WO2000009557A1 - Nouveau gene et nouvelle proteine pgth codee par ce gene - Google Patents

Nouveau gene et nouvelle proteine pgth codee par ce gene Download PDF

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WO2000009557A1
WO2000009557A1 PCT/JP1999/004352 JP9904352W WO0009557A1 WO 2000009557 A1 WO2000009557 A1 WO 2000009557A1 JP 9904352 W JP9904352 W JP 9904352W WO 0009557 A1 WO0009557 A1 WO 0009557A1
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protein
dna
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seq
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Osamu Ohara
Takahiro Nagase
Nobuo Nomura
Kiyoshi Takayama
Hitoshi Toyoda
Makoto Yoshimoto
Original Assignee
Kazusa Dna Research Institute Foundation
Taisho Pharmaceutical Co., Ltd.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/72—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a novel human brain-derived protein P GTH having prostaglandin transport activity, and a gene encoding the protein! ) It is about g th. Background art
  • Prostaglandin is a general term for a series of bioactive lipids such as prostaglandin E, prostaglandin D, prostaglandin F, prostaglandin I, and prostaglandin J.
  • Prostaglandins regulate physiological functions such as blood flow regulation, sleep, gastric mucosal protection, thrombus formation, pregnancy, inflammation, and atherosclerosis via specific cell membrane receptors or nuclear receptors. It is a physiologically active substance in the body, which is deeply related to the pathological enhancement of diabetes.
  • Prostaglandin is converted to eicosaporic acid such as arachidonic acid, which is cleaved from cell membrane by phospholipase A2, in response to various physiological stimuli by cyclooxygenase and various prostaglandin synthases. As a result, it is produced intracellularly and acts on autocrine / paracrine after being released outside the cell. On the other hand, released prostaglandins are taken up by specific cells after circulating in the bloodstream, and are lost by metabolic degradation.
  • eicosaporic acid such as arachidonic acid
  • prostaglandins show a very small amount of strong bioactivity, their production is strictly controlled by controlling the activities of production enzymes and metabolic enzymes.
  • prostaglandins alone cannot cross the lipid bilayer of cell membranes. Therefore, it is assumed that a special protein is involved in the process of prostaglandin produced in cells being released outside the cells and the process of being taken up by specific cells after circulating in the bloodstream as a prostaglandin transport mechanism. It has been.
  • hPGT prostaglandin transporter
  • the present inventors have conducted intensive studies to determine the desired protein from the genes expressed in the human brain. As a result, the existence of the novel protein PGTH (Prostaglandin Transporter Homolog) and the gene encoding it P gth And succeeded in completing the present invention.
  • PGTH Prostaglandin Transporter Homolog
  • the present invention relates to (a) a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, or (b) an amino acid in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the present invention relates to a protein comprising a sequence and having a prostaglandin transport activity.
  • the present invention relates to (c) a gene consisting of the DNA of SEQ ID NO: 2 or (d) a DNA that hybridizes with the DNA of SEQ ID NO: 2 under stringent conditions and has a prostaglandin transport activity. It relates to DNA encoding a protein having the DNA.
  • Pgthh a gene of the present invention, can be isolated as a cDNA fragment containing the gene from a cDNA library derived from human brain.
  • the cDNA library used by the present inventors was prepared from human brain-derived mRNA commercially available from Clonetech.
  • cDNA library as a method for identifying a cDNA encoding a protein having a prostaglandin transport activity, a long chain c D ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ according to the method of Ohara et al. (DNA Research, Vol. 4, ⁇ 53, 1997).
  • a comprehensive cDNA library analysis method using the library 1 was used. 25,000 recombinants were randomly selected from the long-chain cDNA library derived from human brain prepared by the method of Ohara et al., And 5 'and 3' of the cDNA portion of 15,000 clones were selected.
  • the nucleotide sequence on the 'side is determined, and the gene encoding hPGT already reported from the sequence on the 5' side of all clones is Homologous clones can be found by using DNA analysis programs (BLAST and FastA).
  • PGTH protein-coding region
  • pg th is a gene consisting of 2130 base pairs (bp) shown in SEQ ID NO: 2.
