WO2000014227A1 - Nouvelle proteine et son adn - Google Patents

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WO2000014227A1
WO2000014227A1 PCT/JP1999/004766 JP9904766W WO0014227A1 WO 2000014227 A1 WO2000014227 A1 WO 2000014227A1 JP 9904766 W JP9904766 W JP 9904766W WO 0014227 A1 WO0014227 A1 WO 0014227A1
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dna
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Koji Yoshimura
Yuichi Hikichi
Atsushi Nishimura
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Takeda Chemical Industries, Ltd.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6489—Metalloendopeptidases (3.4.24)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value

Definitions

  • the present invention relates to a novel ADAM protein.
  • the extracellular matrix is the cell-supporting tissue that surrounds the cells of the tissue, and includes fibrous proteins such as collagen and elastin, complex carbohydrates such as proteoglycans, and fibronectin and laminin that are involved in cell adhesion. And carbohydrates such as hyaluronic acid.
  • the extracellular matrix is known to have a significant effect on cell activities such as cell morphology 'metabolism' migration, proliferation and differentiation. Therefore, it is known to be related to many biological phenomena such as development, aging, inflammation, wound healing, immunity, and tumors of living organisms.
  • ADAM disintegrin and metal lopro tease family proteins have a structure similar to hemorrhagic snake venom, and consist of a meta-oral protease region and a disintegrin region. Many ADAM family proteins are membrane proteins, and more than 10 cDNAs have been isolated from various organisms (TG Wolfsberg et al., Journal of Cell Biology 131: 275-278, 1995). It is known that the physiological function of ADAM protein is involved in cell fusion, cell differentiation, biological defense, etc. In other words, fertilin, an ADAM expressed on sperm, binds to integrin ⁇ 6 ⁇ 1 on eggs via the disintegrin region and is involved in the binding of eggs to sperm (D. Myles et al., Proc.
  • the new ADAM family protein derived from humans has an activity to regulate its activity, and is a new drug that is useful for the prevention and treatment of various diseases based on its activity, for example, joint diseases such as rheumatoid arthritis and osteoarthritis. Enables the development of Accordingly, in the field of the present invention, it has been desired to find a novel human-derived ADAM protein and develop a method for producing it in large quantities. Disclosure of the invention
  • the present inventors have conducted intensive studies in order to solve the above problems, and as a result, have found an ADAM gene having a novel base sequence, and the ADAM protein encoded thereby has a protease activity, In addition, they found that it was involved in the degradation of extracellular matrix.
  • a diagnostic agent comprising the DNA of (7) or the antibody of (14),
  • a medicine comprising the protein of (1) or the partial peptide of (6) or a salt thereof,
  • a kit for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits protease activity comprising the protein or a salt thereof according to the above (1), (21) A compound or a salt thereof that promotes or inhibits protease activity, which can be obtained by using the screening method according to (19) or the screening kit according to (20).
  • a medicament comprising a compound or a salt thereof, which promotes or inhibits protease activity, which can be obtained by using the screening method according to (19) or the screening kit according to (20);
  • an extracellular matrix degrading agent comprising a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, or a salt thereof;
  • a compound that promotes or inhibits extracellular matrix-degrading enzyme activity comprising a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, or a salt thereof. Or a kit for screening its salts.
  • a compound or salt thereof that promotes or inhibits extracellular matrix degrading enzyme activity which can be obtained by using the screening method according to (27) or the screening kit according to (28).
  • a compound or a salt thereof that promotes or inhibits extracellular matrix degrading enzyme activity which can be obtained by using the screening method according to (27) or the screening kit according to (28). Medicine,
  • a diagnostic agent comprising an antibody against a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 or a salt thereof
  • a proteoglycan degrading enzyme gene characterized in that a recombinant into which a test gene has been introduced and cartilage or cartilage matrix-producing cells derived from an animal are mixedly cultured, and sulfated daricosaminodalican in the culture supernatant is measured. How to detect the
  • an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 has about 95% or more, preferably about 98% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2
  • the amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is: (1) 1 to 5 (preferably 1 to 3) of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 Amino acid sequence with amino acids deleted, 2 Amino acid sequence with 1-5 (preferably 1-3) amino acids added to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 3 SEQ ID NO: 2 1-5 or more (preferably 1-3) amino acids in the amino acid sequence
  • the protein according to the above (1), wherein the amino acid is an amino acid sequence in which amino acid is substituted with another amino acid, or an amino acid sequence obtained by combining them.
  • the antibody of (14) is competitively reacted with a test solution and a labeled protein of (1), a partial peptide of (4) or a salt thereof, The protein according to (1) in a test solution, wherein the ratio of the labeled protein according to (1), the partial peptide according to (4), or a salt thereof bound to an antibody is measured.
  • test solution and the antibody of (14) insolubilized on the carrier and the labeled antibody of (14) are allowed to react simultaneously or continuously, and then labeled on the insolubilized carrier.
  • a method for quantifying the protein according to the above (1), the partial peptide according to the above (6) or a salt thereof in a test solution which comprises measuring the activity of the agent;
  • an antisense DNA having a nucleotide sequence complementary or substantially complementary to the DNA according to (7), (9) or (39), and having an action of suppressing the expression of the DNA;
  • the nucleotide sequence substantially complementary to the DNA according to the above (7), (9) or (39) is approximately 95% the entire nucleotide sequence or a partial nucleotide sequence of the nucleotide sequence complementary to the DNA.
  • FIG. 1 shows the nucleotide sequence of DNA encoding a protein belonging to the ADAM family 1 of the present invention and the amino acid sequence encoded thereby (following FIG. 2).
  • FIG. 2 shows the nucleotide sequence of DNA encoding the protein belonging to the ADAM family of the present invention and the amino acid sequence encoded thereby (continuation of FIG. 1).
  • FIG. 3 shows the nucleotide sequence of the DNA encoding the protein belonging to the ADAM family of the present invention and the amino acid sequence encoded thereby (following FIG. 4).
  • FIG. 4 shows the nucleotide sequence of DNA encoding the protein belonging to the ADAM family of the present invention and the amino acid sequence encoded thereby (continuation of FIG. 3).
  • FIG. 5 shows a construction diagram of the vector (PTB2076) created in Example 9. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, or SEQ ID NO: 15 of the present invention (hereinafter referred to as “the protein of the present invention”).
  • ⁇ are cells of human warm-blooded animals (eg, guinea pigs, rats, mice, birds, chickens, egrets, bushes, hidges, birds, monkeys, etc.) (eg, hepatocytes, spleen cells, nerve cells, glial cells) Cells, T cells i3 cells, bone marrow cells, mesangial cells, Langerhans cells, epidermal cells, epithelial cells, endothelial cells, fibroblasts, fiber cells, muscle cells, fat cells, immune cells (eg, macrophages, T cells, B cells, natural killer cells, mast cells, neutrophils, basophils, eosinophils, Monocytes), megakaryocytes, synovial cells, chondrocytes, bone cells, osteoblasts, osteoclasts, breast cells, hepatocytes or stromal cells, or precursors of these cells, stem cells or cancer cells, etc.) or Any tissue where these cells are located, for example
  • amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, or SEQ ID NO: 15 includes SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: No. 5 or an amino acid sequence having about 95% or more, preferably about 98% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15.
  • the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 includes an amino acid sequence having the amino acid sequence at positions 428 to 437 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:
  • the amino acid sequence that is substantially the same as the amino acid sequence represented by 2 is an amino acid sequence having the 29th to 38th amino acid sequences of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and is represented by SEQ ID NO: 15
  • Examples of the amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence include an amino acid sequence having the 428th to 437th amino acid sequences of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15.
  • a protein having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, or SEQ ID NO: 15 of the present invention For example, it has an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, or SEQ ID NO: 15; A protein having substantially the same activity as the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 15 is preferable.
  • the protease-like activity means, for example, an activity of cleaving (hydrolyzing) a peptide bond.
  • the extracellular matrix-degrading enzyme activity refers to an enzyme activity for degrading a cell supporting tissue surrounding cells of a tissue composed of collagen, elastin, proteoglycan, fibronectin, laminin, hyaluronic acid, etc. It means enzyme activity (proteoglycan-degrading enzyme activity).
  • substantially the same activity examples include protease activity, extracellular matrix-degrading enzyme activity (preferably proteodarican-degrading enzyme activity), and the like.
  • Substantially identical indicates that their activities are qualitatively identical (eg, physiochemically or pharmacologically). Therefore, the activities such as protease activity and extracellular matrix degrading enzyme activity (preferably proteodalican degrading enzyme activity) are equivalent (eg, about 0.1 to 100 times, preferably about 0.5 to 10 times). (More preferably, 0, 5 to 2 times), but the quantitative factors such as the degree of these activities and the molecular weight of the protein may be different.
  • the protease activity can be measured according to a method known per se, for example, according to a screening method described later.
  • the extracellular matrix-degrading enzyme activity can be measured by using the proteodarin-degrading enzyme activity as an index, for example, according to the method described in Example 6 below.
  • Examples of the protein of the present invention include (1) SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, or 1 to 5 (preferably, 1 to 3) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15. 2) SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5 or 1 to 5 (preferably 1 to 3) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 15 An amino acid sequence in which 1 to 5 (preferably 1 to 3) amino acids are inserted in a row; ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ amino acid represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 15
  • a so-called mutin such as a protein having an amino acid sequence in which 1 to 5 (preferably 1 to 3) amino acids in the sequence are substituted with another amino acid, or a protein having an amino acid sequence obtained by combining them is also included. .
  • the position of the insertion, deletion or substitution is not particularly limited.
  • the position of the insertion, deletion or substitution may be, for example, a position other than the 119th Va 1 to 495th He or the 336th position in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 15. Positions other than the 350th As to the 350th As are listed.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 corresponds to the amino acid sequence at positions 400 (Leu) to 495 (Phe) of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and is represented by SEQ ID NO: 5.
  • the amino acid sequence corresponds to the 199th (Va1) to 399th (Pro) amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the left end is the N-terminus (amino terminus) and the right end is the C-terminus (carboxyl terminus) according to the convention of peptide labeling.
  • the proteins of the present invention including the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 15, usually have a C-terminal carboxy group (- The C-terminus may be an amide (one CONH2) or an ester (one COOR).
  • R in the ester e.g., methyl, Echiru, n- propyl, C ⁇ such as isopropyl or n- butyl - 6 alkyl group, for example, Shikurobe pentyl, C 3- 8 cycloalkyl group such as cyclohexyl
  • C 6 -aryl groups such as phenyl and mono-naphthyl
  • phenyl CI- 2 alkyl groups such as benzyl and phenethyl or mono-naphthyl C 1-2 alkyl groups such as hy-naphthylmethyl
  • aralkyl groups such as Viva-yloxymethyl group, which is widely used as an oral ester, is used.
  • the protein of the present invention When the protein of the present invention has a carboxyl group (or carboxylate) at a position other than the C-terminus, the protein of the present invention includes a protein in which a carbonyl group is amidated or esterified.
  • the ester in this case, for example, the above-mentioned C-terminal ester and the like are used.
  • amino acid residues e.g., Mechionin residues
  • N-terminal Amino groups protecting group eg, C ⁇ such as single 6 Al Kanoiru such formyl group, Asechiru group - 6 Ashiru group
  • substituents on the side chains of amino acids in the molecule eg, --OH, 1SH, etc. L one 6 Ashiru group
  • 6 Arukanoiru C such group - amino group, imidazo Ichiru group, indole group, etc. Guanijino group
  • suitable protecting group e.g., C ⁇ such formyl group, ⁇ Se ethyl group
  • suitable protecting group e.g., C ⁇ such formyl group, ⁇ Se ethyl group
  • suitable protecting group e.g., C ⁇ such formyl group, ⁇ Se ethyl group
  • suitable protecting group e.g., C
  • a human-derived protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 15 is used. .
  • the partial peptide of the protein of the present invention is a partial peptide of the protein of the present invention described above, and preferably has the same activity as that of the protein of the present invention (eg, protease activity, extracellular matrix).
  • Any substance may be used as long as it has a degrading enzyme activity (preferably, proteoglycan degrading enzyme activity), for example, at least 20% or more, preferably 50% or more, in the constituent amino acid sequence of the protein of the present invention. It preferably has an amino acid sequence of 70% or more, more preferably 90% or more, and most preferably 95% or more, and has a protease activity, an extracellular matrix enzyme activity (preferably a proteodarican enzyme activity). ) Is used.
  • peptides for example, a peptide containing an amino acid sequence having the 28th to 37th amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8) and the like are exemplified. Used.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 Peptides having an amino acid sequence are also suitable.
  • the partial peptide of the present invention has 1 to 5 amino acids in its amino acid sequence (preferably, 1 to 3 amino acids are deleted, or 1 to 5 amino acids in its amino acid sequence (preferably, 1 to 3 amino acids). Amino acids), or 1 to 5 (preferably, 1 to 3 amino acids are inserted into the amino acid sequence, or 1 to 5 (preferably, The partial peptide of the present invention may have 1 to 3 amino acids substituted with another amino acid, and the partial peptide of the present invention has a C-terminal usually having a carboxyl group (one COOH) or a carboxylate (one COO one). In the protein of the present invention described above, the C-terminal may be an amide (—C ⁇ NH 2 ) or an ester (—COOR).
  • the partial peptide of the present invention has an amino terminal residue at the N-terminal (eg, methionine residue) in which the amino group is protected by a protecting group, and the N-terminal side has a native amino acid residue.
  • N-terminal eg, methionine residue
  • Glutamine residues generated by cleavage in the body and pyroglutamine oxidized, those in which the substituents on the side chains of the amino acids in the molecule are protected with appropriate protecting groups, and so-called glycopeptides to which sugar chains are bonded Complex peptides and the like are also included.
  • the partial peptide of the present invention can be used as an antigen for producing an antibody, it is not always necessary to have a protease activity and an extracellular matrix-degrading enzyme activity (preferably, a proteodalican-degrading enzyme activity).
  • salts with physiologically acceptable acids eg, inorganic acids, organic acids
  • bases eg, alkali metal salts
  • Preferred acid addition salts are:
  • Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, Salts with succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) are used.
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid
  • the protein of the present invention or a salt thereof can be produced from the above-described human warm-blooded animal cell or tissue by a known method for purifying a protein, or a trait containing a DNA encoding the protein described below. By culturing the transformant Can also be manufactured. It can also be produced according to the peptide synthesis method described below.
  • the human or mammalian tissues or cells are homogenized and then extracted with an acid or the like, and the extract is subjected to reverse phase chromatography, ion exchange chromatography, etc. Purification and isolation can be performed by combining the above chromatography.
  • a commercially available resin for protein synthesis can be usually used.
  • resins include chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzylhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, and PAM resin.
  • an amino acid having an ⁇ -amino group and a side chain functional group appropriately protected is condensed on the resin in accordance with the sequence of the target protein according to various known condensation methods.
  • the protein is cleaved from the resin, and at the same time, various protecting groups are removed.
  • an intramolecular disulfide bond formation reaction is performed in a highly diluted solution to obtain the target protein or an amide thereof.
  • the protected amino acid may be added directly to the resin along with the racemization inhibitor (eg, HOBt, HOOBt), or the protected amino acid may be pre-activated as a symmetric anhydride, HOB t ester, or HOOB t ester. Can be added to the resin.
  • the racemization inhibitor eg, HOBt, HOOBt
  • the protected amino acid may be pre-activated as a symmetric anhydride, HOB t ester, or HOOB t ester. Can be added to the resin.
  • the solvent used for activating the protected amino acid or condensing with the resin can be appropriately selected from solvents known to be usable for the protein condensation reaction.
  • Acid amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, N-methylvinylidone; halogenated hydrocarbons such as methylene chloride and chloroform; alcohols such as trifluoroethanol; Sulfoxides such as dimethylsulfoxide, ethers such as pyridine, dioxane and tetrahydrofuran, nitriles such as acetonitrile and propionitrile, esters such as methyl acetate and ethyl acetate, or an appropriate mixture thereof are used.
  • the reaction temperature is appropriately selected from the range known to be usable for the protein bond formation reaction, and is usually selected from the range of about 120 ° C to 50 ° C.
  • the activated amino acid derivative is usually used in a 1.5 to 4-fold excess.
  • Examples of the protecting group for the starting amino group include Z, Boc, t-pentyloxycarbonyl, isobornyloxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, ⁇ - ⁇ , and Br- ⁇ .
  • the carboxyl group may be, for example, alkyl-esterified (eg, methyl, ethyl, propyl, butyl, t-butyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl, etc.).
  • alkyl-esterified eg, methyl, ethyl, propyl, butyl, t-butyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl, etc.
  • Alkyl esterification Alkyl esterification
  • aralkyl esterification eg, benzyl ester, 4-nitrobenzyl ester, 4-methoxybenzyl ester, 4-chlorobenzyl ester, benzhydryl esterification
  • phenacyl esterification benzyloxycarbonyl It can be protected by hydrazide, t-butoxycarbonyl hydrazide, trityl hydrazide, etc.
  • the hydroxyl group of serine can be protected, for example, by esterification or etherification.
  • Suitable groups for this esterification include, for example, lower groups such as an acetyl group.
  • Grade (C; L - 6) Arukanoiru group, Aroiru group such Benzoiru group, Benjiruoki Shikaruponiru group, and a group derived from carbonic acid such as ethoxy Cal Poni Le group is used.
  • Examples of a group suitable for etherification include a benzyl group, a tetrahydrobiranyl group, and a t-butyl group.
  • the protecting group of the phenolic hydroxyl group of tyrosine for example, Bz l, C l 2 -Bz l, 2 - nitrobenzyl, Br @ - Z, t - butyl and the like.
  • imidazole protecting group for histidine for example, Tos, 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl, DNP, benzyloxymethyl, Bum, Boc, Trt, Fmoc and the like are used.
  • activated carboxyl groups in the raw materials include, for example, corresponding acid anhydrides, azides, and activated esters [alcohols (eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichlorophenol, 2,4-dinitrophenol) , Cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, H0NB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, and an ester with HOBt).
  • activated amino group of the raw material for example, a corresponding phosphoric amide is used.
  • a cation scavenger such as dimethyl sulfide, 1,4-butanedithiol, 1,2-ethanedithiol, etc. is effective.
  • the 2,4-dinitro phenyl group used as an imidazole protecting group of histidine is removed by thiophenol treatment
  • the formyl group used as an indole protecting group of tributofan is 1,2-ethanedithiol, 1
  • it is also removed by alkali treatment with dilute sodium hydroxide solution, dilute ammonia, etc.
  • the protection of the functional group which should not be involved in the reaction of the raw materials, the protecting group, the elimination of the protective group, the activation of the functional group involved in the reaction, and the like can be appropriately selected from known groups or known means.
  • a peptide (protein) chain is added to the amino group side at a desired chain length.
  • a protein in which only the protecting group of the ⁇ -amino group at the ⁇ -terminal of the peptide chain was removed and a protein in which only the protecting group of the carboxyl group at the C-terminal had been removed were produced. Condensate in a mixed solvent. Details of the condensation reaction are the same as described above. After purifying the protected protein obtained by the condensation, all the protecting groups are removed by the above-mentioned method to obtain a desired crude protein. The crude protein is purified using various known purification means, and the main fraction is freeze-dried to obtain an amide of the desired protein.
  • ester of a protein for example, after condensing the ⁇ -carboxyl group of the carboxy terminal amino acid with a desired alcohol to form an amino acid ester, the ester of the desired protein is prepared in the same manner as the amide of a protein You can get
  • the partial peptide of the present invention or a salt thereof can be produced according to a known peptide synthesis method, or by cleaving the protein of the present invention with an appropriate peptide.
  • a method for synthesizing a peptide for example, any of a solid phase synthesis method and a liquid phase synthesis method may be used. That is, it is possible to produce the desired peptide by condensing a partial peptide or amino acid that can constitute the partial peptide of the present invention with the remaining portion, and if the product has a protecting group, removing the protecting group. it can.
  • Known condensation methods and elimination of protecting groups include, for example, the methods described in the following 1 to 5.
  • the partial peptide of the present invention can be purified and isolated by a combination of ordinary purification methods such as solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, and recrystallization.
  • the partial peptide or signal peptide obtained by the above method is a free form, it can be converted to an appropriate salt by a known method or a method analogous thereto, and conversely, when it is obtained in the form of a salt. It can be converted to a free form or other salts by a known method or a method analogous thereto.
  • the DNA encoding the protein of the present invention may be any DNA containing the above-described nucleotide sequence encoding the protein of the present invention. Further, it may be any of a genome DNA, a genome DNA library, the above-described cell / tissue-derived cDNA, the above-described cell / tissue-derived cDNA library, and a synthetic DNA.
  • the vector used for the library 1 may be any of pacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like. Alternatively, it can be directly amplified by reverse transcriptase polymerase chain reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR method) using a preparation of total RNA or mRNA fraction from the cells and tissues described above. .
  • RT-PCR method reverse transcriptase polymerase chain reaction
  • Examples of the DNA encoding the protein of the present invention include: (1) DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 or hybridizing with the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 under high stringent conditions.
  • a protein having substantially the same activity as the protein of the present invention eg, protease activity, extracellular matrix-degrading enzyme activity (preferably proteodalican-degrading enzyme activity), etc.
  • Coding DNA (2) a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4 or a nucleotide sequence that hybridizes under high stringent conditions to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4;
  • Activities substantially the same as the protein of the present invention eg, protease activity, extracellular matrix degrading enzyme activity (preferably Is a DNA encoding a protein having proteodalican degrading enzyme activity), etc.
  • DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 16 or the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 16 and high stringency A base sequence that hybridizes under mild conditions, and has substantially the same activity as the protein of the present invention (eg, protease activity, extracellular matrix degrading enzyme activity (preferably proteodalican degrading enzyme activity), etc.) Any DNA can be used as long as it encodes a protein having
  • DNAs that can hybridize under high stringent conditions with the nucleotide sequence represented by any one of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 16 include, for example, SEQ ID NO: 3, DNA or the like containing a nucleotide sequence having about 95% or more, preferably about 98% or more homology with the nucleotide sequence represented by any one of SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 16 is used. .
  • Eight hybridizations can be carried out by a method known per se or a method analogous thereto, for example, Molecular 'Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989).
  • a commercially available library it can be performed according to the method described in the attached instruction manual. More preferably, it can be performed according to high stringent conditions.
  • High stringency conditions include, for example, a sodium concentration of about 19 to 40 mM, preferably about 19 to 20 mM, and a temperature of about 50 to 70 ° C, preferably about 60 to 70 ° C.
  • the conditions at 65 ° C are shown. In particular, the case where the sodium concentration is about 19 mM and the temperature is about 65 is most preferable.
  • the DNA encoding the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 includes a DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 3, and the like.
  • the DNA encoding the protein having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4 includes DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 4, and the DNA encoding the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15 includes the following: SEQ ID NO: 16 DNA having a base sequence represented by is used.
  • the DNA encoding the partial peptide of the present invention may be any DNA containing the above-described nucleotide sequence encoding the partial peptide of the present invention. Further, any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from the above-mentioned cells and tissues, cDNA library derived from the above-mentioned cells and tissues, and synthetic DNA may be used.
  • Examples of the DNA encoding the partial peptide of the present invention include: (1) DNA having the partial nucleotide sequence of DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3, or the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 and a high string DNA having a nucleotide sequence that hybridizes under gentle conditions and having a partial nucleotide sequence of DNA encoding a protein having substantially the same activity as the protein of the present invention; A DNA having a partial nucleotide sequence of a DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4, or a nucleotide sequence hybridizing under high stringent conditions to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4; DNA having a partial base sequence of DNA encoding a protein having the activity of (3), 3 having a partial base sequence of DNA having a base sequence represented by SEQ ID NO: 16.
  • DNA or the like is used.
  • the DNA hybridizable with the nucleotide sequence represented by any one of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 16 has the same significance as described above.
  • Hybridization methods and high stringency conditions are the same as described above.
  • a clone of a DNA that completely encodes the protein or partial peptide of the present invention (hereinafter, these proteins and the like are simply abbreviated as the protein of the present invention in the description of the cloning and expression of the DNA encoding the proteins and the like).
  • Means for the amplification include amplifying DNA by a PCR method using a synthetic DNA primer having a partial nucleotide sequence of the protein of the present invention, or incorporating DNA incorporated into an appropriate vector into a part of the protein of the present invention. Selection by hybridization with DNA fragments encoding the entire region or those labeled with synthetic DNA can do.
  • Hybridization can be carried out, for example, according to the method described in Molecular 'Cloning (Molecular Cloning) 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). When using a commercially available library, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual.
  • DNA base sequence conversion can be performed using a known kit, for example, Mutant TM -G (Takara Shuzo Co., Ltd.), Mutant TM -K (Takara Shuzo Co., Ltd.), or the like, using the Gupped duplex method or the Kunkel method. It can be carried out according to a known method or a method analogous thereto.
  • the DNA encoding the cloned protein can be used as it is depending on the purpose, or it can be used by digesting with a restriction enzyme or adding a linker if desired.
  • the DNA may have ATG as a translation initiation codon at the 5 'end and TAA, TGA or TAG as a translation stop codon at the 3' end. These translation initiation codon and translation termination codon can also be added using an appropriate synthetic DNA adapter.
  • the expression vector for the protein of the present invention includes, for example, (a) cutting out a DNA fragment of interest from DNA encoding the protein of the present invention, and (mouth) ligating the DNA fragment downstream of a promoter in an appropriate expression vector. It can be manufactured by
  • the vector examples include a plasmid derived from E. coli (eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13), a plasmid derived from Bacillus subtilis (eg, pUB110, TP5, pC194), a plasmid derived from yeast (eg, , PSH19, pSH15), bacteriophage such as ⁇ phage, animal viruses such as retrovirus, vaccinia virus, and baculovirus, as well as pAl-11, pXT1, pRcZCMV, pRc / RSV , pc DNA Ieo and the like.
  • E. coli eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13
  • Bacillus subtilis eg, pUB110, TP5, pC194
  • yeast eg, PSH19, pSH15
  • bacteriophage such as ⁇
  • the promoter used in the present invention may be any promoter as long as it is suitable for the host used for gene expression.
  • SR promoter when animal cells are used as hosts, SR promoter, SV40 promoter, LTR mouth promoter, CMV promoter, HSV-TK promoter and the like can be mentioned.
  • CMV (Cytomegalovirus) Promo Yuichi, SRo Promo It is preferable to use overnight or the like.
  • the host is Escherichia
  • the host is Bacillus
  • the host is yeast
  • PH5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter, etc. are preferable when the host is yeast.
  • a polyhedrin promoter, a P10 promoter and the like are preferable.
  • the expression vector may contain, in addition to the above, an enhancer, a splicing signal, a poly-A addition signal, a selection marker, an SV40 replication origin (hereinafter sometimes abbreviated as SV40 ori) and the like, if desired.
  • a selection marker include a dihydrofolate reductase (hereinafter sometimes abbreviated as dh fr) gene [methotrexate (MTX) resistance], an ampicillin resistance gene (hereinafter sometimes abbreviated as Ampr), Neomycin resistance gene (hereinafter sometimes abbreviated as Neo 1; G418 resistance), etc.
  • dh fr gene when used as a selection marker using Chinese hamster cells lacking the dh fr gene, The target gene can also be selected on a thymidine-free medium.
  • a signal sequence suitable for the host is added to the N-terminal side of the protein of the present invention.
  • a PhoA signal sequence, an immediate A signal sequence, etc. and when the host is a bacterium belonging to the genus Bacillus, an ⁇ -amylase signal sequence, a subtilisin signal sequence, etc. are included in the host.
  • yeast MF ⁇ signal sequence, SUC2 ⁇ signal sequence, etc.
  • a transformant can be produced.
  • Escherichia bacteria for example, Escherichia bacteria, Bacillus bacteria, yeast, insect cells, insects, animal cells, and the like are used.
  • Escherichia examples include, for example, Escherichia * coli. E. coli) K 12 ⁇ DH 1 [Pro atl. Acad. Sci. US A], 60, 160 (Prossings of the National Academy of Sciences of the United States) 1968)], JM103 [Nucleic Acids Research ', (Nucleic Acids Research), 9, 309 (1981)], JA221 [Journal of Molecular Biology], 120 , 5 17 (1 978)], HB 101 (Journal of Molecular Biology, 41, 459 (1969)), C 600 [Genetics, 39, 440 (1954) )] Is used.
  • Bacillus bacteria examples include, for example, Bacillus subtilis MI 114 (Gene, 24, 255 (1983)), 207-21 [Journal of Biochemistry, Vol. 95 , 87 (198 4)].
  • yeasts include, for example, Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R—, ⁇ 87-11A, DKD—5D, 20B—12, Schizosaccharomyces pombe NC YC 1913, NCYC 2036, Pichia tricia (Pichia pastoris) KM71 or the like is used.
  • insect cells for example, when the virus is Ac NPV, a cell line derived from a larva of night rob moth (Spodoptera frugiperda cell; S f cell), an MG1 cell derived from the midgut of Trichoplusia ni, and an egg of Trichoplusia ni High Five TM cells derived from Mamestra brassicae or cells derived from Estigmena acrea are used.
  • Sf cells include Sf9 cells (ATCC CRL1711) and Sf21 cells (Vaughn, JL et al., In Vivo, 13, 213-217, (1977)). Used.
  • insects for example, silkworm larvae are used [Maeda et al., Nature, 315, 592 (1985)].
  • animal cells examples include monkey cells COS-7 (COS 7), Vero, Chinese hamster cells CH ⁇ (hereinafter abbreviated as CHO cells), dh fr gene deficiency Chinese hamster cells CHO (hereinafter abbreviated as CH ⁇ (dh fr ⁇ ) cells), mouse L cells, mouse At T—20, mouse myeoma cells, rat GH3, and human FL cells are used.
  • Transformation of Bacillus spp. Can be performed, for example, according to the method described in Molecular & General Genetics, Vol. 168, 11 (1979).
  • a liquid medium is suitable as a medium used for the cultivation, and a carbon source necessary for the growth of the transformant is contained therein.
  • Nitrogen sources inorganic substances and others.
  • carbon sources include glucose, dextrin, soluble starch, and sucrose.
  • nitrogen sources include ammonium salts, nitrates, corn chip liquor, peptone, potato zein, meat extract, soybean meal, and potato extract.
  • Inorganic or organic substances such as liquids, inorganic Examples of the substance include calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, magnesium chloride and the like.
  • yeast, vitamins, growth promoting factors, etc. may be added.
  • the pH of the medium is preferably about 5-8.
  • Examples of a medium for culturing the genus Escherichia include, for example, an M9 medium containing glucose and casamino acids [Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics, Journal of Experiments in Molecular Genetics. ), 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972].
  • a drug such as 3-indolylacrylic acid can be added to make the promoter work efficiently.
  • the cultivation is usually performed at about 15 to 43 ° C for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration or stirring may be added.
  • cultivation is usually performed at about 30 to 40 ° C for about 6 to 24 hours.
  • the pH of the medium is adjusted to about 5-8.
  • the cultivation is usually performed at about 20 ° C to 35 ° C for about 24 to 72 hours, and aeration and stirring are added as necessary.
  • the medium used is 10% immobilized in Grace's Insect Medium (Grace, T., Nature, 195, 788 (1962)). Those to which additives such as serum are appropriately added are used.
  • the pH of the medium is preferably adjusted to about 6.2 to 6.4. Culture is usually performed at about 27 ° C for about 3 to 5 days, and aeration and agitation are added as necessary.
  • the pH is about 6-8.
  • Cultivation is usually carried out at about 30 ° C to 40 ° C for about 15 to 60 hours, and aeration and agitation are added as necessary.
  • the protein of the present invention can be produced on the cell membrane of the transformant.
  • the protein of the present invention can be separated and purified from the culture by, for example, the following method.
  • the cells or cells are collected by a known method after culture, suspended in an appropriate buffer, and sonicated, lysozyme and / or freeze-thawed. After disrupting the cells or cells, a method of obtaining a crude extract of protein by centrifugation or filtration is used as appropriate.
  • the buffer may contain a protein denaturant such as urea or guanidine hydrochloride, or a surfactant such as Triton X-10 ⁇ —.
  • Purification of the protein contained in the culture supernatant or extract obtained in this manner can be performed by appropriately combining known separation and purification methods.
  • These known separation and purification methods include methods using solubility such as salting out and solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. Mainly using differences in molecular weight, methods using differences in charge such as ion exchange chromatography, methods using specific affinity such as affinity chromatography, and hydrophobic methods such as reversed-phase high-performance liquid chromatography.
  • a method using a difference in gender, a method using a difference in isoelectric point such as isoelectric focusing, and the like are used.
  • the protein thus obtained when the protein thus obtained is obtained as a free form, it can be converted to a salt by a method known per se or a method analogous thereto, and conversely, when the protein is obtained as a salt, a method known per se or It can be converted to a free form or other salts by a method analogous thereto.
  • the protein produced by the recombinant can be arbitrarily modified or the polypeptide can be partially removed by the action of an appropriate protein modifying enzyme before or after purification.
  • an appropriate protein modifying enzyme for example, trypsin, chymotoribsin, arginyl endopeptidase, protein kinase, glycosidase and the like are used.
  • the presence or activity of the thus-produced protein of the present invention or a salt thereof can be measured by a binding experiment with a labeled ligand and an enzyme immunoassay using a specific antibody.
  • the antibody against the protein, partial peptide or a salt thereof of the present invention may be any of a polyclonal antibody and a monoclonal antibody as long as it can recognize the protein, partial peptide or a salt thereof of the present invention. .
  • Antibodies against the protein, partial peptide or a salt thereof of the present invention are obtained by using the protein of the present invention as an antigen, and It can be produced according to a known antibody or antiserum production method.
  • the protein of the present invention is administered to a warm-blooded animal itself or together with a carrier or diluent at a site capable of producing an antibody upon administration.
  • Complete Freund's adjuvant / incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance antibody production upon administration.
  • the administration is usually performed once every 2 to 6 weeks, for a total of about 2 to 10 times.
  • Examples of the warm-blooded animal to be used include monkeys, egrets, dogs, guinea pigs, mice, rats, sheep, goats, and chickens, and mice and rats are preferably used.
  • warm-blooded animals immunized with the antigen For example, an individual with an antibody titer is selected from a mouse, the spleen or lymph node is collected 2 to 5 days after the final immunization, and the antibody-producing cells contained in the spleen or lymph node are fused with myeloma cells of the same or xenogeneic animal.
  • a monoclonal antibody-producing hybridoma can be prepared.
  • the antibody titer in the antiserum can be measured, for example, by reacting the labeled protein described below with the antiserum, and then measuring the activity of the labeling agent bound to the antibody.
  • the fusion operation can be performed according to a known method, for example, the method of Koehler and Milstein (Nature, 256, 495 (1975)).
  • the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus, but PEG is preferably used.
  • PEG polyethylene glycol
  • the myeloma cells include myeloma cells of warm-blooded animals such as NS-1, P3U1, SP 2/0, and AP-1, but P3U1 is preferably used.
  • the preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen cells) used and the number of myeloma cells used is about 1: 1 to 20: 1, and PEG (preferably PEG1000 to PEG6000) is used at a concentration of about 10 to 80%.
  • Cell fusion can be carried out efficiently by adding the mixture and incubating at 20 to 40 ° C, preferably 30 to 37 ° C for 1 to 10 minutes.
