively low at 54 and 35%. The comparison between the catalytic domain of human MT4-MMP (2) and MT1-MMP, MT2-MMP, MT3-MMP was 36, 39, and 31%, respectively. From this, it was concluded that mouse MT 4 -MMP (2) was closest to human MT4-MMP (2) and was a mouse homolog of human MT4-MMP (2).
  • Example 3 Expression of MT 4 -MMP (2) and Detection of Gene Product
  • the cDNA was incorporated into pSG5 vector-1 (Stratagene) having the SV40 promoter.
  • pSG5 vector-1 (Stratagene) having the SV40 promoter.
  • detection by an anti-FLAG antibody was made possible by incorporating a FLAG sequence (manufactured by Eastman Chemical Company) downstream of the processing site of the latent enzyme.
  • the expression plasmid of mouse and human MT4-MMP (2) was transfected into COS-1 cells, and the cells collected after 48 hours were lysed. Detection was performed. Both of the anti-FLAG antibody M2 (manufactured by Eastman Chemical) detected a 66 kDa band specific to cells transfected with the expressed plasmid.
  • M2 manufactured by Eastman Chemical
  • the MT4—MMP transcript Since the MT4—MMP transcript has an Alu sequence at the 5 ′ end, it may contain introns. Therefore, a partial sequence of the human MT4—MMP (2) gene (SEQ ID NO: 4, 212- Using the portion shown in (5) to (9) as a probe, clones to be hybridized were isolated by the rehybridization method from the library 1 (Deposit> No. LI020) of the Human Science Research Resource Bank, and the clones were cloned. Liplasmid was extracted by a conventional method, and the gene sequence around the base sequence near the 5 'end of MT4-MMP (Nos. 140 to 272 of SEQ ID NO: 17) contained in the plasmid was examined.
  • the MT 4—MMP gene sequence (No. 1-139 of SEQ ID NO: 17) in the region where homology is lost is the genomic sequence (SEQ ID NO: 17). It almost coincided with No. 3008 to No. 3147 of 18), and a splicing donor array existed at the boundary.
  • the exon-encoding sequence of MT4—MMP (SEQ ID NO: 17 at positions 140 to 340) almost matched the genome sequence (SEQ ID NO: 18) at positions 148 to 3280 and 3564 to 3633. From the above results, it was concluded that the transcript leaving the first ⁇ (intron) was MT4-MMP. From the above results, it was considered that two types of mRNAs, MT4-MMP and MT4-MMP (2), were expressed in humans.
  • MT4-MMP is expressed only in cells that express MT4-MMP (2). I was
  • mice The most highly expressed organs were the cerebrum, cerebellum, brainstem, large intestine, uterus, and testes. Little expression was observed in the adrenal gland, mammary gland, and placenta. The expression results in mice were consistent with those reported in human tissues by Puente et al. [Cancer Research, 56, 944 (1996)].
  • mice MT4-MMP (2) partial peptide (hemoxin clotting enzyme-like domain) having a sequence with a methionine residue added to the N-terminus of the amino acid sequence shown in positions 32 to 550 of SEQ ID NO: 1
  • the cDNA was amplified by polymerase chain reaction (PCR) using mouse MT4-MMP (2) cDNA as type III.
  • the amplified fragment obtained was subcloned into pET3a (Takara Shuzo), an Escherichia coli expression vector, and further introduced into Escherichia coli strain BL2KDE3) pLysS (Takara Shuzo).
  • pET3a Takara Shuzo
  • Escherichia coli expression vector an Escherichia coli expression vector
  • pLysS (Takara Shuzo).
  • 0D 6 The E. coli in the presence of ampicillin lOO ⁇ g / mL, in the expression medium of 1 L. . And culture until 0.4 is reached, and 0.4 t ol / L of isopropyl-1-3-D-thiogalactovyranoside After stimulation with (IPTG), the cells were further cultured for 3 hours.
  • a granule (inclusion body) consisting of mouse MT4-MMP (2) partial peptide formed in E. coli based on a conventional method was obtained, and 8 mol / L urea and 50 mmol / L Tris-HC1 ( It was dissolved in a lysate containing pH 8.6) and 20 mmol / dithiothreitol (DTT). The lysate was applied to a High Q anion exchange column, and a 0.2 mol / L sodium chloride eluted fraction was collected.
  • the fraction was treated with 50 mmol / L Tris-HCl (pH 8.6), 6 mol / L urea, 1 mmol / L dithiothrate, 0.15 mol / L sodium chloride, 5 mmol / L calcium chloride, 100 mmol / L zinc chloride
  • the solution was diluted with a solution containing 0.02% sodium azide, and cystamine (final concentration: 20 mmol / L) was added to the diluted solution. Then, 50 mmol / L Tris-HCl
  • PCR polymerase chain reaction
  • the obtained amplified fragment was subcloned into pRSET (manufactured by Invitrogen) which is an expression vector of E. coli.
  • the expressed enzyme is a 6X His sequence in the leader sequence from pRSET. Was expressed as a fusion protein.
  • the vector is
  • the Escherichia coli was cultured in the presence of 100 ig / mL ampicillin in 1 L of expression medium (tryptone 12 g / L, yeast extract 24 g / L, sodium chloride 10 g / L, trisma base 250 mg / L, glycerol 4 mL / D was stimulated with 0.4 mar ol / L of isopropyl-1- ⁇ -D-thiogalactopyranoside (IPTG) and cultured for an additional 3 hours.
  • IPTG isopropyl-1- ⁇ -D-thiogalactopyranoside
  • Granules composed of (propeptide domain + active domain) were obtained and dissolved in a lysate containing 8 mol / L urea and 50 mmol / L Tris-HCl (H 8.6). The lysate was applied to a nickel chelate column, and a 250 mmol / L imidazole-eluted fraction was collected.
  • MMP is activated by trypsin treatment and shows metalloprotease activity Is known to be.
  • MT4—MMP (2) was also examined for reactivation by such treatment by the following method.
  • Atsushi activating enzyme IOL was added with a measuring buffer or an inhibitor diluted with the measuring buffer (TIMP-1 or TIMP-2; final concentration l ⁇ g / mL) to make 50 zL. Then, 50 L of ⁇ / L fluorescent substrate was added, and the mixture was reacted at 37 ° C for 120 minutes. At each reaction time, the fluorescence generated by the enzyme activity was measured. The fluorescence was measured at an excitation wavelength of 320 nm and a fluorescence wavelength of 395 nm.
  • the reagents and substrates used are as follows.
  • ⁇ fluorescent substrate DMSO stock (10 mmol / L ); M0CAc-Pro-Leu-G 1 y-Leu-A 2 pr (Dnp) -A 1 a- Arg-NH 2 ( Peptide Institute)
  • Table 2 shows the measurement results of the activity. As with other MMPs, strong substrate degradation activity was observed with the MT4-MMP (2) partial peptide, particularly the MT4-MMP (2) partial peptide after activation with trypsin.
  • TIMP-1 which is a meta-oral proteinase inhibitor
  • TIMP-2 a meta-oral proteinase inhibitor
  • MT4-substitute P (2) is a kind of MT-MMP.
  • Table 2 Human MT4-MMP (2) Activity measurement of partial peptide (active domain) Sample Trypsin treatment Inhibitor Fluorescence intensity
  • mice cDNA cDNA library of 17-day embryo was prepared using the ZAP-cDNA Synthesis Kit (Stratagene) according to the manual attached to the kit.
  • the above cDNA library was screened by the plaque hybridization method. Since blacks showing strong and weak signals were obtained, the nucleotide sequences of those clones were determined.
  • the cDNA was prepared using superscript II (Gibco BRL), using human brain poly (A) + RNA (Clontech) and a human MT5-MMP selective primer (SEQ ID NO: 19). It was prepared according to the manual attached to the kit.
  • a single-stranded oligonucleotide adapter (SEQ ID NO: 10) was ligated to the obtained cDNA by T4 RNA ligase, and an MT5-MMP selective primer (SEQ ID NO: 19) and an adapter selective primer One (SEQ ID NO: 11) was subjected to PCR using a GC buffer and LA Taq (Takara Shuzo).
  • MT5-MMP gene expression in tissues was examined by Northern 'plotting. That is, 20 total RNAs were electrophoresed on a 1% agarose gel, transcribed on a nylon membrane, and Northern Plotting was performed using the mouse MT5-MMP gene labeled with 32 P as a probe. The expression pattern of MMP mRNA was examined.
  • the expression in human tissues was examined by multiple tissue blot (Clontech) using the human MT5-MMP gene as a probe, and it was highly expressed in the brain.
  • Northern blotting was performed using the MT5-MMP gene labeled with 32 P as a probe, and strong expression of 4.O kb and 4.8 kb MT5-MMP mRNA was also observed in the human brain.
  • expression was also observed in kidney and kidney. 4.8 kb mRNA power in brain 4. O kb mRNA was strongly expressed in kidney and knee.
  • mice and humans When the expression of MT5-MMP was examined in mice and humans, characteristic expression was found in the brain. Especially in mice, expression was localized in the brain, and expression in other organs was very low.
  • MT5-MMP High expression of MT5-MMP was observed in the cerebellum, as well as in the cerebral cortex, medulla, occipital region, frontal region, temporal region, and putamen, but in the spinal cord. Nakata.
  • MT5-MMP may regulate the degradation of extracellular matrix around cells during processes such as the formation and maintenance of brain tissue and the construction of neural circuits.
  • MT1-MMP is frequently expressed in many cancer tissues, in the cancer cells themselves and in surrounding stromal cells, and acts as a tissue-level activator of gelatinase A. Expression in various cancer cell lines was examined by RT-PCR using MT5-MMP specific primers (SEQ ID NOs: 21 and 22).
  • Table 3 shows the results. Table 3 Expression of MT5-MMP transcript in cancer cells Cancer cell line MT5-MP Deposit number
  • MIA PaCa-2 pancreatic ATCC CRL-1420
  • MT 1-MMP is expressed in various cancer cell lines, whereas MT 5 -MMP is expressed in a limited number of cells.
  • Tumor SK-N-SH (HTB-11, ATCC)
  • undifferentiated darioma ⁇ ⁇ 10 (IF050368, Fermentation Research Laboratories)
  • Darioma KALS-1 (IF050434, Fermentation Research Laboratories)
  • knee cancer CPANC-1 (CRL-1469, ATCC), MIA PaCa-2 (CRL-1420, ATCC)), liver cancer CSK-HEP-1 (HTB-52, ATCC), Hep 3B (HB-8064, ATCC)) is characteristic.
  • M T—M M P Abnormal expression of M T—M M P on the cell surface is considered to enhance cell invasiveness.
  • overexpression of MT1-MMP enhances the invasive potential of cancer cell lines and increases the incidence of experimental metastasis.
  • cancer cells and surrounding fibroblasts frequently express MT1-MMP, and the presence of gelatin, which activates MT1-MMP at the expression site, is associated with cancer invasion. Correlates well with metastasis.
  • a cDNA encoding a mouse MT5-MMP partial peptide having a sequence in which a methionine residue is added to the N-terminus of the amino acid sequence shown in positions 40 to 300 of SEQ ID NO: 5 was used, and a mouse MT5-MMP cDNA was used as type III.
  • the Escherichia coli was cultured in the presence of lOOzg / mL ampicillin in 1 L of an expression medium (tryptone 12 g / L, yeast extract 24 g / L, sodium chloride 10 g / L, trisma base 250 mg / L, The cells were cultured with glycerol (4 mL / L) until the 0D line became 0.5, and further cultured for 3 hours after stimulation with 0.4 tnmol / L of isopropyl / 3-D-thiogalactovyranoside (IPTG). After cultivation, the mouse MT5—banded P-partial peptide formed in E.
  • an expression medium tryptone 12 g / L, yeast extract 24 g / L, sodium chloride 10 g / L, trisma base 250 mg / L
  • the cells were cultured with glycerol (4 mL / L) until the 0D line became 0.5, and further cultured for 3 hours after stimulation
  • coli was obtained according to a standard method to obtain granules (inclusion body), and 8 moi / L urea, 50 t ol / L Tris-HC1 (p H8.6) and 20 mmol / dithiothreitol (DTT).
  • the lysate was applied to a Q-Anion ion exchange column, and a fraction eluted with 0.1 M NaCl was collected.
  • the fraction was subjected to 50 imnol / L Tris-HC1 (pH 8.6), 6 mol / L urea, 1 mmol / L dithiothreitol, 0.15 moi / L sodium chloride, 5 ol / L calcium chloride, 100 mmol / L It was diluted with a solution containing zinc chloride and 0.02% sodium azide, and cystamine (final concentration 20 mmol / L) was added to the diluted solution.
  • the obtained supernatant was concentrated with Amicon YM-10 (manufactured by Millipore) and treated with 0.16 g / mL trypsin for 30 minutes at 37 ° C. After inactivating trypsin with 1 mmol / L DTT, a buffer solution containing 50 mmol / L Tris-HCl (pH 7.5), 150 mmol / L sodium chloride, 10 mmol L calcium chloride and 0.02% sodium azide The mixture was passed through an S-200 column chromatograph equilibrated in step 1 and subjected to gel filtration to obtain a mouse MT5-MMP partial peptide (propeptide domain + active domain).
  • ProMMP-2 final g / mL
  • MT-5 MMP partial peptide propeptide domain + active domain
  • final concentration 1 g / mL was mixed and incubated at 37 ° C for 1 hour.
  • Brij i 35 added TNC buffer [50 mmol / L Tris-HCl (pH 7.5), 150 mmol / L NaCl, 10 mmol / L CaCl 2 , 0.02% NaN 3 , 0.05% Briji 35] was used.
  • an equal amount of SDS / PAGE Loading buffer was added to the sample, electrophoresed according to a standard method, and Coomassie staining was performed.
  • novel MT4-MMP (2) polypeptide DNA obtained according to the present invention provides osteoarthritis, rheumatoid arthritis, asthma, autoimmune diseases, atopic dermatitis, psoriasis, contact dermatitis Diagnosis and prevention of alopecia, ischemic heart disease, immune reactions associated with organ transplantation, hepatitis, nephritis, knee inflammation, arteriosclerosis, wounds including corneal ulcers, leukemia, cancer, inflammation involving leukocyte infiltration, etc. Treatment becomes possible.
  • osteoarthritis rheumatoid arthritis, asthma, autoimmune disease, atopic dermatitis, psoriasis, contact dermatitis , Alopecia, ischemic heart disease, immune reactions associated with organ transplantation, hepatitis, nephritis, knee inflammation, arteriosclerosis, wounds including corneal ulcers, leukemia, brain damage during stroke, Alzheimer's disease, dementia, multiple sclerosis It enables the diagnosis, prevention and treatment of diseases such as Parkinson's disease, brain tumors, cancer, and inflammation involving leukocyte infiltration.
  • diseases such as Parkinson's disease, brain tumors, cancer, and inflammation involving leukocyte infiltration.