  • a recombinant gene can be prepared by a general gene recombination technique using an appropriate host vector system.
  • Suitable vectors include E. coli-derived plasmids (eg, pBR322, pUC118, etc.), Bacillus subtilis-derived plasmids (eg, pUB110, pC194, etc.), yeast-derived plasmids (Eg, pSH19 and others), and animal viruses such as bacteriophage II retrovirus and vaccinia virus can also be used.
  • a translation initiation codon and a translation termination codon can be added using an appropriate synthetic DNA adapter.
  • an appropriate expression promoter is connected upstream of the gene.
  • the promoter to be used may be appropriately selected depending on the host. For example, when the host is Escherichia coli, T7 promoter, lac promoter overnight, trp promoter, ⁇ PL promoter overnight, etc., and when the host is Bacillus, S S promoter, etc. When the host is yeast, ⁇ 5 promoter, GAP promoter, ADH promoter, etc., and when the host is an animal cell, SV40-derived promoter, retrovirus promoter, etc. can be used, respectively. .
  • PGTH protein A
  • the fused PGTH expressed in this manner can be excised using an appropriate protease (eg, thrombin or the like).
  • Hosts that can be used for the expression of PGTH include various strains of Escherichia coli belonging to the genus Escherichia, various strains of Bac i 1 lus subt i 1 is belonging to the genus Bacillus, and various types of Saccharomyces cerevisiae as the yeast.
  • COS-7 cells, CHO cells, etc. can be used as strains and animal cells.
  • a transformation method generally used for a selected host cell can be applied.
  • a DNA that hybridizes with the DNA and encodes a protein having a prostaglandin transport activity is also included in the scope of the present invention.
  • the DNA sequence is partially modified by various artificial treatments, such as site-directed mutagenesis, random mutation by treatment with a mutagen, mutation of a DNA fragment by restriction enzyme digestion, etc. Even if these DNA variants are altered, these DNA mutants will hybridize with pgth under stringent conditions and encode a protein having a prostaglandin transport activity. It is within the scope of the present invention irrespective of the difference from the DNA sequence shown in FIG.
  • the degree of the above-mentioned DNA mutation is within an allowable range as long as it has a homology of 90% or more with the DNA sequence of pgth.
  • the degree of hybridization with Pgth can be determined under normal conditions, for example, when the probe is labeled with a DIG DNA Labeling kit (Bellinger's Mannheim Cat No. 1175033) at 32 ° C. Conditions for hybridization in Easy Hyb solution (Boehringer's Mannheim Cat No. 1603558) and washing in 50 x 0.5 XSSC solution (0.1% [w / v] containing SDS) (1XSSC is 0.15M NaCl, 0.015M sodium citrate), so long as it hybridizes to pgth.
  • a protein encoded by a mutant gene having high homology to pgthh as described above and having a prostaglandin transport activity is also included in the scope of the present invention.
  • one or more amino acids in the amino acid sequence of PGTH are deleted or replaced. Even if the mutant is replaced or added, if the mutant is a protein having prostaglandin transport activity, the mutant is within the scope of the present invention.
  • the side chains of the amino acids that are the constituents of proteins differ in hydrophobicity, charge, size, etc., but do not substantially affect the three-dimensional structure (also called three-dimensional structure) of the entire protein In this sense, some highly conservative relationships are known empirically and by physicochemical measurements.
  • the mutation is a highly conserved mutation in the three-dimensional structure of PGTH, and the mutation is If proteins are proteins having prostaglandin transport activity like PGTH, they can be said to be within the scope of the present invention.
  • the degree of mutation is within the acceptable range when the homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is 90% or more.
  • oligonucleotide having a Notl site (GACTAGTTCTAGATCGCGAGCGGCCGCCC (T) 15 ) was synthesized using a DNA synthesizer (ABI380B). Using this as a primer, double-stranded cDNA was synthesized using Superscript II reverse transcriptase kit (Gibco BRL) using human brain-derived mRNA (Clontech) as type II. This synthetic DNA was ligated to an adapter (Takara Shuzo) having a Sail site, followed by Notl digestion, and a 3% or more cDNA fragment was purified by low-melting agarose electrophoresis at a 1% concentration.