  • Various methods can be used to screen for monoclonal antibody-producing hybridomas. For example, a hybridoma culture supernatant is added to a solid phase (eg, a microplate) on which a protein antigen is directly or adsorbed together with a carrier, and then Anti-immunoglobulin antibody labeled with radioactive substances or enzymes (anti-mouse immunoglobulin antibody is used if the cells used for cell fusion are mouse) or protein A, and monoclonal antibody bound to solid phase is detected A monoclonal antibody bound to a solid phase by adding a hybridoma culture supernatant to a solid phase to which an anti-immunoglobulin antibody or protein A has been adsorbed, adding a protein labeled with a radioactive substance or an enzyme, etc. And the like.
  • the selection of the monoclonal antibody can be performed according to a method known per se or a method analogous thereto. Usually, it can be performed in a medium for animal cells supplemented with HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine).
  • HAT hyperxanthine, aminopterin, thymidine
  • any medium can be used as long as the hybridoma can grow.
  • RPMI 164 containing 1-20%, preferably 10-20% fetal calf serum GIT medium containing 0 to 10% fetal calf serum (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) or serum-free medium for hybridoma culture (SFM-101, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.), etc. Can be used.
  • the culture temperature is usually 20 to 40 ° C, preferably about 3.
  • the culture time is generally 5 days to 3 weeks, preferably 1 week to 2 weeks.
  • the culture can be usually performed under 5% carbon dioxide.
  • the antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the measurement of the antibody titer in the antiserum described above.
  • Monoclonal antibodies can be separated and purified by methods known per se, for example, immunoglobulin separation and purification methods (eg, salting out method, alcohol precipitation method, isoelectric point precipitation method, electrophoresis method, ion exchanger (eg, DEAE) Absorption and desorption method, ultracentrifugation method, gel filtration method, antigen binding Solid phase or specific purification method of collecting antibody only with an active adsorbent such as protein A or protein G and dissociating the bond to obtain the antibody) Can do it.
  • immunoglobulin separation and purification methods eg, salting out method, alcohol precipitation method, isoelectric point precipitation method, electrophoresis method, ion exchanger (eg, DEAE) Absorption and desorption method, ultracentrifugation method, gel filtration method, antigen binding Solid phase or specific purification method of collecting antibody only with an active adsorbent such as protein A or protein G and dissociating the bond to obtain the antibody) Can do it.
  • the polyclonal antibody of the present invention can be produced by a method known per se or a method analogous thereto. For example, an immunizing antigen (protein antigen) itself or a complex thereof with a carrier-protein is formed, and immunization is performed on a warm-blooded animal in the same manner as in the above-described method for producing a monoclonal antibody.
  • the antibody can be produced by collecting a substance containing an antibody to a protein and separating and purifying the antibody.
  • the type of carrier protein and the mixing ratio between the carrier and the hapten are determined by the antibody against the hapten immunized by cross-linking the carrier.
  • any kind may be cross-linked at any ratio.
  • a serum albumin, a thyroglobulin, a hemocyanin, etc. in a weight ratio of about 0.1 to hapten per 1 hapten.
  • a method of coupling at a ratio of 20 and preferably about 1 to 5 is used.
  • various condensing agents can be used for force coupling between the hapten and the carrier.
  • an active ester reagent containing a daltaraldehyde, a carbodiimide, a maleimide active ester, a thiol group or a dithioviridyl group is used.
  • the condensation product is administered to a warm-blooded animal itself or together with a carrier or diluent at a site where antibody production is possible.
  • Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance the antibody-producing ability upon administration. The dose is usually given once every 2 to 6 weeks, about 3 to 10 times in total.
  • the polyclonal antibody can be collected from the blood, ascites, etc., preferably from the blood of a warm-blooded animal immunized by the above method.
  • the measurement of the polyclonal antibody titer in the antiserum can be performed in the same manner as the measurement of the antibody titer in the antiserum described above.
  • the separation and purification of the polyclonal antibody can be performed according to the same method for separation and purification of immunoglobulin as in the above-mentioned separation and purification of the monoclonal antibody.
  • DNA of the present invention has a base sequence complementary to or substantially complementary to DNA encoding the protein or partial peptide of the present invention (hereinafter, these DNAs are abbreviated to DNA of the present invention in the description of antisense DNA).
  • antisense DNA any antisense DNA having a base sequence complementary or substantially complementary to the DNA of the present invention and having an action capable of suppressing the expression of the DNA can be used. There may be.
  • the nucleotide sequence substantially complementary to the DNA of the present invention refers to, for example, the entire nucleotide sequence or a partial nucleotide sequence of the nucleotide sequence complementary to the DNA of the present invention (that is, the complementary strand of the DNA of the present invention).
  • the base sequence of the portion encoding the N-terminal portion of the protein of the present invention for example, a base sequence near the start codon, etc.
  • Antisense DNA having a homology of preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more is suitable.
  • These antisense DNAs can be produced using a known DNA synthesizer or the like.
  • the protein of the present invention may be abbreviated as the protein of the present invention, etc.
  • the DNA encoding the protein or the partial peptide of the present invention hereinafter, the DNA of the present invention
  • the present invention An antibody against the protein, partial peptide or a salt thereof (hereinafter, sometimes abbreviated as the antibody of the present invention), and the use of antisense DNA will be described.
  • the protein of the present invention contributes to the degradation of extracellular matrix (particularly the degradation of proteogliin), if the DNA encoding the protein of the present invention is abnormal or defective, for example, It is highly likely that various diseases such as disc herniation, sciatica, glomerulonephritis, diabetic nephropathy, liver fibrosis, pulmonary fibrosis or marble disease will develop.
  • the protein and the like of the present invention and the DNA of the present invention can be used for the treatment and prevention of various diseases such as disc herniation, sciatica, glomerulonephritis, diabetic nephropathy, hepatic fibrosis, pulmonary fibrosis or marble disease. It can be used as a medicine such as a drug.
  • the DNA of the present invention when there is a patient in a living body in which the protein of the present invention is reduced or deficient, (a) administering the DNA of the present invention to the patient to express the protein or the like of the present invention in the living body (Mouth) by inserting the DNA of the present invention into cells, expressing the protein or the like of the present invention, and then transplanting the cells into a patient; or (8) introducing the protein or the like of the present invention into the patient.
  • the role of the protein or the like of the present invention in the patient can be sufficiently or normally exerted.
  • the DNA of the present invention when used as a therapeutic or prophylactic agent, the DNA may be used alone or after being inserted into an appropriate vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, or an adenovirus associated virus vector. It can be administered to humans or warm-blooded animals according to conventional means.
  • the DNA of the present invention may be formulated as such or with a physiologically acceptable carrier such as an adjuvant for promoting uptake, and may be prepared by a catheter such as a gene gun or a hydrogel catheter. Can be administered.
  • the protein or the like of the present invention When used as the above-mentioned therapeutic or prophylactic agent, it is purified to at least 90%, preferably 95% or more, more preferably 98% or more, and still more preferably 99% or more. It is preferred to use
  • the protein or the like of the present invention can be used, for example, as a sugar-coated tablet, capsule, elixir, microcapsule, or the like, orally or water or other pharmaceutically acceptable liquid. It can be used parenterally in the form of injections such as sterile solutions or suspensions.
  • the amount of the active ingredient in these preparations is such that an appropriate dose in the specified range can be obtained.
  • Additives that can be incorporated into tablets, capsules, etc. include, for example, binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, alginic acid, etc. Swelling agents such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, and flavoring agents such as peppermint, cocoa oil or cherry.
  • a liquid carrier such as oil and fat can be further contained in the above-mentioned type of material.
  • Sterile compositions for injection can be formulated according to standard pharmaceutical practice, such as dissolving or suspending the active substance in vehicles such as water for injection, and naturally occurring vegetable oils such as sesame oil and coconut oil. it can.
  • aqueous liquids for injection include physiological saline, isotonic solutions containing glucose and other adjuvants (eg, D-sorbyl), D-mannitol, sodium chloride, and the like.
  • Solubilizing agents for example, alcohols (for example, ethanol), polyalcohols (for example, propylene glycol, polyethylene glycol, etc.), nonionic surfactants (for example, polysorbate 80TM, HCO-50) Etc.).
  • the oily liquid include sesame oil and soybean oil, and may be used in combination with a solubilizing agent such as benzyl benzoate or benzyl alcohol.
  • a buffer eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer, etc.
  • a soothing agent eg, benzalkonium chloride, proforce hydrochloride, etc.
  • a stabilizer eg, human serum albumin, polyethylene glycol, etc.
  • preservatives eg, benzyl alcohol, phenol, etc.
  • antioxidants etc. Is also good.
  • the prepared injection is usually filled in an appropriate ampoule.
  • the vector into which the DNA of the present invention has been inserted is also formulated in the same manner as described above, and is usually used parenterally.
  • the preparations obtained in this way are safe and have low toxicity, for example, in humans or warm-blooded animals (eg, rats, mice, guinea pigs, egrets, birds, higgies, bush, horses, cats, cats). , Dogs, monkeys, chimpanzees, etc.).
  • warm-blooded animals eg, rats, mice, guinea pigs, egrets, birds, higgies, bush, horses, cats, cats). , Dogs, monkeys, chimpanzees, etc.
  • the dosage of the protein or the like of the present invention varies depending on the target disease, the administration subject, the administration route, and the like.
  • the protein or the like of the present invention is orally administered for the purpose of treating diabetic nephropathy, For adults (assuming 60 kg), the protein is administered in an amount of about 0, 1 mg to 10 Omg, preferably about 1.0 to 5 Omg, more preferably about 1.0 to 20 mg per day. I do.
  • the single dose of the protein or the like varies depending on the administration target, the target disease, and the like.
  • an injection of the protein or the like of the present invention for the purpose of treating diabetic nephropathy When administered to an adult (assuming a body weight of 6 O kg) in the form of about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 2 Omg, and more preferably about 0.1 to 1 mg of the protein or the like per day. It is convenient to administer by injecting about 1010 mg into the affected area. In the case of other animals, the amount converted per 60 kg can be administered.
  • the functions of the protein and the like of the present invention can be used as a therapeutic or prophylactic agent for diseases such as disc herniation, sciatica, glomerulonephritis, diabetic nephropathy, liver fibrosis, pulmonary fibrosis or marble disease. Can be used as a medicine.
  • a compound or a salt thereof that inhibits the function of the protein or the like of the present invention can be used as a therapeutic or preventive agent for chronic rheumatoid arthritis, osteoarthritis, osteoporosis, arteriosclerosis, corneal ulcer (preferably proteoglycan degrading enzyme activity) and the like. And so on. Therefore, the protein of the present invention promotes the function of the protein of the present invention. It is useful as a reagent for screening an inhibitory compound or a salt thereof.
  • the protease activity of the protein of the present invention and the extracellular matrix-degrading enzyme activity are used. It is characterized by measuring and comparing.
  • the protease activity of the protein or the like of the present invention can be determined by a method known per se, for example, a method described in H. agase, Methods in Enzymology, Vol. 248, 449-470 (1995) or a method analogous thereto (specification). Specifically, the measurement can be performed according to the method described in Example 4 described later).
  • Substrates include, for example, peptides (more specifically, MOCAc-ArgPro-Lys-Pro-TyrA la-Nva-Trp-Met described in Example 4 described later).
  • peptides more specifically, MOCAc-ArgPro-Lys-Pro-TyrA la-Nva-Trp-Met described in Example 4 described later.
  • Lys (DNP) NH 2 , Peptide Laboratories, etc.).
  • Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, etc., and these compounds are novel compounds. Or a known compound. No.
  • a sample such as the protein of the present invention is prepared by suspending the protein or the like of the present invention in a buffer suitable for screening.
  • the buffer may be a buffer such as a phosphate buffer having a pH of about 4 to 10 (preferably, a pH of about 6 to 8) or a buffer which does not inhibit the reaction between the protein and the like of the present invention and the substrate, such as a Tris-HCl buffer. Any may be used.
  • a test compound that increases the protease activity in the case of the above (ii) by about 20% or more, preferably 30% or more, more preferably about 50% or more as compared with the case of the above (i), by using the protein of the present invention on the other hand, as a compound that promotes protease activity, the protease activity in the case of the above (ii) is about 20% or more, preferably 30% or more, more preferably about 50% or more as compared with the case of the above (i).
  • a test compound that inhibits at least% can be selected as a compound that inhibits the protease activity of the protein or the like of the present invention.
  • the extracellular matrix-degrading enzyme activity (particularly, proteoglycan-degrading enzyme activity) of the protein or the like of the present invention is determined by comparing a DNA-containing recombinant with a DNA having a nucleotide sequence encoding the protein of the present invention with an animal-derived recombinant. It can be measured by mixing and culturing cartilage or cartilage matrix-producing cells, and measuring the amount of sulfated glycosaminodalican in the culture supernatant.
  • an expression vector for example, the above-mentioned expression vector
  • an expression vector containing DNA containing DNA having the nucleotide sequence encoding the protein of the present invention in the host described above as an expression vector host is used.
  • Any protein may be incorporated as long as it produces the protein of the present invention and secretes it out of the cells (cells) or binds to the cell membrane.
  • animal cells, insect cells, yeasts and the like are preferably used.
  • animal cells, particularly COS 7 cells are preferably used.
  • the method for measuring sulfated glycosaminodalican in the culture supernatant can be measured according to a method known per se, for example, the method described in Methods in Enzymology, vol. 248, pp. 47-58, 1995. . Alternatively, it can be measured using a commercially available (Cosmo Bio) human adarecan (PG) ELISA kit or the like.
  • Examples of the “animal” of the “animal-derived cartilage or cartilage matrix-producing cell” include, for example, Warm-blooded animals (eg, mouse, rat, egret, sheep, pig, pig, horse, horse, bird, cat, dog, monkey, chimpanzee, etc.) are preferable, and mouse and the like are preferable.
  • Warm-blooded animals eg, mouse, rat, egret, sheep, pig, pig, horse, horse, bird, cat, dog, monkey, chimpanzee, etc.
  • mouse and the like are preferable.
  • cartilage matrix-producing cells include, for example, animal-derived chondrocytes, chondrosarcoma cells, and cell lines such as HCS2 / 8 and ATDC5.
  • Proteodalican degrading enzyme gene is detected by mixing and culturing the recombinant transfected with the test gene and animal-derived cartilage or cartilage matrix-producing cells, and measuring sulfated daricosaminodalican in the culture supernatant. It is possible to do.
  • test gene is a gene encoding a peptide, a protein, etc., which is produced by a recombinant and secreted out of a bacterial cell (cell) or bound to a cell membrane. Any one may be used.
  • the proteoglycan-degrading enzyme is encoded by two or more genes, or when an enzyme that activates proteodalican-degrading enzyme is required, there may be a plurality of “test genes”. If necessary, a signal sequence suitable for the host may be added to the N-terminus.
  • a recombinant transfected with a gene encoding a protein having proteodarinase-degrading enzyme activity, cartilage or cartilage matrix-producing cells derived from an animal, and a test substance are mixed-cultured, and sulfation in the culture supernatant is performed.
  • a test substance By measuring glycosaminodalican, it is also possible to screen for an activity inhibitor or activity promoter of proteodalican degrading enzyme.
  • the "recombinant into which a gene encoding a protein having proteodarican-degrading enzyme activity is introduced” is preferably an "animal cell containing a DNA containing a DNA having a nucleotide sequence encoding the protein of the present invention” or the like. Is raised, more preferred Or a DNA containing a DNA having a nucleotide sequence encoding a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by claim 5 or 2 SEQ ID NO: 5; Animal cells ".
  • test substance includes, for example, peptides, proteins, non-peptide compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and the like. These are novel substances. Or a known substance.
  • test substance is considered to be a proteoglycan degrading enzyme activity promoter
  • test substance is considered to be an inhibitor of proteodalicanase activity.
  • the recombinant, cartilage or cartilage matrix-producing cells derived from an animal, and a test substance may be added at the same time and mixed and cultured, or the recombinant and the test substance may be mixed in advance, and the recombinant After the culture, cartilage or cartilage matrix-producing cells derived from an animal may be added to perform further mixed culture.
  • cartilage matrix-producing cell it is preferably used after the cartilage matrix has been produced.
  • animal-derived cartilage or cartilage matrix-producing cells may be killed by heat treatment or freeze-thawing before use.
  • the screening kit of the present invention contains a protein, a precursor protein, a partial peptide or a salt thereof of the present invention.
  • Examples of the screening kit of the present invention include the following.
  • the compound or a salt thereof obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention may be a test compound as described above, for example, a peptide, a protein, a non-peptidic compound, a synthetic compound, a fermentation product, a cell extract, or a plant extract.
  • a compound selected from animal tissue extract, plasma, etc., which promotes the function of the protein of the present invention eg, meprotease activity, extracellular matrix-degrading enzyme activity (preferably proteoglycan-degrading enzyme activity), etc.
  • a compound that inhibits eg, meprotease activity, extracellular matrix-degrading enzyme activity (preferably proteoglycan-degrading enzyme activity), etc.
  • salt of the compound those similar to the aforementioned salts of the protein of the present invention are used.
  • Compounds that promote the function of the protein or the like of the present invention include, for example, herniated disc, sciatica, and thread. It can be used as a medicament such as a therapeutic or prophylactic agent for diseases such as spherical nephritis, diabetic nephropathy, liver fibrosis, pulmonary fibrosis or marble disease.
  • compounds that inhibit the function of the protein or the like of the present invention are useful as medicaments such as therapeutic or preventive agents for diseases such as rheumatoid arthritis, osteoarthritis, osteoporosis, cancer, arteriosclerosis, and corneal ulcer. is there.
  • a compound obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is used as the above-mentioned therapeutic / prophylactic agent, it can be carried out according to conventional means.
  • tablets, capsules, elixirs, microcapsules, sterile solutions, suspensions, and the like can be prepared in the same manner as the above-mentioned pharmaceuticals containing the protein of the present invention.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic and can be used, for example, in humans or in warm-blooded animals (eg mice, rats, puppies, sheep, bush, pussi, puma, birds, cats, dogs, Monkeys, chimpanzees, etc.).
  • warm-blooded animals eg mice, rats, puppies, sheep, bush, pussi, puma, birds, cats, dogs, Monkeys, chimpanzees, etc.
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on its action, target disease, subject to be administered, route of administration, and the like.
  • the protein of the present invention for the treatment of diabetic nephropathy is used.
  • the compound When orally administering a compound that promotes functions such as cytotoxicity, generally in adults (assuming a body weight of 6 O kg), the compound is used in an amount of about 0 :! to 100 mg, preferably about 1.0 to 100 mg per day.
  • the single dose of the compound varies depending on the administration subject, the target disease, and the like.
  • a compound that promotes the function of the protein or the like of the present invention for the purpose of treating diabetic nephropathy Is usually administered to an adult (as 60 kg) in the form of an injection, the compound is administered in an amount of about 0.01 to 3 Omg per day, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 20 mg per day. It is convenient to administer about 1 to 1 Omg by intravenous injection. In the case of other animals, the dose can be administered in terms of 60 kg.
  • a compound that inhibits the function of the protein or the like of the present invention is orally administered for the treatment of rheumatoid arthritis, generally, in an adult (assuming a body weight of 6 O kg), the compound is used in an amount of about 0.1 per day. ⁇ 10 Omg, preferably about 1.0-5 Omg, more preferably about 1.0-20 mg.
  • the single dose of the compound varies depending on the administration subject, target disease, and the like.
  • a compound that inhibits the function of the protein or the like of the present invention for the purpose of treating chronic rheumatoid arthritis When administered to an adult (as 6 O kg) in the form of an injection, the compound is administered in an amount of about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 20 mg per day. It is convenient to administer about 1 to 1 Omg by intravenous injection. In the case of other animals, the dose can be administered in terms of 6 O kg.
  • an antibody against the protein or the like of the present invention (hereinafter sometimes abbreviated as the antibody of the present invention) can specifically recognize the protein or the like of the present invention. It can be used for quantification, especially for quantification by sandwich immunoassay.
  • the antibody of the present invention is allowed to react competitively with the test solution and the labeled protein of the present invention, and the ratio of the labeled protein of the present invention bound to the antibody is measured.
  • a method for quantifying the protein or the like of the present invention in a test solution
  • the present invention provides a method for quantifying the protein and the like of the present invention in a test liquid, which comprises reacting the antibody with the antibody simultaneously or successively, and then measuring the activity of a labeling agent on an insolubilized carrier.
  • one antibody may be an antibody that recognizes the N-terminal of the protein of the present invention, and the other antibody may be an antibody that reacts with the C-terminal of the protein of the present invention. desirable.
  • the monoclonal antibody of the present invention detection by tissue staining or the like can be performed.
  • the antibody molecule itself may be used, or the F (ab ') 2 , Fab', or Fab fraction of the antibody molecule may be used.
  • the method for quantifying the protein or the like of the present invention using the antibody of the present invention is not particularly limited, and may be an antibody, an antigen, or an antibody-antigen complex corresponding to the amount of antigen (eg, the amount of protein) in the test solution.
  • Any method may be used as long as it is a method for detecting the amount of the compound by chemical or physical means and calculating the amount from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of the antigen.
  • nephrometry, a competition method, an immunometric method, and a sandwich method are suitably used, but it is particularly preferable to use a sandwich method described later in terms of sensitivity and specificity.
  • a labeling agent used in a measuring method using a labeling substance for example, a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance and the like are used. Radioisotopes, if example embodiment, [1 2 5 I], [1 3 1 I], [3 H], and [1 4 C] used.
  • the above-mentioned enzyme a stable enzyme having a large specific activity is preferable.
  • -galactosidase, / 3-darcosidase, alkaline phosphatase, phosphoxidase, and malate dehydrogenase are used.
  • the fluorescent substance for example, fluorescein, fluorescein isothiosinate and the like are used.
  • the luminescent substance for example, luminol, luminol derivative, luciferin, lucigenin and the like are used.
  • a biotin-avidin system can be used for binding the antibody or antigen to the labeling agent.
  • insolubilization of antigen or antibody physical adsorption may be used.
  • a method using a chemical bond used for insolubilizing or immobilizing proteins or enzymes may be used.
  • the carrier include insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose; synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon; and glass.
  • a test wave is reacted with an insolubilized monoclonal antibody of the present invention (primary reaction), and then another labeled monoclonal antibody of the present invention is reacted (secondary reaction).
  • primary reaction an insolubilized monoclonal antibody of the present invention
  • secondary reaction another labeled monoclonal antibody of the present invention
  • the primary reaction and the secondary reaction may be performed in the reverse order, may be performed simultaneously, or may be performed at staggered times.
  • the labeling agent and the method of insolubilization can be in accordance with those described above.
  • the antibody used for the solid phase antibody or the labeling antibody does not necessarily need to be one kind, and a mixture of two or more kinds of antibodies is used for the purpose of improving measurement sensitivity and the like. May be used.
  • the monoclonal antibody of the present invention used in the primary reaction and the secondary reaction is an antibody having a different binding site for the protein or the like of the present invention. It is preferably used. That is, the antibody used in the primary reaction and the secondary reaction is, for example, when the antibody used in the secondary reaction recognizes the C-terminal of the protein or the like of the present invention, the antibody used in the primary reaction is Preferably, an antibody that recognizes other than the C-terminal, for example, the N-terminal, is used.
  • the monoclonal antibody of the present invention can be used in a measurement system other than the sandwich method, for example, a competition method, an immunometric method, or a nephrometry.
  • a competition method after the antigen in the test solution and the labeled antigen are allowed to react competitively with the antibody, the unreacted labeled antigen (F) and the labeled antigen (B) bound to the antibody are separated.
  • BZF separation Measure the amount of labeling of either B or F, and quantify the amount of antigen in the test solution.
  • a soluble antibody is used as the antibody
  • BZF separation is performed using polyethylene glycol
  • a liquid phase method using a second antibody against the antibody a solid phase antibody is used as the first antibody
  • An immobilization method using a soluble first antibody and an immobilized antibody as the second antibody is used.
  • the trick method a certain amount of labeled After a competitive reaction with the body, the solid phase and the liquid phase are separated, or the antigen in the test solution is allowed to react with an excessive amount of the labeled antibody, and then the immobilized antigen is added and unreacted After binding the labeled antibody to the solid phase, the solid phase and the liquid phase are separated. Next, the amount of label in either phase is measured to determine the amount of antigen in the test solution.
  • nephrometry the amount of insoluble sediment resulting from an antigen-antibody reaction in a gel or in a solution is measured. Even when the amount of antigen in the test solution is small and only a small amount of sediment is obtained, laser nephrometry utilizing laser scattering is preferably used.
  • the measurement system for the protein of the present invention may be constructed by adding ordinary technical considerations of those skilled in the art to ordinary conditions and operation methods in each method. For details of these general technical means, reference can be made to reviews and written documents.
  • the protein and the like of the present invention can be quantified with high sensitivity by using the antibody of the present invention.
  • the concentration of the protein or the like of the present invention by quantifying the concentration of the protein or the like of the present invention using the antibody of the present invention, (1) when a decrease in the concentration of the protein or the like of the present invention is detected, for example, If it is a disease such as disc herniation, sciatica, glomerulonephritis, diabetic nephropathy, hepatic fibrosis, pulmonary fibrosis or marble disease, or is likely to be affected in the future; If an increase in the concentration is detected, e.g., it is diagnosed as a disease such as rheumatoid arthritis, osteoarthritis, osteoporosis, cancer, arteriosclerosis, or corneal ulcer, or it is highly likely that the disease will occur in the future. Can be.
  • a disease such as disc herniation, sciatica, glomerulonephritis, diabetic nephropathy, hepatic fibrosis, pulmonary fibrosis or marble disease, or is likely to
  • the antibody of the present invention can be used for detecting the protein of the present invention or the like present in a subject such as a body fluid or a tissue.
  • preparation of an antibody column used for purifying the protein of the present invention, detection of the protein of the present invention in each fraction at the time of purification, analysis of the behavior of the protein of the present invention in test cells It can be used for such purposes.
  • the DNA of the present invention can be used, for example, in humans or warm-blooded animals (eg, rats, mice, guinea pigs, egrets, birds, higgies, pigs, pigs, dogs, cats, dogs, monkeys) by using them as probes. , Chimpanzees, etc.), it is possible to detect abnormalities (genetic abnormalities) in DNA or mRNA encoding the protein of the present invention or its partial peptide, for example, damage or sudden mutation or expression of the DNA or mRNA. It is useful as a gene diagnostic agent for a decrease, an increase in the DNA or mRNA, or an overexpression.
  • abnormalities genetic abnormalities
  • the above-described genetic diagnosis using the DNA of the present invention can be carried out, for example, by the well-known Northern Hybridization or PCR-SSCP method (Genomics, Vol. 5, pp. 874-879 (1989)). Proceedings of the Natinal Academy of Sciences of the United States of America, Vol. 86, 2766-2770, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America Page (1 989)).
  • the disease when expression reduction is detected by Northern Hydride, the disease is, for example, a disease such as disc herniation, sciatica, glomerulonephritis, diabetic nephropathy, liver fibrosis, pulmonary fibrosis or marble disease. It can be diagnosed that the probability is high.
  • overexpression is detected by Northern hybridization, for example, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, osteoporosis, cancer, atherosclerosis, corneal ulcer It can be diagnosed that there is a high possibility of the disease such as.
  • DNA mutation when DNA mutation is detected by PCR-S SCP method, for example, disc herniation, sciatica, glomerulonephritis, diabetic nephropathy, liver fibrosis, pulmonary fibrosis or marble disease, etc.
  • a disease such as rheumatoid arthritis, osteoarthritis, osteoporosis, cancer, arteriosclerosis or corneal ulcer.
  • Antisense DNA which complementarily binds to the DNA of the present invention and can suppress the expression of the DNA, is capable of suppressing the function of the protein or the like of the present invention or the DNA of the present invention in vivo. Since it can be used, it can be used as a therapeutic or preventive agent for, for example, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, osteoporosis, cancer, arteriosclerosis, corneal ulcer and the like.
  • the above-mentioned antisense DNA is used as the above-mentioned therapeutic / prophylactic agent, it can be carried out in the same manner as the aforementioned therapeutic / prophylactic agent for various diseases containing the DNA of the present invention.
  • the antisense DNA when used, the antisense DNA is inserted alone or into an appropriate vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adenovirus associated virus vector, and the like, and then the antisense DNA is used. It can be implemented according to the means.
  • the antisense DNA can be administered as it is or in the form of a formulation together with a physiologically acceptable carrier such as an auxiliary agent for promoting uptake, and then administered using a gene gun or a catheter such as a hydrogel catheter.
  • the antisense DNA can also be used as a diagnostic oligonucleotide probe for examining the presence of the DNA of the present invention in tissues or cells and the state of expression thereof.
  • the antibody of the present invention which has the activity of neutralizing the activity of the protein of the present invention, is used as an agent for treating or preventing various diseases such as rheumatoid arthritis, osteoarthritis, osteoporosis, cancer, arteriosclerosis, and corneal ulcer. And so on.
  • the therapeutic / prophylactic agent for the above-mentioned diseases containing the antibody of the present invention can be used as it is as a liquid, Oral or parenteral administration to humans or mammals (eg, rats, puppies, higgs, bushes, puppies, cats, dogs, monkeys, etc.) can do.
  • the dosage varies depending on the administration target, target disease, symptoms, administration route, and the like.For example, when used for the treatment or prevention of rheumatoid arthritis in adults, the antibody of the present invention is used as a single dose.
  • the antibodies of the present invention can be administered by themselves or as a suitable pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition used for the above administration contains the above or a salt thereof and a pharmacologically acceptable carrier, diluent or excipient.
  • Such compositions are provided in dosage forms suitable for oral or parenteral administration.
  • compositions for oral administration include solid or liquid dosage forms, specifically tablets (including sugar-coated tablets and film-coated tablets), pills, granules, powders, capsules (soft capsules) ), Syrups, emulsions, suspensions and the like.
  • Such a composition is produced by a method known per se and contains a carrier, diluent or excipient commonly used in the field of pharmaceuticals.
  • a carrier for example, lactose, starch, sucrose, magnesium stearate and the like are used as carriers and excipients for tablets.
  • compositions for parenteral administration for example, injections, suppositories, etc. are used.
  • Injections are in the form of intravenous injections, subcutaneous injections, intradermal injections, intramuscular injections, drip injections, etc. Is included.
  • Such injections are prepared according to a method known per se, for example, by dissolving, suspending or emulsifying the above antibody or a salt thereof in a sterile aqueous or oily liquid usually used for injections.
  • aqueous liquid for injection for example, physiological saline, isotonic solution containing glucose and other auxiliary agents and the like are used, and suitable solubilizing agents, for example, alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, , Propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactants [eg, Polysoleyl 80, HCO-50 (poiyoxyethylene (50 mol) adduct of ydrogenated castor oil)] or the like.
  • suitable solubilizing agents for example, alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, , Propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactants [eg, Polysoleyl 80, HCO-50 (poiyoxyethylene (50 mol) adduct of ydrogenated castor oil)] or the like.
  • oily liquid for example, sesame oil, soybean oil, and the like are used, and benzyl benzoate, benzyl alcohol,
  • each dosage unit dosage form is 5 to 500 mg, especially for injections.
  • the antibody contains 5 to 100 mg, and other dosage forms contain 10 to 25 Omg of the above antibody.
  • compositions may contain another active ingredient as long as the composition does not cause an undesirable interaction with the above-mentioned antibody.
  • the present invention may be abbreviated as a DNA encoding the exogenous protein of the present invention (hereinafter abbreviated as the exogenous DNA of the present invention) or a mutant DNA thereof (the exogenous mutant DNA of the present invention). ) Is provided.
  • Non-human mammals having the exogenous DNA of the present invention or the mutant DNA thereof include unfertilized eggs, fertilized eggs, germ cells including spermatozoa and their progenitor cells, and the like.
  • the calcium phosphate method, the electric pulse method, Law It can be produced by transferring the desired DNA by an agglutination method, microinjection method, particle gun method, DEAE-dextran method, or the like.
  • the exogenous DNA of the present invention intended for somatic cells, organs of living organisms, tissue cells, and the like can be transferred and used for cell culture, tissue culture, and the like.
  • the DNA transgenic animal of the present invention can also be produced by fusing the cells with the above-mentioned germ cells by a cell fusion method known per se.
  • mice for example, Japanese lions, bushes, higgies, goats, egrets, dogs, cats, guinea pigs, eighteen mussels, mice, rats and the like are used.
  • rodents with a relatively short ontogeny and biological cycle in terms of the creation of disease animal model systems and easy reproduction are particularly useful for mice (for example, pure strains such as C57BL / 6 strain, DBA2 For example, B6C3F strain, BDF; L strain, B6D2Fi strain, BALBZc strain, ICR strain, etc., or rat (eg, Wistar, SD etc.) preferable.
  • mammals humans and the like can be mentioned in addition to the above-mentioned non-human mammals.
  • the exogenous DNA of the present invention refers not to the DNA of the present invention originally possessed by a non-human mammal but to the DNA of the present invention once isolated and extracted from the mammal.
  • mutant DNA of the present invention those having a mutation (for example, mutation) in the base sequence of the original DNA of the present invention, specifically, base addition, deletion, substitution to another base, or the like.
  • a mutation for example, mutation
  • DNA that has undergone replacement is used, and abnormal DNA is also included.
  • the abnormal DNA means a DNA expressing an abnormal protein of the present invention, and for example, a DNA expressing a protein that suppresses the function of the normal protein of the present invention is used.
  • the exogenous DNA of the present invention may be derived from a mammal of the same species or a different species as the target animal.
  • various mammals having the DNA of the present invention having a high homology with the DNA for example, egret, dog, cat, guinea pig, hamster, rat, mouse, etc.
  • Microinjection of a DNA construct eg, vector, etc. in which the human DNA of the present invention is bound downstream of various promoters capable of expressing DNA of interest from a fertilized egg of a target mammal, for example, a mouse fertilized egg.
  • a DNA transgenic mammal that highly expresses the DNA of the present invention can be created.
  • Examples of the expression vector of the protein of the present invention include a plasmid derived from Escherichia coli, a plasmid derived from Bacillus subtilis, a plasmid derived from yeast, a bacteriophage such as ⁇ phage, a retrovirus such as Moroni leukemia virus, a vaccinia virus or Animal viruses such as baculovirus are used.
  • a plasmid derived from Escherichia coli, a plasmid derived from Bacillus subtilis or a plasmid derived from yeast are preferably used.
  • Examples of the promoter that regulates the expression of DN DN include, for example, promoters of DNA derived from 1 virus (eg, simian virus, cytomegalovirus, Moroni leukemia virus, JC virus, breast cancer virus, poliovirus).
  • 1 virus eg, simian virus, cytomegalovirus, Moroni leukemia virus, JC virus, breast cancer virus, poliovirus.
  • 2 Promotes derived from various mammals (humans, egrets, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, etc.), for example, albumin, insulin II, peroplaskin II, erasose, erythropoietin, endothelin , Muscle creatine kinase, glial fibrillary acidic protein, glutathione S-transferase, platelet-derived growth factor / 3, keratin Kl, 10 and 1 ⁇ 14, collagen type I and II, cyclic AMP Dependent protein kinase i3 I subunit, dystrophin, Tartaric acid-resistant alkaline phosphatase, atrial natriuretic factor, endothelial receptor stoichiokinase (generally abbreviated as Tie 2), sodium potassium adenosine 3 kinase (Na, K-ATPase), Monofilament light chain, meta-
  • the vector preferably has a sequence that terminates transcription of the target messenger RN ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ in a DNA-transferred mammal (generally referred to as Yuichi Minei Yuichi).
  • a DNA-transferred mammal generally referred to as Yuichi Minei Yuichi.