Description

明 細 書
新規ポリペプチドをコードする D N A 技 術 分 野
本発明は、新規膜貫通型マトリックスメタ口プロテア一ゼポリべプチド、該ポリ ペプチドをコードする DNA、 該 DN Aを含むベクタ一、 該ベクタ一で形質転換 された形質転換体および該ポリペプチドの製造方法に関する。 更に、 該ポリぺプ チドもしくはその一部又はそれらを発現した微生物もしくは動物細胞を利用した 阻害薬または活性化薬を探索する方法および該ポリぺプチドの遺伝子発現を調節 する化合物を探索する方法に関する。 背 景 技 術
コラーゲン、 フイブロネクチン、 ラミニン、 プロテオダリカン等の複雑な成分 から構成される細胞外マトリックスの分解には、 金属イオンを活性中心に持つマ トリックスメタ口プロテアーゼと総称される一群の酵素 （以下 MMP sと略記す る） が関与している。
これまで MMP sとしては、 間質型コラゲナ一ゼ（MMP— 1 )、 ゼラチナーゼ A (MMP— 2)、 ゼラチナーゼ B (MMP— 9)、 ストロメライシン 1 (MMP 一 3)、 マトリライシン （MMP— 7)、 好中球コラゲナ一ゼ （MMP— 8)、 スト ロメライシン 2 (MMP— 1 0)、 ストロメライシン 3 (MMP— 1 1 )、 メタ口 エラスタ一ゼ （MMP— 1 2)、 コラゲナーゼ 3 (MMP— 1 3)、 膜貫通型 MM P— 1 (MT 1— MMPまたは MMP— 14)、 膜貫通型 MMP— 2 (MT 2 -M MPまたは MMP— 1 5)、膜貫通型 MMP— 3 (MT 3— MMPまたは MMP— 1 6)、 膜貫通型 MM P— 4 (MT 4— MMPまたは MMP— 1 7)等が報告され ている 〔蛋白質核酸酵素， ^， 2386 (1997)〕。 これらの MM P sはファミリ一を 形成し、 各 MMPは基本的に N—末端プロペプチドドメイン、 亜鉛イオンが結合 する活性ドメイン、へモぺキシン凝血酵素様ドメインの 3つから構成されている。 MMP - 7においてはへモぺキシン凝血酵素様ドメインはない。 膜貫通型では、 へモぺキシン凝血酵素様ドメインの C—末端に膜貫通ドメインと、 細胞内ドメイ ンを持っている。
ヒト MT 4—MMP遺伝子は既に報告されているが〔Puente： Cancer Research, 56, 944 (1996)〕、 該遺伝子の塩基配列には翻訳開始領域が含まれておらず、 単に MMPに類似したドメイン領域を有する塩基配列を含んでいるとして定義された 遺伝子である。 従って、 該遺伝子は MT 4— MMP完全長をコードしているとは 考えにくい。
一方、 変形性関節症の患者において MT 1一 MMPの産生が促進されているこ と 〔Am. J. Pathol, 151, 245 (1997)〕、 免疫や炎症反応に重要な白血球の組織へ の浸潤に MM Pが重要なこと 〔J. Immunol., 156, 1 (1996)〕、 MMP阻害薬が肝 炎を予防すること 〔Eur. J. Pharmacol, 3 I, 105 (1998)〕、 MMP阻害薬が角膜 潰瘍の治療 〔日本眼科学会誌， 270 (1998)] に有効であること等が知られて いる。
また、 癌の増殖、 浸潤、 転移に MMPが重要であることが知られており 〔蛋白 質核酸酵素， ， 2386(1997)〕、 MM P阻害薬が制癌活性をもつことが報告されて いる (SCRIP, 2349, 20 (1998)〕。
更に、 MT 4— MMPは白血球に発現して、 白血球の遊走と浸潤に関係がある ことが示唆されている。
以上のことから、 MM Pは変形性関節症、 慢性関節リウマチ、 喘息、 自己免疫 疾患、 アトピー性皮膚炎、 乾癬、 接触性皮膚炎、 脱毛症、 虚血性心疾患、 臓器移 植に伴う免疫反応、 肝炎、 腎炎、 脬炎、 動脈硬化、 白血病、 悪性腫瘍、 創傷、 角 膜潰瘍、 組織傷害、 白血球の浸潤に伴う炎症を診断する指標となるとともに、 そ の阻害薬はこれらの疾患の予防と治療に用いることができる。
既に報告されている MT 4— MMP [Cancer Research, 56, 944 (1996)] は、 転写開始点を含まず、 従来知られている MT 1— MMP等の膜貫通型 MMPに見 られるようなドメイン構造を持っていないため、 生体内では発現していない非生 理的なぺプチドをコードした配列である。
本発明は、 従来報告されている MT 4— MMPとは異なり、 生理的に活性を持 つた新規膜貫通型マトリックスメタ口プロテアーゼポリペプチド 〔以下、 MT4 — MMP (2) と略すこともある〕、 該メタ口プロテア一ゼポリペプチドをコード する D N A、 該メタ口プロテァーゼポリぺプチドの製造法および該メタ口プロテ ァ一ゼポリペプチドおよび D N Aを用いた阻害薬や活性化薬スクリ一ニング法等 を提供する。
また、 本発明は、 生理的に活性を持ったヒトおよびマウスの新規膜貫通型マト リックスメタ口プロテア一ゼポリぺプチド 〔以下、 M T 5一 MM Pと略す〕、 該メ タロプロテアーゼポリペプチドをコードする DNA、 該メタ口プロテアーゼポリべ プチドの製造法および該メタ口プロテア一ゼポリべプチドおよび DNAを用いた阻 害薬や活性化薬スクリーニング法等を提供する。 発 明 の 開 示
本発明者は、既知のヒト M T 4— MM Pは本来の活性を有する蛋白質ではなく、 活性を有する真の M T 4— MM Pが存在するとの推測の基に鋭意検討を行い、 本 発明を完成するに至った。
また、 本発明者は、 医薬用途として有用と考えられている既知の膜貫通型 MM P以外にも、 有用な新規膜貫通型 MM Pが存在するとの推測の基に鋭意検討を行 い、 本発明を完成するに至った。 すなわち、 本発明は以下 （ 1 ) 〜 （3 2 ) に関する。
( 1 ) 配列番号 1記載のァミノ酸配列からなるポリぺプチド。
( 2 ) 上記 （ 1 ) 記載のポリペプチドの有するアミノ酸配列において 1もしくは 数個のアミノ酸が欠失、 置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつメ タロプロテアーゼ活性を有するポリペプチド。
( 3 ) 配列番号 2記載のアミノ酸配列からなるポリぺプチド。
( 4 ) 上記 （3 ) 記載のポリペプチドの有するアミノ酸配列において 1もしぐは 数個のアミノ酸が欠失、 置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつメ タロプロテアーゼ活性を有するポリペプチド。
上記 （2 ) 及び （4 ) のアミノ酸の欠失、 置換若しくは付加は、 出願前周知技 術である部位特異的変異誘発法により実施することができ、 また、 1若しくは数 個のアミノ酸とは、 部位特異的変異誘発法により欠失、 置換若しくは付加できる 程度の数のアミノ酸を意味する。
かかる 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配 列からなり、 かつメタ口プロテア一ゼ活性を有するポリペプチドは、 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) (以下、 モレキュラー クローニング 第 2版と略す）、 Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜 38， John Wiley & Sons (1987-1997) (以下、 カレント ' プロトコ一ルズ 1〜 3 8と略す）、 Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409(1982)、 Gene, 34, 315 (1985)、 Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985)、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5662 (1984)、 Science, 224, 1431 (1984)、 PCT W085Z00817(1985) 、 Nature, 316, 601 (1985)等に記載 の方法に準じて調製することができる。
( 5 ) 配列番号 5記載のァミノ酸配列からなるポリぺプチド。
(6) 上記 （5) 記載のポリペプチドの有するアミノ酸配列において 1もしくは 数個のアミノ酸が欠失、 置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつメ タロプロテアーゼ活性を有するポリべプチド。
( 7 ) 配列番号 6記載のァミノ酸配列からなるポリぺプチド。
(8) 上記 （7) 記載のポリペプチドの有するアミノ酸配列において 1もしくは 数個のアミノ酸が欠失、 置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつメ タロプロテアーゼ活性を有するポリべプチド。
(9) 上記 （ 1 ) から （4) のいずれかに記載のポリペプチドをコードする DN A。
( 1 0) 上記 （ 5) から （8) のいずれかに記載のポリペプチドをコードする D NA。
( 1 1 ) 配列番号 3の 86〜 1 846番または配列番号 4の 1 00〜 1 9 1 7番 に記載の塩基配列からなる DNAまたは該 DNAとストリンジェントな条件下で ハイプリダイズし、 かつメタ口プロテアーゼ活性を有するポリべプチドをコード する DNA。
上記において 「ストリンジェントな条件下でハイブリダィズする DNA」 とは、 配列番号 3の 86〜 1 846番または配列番号 4の 1 00〜 1 9 1 7番に記載の 塩基配列からなる DNAをプローブとして、 コロニー ·ハイプリダイゼ一ション 法、 プラーク · ハイブリダィゼーシヨン法あるいはサザンブロットハイブリダィ ゼーシヨン法等を用いることにより得られる DNAを意味し、 具体的には、 コロ 二一あるいはプラーク由来の DNAを固定化したフィルターを用いて、 0. 7〜 1. 0 m 0 1 ZLの N a C I存在下、 65 °Cでハイブリダィゼ一シヨンを行った 後、 0. 1〜 2倍濃度の S S C (saline-sodiumcitrate) 溶液 （ 1倍濃度の S S C溶液の組成は、 1 50 mm 0 1 ZL 塩化ナトリウム、 1 5mmo l ZL クェ ン酸ナトリウムよりなる） を用い、 65°C条件下でフィルタ一を洗浄することに よリ同定できる DNAをあげることができる。
ハイブリダィゼ一シヨンは、 モレキュラー クロ一ニング 第 2版、 カレント プ ロトコル イン モレキユラ バイオロジー、 D N A Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University Press (1995)等の 実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。
ハイブリダイズ可能な DN Aとして具体的には、 配列番号 3の 86〜 1 846 番または配列番号 4の 1 00〜 1 9 1 7番に記載の塩基配列と少なくとも 80 % 以上の相同性を有する DNA、 好ましくは 95 %以上の相同性を有する DNAを あげることができる。
( 1 2) 配列番号 7の 75〜 1 928番または配列番号 8の 1〜 1 935番に記 載の塩基配列からなる DNAまたは該 DNAとストリンジェントな条件下でハイ プリダイズし、 かつメタ口プロテア一ゼ活性を有するポリべプチドをコードする DNA。
上記において 「ストリンジェントな条件下でハイブリダィズする DNA」 とは、 配列番号 7の 7 5〜 1 928番または配列番号 8の 1〜 1 935番に記載の塩基 配列からなる DNAをプローブとして、 コロニー ·ハイプリダイゼーション法、 プラーク ·ハイブリダィゼーシヨン法あるいはサザンブロットハイブリダィゼ一 シヨン法等を用いることにより得られる DNAを意味し、 具体的には、 コロニー あるいはプラーク由来の DNAを固定化したフィルターを用いて、 0. 7〜 1. 0 m o l L·のN aC l存在下、 65 °Cでハイブリダィゼーシヨンを行った後、 0. 1〜2倍濃度の38じ （saline- sodium citrate) 溶液 （ 1倍濃度の S S C溶 液の組成は、 1 5 Ommo 1 ZL 塩化ナトリウム、 1 5mmo l ZL クェン酸 ナトリウムよりなる） を用い、 6 5°C条件下でフィルターを洗浄することにより 同定できる DN Aをあげることができる。
ハイプリダイズ可能な DN Aとして具体的には、 配列番号 7の 7 5〜 1 928 番または配列番号 8の 1〜 1 935番に記載の塩基配列と少なくとも 80%以上 の相同性を有する DNA、 好ましくは 95 %以上の相同性を有する DN Aをあげ ることができる。
( 1 3) 上記 （9) から （ 1 2) のいずれかに記載の DNAをベクターに組み込 んで得られる組換え体 DNA„
( 14) 上記 （ 1 3) 記載の組換え体 DN Aを保有する形質転換体。
( 1 5) 形質転換体が Escherichia属に属する微生物である、 上記 （ 14) 記載 の形質転換体。
( 1 6) Escherichia属に属する微生物が Escherichia col iである、 上記 （ 1 5) 記載の形質転換体。
( 1 7) 上記 （ 1 ) から （8) のいずれかに記載のポリペプチドをコードする D N Aをべクタ一に組み込んで得られる組換え体 DN Aを保有する形質転換体を培 養液中で培養し、 該ポリペプチドを該培養物中に生成 ·蓄積させ、 該培養物中よ リ該ポリぺプチドを採取することを特徴とする、 該ポリべプチドの製造法。
( 1 8) 上記 （9) または （ 1 1 ) のいずれかに記載の DN Aの有する塩基配列 中の連続した 5〜 60塩基と同じ配列を有するオリゴヌクレオチド、 該オリゴヌ クレオチドと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド、 およびこれらオリゴヌ クレオチドのォリゴヌクレオチド誘導体から選ばれるオリゴヌクレオチド。
( 1 9) 上記 （ 1 0) または （ 1 2) のいずれかに記載の DNAの有する塩基配 列中の連続した 5〜60塩基と同じ配列を有するオリゴヌクレオチド、 該オリゴ ヌクレオチドと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド、 およびこれらオリゴ ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド誘導体から選ばれるオリゴヌクレオチド。
(20) 上記 （ 1 8) または （ 1 9) に記載のオリゴヌクレオチドを用いて上記 ( 1 ) から （8) のいずれかに記載のポリペプチドをコードする mRN Aを検出 する方法。
( 2 1 ) 上記 （ 1 8) または （ 1 9 ) に記載のオリゴヌクレオチドを用いて上記
( 1 ) から （8) のいずれかに記載のポリペプチドの発現を抑制する方法。
(22) 上記 （ 1 ) から （8) のいずれかに記載のポリペプチドおよび該ポリべ プチドを発現する細胞を用いることを特徴とする、 該ポリべプチドの阻害薬また は活性化薬のスクリーニング法。
(23) 上記 （ 1 ) から （4) のいずれかに記載のポリペプチドを含有する変形 性関節症、 慢性関節リウマチ、 喘息、 自己免疫疾患、 アトピー性皮膚炎、 乾癬、 接触性皮膚炎、 脱毛症、 虚血性心疾患、 臓器移植に伴う免疫反応、 肝炎、 腎炎、 膝炎、 動脈硬化、 白血病、 悪性腫瘍、 創傷、 角膜潰瘍、 組織傷害または白血球の 浸潤に伴う炎症の診断薬、 治療薬または予防薬。
(24) 上記 （5) から （8) のいずれかに記載のポリペプチドを含有する変形 性関節症、 慢性関節リウマチ、 喘息、 自己免疫疾患、 アトピー性皮膚炎、 乾癬、 接触性皮膚炎、 脱毛症、 虚血性心疾患、 臓器移植に伴う免疫反応、 肝炎、 腎炎、 滕炎、 動脈硬化、 白血病、 悪性腫瘍、 創傷、 角膜潰瘍、 組織傷害、 白血球の浸潤 に伴う炎症、 脳卒中時の脳障害、 アルツハイマー病、 痴呆症、 多発性硬化症、 パ 一キンソン病または脳腫瘍の診断薬、 治療薬または予防薬。
(25) 上記 （9) または （ 1 1 ) 記載の DNAを含有する変形性関節症、 慢性 関節リウマチ、 喘息、 自己免疫疾患、 アトピー性皮膚炎、 乾癬、 接触性皮膚炎、 脱毛症、 虚血性心疾患、 臓器移植に伴う免疫反応、 肝炎、 腎炎、 脬炎、 動脈硬化、 白血病、 悪性腫瘍、 創傷、 角膜潰瘍、 組織傷害または白血球の浸潤に伴う炎症の 診断薬、 治療薬または予防薬。