  • the purified cDNA fragment was ligated with pBluescriptllSK10 plasmid which had been treated with Sail-Notl restriction enzyme, and the recombinant plasmid was introduced into Escherichia coli ElectroMax DH10B strain (Gibco BRL) by electoporation. Next, 25,000 recombinants were randomly selected from the library, recombinant DNA was extracted, and the 5'- and 3'-bases of the cDNA portion of 15,000 clones were extracted. The sequence was determined. For sequencing, a DNA sequencer (ABI PRISM377) manufactured by PE Applied Biosystems and a reaction kit manufactured by PE Applied Biosystems were used.
  • SEQ ID NO: 3 shows the entire nucleotide sequence of cDNA of the clone.
  • the cDNA contains an ORF encoding a protein consisting of 709 residues (PGTH). Since a termination codon appeared in the same reading frame upstream of the methionine residue, which is the initiation codon of the protein, the amino acid sequence of the protein encoded by the cDNA fragment was as shown in SEQ ID NO: 3. Was confirmed to be the only one.
  • FIG. 1 shows the amino acid homology between the previously reported hPGT and PGTH of the present invention. Both show high homology, especially the conservation of the position of the cysteine residue at the C-terminal side of PGTH, and the 77th residue of hPGT, an amino acid that is particularly important for transport activity. Glutamine, arginine at residue 561, and lysine at residue 614 are also conserved in PGTH.
  • Example 1 Protein Expression by in vitro translation method of Example 2 Pgth with RNaseA, to remove RNaseA in ADVAMAX beads (AGTC Co.), (35 S)
  • In vitro translation was performed using TNT T7. Couple d reticulocyte lysate system (Promega) in the presence of methionine. A part of the reaction solution was separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and analyzed by BAS-2000 (manufactured by Fuji Photo Industry). As a result, as shown in FIG. 2, a single band was confirmed at a position of about 80 kDa.
  • SDS-PAGE SDS-polyacrylamide gel electrophoresis
  • Recombinant cDNA containing SEQ ID NO: 3 isolated in Example 1 was type III, the oligonucleotide of sequence-1 and the oligonucleotide of sequence 12 were used as primers, and PCR was performed using PCR PCR Ver.2. The following PCR operation was performed using a Samarucycla MP (both from Takara Shuzo).
  • the DNA fragment (about 2.2 kb) having a part of SEQ ID NO: 3 was amplified by the above method.
  • the DNA fragment amplified in 1) was fractionated by 1% agarose gel electrophoresis. After the gel was stained with ethidium amide, the gel containing the desired band was cut out by irradiating with ultraviolet light. Extraction and purification of the DNA fragment from the agarose gel were performed using the GENECLEA NII Kit (Bio101).
  • the extracted and purified DNA fragment was subcloned into an animal cell expression vector pTARGET (promega).
  • the ligation solution was reacted for 1.5 hours at 16 ° C with the following composition using Evening DNA Ligation Kit Ver.2 (Takara Shuzo).
  • Escherichia coli K12 strain DH5 was transformed. Transformants were treated with ampicillin (Amp) 50 g / m 1, 5-Bromo-4-Chloro-3-indoly 1- ⁇ -D-galactoside (IPTG) 40 g / ml, Isopropy 1- ⁇ - The cells were plated on LB agar medium containing D-Thio-Ga1actopyranoside (Xga1) 100 / xM, and cultured overnight at 37 ° C.
  • ampicillin Amicillin
  • IPTG 5-Bromo-4-Chloro-3-indoly 1- ⁇ -D-galactoside
  • IPTG 5-Bromo-4-Chloro-3-indoly 1- ⁇ -D-galactoside
  • Isopropy 1- ⁇ - The cells were plated on LB agar medium containing D-Thio-Ga1actopyranoside (Xga1) 100 / xM, and cultured overnight at 37 ° C
  • the colonies that appeared on the above plate were inoculated into 10 ml of LB liquid medium containing 50 g / m1 Amp, cultured at 37 ° C overnight, and the cells were collected by centrifugation.
  • the recombinant DNA was purified using Plasmid Miniprep Kit (manufactured by Qiagen) to obtain pTARGETpgth.