  • the sequence of each DNA can be used, and preferably, the simian virus SV40 or the like is used.
  • the splicing signal of each DNA, the enhancer region, a part of the intron of eukaryotic DNA, etc. are used to further express the target exogenous DNA at the 5 'upstream of the promoter region, the promoter region and the translation region. It is also possible to ligate between them or 3 ′ downstream of the translation region.
  • the normal translation region of the protein of the present invention is DNA derived from the liver, kidney, thyroid cells, fibroblasts derived from humans or various mammals (eg, egret, dog, cat, guinea pig, hamster, rat, mouse, etc.). And all or part of the genomic DNA from various commercially available genomic DNA libraries, or complementary DNA prepared by known methods from liver, kidney, thyroid cell, or fibroblast-derived RNA as a raw material. I can do it.
  • the foreign abnormal DNA can produce a translation region obtained by mutating the translation region of a normal protein obtained from the above cells or tissues by a point mutagenesis method.
  • the translation region is a DNA construct that can be expressed in a transgenic animal, and is linked to the downstream of the promoter and optionally the upstream of a transcription termination site.
  • Transfer of the exogenous DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the target mammal.
  • the presence of the exogenous DNA of the present invention in the germ cells of the transgenic animal after the transfer of the DNA indicates that all of the progeny of the produced animal and the exogenous DNA of the present invention will be present in all of the germ cells and somatic cells. Means to hold.
  • the offspring of this type of animal that inherited the exogenous DNA of the present invention All of the germ cells and somatic cells have the exogenous DNA of the present invention.
  • the non-human mammal to which the exogenous normal DNA of the present invention has been transferred is confirmed to stably maintain the exogenous DNA by mating, and is subcultured as an animal having the DNA in a normal breeding environment. I can do it.
  • Transfer of the exogenous DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in excess in all germ cells and somatic cells of the target mammal.
  • Excessive presence of the exogenous DNA of the present invention in the germinal cells of the produced animal after DNA transfer indicates that all the offspring of the produced animal carry the exogenous DNA of the present invention in all of its germinal and somatic cells. It means having extra.
  • the progeny of such animals that have inherited the exogenous DNA of the present invention have an excess of the exogenous DNA of the present invention in all of their germinal and somatic cells.
  • the non-human mammal having the normal DNA of the present invention has a high level of expression of the normal DNA of the present invention, and eventually promotes the function of endogenous normal DNA, thereby finally improving the protein of the present invention. It may develop hyperfunction and can be used as a model animal for the disease. For example, using the normal DNA-transferred animal of the present invention, it is possible to elucidate the pathological mechanism of the hyperactivity of the protein of the present invention and diseases associated with the protein of the present invention and to examine a method for treating these diseases. It is possible.
  • the mammal to which the exogenous normal DNA of the present invention has been transferred has an increased symptom of the released protein of the present invention, it is also used for a screening test for a therapeutic drug for a disease associated with the protein of the present invention. It is possible.
  • the non-human mammal having the foreign abnormal DNA of the present invention should be subcultured in a normal breeding environment as an animal carrying the DNA after confirming that the foreign DNA is stably maintained by mating. Can be done.
  • the target exogenous DNA can be incorporated into the above-mentioned plasmid and used as a raw material.
  • a DNA construct with a promoter can be prepared by ordinary DNA engineering techniques. The transfer of the abnormal DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the target mammal.
  • the presence of the abnormal DNA of the present invention means that all the offspring of the produced animal have the abnormal DNA of the present invention in all of its germ cells and somatic cells.
  • the progeny of this type of animal that has inherited the exogenous DNA of the present invention has the abnormal DNA of the present invention in all of its germinal and somatic cells.
  • a homozygous animal having the introduced DNA on both homologous chromosomes is obtained, and by crossing these male and female animals, it is possible to breed so that all offspring have the DNA.
  • the abnormal DNA of the present invention is highly expressed, and the function of the protein of the present invention is ultimately achieved by inhibiting the function of endogenous normal DNA.
  • Inactive refractory disease may occur and can be used as a model animal for the disease.
  • using the abnormal DNA transgenic animal of the present invention it is possible to elucidate the pathological mechanism of the function-inactive refractory of the protein of the present invention and to examine a method for treating this disease.
  • the abnormal DNA highly expressing animal of the present invention can be used to inhibit the function of the normal protein by the abnormal protein of the present invention in the function-inactive refractory disease of the protein of the present invention (dominant negative activity). Action).
  • a therapeutic drug screening for a functionally inactive refractory disease of the protein of the present invention can also be used for testing.
  • ⁇ ⁇ Screening of drugs that enhance cell function by using the cells described in 3 above, and ⁇ ⁇ Isolation and purification of the mutant protein of the present invention and production of its antibody can be considered. Furthermore, using the DNA-transferred animal of the present invention, it is possible to examine clinical symptoms of a disease related to the protein of the present invention, including a functionally inactive refractory disease of the protein of the present invention, and the like. More detailed pathological findings in each organ of the protein-related disease model can be obtained, contributing to the development of new treatment methods and the research and treatment of secondary diseases caused by the disease. .
  • each organ from the DNA-transferred animal of the present invention cut it into small pieces, and then use a proteolytic enzyme such as trypsin to obtain free DNA-transferred cells, culture them, or systematize the cultured cells. is there.
  • a proteolytic enzyme such as trypsin
  • the protein of the present invention can be identified, its relationship with apoptosis, differentiation, or proliferation, or its signal transduction mechanism can be examined, and its abnormality can be examined. It is an effective research material for elucidation.
  • the DNA transgenic animal of the present invention in order to use the DNA transgenic animal of the present invention to develop a therapeutic agent for a disease associated with the protein of the present invention, including a refractory inactive type of the protein of the present invention, Using a quantitative method or the like, it is possible to provide an effective and rapid screening method for the therapeutic agent for the disease.
  • using the DNA transgenic animal of the present invention or the exogenous DNA expression vector of the present invention it is possible to study and develop a method of treating a DNA associated disease of the present invention for DNA. It is.
  • the present invention provides a non-human mammalian embryonic stem cell in which the DNA of the present invention has been inactivated, and a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention.
  • a DNA-deficient non-human mammal in which the DNA of the present invention has been inactivated (7)
  • the DNA is inactivated by introducing a repo overnight gene (eg, a 0-galactosidase gene derived from Escherichia coli), and the reporter gene is used as a promoter for the DNA of the present invention.
  • a repo overnight gene eg, a 0-galactosidase gene derived from Escherichia coli
  • the reporter gene is used as a promoter for the DNA of the present invention.
  • the non-human mammal according to (6) which can be expressed under the control of
  • a compound that promotes or inhibits the promoter activity of DNA of the present invention which comprises administering a test compound to the animal described in (7) and detecting the expression of a repo overnight gene; A method for screening the salt is provided.
  • a non-human mammalian embryonic stem cell in which the DNA of the present invention has been inactivated is an artificially mutated DNA of the present invention possessed by the non-human mammal, which suppresses the expression of DNA, or By substantially losing the activity of the protein of the present invention encoded by the DNA, the DNA has substantially no ability to express the protein of the present invention (hereinafter referred to as the knockout DNA of the present invention).
  • Non-human mammalian embryonic stem cells hereinafter abbreviated as ES cells).
  • non-human mammal the same one as described above is used.
  • the method of artificially mutating the DNA of the present invention can be performed, for example, by deleting a part or all of the DNA sequence and inserting or substituting another DNA by a genetic engineering technique.
  • the knockout DNA of the present invention may be prepared by, for example, shifting the codon reading frame or disrupting the function of the promoter or exon by these mutations.
  • Non-human mammalian embryonic stem cells in which the DNA of the present invention has been inactivated include, for example, The DNA of the present invention possessed by a non-human mammal to be isolated is isolated and its exon portion is a drug resistance gene typified by a neomycin resistance gene, a hygromycin resistance gene, 1acZ (3-galactosidase gene), cat (Chloramphenicol acetyltransferase gene) to destroy the exon function by inserting a repo overnight gene or the like, or to terminate transcription of the gene in the intron between the exons.
  • a drug resistance gene typified by a neomycin resistance gene, a hygromycin resistance gene, 1acZ (3-galactosidase gene), cat (Chloramphenicol acetyltransferase gene) to destroy the exon function by inserting a repo overnight gene or the like, or to terminate transcription of the gene in the intron between
  • the DNA strand having the DNA sequence (hereinafter abbreviated as “gathering vector 1”) constructed so as to eventually destroy the gene is transferred to the chromosome of the animal by a homologous recombination method, for example. And the obtained ES cells are used in the present invention.
  • Southern hybridization analysis using the DNA sequence on or near the DNA as a probe or DNA sequence on the target vector and the DNA other than the DNA of the present invention used for the production of the targeting vector It can be obtained by analyzing the DNA sequence of the region by a PCR method using a primer and selecting the knockout ES cells of the present invention.
  • ES cells from which the DNA of the present invention is inactivated by the homologous recombination method or the like for example, those already established as described above may be used, or according to the known method of Evans and Kaufma. May be newly established.
  • mouse ES cells currently, the 129-line ES cells are generally used.
  • immunological background is not clear, a pure line that substitutes them is not suitable for immunologically.
  • the number of eggs collected by C5 7 B LZ 6 mice and C 5 7 8 Oto 6 was improved by crossing with 08 88 72 80? ⁇ mouse
  • BDF i mice have the advantage of a large number of eggs collected and robust eggs, and also have C57B LZ6 mice as their background, so ES cells obtained using these mice When it is created, it can be advantageously used in that the genetic background can be replaced with C57B LZ6 mice by backcrossing with C57BLZ6 mice.
  • blastocysts 3.5 days after fertilization are generally used.However, it is more efficient to collect embryos at the 8-cell stage and culture them up to blastocysts. Many early embryos can be obtained.
  • Either male or female ES cells may be used, but generally male ES cells are more convenient for producing a germline chimera. It is also desirable to discriminate between males and females as soon as possible in order to reduce the complexity of culturing.
  • a method of determining the sex of ES cells for example, a method of amplifying and detecting a gene in the sex-determining region on the Y chromosome by PCR can be mentioned. If this method was used, the number of ES cells in one colony (approximately 50) was sufficient, compared to the conventional method requiring about 106 cells for karyotype analysis.
  • the primary selection of ES cells in the initial stage can be performed by gender discrimination, and the selection of male cells at an early stage greatly reduces the labor required in the initial culture.
  • Embryonic stem cell lines obtained in this way usually have very good proliferative properties, but they must be carefully subcultured because they tend to lose their ability to generate individuals.
  • a suitable feeder cell such as STO fibroblasts
  • LIF 1-1000 OU / ml
  • 95% air or Incubate the cells at about 37 ° C in 5% oxygen, 5% carbon dioxide, 90% air, etc.
  • trypsin ZEDTA solution usually 00 1-0.5% trypsin Z0.1
  • 5 mM EDTA preferably about 0.1% trypsin / 1 mM EDTA
  • ES cells can be transformed into various types of cells, such as parietal, visceral, and cardiac muscle, by monolayer culture up to high density or suspension culture until cell clumps are formed under appropriate conditions. It is possible to differentiate [MJ Evans and MH Kaufman, Nature 292, 154, 1981; GR Martin Proceedings of the National Academy of the Sciences Pro. Natl. Acad. Sci. USA) 78, 7634, 1981; TC Doetschman et al., Journal of embrologi ⁇ and 'experimental morphology, 87, 27, 1985.
  • the present invention obtained by differentiating the ES cells of the present invention
  • the DNA deficient cells of the present invention are useful in the cell biological examination of the protein of the present invention in the mouth.
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention can be distinguished from a normal animal by measuring the mRNA level of the animal using a known method and indirectly comparing the expression level. .
  • non-human mammal those similar to the aforementioned can be used.
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention can be obtained, for example, by introducing the evening-getting vector prepared as described above into a mouse embryonic stem cell or mouse egg cell, By knocking out the DNA of the present invention by causing the DNA sequence in which the DNA of the present invention is inactivated to replace the DNA of the present invention on the chromosome of a mouse embryonic stem cell or mouse egg cell by gene homologous recombination. Can be done.
  • Cells in which the DNA of the present invention has been knocked out can be analyzed by Southern hybridization analysis or DNA sequencing using the DNA sequence on or near the DNA of the present invention as a probe. The determination can be made by PCR analysis using, as a primer, the DNA sequence of a nearby region other than the DNA of the present invention derived from the mouse used as one getting vector.
  • a non-human mammalian embryonic stem cell the cell line in which the DNA of the present invention has been inactivated by gene homologous recombination is cloned, and the cell is used at an appropriate time, for example, at the 8-cell stage non-human cell line.
  • the chimeric embryo is injected into a mammalian embryo or a blastocyst, and the resulting chimeric embryo is transplanted into the uterus of the pseudopregnant non-human mammal.
  • the produced animal is a chimeric animal composed of both cells having the normal DNA locus of the present invention and cells having the artificially altered DNA locus of the present invention.
  • all tissues are artificially mutated from a population obtained by crossing such a chimeric individual with a normal individual. It can be obtained by selecting individuals composed of the cells having the added DNA locus of the present invention, for example, by judging the body color.
  • the individuals obtained in this manner are usually individuals deficient in the hetero-expression of the protein of the present invention, and mated with individuals deficient in the hetero-expression of the protein of the present invention.
  • a homozygous deficient individual can be obtained.
  • a transgenic non-human mammal having a chromosome into which a targeting vector is introduced can be obtained by injecting a DNA solution into the nucleus of an egg by a microinjection method.
  • a transgenic non-human mammal of the present invention by selecting a gene having a mutation at the DNA locus of the present invention by homologous recombination.
  • the animal individuals obtained by mating should also be confirmed to be knocked out of the DNA, and reared in a normal breeding environment. Can be.
  • the germline can be obtained and maintained according to a standard method. That is, by mating male and female animals having the inactivated DNA, homozygous animals having the inactivated DNA on both homologous chromosomes can be obtained.
  • the obtained homozygous animal can be efficiently obtained by rearing the mother animal in such a manner that one normal individual and a plurality of homozygotes are obtained.
  • homozygous and heterozygous animals having the inactivated DNA are bred and subcultured.
  • non-human mammalian embryonic stem cells in which the DNA of the present invention has been inactivated are extremely useful for producing a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention.
  • the non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention lacks various biological activities that can be induced by the protein of the present invention, a disease caused by inactivation of the biological activity of the protein of the present invention. Since it can be a model, it is useful for investigating the causes of these diseases and examining treatment methods.
  • the non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention may be a disease caused by deficiency or damage of the DNA of the present invention (eg, herniated disc, sciatica, glomerulonephritis, diabetic nephropathy, hepatic fibrosis, lung fiber) Can be used to screen for compounds that have therapeutic and / or prophylactic effects against sclerosis or marble disease.
  • a disease caused by deficiency or damage of the DNA of the present invention eg, herniated disc, sciatica, glomerulonephritis, diabetic nephropathy, hepatic fibrosis, lung fiber
  • the present invention comprises administering a test compound to a non-human mammal deficient in expressing the DNA of the present invention, and observing and measuring changes in the animal. It is intended to provide a method for screening a compound or a salt thereof having a therapeutic / preventive effect on a disease caused by injury or damage.
  • Examples of the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention used in the screening method include the same as described above.
  • Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and plasma.These compounds are novel compounds. Or a known compound.
  • a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention is treated with a test compound and compared with a non-treated control animal, and changes in organs, tissues, disease symptoms, etc. of the animal are indicated.
  • the therapeutic and prophylactic effects of the test compound can be tested.
  • test compound for example, oral administration, intravenous injection and the like are used, and it can be appropriately selected according to the symptoms of the test animal, the properties of the test compound, and the like.
  • the dose of the test compound can be appropriately selected according to the administration method, the properties of the test compound, and the like.
  • the DNA of the present invention may be used.
  • a non-human mammal deficient in expression is subjected to a glucose tolerance treatment, a test compound is administered before or after the glucose tolerance treatment, and the blood glucose level and weight change of the animal are measured over time.
  • the blood glucose level of the test animal decreases by about 10% or more, preferably about 30% or more, more preferably about 50% or more.
  • the test compound can be selected as a compound having a therapeutic or preventive effect on intervertebral disc herniation, sciatica, glomerulonephritis, diabetic nephropathy, hepatic fibrosis, pulmonary fibrosis or marble disease.
  • the compound obtained by using the screening method of the present invention is a compound selected from the test compounds described above, and is a disease caused by deficiency or damage of the protein or the like of the present invention (eg, herniated disc, sciatica, It has a therapeutic and preventive effect on glomerulonephritis, diabetic nephropathy, liver fibrosis, pulmonary fibrosis or marble disease) Therefore, it can be used as a drug such as a safe and low-toxic therapeutic / prophylactic agent for the disease. Further, a compound derived from the compound obtained by the above screening can also be used.
  • a disease caused by deficiency or damage of the protein or the like of the present invention eg, herniated disc, sciatica, It has a therapeutic and preventive effect on glomerulonephritis, diabetic nephropathy, liver fibrosis, pulmonary fibrosis or marble disease
  • a compound derived from the compound obtained by the above screening can also be used.
  • the compound obtained by the screening method may form a salt.
  • the salt of the compound include physiologically acceptable acids (eg, inorganic acids, organic acids, etc.) and bases (eg, alkalis). Salts with metals and the like are used, and especially preferred are physiologically acceptable acid addition salts.
  • salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.), and organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid) , Succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, succinic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, etc.).
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid
  • Succinic acid tartaric acid
  • citric acid malic acid
  • succinic acid benzoic acid
  • methanesulfonic acid benzenesulfonic acid, etc.
  • a drug containing the compound or a salt thereof obtained by the screening method can be produced in the same manner as the drug containing the protein of the present invention described above.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic, and can be used, for example, in humans or mammals (eg, rats, mice, guinea pigs, egrets, sheep, sheep, bushus, dogs, dogs, cats, dogs). , Monkeys, etc.).
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the target disease, the administration subject, the administration route, and the like.
  • the compound is administered in an amount of about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 5 Omg, more preferably about 1.0 to 20 mg per day.
  • the single dose of the compound varies depending on the administration subject, target disease, and the like.
  • the compound is usually administered in the form of an injection to an adult (6).
  • the compound is administered by intravenous injection at a rate of about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 1 Omg per day. It is convenient. In the case of other animals, the amount converted per 60 kg can be administered.
  • the present invention provides administering a test compound to a non-human mammal deficient in expressing the DNA of the present invention, A method for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the activity of a promoter for DNA of the present invention, characterized by detecting the expression of a repo overnight gene.
  • the non-human mammal deficient in expressing DNA of the present invention may be a non-human mammal deficient in expressing DNA of the present invention, wherein the DNA of the present invention is obtained by introducing a repo allele gene. Those inactivated and capable of expressing the reporter gene under the control of the promoter of the DNA of the present invention are used.
  • test compound examples include the same compounds as described above.
  • the reporter gene the same one as described above is used, and a 3-galactosidase gene (1 acZ), a soluble alkaline phosphatase gene or a luciferase gene is preferable.
  • the repo overnight gene is under the control of the promoter for the DNA of the present invention, By tracing the expression of the substance encoded by the repo overnight gene, the activity of the promoter overnight can be detected.
  • the tissue originally expressing the protein of the present invention may / 3-galactosidase is expressed instead of the protein of the invention. Therefore, for example, by staining with a reagent serving as a substrate for 3-galactosidase such as 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-galactopyranoside (X_gal), the present method can be easily performed. The expression state of the protein of the present invention in an animal body can be observed.
  • the protein-deficient mouse of the present invention or a tissue section thereof is fixed with dartalaldehyde or the like, washed with phosphate buffered saline (PBS), and then stained with X-ga1 at room temperature or at 37 ° C. After reacting at about 30 ° C for about 30 minutes to 1 hour, the i3-galactosidase reaction may be stopped by washing the tissue specimen with ImM EDTAZPBS solution, and the coloration may be observed. Further, mRNA encoding 1 ac Z may be detected according to a conventional method.
  • the compound or a salt thereof obtained by the above-mentioned screening method is a compound selected from the test compounds described above and a compound that promotes or inhibits the promoter activity of the DNA of the present invention.
  • the compound obtained by the screening method may form a salt.
  • the salt of the compound include physiologically acceptable acids (eg, inorganic acids) and bases (eg, organic acids).
  • physiologically acceptable acid addition salts are preferred.
  • Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.)
  • salts with organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, etc.
  • the compound of the present invention or a salt thereof that promotes the promoter activity over the DNA can promote the expression of the protein of the present invention and promote the function of the protein.
  • the herniated disc, sciatica It is useful as a medicament such as a safe and low toxic therapeutic / prophylactic agent for diseases such as glomerulonephritis, diabetic nephropathy, liver fibrosis, pulmonary fibrosis or marble disease.
  • a compound or a salt thereof that inhibits the promoter activity of the DNA of the present invention can inhibit the expression of the protein of the present invention and inhibit the function of the protein.
  • rheumatoid arthritis It is useful as a drug for safe and low-toxic treatment and prevention of diseases such as arthropathy, osteoporosis, cancer, arteriosclerosis, and corneal ulcer.
  • a drug containing the compound or a salt thereof obtained by the screening method can be produced in the same manner as the above-described drug containing the protein of the present invention or a salt thereof.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic, and can be used, for example, in humans or mammals (eg, rats, mice, guinea pigs, egrets, sheep, sheep, bushus, dogs, dogs, cats, dogs). , Monkeys, etc.).
  • the dose of the compound or a salt thereof depends on the target disease, the subject of administration, the administration route, and the like.
  • an orally administered compound of the present invention that promotes motor activity against DNA for the purpose of treating diabetic nephropathy is generally less than one day for adults (with a body weight of 60 kg).
  • the single dose of the compound varies depending on the administration subject, target disease, and the like.For example, it promotes the promoter activity of DNA of the present invention for the purpose of treating diabetic nephropathy.
  • the compound When the compound is administered to an adult (as 6 O kg) usually in the form of an injection, about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 20 mg of the compound per day is administered. It is convenient to administer about 1 to 1 Omg by intravenous injection. For other animals, the dose can be administered in terms of 60 kg.
  • a compound of the present invention that inhibits the promoter activity against DNA for the purpose of treating rheumatoid arthritis when administered, generally, the compound is administered to an adult (with a body weight of 60 kg) daily. About 0.1 to 10 Omg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 2 Omg is administered.
  • the single dose of the compound varies depending on the administration subject, target disease, and the like.For example, it inhibits the promoter activity of the DNA of the present invention for the purpose of treating rheumatoid arthritis.
  • the compound to be administered When the compound to be administered is usually administered to adults (as 6 O kg) in the form of an injection, the compound is administered in an amount of about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 2 Omg, more preferably about 0.1 to 2 Omg per day. It is convenient to administer about 0.1 to 1 Omg by intravenous injection. For other animals, the dose can be administered in terms of 60 kg.
  • the non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention is extremely useful for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the activity of the promoter for the DNA of the present invention. It can greatly contribute to the investigation or prevention of various diseases caused by insufficient expression of DNA.
  • genes encoding various proteins are ligated downstream thereof and injected into egg cells of an animal to produce a so-called transgenic animal (gene transfer). Animal) It is also possible to synthesize the protein and study its action in living organisms. Furthermore, by binding an appropriate repo overnight gene to a part of the promoter and establishing a cell line that expresses the gene, the action of specifically promoting or suppressing the ability of the protein itself of the present invention to produce in the body can be achieved. It can be used as a search system for low molecular compounds.
  • bases, amino acids, and the like are indicated by abbreviations based on the abbreviations by IUPAC-I UB Commision on Biochemical Nomenclature or commonly used abbreviations in the art, and examples thereof are described below. If there is an optical isomer of the amino acid, the L-form is indicated unless otherwise specified.
  • DNA Deoxyribonucleic acid
  • Y Thymine (T) or cytosine (C)
  • M adenine (A) or cytosine (C)
  • W adenine (A) or thymine (T)
  • B Guanine (G), guanine (G) or thymine (T)
  • D Adenine (A), guanine (G) or thymine (T)
  • V adenine (A), guanine (G) or cytosine (C)
  • RNA liponucleic acid
  • mRNA messenger ribonucleic acid
  • dATP Deoxyadenosine triphosphate
  • dTTP Deoxythymidine triphosphate
  • sequence numbers in the sequence listing in the present specification indicate the following sequences.
  • amino acid sequence of a portion corresponding to the disintegrin region of the protein represented by the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 15 is shown.
  • FIG. 1 shows the nucleotide sequence of DNA encoding the protein of the present invention having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • SEQ ID NO: 1 The amino acid sequence of a portion corresponding to the meta-oral protease region of the protein represented by the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 15 is shown.
  • SEQ ID NO: 1 This corresponds to the 199th to 399th amino acid sequence of the amino acid sequence represented by 1.
  • 1 shows the amino acid sequence of a partial peptide of the protein of the present invention. It corresponds to the amino acid sequence at positions 428 to 433 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 15.
  • Example 1 shows one base sequence used in Example 1.
  • Example 1 shows the base sequence of — used in Example 1.
  • Example 1 shows one base sequence used in Example 1.
  • Example 1 shows one base sequence used in Example 1.
  • Example 1 shows one base sequence used in Example 1.
  • Example 1 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 1.
  • Example 1 shows the amino acid sequence of the novel ADAM protein obtained in Example 1.
  • Example 6 shows the single nucleotide sequence used in Example 2.
  • Fig. 4 shows one base sequence used in Example 2.
  • Example 7 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 5.
  • Example 6 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 5.
  • Example 7 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 7.
  • Example 7 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 7.
  • Example 14 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 8.
  • Example 14 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 8.
  • [SEQ ID NO: 25] 14 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 9.
  • Example 1 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 11.
  • Example 1 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 11;
  • the transformant Escherichia coli DH5 ⁇ / ⁇ 2052 obtained in Example 1 described below has been used since August 26, 1998 by the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (NI ⁇ ) Deposit No. FERM BP-6474 and deposited with the Fermentation Research Institute (IFO) as a deposit number IF # 16173 on May 20, 1998.
  • NI ⁇ National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
  • IFO Fermentation Research Institute
  • the transformant Escherichia coli DH5 ⁇ / ⁇ 2053 obtained in Example 1 described below has been used since August 26, 1998 by the National Institute of Biotechnology and Industrial Technology (NI ⁇ ) Deposit No. FERM BP-6475 and deposited with the Fermentation Research Institute (IFO) as a deposit number IF 0 16174 on May 20, 1998.
  • NI ⁇ National Institute of Biotechnology and Industrial Technology
  • IFO Fermentation Research Institute
  • the transformant Escherichiacoli JM109 / pTB2076 transformed with the vector PTB2076 obtained in Example 9 described below has been used since August 23, 1999 by the Research Institute of Biotechnology, Industrial Technology Institute NI BH) and a deposit number F ERM BP-6857, which was deposited with the Fermentation Research Institute (IFII) on August 4, 2001 as a deposit number IF 0 16305.
  • primers were designed based on the sequences found above, and these primers [ATC ACA GTC CTC TCC CAT TTC CAC CAA C (SEQ ID NO: 9)] and [CAC ATT TCA GGC AGG TCG CAC TCA TC (SEQ ID NO: 10)] and the AP1 and AP2 primers attached to the CL0NTECH Marathon cDNA Amplification Kit, PCR was performed using the Marathon ready cDNA (CL0NTECH) as a type II according to the protocol attached to the kit. Attempt to clone the 5 'upstream fragment.
  • primers [TCG CTG TGG TCC TGA ACA ACG CCA ACA (SEQ ID NO: 11)] and [CAC ACC ATC] were designed based on the sequence of the obtained fragment.
  • CAT CCC ACA GGT GCT GTC A SEQ ID NO: 12
  • primers [GGA ACC AGT TGG TGG AAA TGG GAG AGG A (SEQ ID NO: 13)] and [AGG ACT GTG ATT GTG GGA CGT CTG AGG AA (SEQ ID NO: 14)] was designed and PCR was performed in the same manner as described above. As a result, two types of clones having completely different sequences were obtained from the middle of the protein coding region.
  • the gene fragments obtained by the RACE method were ligated and inserted into the expression vector PCDNA3.1 (manufactured by Invitrogen) to obtain pTB2052 and pTB2053.
  • pTB2052 had the nucleotide sequence shown in FIG. 3 and FIG. 4 (including the 2325 nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 16).
  • This cDNA fragment contains Figure 3 and Figure A new ADAM protein consisting of 775 amino acids represented by 4 (SEQ ID NO: 15) is coded, and the signal sequence, pro-region, meta-oral protease region, disintegrin region, cysteine-rich region, transmembrane region, and cell Internal area was observed.
  • pTB2052 was introduced into Escherichia coli DH5 by a known method to obtain Escherichiaco DH5 ⁇ / ⁇ 2052.
  • pTB2053 had the nucleotide sequence shown in FIGS. 1 and 2 (including the 1620 nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3).
  • This cDNA fragment encodes a new ADAM protein consisting of 540 amino acids represented by SEQ ID NO: 1, and contains the signal sequence, pro region, meta-oral protease region, disintegrin region, and a part of it. A cysteine litch area was noted.
  • pTB2053 was introduced into Escherichia coli DH5a by a known method to obtain Escherichia coli DH5 ⁇ / ⁇ 2053.
  • the meta-oral protease region and the disintegrin region of the ADAM protein of the present invention were expressed in Escherichia coli. That is, pTB2053 obtained in Example 1 was used as a template, and two primers [CAT ATG GTT CAG GAA CAT GAG AAA TAC ATA (SEQ ID NO: 17)] and [CTC GAG GAA GCC ATT GAC TTG GAA TCT A-C C (SEQ ID NO: 18)] according to the protocol of Pfu turbo (manufactured by STRATAGENE) according to the PCR reaction (20 seconds at 95 ° C, 10 seconds at 55 ° C, 2 minutes at 72 ° C, 25 minutes). Times).
  • Escherichia coli BL21 (DE3) was transformed with the plasmid pMDH obtained in Example 2 and used for expression.
  • Expression induction was performed using ImM isopropylthiogalactopyranoside, and purification was performed according to the attached manual using Ni-NTA Agarose (manufactured by QIAGEN).
  • the desired recombinant ADAM protein of about 35 kDa was eluted with Buffer-E (A handbook for high-level expression and purification of 6xHis-tagged proteins, QIAGEN).
  • a 96-well plate (Fluoro B plate, manufactured by Dainippon Pharmaceutical) was obtained in Example 3 with 30 L of buffer solution [25 OmM Tris-HCl (pH 7.5), 5 mM calcium chloride, 10 M zinc chloride]. 20 L of recombinant ADAM protein (0.8 mgZmL) was added. 37 After preincubation at 37 ° C for 10 minutes, 10 M substrate [MOCAc—Arg—Pro—Lys—Pro—Tyr—Ala-Nva-Trp-Met—Ly s (DNP) —NH 2 , manufactured by Peptide Research Laboratories) was added to 10 OL to start the enzymatic reaction.
  • Example 5 Preparation of Expression Plasmid with 10 Amino Acid Deletion in Disintegrin Region
  • the gene described in International Patent Publication (W097 / 09430) was compared with the gene obtained in the present invention (SEQ ID NO: 3). It is a gene in which 30 base pairs (10 amino acids) have been deleted from the syntegrin region.
  • the gene described in International Publication No. WO 97/09430 was obtained by the following method.
  • the cartilage was collected from the nasal septum, cut into a cylinder using a 4 mm diameter cork pole, and the cylindrical cartilage was cut to a thickness of about lmm with a scalpel to obtain a disc-shaped cartilage fragment. Next, this cartilage piece was frozen and thawed 5 times at -80 ° C and 37 ° C, and finally, heat-treated at 65 ° C for 20 minutes, and used as a substrate for the following activity measurement.
  • SGAG sulfated glycosaminodalican
  • the recombinant human ADAM protein (200 g) obtained in Example 3 was suspended in complete Freund's adjuvant, and a Japanese white egret was initially immunized. Thereafter, 400 recombinant human ADAM proteins were suspended in incomplete Freund's adjuvant four times every two weeks to immunize Japanese white egrets. One week after the final immunization, whole blood was collected to obtain about 50 ml of serum. The measurement of the antibody titer was performed as follows. After immobilizing the recombinant human ADAM protein at a concentration of 0.5 g / ⁇ , dilute ⁇ sera serum was added to a 96-well plate that had been blocked with BSA, and allowed to stand at room temperature for 2 hours.
  • the promoter region of the rat type II collagen gene is a primer [5'—GTGGTGGTGGACAACTAGGAAACTCTGG-3 '(SEQ ID NO: 21) designed based on the nucleotide sequence of Kohno et al. (L Biol. Chem 260: 4441, 1985). ] And [5'-CGAGGCGAATCATGGCTCACCGCG-3 '(SEQ ID NO: 22)].
  • the obtained fragment of about 1.2 kb was proto-produced using T0P0 TA Cloning Kit (Invitrogen). According to the call, it was cloned into the attached PCR II-TOPO (pCRII-promoter 2).
  • the nucleotide sequence was confirmed by a conventional method using a DNA sequencer manufactured by ABI. It was cut out at the Notl (5 'side) of the multiple cloning site of pCRII plasmid and at the Smal site within the promoter overnight sequence and used for experiments.
  • the enhancer region of the rat type II collagen gene is derived from a primer designed to generate Mlul sites based on the nucleotide sequence of Krebsbach et al. (SEQ ID NO: 23)] and [5′-GCTTCGTCGCCGCTACGCGTGGGGCCGGA-3 ′ (SEQ ID NO: 24)].
  • the nucleotide sequence of the obtained 0.35 kb Mlul fragment was confirmed by a conventional method using a DNA sequencer manufactured by ABI. Next, an EcoRI linker was added to the Mlul fragment and inserted into the EcoRI site of pBluescript KSII + (pKS-enhancer 1-4).
  • An expression vector for DNA transfer rat, PTB2076 (FIG. 5), was constructed according to a conventional method. This plasmid is obtained by inserting the following fragments 1) to 5) into the Notl site of pBluescriptll KS +.
  • Col2Al promoter promoter region of rat type I collagen gene, a 1,120b fragment from Notl in the multiple cloning site of pCRII described in Example 8 to Smal site in type II collagen gene promoter (Smal Convert site to Sail site).
  • SV40 splicing A fragment containing a splicing site derived from pTB399 (R. Sasada et al., Cell Structure and Fundion 12: 205, 1987), in which the 5 'side is modified to Sall and the 3' side is modified to Clal.
  • ADAM a novel ADAM gene.
  • SV40 polyA BglII and Hindlll fragment containing polyA additional signal derived from pTB399 (R. Sasada et al., Cell Structure and Function 12: 205, 1987).
  • Col2Al enhancer a fragment from the Hindlll site to the Notl site of pKS-enhancer 4 containing the enhancer region of the rat type II collagen gene described in Example 8.
  • Rat SD (ISG) strain was purchased at 8 weeks of age for egg collection, and bred for 1 week at 7: 00-19: 00 12 hours under light conditions.
  • follicle stimulating hormone pregnant horse serum
  • PMSG gonadotropin
  • hCG human chorionic gonadotropin
  • the individual (individual) was intraperitoneally injected and the male rat SD (ISG) strain was inhabited and crossed 1: 1 after 14:00 with an individual after 10 weeks of age.
  • the female rats bred at 9:00 were checked for vaginal plugs.