(26) 上記 （ 1 0) または （ 1 2) 記載の DN Aを含有する変形性関節症、 慢 性関節リウマチ、 喘息、 自己免疫疾患、 アトピー性皮膚炎、 乾癬、 接触性皮膚炎、 脱毛症、 虚血性心疾患、 臓器移植に伴う免疫反応、 肝炎、 腎炎、 膝炎、 動脈硬化、 白血病、 悪性腫瘍、 創傷、 角膜潰瘍、 組織傷害、 白血球の浸潤に伴う炎症、 脳卒 中時の脳障害、 アルツハイマー病、 痴呆症、 多発性硬化症、 パーキンソン病また は脳腫瘍の診断薬、 治療薬または予防薬。
(27) 上記 （ 1 8) 記載のオリゴヌクレオチドを含有する変形性関節症、 慢性 関節リウマチ、 喘息、 自己免疫疾患、 アトピー性皮膚炎、 乾癬、 接触性皮膚炎、 脱毛症、 虚血性心疾患、 臓器移植に伴う免疫反応、 肝炎、 腎炎、 膝炎、 動脈硬化、 白血病、 悪性腫瘍、 創傷、 角膜潰瘍、 組織傷害または白血球の浸潤に伴う炎症の 診断薬、 治療薬または予防薬。
(28) 上記 （ 1 9) 記載のオリゴヌクレオチドを含有する変形性関節症、 慢性 関節リウマチ、 喘息、 自己免疫疾患、 アトピー性皮膚炎、 乾癬、 接触性皮膚炎、 脱毛症、 虚血性心疾患、 臓器移植に伴う免疫反応、 肝炎、 腎炎、 膝炎、 動脈硬化、 白血病、 悪性腫瘍、 創傷、 角膜潰瘍、 組織傷害、 白血球の浸潤に伴う炎症、 脳卒 中時の脳障害、 アルツハイマー病、 痴呆症、 多発性硬化症、 パーキンソン病また は脳腫瘍の診断薬、 治療薬または予防薬。
(29) 上記 （ 9 ) または （ 1 1 ) の D N A、 または上記 （ 1 8 ) 記載のオリゴ ヌクレオチドをベクターに組み込んで得られる、 変形性関節症、 慢性関節リウマ チ、 喘息、 自己免疫疾患、 アトピー性皮膚炎、 乾癬、 接触性皮膚炎、 脱毛症、 虚 血性心疾患、 臓器移植に伴う免疫反応、 肝炎、 腎炎、 膝炎、 動脈硬化、 白血病、 悪性腫癟、 創傷、 角膜潰瘍、 組織傷害または白血球の浸潤に伴う炎症の治療のた めの遺伝子治療用ベクター。
(30) 上記 （ 1 0) または （ 1 2) の DNA、 または上記 （ 1 9) 記載のオリ ゴヌクレオチドをベクターに組み込んで得られる、 変形性関節症、 慢性関節リウ マチ、 喘息、 自己免疫疾患、 アトピー性皮膚炎、 乾癬、 接触性皮膚炎、 脱毛症、 虚血性心疾患、 臓器移植に伴う免疫反応、 肝炎、 腎炎、 膝炎、 動脈硬化、 白血病、 悪性腫瘍、 創傷、 角膜潰瘍、 組織傷害、 白血球の浸潤に伴う炎症、 脳卒中時の脳 障害、 アルツハイマー病、 痴呆症、 多発性硬化症、 パーキンソン病または脳腫瘍 のための遺伝子治療用ベクター。
(3 1 ) 上記 （ 1 ) から （8) のいずれかに記載のポリペプチドを発現する細胞 と被験試料とを接触させることを特徴とする、 上記 （ 1 ) 力 ら （8) のいずれか に記載のポリぺプチドをコードする遺伝子の発現を調節する化合物のスクリ一二 ング法。
(32) 遺伝子の発現を調節する化合物を、 上記 （ 1 ) から （8) のいずれかに 記載のポリべプチドをコードする mRN A量を測定することにより検出すること を特徴とする、 上記 （3 1 ) 記載のスクリーニング法。 図面の簡単な説明
図 1は、 ヒト MT 5— MMPとマウス MT 5— MM Pのアミノ酸配列とヒト M T 1— MMP、MT 2— MMP、MT 3— MMPならびにヒト MT 4— MMP( 2 ) のアミノ酸配列を比較した図である。
*の部分は一致しているアミノ酸残基を示す。
. の部分は類似しているアミノ酸残基を示す。
(アミノ酸残基は一文字表記で示す。）
ここで、 kbはキロ塩基対 （kilobase pairs)を表す。 図 2は、 各々の濃度でマウス MT 5— MMP部分ペプチド （プロペプチドドメ イン +活性ドメイン、 図中 ΜΤ 5 ΔΟ を pro— MMP— 2と反応させ、 pro— M MP 2を切断して活性化する能力を調べた結果を示した図である。
ポジティブコントロールとして A PMAを用いた。 その結果、 MM P濃度依存 的に活性化が認められた。 図中 「Activej は活性化された MMP— 2を示す。 発明を実施するための形態
以下、 本発明を詳細に説明する。
[ 1 ] 本発明の新規マトリックスメタ口プロテア一ゼポリべプチドをコードする DN Aの取得
( 1 ) c DN Aライブラリ一の作製
c DNAライブラリ一を作製するために、 適切な細胞または組織よリ全 RNA あるいは mRN Aを調製する。
全 RNAを調製する方法として、 チォシアン酸グァニジン一トリフルォロ酢酸 セシウム法 [Methods in Enzymology, 154, 3 (1987)〕、 酸性グァニジンチオシァ ネート · フエノール . クロ口ホルム （AGPC) 法 [Analytical Biochemistry, 162, 156 (1987)、 実験医学 ， 1937 (1991)〕 等を用いることができる。
全 RN Aからポリ （A) +RNAとして m R N Aを調製する方法として、 オリゴ ( d T) 固定化セルロースカラム法 （モレキュラー クロ一ニング 第 2版） ゃォ リゴ dTラテックスを用いる方法 〔細胞光学 別冊 8 「新細胞光学実験プロトコ —ル」 秀潤社 48-52頁、 Nucleic Acids Res.， Symposium Series, 19,61(1988)] 等を用いることができる。
ファースト ' トラック ' mRN A単離キット [Fast Track mRNA Isolation Kit ；インビトロジェン （Invitrogen) 社製〕、 クイック .プレップ . mRN A精製キ ット 〔Quick Prep mRNA Purification Kit； フアルマシア （Pharmacia) 社製〕 等 のキットを用いて組織や細胞から直接 mRN Aを調製することもできる。
適切な細胞または組織として、 MT4— MMP (2) の場合には、 データべ一 スから見出された MT 4— MMPをコードする DNAの E S T等が含まれていた c DNAライブラリーの種類を調べ、 該ライブラリ一を構築するために用いた細 胞または組織、 あるいは該組織由来の細胞株等を用いることが好ましい。 また、 MT 5— MMPの場合には、 適切な細胞または組織として、 脳や腎臓など組織、 あるいは該組織由来の細胞株等を用いることが好ましい。
得られた全 RN Aあるいは mRN Aを用い、 常法により c DNAライブラリ一 を作製する。
c DNAライブラリ一作製法として、 モレキュラー クローニング 第 2版や力 レント プロトコ一ルズ 1〜38、 DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University Press (1995)等に記 載された方法、 あるいは市販のキット、 例えばスーパ一スクリプト . プラスミ ド •システム ' フォー ' c DNA ·シンセシス ' アンド . プラスミ ド ' クローニン グ [superscript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning； キ ブコ B R L (GibcoBRL)社製〕ゃザップ - c DN A 'シンセシス.キット〔ZAP-cDNA Synthesis Kit, ストラタジーン社製〕 を用いる方法等をあげることができる。
c DNAライブラリーを作成するためのクローニングベクタ一としては、 大腸 菌 K 1 2株中で自立複製できるものであれば、 ファージベクター、 プラスミ ドべ クタ一等いずれでも使用できる。
具体的には、 ZAP Express 〔ストラタジーン社製、 Strategies, 5, 58 (1992) 〕、 pBluescript II SK (+) [Nucleic Acids Research, 17， 9494 (1989)〕、 Lambda ZAP II (ストラタジーン社製）、 gtlO, Agtll [D N A Cloning, A Practical Approach, 丄， 49 (1985)〕、 ATriplEx (クローンテック社製）、 AExCell (フアル マシア社製）、 PT7T318U (フアルマシア社製）、 pcD2 (Mol. Cell. Biol., 3, 280 (1983)〕、 p U C 1 8 (Gene, 33, 103 (1985)], p AM o (J. Biol. Chem. , 268, 22782-22787 (1993)、 別名 pAMoPRC3Sc (特開平 05-336963)〕 等をあげることがで きる。
宿主微生物としては、 大腸菌 Escherichia col iに属する微生物であればいずれ も用いることができる。 具体的には、 Escherichia coli XLl-Blue MRF' 〔ストラ タジーン社製、 Strategies互， 81 (1992)〕、 Escherichia coli C600 [Genetics, 39, 440 (1954)〕、 Escherichiacoli Y1088 (Science, 222, 778 (1983)〕、 E_scheri_chia coli Y1090 [Science, 222, 778 (1983)〕、 Escherichiacoli丽 522 [J. Mol. Biol. , 166' 1 (1983)〕、 Escherichia coli K802 [J. Mol. Biol. , 16， 118 (1966)〕、 Escherichia coli JM105 (Gene, 38, 275 (1985)〕、 Escherichia col i SOLRTM Strain (ストラタジーン社製）、 Escherichia coli LE392(モレキュラー クロ一ニング 第 2版） 等を用いることができる。
上記方法により作製した c DNAライブラリ一に加え、 市販の c DNAライブ ラリ一も利用することができる。
市販の c DNAライブラリ一として、 クローンテック社、 ライフテックオリエ ンタル社等のヒト、 ゥシ、 マウス、 ラット、 ゥサギ等由来の各臓器 c DNAライ ブラリ一をあげることができる。
(2) 本発明の DN Aの取得
上記 （ 1 ) で作製した c DN Aライブラリ一より、 本発明の DN Aを有する c DN Aクローンを、 ァイソトープあるいは蛍光標識したプローブを用いたコロニ 一 ·ハイプリダイゼーシヨン法あるいはプラーク ·ハイプリダイゼーシヨン法 〔 モレキュラー クローニング 第 2版〕 等により選択することができる。
プローブとしては、 MT4— MMP (2) の場合には、 一部明らかになつてい る MT 4— MM Pをコードする DN Aの塩基配列に基いたオリゴヌクレオチドを 利用することができる。 また、 MT 5— MMPの場合には、 MT 3—MMPをコ —ドする DNAの塩基配列に基いたオリゴヌクレオチドを利用することができる。 上記方法により得られた、 目的とするクローンより、 上述の方法で mRNAを 取得し、 cDNAを合成する。
該 cDNAの両端にアダプタ一を付加し、 このアダプターの塩基配列と一部明 らかになつている塩基配列に基づいたプライマーで P C Rを行う 5'- RACE(rapid amplification of cDNA ends)および 3' -RACE [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85,
8998 (1988)] により、 プライマ一に用いた配列よりも 5'端側および 3'端側の c
DNA断片を得ることができる。
得られた cDNA断片をつなぎあわせることにより全長の cDNAを取得する ことができる。
上記の方法により取得された DNAの塩基配列は、 該 DNA断片をそのままあ るいは適当な制限酵素等で切断後常法によりベクターに組み込み、 通常用いられ る塩基配列解析方法、 例えばサンガー（Sanger)らのジデォキシ法 〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977)〕 あるいはパーキン 'エルマ一社 （PerkinElmer ： 373 A · DNAシークェンサ一）、 フアルマシア社、 ライコア （LI- C0R)社等 の塩基配列分析装置を用いて分析することにより決定することができる。
本発明のポリペプチドをコードするゲノム遺伝子の塩基配列を決定するために は、通常の染色体 DNAクローン化法を用いることができる （モレキュラー クロ 一二ング 第 2版）。
即ち、本発明のポリべプチドを発現している細胞、すなわち MT 4— MMP( 2) の場合には例えばモノサイト系の TH P— 1細胞等、 MT 5— MM Pの場合には 例えば脳や腎臓等の染色体 DN Aを制限酵素で消化し、 該切断断片を通常のブラ スミ ドベクタ一またはファージベクタ一を用いてクロ一ニングし、 ゲノムライブ ラリーを作製する。
上記において取得され、 塩基配列の決定された DNA断片をプローブとして用 い、 上記の c DN Aクローニングで用いた方法と同様の方法で該ゲノムライブラ リーをスクリ一ニングすることにより、 本発明のポリぺプチドをコードするゲノ ム遺伝子を有するクローンを取得することができる。
該クローンを用いて、 上述の方法によりゲノム遺伝子の塩基配列を決定するこ とができる。
また、 上記方法で取得した D N Aとストリンジェントな条件下でハイブリダイ ズする DN Aを選択することにより、 他の組織あるいは、 他の動物由来、 例えば ヒト由来の目的とする DN Aを取得することができる。
上記方法により得られた塩基配列情報に基づき、 DNA合成機で化学合成する ことにより目的とする DN Aを調製することもできる。 DNA合成機としては、 チォホスフアイ ト法を利用した島津製作所社製の DNA合成機、 フォスフォアミ ダイ ト法を利用したパーキン 'エルマ一社製の DNA合成機 m 0 d e 1 392等 をあげることができる。
得られた塩基配列の新規性に関しては、 BLAST 等の相同性検索プログラムを用 いて、 GenBank、 EMBLおよび DDBJなどの塩基配列データベースを検索することに より確認することができる。 新規な塩基配列については、 アミノ酸配列に変換し たのち FASTA、 フレームサーチ （FrameSearch) などの相同性検索プログラムを用 いて、 GenPept、 PIR、 Swiss- Protなどのアミノ酸配列データべ一スを検索するこ とにより、 相同性をもつ既存の遺伝子を検索することができる。
該方法によリ確認された新規な塩基配列を有する本発明のポリベプチドである MT 4 -MMP (2) をコードする DNAとして、 例えば、 配列番号 3または配 列番号 4で表される配列を有する DN A等をあげることができる。
配列番号 3で表される塩基配列からなる DNAを有するプラスミ ドとしては pmMT4/PBSSKを、配列番号 4で表される塩基配列からなる DNAを有するプラスミ ドとしては phMT4/pBSIIKSをあげることができる。
プラスミ ド pmMT4/pBSSKを含有する大腸菌 Escherichia coli pmMT4/pBSSKは、 FERM BP— 6528として、 プラスミ ド phMT4/pBSIIKSを含有する大腸菌 Escherichia coli phMT4/pBSIIKSは、 F ERM B P— 6530として平成 1 0 年 9月 25日付けで工業技術院生命工学工業技術研究所、 日本国茨城県つくば市 東 1丁目 1番 3号 （郵便番号 305- 8566) に寄託されている。
また、 上記方法により確認された新規な塩基配列を有する本発明の MT 5一 M MPポリペプチドをコードする DNAとして、 例えば、 配列番号 7または配列番 号 8で表される配列を有する DN A等をあげることができる。 配列番号 7で表される塩基配列からなる DNAを有するプラスミ ドとしては pmMT5/pBSSKを、配列番号 8で表される塩基配列からなる DNAを有するプラスミ ドとしては phMT5/pGEMをあげることができる。
プラスミ ド pmMT5/pBSSKを含有する大腸菌 Escherichia coli pmMT5/pBSSKは、 FE RM B P— 6529として、 プラスミ ド phMT5/pGEMを含有する大腸菌 Escherichia coli phMT5/pGEMは、 FERM B P— 653 1として平成 1 0年 9 月 25日付けで工業技術院生命工学工業技術研究所、 日本国茨城県つくば市東 1 丁目 1番 3号 （郵便番号 305- 8566) に寄託されている。
(3) 本発明のオリゴヌクレオチドの調製
上述の方法で取得した本発明の DN Aおよび DN A断片を用いて、 常法あるい は上記記載の DNA合成機により、 本発明の DNAの一部の配列を有するアンチ センス ·オリゴヌクレオチド、 センス ·オリゴヌクレオチド等のオリゴヌクレオ チドを調製することができる。