  • the nucleotide sequence was determined using DNA sequencing (PRISM377, manufactured by ABI), and the entire nucleotide sequence of both strands was determined by the primer walking method using the Die-Yuichi-Mine-Yuichi-Ichi method. Since this clone contained all the regions flanked by SEQ ID NOS: 1 and 12 in the sequence of SEQ ID NO: 3, it was confirmed that the target gene pTARGETpgth was cloned.
  • PTARGETpgth obtained in Example 2 has a CMV promoter upstream of pgth, and it is possible to express pgth by introducing the recombinant DNA into animal cells.
  • CHOk 1 cells were cultured in a plastic Petri dish having a diameter of 60 mm.
  • the medium used was HamF-12 (manufactured by Gibco, hereinafter referred to as growth medium) containing 10% fetal bovine serum (Dainippon Pharmaceutical), 50 units / m1 penicillin, and 50 g Zm1 streptomycin. 7 ° C, 5% C_ ⁇ were cultured in 2 presence.
  • the LIPOFECTAMINE reagent manufactured by Gibco
  • pTARGETpgth obtained in Example 2 was overlaid on the cells, cultured for 6 hours, and replaced with the growth medium for 48 hours. did.
  • the cell suspension was dispensed into a 60 mm diameter plastic dish and cultured for another 24 hours. After removing the medium, use the G418 reagent (manufactured by Gibco The medium was replaced with a growth medium containing a final concentration of 500 g / m 1). The culture medium supplemented with the G418 reagent was replaced every three days, and the cells were cultured for 2 weeks. When cell colonies became visible to the naked eye, three were isolated using a stainless steel cup. For use as a control, the pTARGET vector (Promega) alone was introduced into CHO k1 cells in the same manner as described above, and stable transformants were isolated.
  • G418 reagent manufactured by Gibco The medium was replaced with a growth medium containing a final concentration of 500 g / m 1). The culture medium supplemented with the G418 reagent was replaced every three days, and the cells were cultured for 2 weeks. When cell colonies became visible to the naked eye, three were isolated using a stainless steel cup.
  • a PCR reaction was performed on the synthesized cDNA using the same oligonucleotide (SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 1) as in Example 2-1.
  • the amplified DNA fragment is fractionated by agarose gel electrophoresis (gel concentration: 1%), stained with ethidium bromide, and irradiated with ultraviolet light to check whether the target band is amplified.
  • agarose gel electrophoresis gel concentration: 1%
  • stained with ethidium bromide and irradiated with ultraviolet light to check whether the target band is amplified.
  • the target band was amplified only in the CH ⁇ k1 cells into which pTARGETpgth had been introduced, and no amplification could be confirmed in the CH ⁇ k1 cells into which the control vector had been introduced. won.
  • Example 5 Prostaglandin transporting activity of CHOkl cells transfected with pgth Comparison of prostaglandin transporting activity of CHO k1 transfected with pgth established in Example 3 and CH 0 k1 cells transfected with control vector 1 was done.
  • CHOk 1 cells into which 600000 pgth were introduced per well and CH Ok 1 cells into which a control vector had been introduced were cultured in a 6-well culture plate. After 24 hours, the cells were washed with a suitable buffer solution containing bovine serum albumin were further incubated for 20 minutes with buffer containing (Amersham) (3 H) radiolabeled PGE 2. After washing the cells, the cells were collected and the incorporated radioactivity was measured. As a result, CHOk 1 into which pgth was introduced showed a statistically significantly higher value of prostaglandin transport activity than CHOk 1 cells into which control vector 1 had been introduced.
  • Normal monocyte cDNA was prepared using Triscript 1 (Gibco BRL) prepared from Trizo 1 (Gibco BRL) from CD14-positive monocytes from human peripheral blood using Superscript II reverse transcriptase kit (Gibco BRL). Created. Human oxidized LDL-loaded macrophages are obtained by culturing normal monocytes with RPMI-1640 (Dainippon Pharmaceutical) containing human 20% AB type serum and antibiotics for 14 days, and then oxidizing them with copper sulfate according to a conventional method. LDL) was added to a final concentration of 40 / ml and cultured for another 24 hours. CDNA was prepared in the same manner as normal monocytes.