  • the individual with the confirmed vaginal plugs was sacrificed, and egg collection was started. From the fertilized eggs, pronucleated eggs were selected, the plasmid PTB2076 obtained in Example 9 was cut with Notl from 14:30, and a fragment containing the novel ADM gene was prepared to a concentration of 10 g / ml. 21 was injected into the male pronucleus of the fertilized single-cell SD rat eggs while observing under a microscope. Subsequently, the egg cells were cultured in a HER medium known per se, and after confirming the 2-cell stage embryo at 13:30 on day 5, Wagner et al. (Pro at. Acad. Sc.
  • PCR was carried out using a DNA fragment consisting of a nucleotide sequence complementary to the base sequence corresponding to the base) [5'-TCCATCCCGATGTATGGGGC-13 '(SEQ ID NO: 28)].
  • the genomic DNA of these six PCR-positive individuals was analyzed by Southern hybridization. That is, 10 g of the DNA was completely digested with Hindlll, electrophoresed on a 1.0% agarose gel, and then transferred to Nylon Fil Yuichi. This filter was used for the novel ADAM gene (about 2.4 Kb gene fragment (corresponding to nucleotides 13 to 2448 in FIGS.
  • Example 9 Example 9 and a DIG DNA labeling kit (Beringer Mannheim). ), Washed twice with 2xSS 0.1% SDS at room temperature, and then twice with 0.1xSDS (: 0.1% SDS, 68 ° C). A DIG fluorescence detection kit (Beringer Mannheim) was used, and as a result, a 1.9 Kb fragment was observed in all of these six individuals, confirming the introduction of the novel ADAM gene.
  • the copy number of the gene is 40 copies for RCA-14 (female), 5 copies for RCA-22 (male), 40 copies for RCA-50 (male), 2 copies for RCA-79 (male), RCA It was confirmed that 10 copies of -83 (female) and 40 copies of RCA-86 (male) were obtained. 2 Expression of human ADAM protein in tail vertebrae of DNA transfer rat
  • the presence of the novel human ADAM protein of the present invention was confirmed from the proliferating chondrocytes to the hypertrophic chondrocyte layer in the tail cartilage tissue of the tail vertebra of the RCA-14 (female) rat with DNA transfer.
  • the DNA-transferred rat incorporating the novel ADAM gene of the present invention thus obtained develops joint deformity such as rheumatoid arthritis and osteoarthritis, arthritic joint disease accompanied by damage, bone disease, and chronic inflammatory disease. Can be used as a disease model animal. Furthermore, it is possible to elucidate the pathological mechanism of these diseases and to examine a method of treating these diseases using the DNA metastatic rat of the present invention. Further, by the method for producing a DNA transfer rat according to the present invention, a target DNA transfer rat can be efficiently obtained at a high yield.
  • Example 13 Search for a substance that regulates the protease activity of ADAM protein
  • ADAM protein solution (25 fi 1) obtained in the same manner as described in Example 3 was added to 75 1 buffer (83.3 mM Tris-HC1, pH 7.5, 16.7 mM NaCK 1.67 mM) After addition of CaCl 2> 16.7 II M CoCl 2 , 0.067% BSA)> 25 1 substrate solution (50 uM ma-Pro-Lys-Pro-Leu-Ala-Nva-Trp-Lys ( (DNP) -H 0.05% BSA, 5% DMS0) was added to start the enzyme reaction. After incubation at 37 ° C for 2 hours, 100 1 of 0.5 M acetate buffer (pH 3.0) was added to stop the enzyme reaction.
  • the fluorescence intensity when no enzyme solution was added (the fluorescence intensity was measured using a fluorescence plate reader (Corona MTP-32) at an excitation wavelength of 340 nm and a measurement wavelength of 450 nm) was 10, whereas the enzyme solution was 10.
  • the fluorescence intensity upon addition of was 180. Therefore, it was revealed that the ADAM protein exhibited protease activity even under these conditions.
  • the protein of the present invention and DNA encoding the same may be used, for example, for the treatment and prevention of diseases such as disc herniation, sciatica, glomerulonephritis, diabetic nephropathy, hepatic fibrosis, pulmonary fibrosis or marble disease.
  • the protein of the present invention comprises a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the protease activity of the protein of the present invention and the activity of Z or extracellular matrix-degrading enzyme (particularly, the activity of proteodalican-degrading enzyme).
  • the antibody against the protein of the present invention can specifically recognize the protein of the present invention, it can be used for quantification of the protein of the present invention in a test solution.

Description

新規タンパク質およびその D N A 技術分野
本発明は、 新規な ADAMタンパク質に関する。 背景技術
細胞外マトリックスは、 組織の細胞を取り巻く細胞支持組織であり、 コラーゲ ンゃエラスチンなどの繊維性タンパク質、 プロテオグリカンなどの複合糖質、 細 胞接着などに関係のあるフイブロネクチン、 ラミニンなどの糖夕ンパク質及びヒ アルロン酸などの糖質からなる。細胞外マトリックスは細胞の形態 '代謝'移動 · 増殖 ·分化など細胞の活動に重大な影響を与えることが知られている。 したがつ て、 生体の発生 ·加齢 ·炎症 ·創傷治癒 ·免疫 ·腫瘍など多くの生体現象と関連 することが知られている。 また、 慢性関節リウマチ、 変形性関節症、 骨粗鬆症、 ガンの転移 ·浸潤、 動脈硬化、 角膜潰瘍など種々の疾病においては細胞外マトリ ックスの異常な分解が起こることも知られている。 この細胞外マトリックスの分 解に関与する酵素の作用を調節することにより、 これらの疾患の治療薬となる可 能性がある。
ADAM (A disintegrin and metal lopro tease) ファミリータンパク質は、 出血性 蛇毒に類似した構造を持ち、 メタ口プロテアーゼ領域及びディスインテグリン領 域等からなる。 ADAMファミリータンパク質の多くは膜タンパク質であり、 種々の 生物から 10個以上の cDNAが単離されている （T. G. Wolfsberg et al. , journal of Cell Biology 131:275-278, 1995) 。 ADAM タンパク質の生理的機能としては 細胞融合、 細胞分化、 生体防御等に関与することが知られている。 すなわち、 精 子上で発現する ADAMである fertilinはディスィンテグリン領域を介して卵子上 のインテグリン α 6 β 1と結合し、卵子と精子の結合に関与する（D. Myles et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:4195-4198, 1994) 。 mel trinのデイスインテグ リン領域は筋細胞の融合に関与することが報告されている （T. Yagami-Hiromasa et al. , Nature 377:652-656, 1995) 。 また、 ショウジヨウバエの ADAMタンパク 質である KUZは神経分化に関与する (J. Rooke et al., Science 273:1227-1230, 1996) 。 また、 TNF-α convertase (R. A. Blacket al., Nature 385:729-733, 1997) や ADAM 10 (C. A. Lunn et al. , FEBS letter 400:333-335, 1997)では膜に結合し た TNF- a前駆体を切断し分泌型に変換することが報告されている。
新たなヒト由来 ADAMファミリータンパク質は、その活性を調節する作用を有し、 その活性に基づく種々の疾患、 例えば慢性関節リゥマチや変形性関節症などの関 節疾患の予防や治療に役立つ新たな医薬品の開発を可能にする。 したがって、 本 発明の分野ではヒト由来の新規な ADAMタンパク質を見出し、大量に生産する方法 の開発が望まれていた。 発明の開示
本発明者らは、 上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、 新規な塩 基配列を有する ADAM遺伝子を見出し、 それにコードされる ADAMタンパク質がプ 口テア一ゼ活性を有し、 さらに細胞外マトリックスの分解にも関与することを見 出した。
本発明者は、 これらの知見を基づいて、 さらに検討を重ねた結果、 本発明を完 成するに至った。
すなわち、 本発明は、
(1) 配列番号： 2で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を有するタンパク質またはその塩、
(2) 配列番号： 2で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列をデイスインテグリン領域として有する前記 （1) 記載のタンパク質又 はその塩、
(3) ADAMファミリーに属する前記 （1) 記載のタンパク質またはその塩、
(4) 配列番号： 1または配列番号： 1 5で表されるアミノ酸配列と同一もしく は実質的に同一のアミノ酸配列を有する前記 （1) 記載のタンパク質またはその
(5) プロテアーゼ活性を有する前記 （1) 記載のタンパク質またはその塩、 (6) 配列番号： 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を有する前記 （1) 記載のタンパク質の部分ペプチドまたはその塩、
(7) 配列番号： 2で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を有するタンパク質をコードする塩基配列を有する DN Aを有する DN A、
(8)配列番号： 3または配列番号： 16で表される塩基配列を有する前記 （7) 記載の DNA、
(9) 前記 （6) 記載の部分ペプチドをコードする DN Aを有する DNA、
(10) 配列番号： 4で表される塩基配列を有する前記 （9) 記載の DNA、 (1 1) 前記 （7) 記載の DN Aを有する組換えベクター、
(12) 前記 （11) 記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体、
(13) 前記 （12) 記載の形質転換体を培養し、 前記 （1) 記載のタンパク質を 生成せしめることを特徴とする前記 （1) 記載のタンパク質またはその塩の製造 法、
(14) 前記 （1) 記載のタンパク質もしくは前記 （6) 記載の部分ペプチドま たはその塩に対する抗体、
(15) 前記 （7) 記載の DNAまたは前記 （14) 記載の抗体を含有してなる 診断薬、
(16) 前記 （1) 記載のタンパク質もしくは前記 （6) 記載の部分ペプチドま たはその塩を含有してなる剤、
(17) 前記 （1) 記載のタンパク質もしくは前記 （6) 記載の部分ペプチドま たはその塩を含有してなる医薬、
(18) 椎間板ヘルニア、 坐骨神経痛、 糸球体腎炎、 糖尿病性腎症、 肝繊維症、 肺繊維症または大理石病の予防 ·治療剤である前記 （17) 記載の医薬、 (19) 前記 （1) 記載のタンパク質またはその塩を用いることを特徴とする、 プロテアーゼ活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方 法、
(20) 前記 （1) 記載のタンパク質またはその塩を含有してなる、 プロテア一 ゼ活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット、 (21) 前記 （19) 記載のスクリーニング方法または前記 （20) 記載のスク リ一ニング用キットを用いて得られうる、 プロテアーゼ活性を促進または阻害す る化合物またはその塩、
(22) 前記 （19) 記載のスクリーニング方法または前記 （20) 記載のスク リーニング用キットを用いて得られうるプロテア一ゼ活性を促進または阻害する 化合物またはその塩を含有してなる医薬、
(23) 配列番号： 5で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を有するタンパク質またはその塩を含有してなる細胞外マトリックス 分解剤、
(24) 細胞外マトリックスがプロテオダリカンである前記 （23) 記載の剤、 (25) 医薬組成物である前記 （23) 記載の剤、
(26) 椎間板ヘルニア、 坐骨神経痛、 糸球体腎炎、 糖尿病性腎症、 肝繊維症、 肺繊維症もしくは大理石病の予防 ·治療剤である前記 （23) 記載の剤、
(27) 配列番号： 5で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を有するタンパク質またはその塩を用いることを特徴とする、 細胞外 マトリックス分解酵素活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリ一 ニング方法、
(28) 配列番号： 5で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を有するタンパク質またはその塩を含有してなる、 細胞外マトリック ス分解酵素活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キ ッ卜。
(29) 前記 （27) 記載のスクリーニング方法または前記 （28) 記載のスク リーニング用キットを用いて得られうる、 細胞外マトリックス分解酵素活性を促 進または阻害する化合物またはその塩、
(30) 前記 （27) 記載のスクリーニング方法または前記 （28) 記載のスク リーニング用キットを用いて得られうる、 細胞外マトリックス分解酵素活性を促 進または阻害する化合物またはその塩を含有してなる医薬、
(31) 配列番号： 5で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を有するタンパク質またはその塩に対する抗体を含有してなる診断薬、 (32) 被検遺伝子を導入した組換え体と動物由来の軟骨あるいは軟骨基質産生 細胞を混合培養し、 培養上清中の硫酸化ダリコサミノダリカンを測定することを 特徴とするプロテオグリカン分解酵素遺伝子を検出する方法、
(33) (i) プロテオグリカン分解酵素活性を有するタンパク質をコードする遺 伝子を導入した組換え体、 （ii) 動物由来の軟骨または軟骨基質産生細胞および (iii)被検物を混合培養し、培養上清中の硫酸化グリコサミノダリカンを測定す ることを特徴とする、 プロテオダリ力ン分解酵素の活性阻害剤あるいは活性促進 剤のスクリーニング方法、
(34) (i)①前記 7記載の DNAまたは②配列番号： 5で表されるアミノ酸配列 と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードする 塩基配列を有する DNAを含有する DNA、 を含有する動物細胞、 （ii) 動物由来の 軟骨または軟骨基質産生細胞および（iii)被検物を混合培養し、 上清中の硫酸化 グリコサミノダリカン量を測定することを特徴とするプロテオダリカン分解酵素 の活性阻害剤あるいは活性促進剤のスクリ一ニング方法、
(35) 配列番号： 2で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を有するタンパク質をコードする塩基配列を有する DNAを有する D N Aまたはその変異 DN Aを有する非ヒト哺乳動物、
(36) 配列番号： 2で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を有するタンパク質を発現しうる前記 （35) 記載の動物などを提供 する。
さらには、 本発明は、
(37) 配列番号： 2で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列が、 配列番号： 2で表されるアミノ酸配列と約 95%以上、 好ましくは約 98%以上 の相同性を有するアミノ酸配列である前記 （1) 記載のタンパク質、
(38) 配列番号： 2で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列が、 ①配列番号： 2で表されるアミノ酸配列中の 1〜5個 （好ましくは、 1〜3個） のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、 ②配列番号： 2で表されるアミノ酸配列に 1-5 (好ましくは、 1〜3個） のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、 ③配列番 号： 2で表されるアミノ酸配列中の 1〜5個以上 （好ましくは、 1〜3個） のァ ミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、 または④それらを組み合わせ たアミノ酸配列である前記 （1) 記載のタンパク質、
(39) 前記 （7) または （9) 記載の DNAをコードする塩基配列とハイストリン ジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有する D N Aを含有する D N A、
(40) 前記 （39) 記載の DNAを含有する組換えべクタ一、
(41) 前記 （40) 記載の組換えべクタ一で形質転換させた形質転換体、
(42) 前記 （41) 記載の形質転換体を培養し、 前記 （39) 項記載の DNA にコードされるタンパク質を生成し、 蓄積せしめ、 これを採取することを特徴と する前記 （39) 記載の DNAでコードされるタンパク質またはその塩の製造法、
(43) 前記 （42) 記載の製造法で製造される、 前記 （39) 記載の DNAで コ一ドされるタンパク質またはその塩，
(44) (i) 前記 （1) 記載のタンパク質、 前記 （6) 項記載の部分ペプチド またはそれらの塩に基質を接触させた場合と、 （Π) 前記 （1) 記載のタンパク 質、 前記 （6) 記載の部分ペプチドまたはそれらの塩に基質および試験化合物を 接触させた場合における、 プロテアーゼ活性を測定し、 比較することを特徴とす る前記 （19) 項記載のスクリーニング方法、
(45) 前記 （19) 項記載のスクリーニング方法または前記 （20) 項記載の スクリーニング用キットを用いて得られる、 前記 （1) 記載のタンパク質、 前記 (6) 項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩のプロテア一ゼ活性を促進する化 合物またはその塩を含有してなる医薬、
(46) 椎間板ヘルニア、 坐骨神経痛、 糸球体腎炎、 糖尿病性腎症、 肝繊維症、 肺繊維症または大理石病の治療 ·予防剤である前記 （45) 記載の医薬、
(47) 前記 （19) 記載のスクリーニング方法または前記 （20) 記載のスク リーニング用キットを用いて得られる、 前記 （1) 記載のタンパク質、 前記 （6) 記載の部分ペプチドまたはそれらの塩のプロテア一ゼ活性を阻害する化合物また はその塩を含有してなる医薬、
(48) 慢性関節リウマチ、 変形性関節症、 骨粗鬆症、 癌、 動脈硬化、 角膜潰瘍 の治療 ·予防剤である前記 （47) 記載の医薬、 (49) 前記 （14) 記載の抗体と、 被検液および標識化された前記 （1) 記載 のタンパク質、 前記 （4) 記載の部分ペプチドまたはそれらの塩とを競合的に反 応させ、 該抗体に結合した標識化された前記 （1) 記載のタンパク質、 前記 （4) 記載の部分ペプチドまたはそれらの塩の割合を測定することを特徴とする被検液 中の前記 （1) 記載のタンパク質、 前記 （6) 項記載の部分ペプチドまたはそれ らの塩の定量法、
(50) 被検液と担体上に不溶化した前記 （14) 項記載の抗体および標識化さ れた前記 （14) 記載の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、 不溶化 担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の前記 （1) 記載の タンパク質、 前記 （6) 項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩の定量法、
(51) 前記 （14) 項記載の抗体を含有してなる医薬、
(52) 前記 （7) 、 (9) または （39) 記載の DNAに相補的または実質的 に相補的な塩基配列を有し、 該 DN Aの発現を抑制し得る作用を有するアンチセ ンス DNA、
(53) 前記 （7) 、 (9) または （39) 項記載の D N Aに実質的に相補的な 塩基配列が、 該 D N Aに相補的な塩基配列の全塩基配列あるいは部分塩基配列と 約 95%以上、好ましくは約 98%以上の相同性を有する塩基配列である前記（5 2) 記載のアンチセンス DNA、
(54) 前記 （52) 記載のアンチセンス DN Aを含有してなる医薬、
(55) 配列番号： 5で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的にアミノ酸 配列を含有するタンパク質またはその塩に対する抗体と被検液および標識化され た配列番号： 5で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的にァミノ酸配列を 含有するタンパク質またはその塩とを競合的に反応させ、 該抗体に結合した標識 化された配列番号： 5で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的にアミノ酸 配列を含有するタンパク質またはその塩の割合を測定することを特徴とする被検 液中の配列番号： 5で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的にアミノ酸配 列を含有するタンパク質またはその塩の定量法、
(56) 被検液と担体上に不溶化した配列番号： 5で表されるアミノ酸配列と同 一もしくは実質的にアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩に対する抗 体および標識化された配列番号： 5で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質 的にアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩に対する抗体をとを同時あ るいは連続的に反応させたのち、 不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを 特徴とする被検液中の配列番号： 5で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質 的にアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩の定量法、
( 5 7 ) 配列番号： 5で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的にアミノ酸 配列を含有するタンパク質またはその塩に対する抗体を含有してなる医薬などを 提供する。 図面の簡単な説明
図 1は本発明の AD AMファミリ一に属するタンパク質をコ一ドする D N Aの 塩基配列とそれにコードされるアミノ酸配列を示す （図 2に続く） 。
図 2は本発明の AD AMファミリーに属するタンパク質をコードする D N Aの 塩基配列とそれにコードされるアミノ酸配列を示す （図 1の続き） 。
図 3は本発明の AD AMファミリーに属するタンパク質をコードする D NAの 塩基配列とそれにコードされるアミノ酸配列を示す （図 4に続く） 。
図 4は本発明の AD AMファミリーに属するタンパク質をコードする D N Aの 塩基配列とそれにコードされるアミノ酸配列を示す （図 3の続き） 。
図 5は実施例 9で作成したベクター （PTB2076) の構築図を示す。 発明を実施するための最良の形態
本発明の配列番号： 1、 配列番号： 2、 配列番号： 5または配列番号： 1 5で 表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有する夕 ンパク質 （以下、 本発明のタンパク質と称する） は、 ヒトゃ温血動物 （例えば、 モルモット、 ラット、 マウス、 ニヮトリ、 ゥサギ、 ブ夕、 ヒッジ、 ゥシ、 サルな ど） の細胞 （例えば、 肝細胞、 脾細胞、 神経細胞、 グリア細胞、 滕臓 i3細胞、 骨 髄細胞、 メサンギゥム細胞、 ランゲルハンス細胞、 表皮細胞、 上皮細胞、 内皮細 胞、 繊維芽細胞、 繊維細胞、 筋細胞、 脂肪細胞、 免疫細胞 （例、 マクロファージ、 T細胞、 B細胞、 ナチュラルキラー細胞、 肥満細胞、 好中球、 好塩基球、 好酸球、 単球） 、 巨核球、 滑膜細胞、 軟骨細胞、 骨細胞、 骨芽細胞、 破骨細胞、 乳腺細胞、 肝細胞もしくは間質細胞、 またはこれら細胞の前駆細胞、 幹細胞もしくはガン細 胞など） もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、 例えば、 脳、 脳の各部 位 （例、 嗅球、 扁桃核、 大脳基底球、 海馬、 視床、 視床下部、 大脳皮質、 延髄、 小脳） 、 脊髄、 下垂体、 胃、 塍臓、 腎臓、 肝臓、 生殖腺、 甲状腺、 胆のう、 骨髄、 副腎、 皮膚、 筋肉、 肺、 消化管 （例、 大腸、 小腸） 、 血管、 心臓、 胸腺、 脾臓、 顎下腺、 末梢血、 前立腺、 睾丸、 卵巣、 胎盤、 子宮、 骨、 関節、 骨格筋など、 ま たは血球系の細胞もしくはその培養細胞 （例えば、 MEL, Ml, CTLL-2, HT- 2, WEH I— 3， HL- 60, J OSK - 1, K 562, ML - 1， M OLT- 3, MOLT— 4, MOLT— 10， CCRF— CEM, TALL— 1， J u r k a t , CCRT-HS B- 2, KE- 37, SKW - 3, HUT— 78， HUT- 102, H9， U 937, THP— 1, HEL, JK— 1, CMK, K O- 8 12, MEG— 0 1など） に由来するタンパク質であってもよく、 合成夕 ンパク質であってもよい。
配列番号： 1、 配列番号： 2、 配列番号： 5または配列番号： 15で表わされ るアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、 それぞれ配列番号： 1、 配列番号： 2、 配列番号： 5または配列番号： 1 5で表わされるアミノ酸配列と 約 95 %以上、 好ましくは約 98 %以上の相同性を有するァミノ酸配列などが挙 げられる。
特に、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列 としては、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列の第 428〜437番目のァ ミノ酸配列を有するアミノ酸配列、 配列番号： 2で表わされるアミノ酸配列と実 質的に同一のアミノ酸配列としては、 配列番号： 2で表わされるアミノ酸配列の 第 29〜 38番目のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列、 配列番号： 1 5で表わ されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、 配列番号： 1 5で 表わされるアミノ酸配列の第 428〜437番目のアミノ酸配列を有するァミノ 酸配列などが挙げられる。
本発明の配列番号： 1、 配列番号： 2、 配列番号： 5または配列番号： 1 5で 表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質とし ては、 例えば、 前記の配列番号： 1、 配列番号： 2、 配列番号： 5または配列番 号： 1 5で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、 配列 番号： 1、 配列番号： 2、 配列番号： 5または配列番号： 1 5で表わされるアミ ノ酸配列を有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好 ましい。
本明細書中、 プロテアーゼ様活性とは、 例えばペプチド結合を切断（加水分解） する活性などを意味する。
本発明中、 細胞外マトリックス分解酵素活性とは、 コラーゲン、 エラスチン、 プロテオグリカン、 フイブロネクチン、 ラミニン、 ヒアルロン酸などからなる組 織の細胞を取り巻く細胞支持組織を分解する酵素活性、 特にプロテオダリカンを 分解する酵素活性 （プロテオグリカン分解酵素活性） などを意味する。
実質的に同質の活性としては、 例えば、 プロテアーゼ活性、 細胞外マトリック ス分解酵素活性 （好ましくはプロテオダリカン分解酵素活性） などが挙げられる。 実質的に同質とは、 それらの活性が性質的に （例、 生理化学的に、 または薬理学 的に） 同質であることを示す。 したがって、 プロテアーゼ活性、 細胞外マトリツ クス分解酵素活性 （好ましくはプロテオダリカン分解酵素活性） などの活性が同 等 （例、 約 0 . 1〜 1 0 0倍、 好ましくは約 0 . 5〜 1 0倍、 より好ましくは 0 , 5〜2倍） であることが好ましいが、 これらの活性の程度、 タンパク質の分子量 などの量的要素は異なっていてもよい。
プロテア一ゼ活性の測定は、 自体公知の方法に準じて行なうことができるが、 例えば、 後述するスクリーニング方法に従つて測定することができる。
プロテオダリ力ン分解酵素活性を指標とした細胞外マトリックス分解酵素活性 の測定は、 例えば後述の実施例 6記載の方法に従って測定することができる。 また、 本発明のタンパク質としては、 例えば、 ①配列番号： 1、 配列番号： 2、 配列番号： 5または配列番号： 1 5で表わされるアミノ酸配列中の 1〜 5 (好ま しくは、 1〜3個） のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、 ②配列番号： 1、 配列 番号： 2、 配列番号： 5または配列番号： 1 5で表わされるアミノ酸配列に 1〜 5 (好ましくは、 1〜3個） のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、 ③配列番号： 1、 配列番号： 2、 配列番号： 5または配列番号： 1 5で表わされるアミノ酸配 列に 1〜5個 （好ましくは、 1〜3個） のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、 ④配列番号： 1、 配列番号： 2、 配列番号： 5または配列番号： 15で表わされ るアミノ酸配列中の 1〜 5個 （好ましくは、 1〜3個） のアミノ酸が他のアミノ 酸で置換されたァミノ酸配列、 または⑤それらを組み合わせたアミノ酸配列を含 有するタンパク質などのいわゆるムティンも含まれる。
上記のようにアミノ酸配列が挿入、 欠失または置換されている場合、 その挿入、 欠失または置換の位置としては、 特に限定されない。
また、 挿入、 欠失または置換の位置としては、 配列番号： 1または配列番号： 15で表わされるアミノ酸配列のうち、 第 1 19番目の V a 1〜495番目の P h e以外の位置または第 336番目の Th r〜350番目の As p以外の位置な どがあげられる。
配列番号： 2で表わされるアミノ酸配列は、 配列番号： 1で表わされるァミノ 酸配列の第 400番目 （Le u) 〜第 495番目 （Phe) のアミノ酸配列に相 当し、 配列番号： 5で表わされるアミノ酸配列は、 配列番号： 1で表わされるァ ミノ酸配列の第 199番目 （Va 1) 〜第 399番目 （P r o) のアミノ酸配列 に相当する。
本明細書におけるタンパク質は、ペプチド標記の慣例に従って左端が N末端（ァ ミノ末端） 、 右端が C末端 （カルボキシル末端） である。 配列番号： 1、 配列番 号： 2、 配列番号： 5または配列番号： 15で表わされるアミノ酸配列を含有す るタンパク質をはじめとする、 本発明のタンパク質は、 C末端が通常カルボキシ ル基 （― COOH) またはカルボキシレート（—C〇〇一） である力 C末端がァ ミド （一 CONH2) またはエステル （一 COOR) であってもよい。
ここでエステルにおける Rとしては、 例えば、 メチル、 ェチル、 n—プロピル、 イソプロピルもしくは n—ブチルなどの C丄—6アルキル基、 例えば、 シクロべ ンチル、 シクロへキシルなどの C 3— 8シクロアルキル基、 例えば、 フエニル、 ひ一ナフチルなどの C 6—丄 2ァリール基、 例えば、 ベンジル、 フエネチルなど のフエ二ルー C I— 2アルキル基もしくはひ—ナフチルメチルなどのひ一ナフチ ルー C 1— 2アルキル基などの C 7- 14ァラルキル基のほか、 経口用エステル として汎用されるビバ口ィルォキシメチル基などが用いられる。 本発明のタンパク質が C末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート） を有している場合、 力ルポキシル基がアミド化またはエステル化されているもの も本発明のタンパク質に含まれる。 この場合のエステルとしては、 例えば上記し た C末端のエステルなどが用いられる。
さらに、 本発明のタンパク質には、 N末端のアミノ酸残基 （例、 メチォニン残 基） のァミノ基が保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチル基などの 一 6アル カノィルなどの C丄— 6ァシル基など） で保護されているもの、 生体内で切断さ れて生成する N末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、 分子内の アミノ酸の側鎖上の置換基 （例えば— OH、 一 S H、 アミノ基、 イミダゾ一ル基、 インドール基、 グァニジノ基など） が適当な保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセ チル基などの C丄— 6アルカノィル基などの C ;L一 6ァシル基など） で保護され ているもの、 あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク 質なども含まれる。
本発明のタンパク質の具体例としては、例えば、配列番号： 1または配列番号： 1 5で表わされるアミノ酸配列を有するヒト由来のタンパク質 （図 1および図 2 または図 3および図 4 ) などが用いられる。
本発明の夕ンパク質の部分べプチドとしては、 前記した本発明の夕ンパク質の 部分ペプチドであって、 好ましくは、 前記した本発明のタンパク質と同様の活性 (例、 プロテアーゼ活性、 細胞外マトリックス分解酵素活性 （好ましくはプロテ ォグリカン分解酵素活性） を有するものであればいずれのものでもよい。 例えば、 本発明のタンパク質の構成アミノ酸配列中の少なくとも 2 0 %以上、 好ましくは 5 0 %以上、 さらに好ましくは 7 0 %以上、 より好ましくは 9 0 %以上、 最も好 ましくは 9 5 %以上のアミノ酸配列を有し、 プロテアーゼ活性、 細胞外マトリツ クス分解酵素活性 （好ましくはプロテオダリカン分解酵素活性） を有するぺプチ ドなどが用いられる。
これらペプチドの中でも、 例えば、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列の 第 2 8〜 3 7番目のアミノ酸配列 （配列番号： 8で表わされるアミノ酸配列） を 有するァミノ酸配列を含有するべプチドなどが用いられる。
また、 配列番号： 8で表わされるアミノ酸配列および配列番号： 2で表わされ るァミノ酸配列を有するペプチドなども好適である。
また、 本発明の部分ペプチドは、 そのアミノ酸配列中の 1〜5個 （好ましくは、 1〜 3個のアミノ酸が欠失し、 または、 そのアミノ酸配列に 1〜 5個 （好ましく は、 1〜3個） のアミノ酸が付加し、 または、 そのアミノ酸配列に 1〜 5個 （好 ましくは、 1〜 3個のアミノ酸が揷入され、 または、 そのアミノ酸配列中の 1〜 5個 （好ましくは、 1〜3個のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。 また、 本発明の部分ペプチドは C末端が通常カルボキシル基 （一 C O O H) ま たはカルボキシレート （一 C O O一） である力 前記した本発明のタンパク質のご とく、 C末端がアミド （― C〇NH 2 ) またはエステル （—C O O R) であって もよい。
さらに、 本発明の部分ペプチドには、 前記した本発明のタンパク質と同様に、 N末端のアミノ酸残基 （例、 メチォニン残基） のァミノ基が保護基で保護されて いるもの、 N端側が生体内で切断され生成したグルタミン残基がピログルタミン 酸化したもの、 分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されて いるもの、 あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなど も含まれる。
本発明の部分べプチドは抗体作成のための抗原として用いることができるので、 必ずしもプロテア一ゼ活性、 細胞外マトリックス分解酵素活性 （好ましくはプロ テオダリカン分解酵素活性） を有する必要はない。
本発明のタンパク質または部分ペプチドの塩としては、 生理学的に許容される 酸 （例、 無機酸、 有機酸） や塩基 （例、 アルカリ金属塩） などとの塩が用いられ、 とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。 この様な塩としては、 例え ば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸） との塩、 あるいは有機 酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒 石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスル ホン酸） との塩などが用いられる。
本発明のタンパク質またはその塩は、 前述したヒトゃ温血動物の細胞または組 織から自体公知のタンパク質の精製方法によつて製造することもできるし、 後述 するタンパク質をコードする D N Aを含有する形質転換体を培養することによつ ても製造することができる。 また、 後述のペプチド合成法に準じて製造すること もできる。