該オリゴヌクレオチドとしては、 上記 DN Aの有する塩基配列中の連続した 5 〜60塩基と同じ配列を有する DN Aまたは該 DN Aと相補的な配列を有する D NAをあげることができ、 具体的には、 MT4— MMP (2) の場合には、 配列 番号 3または 4で表される塩基配列中の連続した 5〜 60塩基と同じ配列を有す る D N Aまたは該 D N Aと相補的な配列を有する D N Aをあげることができる。 また、 MT 5— MM Pの場合には、 配列番号 7または 8で表される塩基配列中の 連続した 5〜60塩基と同じ配列を有する DN Aまたは該 DN Aと相補的な配列 を有する D N Aをあげることができる。 センスプライマ一およびアンチセンスプ ライマ一として用いる場合には、 両者の融解温度 （Tm) および塩基数が極端に 変わることのない上記記載のオリゴヌクレオチドが好ましい。
更に、 これらオリゴヌクレオチドの誘導体も本発明のオリゴヌクレオチドとし て利用することができる。
該オリゴヌクレオチド誘導体としては、 オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエス テル結合がホスフォロチォェ一ト結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、 オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合が N 3' — P 5' ホスフォアミデ ―ト結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、 オリゴヌクレオチド中のリボ 一スとリン酸ジエステル結合がペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチ ド誘導体、 オリゴヌクレオチド中のゥラシルが C一 5プロピニルゥラシルで置換 されたオリゴヌクレオチド誘導体、 オリゴヌクレオチド中のゥラシルが C— 5チ ァゾ一ルゥラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、 オリゴヌクレオチド 中のシトシンが C— 5プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導 体、 オリゴヌクレオチド中のシトシンがフエノキサジン修飾シトシン （ phenoxazine-modi f ied cytos ine)で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、 オリ ゴヌクレオチド中のリボースが 2 ' — 0—プロピルリボースで置換されたォリゴ ヌクレオチド誘導体、 あるいはオリゴヌクレオチド中のリボースが 2 ' —メ トキ シエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体等をあげることがで きる 〔細胞工学， ， 1463 ( 1997)〕。
[ 2 ] 本発明のマトリックスメタ口プロテアーゼポリペプチドの調製
( 1 ) 形質転換体の作製
上記 [ 1 ] に記載の方法により取得した本発明の D N Aを宿主細胞中で発現さ せるためには、 モレキュラー クローニング 第 2 版やカレント プロトコルズ 1〜 3 8等に記載された方法を用いることができる。
即ち、 本発明の D N Aを適当な発現ベクターのプロモーター下流に揷入した組 換えべクタ一を作成し、 それを宿主細胞に導入することにより、 本発明のポリべ プチドを発現する形質転換体を得ることができる。
宿主細胞としては、 細菌、 酵母、 動物細胞、 昆虫細胞等、 目的とする遺伝子を 発現できるものであればいずれも用いることができる。
発現ベクターとしては、 上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中 への組込が可能で、 本発明の D N Aを転写できる位置にプロモーターを含有して いるものが用いられる。
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、 本発明のポリべプチド遺伝 子発現べクタ一は原核生物中で自立複製可能であると同時に、 プロモータ一、 リ ポソーム結合配列、 本発明の D N A、 転写終結配列より構成された組換えべクタ 一であることが好ましい。プロモータ一を制御する遺伝子が含まれていてもよい。 発現べクタ一としては、 例えば、 PKK233- 2 (フアルマシア社製）、 PSE280 (イン ビトロジェン社製）、 pGEMEX- 1〔プロメガ（ Promega)社製〕、 pQE-8〔キアゲン（Q I AGEN) 社製〕、 pKYP10(特開昭 58- 110600)、 pKYP200〔Agri Biol. Chem. , 48, 669 (1984)〕、 pLSAl (Agric. Biol. Chem. , 53, 277 (1989)〕、 pGELl [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985)〕、 pBluescript II SK (-) (ストラタジーン社製）、 GEX (フ アルマシア社製）、 pET-3 (ノバジェン社製） 等をあげることができる。
プロモーターとしては、 大腸菌や枯草菌等の宿主細胞中で発現できるものであ ればいかなるものでもよい。 例えば、 trpプロモータ一 （Ptrp)、 lacプロモータ 一、 PLプロモータ一、 PRプロモーター、 T7プロモータ一等の大腸菌やファージ 等に由来するプロモータ一、 SP01 プロモータ一、 SP02プロモータ一、 penPプロ モーター等をあげることができる。 また Ptrp を 2つ直列させたプロモーター (Ptrpx 2 ), tacプロモータ一、 lacT7プロモーター、 let I プロモータ一のよ うに人為的に設計改変されたプロモータ一等も用いることができる。
リボソーム結合配列としては、 シャイン一ダルガノ （Shine- Dalgarno) 配列と 開始コドンとの間を適当な距離 （例えば 6〜 1 8塩基） に調節したプラスミ ドを 用いることが好ましい。
本発明の組換えべクタ一においては、 本発明の DN Aの発現には転写終結配列 は必ずしも必要ではないが、 構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが 好ましい。
宿主細胞としては、 ェシエリヒア属、 セラチア属、 バチルス属、 ブレビバクテ リウム属、 コリネバクテリウム属、 ミクロバクテリウム属、 シユードモナス属等 に属する微生物、 例えば、 Escherichia coli XLl-Blue, Escherichia coli XL2- Blue、 Escherichia coli DH1、 Escherichia col i MC1000、 Escherichia col i KY3276 、 Escherichia col i W1485、 Escherichia col i JM109、 Escherichia col i 腿 01、 Escherichia col i No.49、 Escherichia col i W3110、 Escherichia col i NY49、 Serratia f icaria, Serratia font i col a. Serratia 1 iquefaciens, Serratia marcescens, Baci 1 lus subti 1 is, Baci 1 lus amylol iquefaciens, Brevibacterium ammmoniagenes, Brevibacterium iramar iophi lum ATCC14068, Brevibacterium 1
Figure imgf000019_0001
pCDM8 (Nature, 329, 840 (1987)〕、 pcDNAl/Amp (ィンビトロジェン社製）、 REP4 (ィンビトロジェン社製）、 AGE103 [Journal of Biochemistry,巡， 1307 (1987)〕 等が用いられる。
プロモータ一としては、 動物細胞中で発現できるものであればいずれも用いる ことができ、 例えば、 サイ トメガロウィルス （CMV) の I E (immediate early) 遺伝子のプロモーター、 S V 40の初期プロモータ一あるいはメタロチォネィン のプロモータ一、 レトロウイルスのプロモーター、 ヒートショックプロモーター、 S R αプロモータ一等をあげることができる。 また、 ヒト CMVの I E遺伝子の ェンハンサ一をプロモータ一と共に用いてもよい。
動物細胞としては、 ヒトの細胞であるナマルバ （Namaiwa) 細胞、 HEK293 細胞 (ATCC: CRL-1573), サルの細胞である COS細胞、 チャイニーズ ·ハムスターの細 胞である CH0細胞、 HBT5637 (特開昭 63- 299) 等をあげることができる。
組換えべクタ一の導入方法としては、 動物細胞に DNAを導入する方法であれ ばいずれも用いる こ とができ、 例えば、 エレク ト ロボレ一シ ヨ ン法 (Cytotechnology, 3, 133 (1990)〕、 リン酸カルシウム法 （特開平 2-227075)、 リポフエクシヨン法 〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)、 Virology, 52, 456 (1973)〕 等をあげることができる。
昆虫細胞を宿主と して用いる場合には、 例えば Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York (1992)、 カレント . プロトコルズ 1〜 38、 Bio Technology, 6, 47 (1988)等に記載され た方法によって、 ポリぺプチドを発現することができる。
即ち、 組換え遺伝子導入べクタ一およびバキュロウィルスを昆虫細胞に共導入 して昆虫細胞培養上清中に組換えウィルスを得た後、 さらに組換えウィルスを昆 虫細胞に感染させ、 ポリペプチドを発現させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、 例えば、 pVL1392、 pVL1393、 pBlueBacIII (ともにインビトロジェン社製）等をあげることができる。 バキュロウィルスとしては、 例えば、 夜盗蛾科昆虫に感染するウィルスである ァゥ トグラファ · カリフォルニ力 · ヌクレア一 · ポリへドロシス · ウィルス (Autographa cal ifornica nuclear polyhedrosis virus) 等 ¾:用レヽること力でき る。
昆虫細胞と しては、 Spodoptera frugiperda の卵巣細胞である Sf9、 Sf21 [Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual (1992)〕、 Trichoplus ia ELの卵巣細胞である High 5 (インビトロジェン社製） 等を用いることができる。 組換えウィルスを調製するための、 昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入べクタ 一と上記バキュロウィルスの共導入方法としては、 例えば、 リン酸カルシウム法 (特開平 2- 227075)、 リポフエクシヨン法 〔Pro Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)] 等をあげることができる。
遺伝子の発現方法としては、 直接発現以外に、 モレキュラー クロ一ニング第 2 版に記載されている方法等に準じて、 分泌生産、 融合蛋白質発現等を行うことが できる。
酵母、 動物細胞または昆虫細胞により発現させた場合には、 糖あるいは糖鎖が 付加されたポリベプチドを得ることができる。
以上のようにして得られる形質転換体を培地に培養し、 培養物中に本発明のポ リペプチドを生成蓄積させ、 該培養物から採取することにより、 本発明のポリべ プチドを製造することができる。
また、 患者の生体内から採取した細胞に、 本発明のポリペプチドを発現する適 切な発現ベクターを導入した後、 細胞を生体内に戻すことにより、 本発明のポリ ぺプチドを患者の生体内で発現させることもできる。
( 2 ) 形質転換体の培養
本発明の形質転換体を培地に培養する方法は、 宿主の培養に用いられる通常の 方法に従って行うことができる。
大腸菌等の原核生物ある 、は酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転換 体を培養する培地としては、 該生物が資化し得る炭素源、 窒素源、 無機塩類等を 含有し、 形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、 合成培地の いずれを用いてもよい。
炭素源としては、 該生物が資化し得るものであればよく、 グルコース、 フラク トース、 スクロース、 これらを含有する糖蜜、 デンプンあるいはデンプン加水分 解物等の炭水化物、 酢酸、 プロピオン酸等の有機酸、 エタノール、 プロパノール 等のアルコール類等を用いることができる。
窒素源としては、 アンモニア、 塩化アンモニゥム、 硫酸アンモニゥム、 酢酸ァ ンモニゥム、 リン酸アンモニゥム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニゥム塩、 その他の含窒素化合物、 並びに、 ペプトン、 肉エキス、 酵母エキス、 コーンスチ 一プリカ一、 カゼイン加水分解物、 大豆粕および大豆粕加水分解物、 各種発酵菌 体、 およびその消化物等を用いることができる。
無機物としては、 リン酸第一カリウム、 リン酸第二カリウム、 リン酸マグネシ ゥム、 硫酸マグネシウム、 塩化ナトリウム、 硫酸第一鉄、 硫酸マンガン、 硫酸銅、 炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、 通常振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。 培養 温度は 1 5〜40°Cがよく、 培養時間は、 通常 1 6〜 96時間である。 培養中 p Hは 3. 0〜9. 0に保持する。 p Hの調整は、 無機または有機の酸、 アルカリ 溶液、 尿素、 炭酸カルシウム、 アンモニア等を用いて行う。
また、 培養中必要に応じて、 アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を 培地に添加してもよい。
プロモータ一として誘導性のプロモータ一を用いた発現ベクターで形質転換し た微生物を培養するときには、 必要に応じてインデューサーを培地に添加しても よい。 例えば、 1 a cプロモータ一を用いた発現ベクターで形質転換した微生物 を培養するときにはイソプロピル一 — D—チォガラクトビラノシド等を、 t r Pプロモータ一を用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには ィンドールァクリル酸等を培地に添加してもよい。
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、 一般に使 用されている RPM 11640培地 (The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)〕、 Eagleの MEM培地 [Science, 122, 501 (1952)〕、 DMEM培地 (Virology, 8, 396 (1959)〕、 199 培地 [Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)〕 またはこれら培地に牛胎児血清等を添加し た培地等を用いることができる。
培養は、 通常 p H6〜8、 30〜40°C、 5%C〇2存在下等の条件下で 1〜 7日間行う。
また、 培養中必要に応じて、 カナマイシン、 ペニシリン、 ストレプトマイシン 等の抗生物質を培地に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、 一般に使 用されている TNM-FH培地〔ファーミンジェン（Phami ngen)社製〕、 Sf-900 I I SFM 培地 （ライフ ·テクノロジ一ズ社製）、 ExCe l l400、 ExCe 1 1405 〔いずれも JRHバイ ォサイエンシーズ（JRH B i osc i ences)社製〕、 Grace' s Insect Med i um (Nature, 195, 788 ( 1962)〕 等を用いることができる。