  • the mixture was kept at 94 ° C for 5 minutes, reacted at 94 ° C for 1 minute, kept at 58 ° C for 1 minute, and further kept at 72 ° C for 1 minute 30 times.
  • the PCR reaction solution was fractionated by 1% agarose gel electrophoresis. After the gel was stained with ethidium, a band of about 500 bp amplified by ultraviolet light irradiation was detected.
  • PCR was performed using Gceraldehyde3-Phosphate Dehydrogenase gene amplification primer (G3PDH: Clontech) as a standard cDNA, and the assay was performed. As a result, as shown in FIG. 3, expression of pg th mRNA was strongly induced in oxidized LDL-loaded macrophages.
  • FIG. 1 shows a comparison of amino acid sequence homology between hPGT and PGTH of the present invention.
  • Fig. 2 shows the expression by in vitro translation method using pgth. The results of SDS-PAGE of PGTH are shown.
  • FIG. 3 shows the results of detecting the expression of pg th in human oxidized LDL-loaded macrophages using mRNA using the RT-PCR method.
  • o shows the detection results for human oxidized LDL-loaded macrophages
  • m shows the detection results for human normal monocytes.

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Description

明 細 書
新規遺伝子及びそれにコードされる蛋白質 P G T H
技術分野
本発明は、 プロスタグランジン輸送活性を有する、 ヒト脳由来の新規蛋白質 P G T Hと、 該蛋白質をコードする遺伝子！） g t hに関するものである。 背景技術
プロスタグランジンとは、 プロスタグランジン E、 プロスタグランジン D、 プ ロスタグランジン F、 プロスタグランジン I、 プロスタグランジン J等の一連の 生理活性脂質の総称である。 プロスタグランジンは、 特異的細胞膜受容体、 或い は核内受容体を介して、 血流量調節、 睡眠、 胃粘膜保護作用、 血栓形成、 妊娠と いった生理的機能の調節や炎症、 動脈硬化、 糖尿病の病態亢進に深く関連する、 生体内の生理活性物質である。
プロスタグランジンは、 様々な生理的刺激に応答して、 細胞膜からホスホリパ —ゼ A 2により切り出されたァラキドン酸等のエイコサポリェン酸が、 シクロォ キシゲナーゼならびに各種のプロスタグランジン合成酵素により変換されること で細胞内で産生され、 細胞外に遊離した後にオートクリンゃパラクリンに作用す る。 一方、 遊離したプロスタグランジンは血流を循環後、 特定の細胞に取り込ま れ、 代謝分解を受けて消失する。
プロスタグランジンは微量で強い生理活性を示すことから、 これらの産生は、 生 産系酵素ならびに代謝系酵素の活性制御により厳密に制御されている。
しかしながら、 プロスタグランジンは単独で細胞膜の脂質 2重層を通過するこ とが出来ないことが報告されている。 そのため、 プロスタグランジン輸送機構と して、 細胞内で産生されたプロスタグランジンが細胞外に遊離する過程、 血流を 循環した後に特定の細胞に取り込まれる過程に、 特別な蛋白質の介在が想定され ている。