ヒトゃ哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、 ヒトゃ哺乳動物の組織ま たは細胞をホモジナイズした後、 酸などで抽出を行ない、 該抽出液を逆相クロマ トグラフィー、 イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み 合わせることにより精製単離することができる。
本発明のタンパク質、 部分ペプチド、 もしくはそれらの塩、 またはそれらのァ ミド体の合成には、 通常市販のタンパク質合成用樹脂を用いることができる。 そ のような樹脂としては、 例えば、 クロロメチル樹脂、 ヒドロキシメチル樹脂、 ベ ンズヒドリルァミン樹脂、 アミノメチル樹脂、 4—ベンジルォキシベンジルアル コール樹脂、 4—メチルベンズヒドリルァミン樹脂、 PAM樹脂、 4—ヒドロキシメ チルメチルフエニルァセトアミドメチル樹脂、 ポリアクリルアミド樹脂、 4— 4' -ジメトキシフエ二ル一ヒドロキシメチル）フエノキシ樹脂、 4一 (2' , 4' - ジメトキシフエ二ルー Fmocアミノエチル） フエノキシ樹脂などを挙げることがで きる。 このような樹脂を用い、 α—ァミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミ ノ酸を、 目的とするタンパク質の配列通りに、 自体公知の各種縮合方法に従い、 樹脂上で縮合させる。 反応の最後に樹脂からタンパク質を切り出すと同時に各種 保護基を除去し、 さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィ ド結合形成反応を実施 し、 目的のタンパク質またはそれらのアミド体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、 タンパク質合成に使用できる各種活 性化試薬を用いることができるが、 特に、 カルポジイミド類がよい。 カルボジィ ミド類としては、 DC N, Ν' -ジイソプロピルカルポジイミド、 Ν-ェチル -Ν' - (3- ジメチルァミノプロリル） カルポジイミドなどが用いられる。 これらによる活性 化にはラセミ化抑制添加剤 （例えば、 HOBt, HOOBt)とともに保護アミノ酸を直接 樹脂に添加するかまたは、対称酸無水物または HOB tエステルあるいは HOOB tエステ ルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することが できる。
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、 タンパク質 縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。 例えば、 N, N—ジメチルホルムアミド， N， N—ジメチルァセトアミド， N—メチルビ 口リドンなどの酸アミド類、 塩化メチレン， クロ口ホルムなどのハロゲン化炭化 水素類、 トリフルォロエタノールなどのアルコール類、 ジメチルスルホキシドな どのスルホキシド類、 ピリジン， ジォキサン， テトラヒドロフランなどのエーテ ル類、 ァセトニトリル， プロピオ二トリルなどの二トリル類、 酢酸メチル， 酢酸 ェチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。 反応 温度はタンパク質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜 選択され、 通常約一 2 0 °C〜5 0 °Cの範囲から適宜選択される。 活性化されたァ ミノ酸誘導体は通常 1 . 5〜 4倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテ ストの結果、 縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行なうことなく縮合反応を 繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。 反応を繰り返しても十分 な縮合が得られないときには、 無水酢酸またはァセチルイミダゾールを用いて未 反応ァミノ酸をァセチル化することによって、 後の反応に影響を与えないように することができる。
原料のァミノ基の保護基としては、 例えば、 Z、 Boc、 t—ペンチルォキシカル ポニル、 イソボルニルォキシカルボニル、 4ーメ卜キシベンジルォキシカルポ二 ル、 Π-Ζ、 Br- Ζ、 ァダマンチルォキシカルボニル、 トリフルォロアセチル、 フタ ロイル、 ホルミル、 2—二トロフエニルスルフエ二ル、 ジフエニルホスフイノチ オイル、 Fmocなどが用いられる。
カルボキシル基は、 例えば、 アルキルエステル化 （例えば、 メチル、 ェチル、 プロピル、 ブチル、 t—ブチル、 シクロペンチル、 シクロへキシル、 シクロヘプ チル、 シクロォクチル、 2—ァダマンチルなどの直鎖状、 分枝状もしくは環状ァ ルキルエステル化） 、 ァラルキルエステル化 （例えば、 ベンジルエステル、 4一 ニトロべンジルエステル、 4ーメトキシベンジルエステル、 4一クロ口べンジル エステル、 ベンズヒドリルエステル化） 、 フエナシルエステル化、 ベンジルォキ シカルボニルヒドラジド化、 t—ブトキシカルポニルヒドラジド化、 トリチルヒ ドラジド化などによつて保護することができる。
セリンの水酸基は、 例えば、 エステル化またはエーテル化によって保護するこ とができる。 このエステル化に適する基としては、 例えば、 ァセチル基などの低 級 （C ;L — 6 ) アルカノィル基、 ベンゾィル基などのァロイル基、 ベンジルォキ シカルポニル基、 エトキシカルポニル基などの炭酸から誘導される基などが用い られる。 また、 エーテル化に適する基としては、 例えば、 ベンジル基、 テトラヒ ドロビラニル基、 t-ブチル基などである。
チロシンのフエノール性水酸基の保護基としては、 例えば、 Bz l、 C l 2-Bz l、 2 —ニトロベンジル、 Br- Z、 t —ブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、 Tos、 4 -メトキシ- 2， 3, 6- トリメチルベンゼンスルホニル、 DNP、 ベンジルォキシメチル、 Bum、 Boc、 Tr t、 Fmocなどが用いられる。
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、 例えば、 対応する酸無水 物、アジド、活性エステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフエノール、 2， 4, 5- トリクロ口フエノール、 2, 4 -ジニトロフエノール、 シァノメチルアルコール、 パ ラニトロフエノール、 H0NB、 N-ヒドロキシスクシミド、 N-ヒドロキシフタルイミ ド、 HOB t ) とのエステル〕 などが用いられる。 原料のァミノ基の活性化されたも のとしては、 例えば、 対応するリン酸アミドが用いられる。
保護基の除去 （脱離） 方法としては、 例えば、 ？3—黒ぁるぃは？01 -炭素など の触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、 また、 無水フッ化水素、 メタン スルホン酸、 トリフルォロメ夕ンスルホン酸、 トリフルォロ酢酸あるいはこれら の混合液などによる酸処理や、 ジイソプロピルェチルァミン、 トリェチルァミン、 ピぺリジン、 ピぺラジンなどによる塩基処理、 また液体アンモニア中ナトリウム による還元なども用いられる。 上記酸処理による脱離反応は、 一般に約 _ 2 0 °C 〜4 0 の温度で行なわれるが、 酸処理においては、 例えば、 ァニソ一ル、 フエ ノール、 チオアニソ一ル、 メタクレゾール、 パラクレゾール、 ジメチルスルフィ ド、 1， 4 -ブタンジチオール、 1 , 2 -エタンジチオールなどのようなカチオン捕捉剤 の添加が有効である。 また、 ヒスチジンのイミダゾ一ル保護基として用いられる 2, 4-ジニト口フエニル基はチォフエノ一ル処理により除去され、 トリブトファン のィンドール保護基として用いられるホルミル基は上記の 1, 2-エタンジチオール、 1, 4-ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、 希水酸化ナト リウム溶液、 希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。 原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、 およびその保護 基の脱離、 反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から 適宜選択しうる。
タンパク質のアミド体を得る別の方法としては、 例えば、 まず、 カルボキシ末 端アミノ酸の α _力ルポキシル基をアミド化して保護した後、 アミノ基側にぺプ チド （タンパク質） 鎖を所望の鎖長まで延ばした後、 該ペプチド鎖の Ν末端の α ーァミノ基の保護基のみを除いたタンパク質と C末端のカルボキシル基の保護基 のみを除去したタンパク質とを製造し、 この両タンパク質を上記したような混合 溶媒中で縮合させる。 縮合反応の詳細については上記と同様である。 縮合により 得られた保護タンパク質を精製した後、 上記方法によりすベての保護基を除去し、 所望の粗夕ンパク質を得ることができる。 この粗夕ンパク質は既知の各種精製手 段を駆使して精製し、 主要画分を凍結乾燥することで所望のタンパク質のアミド 体を得ることができる。
タンパク質のエステル体を得るには、 例えば、 カルボキシ末端アミノ酸の α— カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、 タン パク質のアミド体と同様にして、 所望のタンパク質のエステル体を得ることがで さる。
本発明の部分べプチドまたはその塩は、 自体公知のぺプチドの合成法に従って、 あるいは本発明のタンパク質を適当なぺプチダーゼで切断することによって製造 することができる。 ペプチドの合成法としては、 例えば、 固相合成法、 液相合成 法のいずれによっても良い。 すなわち、 本発明の部分ペプチドを構成し得る部分 ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、 生成物が保護基を有する場 合は保護基を脱離することにより目的のぺプチドを製造することができる。 公知 の縮合方法や保護基の脱離としては、 例えば、 以下の①〜⑤に記載された方法が 挙げられる。
① M. Bodanszky および M. A. Onde t t i , ペプチド · シンセシス （Pept i de Synthes i s) , Intersc i ence Pub l i shers, New York (1966年)
② Schroederおよび Luebke、ザ'ぺプチド (The Pept i de) , Academi c Press, New York (1965年） ③泉屋信夫他、 ペプチド合成の基礎と実験、 丸善 (株） （1975年）
④矢島治明 および榊原俊平、 生化学実験講座 1、 タンパク質の化学 IV、 205、 (1977年)
⑤矢島治明監修、 続医薬品の開発、 第 14巻、 ペプチド合成、 広川書店
また、 反応後は通常の精製法、 例えば、 溶媒抽出 ·蒸留 ·カラムクロマトグラ フィ一♦液体クロマトグラフィー ·再結晶などを組み合わせて本発明の部分ぺプ チドを精製単離することができる。 上記方法で得られる部分べプチドまたはシグ ナルペプチドが遊離体である場合は、 公知の方法あるいはそれに準じる方法によ つて適当な塩に変換することができるし、 逆に塩で得られた場合は、 公知の方法 あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。 本発明のタンパク質をコードする D N Aとしては、 前述した本発明のタンパク 質をコ一ドする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。 また、 ゲノム D N A、 ゲノム D NAライブラリー、 前記した細胞 ·組織由来の c D NA、 前記した細胞 ·組織由来の c D N Aライブラリー、 合成 D N Aのいずれ でもよい。
ライブラリ一に使用するベクターは、 パクテリオファ一ジ、 プラスミド、 コス ミド、 ファージミドなどいずれであってもよい。 また、 前記した細胞 ·組織より total R N Aまたは m R N A画分を調製したものを用いて直接 Reverse Transcr iptase Po lymerase Chain Reac t ion (以下、 R T- P C R法と略称する） によって増幅することもできる。
本発明のタンパク質をコードする D NAとしては、 例えば、 ①配列番号： 3で 表わされる塩基配列を含有する D N A、 または配列番号： 3で表わされる塩基配 列とハイストリンジェン卜な条件下でハイブリダィズする塩基配列を有し、 本発 明のタンパク質と実質的に同質の活性 （例、 プロテア一ゼ活性、 細胞外マトリツ クス分解酵素活性 （好ましくはプロテオダリカン分解酵素活性） など） を有する タンパク質をコードする D NA、 ②配列番号： 4で表わされる塩基配列を含有す る D NA、 または配列番号： 4で表わされる塩基配列とハイストリンジェン卜な 条件下でハイブリダィズする塩基配列を有し、 本発明のタンパク質と実質的に同 質の活性 （例、 プロテア一ゼ活性、 細胞外マトリックス分解酵素活性 （好ましく はプロテオダリカン分解酵素活性） など） を有るタンパク質をコードする D NA、 ③配列番号： 1 6で表わされる塩基配列を含有する D N A、 または配列番号： 1 6で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイプリダイズする 塩基配列を有し、 本発明のタンパク質と実質的に同質の活性 （例、 プロテア一ゼ 活性、 細胞外マトリックス分解酵素活性 （好ましくはプロテオダリカン分解酵素 活性） など） を有るタンパク質をコードする D NA、 であれば何れのものでもよ い。
配列番号： 3、 配列番号： 4または配列番号： 1 6のいずれかの配列番号で表 わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダィズできる D N Aとしては、 例えば、 それぞれ配列番号： 3、 配列番号： 4または配列番号： 1 6のいずれかの配列番号で表わされる塩基配列と約 9 5 %以上、 好ましくは約 9 8 %以上の相同性を有する塩基配列を含有する D N Aなどが用いられる。
八イブリダィゼーシヨンは、 自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、 例え ば、 モレキュラー 'クロ一ニング（Mo l ecul ar Cloning) 2 nd (J. Sambrook e t al. , Cold Spr ing Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行なうことが できる。 また、 市販のライブラリーを使用する場合、 添付の使用説明書に記載の 方法に従って行なうことができる。 より好ましくは、 ハイストリンジェントな条 件に従って行なうことができる。
ハイストリンジェントな条件とは、 例えば、 ナトリウム濃度が約 1 9〜4 0 m M、 好ましくは約 1 9〜 2 0 mMで、 温度が約 5 0〜 7 0 °C、 好ましくは約 6 0 〜6 5 °Cの条件を示す。 特に、 ナトリウム濃度が約 1 9 mMで温度が約 6 5での 場合が最も好ましい。
より具体的には、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列を有するタンパク質 をコードする D N Aとしては、 配列番号： 3で表わされる塩基配列を有する D N Aなどが、 配列番号： 2で表わされるアミノ酸配列を有するタンパク質をコード する D N Aとしては、 配列番号： 4で表わされる塩基配列を有する D NAなどが、 配列番号： 1 5で表わされるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする D N Aとしては、 配列番号： 1 6で表わされる塩基配列を有する D NAなどが用いら れる。 本発明の部分ペプチドをコードする DNAとしては、 前述した本発明の部分べ プチドをコ一ドする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよ い。 また、 ゲノム DNA、 ゲノム DNAライブラリ一、 前記した細胞 ·組織由来 の cDNA、 前記した細胞 '組織由来の c DNAライブラリ一、 合成 DNAのい ずれでもよい。
本発明の部分ペプチドをコードする DNAとしては、 例えば、 ①配列番号： 3 で表わされる塩基配列を有する DN Aの部分塩基配列を有する DNA、 または配 列番号： 3で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダ ィズする塩基配列を有し、 本発明のタンパク質と実質的に同質の活性を有する夕 ンパク質をコードする DN Aの部分塩基配列を有する DNA、 ②配列番号： 4で 表わされる塩基配列を有する D N Aの部分塩基配列を有する D N A、 または配列 番号： 4で表わされる塩基配列とハイストリンジェン卜な条件下でハイブリダィ ズする塩基配列を有し、 本発明の実質的に同質の活性を有するタンパク質をコ一 ドする DNAの部分塩基配列を有する DNA、 ③配列番号： 16で表わされる塩 基配列を有する DNAの部分塩基配列を有する DNA、 または配列番号： 16で 表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダィズする塩基 配列を有し、 本発明の実質的に同質の活性を有するタンパク質をコードする DN Aの部分塩基配列を有する D N Aなどが用いられる。
配列番号： 3、 配列番号： 4または配列番号： 16のいずれかの配列番号で表 わされる塩基配列とハイブリダィズできる DNAは、 前記と同意義を示す。 ハイブリダイゼ一ションの方法およびハイストリンジェントな条件は前記と同 様のものが用いられる。
本発明のタンパク質または部分ペプチド （以下、 これらタンパク質等をコード する DNAのクロ一ニングおよび発現の説明においては、 これらタンパク質等を 単に本発明のタンパク質と略記する） を完全にコードする DNAのクロ一ニング の手段としては、 本発明のタンパク質の部分塩基配列を有する合成 DN Aプライ マーを用いて PC R法によって増幅するか、 または適当なベクターに組み込んだ DN Aを本発明のタンパク質の一部あるいは全領域をコードする DN A断片もし くは合成 D N Aを用いて標識したものとのハイブリダイゼーシヨンによつて選別 することができる。 ハイブリダィゼーシヨンの方法は、 例えば、 モレキュラー ' クローニンク (Molecular Cloning) 2nd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行なうことができる。 また、 巿販 のライブラリーを使用する場合、 添付の使用説明書に記載の方法に従って行なう ことができる。
DNAの塩基配列の変換は、公知のキット、例えば、 Mutant™-G (宝酒造（株） )、 Mutant™-K (宝酒造 （株） ） などを用いて、 Gupped duplex法や Kunkel法などの自 体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことができる。
クロ一ン化されたタンパク質をコードする DNAは目的によりそのまま、 また は所望により制限酵素で消化したり、 リンカ一を付加したりして使用することが できる。 該 DN Aはその 5' 末端側に翻訳開始コドンとしての AT Gを有し、 ま た 3' 末端側には翻訳終止コドンとしての TAA、 TGAまたは TAGを有して いてもよい。 これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、 適当な合成 DNAァ ダブ夕一を用いて付加することもできる。
本発明のタンパク質の発現ベクターは、 例えば、 （ィ） 本発明のタンパク質を コードする DNAから目的とする DNA断片を切り出し、 （口） 該 DNA断片を 適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造すること ができる。
ベクターとしては、 大腸菌由来のプラスミド （例、 pBR322， p BR 32 5， pUC 12, pUC 13) 、 枯草菌由来のプラスミド （例、 pUB 1 10， TP 5, p C 194) 、 酵母由来プラスミド （例、 p SH 19， p SH 15) 、 λファ一ジなどのバクテリオファージ、 レトロウイルス， ワクシニアウィルス， バキュロウィルスなどの動物ウィルスなどの他、 pAl— 1 1、 pXT l、 pR cZCMV、 pRc/RS V, p c DNA I e oなどが用いられる。
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応 して適切なプロモー夕一であればいかなるものでもよい。 例えば、 動物細胞を宿 主として用いる場合は、 SRひプロモーター、 SV40プロモータ一、 LTRプ 口モー夕—、 CMVプロモータ一、 HSV-TKプロモーターなどが挙げられる。
これらのうち、 CMV (サイトメガロウィルス） プロモー夕一、 SRo:プロモ 一夕一などを用いるのが好ましい。 宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 t r pプロモーター、 l a cプロモー夕一、 r e cAプロモ一夕一、 λ PLプロモー夕 一、 l p pプロモー夕一、 T 7プロモーターなどが、 宿主がバチルス属菌である 場合は、 SPO lプロモータ一、 SPO 2プロモーター、 p e nPプロモータ一 など、 宿主が酵母である場合は、 PH〇5プロモー夕一、 PGKプロモ一夕一、 GAPプロモータ一、 ADHプロモーターなどが好ましい。 宿主が昆虫細胞であ る場合は、 ポリヘドリンプロモーター、 P 10プロモーターなどが好ましい。 発現べクタ一には、 以上の他に、 所望によりェンハンサ一、 スプライシングシ グナル、 ポリ A付加シグナル、 選択マーカー、 SV40複製オリジン （以下、 S V40 o r iと略称する場合がある） などを含有しているものを用いることがで きる。 選択マーカ一としては、 例えば、 ジヒドロ葉酸還元酵素 （以下、 dh f r と略称する場合がある） 遺伝子 〔メソトレキセート （MTX) 耐性〕 、 アンピシ リン耐性遺伝子 （以下、 Amp rと略称する場合がある） 、 ネオマイシン耐性遺 伝子 （以下、 Ne o 1 "と略称する場合がある、 G418耐性） 等が挙げられる。 特に、 dh f r遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用いて dh f r遺伝子 を選択マーカーとして使用する場合、 目的遺伝子をチミジンを含まない培地によ つても選択できる。
また、 必要に応じて、 宿主に合ったシグナル配列を、 本発明のタンパク質の N 端末側に付加する。 宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 PhoA ·シグナル配列、 0即 A ·シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、 α—アミラーゼ · シグナル配列、 サブチリシン ·シグナル配列などが、 宿主が酵母である場合は、 MF ·シグナル配列、 SUC2 ·シグナル配列など、 宿主が動物細胞である場 合には、 インシュリン ·シグナル配列、 α—イン夕一フエロン ·シグナル配列、 抗体分子 · シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築された本発明のタンパク質をコードする DNAを含有する ベクターを用いて、 形質転換体を製造することができる。
宿主としては、 例えば、 ェシエリヒア属菌、 バチルス属菌、 酵母、 昆虫細胞、 昆虫、 動物細胞などが用いられる。
ェシエリヒア属菌の具体例としては、例えば、ェシエリヒア *コリ（Escherichia coli) K 12 · DH 1 〔プロシ一ジングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー · ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ユーエスェ一 （Pro atl. Acad. Sci. US A) , 60巻， 160 (1968)〕 ， JM103 〔ヌクイレック ·ァシッズ' リ サーチ， （Nucleic Acids Research) , 9巻， 309 (1981)] ， J A221 〔ジャーナル ·ォブ 'モレキュラー ·バイオロジー （Journal of Molecular Biology) 〕 ， 120巻， 5 1 7 (1 978)〕 ， HB 10 1 〔ジャーナル ·ォブ · モレキュラー ·バイオロジー， 41巻， 459 (1969)〕 ， C 600 〔ジエネ ティックス （Genetics) ， 39巻， 440 (1 954)〕 などが用いられる。
バチルス属菌としては、 例えば、 バチルス ·サブチルス (Bacillus subtilis) M I 1 14 〔ジーン， 24卷， 255 (1983)〕 ， 207 - 21 〔ジャーナル · ォブ 'バイオケミストリ— （Journal of Biochemistry) ， 95巻， 87 (198 4)〕 などが用いられる。
酵母としては、 例えば、 サッカロマイセス セレピシェ （Saccharomyces cerevisiae) AH22, AH22R— , ΝΑ87 - 1 1 A, DKD— 5D， 20 B— 12、 シゾサッカロマイセス ボンべ （Schizosaccharomyces pombe) NC Y C 1913, NCYC 2036, ピキア パストリス （Pichia pastoris) KM 7 1などが用いられる。
昆虫細胞としては、 例えば、 ウィルスが Ac NPVの場合は、 夜盗蛾の幼虫由 来株化細胞 (Spodoptera frugiperda cell ； S f細胞) 、 Tr ichoplusia niの中腸 由来の MG 1細胞、 Trichoplusia niの卵由来の High FiveTM細胞、 Mamestra brassicae由来の細胞または Estigmena acrea由来の細胞などが用いられる。 ウイ ルスが BmNP Vの場合は、 蚕由来株化細胞 （Bombyxmori N細胞； BmN細胞） などが用いられる。 該 S f細胞としては、 例えば、 S f 9細胞 （ATCC CRL1711) 、 S f 21細胞（以上、 Vaughn, J. L.ら、イン'ヴイボ（In Vivo), 13, 213-217, (1977)) などが用いられる。
昆虫としては、 例えば、 カイコの幼虫などが用いられる 〔前田ら、 ネィチヤ一 (Nature) ， 31 5巻， 592 (1 985)〕 。
動物細胞としては、 例えば、 サル細胞 COS— 7 (COS 7) , Vero, チヤィ ニーズハムスター細胞 CH〇 （以下、 CHO細胞と略記） ， dh f r遺伝子欠損 チャイニーズハムスター細胞 CHO (以下、 CH〇 （dh f r— ) 細胞と略記） ， マウス L細胞， マウス At T— 20, マウスミエ口一マ細胞， ラット GH3, ヒ ト FL細胞などが用いられる。
ェシエリヒア属菌を形質転換するには、例えば、 プロシ一ジングズ 'ォブ 'ザ · ナショナル 'アカデミー'ォブ ·サイェンジィズ 'ォブ ·ザ ·ュ一エスェ一（Proc. Natl. Acad. Sci. USA) ， 69巻， 21 10 (1972)やジーン （Gene) ， 1 7巻， 107 (1982)などに記載の方法に従って行なうことができる。
バチルス属菌を形質転換するには、 例えば、 モレキュラー ·アンド ·ジエネラ ル ·ジェネティックス （Molecular & General Genetics) , 168巻， 1 1 1 (1 979)などに記載の方法に従って行なうことができる。
酵母を形質転換するには、例えば、 メソッズ'イン.ェンザィモロジ一（Methods inEnzymology) , 194巻， 182— 187 ( 1991 ) 、 プロシージングズ' ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ュ一ェ スェ一 （Pro Natl. Acad. Sci. USA) ， 75巻， 1929 (1978) など に記載の方法に従って行なうことができる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、 例えば、 バイオ Zテクノロジ一
(Bio/Technology) , 6, 47-55 (1988)) などに記載の方法に従って行なうことがで さる。
動物細胞を形質転換するには、 例えば、 細胞工学別冊 8 新細胞工学実験プロ 卜コール. 263— 267 ( 1995) (秀潤社発行）、 ヴィロロジ一（Virology)， 52巻， 456 (1973)に記載の方法に従って行なうことができる。
このようにして、 タンパク質をコ一ドする DNAを含有する発現べクタ一で形 質転換された形質転換体を得ることができる。
宿主がェシエリヒア属菌、 バチルス属菌である形質転換体を培養する際、 培養 に使用される培地としては液体培地が適当であり、 その中には該形質転換体の生 育に必要な炭素源、 窒素源、 無機物その他が含有せしめられる。 炭素源としては、 例えば、 グルコース、 デキストリン、 可溶性澱粉、 ショ糖など、 窒素源としては、 例えば、 アンモニゥム塩類、 硝酸塩類、 コーンスチープ · リカ一、 ペプトン、 力 ゼイン、 肉エキス、 大豆粕、 バレイショ抽出液などの無機または有機物質、 無機 物としては、 例えば、 塩化カルシウム、 リン酸二水素ナトリウム、 塩化マグネシ ゥムなどが挙げられる。 また、 酵母、 ビタミン類、 生長促進因子などを添加して もよい。 培地の pHは約 5〜 8が望ましい。
ェシエリヒア属菌を培養する際の培地としては、 例えば、 グルコース、 カザミ ノ酸を含む M 9培地〔ミラー （Miller) ， ジャーナル ·ォブ'ェクスペリメンッ · ィン ·モレキュラー ·ジエネティックス （Journal of Experiments in Molecular Genetics) ， 43 1—433， Cold Spring Harbor Laboratory, New York 19 72〕 が好ましい。 ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、 例えば、 3 —インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。
宿主がェシエリヒア属菌の場合、 培養は通常約 1 5〜43°Cで約 3〜24時間 行ない、 必要により、 通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、 培養は通常約 30〜 40 °Cで約 6〜 24時間行な レ 必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 バークホ 一ルダー（Burkholder)最小培地〔Bostian, K. L. ら、 プロシージングズ ·ォブ · ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ユーエスエー (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 77卷， 4505 (1980)〕 や 0. 5% カザミノ酸を含有する SD培地 〔Bitter, G. A. ら、 プロシ一ジングズ ·ォブ · ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ュ一エスエー (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) ， 8 1巻， 5330 ( 1984) 〕 が挙げら れる。 培地の pHは約 5〜8に調整するのが好ましい。 培養は通常約 20°C〜3 5°Cで約 24〜72時間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、 培地としては、 Grace's Insect Medium (Grace, T. ，ネィチヤ一 (Nature) , 195, 788(1962)) に非動化した 10%ゥシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。 培 地の pHは約 6. 2〜6. 4に調整するのが好ましい。 培養は通常約 27°Cで約 3〜5日間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 約 5 〜20 %の胎児牛血清を含む MEM培地 〔サイエンス （Seience)， 122巻， 5 01 (1952)〕 ， DMEM培地 〔ヴイロロジ一 （Virology) , 8巻， 396 (1 959)〕 ， RPMI 1640培地 〔ジャーナル 'ォブ ·ザ ·アメリカン 'メデ イカル 'アソシエーション (The Jounal of the American Medical Association) 199巻， 519 (1967)〕 ， 199培地 〔プロシ一ジング ·ォブ ·ザ ·ソサ イエティ ·フォー ·ザ ·バイオロジカル ·メディスン （Proceedingof the Society for the Biological Medicine) , 73巻， 1 (1950)〕 などが用いられる。 p Hは約 6〜 8であるのが好ましい。 培養は通常約 30°C〜40°Cで約 15〜60 時間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
以上のようにして、 形質転換体の細胞膜に本発明のタンパク質を生成せしめる ことができる。
上記培養物から本発明のタンパク質を分離精製するには、 例えば、 下記の方法 により行なうことができる。
本発明のタンパク質を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、 培養後、 公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、 これを適当な緩衝液に懸濁し、 超音波、 リゾチームおよび または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したの ち、 遠心分離やろ過により夕ンパク質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられ る。 緩衝液の中に尿素や塩酸グァニジンなどの蛋白質変性剤や、 トリトン X— 1 0 θΤΜなどの界面活性剤が含まれていてもよい。 培養液中にタンパク質が分泌 される場合には、 培養終了後、 それ自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清と を分離し、 上清を集める。
このようにして得られた培養上清、 あるいは抽出液中に含まれるタンパク質の 精製は、 自体公知の分離 ·精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。 こ れらの公知の分離、 精製法としては、 塩析ゃ溶媒沈澱法などの溶解度を利用する 方法、 透析法、 限外ろ過法、 ゲルろ過法、 および SDS—ポリアクリルアミドゲ ル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、 イオン交換クロマトグ ラフィ一などの荷電の差を利用する方法、 ァフィ二ティークロマトグラフィーな どの特異的親和性を利用する方法、 逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水 性の差を利用する方法、 等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法など が用いられる。 かくして得られるタンパク質が遊離体で得られた場合には、 自体公知の方法あ るいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、 逆に塩で得られた場 合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、 遊離体または他の塩に 変換することができる。
なお、 組換え体が産生するタンパク質を、 精製前または精製後に適当な蛋白修 飾酵素を作用させることにより、 任意に修飾を加えたり、 ポリペプチドを部分的 に除去することもできる。 蛋白修飾酵素としては、 例えば、 トリプシン、 キモト リブシン、 アルギニルエンドべプチダ一ゼ、 プロテインキナーゼ、 グリコシダー ゼなどが用いられる。
かくして生成する本発明のタンパク質またはその塩の存在または活性は、 標識 したリガンドとの結合実験および特異抗体を用いたェンザィムィムノアツセィな どにより測定することができる。
本発明のタンパク質、 部分ペプチドまたはそれらの塩に対する抗体は、 本発明 のタンパク質、 部分ペプチドまたはそれらの塩を認識し得る抗体であれば、 ポリ クロ一ナル抗体、 モノクローナル抗体の何れであってもよい。
本発明のタンパク質、 部分ペプチドまたはそれらの塩 （以下、 抗体の説明にお いては、 これらタンパク質等を単に本発明のタンパク質と略記する） に対する抗 体は、 本発明のタンパク質を抗原として用い、 自体公知の抗体または抗血清の製 造法に従つて製造することができる。
〔モノクローナル抗体の作製〕
( a ) モノクロナール抗体産生細胞の作製
本発明のタンパク質は、 温血動物に対して投与により抗体産生が可能な部位に それ自体あるいは担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体産生能を 高めるため、 完全フロイントアジュバントゃ不完全フロイントアジュバントを投 与してもよい。 投与は通常 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計 2〜 1 0回程度行われる。 用いられる温血動物としては、 例えば、 サル、 ゥサギ、 ィヌ、 モルモット、 マウ ス、 ラット、 ヒッジ、 ャギ、 ニヮトリが挙げられるが、 マウスおよびラットが好 ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、 抗原で免疫された温血動物、 例えばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の 2〜 5日後に脾臓 またはリンパ節を採取し、 それらに含まれる抗体産生細胞を同種または異種動物 の骨髄腫細胞と融合させることにより、 モノクローナル抗体産生ハイプリドーマ を調製することができる。 抗血清中の抗体価の測定は、 例えば、 後記の標識化夕 ンパク質と抗血清とを反応させたのち、 抗体に結合した標識剤の活性を測定する ことにより行なうことができる。 融合操作は既知の方法、 例えば、 ケーラーとミ ルスタインの方法 〔ネイチヤー （Nature)、 256、 495 (1975)) に従い実施するこ とができる。 融合促進剤としては、 例えば、 ポリエチレングリコール （PEG) やセンダイウィルスなどが挙げられるが、 好ましくは P E Gが用いられる。 骨髄腫細胞としては、 例えば、 NS— 1、 P 3U1、 SP 2/0、 AP— 1な どの温血動物の骨髄腫細胞が挙げられるが、 P 3U 1が好ましく用いられる。 用 いられる抗体産生細胞 （脾臓細胞） 数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は 1 ： 1 〜20 ： 1程度であり、 PEG (好ましくは PEG 1000〜PEG6000) が 10〜 80 %程度の濃度で添加され、 20〜 40 °C、 好ましくは 30〜 37 °C で 1〜10分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。 モノクローナル抗体産生ハイプリドーマのスクリーニングには種々の方法が使 用できるが、 例えば、 タンパク質抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固 相 （例、 マイクロプレート） にハイプリドーマ培養上清を添加し、 次に放射性物 質や酵素などで標識した抗免疫グロプリン抗体 （細胞融合に用いられる細胞がマ ウスの場合、 抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる） またはプロテイン Aを 加え、 固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、 抗免疫グロブリン抗 体またはプロテイン Aを吸着させた固相にハイプリドーマ培養上清を添加し、 放 射性物質や酵素などで標識したタンパク質を加え、 固相に結合したモノクローナ ル抗体を検出する方法などが挙げられる。
モノクローナル抗体の選別は、 自体公知あるいはそれに準じる方法に従って行 なうことができる。 通常 HAT (ヒポキサンチン、 アミノプテリン、 チミジン） を添加した動物細胞用培地で行なうことができる。 選別および育種用培地として は、 ハイプリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。 例 えば、 1〜20%、好ましくは 10〜20%の牛胎児血清を含む RPM I 164 0培地、 1〜1 0 %の牛胎児血清を含む G I T培地 （和光純薬工業 （株） ） ある いはハイプリドーマ培養用無血清培地 （S F M— 1 0 1、 日水製薬 （株） ) など を用いることができる。 培養温度は、 通常 2 0〜4 0 °C、 好ましくは約 3 で ある。 培養時間は、 通常 5日〜 3週間、 好ましくは 1週間〜 2週間である。 培養 は、 通常 5 %炭酸ガス下で行なうことができる。 ハイプリドーマ培養上清の抗体 価は、 上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
( b ) モノクロナール抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、 自体公知の方法、 例えば、 免疫グロブリン の分離精製法 〔例、 塩析法、 アルコール沈殿法、 等電点沈殿法、 電気泳動法、 ィ オン交換体 （例、 D E A E) による吸脱着法、 超遠心法、 ゲルろ過法、 抗原結合 固相あるいはプロテイン Aあるいはプロテイン Gなどの活性吸着剤により抗体の みを採取し、 結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕 に従って行なうことが できる。
〔ポリクローナル抗体の作製〕
本発明のポリクロ一ナル抗体は、 それ自体公知あるいはそれに準じる方法に従 つて製造することができる。 例えば、 免疫抗原 （タンパク質抗原） 自体、 あるい はそれとキャリア一蛋白質との複合体をつくり、 上記のモノクローナル抗体の製 造法と同様に温血動物に免疫を行ない、 該免疫動物から本発明のタンパク質に対 する抗体含有物を採取して、 抗体の分離精製を行なうことにより製造することが できる。