培養は、 通常 p H 6〜 7、 2 5〜 3 0 °C等の条件下で 1〜 5日間行う。
また、 培養中必要に応じて、 ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加しても よい。
( 3 ) 発現させたポリペプチドの単離精製
上記形質転換体の培養液から、 上記方法により発現させたポリペプチドを単離 精製するためには、 通常の酵素の単離、 精製法を用いればよい。 例えば、 本発明 のポリペプチドが、 細胞内に溶解状態で発現した場合には、 培養終了後、 細胞を 遠心分離により回収し水系緩衝液にけん濁後、 超音波破砕機、 フレンチプレス、 マントンガウリンホモゲナイザー、 ダイノミル等により細胞を破砕し、 無細胞抽 出液を得る。 該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、 通常 の酵素の単離精製法、 即ち、 溶媒抽出法、 硫安等による塩析法、 脱塩法、 有機溶 媒による沈殿法、 Q—セファロ一ス、 ジェチルアミノエチル （DEAE) —セファロ一 ス、 D IAI0N HPA-75 (三菱化学社製） 等レジンを用いた陰イオン交換クロマトダラ フィ一法、 S-Sepharose FF (フアルマシア社製） 等のレジンを用いた陽イオン交 換クロマトグラフィー法、 ブチルセファロース、 フエ二ルセファロース等のレジ ンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、 分子篩を用いたゲルろ過法、 ァフィ二 ティークロマトグラフィー法、 クロマトフォーカシング法、 等電点電気泳動等の 電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、 精製標品を得ることがで きる。
また、 該ポリペプチドが細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、 同様に細 胞を回収後破砕し、 遠心分離を行うことにより得られた沈殿画分より、 通常の方 法により該ポリべプチドを回収後、 該ポリべプチドの不溶体を蛋白質変性剤で可 溶化する。 該可溶化液を、 蛋白質変性剤を含まないあるいは蛋白質変性剤の濃度 が蛋白質が変性しない程度に希薄な溶液に希釈、 あるいは透析し、 該ポリべプチ ドを正常な立体構造に構成させた後、 上記と同様の単離精製法により精製標品を 得ることができる。
本発明のポリべプチドあるいはその糖修飾体等の誘導体が細胞外に分泌された 場合には、 培養上清に該ポリべプチドあるいはその糖鎖付加体等の誘導体を回収 することができる。 即ち、 該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理 することにより可溶性画分を取得し、 該可溶性画分から、 上記と同様の単離精製 法を用いることにより、 精製標品を得ることができる。 本発明のポリペプチドあ るいはその糖修飾体等の誘導体が細胞上に発現された場合には、 培養細胞の膜画 分を界面活性化剤で溶解して可溶性画分を取得し、 該可溶性画分から、 上記と同 様の単離精製法を用いることにより、 精製標品を得ることができる。
また、 本発明のポリペプチドは、 Fmoc法 （フルォレニルメチルォキシカルボ二 ル法）、 tBoc 法 （t一ブチルォキシカルボニル法） 等の化学合成法によっても製 造することができる。 また、 アドバンスト 'ケムテック （Advanced ChemTech) 社、 パーキン · エルマ一社、 フアルマシア社、 プロテイン ' テクノロジー ' インスト ウ ノレ メ ン 卜 ( Prote in Techno logy Instrument ) ネ土、 シ ンセ セ ノレ · ベガ (Synthece l l-Vega) 社、 パーセプティブ （PerSept ive) 社、 島津製作所等のぺプ チド合成機を利用し化学合成することもできる。
[ 3 ] 本発明のポリペプチドの生物活性の検出
上記 [ 2 ] に記載の方法により取得した本発明のポリペプチドのプロテアーゼ 活性は、 ぺプチドまたは蛋白質の分解物を電気泳動またはカラムクロマトグラフ ィ一を用いて測定するか、 または蛍光標識あるいはァイソトープ標識したぺプチ ドまたは蛋白質の分解で測定する。 ぺプチドが切断されることで活性化される酵 素の活性化状態を測定することでも検出可能である。 ゼラチンザィモグラフィ一 に用いられるのと同様に、 該酵素によって分解されるべプチドを含むゲルを用い ても測定できる。
[ 4 ] 本発明のポリぺプチドの阻害薬または活性化薬の探索および同定
本発明のポリペプチドについて [2] 記載の方法で本発明のポリペプチドを発 現させた細胞、 [2]記載の方法で調製した本発明のポリペプチド発現大腸菌から [ 2 ] に記載した方法で精製した本発明のポリベプチドに被験試料を添加する。 被験試料の添加の有無における、 本発明のポリべプチドのプロテアーゼ活性を 比較することにより、 被験試料の中からプロテア一ゼ活性を増強する物質 （活性 化薬） および阻害する物質 （阻害薬） をスクリーニングすることができる。
被験試料としては、 合成化合物、 天然に存在する蛋白質、 人工的に合成された 蛋白質、 ペプチド、 糖質、 脂質、 これらの修飾体、 誘導体を、 また哺乳動物（例え ばマウス、 ラット、 モルモット、 ハムスター、 ブタ、 ヒッジ、 ゥシ、 ゥマ、 ィヌ、 ネコ、 サル、 ヒト等）の尿、 体液、 組織抽出物、 細胞培養上清、 細胞抽出物を、 更 に、 非ペプチド性化合物、 発酵生産物、 植物その他の生物の抽出物等をあげるこ とができる。
被験試料としてべプチドを用いる場合、ランダムべプチドライブラリーを利用 することができる。ランダムべプチドライブラリーとしては、ファージ上のぺプチ ドシステム （peptides on phage) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 6378 (1990)； PCT 特許出願番号 96/40189〕 、プラスミ ド上のペプチドシステム （peptides on plasmids) (米国出願特許番号 5,270,170;米国出願特許番号 5,338， 665)があげら れる。
また、本発明の MT 4— MMP (2) に結合するペプチドは、ランダムペプチド ライブラリ一を利用してスクリーニングすることにより取得できる。ランダムべ プチドライブラリーとしては、ファージ上のペプチドシステム （peptides on phage) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 6378 (1990); PCT 特許出願番号 96/40189] 、プラスミ ド上のペプチドシステム （peptides on plasmids) (米国出 願特許番号 5,270, 170;米国出願特許番号 5，338，665) があげられる。
[5] 本発明の DNA、—ポリペプチドの利用 ( 1 )本発明の DNA は、 これをプローブとして用いて、 ヒトの組織ゃヒト由来 の細胞から [ 1 ] (2) と同様にして抽出した RNAについてノーザンハイプリダ ィゼーシヨンを行うことにより、 その組織や細胞における本発明のポリぺプチド 遺伝子の mRN Aを検出あるいは定量することができる。 各種の組織でその mR N Aの発現量を比較することによリ本発明のポリべプチドの組織発現分布を知る ことができる。
また、 本発明のオリゴヌクレオチドは、 本発明の DNAの特異的プライマ一と して用いて、 ヒトの組織ゃヒト由来の細胞から [ 1 ] ( 2 ) と同様にして抽出した RNAについて RT— P C R [reverse transcription PCR;PCR Protocols (1990)〕 を行うことによつても mRNAの検出や定量を行うことができる。 これらの該ポ リペプチド m R N A定量法は本遺伝子が関与する病態の診断に用いることができ る。
各種病態モデル動物における該ポリペプチド m R N Aを定量することにより、 病態における該遺伝子産物の重要性を明らかにすることができる。 また、 薬剤の 有無による該ポリペプチド mRN Aの発現量を比較することにより薬剤を評価す ることができる。
(2) 本発明の DN Aあるいは該 DN Aの一部の塩基配列と同じ塩基配列または 相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドは、これをプローブとして用いて、 ヒトの組織切片に対して in situハイブリダイゼーション [Methods in Enzymology, 254, 419 (1995)] を行うことにより、 組織内での本発明のポリペプチドの発現細 胞の特定等のよリ細かい発現分布を知ることができる。
これらの方法によって得られる、 本発明のポリぺプチドがどのような組織や細 胞で発現しているかという情報や、 細胞がどのような刺激を受けたときに発現量 が変化するかという情報は、 本発明のポリべプチドの生理機能や病態への関与を 解析するのに役立つ。
(3) 本発明の DNAをプローブとして、 ゲノム DN Aに対してサザンハイブリ ダイゼ一シヨン （モレキュラー クローニング 第 2版） を行うことにより、 本発 明のポリべプチドをコードする遺伝子の変異を検出することができる。 変異の検 出を行うことにより、 該遺伝子の変異が原因となっている可能性のある疾患の診 断を行うことができる。 具体的には、 MT4— MMP (2) の場合には、 例えば、 変形性関節症、 慢性関節リウマチ、 喘息、 自己免疫疾患、 アトピー性皮膚炎、 乾 癬、 接触性皮膚炎、 脱毛症、 虚血性心疾患、 臓器移植に伴う免疫反応、 肝炎、 腎 炎、 膝炎、 動脈硬化、 白血病、 悪性腫瘍、 白血球浸潤に伴う炎症などの疾患の診 断を行うことができ、 MT 5— MMPの場合には、 例えば、 変形性関節症、 慢性 関節リウマチ、 喘息、 自己免疫疾患、 アトピー性皮膚炎、 乾癬、 接触性皮膚炎、 脱毛症、 虚血性心疾患、 臓器移植に伴う免疫反応、 肝炎、 腎炎、 膝炎、 動脈硬化、 白血病、 悪性腫瘍、 脳卒中時の脳障害、 アルツハイマー病、 痴呆症、 多発性硬化 症、 パーキンソン病、 脳腫瘍、 白血球浸潤に伴う炎症などの疾患の診断を行うこ とができる。
(4) 本発明のアンチセンス ·ォリゴヌクレオチド（RNA/DNA)は、 本発明の ポリペプチドをコードする遺伝子の転写もしくは m R N Aの翻訳を抑制すること により 〔化学 46, 681 (1991)、 Bio Technology, 9, 358 (1992)〕、 該遺伝子が発 症に関与している可能性のある治療あるいは予防などへの応用も期待される。 こ うした疾患として、 MT4— MMP (2) の場合には、 例えば変形性関節症、 慢 性関節リウマチ、 喘息、 自己免疫疾患、 アトピー性皮膚炎、 乾癬、 接触性皮膚炎、 脱毛症、 虚血性心疾患、 臓器移植、 肝炎、 腎炎、 膝炎、 動脈硬化、 白血病、 悪性 腫瘍、 白血球浸潤に伴う炎症があげられ、 MT 5— MMPの場合には、 例えば変 形性関節症、 慢性関節リウマチ、 喘息、 自己免疫疾患、 アトピー性皮膚炎、 乾癬、 接触性皮膚炎、 脱毛症、 虚血性心疾患、 臓器移植、 肝炎、 腎炎、 膝炎、 動脈硬化、 白血病、 悪性腫瘍、 脳卒中時の脳障害、 アルツハイマー病、 痴呆症、 多発性硬化 症、 パーキンソン病、 脳腫瘍、 白血球浸潤に伴う炎症が挙げられる。
上述のアンチセンス'オリゴヌクレオチドは、本発明のポリべプチドをコードす る DNAの一部の塩基配列、 好ましくは翻訳開始領域にある 1 0〜50塩基と相 補的な塩基配列を基にして設計 ·調製し、 生体内に投与する。
本発明の DN Aを含有する医薬は、 本発明のポリべプチドに代えて本発明の D NAを用いる以外は、 下記に示した本発明のポリべプチドを含有する医薬と同様 な方法を用いて調製または投与される。
(5)本発明の DNAを用い、 [2]記載の方法により本発明のポリべプチドを取 得することができる。
本発明のポリペプチドの用途としては、 M T 4— MM P ( 2 ) の場合には、 変 形性関節症、 慢性関節リウマチ、 喘息、 自己免疫疾患、 アトピー性皮膚炎、 乾癬、 接触性皮膚炎、 脱毛症、 虚血性心疾患、 臓器移植、 肝炎、 腎炎、 膝炎、 動脈硬化、 白血病、 悪性腫瘍、 白血球浸潤に伴う炎症などの診断薬、 治療薬または予防薬が 考えられる。 また、 M T 5— MM Pの場合には、 変形性関節症、 慢性関節リウマ チ、 喘息、 自己免疫疾患、 アトピー性皮膚炎、 乾癬、 接触性皮膚炎、 脱毛症、 虚 血性心疾患、 臓器移植、 肝炎、 腎炎、 塍炎、 動脈硬化、 白血病、 悪性腫瘍、 脳卒 中時の脳障害、 アルツハイマー病、 痴呆症、 多発性硬化症、 パーキンソン病、 脳 腫瘍、 白血球浸潤に伴う炎症などの診断薬、 治療薬または予防薬が考えられる。 本発明のポリぺプチドを含有する医薬は、 診断薬または治療薬として該ポリべ プチド単独で投与することも可能ではあるが、 通常は該ポリベプチドを薬理学的 に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、 製剤学の技術分野に おいてよく知られる任意の方法にょリ製造した医薬製剤として提供するのが望ま しい。 好ましくは水、 あるいは食塩、 グリシン、 グルコース、 ヒトアルブミン等 の水溶液等の水性担体に溶解した無菌的な溶液が用いられる。 また、 製剤溶液を 生理的条件に近づけるための緩衝化剤や等張化剤のような、 薬理学的に許容され る添加剤、 例えば、 酢酸ナトリウム、 塩化ナトリウム、 乳酸ナトリウム、 塩化力 リウム、 クェン酸ナトリウム等を添加することもできる。 また、 貯蔵のため凍結 乾燥し、 使用時に適当な溶媒に溶解させて用いることもできる。
投与経路は、 治療に際し最も効果的なものを使用するのが望ましく、 通常は非 経口経路、 例えば皮下、 筋肉内、 静脈内、 気道内等の投与経路が用いられる。
( 6 ) 本発明の D N A (センス D N Aまたはアンチセンス D N A ) またはこれら の塩基配列の一部を含むオリゴヌクレオチドは一本鎖または二本鎖としてレトロ ウィルス、 アデノウイルス、 アデノ随伴ウィルス等のウィルスベクター、 その他 のベクターに組み込んで遺伝子治療用べクタ一とし、 遺伝子治療に用いることが できる。 実 施 例 以下により具体的な実施例をあげて説明するが、 これにより本発明の範囲が限 定されるものではない。 実施例 1 マウス MT4— MM P関連蛋白 [； MT4 -MMP (2)〕 遺伝子のクロ —ニング
MT 4— MM P遺伝子はヒトの脳で高発現していることから、 マウス 1 7日胚 の脳 cDN Aライブラリ一を ZAP- cDN A Synthesis Ki t(Stratagene)を用い、 該 キットに添付のマニュアルに従って作成した。
ヒト MT 4—MMP遺伝子の部分配列（（配列番号 1 7の 233— 1 899) を プローブとして用い、 上記 c DN Aライブラリ一のスクリ一二ングをプラークハ ィブリダイゼ一ション法によリ行った。
該スクリ一二ングにより上記プローブとハイプリダイズする陽性クローンの数 種について塩基配列を解析した。 解析したクローンは全て報告されたヒト MT 4 — MM P遺伝子において欠落していると思われるシダナルぺプチド配列部分を含 んでおリ、 最長のクローンは 3. 5 k bであった。 従って、 マウスでは 587ァ ミノ酸の配列番号 1に記載した MT 4—MM P (2) を発現できる配列番号 3に 記載した DN Aに対応する mRN Aが発現していると考えられた。 実施例 2 ヒト MT4— MMP (2) 遺伝子のクローニング
ヒト MT4—MMP遺伝子に関する E S Tクローンをデータベースで調べたが、 上記マウスで見られたようなシダナルぺプチドをコードする部分を含むクローン の登録はなかった。 従って、 ヒト MT 4— MMP遺伝子において分泌型のヒト M T 4一 MMP遺伝子は存在しないか、 あるいは単離するには困難な理由があると 思われた。
実施例 1で取得したマウス MT 4— MM P (2) 遺伝子のシグナルペプチドに 相当する N末の部分をコードする配列をプローブとしてヒト脳 cDNAライブラ リー （クロンテック社製） をスクリーニングしたが、 相当する遺伝子の単離はで きなかった。 そこで 5' RAC E法にて転写産物の 5' 領域の解析を行った。 細 胞は MT 4— MMP mRN Aの発現が確認された単核球由来の THP- 1 (ATCC TIB-202, American Type Culture Col lection) 細胞を用いた。