この輸送機構を担う蛋白質としてプロスタグランジントランスポーター （以下 h P G Tとする ： human Pros tagl and in Transpor t er ) が報告されているものの、 全てのプロスタグランジン 輸送を担う蛋白質ではなく、 不明な点が多い。 そのた め、 この輸送機構に関わる h PGT以外の生体分子を明らかにすることにより、 かかる生体分子を直接的に医薬として使用し、 又は間接的に医薬化合物の探索に 供することが可能となると推察される。 本発明の目的は、 この様な分子を同定し、 医薬等または医薬等の開発に利用することにある。 発明の開示
本発明者らは、 ヒト脳で発現している遺伝子の中から、 所望の蛋白質を把握す るべく鋭意研究の結果、 新規蛋白質 PGTH (Prostaglandin Transporter Homo log)の存在とそれをコードする遺伝子 P g t hの単離に成功し、 本発明を完成し た。
即ち、 本発明は、 （a) 配列番号： 1に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質、 または （b) 配列番号： 1のアミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸が 欠失、 置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつプロスタグランジン 輸送活性を有する蛋白質に関するものである。
さらに本発明は、 （c) 配列番号： 2に記載の DN Aからなる遺伝子、 または、 (d) 配列番号： 2の DNAとストリンジェン卜な条件でハイブリダィズし、 か つプロスタグランジン輸送活性を有する蛋白質をコードする DN Aに関するもの である。
本発明の遺伝子である P g t hは、 ヒト脳由来の c DNAライブラリーから、 該遺伝子を含んだ c DN A断片として単離することができる。 本発明者らが使用 した c DNAライブラリ一は、 クローンテック社から市販されているヒ卜脳由来 の mRN Aをもとに調製したものである
上述の c DNAライブラリーにおいて、 プロスタグランジン輸送活性を有する 蛋白質をコード c DNAを識別する方法として、 小原らの方法 （DNA Research, Vol.4, ρ53, 1997) による、 長鎖 c D Ν Αライブラリ一を用いた網羅的 c D N A ライブラリーの解析方法を用いた。 小原らの方法で作製した、 ヒト脳由来の長鎖 c DN Aライブラリーから無作為に 25, 000個の組換え体を選択し、 1 5， 000クローンの c DNA部分の 5 ' 側ならびに 3 ' 側の塩基配列を決定し、 全 クローンの 5 ' 側の配列から既に報告されている h P GTをコードする遺伝子と 相同性のあるクローンを DNA解析プログラム （BLAST並びに FastA) を用いるこ とで、 見いだす事が出来る。
塩基配列中の蛋白質をコードする領域 （ORF、 open reading frame) の存在 は、 塩基配列をコンピュータ一プログラムを用いて解析する汎用の方法により確 認することができる。 該 c DN A配列の中に目的とする遺伝子の存在を確信した 本発明者らは、 コンピュータ一を利用して該配列中に一つの OR Fを見いだし、 この遺伝子を P g t hと、 該遺伝子にコードされる蛋白質を PGTHと命名した。 本発明である PGTHは、 全 709アミノ酸残基からなる分子量約 80キロダル トン （kDa) の蛋白質である。
p g t hは、 配列番号： 2に示される 2 1 30塩基対 （b p) からなる遺伝子 である。 この p g t hを用い、 適当な宿主ベクター系による一般的な遺伝子組み 換え技術によって、 組み換え遺伝子を調製することができる。 適当なベクタ一と しては、 大腸菌由来のプラスミド （例、 p BR 322、 pUC 1 1 8その他） 、 枯草菌由来のプラスミ ド （例、 pUB 1 10、 p C 194その他） 、 酵母由来の プラスミド （例、 p SH 1 9その他） 、 さらにバクテリオファージゃレトロウイ ルスやワクシニアウィルス等の動物ウィルス等が利用できる。 組み換えに際して は、 適当な合成 DN Aアダプタ一を用いて翻訳開始コドンや翻訳終止コドンを付 加することも可能である。 さらに該遺伝子を発現させるために、 遺伝子の上流に 適当な発現プロモーターを接続する。 使用するプロモーターは、 宿主に応じて適 宜選択すればよい。 例えば、 宿主が大腸菌である場合には、 T 7プロモーター、 l a cプロモ一夕一、 t r pプロモーター、 λ P Lプロモ一夕一などが、 宿主が バチルス属菌である場合には S ΡΟ系プロモーター等が、 宿主が酵母である場合 には ΡΗ〇 5プロモーター、 GAPプロモー夕一、 ADHプロモーター等が、 宿 主が動物細胞である場合には SV 40由来プロモーター、 レトロウイルスプロモ 一夕一等が、 それぞれ使用できる。