温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアー蛋白質との複合体 に関し、 キャリアー蛋白質の種類およびキャリア一とハプテンとの混合比は、 キ ャリア一に架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、 どの 様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、 例えば、 ゥシ血清アルブミンや ゥシサイログロブリン、 へモシァニン等を重量比でハプテン 1に対し、 約 0 . 1 〜2 0、 好ましくは約 1〜5の割合でカプルさせる方法が用いられる。
また、 ハプテンとキャリアーの力プリングには、 種々の縮合剤を用いることが できるが、 ダルタルアルデヒドやカルポジイミド、 マレイミド活性エステル、 チ オール基、 ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。 縮合生成物は、 温血動物に対して、 抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは 担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体産生能を高めるため、 完全 フロイントアジュバン卜や不完全フロイントアジュバン卜を投与してもよい。 投 与は、 通常約 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計約 3〜 10回程度行なわれる。
ポリクローナル抗体は、 上記の方法で免疫された温血動物の血液、 腹水など、 好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、 上記の抗血清中の抗体価の測定と 同様にして測定できる。 ポリクローナル抗体の分離精製は、 上記のモノクロ一ナ ル抗体の分離精製と同様の免疫グロプリンの分離精製法に従って行なうことがで きる。
本発明のタンパク質または部分ペプチドをコードする DNA (以下、 アンチセ ンス DNAの説明においては、 これらの DNAを本発明の DNAと略記する） に 相補的な、 または実質的に相補的な塩基配列を有するァンチセンス D N Aとして は、 本発明の DNAに相補的な、 または実質的に相補的な塩基配列を有し、 該 D N Aの発現を抑制し得る作用を有するものであれば、 いずれのアンチセンス DN Aであってもよい。
本発明の DNAに実質的に相補的な塩基配列とは、 例えば、 本発明の DNAに 相補的な塩基配列 （すなわち、 本発明の DN Aの相補鎖） の全塩基配列あるいは 部分塩基配列と約 70%以上、好ましくは約 80%以上、より好ましくは約 90% 以上、 最も好ましくは約 95%以上の相同性を有する塩基配列などが挙げられる。 特に、 本発明の DNAの相補鎖の全塩基配列うち、 本発明のタンパク質の N末端 部位をコードする部分の塩基配列 （例えば、 開始コドン付近の塩基配列など） の 相補鎖と約 70%以上、 好ましくは約 80%以上、 より好ましくは約 90%以上、 最も好ましくは約 95%以上の相同性を有するアンチセンス DNAが好適である。 これらのアンチセンス DNAは、 公知の DN A合成装置などを用いて製造するこ とができる。
以下に、 本発明のタンパク質、 部分ペプチドまたはそれらの塩 （以下、 本発明 のタンパク質等と略記する場合がある） 、 本発明のタンパク質または部分べプチ ドをコードする DNA (以下、 本発明の DNAと略記する場合がある） 、 本発明 のタンパク質、 部分ペプチドまたはそれらの塩に対する抗体 （以下、 本発明の抗 体と略記する場合がある） 、 およびアンチセンス D N Aの用途を説明する。
( 1 ) 本発明のタンパク質が関与する各種疾病の治療 ·予防剤
本発明の夕ンパク質は細胞外マトリックスの分解 （特にプロテオグリ力ンの分 解） に寄与しているので、 本発明のタンパク質をコードする D NAに異常があつ たり、 欠損している場合、 例えば、 椎間板ヘルニア、 坐骨神経痛、 糸球体腎炎、 糖尿病性腎症、 肝繊維症、 肺繊維症または大理石病などの種々の疾病が発症する 可能性が高い。
したがって、 本発明のタンパク質等および本発明の D N Aは、 例えば、 椎間板 ヘルニア、 坐骨神経痛、 糸球体腎炎、 糖尿病性腎症、 肝繊維症、 肺繊維症または 大理石病などの種々の疾病の治療 ·予防剤などの医薬として使用することができ る。
例えば、 生体内において本発明のタンパク質が減少あるいは欠損している患者 がいる場合に、 （ィ） 本発明の D NAを該患者に投与し、 生体内で本発明のタン パク質等を発現させることによって、 （口） 細胞に本発明の D N Aを挿入し、 本 発明のタンパク質等を発現させた後に、 該細胞を患者に移植することによって、 または （八） 本発明のタンパク質等を該患者に投与することなどによって、 該患 者における本発明のタンパク質等の役割を十分に、 あるいは正常に発揮させるこ とができる。
本発明の D N Aを上記の治療 ·予防剤として使用する場合は、 該 D NAを単独 あるいはレトロウイルスベクター、 アデノウイルスベクタ一、 アデノウイルスァ ソシェ一テツドウィルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、 常套手段 に従って、 ヒトまたは温血動物に投与することができる。 本発明の D NAは、 そ のままで、 あるいは摂取促進のための補助剤などの生理学的に認められる担体と ともに製剤化し、 遺伝子銃やハイド口ゲルカテーテルのようなカテ一テルによつ て投与できる。
本発明のタンパク質等を上記の治療 ·予防剤として使用する場合は、 少なくと も 9 0 %、 好ましくは 9 5 %以上、 より好ましくは 9 8 %以上、 さらに好ましく は 9 9 %以上に精製されたものを使用するのが好ましい。 本発明のタンパク質等は、 例えば、 必要に応じて糖衣を施した錠剤、 カプセル 剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤などとして経口的に、 あるいは水もしく はそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、 または懸濁液剤などの注射 剤の形で非経口的に使用できる。 例えば、 本発明のタンパク質等を生理学的に認 められる担体、 香味剤、 賦形剤、 べヒクル、 防腐剤、 安定剤、 結合剤などととも に一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって 製造することができる。 これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当 な容量が得られるようにするものである。
錠剤、 カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、 例えば、 ゼラ チン、 コーンスターチ、 トラガント、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セル ロースのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸などのような膨 化剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖またはサッカリ ンのような甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油またはチェリーのような香味剤な どが用いられる。 調剤単位形態がカプセルである場合には、 前記タイプの材料に さらに油脂のような液状担体を含有することができる。 注射のための無菌組成物 は注射用水のようなべヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油などのような天然産 出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方するこ とができる。
注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬を 含む等張液 （例えば、 D _ソルビ] ル、 D—マンニトール、 塩化ナトリウムな ど） などが挙げられ、 適当な溶解補助剤、 例えば、 アルコール （例えば、 ェ夕ノ ールなど） 、 ポリアルコール （例えば、 プロピレングリコール、 ポリエチレング リコールなど） 、 非イオン性界面活性剤 （例えば、 ポリソルベート 8 0 TM、 H C O— 5 0など） などと併用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆 油などが挙げられ、 溶解補助剤として安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールな どと併用してもよい。 また、 緩衝剤 （例えば、 リン酸塩緩衝液、 酢酸ナトリウム 緩衝液など） 、 無痛化剤（例えば、 塩化ベンザルコニゥム、塩酸プロ力インなど） 、 安定剤 （例えば、 ヒト血清アルブミン、 ポリエチレングリコールなど） 、 保存剤 (例えば、 ベンジルアルコール、 フエノールなど） 、 酸化防止剤などと配合して もよい。 調製された注射液は、 通常、 適当なアンプルに充填される。
本発明の DNAが挿入されたベクターも上記と同様に製剤化され、 通常、 非経 口的に使用される。
このようにして得られる製剤は、 安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトまた は温血動物 （例えば、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 トリ、 ヒッジ、 ブ 夕、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 チンパンジーなど） に対して投与すること ができる。
本発明のタンパク質等の投与量は、 対象疾患、 投与対象、 投与ルートなどによ り差異はあるが、 例えば、 糖尿病性腎症の治療目的で本発明のタンパク質等を経 口投与する場合、 一般的に成人 （60 kgとして） においては、 一日につき該夕 ンパク質等を約 0, lmg〜 10 Omg、 好ましくは約 1. 0〜5 Omg、 より好 ましくは約 1. 0〜20mg投与する。 非経口的に投与する場合は、 該夕ンパク 質等の 1回投与量は投与対象、 対象疾患などによっても異なるが、 例えば、 糖尿 病性腎症の治療目的で本発明のタンパク質等を注射剤の形で成人 （体重 6 O kg として） に投与する場合、 一日につき該タンパク質等を約 0. 01〜30mg程 度、 好ましくは約 0. 1〜2 Omg程度、 より好ましくは約 0. l〜10mg程 度を患部に注射することにより投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 60 k g当たりに換算した量を投与することができる。
(2) 疾病に対する医薬候補化合物のスクリーニング
本発明のタンパク質等はプロテアーゼ活性及び Zまたは細胞外マトリックス (特にプロテオダリカン） 分解酵素活性を有するため、 本発明のタンパク質等の 機能 （例、 プロテアーゼ活性、 細胞外マトリックス分解酵素活性 （好ましくはプ 口テオダリカン分解酵素活性） など） を促進する化合物またはその塩は、 椎間板 ヘルニア、 坐骨神経痛、 糸球体腎炎、 糖尿病性腎症、 肝繊維症、 肺繊維症または 大理石病など疾病の治療 ·予防剤などの医薬として使用できる。
一方、 本発明のタンパク質等の機能を阻害する化合物またはその塩は、 慢性関 節リウマチ、 変形性関節症、 骨粗鬆症、 動脈硬化、 角膜潰瘍 （好ましくはプロテ ォグリカン分解酵素活性） などの治療 ·予防剤などの医薬として使用できる。 したがって、 本発明のタンパク質等は、 本発明のタンパク質等の機能を促進ま たは阻害する化合物またはその塩のスクリ一ニングのための試薬として有用であ る。
すなわち、 本発明は、
①本発明のタンパク質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩を用いることを特徴 とする本発明のタンパク質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩の機能 （例えば、 プロテアーゼ活性、 細胞外マトリックス分解酵素活性 （好ましくはプロテオダリ カン分解酵素活性） など） を促進する化合物もしくはその塩 （以下、 促進剤と略 記する場合がある） 、 または本発明のタンパク質、 その部分ペプチドまたはそれ らの塩の機能を阻害する化合物 （以下、 阻害剤と略記する場合がある） のスクリ —ニング方法を提供し、 より具体的には、 例えば、
② （ i) 本発明のタンパク質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩に基質を接触 させた場合と （ii) 本発明のタンパク質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩に 基質および試験化合物を接触させた場合との比較を行なうことを特徴とする促進 剤または阻害剤のスクリーニング方法を提供する。
具体的には、 上記スクリーニング方法においては、 例えば、 （ i) と （ii) の 場合における、 本発明のタンパク質等のプロテアーゼ活性、 細胞外マトリックス 分解酵素活性 （好ましくはプロテオダリカン分解酵素活性） を測定して、 比較す ることを特徴とするものである。
本発明のタンパク質等のプロテアーゼ活性は、 自体公知の方法、 例えば、 H. agase, メソッズ イン ェンザィモロジ一 （Methods in Enzymology) 、 248卷、 449-470 (1995) に記載の方法あるいはそれに準じる方法 （具体的には後述の実 施例 4に記載の方法など） などに従つて測定することができる。
基質としては、 例えば、 ペプチドなど （より具体的には、 後述の実施例 4に記 載の MOCAc -Ar g-P r o-Ly s -P r o-Ty r-A l a -N v a - Tr p— Me t— Ly s (DNP) — NH2、 ペプチド研究所 社製など） などが用 いられる。
試験化合物としては、 例えば、 ペプチド、 タンパク、 非ペプチド性化合物、 合 成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液などが挙げら れ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物であってもよ い。
上記のスクリーニング方法を実施するには、 本発明のタンパク質等を、 スクリ 一二ングに適したバッファーに懸濁することにより本発明のタンパク質等の標品 を調製する。 バッファ一には、 pH約 4〜10 (望ましくは、 pH約 6〜8) の リン酸バッファ一、 トリス—塩酸バッファーなどの、 本発明のタンパク質等と基 質との反応を阻害しないバッファ一であればいずれでもよい。
例えば、 上記 （ii) の場合におけるプロテアーゼ活性が上記 （ i) の場合に比 ベて、 約 20%以上、 好ましくは 30%以上、 より好ましくは約 50%以上上昇 させる試験化合物を本発明のタンパク質等のプロテアーゼ活性を促進する化合物 として、 一方、 上記 （ii) の場合におけるプロテアーゼ活性等が上記 （ i) の場 合に比べて、 約 20%以上、 好ましくは 30%以上、 より好ましくは約 50%以 上阻害する試験化合物を本発明のタンパク質等のプロテア一ゼ活性を阻害する化 合物として選択することができる。
本発明のタンパク質等の細胞外マトリックス分解酵素活性 （特にプロテオグリ カン分解酵素活性） は、 本発明のタンパク質をコードする塩基配列を有する DN Aを含有する DN Aを含有する組換え体と動物由来の軟骨あるいは軟骨基質産生 細胞を混合培養し、 培養上清中の硫酸化グリコサミノダリカン量を測定すること によって測定することができる。 該組換え体としては、 発現ベクターの宿主とし て上記したものに本発明のタンパク質をコードする塩基配列を有する DN Aを含 有する DNAを含有する発現ベクター （例えば、 上記の発現ベクターなど） が自 体公知の方法で組み込まれたものであり、 本発明のタンパク質を産生して、 菌体 (細胞） 外に分泌する、 あるいは細胞膜に結合するものであればいずれのもので あってもよく、 なかでも動物細胞、 昆虫細胞または酵母などが好ましく用いられ る。 特に動物細胞、 なかでも COS 7細胞が好ましく用いられる。 培養上清中の 硫酸化グリコサミノダリカンの測定方法は、 自体公知の方法、例えば、 Methods in Enzymology, 248巻、 47- 58頁、 1995年に記載の方法に準じて測定することができ る。 あるいは、 市販 （コスモバイオ） のヒトァダレカン (PG)ELISAキット等を用い て測定することもできる。
該 「動物由来の軟骨あるいは軟骨基質産生細胞」 の 「動物」 としては、 例えば、 温血動物 （例えば、 マウス、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ゥマ、 トリ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 チンパンジーなど） があげられ、 好ましくはゥシなどがあげ られる。
また、 軟骨基質産生細胞としては、 例えば動物由来の軟骨細胞、 軟骨肉腫細胞、 あるいは HCS2/8、 ATDC5などの株化細胞があげられる。
培養上清中の硫酸化ダリコサミノダリカン量が多ければ、 細胞外マトリックス 分解酵素活性 （特にプロテオグリカン分解酵素活性） が高いことを示す。 より具 体的な、 細胞外マトリックス分解酵素活性の測定方法としては、 例えば後述の実 施例 6に記載の方法等があげられる。
上記の細胞外マトリックス分解酵素活性 (特にプロテオダリ力ン分解酵素活性） を測定する方法を用いて、 例えば、
①被検遺伝子を導入した組換え体と動物由来の軟骨あるいは軟骨基質産生細胞 を混合培養し、 培養上清中の硫酸化ダリコサミノダリカンを測定することにより、 プロテオダリカン分解酵素遺伝子を検出することが可能となる。
該 「被検遺伝子」 としては、 ペプチド、 タンパク質などをコードする遺伝子で あって、 該ペプチド、 タンパク質などが組換え体により産生され、 菌体 （細胞） 外に分泌する、 あるいは細胞膜に結合するものであればいずれのものであっても よい。 プロテオグリカン分解酵素が 2つ以上の遺伝子にコードされている場合、 またプロテオダリカン分解酵素の活性化酵素が必要な場合等、 「被検遺伝子」 は 複数であってもよい。 また、 必要に応じて、 N末端に宿主にあったシグナル配列 が付加されていてもよい。
さらに、 ②プロテオダリ力ン分解酵素活性を有するタンパク質をコードする遺 伝子を導入した組換え体、 動物由来の軟骨あるいは軟骨基質産生細胞および被検 物を混合培養し、 培養上清中の硫酸化グリコサミノダリカンを測定することによ つて、 プロテオダリカン分解酵素の活性阻害剤あるいは活性促進剤をスクリー二 ングすることも可能である。
該 「プロテオダリカン分解酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を 導入した組換え体」 として好ましくは、 「本発明のタンパク質をコードする塩基 配列を有する DNAを含有する DNAを含有する動物細胞」 などがあげられ、 より好ま しくは、 「請求項 5記載の DNAまたは②配列番号： 5で表されるアミノ酸配列と同 一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードする塩基 配列を有する DNAを含有する DNAを含有する動物細胞」 などがあげられる。
該 「被検物」 としては、 例えば、 ペプチド、 タンパク、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液などがあげ られ、 これらは新規物質であっても、 公知物質であっていてもよい。
被検物を加えない場合と比べて、 培養上清中の硫酸化グリコサミノダリカン量 が増加した場合には、 被検物はプロテオグリカン分解酵素の活性促進剤と考えら れ、
被検物を加えない場合と比べて、 培養上清中の硫酸化グリコサミノダリカン量 が減少した場合には、 被検物はプロテオダリカン分解酵素の活性阻害剤と考えら れる。
また、 組換え体、 動物由来の軟骨あるいは軟骨基質産生細胞および被検物を同 時に添加して混合培養してもよいし、 あらかじめ、 組換え体と被検物を混合し、 組換え体を培養してから、 動物由来の軟骨あるいは軟骨基質産生細胞を加えて更 に混合培養を行ってもよい。 軟骨基質産生細胞の場合は、 軟骨基質が産生された 後に用いることが好ましい。 また、 動物由来の軟骨あるいは軟骨基質産生細胞を 熱処理や凍結融解などで細胞を死滅させて用いてもよい。
本発明のスクリーニング用キットは、 本発明のタンパク質、 前駆体タンパク質、 部分ペプチドまたはそれらの塩を含有するものである。 本発明のスクリーニング 用キットの例としては、 次のものが挙げられる。
〔スクリーニング用試薬〕
①測定用緩衝液
2 5 OmM トリスー塩酸 （pH 7. 5) 、 5 mM 塩化カルシウム、 I O M 塩化亜鉛
②タンパク質標品
本発明のタンパク質、 部分ペプチドまたはそれらの塩
MOCAc -Ar g-P r o-Ly s -P r o-Ty r-A l a— Nv a— T p -M e t - L y s (匿） 一 NH 2
④検出方法
蛍光強度の測定
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる 化合物またはその塩は、 上記した試験化合物、 例えば、 ペプチド、 タンパク、 非 ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組 織抽出液、血漿などから選ばれた化合物であり、本発明のタンパク質等の機能（例、 メプロテアーゼ活性、 細胞外マトリックス分解酵素活性 （好ましくはプロテオグ リカン分解酵素活性） など） を促進または阻害する化合物である。
該化合物の塩としては、 前記した本発明のタンパク質の塩と同様のものが用い られる。
本発明のタンパク質等の機能 （例、 プロテア一ゼ活性、 細胞外マトリックス分 解酵素活性 （好ましくはプロテオダリカン分解酵素活性） など） を促進する化合 物は、 例えば、 椎間板ヘルニア、 坐骨神経痛、 糸球体腎炎、 糖尿病性腎症、 肝繊 維症、 肺繊維症または大理石病などの疾病に対する治療 ·予防剤などの医薬とし て使用できる。
一方、 本発明のタンパク質等の機能を阻害する化合物は、 例えば、 慢性関節リ ゥマチ、 変形性関節症、 骨粗鬆症、 癌、 動脈硬化、 角膜潰瘍などの疾病に対する 治療 ·予防剤などの医薬として有用である。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる 化合物を上述の治療 ·予防剤として使用する場合、 常套手段に従って実施するこ とができる。 例えば、 前記した本発明のタンパク質等を含有する医薬と同様にし て、 錠剤、 カプセル剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤、 無菌性溶液、 懸濁 液剤などとすることができる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトまたは 温血動物 （例えば、 マウス、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ゥマ、 トリ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 チンパンジーなど） に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 その作用、 対象疾患、 投与対象、 投与ル一 トなどにより差異はあるが、 例えば、 糖尿病性腎症の治療目的で本発明のタンパ ク質等の機能を促進する化合物を経口投与する場合、 一般的に成人 （体重 6 O k gとして） においては、 一日につき該化合物を約 0. ：!〜 100mg、好ましくは 約 1. 0〜5 Omg、 より好ましくは約 1. 0〜2 Omg投与する。 非経口的に 投与する場合は、 該化合物の 1回投与量は投与対象、 対象疾患などによっても異 なるが、 例えば、 糖尿病性腎症の治療目的で本発明のタンパク質等の機能を促進 する化合物を注射剤の形で通常成人 （60 kgとして） に投与する場合、 一日に つき該化合物を約 0. 01〜3 Omg程度、 好ましくは約 0. l〜20mg程度、 より好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射により投与するのが好都合で ある。 他の動物の場合も、 60 kg当たりに換算した量を投与することができる。 一方、 慢性関節リウマチの治療目的で本発明のタンパク質等の機能を阻害する 化合物を経口投与する場合、 一般的に成人 （体重 6 O kgとして） においては、 一日につき該化合物を約 0. 1〜10 Omg、 好ましくは約 1. 0〜5 Omg、 よ り好ましくは約 1. 0〜20mg投与する。 非経口的に投与する場合は、 該化合 物の 1回投与量は投与対象、 対象疾患などによっても異なるが、 例えば、 慢性関 節リウマチの治療目的で本発明のタンパク質等の機能を阻害する化合物を注射剤 の形で通常成人 （6 O kgとして） に投与する場合、 一日につき該化合物を約 0. 01-30 m g程度、 好ましくは約 0. 1〜 20 m g程度、 より好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射により投与するのが好都合である。 他の動物の場合 も、 6 O kg当たりに換算した量を投与することができる。
(3) 本発明のタンパク質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩の定量
本発明のタンパク質等に対する抗体 （以下、 本発明の抗体と略記する場合があ る） は、 本発明のタンパク質等を特異的に認識することができるので、 被検波中 の本発明のタンパク質等の定量、 特にサンドイッチ免疫測定法による定量などに 使用することができる。
すなわち、 本発明は、
( i ) 本発明の抗体と、 被検液および標識化された本発明のタンパク質等とを競 合的に反応させ、 該抗体に結合した標識化された本発明のタンパク質等の割合を 測定することを特徴とする被検液中の本発明のタンパク質等の定量法、 および
(ii) 被検波と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明の別 の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、 不溶化担体上の標識剤の活性 を測定することを特徴とする被検液中の本発明の夕ンパク質等の定量法を提供す る。
上記 （U) の定量法においては、 一方の抗体が本発明のタンパク質等の N端部 を認識する抗体で、 他方の抗体が本発明のタンパク質等の C端部に反応する抗体 であることが望ましい。
また、 本発明のタンパク質等に対するモノクローナル抗体 （以下、 本発明のモ ノクローナル抗体と称する場合がある） を用いて本発明のタンパク質等の定量を 行なえるほか、 組織染色等による検出を行なうこともできる。 これらの目的には、 抗体分子そのものを用いてもよく、 また、 抗体分子の F ( a b ' ) 2 、 F a b '、 あ るいは F a b画分を用いてもよい。
本発明の抗体を用いる本発明のタンパク質等の定量法は、 特に制限されるべき ものではなく、 被測定液中の抗原量 （例えば、 タンパク質量） に対応した抗体、 抗原もしくは抗体一抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、 こ れを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法で あれば、 いずれの測定法を用いてもよい。 例えば、 ネフロメトリ一、 競合法、 ィ ムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、 感度、 特異性の 点で、 後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、 例えば、 放射性同位元 素、 酵素、 蛍光物質、 発光物質などが用いられる。 放射性同位元素としては、 例 えば、 〔1 2 5 I〕 、 〔1 3 1 I〕 、 〔3 H〕 、 〔1 4 C〕 などが用いられる。 上記酵素 としては、 安定で比活性の大きなものが好ましく、 例えば、 —ガラクトシダー ゼ、 /3—ダルコシダ一ゼ、 アルカリフォスファタ一ゼ、 パ一ォキシダ一ゼ、 リン ゴ酸脱水素酵素などが用いられる。 蛍光物質としては、 例えば、 フルォレス力ミ ン、 フルォレツセンイソチオシァネートなどが用いられる。 発光物質としては、 例えば、 ルミノール、 ルミノール誘導体、 ルシフェリン、 ルシゲニンなどが用い られる。 さらに、 抗体あるいは抗原と標識剤との結合にピオチン一アビジン系を 用いることもできる。
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、 物理吸着を用いてもよく、 また通常夕 ンパク質あるいは酵素等を不溶化、 固定化するのに用いられる化学結合を用いる 方法でもよい。 担体としては、 ァガロース、 デキストラン、 セルロースなどの不 溶性多糖類、 ポリスチレン、 ポリアクリルアミド、 シリコン等の合成樹脂、 ある いはガラス等が挙げられる。
サンドィツチ法においては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検波を 反応させ （1次反応） 、 さらに標識化した別の本発明のモノクローナル抗体を反 応させ （2次反応） たのち、 不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより 被検液中の本発明のタンパク質量を定量することができる。 1次反応と 2次反応 は逆の順序に行っても、 また、 同時に行なってもよいし時間をずらして行なって もよい。 標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。 ま た、 サンドイッチ法による免疫測定法において、 固相用抗体あるいは標識用抗体 に用いられる抗体は必ずしも 1種類である必要はなく、 測定感度を向上させる等 の目的で 2種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
本発明のサンドィツチ法による本発明のタンパク質等の測定法においては、 1 次反応と 2次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体は、 本発明のタンパ ク質等の結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。 すなわち、 1次反 応および 2次反応に用いられる抗体は、 例えば、 2次反応で用いられる抗体が、 本発明のタンパク質等の C端部を認識する場合、 1次反応で用いられる抗体は、 好ましくは C端部以外、 例えば N端部を認識する抗体が用いられる。
本発明のモノクローナル抗体をサンドイッチ法以外の測定システム、 例えば、 競合法、 ィムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることができる。 競合法では、 被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させた のち、 未反応の標識抗原（F ) と、 抗体と結合した標識抗原 （B ) とを分離し （B Z F分離） 、 B， Fいずれかの標識量を測定し、 被検液中の抗原量を定量する。 本反応法には、 抗体として可溶性抗体を用い、 B Z F分離をポリエチレングリコ ール、 前記抗体に対する第 2抗体などを用いる液相法、 および、 第 1抗体として 固相化抗体を用いるか、 あるいは、 第 1抗体は可溶性のものを用い第 2抗体とし て固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
トリック法では、 被検波中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗 体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、 あるいは、 被検液中の抗 原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、 次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗 体を固相に結合させたのち、 固相と液相を分離する。 次に、 いずれかの相の標識 量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、 ネフロメトリ一では、 ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じ た不溶性の沈降物の量を測定する。 被検液中の抗原量が僅かであり、 少量の沈降 物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーな どが好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、 特 別の条件、 操作等の設定は必要とされない。 それぞれの方法における通常の条件、 操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のタンパク質等の測定系を構 築すればよい。 これらの一般的な技術手段の詳細については、 総説、 成書などを 参照することができる。
例えば、 入江 寛編 「ラジオィムノアツセィ〕 （講談社、 昭和 49年発行） 、 入江 寛編 「続ラジオィムノアツセィ〕 （講談社、 昭和 54年発行） 、 石川栄治 ら編 「酵素免疫測定法」 （医学書院、 昭和 53年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免 疫測定法」 （第 2版） （医学書院、 昭和 57年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免疫 測定法」 (第 3版) (医学書院、昭和 62年発行）、 rMethods in ENZYMOLOGYj Vol. 70 (Immunochemical Techniques (Part A)) 、 同書 Vol. 73 (Immunochemical Techniques (Part B))、 同書 Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part C))、 同書 Vol. 84 (Immunochemical Techniques (Part D:Selected Immunoassays)) , 同書 Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part E:Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods)) 、 同 書 Vol. 121 (Immunochemical Techniques (Part I： Hybr idoma Technology and Monoclonal Antibodies)) (以上、 アカデミックプレス社発行）などを参照することができる。
以上のようにして、 本発明の抗体を用いることによって、 本発明のタンパク質 等を感度良く定量することができる。
さらには、 本発明の抗体を用いて本発明のタンパク質等の濃度を定量すること によって、 ①本発明のタンパク質等の濃度の減少が検出された場合、 例えば、 椎 間板ヘルニア、 坐骨神経痛、 糸球体腎炎、 糖尿病性腎症、 肝繊維症、 肺繊維症ま たは大理石病などの疾病である、 または将来罹患する可能性が高いと、 また②本 発明のタンパク質等の濃度の増加が検出された場合、 例えば、 慢性関節リウマチ、 変形性関節症、 骨粗鬆症、 癌、 動脈硬化、 角膜潰瘍などの疾病である、 または将 来罹患する可能性が高いと診断することができる。
また、 本発明の抗体は、 体液や組織などの被検体中に存在する本発明のタンパ ク質等を検出するために使用することができる。 また、 本発明のタンパク質等を 精製するために使用する抗体カラムの作製、 精製時の各分画中の本発明のタンパ ク質等の検出、 被検細胞内における本発明のタンパク質の挙動の分析などのため に使用することができる。
(4) 遺伝子診断剤
本発明の DN Aは、 例えば、 プローブとして使用することにより、 ヒトまたは 温血動物 （例えば、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 トリ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 チンパンジーなど） における本発明のタンパク 質またはその部分ペプチドをコードする DNAまたは mRNAの異常 （遺伝子異 常） を検出することができるので、 例えば、 該 DN Aまたは mRNAの損傷、 突 然変異あるいは発現低下や、 該 D N Aまたは m R N Aの増加あるいは発現過多な どの遺伝子診断剤として有用である。
本発明の DN Aを用いる上記の遺伝子診断は、 例えば、 自体公知のノーザンハ イブリダィゼーシヨンや PC R— S S CP法 （ゲノミックス （Genomics) , 第 5 巻， 874〜 879頁 （1 989年） 、 プロシ一ジングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナ ル 'アカデミー'ォブ'サイェンシィズ 'ォブ 'ュ一エスェ一（Proceedings of the Natinal Academy of Sciences of the United States of America) ， 第 86巻， 2766〜 2770頁 （1 989年） ） などにより実施することができる。
例えば、ノーザンハイプリダイゼ一シヨンにより発現低下が検出された場合は、 例えば、 椎間板ヘルニア、 坐骨神経痛、 糸球体腎炎、 糖尿病性腎症、 肝繊維症、 肺繊維症または大理石病などの疾病である可能性が高いと診断することができる。 一方、 ノーザンハイブリダィゼ一ションにより発現過多が検出された場合は、 例えば、 慢性関節リウマチ、 変形性関節症、 骨粗鬆症、 癌、 動脈硬化、 角膜潰瘍 などの疾病である可能性が高いと診断することができる。
また、 PCR— S SCP法により DNAの突然変異が検出された場合は、 例え ば、 椎間板ヘルニア、 坐骨神経痛、 糸球体腎炎、 糖尿病性腎症、 肝繊維症、 肺繊 維症もしくは大理石病など、 または慢性関節リウマチ、 変形性関節症、 骨粗鬆症、 癌、 動脈硬化もしくは角膜潰瘍などの疾病である可能性が高いと診断することが できる。
(5) アンチセンス DNAを含有する医薬
本発明の DN Aに相補的に結合し、 該 DN Aの発現を抑制することができるァ ンチセンス DN Aは、 生体内における本発明のタンパク質等または本発明の DN Aの機能を抑制することができるので、 例えば、 慢性関節リウマチ、 変形性関節 症、 骨粗鬆症、 癌、 動脈硬化、 角膜潰瘍などなどの治療，予防剤として使用する ことができる。
上記アンチセンス DN Aを上記の治療 ·予防剤として使用する場合、 前記した 本発明の DNAを含有する各種疾病の治療 ·予防剤と同様にして実施することが できる。
例えば、 該アンチセンス DNAを用いる場合、 該アンチセンス DNAを単独あ るいはレトロウイルスベクター、 アデノウイルスベクタ一、 アデノウイルスァソ シエーテツドウィルスベクタ一などの適当なベクタ一に挿入した後、 常套手段に 従って実施することができる。 該アンチセンス DNAは、 そのままで、 あるいは 摂取促進のために補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、 遺 伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。
さらに、 該アンチセンス DNAは、 組織や細胞における本発明の DNAの存在 やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプローブとして使用す ることもできる。
(6) 本発明の抗体を含有する医薬
本発明のタンパク質等の活性を中和する作用を有する本発明の抗体は、 例えば、 慢性関節リウマチ、変形性関節症、骨粗鬆症、癌、 動脈硬化、 角膜潰瘍などの種々 の疾病の治療 ·予防剤などの医薬として使用することができる。
本発明の抗体を含有する上記疾患の治療 ·予防剤は、 そのまま液剤として、 ま たは適当な剤型の医薬組成物として、 ヒトまたは哺乳動物 （例、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して経口的または非経口的に 投与することができる。 投与量は、 投与対象、 対象疾患、 症状、 投与ルートなど によっても異なるが、 例えば、 成人の慢性関節リウマチの治療 ·予防のために使 用する場合には、本発明の抗体を 1回量として、通常 0 . 0 1〜2 0 m g / k g体 重程度、 好ましくは 0 . 1〜 1 O m g Z k g体重程度、 さらに好ましくは 0 . 1〜 5 m g Z k g体重程度を、 1日 1〜5回程度、 好ましくは 1日 1〜3回程度、 静 脈注射により投与するのが好都合である。 他の非経口投与および経口投与の場合 もこれに準ずる量を投与することができる。 症状が特に重い場合には、 その症状 に応じて増量してもよい。
本発明の抗体は、 それ自体または適当な医薬組成物として投与することができ る。 上記投与に用いられる医薬組成物は、 上記またはその塩と薬理学的に許容さ れ得る担体、 希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。 かかる組成物は、 経口 または非経口投与に適する剤形として提供される。
すなわち、 例えば、 経口投与のための組成物としては、 固体または液体の剤形、 具体的には錠剤 （糖衣錠、 フィルムコーティング錠を含む） 、 丸剤、 顆粒剤、 散 剤、 カプセル剤 （ソフトカプセル剤を含む） 、 シロップ剤、 乳剤、 懸濁剤などが あげられる。 かかる組成物は自体公知の方法によって製造され、 製剤分野におい て通常用いられる担体、 希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。 例えば、 錠剤用の担体、 賦形剤としては、 乳糖、 でんぷん、 蔗糖、 ステアリン酸マグネシ ゥムなどが用いられる。
非経口投与のための組成物としては、 例えば、 注射剤、 坐剤などが用いられ、 注射剤は静脈注射剤、 皮下注射剤、 皮内注射剤、 筋肉注射剤、 点滴注射剤などの 剤形を包含する。 かかる注射剤は、 自体公知の方法に従って、 例えば、 上記抗体 またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、 懸濁 または乳化することによって調製する。 注射用の水性液としては、 例えば、 生理 食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが用いられ、 適当な溶解補 助剤、 例えば、 アルコール （例、 エタノール） 、 ポリアルコール （例、 プロピレ ングリコール、 ポリエチレングリコール） 、 非イオン界面活性剤 〔例、 ポリソリレ ベ一卜 80、 HCO— 50 (poiyoxyethylene (50mol) adduct of ydrogenated castor oil) 〕 などと併用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆 油などが用いられ、 溶解補助剤として安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールな どを併用してもよい。 調製された注射液は、 通常、 適当なアンプルに充填される。 直腸投与に用いられる坐剤は、 上記抗体またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合 することによって調製される。