即ち、 ヒト THP— 1細胞から単離した poly(A)+ RNA とヒト MT4— MMP 選択的なプライマー（配列番号 9) を使用して superscript II (ギブコ BRL社製） で c DN Aを作成した。 得られた c DN Aに単一鎖のオリゴヌクレオチドアダブ ター （配列番号 1 0) を T 4 RNAリガ一ゼでつなぎ、 MT4— MMP選択的な プライマー （配列番号 9) とアダプター選択的なプライマー （配列番号 1 1 ) で GC緩衝液と LA Taq (宝酒造社製）を用いて PCR を行った。 PCR後、 遺伝子選 択的な他のプライマー （配列番号 1 2) とアダプター選択的なプライマー （配列 番号 1 3) を用いて PCRを行った。
50個のクローンを解析した結果、 3個は MT 4— MM Pの配列を含む c DN A断片であつたが、 47個はマウス MT 4—MM P (2) に類似するシグナルぺ プチド配列をコードする c DNA断片であった。 このことにより、 既に明らかに なっているプロべプチド配列の下流部分に加えて、 シグナルべプチドを含む配列 番号 2に示すヒト MT 4— MMP (2) をコードする配列番号 4に示す m R N A の全量域が明らかとなった。 E STクローンの H97792 クローンの遺伝子配列は Puente により報告された MT 4— MM P (Cancer Research, 56, 944 (1996) ： 配列番号 1 7〕 とほとんど同一であつたが、 触媒領域の配列の一部が異なってお リ、 E STクローン H97792の方がマウス MT4— MMP (2) との保存性が高か つた。 全配列を新たに決定したところ、 Puenteにより報告された MT 4—MMP の既に明らかになつている部分においても、 MT4— MMP (2) は配列の異な る部分が見られた。
マウスおよびヒト MT 4— MMP (2) は相互によく保存されており、 プロべ プチド、 触媒、 ヒンジ、 へモぺキシン凝血酵素様ドメインの各ドメインはそれぞ れ 87、 87、 78、 96 %のホモロジ一を有していた。 シグナルペプチドと膜 貫通部位比較的類似性が低く 54と 35%であった。 また、 触媒ドメインのヒト MT 4 -MMP ( 2 ) と MT 1— MMP， MT 2 -MMP, MT 3— MMPの間 との比較は、 それぞれ、 36、 39、 3 1 %であった。 このことからも、 マウス MT 4 -MMP (2) はヒト MT4— MMP (2) に最も近く、 ヒト MT4— M MP (2) のマウスホモログであると結論された。 実施例 3 MT 4 -MMP (2) の発現と遺伝子産物の検出
単離した cDNAから確かに遺伝子産物が翻訳されることを確認するために、 c DNAを SV40プロモ一ターを持つ p SG 5ベクタ一 （ストラタジーン社製） に組み込んだ。 発現した産物の検出のために、 潜在型酵素のプロセッシング部位 の下流に FLAG配列（イーストマンケミカル社製） を組み込むことにより、 抗 FLAG 抗体による検出を可能とした。
COS- 1 細胞にマウスおよびヒトの MT 4— MMP (2) の発現プラスミ ドをト ランスフエクシヨンし、 48時間後に採取した細胞を溶解して、 ウェスタン法に よって FLAG標識 MT 4—MMPの検出を行った。 抗 FLAG抗体 M2 (イーストマ ンケミカル社製） によってともに、 発現プラスミ ドをトランスフエクシヨンした 細胞に特異的な 66 kDaのバンドが検出された。 実施例 4 MT 4— MM Pの転写産物の検出および解析
MT 4— MMP転写産物は 5' 端に Alu配列を持つことから、 イントロンを含 んでいる可能性があつたため、 ヒト MT4— MMP (2) 遺伝子の部分配列 （配 列番号 4の 2 1 2〜 5 1 9番目） に示した部分をプローブとして用い、 ヒュ一マ ンサイエンス研究資源バンクのライブラリ一 （Deposit >No. LI020) よリハイブ リダィゼーシヨン法により、 ハイブリダィズするクローンを単離して、 該クロー ンょリプラスミ ドを常法により抽出し、 該プラスミ ドに含有される MT4— MM Pの 5 ' 末端付近の塩基配列 （配列番号 1 7の 1 40〜272番） の周辺の遺伝 子配列を調べた。
MT 4— MMPと MT 4— MMP (2) 遺伝子を比較した時に、 相同性が無く なる領域の MT 4—MM P遺伝子配列 （配列番号 1 7の 1〜 1 39番） はゲノム 配列 （配列番号 1 8) の 3008〜 3 1 47番にほぼ一致し、 その境界にはスプ ライシングドナ一配列が存在した。 MT 4— MMPのェクソンコードする配列（配 列番号 1 7の 1 40〜 340番） はゲノムの配列 （配列番号 1 8 ) の 3 1 48〜 3280番及び 3564〜 3633番にほぼ一致した。 以上の結果から、 第一^ ( ントロンを残した転写産物が MT 4一 MMPであると結論された。 以上の結果から、 ヒトでは MT 4—MMPと MT 4—MMP ( 2) の 2種類の mRN Aが発現していると考えられた。
これら 2種類の転写産物をそれぞれ RT- PCRによって識別するために、それぞれ に特異的な 5' 領域のプライマ一 （MT 4 -MMP ：配列番号 1 4, MT 4— M MP (2) ：配列番号 1 5) と共通の 3' プライマ一 （配列番号 1 6) を作成した。 これら転写産物の各種癌細胞における発現を表 1に示した。 表 1 MT4— MMP (2) および] VIT 4— MMPの
転写産物の癌細胞での発現
7¾細 BSi株 MT4- MP(2) MT4- MP 寄託番号
Jurkat (T eel 1) ++ +/- ATCC TIB-152
Raj i (B cell) ATCC CCL-86
BJAB(B cell) ATCC HB-136
THP-1 (monocytic) ++ ATCC TIB-202
K562(monocytic) ++ ATCC CCL-243
U-937 (monocytic) ++ ATCC CRL-1593.2 U-251 MG( astrocytoma) ++ 発酵研 IF050288 SK-N-SH(neurob 1 astoma) ++ ATCC HTB-11 no.10(gl ioma) +/- 発酵研 IF050368 KALS-1 (glioma) ++ 発酵研 IF050434 MK -7 (gastric) + 理化研 RCB0999 MKN-28(gastric) 理化研 RCB1000 NUGC-4(gastric) HS財団 JCRB0834 PANC-1 (pancreatic) ++ ATCC CRL-1469 MIA PaCa-2(pancreat i c) ++ ATCC CRL-1420 SK-HEP-1 (hepatoma) ++ + ATCC HTB-52
Hep 3B (hepatoma) ++ + ATCC HB-8064
ZR-75-1 (breast) ++ ATCC CRL-1500 MCF7 ( adenocarc i noma) ++. + ATCC HTB-22
T-24(b ladder) ++ + ATCC HTB-4
A375 (melanoma) ++ ATCC CRL-1619 HT-1080(fibrosarcoma) ATCC CCL-121
+ + :強発現、 +:中程度の発現、 + —：少量発現、 一：発現無し
ATCC： American Type Culture Col lection
HS財団：財団法人ヒューマンサイエンス振興財団
理化研：特殊法人理化学研究所
発酵研：財団法人発酵研究所
MT 4— MMPは MT 4— MMP (2) の発現が認められる細胞でだけ発現し ていた。
以上の結果から、 MT4— MMP (2) が主たる転写産物であるが、 細胞によ つては類似した転写制御下に M T 4 -MM Pの発現が起こっていると考えられる。 実施例 5 マウス組織における MT 4— MMP (2) の発現
4週齢のマウスの組織を臓器ごとに切除して RN Aを抽出して MT 4— MM P (2) の発現パターンを調べた。 20 の全 RN Aを 1 %ァガロースゲルで泳 動しナイロンメンブレンに転写して32 Pで標識したマウス MT 4 -MMP ( 2 ) 遺伝子をプローブに用いてノーザンプロッティングを行い、 MT4— MMP (2) の発現パターンを調べた。
特に発現の高い臓器は大脳、 小脳、 脳幹、 大腸、 子宮、 睾丸であった。 副腎、 乳腺、 胎盤ではほとんど発現は認められなかった。 マウスでの発現結果は Puente らによるヒト組織での報告 〔Cancer Research, 56, 944 (1996)〕 と一致した。 マウスの各臓器での MT4— MMP (2) の発現は脳で非常に高く、 他に大腸、 子宮、 睾丸など限定された組織での発現が見られ、 MT l—MMP, MT 2— M M Pが比較的広範な組織での発現を示すのに対して特徴的であつた。 このことか ら、 MT4— MMP (2) が発現臓器に特異的な細胞外基質の分解を介して、 組 織の恒常性維持に関与していると考えられる。 実施例 6 マウス MT4-MMP(2)部分ペプチド（へモぺキシン凝血酵素様ドメイン） の大腸菌での発現
配列番号 1の 32 1〜550番目に示されるアミノ酸配列の N末端にメチォ二 ン残基の付加した配列を有するマウス MT4-MMP (2)部分ペプチド （へモぺキシン 凝血酵素様ドメイン） をコードする cDNAを、 マウス MT4- MMP (2) の cDNAを錡型 として用いポリメラーゼ連鎖反応 （PCR) 法で増幅した。
得られた増幅断片を大腸菌の発現べクタ—である pET3a (宝酒造社製） にサブ クローニングして、 さらに大腸菌株 BL2KDE3) pLysS (宝酒造社製） に導入した。 該大腸菌を lOO^g/mLのアンピシリン存在下、 1 Lの発現用培地で 0D6。。が 0.5になる まで培養して、 0.4腿 ol/Lのィソプロピル一 3—D—チォガラクトビラノシド (IPTG) で刺激後さらに 3時間培養した。
培養後、 常法に基づいて大腸菌内に形成されたマウス MT4—MMP (2) 部分ぺプ チドよりなる顆粒 （inclusion body) を取得し、 8 mol/L尿素、 50 mmol/L Tris- HC1 (pH 8.6) および 20 mmol/ぃジチオスレィ トール （DTT) を含む可溶化液に溶 解した。 該溶解液を High Q anion exchange columnにアプライし、 0.2 mol/L 塩 化ナトリゥム溶出フラクションを回収した。
該フラクションを 50 mmol/L Tris-HCl (pH8.6)、 6mol/L尿素、 1 mmol/Lジ チオスレイ ト一ル、 0.15mol/L塩化ナトリウム、 5mmol/L塩化カルシウム、 100 mmol/L 塩化亜鉛、 0.02% アジ化ナトリウムを含有する溶液で希釈し、 該希釈液 にシスタミン （最終濃度 20 mmol/L) を加えた。 次いで、 50 mmol/L Tris-HCl
(pH8.6)、 0.15 mol/L塩化ナトリウム、 5 mraol/L塩化カルシウム、 100mmol/L 塩化亜鉛、 5腿 0 L)3メルカプトエタノール、 1 mmol/L 2-ヒドロキシェチルジ スルフイ ド、 0.02%アジ化ナトリウムを含有する溶液を用い、 4°Cで透析した。 さ らに、 10倍量の 50 mmol/L Tris-HCl (pH7.5)、 0. mol/L塩化ナトリウム、 5 腿 ol/L塩化カルシウム、 50 mmol/L塩化亜鉛、 0.02% アジ化ナトリウムを含有 する溶液で透析した （4時間 X3回）。 この溶液を 22000 xg、 4t：、 10分間遠心分 離し、 沈殿を除いた。
得られた上清を 50謹 ol/L Tris-HCl (pH7.5)、 150 mmol/L塩化ナトリウム、 10 腿 ol/L塩化カルシウムおよび 0.02% アジ化ナト リゥムを含む緩衝液で平衡化し た S-200カラムクロマトグラフィーに通塔し、 ゲルろ過を行い、 へモぺキシン凝 血酵素様ドメインに相当するマウス MT4-MMP (2) 部分ペプチドを取得した。 実施例 7 ヒト MT4-MMP (2) 部分べプチド （プロべプチドドメイン +活性ドメイ ン） の大腸菌での発現
配列番号 2の 58〜298番目に示されるアミノ酸配列を有するヒト MT4-MMP部分べ プチドをコードする cDNAを、 ヒト MT4-MMP (2) の cDNAを錡型として用いポリメラ —ゼ連鎖反応 （PCR) 法で増幅した。
得られた増幅断片を大腸菌の発現べクタ—である pRSET (Invitrogen製） にサブ クロ—ニングした。 発現酵素は pRSET由来のリーダ一配列中にある 6 X His配列と のフュージョンタンパクとして発現した。 さらにそのベクターを大腸菌株
BL2KDE3) pLysS (宝酒造社製） に導入した。 該大腸菌を 100 i g/mLのアンピシリ ン存在下、 1 Lの発現用培地 （トリプトン 12g/L、 イーストェクストラクト 24g/L、 塩化ナトリウム 10g/L、 トリスマベース 250mg/L、 グリセロール 4mL/い で 0D画 が 0.5になるまで培養して、 0.4匪 ol/Lのィソプロピル一 β一 D—チォガラクトピ ラノシド （IPTG) で刺激後さらに 3時間培養した。
培養後、 常法に基づいて大腸菌内に形成されたヒト ΜΤ4—匪 Ρ (2)部分ペプチド
(プロペプチドドメイン +活性ドメイン） よりなる顆粒 （inclusion body) を取 得し、 8 mol/L尿素、 50 mmol/L Tris- HC1 ( H 8.6) を含む可溶化液に溶解した。 該溶解液をニッケルキレートカラムにアプライし、 250 mmol/Lイミダゾ一ル溶出 フラクションを回収した。
該フラクションを 50 mmol/L Tris-HCl, pH8.6/ 6mol/L尿素/ 20 mmol/Lジチ オスレイト一ル / 0.15 mol/L塩化ナトリウム/ 100 mmol/L塩化カルシウム/ 100 μ mol/L塩化亜鉛/ 0.02% アジ化ナトリウムで希釈し （200倍希釈）、 シスタミン
(最終濃度 20 mmol/L)を加えた。次いで、 50 mmol/L Tris-HCl, pH8.6/ 0.15 mol/L 塩化ナトリウム/ 10 mmol/L塩化カルシウム/ 100 μ mol/L塩化亜鉛/ 5 rmol/Ιβ メルカプトエタノール/ 1 mmol/L 2-ヒドロキシェチルジスルフィ ド / 0.02%アジ 化ナトリウムに対して、 4°Cで透析した。 さらに、 10倍量の 50mmol/LTris-HCl， pH7.5/ 0.15 mol/L塩化ナトリウム/ 10 腿 ol/L塩化カルシウム / 50μπιο1 /L塩 化亜鉛/ 0.02% アジ化ナトリウムに対して透析した （4時間 Χ3回）。 この溶液を 22，000 xg、 4° ( 、 10分遠心し、 沈殿を除いた。
得られた上清をアミコン YM-10 (ミリポア製） で 5倍濃縮し、 粗精製酵素と した。 実施例 8 ヒト MT4-MMP (2) 部分ペプチド （活性ドメイン） の活性測定
a)MT4-MMP (2) 部分ペプチド （プロペプチドドメイン +活性ドメイン） の活性 lb
MMPはトリプシン処理により活性化されメタロプロテアーゼ活性を示すよう になることが知られている。 MT4— MMP (2) においてもそのような処理に よリ活性化されるか以下の方法で調べた。
200 の粗精製 MT4-匪 P (2) 部分ペプチド （プロペプチドドメイン +活性ドメ イン） 溶液にトリプシン （和光純薬） を O. l g/mLとなるように添加して、 37°C、 30分間反応後、 トリプシンを不活化するためにセリンプロテア一ゼィンヒビター のフエニルメタンスルホニルフルオリ ド （PMSF) を 1 mmol/L添加した。
b)アツセィ 活性化酵素 IO Lに測定用緩衝液または測定用緩衝液で希釈した阻害剤 （TIMP - 1または TIMP- 2；最終濃度 l^g/mL) を加えて 50 zLとした。 そこに ΙΟμπιοΙ/Lの蛍 光基質を 50 L加え、 37°Cで 120分間反応させた。 それぞれの反応時間が来た時点 で酵素活性によって発生する蛍光を測定した。 蛍光は励起波長 320nm、 蛍光波長 395 nmの条件で測定した。 用いた試薬、 基質は以下の通りである。 〇蛍光基質： DMSO stock (10 mmol/L) ； M0CAc-Pro-Leu-G 1 y-Leu-A2pr (Dnp) -A 1 a- Arg-NH2 (ペプチド研究所）
〇標準蛍光基質 DMSO stock (1 mmol/L) ； MOCAc-Pro- Leu-Gly (ペプチド研究所） 〇活性測定用緩衝液； 0.1 mol/L Tris-HCl (pH 7.5；ナカライテスク）， 0. lmol/L NaCl (ナカライテスク) , 0.01 mol/L CaCl2 (和光純薬) , 0.05¾ Briji-35(w/v； 和光純薬）