また該遺伝子を他の蛋白質 （例、 ダル夕チオン Sトランスフェラーゼ、 プロテ イン Aその他） との融合蛋白質として発現させることも可能である。 このように して発現させた融合型 P GTHは、 適当なプロテア一ゼ （例、 トロンビンその他） を用いて切り出すことが可能である。 P GTHの発現の際に利用できる宿主としては、 ェシェリヒア属菌である Esch erichia coliの各種菌株、 バチルス属菌である Bac i 1 lus subt i 1 isの各種菌株、 酵 母としては Saccharomyces cerevisiaeの各種菌株、 動物細胞としては C O S— 7 細胞、 CHO細胞等が利用できる。
上記組み換えベクターを用いて宿主細胞を形質転換する方法としては、 選択す る宿主細胞に対して一般に用いられる形質転換方法が適用できる。
尚、 本発明においては、 配列番号： 2に示した DN A配列の他に、 該 DNAと ハイブリダィズしかつプロスタグランジン輸送活性を有する蛋白質をコードする DNAも、 本発明の範囲内である。
すなわち、 p g t hの全長配列において、 種々の人為的処理、 例えば部位特異 的変異導入、 変異剤処理によるランダム変異、 制限酵素切断による DNA断片の 変異 '欠失 '連結等により、 部分的に DN A配列が変化したものであっても、 こ れら DNA変異体が p g t hとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、 かつプロスタグランジン輸送活性を有する蛋白質をコ一ドする DN Aであれば、 配列番号： 2に示した DNA配列との相違に関わらず、 本発明の範囲内のもので ある。
上記の DNA変異の程度は、 p g t hの DNA配列と 90 %以上の相同性を有 するものであれば許容範囲内である。 また、 P g t hとハイブリダィズする程度 としては、 通常の条件下、 例えば DIG DNA Labeling kit (ベ一リンガ一 'マンハ ィム社製 Cat No.1175033) でプローブをラベルした場合に、 32°Cの DIG Easy H yb溶液 （ベーリンガー 'マンハイム社製 Cat No.1603558) 中でハイブリダィズさ せ、 50 の0. 5 X S S C溶液 （0. 1 % [w/v] S D Sを含む） 中でメン ブレンを洗浄する条件 （ 1 X S S Cは 0. 1 5M Na C l、 0. 0 1 5M ク ェン酸ナトリウムである） でのサザンハイブリダィゼ一シヨンで、 p g t hにハ イブリダイズする程度であればよい。
また、 上記のごとく p g t hと相同性の高い変異体遺伝子にコードされる蛋白 質であって、 プロスタグランジン輸送活性を有する蛋白質もまた、 本発明の範囲 内のものである。
すなわち、 PGTHのアミノ酸配列の 1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、 置 換もしくは付加された変異体であっても、 該変異体がプロスタグランジン輸送活 性を有する蛋白質であれば、 該変異体は本発明の範囲内のものである。
蛋白質の構成要素となるアミノ酸の側鎖は、 疎水性、 電荷、 大きさなどにおい てそれぞれ異なるものであるが、 実質的に蛋白質全体の 3次元構造 （立体構造と も言う） に影響を与えないという意味で保存性の高い幾つかの関係が、 経験的に また物理化学的な実測により知られている。 例えば、 アミノ酸残基の置換につい ては、 グリシン （G 1 y) とプロリン （P r o) 、 G 1 yとァラニン （A l a) またはバリン （V a 1 ) 、 ロイシン （L e u) とイソロイシン （ I 1 e) 、 ダル 夕ミン酸 （G 1 u) とグルタミン （G i n) 、 ァスパラギン酸 （As p) とァス パラギン （As n) 、 システィン （Cy s) とスレオニン （Th r) 、 Th rと セリン （S e r ) または A 1 a、 リジン （L y s ) とアルギニン （A r g) 、 等 が挙げられる。
従って、 配列番号： 1に示した PGTHのアミノ酸配列上の置換、 挿入、 欠失 等による変異蛋白質であっても、 その変異が PGTHの 3次元構造において保存 性が高い変異であって、 その変異蛋白質が PGTHと同様にプロスタグランジン 輸送活性を有する蛋白質であれば、 これらは本発明の範囲内にあるものと言うこ とができる。 変異の程度としては、 配列番号： 1に示したアミノ酸配列との相同 性が 90 %以上のものが許容し得る範囲である。 産業上の利用可能性