上記の経口用または非経口用医薬組成物は、 活性成分の投与量に適合するよう な投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。 かかる投薬単位の剤形とし ては、 錠剤、 丸剤、 カプセル剤、 注射剤 （アンプル） 、 坐剤などが例示され、 そ れぞれの投薬単位剤形当たり通常 5〜500mg、 とりわけ注射剤では 5〜 10 0mg、 その他の剤形では 10〜25 Omgの上記抗体が含有されていることが 好ましい。
なお前記した各組成物は、 上記抗体との配合により好ましくない相互作用を生 じない限り他の活性成分を含有してもよい。
(7) DNA転移動物
本発明は、 外来性の本発明のタンパク質等をコードする DN A (以下、 本発明 の外来性 DN Aと略記する） またはその変異 DN A (本発明の外来性変異 DNA と略記する場合がある） を有する非ヒ卜哺乳動物を提供する。
すなわち、 本発明は、
(1) 本発明の外来性 DNAまたはその変異 DN Aを有する非ヒト哺乳動物、
(2) 非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第 （1)記載の動物、
(3) ゲッ歯動物がマウスまたはラットである第 （2) 記載の動物、 および
(4) 本発明の外来性 DNAまたはその変異 DNAを含有し、 哺乳動物において 発現しうる組換えベクターを提供するものである。
本発明の外来性 DNAまたはその変異 DNAを有する非ヒト哺乳動物 （以下、 本発明の DN A転移動物と略記する） は、 未受精卵、 受精卵、 精子およびその始 原細胞を含む胚芽細胞などに対して、 好ましくは、 非ヒト哺乳動物の発生におけ る胚発生の段階 （さらに好ましくは、 単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一般 に 8細胞期以前） に、 リン酸カルシウム法、 電気パルス法、 リポフエクシヨン法、 凝集法、 マイクロインジェクション法、 パ一ティクルガン法、 DEAE—デキス トラン法などにより目的とする DN Aを転移することによって作出することがで きる。 また、 該 DNA転移方法により、 体細胞、 生体の臓器、 組織細胞などに目 的とする本発明の外来性 DN Aを転移し、 細胞培養、 組織培養などに利用するこ ともでき、 さらに、 これら細胞を上述の胚芽細胞と自体公知の細胞融合法により 融合させることにより本発明の DN A転移動物を作出することもできる。
非ヒト哺乳動物としては、 例えば、 ゥシ、 ブ夕、 ヒッジ、 ャギ、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 八ムス夕一、 マウス、 ラットなどが用いられる。 なかでも、 病体動物モデル系の作成の面から個体発生および生物サイクルが比較的短く、 ま た、 繁殖が容易なゲッ歯動物、 とりわけマウス （例えば、 純系として、 C 5 7 B L/6系統， DBA2系統など、 交雑系として、 B 6 C 3 F 系統， BD F ;L系 統， B 6D 2 F i系統， BALBZc系統， I CR系統など） またはラット （例 えば、 W i s t a r, SDなど） などが好ましい。
哺乳動物において発現しうる組換えべクタ一における 「哺乳動物」 としては、 上記の非ヒト哺乳動物の他にヒトなどが挙げられる。
本発明の外来性 DNAとは、 非ヒト哺乳動物が本来有している本発明の DNA ではなく、 いったん哺乳動物から単離 ·抽出された本発明の DNAをいう。
本発明の変異 DN Aとしては、 元の本発明の DN Aの塩基配列に変異 （例えば、 突然変異など） が生じたもの、 具体的には、 塩基の付加、 欠損、 他の塩基への置 換などが生じた DNAなどが用いられ、 また、 異常 DNAも含まれる。
該異常 DN Aとしては、 異常な本発明のタンパク質を発現させる DN Aを意味 し、 例えば、 正常な本発明のタンパク質の機能を抑制するタンパク質を発現させ る DN Aなどが用いられる。
本発明の外来性 DNAは、 対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの哺乳 動物由来のものであってもよい。 本発明の DNAを対象動物に転移させるにあた つては、 該 DNAを動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合した DN Aコンストラクトとして用いるのが一般に有利である。 例えば、 本発明のヒト D N Aを転移させる場合、 これと相同性が高い本発明の DN Aを有する各種哺乳動 物 （例えば、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムスター、 ラッ卜、 マウスな ど） 由来の DNAを発現させうる各種プロモーターの下流に、 本発明のヒト DN Aを結合した DNAコンストラクト （例、 ベクターなど） を対象哺乳動物の受精 卵、 例えば、 マウス受精卵へマイクロインジェクションすることによって本発明 の DN Aを高発現する DN A転移哺乳動物を作出することができる。
本発明のタンパク質の発現べクタ一としては、 大腸菌由来のプラスミド、 枯草 菌由来のプラスミド、 酵母由来のプラスミド、 λファージなどのバクテリオファ ージ、 モロニ一白血病ウィルスなどのレトロウイルス、 ワクシニアウィルスまた はバキュロウィルスなどの動物ウィルスなどが用いられる。 なかでも、 大腸菌由 来のプラスミド、 枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由来のプラスミドなどが好 ましく用いられる。
上記の DN Α発現調節を行なうプロモーターとしては、例えば、①ウィルス（例、 シミアンウィルス、 サイトメガロウィルス、 モロニ一白血病ウィルス、 J Cウイ ルス、 乳癌ウィルス、 ポリオウイルスなど） に由来する DNAのプロモー夕一、 ②各種哺乳動物 （ヒト、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムスター、 ラット、 マウスなど） 由来のプロモー夕一、 例えば、 アルブミン、 インスリン I I、 ゥロ プラキン I I、 エラス夕ーゼ、 エリスロポエチン、 エンドセリン、 筋クレアチン キナーゼ、 グリア線維性酸性タンパク質ク、 グル夕チオン S—トランスフェラ一 ゼ、 血小板由来成長因子 /3、 ケラチン Kl， 10ぉょび1^14、 コラーゲン I 型および I I型、 サイクリック AMP依存タンパク質キナーゼ i3 Iサブユニット、 ジストロフィン、 酒石酸抵抗性アルカリフォスファタ一ゼ、 心房ナトリウム利尿 性因子、 内皮レセプターチ口シンキナーゼ （一般に T i e 2と略される） 、 ナト リウムカリウムアデノシン 3リン酸化酵素 （Na， K-ATP a s e) 、 ニュ一 口フィラメント軽鎖、 メタ口チォネイン Iおよび I I A、 メタ口プロティナーゼ 1組織インヒビ夕一、 MHCクラス I抗原 （H— 2L) 、 H— r a s、 レニン、 ドーパミン i3—水酸化酵素、 甲状腺ペルォキシダーゼ （TPO) 、 ポリペプチド 鎖延長因子 la (EF- 1 α) 、 βァクチン、 αおよび /3ミオシン重鎖、 ミオシン 軽鎖 1および 2、 ミエリン基礎タンパク質、 チログロブリン、 Thy— 1、 免疫 グロブリン、 H鎖可変部 （VNP) 、 血清アミロイド Pコンポーネント、 ミオグ ロビン、 トロポニン C、 平滑筋 αァクチン、 プレブ口エンケフアリン Α、 バソプ レシンなどのプロモーターなどが用いられる。 なかでも、 全身で高発現すること が可能なサイトメガロウィルスプロモー夕一、 ヒトポリペプチド鎖延長因子 1 α (EF- 1 α) のプロモー夕一、 ヒトおよび二ヮ卜リ /3ァクチンプロモーターな どが好適である。
上記ベクターは、 DNA転移哺乳動物において目的とするメッセンジャー RN Αの転写を終結する配列 （一般に夕一ミネ夕一と呼ばれる） を有していることが 好ましく、 例えば、 ウィルス由来および各種哺乳動物由来の各 DNAの配列を用 いることができ、 好ましくは、 シミアンウィルスの SV40夕一ミネ夕一などが 用いられる。
その他、 目的とする外来性 DNAをさらに高発現させる目的で各 DNAのスプ ライシングシグナル、 ェンハンサ一領域、 真核 DN Aのイントロンの一部などを プロモータ—領域の 5' 上流、 プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域 の 3' 下流 に連結することも目的により可能である。
正常な本発明のタンパク質の翻訳領域は、 ヒトまたは各種哺乳動物 （例えば、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムスター、 ラット、 マウスなど） 由来の肝 臓、 腎臓、 甲状腺細胞、 線維芽細胞由来 DNAおよび市販の各種ゲノム DNAラ イブラリーよりゲノム DN Aの全てあるいは一部として、 または肝臓、 腎臓、 甲 状腺細胞、 線維芽細胞由来 RNAより公知の方法により調製された相補 DNAを 原料として取得することが出来る。 また、 外来性の異常 DNAは、 上記の細胞ま たは組織より得られた正常なタンパク質の翻訳領域を点突然変異誘発法により変 異した翻訳領域を作製することができる。
該翻訳領域は転移動物において発現しうる DNAコンストラクトとして、 前記 のプロモ—夕—の下流および所望により転写終結部位の上流に連結させる通常の
DN A工学的手法により作製することができる。
受精卵細胞段階における本発明の外来性 DN Aの転移は、 対象哺乳動物の胚芽 細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。 DN A転移後の作出動 物の胚芽細胞において、 本発明の外来性 DN Aが存在することは、 作出動物の後 代がすべて、 その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性 DN Aを保持 することを意味する。 本発明の外来性 DNAを受け継いだこの種の動物の子孫は その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性 DN Aを有する。
本発明の外来性正常 DNAを転移させた非ヒト哺乳動物は、 交配により外来性 DN Aを安定に保持することを確認して、 該 DN A保有動物として通常の飼育環 境で継代飼育することが出来る。
受精卵細胞段階における本発明の外来性 DN Aの転移は、 対象哺乳動物の胚芽 細胞および体細胞の全てに過剰に存在するように確保される。 DNA転移後の作 出動物の胚芽細胞において本発明の外来性 DN Aが過剰に存在することは、 作出 動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性 DN Aを過 剰に有することを意味する。 本発明の外来性 DNAを受け継いだこの種の動物の 子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性 DN Aを過剰に有する。 導入 DN Aを相同染色体の両方に持つホモザィゴ一ト動物を取得し、 この雌雄 の動物を交配することによりすべての子孫が該 DN Aを過剰に有するように繁殖 継代することができる。
本発明の正常 DNAを有する非ヒト哺乳動物は、 本発明の正常 DNAが高発現 させられており、 内在性の正常 DN Aの機能を促進することにより最終的に本発 明の夕ンパク質の機能亢進症を発症することがあり、 その病態モデル動物として 利用することができる。 例えば、 本発明の正常 DNA転移動物を用いて、 本発明 のタンパク質の機能亢進症や、 本発明のタンパク質が関連する疾患の病態機序の 解明およびこれらの疾患の治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、 本発明の外来性正常 DN Aを転移させた哺乳動物は、 遊離した本発明の タンパク質の増加症状を有することから、 本発明のタンパク質に関連する疾患に 対する治療薬のスクリーニング試験にも利用可能である。
一方、 本発明の外来性異常 DNAを有する非ヒト哺乳動物は、 交配により外来 性 DN Aを安定に保持することを確認して該 DN A保有動物として通常の飼育環 境で継代飼育することが出来る。 さらに、 目的とする外来 DNAを前述のプラス ミドに組み込んで原科として用いることができる。 プロモーターとの DNAコン ストラク卜は、 通常の DNA工学的手法によって作製することができる。 受精卵 細胞段階における本発明の異常 DN Aの転移は、 対象哺乳動物の胚芽細胞および 体細胞の全てに存在するように確保される。 D N A転移後の作出動物の胚芽細胞 において本発明の異常 D N Aが存在することは、 作出動物の子孫が全てその胚芽 細胞および体細胞の全てに本発明の異常 D N Aを有することを意味する。 本発明 の外来性 D N Aを受け継いだこの種の動物の子孫は、 その胚芽細胞および体細胞 の全てに本発明の異常 D N Aを有する。 導入 D N Aを相同染色体の両方に持つホ モザィゴート動物を取得し、 この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫 が該 D N Aを有するように繁殖継代することができる。
本発明の異常 D NAを有する非ヒト哺乳動物は、 本発明の異常 D NAが高発現 させられており、 内在性の正常 D N Aの機能を阻害することにより最終的に本発 明のタンパク質の機能不活性型不応症となることがあり、 その病態モデル動物と して利用することができる。 例えば、 本発明の異常 D N A転移動物を用いて、 本 発明のタンパク質の機能不活性型不応症の病態機序の解明およびこの疾患を治療 方法の検討を行なうことが可能である。
また、 具体的な利用可能性としては、 本発明の異常 D N A高発現動物は、 本発 明のタンパク質の機能不活性型不応症における本発明の異常タンパク質による正 常タンパク質の機能阻害 （dominant negat ive作用） を解明するモデルとなる。 また、 本発明の外来異常 D N Aを転移させた哺乳動物は、 遊離した本発明の夕 ンパク質の増加症状を有することから、 本発明のタンパク質の機能不活性型不応 症に対する治療薬スクリ一ニング試験にも利用可能である。
また、 上記 2種類の本発明の D N A転移動物のその他の利用可能性として、 例 えば、
①組織培養のための細胞源としての使用、
②本発明の D N A転移動物の組織中の D N Aもしくは R N Aを直接分析するか、 または D N Aにより発現されたタンパク質組織を分析することによる、 本発明の タンパク質により特異的に発現あるいは活性化するタンパク質との関連性につい ての解析、
③ D NAを有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、 これらを使用し て、 一般に培養困難な組織からの細胞の機能の研究、
④上記③記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高めるような薬剤のスクリ 一二ング、 および ⑤本発明の変異タンパク質を単離精製およびその抗体作製などが考えられる。 さらに、 本発明の DNA転移動物を用いて、 本発明のタンパク質の機能不活性 型不応症などを含む、 本発明のタンパク質に関連する疾患の臨床症状を調べるこ とができ、 また、 本発明のタンパク質に関連する疾患モデルの各臓器におけるよ り詳細な病理学的所見が得られ、 新しい治療方法の開発、 さらには、 該疾患によ る二次的疾患の研究および治療に貢献することができる。
また、 本発明の DNA転移動物から各臓器を取り出し、 細切後、 トリプシンな どのタンパク質分解酵素により、 遊離した DNA転移細胞の取得、 その培養また はその培養細胞の系統化を行なうことが可能である。 さらに、 本発明のタンパク 質産生細胞の特定化、 アポトーシス、 分化あるいは増殖との関連性、 またはそれ らにおけるシグナル伝達機構を調べ、 それらの異常を調べることなどができ、 本 発明のタンパク質およびその作用解明のための有効な研究材料となる。
さらに、 本発明の DNA転移動物を用いて、 本発明のタンパク質の機能不活性 型不応症を含む、 本発明のタンパク質に関連する疾患の治療薬の開発を行なうた めに、 上述の検査法および定量法などを用いて、 有効で迅速な該疾患治療薬のス クリーニング法を提供することが可能となる。 また、 本発明の DN A転移動物ま たは本発明の外来性 D N A発現べクタ一を用いて、 本発明の夕ンパク質が関連す る疾患の DN A治療法を検討、 開発することが可能である。
(8) ノックアウト動物
本発明は、 本発明の DNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞および本 発明の DNA発現不全非ヒ卜哺乳動物を提供する。
すなわち、 本発明は、
( 1 ) 本発明の DNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
(2) 該 DNAがレポ一夕一遺伝子 （例、 大腸菌由来の —ガラクトシダーゼ遺 伝子） を導入することにより不活性化された第 （1) 項記載の胚幹細胞、
(3) ネオマイシン耐性である第 （1) 項記載の胚幹細胞、
(4) 非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第 （1) 項記載の胚幹細胞、
(5) ゲッ歯動物がマウスである第 （4) 項記載の胚幹細胞、
(6) 本発明の DNAが不活性化された該 DNA発現不全非ヒト哺乳動物、 (7) 該 DNAがレポ一夕一遺伝子 （例、 大腸菌由来の 0—ガラクトシダ一ゼ遺 伝子） を導入することにより不活性化され、 該レポーター遺伝子が本発明の DN Aに対するプロモ一夕一の制御下で発現しうる第 （6) 項記載の非ヒト哺乳動物、
(8) 非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第 （6) 項記載の非ヒト哺乳動物、 (9) ゲッ歯動物がマウスである第 （8) 項記載の非ヒト哺乳動物、 および
(10) 第 （7) 項記載の動物に、 試験化合物を投与し、 レポ一夕一遺伝子の発 現を検出することを特徴とする本発明の DN Aに対するプロモーター活性を促進 または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
本発明の DNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞とは、 該非ヒト哺乳 動物が有する本発明の DN Aに人為的に変異を加えることにより、 DNAの発現 能を抑制するか、 もしくは該 D N Aがコードしている本発明のタンパク質の活性 を実質的に喪失させることにより、 DN Aが実質的に本発明のタンパク質の発現 能を有さない （以下、 本発明のノックアウト DNAと称することがある） 非ヒト 哺乳動物の胚幹細胞 （以下、 ES細胞と略記する） をいう。
非ヒト哺乳動物としては、 前記と同様のものが用いられる。
本発明の DN Aに人為的に変異を加える方法としては、 例えば、 遺伝子工学的 手法により該 DNA配列の一部又は全部の削除、 他 DNAを挿入または置換させ ることによって行なうことができる。 これらの変異により、 例えば、 コドンの読 み取り枠をずらしたり、 プロモーターあるいはェキソンの機能を破壊することに より本発明のノックアウト DNAを作製すればよい。
本発明の DNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞 （以下、 本発明の D NA不活性化 ES細胞または本発明のノックアウト ES細胞と略記する） の具体 例としては、 例えば、 目的とする非ヒト哺乳動物が有する本発明の DNAを単離 し、 そのェキソン部分にネオマイシン耐性遺伝子、 ハイグロマイシン耐性遺伝子 を代表とする薬剤耐性遺伝子、あるいは 1 a c Z ( 3—ガラクトシダ一ゼ遺伝子）、 c a t (クロラムフエニコールァセチルトランスフェラーゼ遺伝子） を代表とす るレポ一夕一遺伝子等を挿入することによりェキソンの機能を破壊するか、 ある いはェキソン間のィントロン部分に遺伝子の転写を終結させる DN A配列 （例え ば、 polyA付加シグナルなど） を挿入し、 完全なメッセンジャー RNAを合成で きなくすることによって、 結果的に遺伝子を破壊するように構築した DN A配列 を有する DNA鎖 （以下、 夕一ゲッティングベクタ一と略記する） を、 例えば相 同組換え法により該動物の染色体に導入し、 得られた E S細胞について本発明の
DN A上あるいはその近傍の DN A配列をプローブとしたサザンハイブリダィゼ —ション解析あるいは夕一ゲッティングベクタ一上の DNA配列とターゲッティ ングベクター作製に使用した本発明の DN A以外の近傍領域の DN A配列をブラ イマ一とした P C R法により解析し、 本発明のノックアウト E S細胞を選別する ことにより得ることができる。
また、 相同組換え法等により本発明の DNAを不活化させる元の E S細胞とし ては、例えば、前述のような既に樹立されたものを用いてもよく、また公知 Evans と Kaufmaの方法に準じて新しく樹立したものでもよい。 例えば、 マウスの ES細 胞の場合、 現在、 一般的には 1 2 9系の E S細胞が使用されているが、 免疫学的 背景がはっきりしていないので、 これに代わる純系で免疫学的に遺伝的背景が明 らかな E S細胞を取得するなどの目的で例えば、 C 5 7 B LZ 6マウスや C 5 7 8乙ノ6の採卵数の少なさを08八72との交雑にょり改善した80？丄マウス
(C 5 7 B L/6と DBAZ 2との F ;L ) を用いて樹立したものなども良好に用 いうる。 BDF iマウスは、 採卵数が多く、 かつ、 卵が丈夫であるという利点に 加えて、 C 5 7 B LZ6マウスを背景に持つので、 これを用いて得られた E S細 胞は病態モデルマウスを作出したとき、 C 5 7 B LZ 6マウスとバッククロスす ることでその遺伝的背景を C 5 7 B LZ 6マウスに代えることが可能である点で 有利に用い得る。
また、 E S細胞を樹立する場合、一般には受精後 3. 5日目の胚盤胞を使用する が、 これ以外に 8細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより効率よ く多数の初期胚を取得することができる。
また、 雌雄いずれの E S細胞を用いてもよいが、 通常雄の E S細胞の方が生殖 系列キメラを作出するのに都合が良い。 また、 煩雑な培養の手間を削減するため にもできるだけ早く雌雄の判別を行なうことが望ましい。
E S細胞の雌雄の判定方法としては、 例えば、 P C R法により Y染色体上の性 決定領域の遺伝子を増幅、 検出する方法が、 その 1例として挙げることができる。 この方法を使用すれば、 従来、 核型分析をするのに約 1 06個の細胞数を要して いたのに対して、 1コロニー程度の ES細胞数 （約 50個） で済むので、 培養初 期における E S細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行なうことが可能であ り、 早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に削減で さる。
また、 第二次セレクションとしては、 例えば、 G—バンデイング法による染色 体数の確認等により行うことができる。 得られる ES細胞の染色体数は正常数の 100%が望ましいが、 樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、 ES細 胞の遺伝子をノックアウトした後、 正常細胞 （例えば、 マウスでは染色体数が 2 n = 40である細胞） に再びクローニングすることが望ましい。
このようにして得られた胚幹細胞株は、 通常その増殖性は大変良いが、 個体発 生できる能力を失いやすいので、 注意深く継代培養することが必要である。 例え ば、 S TO繊維芽細胞のような適当なフィーダ一細胞上で L I F (1 - 1000 OU/ml) 存在下に炭酸ガス培養器内 （好ましくは、 5%炭酸ガス、 95%空気ま たは 5%酸素、 5%炭酸ガス、 90%空気） で約 37 °Cで培養するなどの方法で 培養し、 継代時には、 例えば、 トリプシン ZEDTA溶液 （通常 00 1— 0. 5%トリプシン Z0. 1 - 5mM EDTA、好ましくは約 0. 1 %トリプシン/ 1 mM EDTA)処理により単細胞化し、新たに用意したフィーダ一細胞上に播種 する方法などがとられる。 このような継代は、 通常 1一 3日毎に行なう力 この 際に細胞の観察を行い、 形態的に異常な細胞が見受けられた場合はその培養細胞 は放棄することが望まれる。
ES細胞は、 適当な条件により、 高密度に至るまで単層培養するか、 または細 胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、頭頂筋、内臓筋、心筋などの種々 のタイプの細胞に分化させることが可能であり 〔M. J. Evans及び M. H. Kaufman, ネィチヤ一 （Nature) 第 292巻、 154頁、 1981年； G. R. Martin プロシーディン グス ·ォブ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ'サイエンス ·ユーエスエー （Pro Natl. Acad. Sci. U.S.A.) 第 78巻、 7634頁、 1981年； T. C. Doetschman ら、 ジ ヤーナル ·ォブ ·ェンブリオロジ一 'アンド 'ェクスペリメンタル ·モルフォロ ジ一、 第 87巻、 27頁、 1985年〕 、 本発明の E S細胞を分化させて得られる本発明 の D N A発現不全細胞は、 インビト口における本発明のタンパク質の細胞生物学 的検討において有用である。
本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物は、 該動物の mR NA量を公知方法を 用いて測定して間接的にその発現量を比較することにより、 正常動物と区別する ことが可能である。
該非ヒト哺乳動物としては、 前記と同様のものが用いられる。
本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物は、 例えば、 前述のようにして作製し た夕ーゲッティングベクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入し、 導 入により夕一ゲッティングベクタ一の本発明の D N Aが不活性化された D N A配 列が遺伝子相同組換えにより、 マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色体上の 本発明の D N Aと入れ換わる相同組換えをさせることにより、 本発明の D N Aを ノックアウトさせることができる。
本発明の D NAがノックアウトされた細胞は、 本発明の D NA上またはその近 傍の D N A配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼ一ション解析または夕一 ゲッティングベクタ一上の D N A配列と、 夕一ゲッティングベクターに使用した マウス由来の本発明の D N A以外の近傍領域の D N A配列とをプライマーとした P C R法による解析で判定することができる。 非ヒト哺乳動物胚幹細胞を用いた 場合は、 遺伝子相同組換えにより、 本発明の D N Aが不活性化された細胞株をク ローニングし、 その細胞を適当な時期、 例えば、 8細胞期の非ヒト哺乳動物胚ま たは胚盤胞に注入し、 作製したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒト哺乳動物の子宮 に移植する。 作出された動物は正常な本発明の D N A座をもつ細胞と人為的に変 異した本発明の D N A座をもつ細胞との両者から構成されるキメラ動物である。 該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異した本発明の D N A座をもつ場合、 この ようなキメラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体群より、 全ての 組織が人為的に変異を加えた本発明の D N A座をもつ細胞で構成された個体を、 例えば、 コ一トカラ一の判定等により選別することにより得られる。 このように して得られた個体は、 通常、 本発明のタンパク質のヘテロ発現不全個体であり、 本発明のタンパク質のヘテロ発現不全個体同志を交配し、 それらの産仔から本発 明のタンパク質のホモ発現不全個体を得ることができる。 卵細胞を使用する場合は、 例えば、 卵細胞核内にマイクロインジェクション法 で D N A溶液を注入することにより夕ーゲッティングベクタ一を染色体内に導入 したトランスジエニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、 これらのトランスジ エニック非ヒト哺乳動物に比べて、 遺伝子相同組換えにより本発明の D N A座に 変異のあるものを選択することにより得られる。
このようにして本発明の D NAがノックアウトされている個体は、 交配により 得られた動物個体も該 D NAがノックアウトされていることを確認して通常の飼 育環境で飼育継代を行なうことができる。
さらに、 生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよい。 すなわち、 該不活化 D N Aの保有する雌雄の動物を交配することにより、 該不活化 D N Aを 相同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取得しうる。 得られたホモザィゴ ート動物は、 母親動物に対して、 正常個体 1 , ホモザィゴ一ト複数になるような 状態で飼育することにより効率的に得ることができる。 ヘテロザィゴート動物の 雌雄を交配することにより、 該不活化 D N Aを有するホモザィゴ一トおよびへテ ロザィゴ一ト動物を繁殖継代する。
本発明の D NAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞は、 本発明の D NA 発現不全非ヒト哺乳動物を作出する上で、 非常に有用である。
また、 本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物は、 本発明のタンパク質により 誘導され得る種々の生物活性を欠失するため、 本発明のタンパク質の生物活性の 不活性化を原因とする疾病のモデルとなり得るので、 これらの疾病の原因究明及 び治療法の検討に有用である。
( 8 a ) 本発明の D N Aの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療 ·予防効 果を有する化合物のスクリーニング方法
本発明の D N A発現不全非ヒト哺乳動物は、 本発明の D NAの欠損や損傷など に起因する疾病 （例、 椎間板ヘルニア、 坐骨神経痛、 糸球体腎炎、 糖尿病性腎症、 肝繊維症、 肺繊維症または大理石病など） に対して治療 ·予防効果を有する化合 物のスクリーニングに用いることができる。
すなわち、 本発明は、 本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を 投与し、 該動物の変化を観察 ·測定することを特徴とする、 本発明の D NAの欠 損や損傷などに起因する疾病に対して治療 ·予防効果を有する化合物またはその 塩のスクリーニング方法を提供する。
該スクリーニング方法において用いられる本発明の D NA発現不全非ヒ卜哺乳 動物としては、 前記と同様のものが挙げられる。
試験化合物としては、 例えば、 ペプチド、 タンパク、 非ペプチド性化合物、 合 成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液、 血漿などが 挙げられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物であつ てもよい。
具体的には、 本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物を、 試験化合物で処理し、 無処理の対照動物と比較し、 該動物の各器官、 組織、 疾病の症状などの変化を指 標として試験化合物の治療 ·予防効果を試験することができる。
試験動物を試験化合物で処理する方法としては、 例えば、 経口投与、 静脈注射 などが用いられ、 試験動物の症状、 試験化合物の性質などにあわせて適宜選択す ることができる。 また、 試験化合物の投与量は、 投与方法、 試験化合物の性質な どにあわせて適宜選択することができる。
例えば、 椎間板ヘルニア、 坐骨神経痛、 糸球体腎炎、 糖尿病性腎症、 肝繊維症、 肺繊維症または大理石病に対して治療 ·予防効果を有する化合物をスクリ一ニン グする場合、 本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物に糖負荷処置を行ない、 糖 負荷処置前または処置後に試験化合物を投与し、 該動物の血糖値および体重変化 などを経時的に測定する。
該スクリーニング方法において、 試験動物に試験化合物を投与した場合、 該試 験動物の血糖値が約 1 0 %以上、 好ましくは約 3 0 %以上、 より好ましくは約 5 0 %以上低下した場合、 該試験化合物を椎間板ヘルニア、 坐骨神経痛、 糸球体腎 炎、 糖尿病性腎症、 肝繊維症、 肺繊維症または大理石病に対して治療，予防効果 を有する化合物として選択することができる。
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物は、 上記した試験化合物 から選ばれた化合物であり、 本発明のタンパク質等の欠損や損傷などによって引 き起こされる疾患 （例、 椎間板ヘルニア、 坐骨神経痛、 糸球体腎炎、 糖尿病性腎 症、 肝繊維症、 肺繊維症または大理石病など） に対して治療 ·予防効果を有する ので、 該疾患に対する安全で低毒性な治療 ·予防剤などの医薬として使用するこ とができる。 さらに、 上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合 物も同様に用いることができる。
該スクリ一ニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、 該化合物 の塩としては、 生理学的に許容される酸 （例、 無機酸、 有機酸など） や塩基 （例、 アルカリ金属など） などとの塩が用いられ、 とりわけ生理学的に許容される酸付 加塩が好ましい。 この様な塩としては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸など） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピ オン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 篠酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸など） との塩などが用いられ る。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、 前記 した本発明のタンパク質を含有する医薬と同様にして製造することができる。 このようにして得られる製剤は、 安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトまた は哺乳動物 （例えば、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥ シ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 対象疾患、 投与対象、 投与ルートなどによ り差異はあるが、 例えば、 の治療目的で該化合物を経口投与する場合、 一般的に 成人（体重 60 k gとして） においては、 一日につき該化合物を約 0. 1〜 100 mg、 好ましくは約 1. 0〜5 Omg、 より好ましくは約 1. 0〜20mg投与 する。 非経口的に投与する場合は、 該化合物の 1回投与量は投与対象、 対象疾患 などによっても異なるが、 例えば、 糖尿病性腎症の治療目的で該化合物を注射剤 の形で通常成人 （6 O kgとして） に投与する場合、 一日につき該化合物を約 0. 01〜30mg程度、 好ましくは約 0. l〜20mg程度、 より好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射により投与するのが好都合である。 他の動物の場合 も、 60 k g当たりに換算した量を投与することができる。
(8 b) 本発明の DN Aに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合 物をスクリーニング方法
本発明は、 本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物に、 試験化合物を投与し、 レポ一夕一遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明の DNAに対するプ 口モーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方 法を提供する。
上記スクリーニング方法において、 本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物と しては、 前記した本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物の中でも、 本発明の D N Aがレポ一夕一遺伝子を導入することにより不活性化され、 該レポーター遺伝 子が本発明の D N Aに対するプロモー夕一の制御下で発現しうるものが用いられ る。
試験化合物としては、 前記と同様のものが挙げられる。
レポーター遺伝子としては、 前記と同様のものが用いられ、 3—ガラクトシダ ーゼ遺伝子 （ 1 a c Z) 、 可溶性アルカリフォスファターゼ遺伝子またはルシフ エラーゼ遺伝子などが好適である。
本発明の DN Aをレポ一夕一遺伝子で置換された本発明の DN A発現不全非ヒ ト哺乳動物では、 レポ一夕一遺伝子が本発明の DN Aに対するプロモーターの支 配下に存在するので、 レポ一夕一遺伝子がコードする物質の発現をトレースする ことにより、 プロモ一夕一の活性を検出することができる。
例えば、 本発明のタンパク質をコードする DNA領域の一部を大腸菌由来の ]3 —ガラクトシダーゼ遺伝子 （ 1 ac Z) で置換している場合、 本来、 本発明の夕 ンパク質の発現する組織で、 本発明のタンパク質の代わりに /3—ガラクトシダー ゼが発現する。 従って、 例えば、 5—ブロモ—4—クロロー 3—インドリル一 3 一ガラクトピラノシド （X_g a l) のような 3—ガラクトシダ一ゼの基質とな る試薬を用いて染色することにより、 簡便に本発明のタンパク質の動物生体内に おける発現状態を観察することができる。 具体的には、 本発明のタンパク質欠損 マウスまたはその組織切片をダルタルアルデヒドなどで固定し、 リン酸緩衝生理 食塩液 （PBS) で洗浄後、 X— ga 1を含む染色液で、 室温または 37°C付近 で、約 30分ないし 1時間反応させた後、組織標本を ImM EDTAZPBS溶 液で洗浄することによって、 i3—ガラクトシダ一ゼ反応を停止させ、 呈色を観察 すればよい。 また、 常法に従い、 1 a c Zをコードする mRNAを検出してもよ い。 上記スクリ一ニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、 上記した試 験化合物から選ばれた化合物であり、 本発明の D N Aに対するプロモーター活性 を促進または阻害する化合物である。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、 該化合物 の塩としては、 生理学的に許容される酸 （例、 無機酸など） や塩基 （例、 有機酸 など） などとの塩が用いられ、 とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好まし レ この様な塩としては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸など） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマ ル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸など） との塩などが用いられる。
本発明の D N Aに対するプロモ一夕一活性を促進する化合物またはその塩は、 本発明のタンパク質の発現を促進し、 該タンパク質の機能を促進することができ るので、 例えば、 椎間板ヘルニア、 坐骨神経痛、 糸球体腎炎、 糖尿病性腎症、 肝 繊維症、 肺繊維症または大理石病などの疾病に対する安全で低毒性な治療 ·予防 剤などの医薬として有用である。
一方、 本発明の D N Aに対するプロモー夕一活性を阻害する化合物またはその 塩は、 本発明のタンパク質の発現を阻害し、 該タンパク質の機能を阻害すること ができるので、 例えば、 慢性関節リウマチ、 変形性関節症、 骨粗鬆症、 癌、 動脈 硬化、 角膜潰瘍などの疾病に対する安全で低毒性な治療 ·予防剤などの医薬とし て有用である。
さらに、 上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に 用いることができる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、 前記 した本発明の夕ンパク質またはその塩を含有する医薬と同様にして製造すること ができる。
このようにして得られる製剤は、 安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトまた は哺乳動物 （例えば、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥ シ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 対象疾患、 投与対象、 投与ルートなどによ り差異はあるが、 例えば、 糖尿病性腎症の治療目的で本発明の DNAに対するプ 口モーター活性を促進する化合物を経口投与する場合、 一般的に成人 （体重 60 kgとして） においては、 一日につき該化合物を約 0. l〜100mg、 好ましく は約 1. 0〜5 Omg、 より好ましくは約 1. 0〜20mg投与する。 非経口的 に投与する場合は、 該化合物の 1回投与量は投与対象、 対象疾患などによっても 異なるが、 例えば、 糖尿病性腎症の治療目的で本発明の DN Aに対するプロモー ター活性を促進する化合物を注射剤の形で通常成人 （6 O kgとして） に投与す る場合、 一日につき該化合物を約 0. 01〜30mg程度、 好ましくは約 0. 1 〜20mg程度、 より好ましくは約 0. 1〜 1 Omg程度を静脈注射により投与 するのが好都合である。 他の動物の場合も、 60 k g当たりに換算した量を投与 することができる。