表 2に活性の測定結果を示した。 他の MMPs同様、 MT4-MMP (2) 部分ペプチド、 特にトリプシンによる活性化後の MT4- MMP (2) 部分ペプチドによる強い基質分解 活性が認められた。
MT— MM Pはメタ口プロテァ一ゼ阻害剤である TIMP- 1によっては阻害されず に、 TIMP- 2によっては阻害されることが報告されている [FEBS Letters， ， 101 (1996)]。
MT4-MMP (2) もかかる性質を有するかを検討した。
表 2に示すように、 MT4- MMP (2) の活性は他の M T— MM Pと同様に TIMP- U: よっては阻害されず T I MP- 2によって強く阻害された。
以上のことから、 MT4-讓 P (2) は MT— MMPの 1種であることが示された。 表 2 ヒト MT4- MMP (2) 部分ペプチド （活性ドメイン） の活性測定 試料 トリプシン処理 阻害剤 蛍光強度
(平均土 S D) (n=3) ブランク 0.000±0.057 ヒト MT4-MMP(2)部分べプチド 一 なし 1.304±0.056 ヒト MT4-MMP(2)部分べプチド + なし 4.882±0.102 ヒト MT4-MMP(2)部分べプチド + TIMP-1 3.493±0.166 ヒト MT4- MMP(2)部分べプチド + TIMP-2 0.076±0.065
実施例 9 マウス MT 5— MM P遺伝子のクローニング
マウス MT 3— MMP遺伝子を単離するために、 マウス 1 7日胚の脳 cDNA ライブラリ一を ZAP-cDNA Synthesis Kit(Stratagene)を用い、 該キットに添付の マニュアルに従って作成した。
ヒト MT 3— MM P遺伝子をプローブとして上記 c DNAライブラリ一のスク リーニングをプラークハイプリダイゼーション法によリ行った。 強いシグナルと 弱いシグナルを示すブラ一クが得られたため、 それらのクローンの塩基配列を決 定した。
弱いシグナルを示すクローンを解析した結果、 その中の一つの 2. l k bの配 列はヒトならびにラット MT 3—MMPと弱い相同性を示すが、 他の MMPとも 相同性が大幅に異なることから、 新規の MMP遺伝子であると考えられた。
続いて、 上記ライブラリ一からプラークハイプリダイゼ一シヨン法により 2. 1 k bの配列とハイブリダィズする 3. 7 k bの c DNAを取得した。 2. I k bと 3. 7 k bの配列から、 配列番号 7に示す 4. 2 k bの c DNA配列が得ら れた。
配列番号 7に示す c DN Aには配列番号 5で表される 6 1 8アミノ酸の蛋白質 がコードされていた。 配列番号 5のぺプチドは MT— MMPの各ドメインに相当 する配列をよく保存された状態で持っていることから、 新規の MT— MMP、 即 ち、 マウス MT 5— MMPであると結論された （図 1 )。 実施例 1 0 ヒト MT 5— MM P遺伝子のクローニング
マウス MT 5一 MMPに対応するヒト遺伝子を確認する為に、 マウス MT 5 - MM P遺伝子をプローブとしてヒト腎臓 c DNAライブラリ一（クロンテック社 製）のスクリ一ニングを上記実施例 9と同様の方法でプラークハイプリダイゼー シヨンを行い、 マウス MT 5— MMPと 92 %の相同性を有し、 既知の MT— M MPとは異なる遺伝子を得た。
解析したヒト MT 5— MMPの c DNAクローンは全て、 シグナルぺプチドを コードするはずの 5' 領域を欠いていたため、 以下に示す 5' RACE法によつ て欠損部分の配列を決定し、 ヒト MT 5— MM Pをコードする全領域を含む遺伝 子配列を決定した。
c DNAは superscript II (ギブコ BRL)を使用して、 ヒト脳の poly(A)+ RNA (クロンテック社製） とヒト MT 5—MMP選択的なプライマ一（配列番号 1 9) を用いて、 該キットに添付のマニュアルに従って作成した。
得られた c DN Aに単一鎖のオリゴヌクレオチドアダプタ一（配列番号 1 0)を T 4 RNAリガーゼでつなぎ、 MT 5— MM P選択的なプライマー（配列番号 1 9)とアダプター選択的なプライマ一（配列番号 1 1 )で GC緩衝液と LA T a q (宝酒造社製） を用いて PC Rを行った。
PCR後、 遺伝子選択的な他のプライマー（配列番号 20)とアダプタ一選択的 なプライマ一（配列番号 1 3)を用いて PCRを行った。 マウス遺伝子をプローブ としてヒト腎臓 c DNAライブラリ一から得られた配列と 5' RAC E法によつ て得られた配列から、 配列番号 6の 645アミノ酸の蛋白質をコードする配列番 号 8の 2. 6 k bの c DNAが取得できた。 実施例 1 1 MT 5 _MMPの mRNAの臓器での発現
組織における MT 5一 MMP遺伝子発現をノーザン 'プロッティングで調べた。 即ち、 20 の全 RNAを 1 %ァガロースゲルで泳動しナイロンメンブレン に転写し、 32 Pで標識したマウス MT 5—MMP遺伝子をプローブに用いてノ一 ザンプロッティングを行い、 約 4 k bの MT 5—MMPの mRNAの発現パター ンを調べた。
2週齡のマウスでは、 発現は脳にのみ強いシグナルが観察され、 他の臓器の組 織では脳に比べて検出限界かそれ以下の低い発現しか認められなかった。
ヒトの組織での発現をヒト MT 5— MM P遺伝子をプローブに用いて multiple tissue blot (クロンテック社製） を行って調べたところ、 脳に高発現 であった。 32 Pで標識した MT 5—MMP遺伝子をプローブに用いてノーザンプ ロッテイングを行い、 ヒト脳でも 4. O k bと 4. 8 k bの MT 5— MMPの m RN Aの強い発現が認められた。 ヒトではそれ以外に腎臓と塍臓で発現が認めら れた。 脳では 4. 8 k bの mRNA力 腎臓と膝臓では 4. O k bの mRNAが 強く発現していた。
MT 5— MMP特異的なプライマ一 （配列番号 2 1および 22) を用いた、 R T— PCRによる解析では腎臓、 膝臓ともに脳と同じサイズの D N A断片が同程 度の効率で増幅し、 サイズの異なるプロダクトが見られないことから、 短い転写 産物も完全なコーディング領域を持つと考えられる。
MT 5—MMPの発現をマウス及びヒ卜で調べると特徴的な発現が脳に見られ た。 特にマウスで見る限り、 発現は脳に限局しており、 他の臓器での発現は非常 に低かった。
脳の発現に特徴があることから、 脳の組織別ブロット （human brain multiple tissue blot： クロンテック社製） を用い、 部位特異的発現を調べた。
MT 5—MMPの発現は小脳に高い発現が見られる他、 大脳皮質、 髄質、 後頭 部、 前頭部、 側頭部、 被殻での発現が認められたが、 脊髄での発現は見られなか つた。
この結果は、 他の MT— MM Pが様々な組織で発現するのとは異なる、 MT 5 一 MM P特有の際だった特徴を示している。 ヒトでも、 脳の発現は強く、 それ以外にも腎臓及び膝臓での発現が見られた。 ヒト脳の部位特異的な発現を調べると、 小脳での高発現が特徴的であった。 小脳 での高発現はマウスでも確認された。
この結果は、 MT 5— MMPは脳組織の形成と維持、 神経回路構築などの過程 に伴う細胞周辺の細胞外基質分解を制御している可能性を示している。 実施例 1 2 MT 5— MMPの mRNAの癌細胞での発現
MT 1一 MM Pは多くの癌組織で、 癌細胞自身及び周辺の間質細胞で高頻度に 発現しており、 ゼラチナ一ゼ Aの組織レベルでの活性化因子として働いている。 様々な癌細胞株における発現を MT 5— MMP特異的なプライマ一 （配列番号 2 1および 22) を用いて、 RT— PCRで調べた。
結果を表 3に示した。 表 3 MT 5—MM P転写産物の癌細胞での発現 癌細胞株 MT5- MP 寄託番号
Jurkat (T eel 1) ATCC TIB-152
Raj i (B cell) ATCC CCL-86
BJAB(B cell) ATCC HB-136
THP-1 (monocytic) ATCC TIB-202
K562(monocytic) ATCC CCL-243
U - 937 (monocytic) ATCC CRL-1593.2
U-251 MG( astrocytoma) 発酵研 I画 288
SK-N-SH(neurob 1 astoma) +++ ATCC HTB-11
no.10(gl ioma) ++ 発酵研 IF050368
KALS-1 (glioma) +++ 発酵研 IF050434
MKN-7 (gastric) + 理化研 RCB0999
MKN-28 (gastric) 理化研 RCB1000
NUGC-4(gastric) HS財団 謂 0834
PANC-1 (pancreatic) ATCC CRL-1469
MIA PaCa-2(pancreatic) ATCC CRL-1420
SK-HEP-1 (hepatoma) ATCC HTB-52
Hep 3B (hepatoma) ATCC HB-8064
ZR - 75-1 (breast) ATCC CRL-1500
Mし F7 ( adenocarc i noma) ATCC HTB-22
T-24(b ladder) ATCC HTB-4
A375 (melanoma) +/- ATCC CRL-1619
HT-1080( fibrosarcoma) +/- ATCC CCL-121 + + + :非常に強発現、 + + :強発現、 +:中程度の発現、 +ノー：少量発現、 一：発現無し
ATCC： American Type Culture Col lection
HS財団：財団法人ヒューマンサイエンス振興財団
理化研：特殊法人理化学研究所
発酵研：財団法人発酵研究所
MT 1 — MM Pが様々な癌細胞株で発現しているのに対して、 MT 5 -MMP の発現細胞は限られていたが、 脳での発現に一致して神経系由来の神経芽細胞腫 〔SK- N- SH(HTB- 11， ATCC)),未分化型ダリオ一マ〔ηο· 10 ( IF050368,発酵研究所）〕、 ダリオ一マ 〔KALS-1 (IF050434,発酵研究所）〕 で高い発現が見られた。
また、 膝臓癌 CPANC-1 (CRL-1469, ATCC) ， MIA PaCa-2 (CRL-1420, ATCC)) 、 肝癌 CSK-HEP-1 (HTB-52, ATCC) ， Hep 3B (HB-8064, ATCC)) での発現が特徴的 でめつ ,こ。
M T— M M Pの細胞表面での異常発現は細胞の浸潤性を亢進させることが考え られる。 実際に MT 1— MMPの過剰発現は癌細胞株の浸潤能を亢進させ、 実験 的転移を高発させる。 ヒト癌組織では癌細胞や周辺の線維芽細胞が MT 1 -MM Pを高頻度で発現しており、 MT 1一 MM Pが発現場所で活性化させるゼラチナ —ゼ Aの存在は癌の浸潤 ·転移とよく相関する。
未分化型ダリオ一マ、 ダリオ一マ、 膝臓癌、 肝がんの細胞株で発現が見られる ことから、 特定のタイプの癌では MT 5— MM Pの過剰発現が癌細胞の悪性性質 に関与している可能性が示唆された。 実施例 1 3 マウス MT5- MMP部分べプチド （プロペプチドドメイン +活性ドメイ ン） の大腸菌での発現
配列番号 5の 40〜300番目に示されるアミノ酸配列の N末端にメチォニン残基 の付加した配列を有するマウス MT5-MMP部分ぺプチドをコードする cDNAを、マウス MT5-MMPの cDNAを錡型として用いポリメラーゼ連鎖反応 （PCR) 法で増幅した。 得られた増幅断片を大腸菌の発現べクタ—である pET3a (宝酒造社製） にサブ クローニングして、 さらに大腸菌株 BL21(DE3) pLysS (宝酒造社製） に導入した。 該大腸菌を lOO zg/mLのアンピシリン存在下、 1 Lの発現用培地 （トリプトン 12g/L、 イーストェクストラク ト 24g/L、 塩化ナトリ ウム 10g/L、 ト リスマベース 250mg/L、 グリセロール 4mL/L) で 0D細が 0.5になるまで培養して、 0.4tnmol/Lのィソプロピ ルー /3—D—チォガラクトビラノシド （IPTG) で刺激後さらに 3時間培養した。 培養後、 常法に基づいて大腸菌内に形成されたマウス MT5—匪 P部分べプチドょ りなる顆粒 （inclusion body) を取得し、 8 moi/L尿素、 50腿 ol/L Tris- HC1 (p H8.6) および 20 mmol/ぃジチオスレイ ト一ル （DTT) を含む可溶化液に溶解した。 該溶解液を Q-ァニオンイオン交換カラムにアプライし、 0.1 M NaCl溶出画分を回 収した。
該フラクションを 50 imnol/L Tris- HC1 (pH8.6)、 6mol/L尿素、 1 mmol/Lジ チオスレイ ト一ル、 0.15moi/L塩化ナトリウム、 5廳 ol/L塩化カルシウム、 100 mmol/L 塩化亜鉛、 0.02% アジ化ナトリウムを含有する溶液で希釈し、 該希釈溶 液にシスタミン （最終濃度 20 mmol/L) を加えた。 次いで、 50 mmol/L Tris-HCl (pH8.6)、 0.15mol/L塩化ナトリウム、 5腿 ol/L塩化カルシウム、 100腿 ol/L 塩化亜鉛、 5匪 ol/L/3メルカプトエタノール、 1 mmol/L 2-ヒドロキシェチルジ スルフイ ド、 0.02%アジ化ナトリウムを含有する溶液 4 Lに対して、 4°Cでー晚透 析した。 さらに、 10倍量の 50 mmol/L Tris-HCl (pH7.5)、 0.15 mol/L塩化ナ トリウム、 5腿 ol/L塩化カルシウム、 50 μ mol/L塩化亜鉛、 0.02%アジ化ナト リゥムを含有する溶液で透析した （4時間 X3回）。 この溶液を 22000 xg、 4°C、 10分間遠心分離し、 沈殿を除いた。
得られた上清をアミコン YM-10 (ミリポア製） で濃縮し、 0. l 6g/mL トリプシ ンで 30分間 3 7 °Cで処理した。 トリプシンを 1 mmol/L DTTで失活させた後、 50 mmol/L Tris-HCl (pH7.5)、 150 mmol/L塩化ナトリウム、 10 mmo L塩化カルシゥ ムおよび 0.02% アジ化ナトリウムを含む緩衝液で平衡化した S-200カラムクロ マトグラフィ一に通塔し、 ゲルろ過を行い、 マウス MT5-MMP部分ペプチド （プロ ペプチドドメイン +活性ドメイン） を取得した。
ヒト MT5-MMPも同様の方法で発現が可能である。 実施例 1 4 マウス MT 5 - MMP部分べプチド （活性ドメイン） の活性測定
ProMMP-2 (final g/mL), MT- 5 MMP部分ペプチド （プロペプチドドメイン + 活性ドメイン） （最終濃度 1 g/mL) を混和し、 37°Cで 1時間インキュベートした。 この際に Brij i 35添加 TNCバッファー [50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5), 150 mmol/L NaCl, 10 mmol/L CaCl2， 0.02% NaN3， 0.05% Briji 35]を用いた。 インキュべ一 シヨン後、 サンプルに SDS/PAGE Loading bufferを等量加えて、 定法に従い電気 泳動後、 クーマーシー染色を行った。 ProMMP- 2活性化のポジティブコントロール として p-aminophenylmercuric acetate(APMA)を用いた。 その結果 MMP濃度依存 的に？：^匪!5 の活性化が認められた。 図 2に結果を示す。 産業上の利用可能性
本発明により得られる新規 MT 4— MMP (2) ポリペプチドの DNAを用い ることにより、 変形性関節症、 慢性関節リウマチ、 喘息、 自己免疫疾患、 アトピ 一性皮膚炎、 乾癬、 接触性皮膚炎、 脱毛症、 虚血性心疾患、 臓器移植に伴う免疫 反応、 肝炎、 腎炎、 膝炎、 動脈硬化、 角膜潰瘍を含む創傷、 白血病、 癌、 白血球 の浸潤を伴う炎症等の疾患の診断、 予防、 治療が可能となる。
また、 本発明により得られる新規 MT 5一 MMPポリぺプチドの DNAを用い ることにより、 変形性関節症、 慢性関節リウマチ、 喘息、 自己免疫疾患、 アトピ 一性皮膚炎、 乾癬、 接触性皮膚炎、 脱毛症、 虚血性心疾患、 臓器移植に伴う免疫 反応、 肝炎、 腎炎、 膝炎、 動脈硬化、 角膜潰瘍を含む創傷、 白血病、 脳卒中時の 脳障害、 アルツハイマー病、 痴呆症、 多発性硬化症、 パーキンソン病、 脳腫瘍、 癌、 白血球の浸潤を伴う炎症等の疾患の診断、 予防、 治療が可能となる。

Claims

請 求 の 範 囲
I . 配列番号 1記載のァミノ酸配列からなるポリペプチド。
2 . 請求項 1記載のポリべプチドの有するアミノ酸配列において 1もしくは数個 のアミノ酸が欠失、 置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつメタ口 プロテァーゼ活性を有するポリべプチド。
3 . 配列番号 2記載のァミノ酸配列からなるポリぺプチド。
4 . 請求項 3記載のポリべプチドの有するアミノ酸配列において 1もしくは数個 のアミノ酸が欠失、 置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつメタ口 プロテアーゼ活性を有するポリペプチド。
5 . 配列番号 5記載のァミノ酸配列からなるポリペプチド。
6 . 請求項 5記載のポリペプチドの有するアミノ酸配列において 1もしくは数個 のアミノ酸が欠失、 置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつメタ口 プロテァーゼ活性を有するポリペプチド。
7 . 配列番号 6記載のァミノ酸配列からなるポリべプチド。
8 . 請求項 7記載のポリべプチドの有するアミノ酸配列において 1もしくは数個 のアミノ酸が欠失、 置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつメタ口 プロテア一ゼ活性を有するポリべプチド。
9 . 請求項 1から 4のいずれか 1項に記載のポリべプチドをコードする D N A。 1 0 .請求項 5から 8のいずれか 1項に記載のポリべプチドをコードする D N A。
I I . 配列番号 3の 8 6〜 1 8 4 6番または配列番号 4の 1 0 0〜 1 9 1 7番に 記載の塩基配列からなる D N Aまたは該 D N Aとストリンジェントな条件下でハ ィブリダイズし、 かつメタ口プロテァ一ゼ活性を有するポリペプチドをコードす る D N A。
1 2 . 配列番号 7の 7 5〜 1 9 2 8番または配列番号 8の 1〜 1 9 3 5番に記載 の塩基配列からなる D N Aまたは該 D N Aとストリンジェントな条件下でハイブ リダイズし、 かつメタ口プロテアーゼ活性を有するポリぺプチドをコードする D N A。
1 3 . 請求項 9から 1 2のいずれか 1項に記載の D N Aをベクターに組み込んで 得られる組換え体 DN A。
14. 請求項 1 3記載の組換え体 DNAを保有する形質転換体。
1 5. 形質転換体が Escherichia属に属する微生物である、 請求項 1 4記載の形 質転換体。
1 6. Escherichia属に属する微生物が Escherichia col iである、 請求項 1 5記 載の形質転換体。
1 7. 請求項 1から 8のいずれか 1項に記載のポリペプチドをコードする DN A をべクタ一に組み込んで得られる組換え体 DNAを保有する形質転換体を培養液 中で培養し、 該ポリペプチドを該培養物中に生成 ·蓄積させ、 該培養物中より該 ポリぺプチドを採取することを特徴とする、 該ポリペプチドの製造法。
1 8. 請求項 9または 1 1のいずれか 1項に記載の DN Aの有する塩基配列中の 連続した 5〜60塩基と同じ配列を有するオリゴヌクレオチド、 該オリゴヌクレ ォチドと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド、 およびこれらオリゴヌクレ ォチドのオリゴヌクレオチド誘導体から選ばれるオリゴヌクレオチド。
1 9. 請求項 1 0または 1 2のいずれか 1項に記載の DN Aの有する塩基配列中 の連続した 5〜 60塩基と同じ配列を有するオリゴヌクレオチド、 該オリゴヌク レオチドと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド、 およびこれらオリゴヌク レオチドのオリゴヌクレオチド誘導体から選ばれるオリゴヌクレオチド。
20. 請求項 1 8または 1 9に記載のオリゴヌクレオチドを用いて請求項 1から 8のいずれか 1項に記載のポリべプチドをコードする mRNAを検出する方法。 2 1. 請求項 1 8または 1 9に記載のオリゴヌクレオチドを用いて請求項 1から 8のいずれか 1項に記載のポリべプチドの発現を抑制する方法。
22. 請求項 1から 8のいずれか 1項に記載のポリべプチドおよび該ポリべプチ ドを発現する細胞を用いることを特徴とする、 該ポリぺプチドの阻害薬または活 性化薬のスクリーニング法。
23. 請求項 1から 4のいずれか 1項に記載のポリべプチドを含有する変形性関 節症、 慢性関節リウマチ、 喘息、 自己免疫疾患、 アトピー性皮膚炎、 乾癬、 接触 性皮膚炎、 脱毛症、 虚血性心疾患、 臓器移植に伴う免疫反応、 肝炎、 腎炎、 脬炎、 動脈硬化、 白血病、 悪性腫瘍、 創傷、 角膜潰瘍、 組織傷害または白血球の浸潤に 伴う炎症の診断薬、 治療薬または予防薬。
2 4 . 請求項 5〜 8のいずれか 1項に記載のポリべプチドを含有する変形性関節 症、 慢性関節リウマチ、 喘息、 自己免疫疾患、 アトピー性皮膚炎、 乾癬、 接触性 皮膚炎、 脱毛症、 虚血性心疾患、 臓器移植に伴う免疫反応、 肝炎、 腎炎、 膝炎、 動脈硬化、 白血病、 悪性腫瘍、 創傷、 角膜潰瘍、 組織傷害、 白血球の浸潤に伴う 炎症、 脳卒中時の脳障害、 アルツハイマー病、 痴呆症、 多発性硬化症、 パーキン ソン病または脳腫瘍の診断薬、 治療薬または予防薬。
2 5 . 請求項 9または 1 1記載の D N Aを含有する変形性関節症、 慢性関節リウ マチ、 喘息、 自己免疫疾患、 アトピー性皮膚炎、 乾癬、 接触性皮膚炎、 脱毛症、 虚血性心疾患、 臓器移植に伴う免疫反応、 肝炎、 腎炎、 滕炎、 動脈硬化、 白血病、 悪性腫瘍、 創傷、 角膜潰瘍、 組織傷害または白血球の浸潤に伴う炎症の診断薬、 治療薬または予防薬。
2 6 . 請求項 1 0または 1 2記載の D N Aを含有する変形性関節症、 慢性関節リ ゥマチ、 喘息、 自己免疫疾患、 アトピー性皮膚炎、 乾癬、 接触性皮膚炎、 脱毛症、 虚血性心疾患、 臓器移植に伴う免疫反応、 肝炎、 腎炎、 膝炎、 動脈硬化、 白血病、 悪性腫瘍、 創傷、 角膜潰瘍、 組織傷害、 白血球の浸潤に伴う炎症、 脳卒中時の脳 障害、 アルツハイマー病、 痴呆症、 多発性硬化症、 パーキンソン病または脳腫瘍 の診断薬、 治療薬または予防薬。
2 7 . 請求項 1 8記載のオリゴヌクレオチドを含有する変形性関節症、 慢性関節 リウマチ、 喘息、 自己免疫疾患、 アトピー性皮膚炎、 乾癬、 接触性皮虜炎、 脱毛 症、 虚血性心疾患、 臓器移植に伴う免疫反応、 肝炎、 腎炎、 膝炎、 動脈硬化、 白 血病、 悪性腫瘍、 創傷、 角膜潰瘍、 組織傷害または白血球の浸潤に伴う炎症の診 断薬、 治療薬または予防薬。
2 8 . 請求項 1 9記載のオリゴヌクレオチドを含有する変形性関節症、 慢性関節 リウマチ、 喘息、 自己免疫疾患、 アトピー性皮膚炎、 乾癬、 接触性皮膚炎、 脱毛 症、 虚血性心疾患、 臓器移植に伴う免疫反応、 肝炎、 腎炎、 滕炎、 動脈硬化、 白 血病、 悪性腫瘍、 創傷、 角膜潰瘍、 組織傷害、 白血球の浸潤に伴う炎症、 脳卒中 時の脳障害、 アルツハイマー病、 痴呆症、 多発性硬化症、 パーキンソン病または 脳腫瘍の診断薬、 治療薬または予防薬。
2 9 . 請求項 9または 1 1の D N A、 または請求項 1 8記載のオリゴヌクレオチ ドをベクタ一に組み込んで得られる、 変形性関節症、 慢性関節リウマチ、 喘息、 自己免疫疾患、 アトピー性皮膚炎、 乾癬、 接触性皮膚炎、 脱毛症、 虚血性心疾患、 臓器移植に伴う免疫反応、 肝炎、 腎炎、 滕炎、 動脈硬化、 白血病、 悪性腫瘍、 創 傷、 角膜潰瘍、 組織傷害または白血球の浸潤に伴う炎症の治療のための遺伝子治 療用ベクター。
3 0 . 請求項 1 0または 1 2の D N A、 または請求項 1 9記載のオリゴヌクレオ チドをベクターに組み込んで得られる、 変形性関節症、 慢性関節リウマチ、 喘息、 自己免疫疾患、 アトピー性皮膚炎、 乾癬、 接触性皮膚炎、 脱毛症、 虚血性心疾患、 臓器移植に伴う免疫反応、 肝炎、 腎炎、 膝炎、 動脈硬化、 白血病、 悪性腫瘍、 創 傷、 角膜潰瘍、 組織傷害、 白血球の浸潤に伴う炎症、 脳卒中時の脳障害、 ァルツ ハイマ一病、 痴呆症、 多発性硬化症、 パーキンソン病または脳腫瘍のための遺伝 子治療用ベクター。
3 1 . 請求項 1から 8のいずれか 1項に記載のポリペプチドを発現する細胞と被 験試料とを接触させることを特徴とする、 請求項 1から 8のいずれか 1項に記載 のポリベプチドをコードする遺伝子の発現を調節する化合物のスクリ一二ング法。 3 2 . 遺伝子の発現を調節する化合物を、 請求項 1から 8のいずれか 1項に記載 のポリペプチドをコードする m R N A量を測定することにより検出することを特 徴とする、 請求項 3 1記載のスクリーニング法。
PCT/JP1999/005349 1998-09-29 1999-09-29 Adn codant pour de nouveaux polypeptides WO2000018900A1 (fr)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CA002344464A CA2344464A1 (en) 1998-09-29 1999-09-29 Dnas encoding novel polypeptides
EP99969738A EP1136549A4 (en) 1998-09-29 1999-09-29 DNA ENCODING FOR NEW POLYPEPTIDES
AU59990/99A AU5999099A (en) 1998-09-29 1999-09-29 Dnas encoding novel polypeptides

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP10/276258 1998-09-29
JP27625898 1998-09-29
JP29150598 1998-09-29
JP10/291505 1998-09-29

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2000018900A1 true WO2000018900A1 (fr) 2000-04-06

Family

ID=26551830

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP1999/005349 WO2000018900A1 (fr) 1998-09-29 1999-09-29 Adn codant pour de nouveaux polypeptides

Country Status (4)

Country Link
EP (1) EP1136549A4 (ja)
AU (1) AU5999099A (ja)
CA (1) CA2344464A1 (ja)
WO (1) WO2000018900A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001090326A2 (en) * 2000-05-22 2001-11-29 Pharmacia & Upjohn Company Novel matrix metalloproteinases

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU5999199A (en) * 1998-09-29 2000-04-17 Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd. Novel antibodies, drugs containing these antibodies and methods for screening compounds by using these antibodies
WO2010079340A2 (en) * 2009-01-08 2010-07-15 Eisai R & D Management Co., Ltd. Assay

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995025171A2 (de) * 1994-03-17 1995-09-21 Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin Dna-sequenzen für matrix-metallproteasen, ihre herstellung und verwendung
WO1997004080A1 (fr) * 1995-07-14 1997-02-06 Fuji Yakuhin Kogyo Kabushiki Kaisha Nouvelle proteine et anticorps monoclonal specifique a cette derniere
EP0875577A2 (en) * 1997-03-06 1998-11-04 Smithkline Beecham Corporation Novel membrane-type matrix metalloproteinase-5 gene

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995025171A2 (de) * 1994-03-17 1995-09-21 Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin Dna-sequenzen für matrix-metallproteasen, ihre herstellung und verwendung
WO1997004080A1 (fr) * 1995-07-14 1997-02-06 Fuji Yakuhin Kogyo Kabushiki Kaisha Nouvelle proteine et anticorps monoclonal specifique a cette derniere
EP0875577A2 (en) * 1997-03-06 1998-11-04 Smithkline Beecham Corporation Novel membrane-type matrix metalloproteinase-5 gene

Non-Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE MEDLINE ON PUBMED KAJITA M. ET AL.: "Human membrane type-4 matrix metalloproteinase (MT4-MMP) is encoded by a novel major transcript: isolation of complementary DNA clones for human and mouse mt4-mmp transcripts" *
DUANQING PEI: "Identification and Characterization of the Fifth Mambrane-type Matrix Metallo- proteinase MT5-MMP", THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 274, no. 13, 26 March 1999 (1999-03-26), pages 8925 - 8932 *
ELENA LLANO ET AL.: "Identification and Characterization of Human MT5-MMP, a New Membrane-bound Activator of Pro-gelatinase A Overexpressed in Brain Tumors", CANCER RESEARCH, vol. 59, no. 11, 1 June 1999 (1999-06-01), pages 2570 - 2576 *
FEBS LETTERS, vol. 457, no. 3, 3 September 1999 (1999-09-03), pages 353 - 356 *
HORST WILL ET AL.: "cDNA sequence and mRNA tissue distribution of a novel human matrix metallo- proteinase with a potential transmembrane segment", EUROPEAN JOURNAL OF BIOCHEMISTRY, vol. 231, no. 3, 1 August 1995 (1995-08-01), pages 602 - 608 *
KEN-ICHI SHOFUDA ET AL.: "Expression of Three Membrane-type Matrix Metalloproteinases (MT-MMPs) in Rat Vascular Smooth Muscle Cells and Characterization of MT3-MMPs with and without Transmembrane Domain", THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 272, no. 15, 11 April 1997 (1997-04-11), pages 9749 - 9754, XP001039518, DOI: doi:10.1074/jbc.272.15.9749 *
See also references of EP1136549A4 *
TAKAHISA TAKINO ET AL.: "Identification of the Second Membrane-type Matrix Metalloprotein- ase (MT-MMP-2) Gene from a Human Placenta cDNA Library", THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 270, no. 39, 29 September 1995 (1995-09-29), pages 23013 - 23020 *
XOSE S. PUENTE ET AL.: "Molecular Cloning of a Novel Membrane-Type Matrix Metalloproteinase from a Human Breast Carcinoma", CANCER RESEARCH, vol. 56, no. 5, 1 March 1996 (1996-03-01), pages 944 - 949 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001090326A2 (en) * 2000-05-22 2001-11-29 Pharmacia & Upjohn Company Novel matrix metalloproteinases
WO2001090326A3 (en) * 2000-05-22 2003-01-16 Upjohn Co Novel matrix metalloproteinases
US6734005B2 (en) 2000-05-22 2004-05-11 Pharmacia & Upjohn Company Matrix metalloproteinases
US7070976B2 (en) 2000-05-22 2006-07-04 Pfizer Inc. Matrix metalloproteinase polypeptide

Also Published As

Publication number Publication date
AU5999099A (en) 2000-04-17
EP1136549A1 (en) 2001-09-26
EP1136549A4 (en) 2003-03-12
CA2344464A1 (en) 2000-04-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2003527067A (ja) Ａｃｒｐ３０（３０ｋｄの脂肪細胞補体関連タンパク質）の相同体ａｃｒｐ３０ｒ１ｌ
JP2001504333A (ja) 前立腺特異カリクレイン
JP2009039117A (ja) 血管形成に関連する障害を診断及び治療するための組成物と方法
JP2000516453A (ja) ヒトカリクレイン
US6358725B1 (en) Mouse aspartic secretase-1 (mASP1)
JPH10510986A (ja) メタロプロテイナーゼ−４のヒト組織インヒビター
JP2001521400A (ja) ケラチノサイト由来カリクレイン
JPH1175873A (ja) 新規化合物
JPH11505705A (ja) Ｍｃｈ２、アポトーシス性システインプロテアーゼ、ならびに組成物、ならびにそれを製造および使用する方法
JP2002525058A (ja) プロテインキナーゼｋｉａａ０５５１の薬剤としての使用
JP2004000198A (ja) ショウジョウバエｋｕｚ遺伝子に関連したヒト・ディスインテグリン・メタロプロテアーゼ
JP2002523029A (ja) ヒトヒストンデアセチラーゼ遺伝子ｈｄ４
JP2003508011A (ja) ヒトｆｅｚ１遺伝子である新規ガン抑制遺伝子に関する組成物、キットおよび方法
WO2000018805A1 (fr) Nouveaux anticorps, medicaments les contenant et methodes de criblage de composes par utilisation desdits anticorps
EP0732398B1 (en) Novel tyrosine kinase
WO2000018900A1 (fr) Adn codant pour de nouveaux polypeptides
CA2281674A1 (en) Parg, a gtpase activating protein which interacts with ptpl1
JP2001511011A (ja) 腫瘍壊死因子レセプター−１誘導性アポトーシスおよびｃｄ−９５誘導性アポトーシスの新規なインヒビターである、ｉ−ｆｌｉｃｅ
US20080177034A1 (en) Taspase1 and Methods of Use
JPH11253183A (ja) Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−３ポリペプチドおよびポリヌクレオチド
JP2001506846A (ja) 新規のカルパイン、その製造方法および使用
JP2003210183A (ja) ヒトＩκＢ−β
JPH10313878A (ja) 新規膜タイプマトリックス金属プロテイナーゼ−５遺伝子
JPH119288A (ja) 新規ｈａｓ２スプライシング変種ｈｏｅｆｃ１１：慢性腎不全、炎症性疾患および心筋虚血における標的
CA2447958A1 (en) Hypoxia inducible factors and uses thereof for inducing angiogenesis and improving muscular functions

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AU BG BR CA CN CZ HU ID IL IN JP KR MX NO NZ PL RO SG SI SK UA US VN ZA

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
ENP Entry into the national phase

Ref country code: JP

Ref document number: 2000 572347

Kind code of ref document: A

Format of ref document f/p: F

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2344464

Country of ref document: CA

Ref country code: CA

Ref document number: 2344464

Kind code of ref document: A

Format of ref document f/p: F

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 09806232

Country of ref document: US

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1999969738

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 1999969738

Country of ref document: EP

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: 1999969738

Country of ref document: EP