一方、 例えば、 慢性関節リウマチの治療目的で本発明の DNAに対するプロモ 一ター活性を阻害する化合物を経口投与する場合、 一般的に成人 （体重 6 O kg として） においては、 一日につき該化合物を約 0. 1〜10 Omg、 好ましくは約 1. 0〜50mg、 より好ましくは約 1. 0〜 2 Omg投与する。 非経口的に投 与する場合は、 該化合物の 1回投与量は投与対象、 対象疾患などによっても異な るが、 例えば、 慢性関節リウマチの治療目的で本発明の DNAに対するプロモ一 ター活性を阻害する化合物を注射剤の形で通常成人 （6 O kgとして） に投与す る場合、 一日につき該化合物を約 0. 01〜30mg程度、 好ましくは約 0. 1 〜2 Omg程度、 より好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射により投与 するのが好都合である。 他の動物の場合も、 60 kg当たりに換算した量を投与 することができる。
このように、 本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物は、 本発明の DNAに対 するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリー二 ングする上で極めて有用であり、 本発明の DN A発現不全に起因する各種疾患の 原因究明または予防 ·治療薬の開発に大きく貢献することができる。
また、 本発明のタンパク質のプロモーター領域を含有する DNAを使って、 そ の下流に種々のタンパクをコードする遺伝子を連結し、 これを動物の卵細胞に注 入していわゆるトランスジエニック動物 （遺伝子移入動物） を作成すれば、 特異 的にそのタンパクを合成させ、 その生体での作用を検討することも可能となる。 さらに上記プロモー夕一部分に適当なレポ一夕遺伝子を結合させ、 これが発現す るような細胞株を樹立すれば、 本発明のタンパク質そのものの体内での産生能力 を特異的に促進もしくは抑制する作用を持つ低分子化合物の探索系として使用で さる。
本明細書および図面において、 塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、 I UP AC- I UB Commision on Biochemical Nomenclature による略号あるい は当該分野における慣用略号に基づくものであり、 その例を下記する。 またアミ ノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、 特に明示しなければ L体を示すものと する。
DNA ：デォキシリボ核酸
c DNA ：相補的デォキシリボ核酸
A ：アデニン
T ：チミン
G ： グァニン
C シ卜シン
I ：イノシン
R ：アデニン （A) またはグァニン （G)
Y ：チミン （T) またはシトシン （C)
M ：ァデニン （A) またはシトシン （C)
K ： グァニン （G) またはチミン （T)
S ： グァニン （G) またはシトシン （C)
W ：ァデニン （A) またはチミン （T)
B ： グァニン （G) 、 グァニン （G) またはチミン （T) D ：ァデニン （A) 、 グァニン （G) またはチミン （T)
V ：ァデニン （A) 、 グァニン （G) またはシトシン （C) RNA ： リポ核酸
mRNA ： メッセンジャーリボ核酸
dATP ：デォキシアデノシン三リン酸 dTTP デォキシチミジン三リン酸
dGTP デォキシグァノシン三リン酸
d CTP デォキシシチジン三リン酸
ATP アデノシン三リン酸
EDTA エチレンジァミン四酢酸
SDS ドデシル硫酸ナトリウム
G 1 y グリシン
A 1 a ァラニン
V a 1 バリン
L e u ロイシン
I 1 e ィソロイシン
S e r セリン
Th r スレオニン
Cy s システィン
Me t メチォニン
G 1 u グルタミン酸
As p ァスパラギン酸
L y s リジン
Ar g アルギニン
H i s ヒスチジン
P h e フエ二ルァラニン
Ty r チロシン
T r p トリプトファン
P r o プロリン
A s n
G 1 n グルタミン
p G 1 u ピログルタミン酸
また、 本明細書中で繁用される置換基、 保護基および試薬を下記の記号で表記 する。 Me メチル基
E t ェチル基
Bu ブチル基
P h フエニル基
TC チアゾリジン一 4 (R) —カルポキサミド基 T o s p -トルエンスルフォニル
CHO ホルミル
B z 1
Cl2Bzl 2， 6—ジクロ口べンジル
Bom ベンジルォキシメチル
Z ベンジルォキシカルボニル
C 1 - Z
B r -Z 2—ブロモベンジルォキシカルボニル
B o c t—ブトキシカルボニル
DNP ジニトロフエニル
T r t 卜リチル
Bum t一ブトキシメチル
Fmo c N— 9—フルォレニルメトキシカルボニル
HOB t 1—ヒドロキシベンズトリアゾール
HOOB t 3， 4—ジヒドロ一3—ヒドロキシ一 4—ォキソ一
1, 2, 3—ベンゾトリアジン
HONB ：卜ヒドロキシ -5-ノルボルネン -2, 3-ジカルポキシィ
MOCAc ： (7—メトキシクマリン一 4—ィル） ァセチル
Nv a ： ノルバリン
Nma ： N—メチルアントラニル酸
本願明細書の配列表の配列番号は、 以下の配列を示す。
〔配列番号： 1〕
実施例 1で得られた新規 ADA タンパク質のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号： 2〕
配列番号： 1または配列番号： 1 5で表されるアミノ酸配列で表されるタンパ ク質のディスィンテグリン領域に相当する部分のアミノ酸配列を示す。 配列番 号： 1で表されるアミノ酸配列の第 4 0 0番目〜 4 9 5番目のアミノ酸配列に相 当する。
〔配列番号： 3〕
配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列を有する本発明のタンパク質をコード する D N Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 4〕
配列番号： 2で表わされるアミノ酸配列を有するペプチドをコ一ドする D NA の塩基配列を示す。
〔配列番号： 5〕
配列番号： 1または配列番号： 1 5で表されるアミノ酸配列で表されるタンパ ク質のメタ口プロテアーゼ領域に相当する部分のアミノ酸配列を示す。 配列番 号： 1で表されるアミノ酸配列の第 1 9 9番目〜 3 9 9番目のアミノ酸配列に相 当する。
〔配列番号： 6〕
本発明のタンパク質の部分ペプチドのアミノ酸配列を示す。 配列番号： 1また は配列番号： 1 5で表されるアミノ酸配列の第 4 2 8番目〜 4 3 7番目のァミノ 酸配列に相当する。
〔配列番号： 7〕
実施例 1で用いられた 一の塩基配列を示す。
〔配列番号： 8〕
実施例 1で用いられた —の塩基配列を示す。
〔配列番号： 9〕
実施例 1で用いられた 一の塩基配列を示す。
〔配列番号： 1 0〕
実施例 1で用いられた 一の塩基配列を示す。
〔配列番号： 1 1〕 実施例 1で用いられた 一の塩基配列を示す c
〔配列番号： 12〕
実施例 1で用いられた -の塩基配列を示す
〔配列番号： 13〕
実施例 1で用いられた 一の塩基配列を示す。
〔配列番号： 14〕
実施例 1で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 15〕
実施例 1で得られた新規 ADAMタンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 16〕
配列番号： 15で表わされるアミノ酸配列を有する本発明のタンパク質をコ' ドする D N Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 17〕
実施例 2で用いられた' '一の塩基配列を示す。
〔配列番号： 18〕
実施例 2で用いられた 一の塩基配列を示す
〔配列番号： 19〕
実施例 5で用いられたプライマ一の塩基配列を示す。
〔配列番号： 20〕
実施例 5で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 21〕
実施例 7で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 22〕
実施例 7で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 23〕
実施例 8で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 24〕
実施例 8で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 25〕 実施例 9で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 26〕
実施例 9で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 27〕
実施例 1 1で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 28〕
実施例 1 1で用いられたプライマ一の塩基配列を示す。
後述の実施例 1で得られた形質転換体ェシエリヒア コリ （Escherichia col i) DH5 α/ρΤΒ 2052は、 平成 10年 8月 26日から通商産業省工業技術院 生命工学工業技術研究所 （N I ΒΗ) に寄託番号 FERM BP— 6474とし て、 平成 10年 5月 20日から財団法人 ·発酵研究所 （ I FO) に寄託番号 I F 〇 16173として寄託されている。
後述の実施例 1で得られた形質転換体ェシエリヒア コリ （Escherichia col i) DH5 α/ρΤΒ 2053は、 平成 10年 8月 26日から通商産業省工業技術院 生命工学工業技術研究所 （N I ΒΗ) に寄託番号 FERM BP— 6475とし て、 平成 10年 5月 20日から財団法人 ·発酵研究所 （I FO) に寄託番号 I F 0 16174として寄託されている。
後述の実施例 9で得られたベクター PTB2076により形質転換された形質転換体 ェシエリヒア コリ （Escherichiacoli) JM109/pTB2076は、 平成 11年 8月 23 日から通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所 （N I BH) に寄託番号 F ERM BP— 6857として、 平成 1 1年 8月 4日から財団法人 ·発酵研究所 ( I F〇） に寄託番号 I F 0 16305として寄託されている。
以下に、 実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、 本発明はそれに 限定されるものではない。 なお、 大腸菌を用いての遺伝子操作法は、 モレキユラ — 'クローニング （Molecular cloning) に記載されている方法に従った。 実施例 1 新規 ADAM夕ンパク質をコードする遺伝子のクロ一ニング
ADA ファミリ一で保存されている領域を基に設計したプライマー 列番号： 7) ] および
(A/C/G) (A/G/T) (A/G/T) (C/G) IGGGCA (配列番号 : 8) ] を用い、 種々のヒト cD N Aを铸型として縮重 PC Rを行った（95°Cで 20秒、 40°Cで 10秒、 72°C で 1分を 40回） 。
得られた増幅 DNA断片の塩基配列を決定した結果、 出血性蛇毒である At rolys in に高い相同性を示す配列が見出された。 この遺伝子の全長を取得するため、 以下 のように RACE (rapid amplification of cDNA ends)法を用いた。
まず、 上記で見出された配列を基にプライマーを設計し、 これらのプライマ一 [ATC ACA GTC CTC TCC CAT TTC CAC CAA C (配列番号： 9 ) ] および [CAC ATT TCA GGC AGG TCG CAC TCA TC (配列番号： 1 0) ] と CL0NTECH社製 Marathon cDNA Amplification Kit 添付の AP1、 AP2プライマ一を用いて、 Marathon ready cDNA (CL0NTECH社製）を錡型としてキット添付のプロトコ一ルに従い PCRを行い、 5' 上流断片のクロ一ニングを試みた。 翻訳開始コドンを含む断片が取得できなかつ たため、 さらに、得られた断片の配列を基に設計したプライマ一 [TCG CTG TGG TCC TGA ACA ACG CCA ACA (配列番号： 1 1 ) ] および [CAC ACC ATC CAT CCC ACA GGT GCT GTC A (配列番号： 12) ] を用いて、 5' 上流断片のクローニングを上記と 同様の方法で行った。得られた PCR断片は翻訳開始コドンと思われる配列を含んで いた。
—方 3' 下流断片をクローニングするためにプライマ一 [GGA ACC AGT TGG TGG AAA TGG GAG AGG A (配列番号： 13) ] および [AGG ACT GTG ATT GTG GGA CGT CTG AGG AA (配列番号： 14) ] を設計し、 上記と同様の方法で PCRを行った。 そ の結果、 蛋白コード領域中の途中部分から全く異なる配列を示す 2種のクローン が得られた。
以上 R AC E法で得られた遺伝子断片を連結し、 発現ベクター PCDNA3.1 (Invitrogen社製） に挿入することにより、 p TB 2052及び p TB 2053 を得た。
pTB 2052は図 3および図 4に示される塩基配列 （配列番号： 16で示さ れる 2325個の塩基配列を含む） を有していた。 この cDNA断片には、 図 3および図 4 (配列番号： 15)で表される 775アミノ酸からなる新しい ADAMタンパク質がコ ードされ、 シグナル配列、 プロ領域、 メタ口プロテアーゼ領域、 デイスインテグ リン領域、 システィンリッチ領域、 膜貫通領域、 及び細胞内領域が認められた。 pTB 2052を公知の方法で、 ェシエリヒア コリ （Escherichia col i)DH 5 ひに導入し、 ェシエリヒア コリ （Escherichiacoli)DH5 α/ρΤΒ 2052 を得た。
一方、 pTB 2053は図 1および図 2に示される塩基配列 （配列番号： 3で 示される 1620個の塩基配列を含む）を有していた。この cDNA断片には、配列番号： 1で表される 540アミノ酸からなる新しい ADAM夕ンパク質がコ一ドされ、シグナル 配列、 プロ領域、 メタ口プロテア一ゼ領域、 デイスインテグリン領域、 及び一部 のシスティンリツチ領域が認められた。 pTB 2053を公知の方法で、ェシェ リヒア コリ （Escherichia coli) DH 5 aに導入し、 ェシエリヒア コリ (Escherichia coli)DH 5 α/ρΤΒ 2053を得た。 実施例 2 大腸菌発現ベクターの構築
本発明の ADAMタンパク質のメタ口プロテアーゼ領域とデイスインテグリン領域 を大腸菌において発現を行った。 すなわち、 実施例 1で得た pTB 2053をテ ンプレートとし、 2種のプライマー [CAT ATG GTT CAG GAA CAT GAG AAA TAC ATA (配列番号 : 1 7) ] および [CTC GAG GAA GCC ATT GAC TTG GAA TCT A丁 C (配列 番号： 18) ] を用いて Pfu turbo (STRATAGENE社製） のプロトコールに従い PC R反応 （95°Cで 20秒、 55 °Cで 1 0秒、 72°Cで 2分、 25回） を行った。 PCR反応液を 1 %ァガロースゲルで電気泳動後、 900 b p付近のバンドを回 収し、 QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN社製） を用いて精製した。 これを pCR- Bluntベクタ一 （INVITROGEN社製） に挿入し、大腸菌 DH5 aを形質転換した。 この大腸菌よりプラスミドを抽出し、 Nd e Iと Xho Iで切断し、 同様に処理 した pET21a (N0VAGEN社製） とライゲ一シヨンを行った後、 大腸菌 DH5 aを形質 転換した。 次にこの形質転換体よりプラスミド （pMDH) を抽出し、 配列に誤 りのないことを確認した。 実施例 3 組換え型 ADAMタンパク質の大腸菌での発現と精製
実施例 2で得られたプラスミド p M D Hで大腸菌 BL 21 (DE3)を形質転換し、発現 に用いた。 発現誘導は ImMのイソプロピルチオガラクトピラノシドで行い、 精 製は Ni- NTA Agarose (QIAGEN社製） を用いて添付のマニュアルに従った。 その結 果、 目的の約 35 kD aの組換え型 ADAMタンパク質はバッファ一 E (A handbook for high-level expression and purification of 6xHis-tagged proteins, QIAGEN 社） で溶出された。 次に分画分子量 6, 000〜8, 000の透析膜 （SPECTRUM MEDICAL社製） を用いて 4°Cにて緩衝液 [0. 2M トリス—塩酸 （pH9. 0) ， 3mM 2—メルカプトエタノール， 0. 3mM 2—ヒドロキシェチルジスル フイ ド， 2M尿素， 0. 1 %トリトン X— 100]に対して 3時間透析後、 緩衝液 [0. 2M トリスー塩酸 (pH8. 5) , 3mM 2—メルカプトエタノール, 0. 3mM 2—ヒドロキシェチルジスルフイ ド， 0. 5M 尿素， 0. 1% トリトン X— 100]で 2時間、 緩衝液 [5 OmM トリス—塩酸 （pH8. 0) ， ImM 2—メルカプトエタノール， 0. ImM 2—ヒドロキシェチルジスル フイ ド， 0. 1M 尿素， 0. 05%トリトン X— 100、 15 OmM 塩化ナ トリウム]で 3時間、緩衝液 [5 OmM トリス—塩酸 (pH 7. 5) , 0. 05% トリトン X— 100、 15 OmM 塩化ナトリウム]で 16時間透析した。 このよ うにして 500 mLの培養液から 3. 9 m gの組換え型 ADAM夕ンパク質が取得で きた。 実施例 4 組換え型 ADAM夕ンパク質のプロテアーゼ活性の検出
96穴プレート （フルォロ Bプレート、 大日本製薬製） に 30 Lの緩衝液 [2 5 OmM トリス—塩酸 （pH 7. 5) 、 5mM 塩化カルシウム、 10 M 塩化亜鉛]と実施例 3で得られた組換え型 ADAMタンパク質 （0. 8mgZmL) を 20 L添加した。 3 7 °Cにて 1 0分間プレインキュベーション後、 1 0 Mの 基質 [MOCAc—Ar g— P r o— Ly s— P r o— Ty r— A l a -N v a -T r p-Me t—Ly s (DNP) — NH2、 ペプチド研究所 社製]を 10 O L 添加することによって酵素反応を開始した。 37°Cにて 22時間反応後マイクロ プレートリーダー （Applied Biosystems社製） を用いて励起波長 328 nm, 吸 収波長 393 nmで反応液中の蛍光強度を測定した。 組換え型 ADAMタンパク質無 添加の場合の蛍光強度が 2であったのに対し、 添加した場合は 70の蛍光強度を 示した。 これらのことから、 本 ADAMタンパク質はプロテア一ゼ活性を有すること が明らかになった。 この、 アツセィ系を用いて本発明の ADAMタンパク質のプロテ ァーゼ活性を調節 （阻害及び促進） する物質の探索が可能と考えられる。 実施例 5 デイスインテグリン領域 10アミノ酸欠失型発現プラスミドの調製 国際公開公報 （W0 97/09430) 記載の遺伝子は、 本発明で得られた遺伝子 (配列 番号： 3)と比較すると蛋白コード領域中ディスィンテグリン領域に 30塩基対 (10アミノ酸） を欠失した遺伝子である。 この遺伝子由来のタンパク質と本発 明にて得られた遺伝子由来のタンパク質の活性を比較するため国際公開公報 （W0 97/09430) 記載の遺伝子を以下の方法で取得した。 すなわち、 5 ' 側をリン酸化 した 2種のプライマ一 [CTC AGA TGT CCC ACA ATC ACA GTC (配列番号： 19) ] および [ACA TGT AAA ATC AAA GCA ACT TTT C (配列番号： 20) ] を用いて実施 例 1で得た p TB 2053をテンプレートとし、 Pfu turbo (STRATAGENE社製） の プロトコ一ルに従い PCR反応 （96°Cで 30秒、 56°Cで 30秒、 72 で 1 2分、 30回） を行った。 P CR反応液を 1 %ァガロースゲルで電気泳動後、 QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN社製) を用いて精製した。 これを T4リガ —ゼ （二ツボンジーン社製） を用いて自己環状化させ、 大腸菌 DH 5 αにトラン スフォーメーションした。 次にこの大腸菌よりプラスミドを抽出し、 塩基配列を 決定し、 特許 （W097/09430) 記載の遺伝子コーディング領域が pCDNA3.1に挿入さ れた発現プラスミド （pATR— CT) が得られたことを確認した。 実施例 6 ゥシ鼻軟骨プロテオダリ力ン分解活性の比較
ゥシ鼻中隔部分より軟骨を採取し、 直径 4mmコルクポーラ一を用いて円筒形 に切断後、 その円筒形軟骨をメスで厚さ約 lmmに切断し、 ディスク状の軟骨片 とした。 次にこの軟骨片を— 80°C及び 37°Cにて凍結、 融解を 5回行い、 最後 に 65°Cで 20分加熱処理して以下の活性測定用の基質として用いた。
1日前に 1 X 104個ずつ 48穴プレートに播き、 培養しておいた COS 7細胞 を用いてトランスフエクションを行った。 トランスフエクションは Fugene6 (ベー リンガーマンハイム社製） を用い、 そのプロトコールに従った。 トランスフエク シヨン 4時間後、 上記で得られたディスク状ゥシ軟骨片を添加し、 3 7°Cにてさ らに培養を継続した。 培養 2日後、 上清中の硫酸化グリコサミノダリカンを C. J. Handleyと D. J. Buttleの方法 (Methods in Enzymology 248:47-58, 1995) に従 つて測定し、 各種遺伝子導入によるプロテオダリカン分解亢進を比較した。 その 結果を下表に示すが、 pTB 2 0 5 2、 pTB 2 0 5 3のトランスフエクシヨン によってプロテオダリカン分解は有意に亢進し、 国際公開公報 （W097/09430) 記 載の遺伝子では明らかな分解は認められなかった。
表 1
Figure imgf000076_0001
SGAG (硫酸化グリコサミノダリカン） 値は 4連の実験の平均値 実施例 7 抗 ADAM夕ンパク質ポリクローナル抗体の取得
実施例 3で得られた組換え型ヒト ADAMタンパク質 （200 g ) を完全フロイン トアジュバントに懸濁し、 日本白色ゥサギに初回免疫を行った。 以後、 2 週間ご と 4回、 400 の組換え型ヒト ADAMタンパク質を不完全フロイン卜アジュバン 卜に懸濁し、 日本白色ゥサギに免疫を行った。 最終免疫の 1週間後に全採血する ことにより、約 50mlの血清が取得できた。抗体価の測定は以下のようにして行つ た。組換え型ヒト ADAMタンパク質を 0. 5 g/ゥエルとなるように固定化した後、 BSAでプロッキングした 96穴プレートに希釈したゥサギ血清を添加し、 室温で 2 時間静置した。 0. l¾Tween-20を含む PBSで洗浄後、抗ゥサギ IgG-パーォキシダ一 ゼ （Capel社） を加え、 2時間静置した。 洗浄後、 0-フエ二レンジァミンと過酸化 水素を含むクェン酸-リン酸緩衝液を加え、 20 分間発色させた。 反応を 1 M硫酸 で停止させた後、プレートリーダーを用いて 492nMの発色を測定した。 その結果、 非免疫ゥサギの約 1万倍の抗体価を示す抗血清が得られた。 実施例 8 ラット I I 型コラーゲン遺伝子のプロモーター及びェンハンサーのク ローニング
ラット I I型コラーゲン遺伝子のプロモーター領域は、 Kohnoら （L Bi ol. Chem 260 : 4441, 1985 ) の塩基配列をも とに設計したプライ マー [ 5 ' — GTGGTGGTGGACAACTAGGAAACTCTGG - 3 ' (配列番号 ： 2 1 ) ] および [ 5 ' — CGAGGCGAATCATGGCTCACCGCG - 3 ' (配列番号： 2 2 ) ] を用いて PCR法により得た。 得られた約 1. 2kbの断片を T0P0 TA Cloning Ki t (Invi trogen社）を用い、 プロト コールに従い添付の PCR II-TOPOにクローニングした （pCRII- promoter 2) 。 そ の塩基配列を ABI社製 DNAシークェンサ一で常法により確認した。 pCRIIプラス ミドのマルチプルクローニングサイトの Notl (5'側） とプロモ一夕一配列内の Smalサイトで切り出し、 実験に用いた。
ラット II型コラーゲン遺伝子のェンハンサー領域は、 Krebsbachら （J. Biol. Chem 271 :4298, 1996)の塩基配列をもとに Mlulサイトが生じるように設計したプ ライマ一 [5' - TCCACGCGTTTGGGAAACTTCTTGGCTGCG - 3 ' (配列番号: 23)] およ び [5' - GCTTCGTCGCCGCTACGCGTGGGGCCGGA - 3 ' (配列番号： 24) ] を用いて PCR法により得た。 得られた 0.35kbの Mlul断片の塩基配列を ABI社製 DNAシ一 クェンサ一で常法により確認した。次にその Mlul断片に EcoRI リンカ一を付与し、 pBluescript KSII +の EcoRIサイトに挿入した (pKS- enhancer 1-4) 。 実施例 9 DNA転移ラット用発現ベクターの作成
DNA転移ラット用発現ベクター、 PTB2076 (図 5 ) を常法に基づいて構築した。 本プラスミドは下記の 1) から 5) までの断片が pBluescriptll KS +の Notlサ ィトに揷入されたものである。
1) Col2Al promoter： ラット Π型コラーゲン遺伝子のプロモーター領域、 実施 例 8に記載の pCRIIのマルチプルクローニングサイト内の Notlから II型コラ一 ゲン遺伝子プロモーター内にある Smalサイ卜までの 1, 120b 断片 （Smalサイト を Sailサイ卜に変換） 。
2) SV40 splicing： pTB399 (R. Sasadaら、 Cell Structure and Fund ion 12:205, 1987) 由来のスプライシングサイトを含む断片の 5' 側を Sall、 3' 側を Clalに 改変したもの。
3 ) ADAM：新規 ADAM遺伝子。
実施例 1で取得したプラスミド （PTB2052)を铸型として、合成プライマー [5' -ATC GAT TGA GCG AGA AGA GCA GAC ACC— 3 ' (配列番号： 25 ) ] 及び [ 5 ' -AGA TCT TGC CAT CCA GAT TTT CCA GTT T_ 3 ' (配列番号： 26) ] を用いて Pfu turbo (STRATAGENE)を使用して、 PCR反応（95 、 20秒、 52。C、 10秒、 72。C、 3分、 を 30サイクル） を行い、 5' 側に Clalサイト、 3' 側に Bglllサイトを付 与した約 1.4Kbの遺伝子断片 （図 3及び 4の 13番目から 2448番目の塩基に対応 する） 。
4) SV40 polyA： pTB399 (R. Sasadaら、 Cell Structure and Function 12:205, 1987) 由来の polyA付加シグナルを含む BglII、 Hindlll断片。
5) Col2Al enhancer：実施例 8に記載したラット II型コラーゲン遺伝子のェン ハンサー領域を含む pKS-enhancer 卜 4の Hindlllサイ卜から Notlサイトまでの 断片。 実施例 10DNA転移ラッ卜の作出
採卵用としてラット SD(ISG)系統を 8週齢で購入し、 7:00〜19:00 12時間明期 条件で 1週間飼育し、 まず 1日目 11 :00に卵胞刺激ホルモン （妊馬血清性性腺刺 激ホルモン、 一般に PMSGと略する） （30IU/個体） を腹腔注射し、 3日目 11:00 に黄体形成ホルモン（ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン、一般に hCGと略する） （5 IU/ 個体）を腹腔注射して雄ラット SD(ISG)系統 10週齢以降の個体と 14:00以降に 1:1 で同居、交配させた。 4日目 9:00に交配させた雌ラッ卜の膣栓確認を行い、 13:30 から膣栓確認した個体を屠殺後、 採卵を開始した。 受精卵で前核形成卵を選択し、 14:30から実施例 9で得られたプラスミド PTB2076を Notlによって切断し、新規 ADM遺伝子を含む断片を 10 g/mlの濃度に調製し、 その 1〜2 1 を顕微鏡下 で観察しながら受精した単細胞期の SD系統ラット卵の雄前核へ注入した。続いて、 卵細胞を自体公知の HER培地で培養し、 5 日目 13:30に 2細胞期胚を確認してか ら、 Wagnerら （Pro at. Acad. Sc. U. S.A. , 78： 5016, 1981) により記載され た方法に従って、偽妊娠の雌 Wistar系統ラッ卜の卵管に移植し、 着床させた。偽 妊娠の雌 Wistar系統ラット （11週齢以降） は 0日目 11 :00にコンセラ一ル （武 田薬品工業） を皮下注射 （50 11 g/個体） し、 4 日目 15:00以降に雄 Wistar系統 12週以降の個体と 1:1で同居、交配させた。 5日目 9:00に交配させた雌ラットの 膣栓確認を行い、 上記の目的で使用した。 実施例 1 1 D N A転移ラットの遺伝子解析
3週齢に達した出産仔の尾から B. H0GA ら （MANUPULATING THE MOUSE EMBRYO, 1986、 COLD SPRING HARVOR LABORATORIES) の方法で採取した D N Aを用いて、 実 施例 8記載のラット II 型コラーゲンプロモーター配列を基に設計したプライマ 一 [5' -CGCCGCTGGGCTGCCGGGTC-3' (配列番号： 2 7) ] 、 実施例 1記載の新 規 ADAMタンパク質遺伝子配列を基に設計したプライマ一（配列番号： 1 6で表わ される塩基配列のうち、 第 2 9 3番目から第 3 0 8番目までの塩基に対応する塩 基配列に相補的な塩基配列からなる DN A断片） [5' -TCCATCCCGATGTATGGGGC 一 3' (配列番号： 28) ] を用いて PCRを行った。 合計 9 5個体の産仔ラット を解析した結果、 780bpの PCR断片が検出できた PCR陽性個体は 6個体であった。 これら 6個体の PCR陽性個体のゲノム DNAをサザンハイブリダィゼ一ション法 により解析した。 すなわち、 10 gの DNAを Hindlllで完全に切断し、 1.0% ァガロースゲル電気泳動後、 ナイロンフィル夕一へ移した。 このフィル夕一を、 実施例 9で用いた新規 ADAM遺伝子 （約 2.4Kbの遺伝子断片 （図 3及び 4の 13番 目から 2448番目の塩基に対応する） ） を DIG DNAラベリングキット （ベリンガー マンィハイム社製） で標識したプローブと一晩ハイブリダィズし、 2xSS 0.1% SDSにて室温で 2回洗浄し、 次に 0. lxSS (：、 0.1 %SDSにて 68°Cで 2回洗浄した。 検出には DIG蛍光検出キット （ベリンガーマンィハイム社製） を用いた。 その結 果、 これらの 6個体には全て 1.9Kbの断片が観察され、新規 ADAM遺伝子の導入が 確認された。 また、 導入された遺伝子のコピー数は、 個体番号 RCA-14 (雌） が 40 コピー、 RCA- 22 (雄） が 5コピー、 RCA- 50 (雄） が 40コピー、 RCA- 7 9 (雄） が 2コピー、 RCA- 8 3 (雌） が 10コピー、 RCA- 8 6 (雄） が 40コピ一であること が確認された。 実施例 1 2 DNA転移ラッ卜の尾椎でのヒト ADAMタンパク質の発現
DNA転移ラット RCA- 14 (雌） の尾椎末端組織、 約 5mmを生体より切り出した c この組織を 4%パラホルムアルデヒドにて室温で一晩固定した。 その後、 70%エタ ノールにて室温で 24時間脱脂後、 0.5M EDTA(pH-8.0)にて室温で 1週間脱灰した c 脱灰完了は針で組織を突き刺して容易に貫通することで確かめた。 脱灰完了後、 室温にて 2時間水洗し、 常法 （組織学研究法、 佐野豊、 南山堂） に従ってパラフ インブロックを作製した。 ブロックは薄切まで 4°Cで保存した。 薄切時にブロッ クを室温まで戻し、 切片を 5マイクロメーターにて薄切し、 温水上で伸展後、 ス ライドグラス上にマウントし、 一晩 37 にて乾燥させた。 免疫染色は実施例 7記 載のゥサギポリクローナル抗体を一次抗体に使用し、 vectas tain ABC universal ki t (Vec tor社）のプロトコ一ルに従って行った。発色は peroxidase subs trate AEC ki t (Vec tor社） を用い、 添付プロトコ一ルに従って発色させた。
その結果、 D NA転移ラット RCA-14 (雌） の尾椎末端軟骨組織中の増殖軟骨細胞 から肥大軟骨細胞層にかけて本発明の新規ヒト ADAM タンパク質の存在が確認さ れた。
こうして得られた本発明の新規 ADAM遺伝子を組み込んだ D N A転移ラットは、 慢性関節リウマチや変形性などの関節の変形、 損傷を伴う関節症関節疾患、 骨疾 患、 および慢性炎症性疾患などを発症することがあり、 その疾患モデル動物とし て利用することができる。 さらに、 本発明の D N A転移ラットを用いて、 これら 病態機序の解明およびこれら疾患を治療方法の検討を行うことが可能である。 ま た本発明の D N A転移ラッ卜の作製方法により、 目的とする遺伝子 D N A転移ラ ットを効率的に高収率で得ることができる。 実施例 1 3 ADAMタンパク質のプロテアーゼ活性を調節する物質の探索
実施例 3に記載した方法と同様にして得た ADAMタンパク質溶液（25 fi 1)に 75 1 の緩衝液 (83. 3 mM Tr i s - HC1、 pH7. 5、 16. 7 mM NaCK 1. 67 mM CaCl2> 16. 7 II M CoCl2、 0. 067% B S A) を加えた後 > 25 1 の基質溶液 （50 u M ma-Pro- Lys-Pro-Leu-Al a-Nva-Trp-Lys (DNP) - H 0. 05% BSA、 5% DMS0) を添加すること により酵素反応を開始した。 37°Cで 2時間保温後、 100 1の 0. 5M酢酸緩衝液（pH 3. 0) を加え、 酵素反応を停止した。 酵素液を加えない場合の蛍光強度 （励起波長 340nm、 測定波長 450nmで蛍光プレートリーダ一 （コロナ MTP- 32) を用いて、 蛍 光強度を測定した。 ） が 10であるのに対し、 酵素液を加えた時の蛍光強度は 180 であった。従って、本条件においても本 ADAMタンパク質はプロテア一ゼ活性を示 すことが明らかになった。
10 1の所定の濃度に調整した被検化合物 （50% DMSOに溶解） を上記の活性測 定系に加えた。 その結果、 ac t inonin (シグマ社 A6671) は 0. 6mMの I ( ^値 （プロ テアーゼ活性を 5 0 %阻害する被検化合物の濃度） を、 N-CBZ- Pro- Leu-Gly hydroxamate (シグマ社 C8537) は約 0. 1 の IC5。値を示した。 この事から、 本 アツセィ系を用いて本発明の ADAMタンパク質のプロテアーゼ活性を調節（阻害あ るいは促進） する物質の探索が可能と考えられた。 産業上の利用可能性
本発明のタンパク質およびそれをコードする D NAは、 例えば、 椎間板ヘル二 ァ、 坐骨神経痛、 糸球体腎炎、 糖尿病性腎症、 肝繊維症、 肺繊維症または大理石 病などの疾病の治療 ·予防剤として使用することができる。 また、 本発明のタン パク質は、 本発明の夕ンパク質のプロテアーゼ活性および Zまたは細胞外マ卜リ ックス分解酵素活性 （特にプロテオダリカン分解酵素活性） を促進もしくは阻害 する化合物またはその塩のスクリ一ニングのための試薬として有用である。 さら に、 本発明のタンパク質に対する抗体は、 本発明のタンパク質を特異的に認識す ることができるので、 被検液中の本発明の夕ンパク質の定量などに使用すること ができる。

Claims

請求の範囲
1. 配列番号： 2で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ 酸配列を有するタンパク質またはその塩。
2. 配列番号： 2で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ 酸配列をディスィンテグリン領域として有する請求項 1記載のタンパク質又はそ の塩。
3. ADAMフアミリーに属する請求項 1記載の夕ンパク質またはその塩。
4. 配列番号： 1または配列番号： 15で表されるアミノ酸配列と同一もしくは 実質的に同一のアミノ酸配列を有する請求項 1記載のタンパク質またはその塩。
5. プロテアーゼ活性を有する請求項 1記載のタンパク質またはその塩。
6. 配列番号： 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ 酸配列を有する請求項 1記載のタンパク質の部分べプチドまたはその塩。
7. 配列番号： 2で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ 酸配列を有するタンパク質をコードする塩基配列を有する DN Aを有する DNA。
8. 配列番号： 3または配列番号： 16で表される塩基配列を有する請求項 7記 載の DNA。
9. 請求項 6記載の部分ペプチドをコードする DNAを有する DNA。
10. 配列番号： 4で表される塩基配列を有する請求項 9記載の DNA。
1 1. 請求項 7記載の DNAを有する組換えベクター。
12. 請求項 1 1記載の組換えべクタ一で形質転換された形質転換体。
13. 請求項 12記載の形質転換体を培養し、 請求項 1記載のタンパク質を生成 せしめることを特徴とする請求項 1記載のタンパク質またはその塩の製造法。
14. 請求項 1記載のタンパク質もしくは請求項 6記載の部分ペプチドまたはそ の塩に対する抗体。
15. 請求項 7記載の DN Aまたは請求項 14記載の抗体を含有してなる診断薬。
16. 請求項 1記載のタンパク質もしくは請求項 6記載の部分ペプチドまたはそ の塩を含有してなる剤。
17. 請求項 1記載のタンパク質もしくは請求項 6記載の部分ペプチドまたはそ の塩を含有してなる医薬。
1 8 . 椎間板ヘルニア、 坐骨神経痛、 糸球体腎炎、 糖尿病性腎症、 肝繊維症、 肺 繊維症または大理石病の予防 ·治療剤である請求項 1 7記載の医薬。
1 9 . 請求項 1記載のタンパク質またはその塩を用いることを特徴とする、 プロ テアーゼ活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
2 0 . 請求項 1記載のタンパク質またはその塩を含有してなる、 プロテアーゼ活 性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
2 1 . 請求項 1 9記載のスクリーニング方法または請求項 2 0記載のスクリー二 ング用キットを用いて得られうる、 プロテア一ゼ活性を促進または阻害する化合 物またはその塩。
2 2 . 請求項 1 9記載のスクリーニング方法または請求項 2 0記載のスクリー二 ング用キットを用いて得られうるプロテァーゼ活性を促進または阻害する化合物 またはその塩を含有してなる医薬。
2 3 . 配列番号： 5で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を有するタンパク質またはその塩を含有してなる細胞外マトリックス分 解剤。
2 4 . 細胞外マトリックスがプロテオグリカンである請求項 2 3記載の剤。
2 5 . 医薬組成物である請求項 2 3記載の剤。
2 6 . 椎間板ヘルニア、 坐骨神経痛、 糸球体腎炎、 糖尿病性腎症、 肝繊維症、 肺 繊維症もしくは大理石病の予防 ·治療剤である請求項 2 3記載の剤。
2 7 . 配列番号： 5で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を有するタンパク質またはその塩を用いることを特徴とする、 細胞外マ トリックス分解酵素活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリー二 ング方法。
2 8 . 配列番号： 5で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を有するタンパク質またはその塩を含有してなる、 細胞外マトリックス 分解酵素活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キッ 卜。
2 9 . 請求項 2 7記載のスクリーニング方法または請求項 2 8記載のスクリー二 ング用キットを用いて得られうる、 細胞外マトリックス分解酵素活性を促進また は阻害する化合物またはその塩。
3 0 . 請求項 2 7記載のスクリーニング方法または請求項 2 8記載のスクリ一二 ング用キットを用いて得られうる、 細胞外マトリックス分解酵素活性を促進また は阻害する化合物またはその塩を含有してなる医薬。
3 1 . 配列番号： 5で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を有するタンパク質またはその塩に対する抗体を含有してなる診断薬。
3 2 . 被検遺伝子を導入した組換え体と動物由来の軟骨あるいは軟骨基質産生細 胞を混合培養し、 培養上清中の硫酸化ダリコサミノダリカンを測定することを特 徵とするプロテオグリカン分解酵素遺伝子を検出する方法。
3 3 . ( 1 ) プロテオグリカン分解酵素活性を有するタンパク質をコードする遺 伝子を導入した組換え体、 （2 ) 動物由来の軟骨または軟骨基質産生細胞および ( 3 ) 被検物を混合培養し、 培養上清中の硫酸化グリコサミノダリカンを測定す ることを特徴とする、 プロテオダリ力ン分解酵素の活性阻害剤あるいは活性促進 剤のスクリーニング方法。
3 4 . ( 1 ) ①請求項 7記載の DNAまたは②配列番号： 5で表されるアミノ酸配 列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質をコ一ドす る塩基配列を有する DNAを含有する DNA、 を含有する動物細胞、 （2 ) 動物由来 の軟骨または軟骨基質産生細胞および （3 ) 被検物を混合培養し、 上清中の硫酸 化ダリコサミノグリカン量を測定することを特徴とするプロテオダリ力ン分解酵 素の活性阻害剤あるいは活性促進剤のスクリーニング方法。
3 5 . 配列番号： 2で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を有するタンパク質をコードする塩基配列を有する D N Aを有する D N Aまたはその変異 D N Aを有する非ヒ卜哺乳動物。
3 6 . 配列番号： 2で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を有するタンパク質を発現しうる請求項 3 5記載の動物。
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