PGTHはプロスタグランジン輸送活性を有していることから、 p g t hの発 現異常あるいは PGTHの機能不全は、 生体の正常なプロスタグランジン生産調 節機構を失うこととなり、 重大な障害となるものと推測される。
従って、 PGTHそれ自体が医薬として有用と考えられる一方、 811 ゃ GTHを用いることにより、 PGTHの機能と同様の機能を有する物質や当該機 能を促進または阻害する物資、 あるいは遺伝子の発現を促進する物質等の探索、 評価を効率よく行うことができる。 発明を実施するための最良の形態 以下実施例を挙げて詳述するが、 本発明はこの実施例に限定されないことは言 うまでもない。 尚、 特に断らない限り、 下記実施例において使用した実験操作は、
Molecular Cloning 2nd. ed. (Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に代表され る各種の標準的な実験書や市販キットの取扱説明書の記載に従い、 また制限酵素 等の各市販製品に対する推奨条件下で行うことができる。 実施例 1 p g t hのクロ一ニング
1) ヒト脳由来長鎖 c DNAライブラリーの構築
Notlサイ 卜を有するオリゴヌクレオチド （GACTAGTTCTAGATCGCGAGCGGCCGCCC (T) 15)を DNA合成機 （ABI380B) で合成した。 これをプライマ一として、 ヒト脳 由来の mRNA (クローンテック社） を铸型に Superscript II逆転転写酵素キッ ト （ギブコ BRL社） で 2本鎖 c DNAを合成した。 この合成 DNAと、 Sail サイ トを有するアダプタ一 （宝酒造） とを c DNAとライゲーシヨンした後に Notl消 化し、 1 %濃度の低融解ァガロース電気泳動により、 3 k b以上のc DNA断片 を精製した。
精製した c DNA断片を、 Sail— Notl制限酵素処理を施した pBluescriptllSK十 プラスミドとライゲーシヨンした後、 大腸菌 ElectroMax DH10B株（ギブコ BRL社） に、 エレクト口ポーレーシヨン法により組み換えプラスミドを導入した。 次いで、 当該ライブラリーから無作為に 2 5, 000個の組換え体を選択し、 組換え DN Aを抽出し、 1 5， 000クローンの c DNA部分の 5 ' 側ならびに 3 ' 側の塩 基配列を決定した。 配列決定には PEアプライ ドバイオシステムズ社製の DNA シークェンサ一 （ABI PRISM377) と同社製反応キッ トを用いた。
2) p g t hの配列を含むクローンの選別
1) で決定した全クローンの 5 ' 側の配列を、 既に報告されている h PGTと D NA解析プログラム （BLAST並びに FastA) を用いて比較したところ、 クロ一ン名 HK 07457が有為な相同性を示した。
3) DN A断片の塩基配列の決定
塩基配列決定には P Eアプライ ドバイォシステムズ社製の D N Aシークェンサ 一を用い、 ダイプライマー法を用いた。 大部分の配列はショットガン法で、 一部 の塩基配列については、 決定した塩基配列を元にしてオリゴヌクレオチドを合成 し、 プライマ一ウォーキング法で両鎖の全塩基配列を決定した。 当該クローンの c DNAの全塩基配列を配列番号： 3に示す。
当該 c DNAは、 7 0 9残基より成る蛋白質 （PGTH) をコードする ORF を含んでいる。 該蛋白質の開始コドンであるメチォニン残基の上流域に同じ read ing frameで終止コドンが出現したことから、 当該 c D N A断片がコードす'る蛋白 質のアミノ酸配列は、 配列番号 3に示したものが唯一のものであることを確認し た。
既に報告されている h P GTと、 本発明である PGTHのアミノ酸の相同性を 第 1図に示す。 両者は高い相同性を示し、 特に PGTHの C末端側に存在するシ スティン残基の位置が保存されていること、 輸送活性に特に重要なアミノ酸であ る h P GTの 7 7残基目のグルタミン、 56 1残基目のアルギニン、 6 14残基 目のリジンが P GTHでもそれぞれ保存されている。
実施例 2 p g t hの in vitroトランスレーション法による蛋白質発現の確認 実施例 1で調製した P g t hを含むプラスミ ドを RNaseAで処理後、 ADVAMAXビー ズ （AGTC社製） で RNaseAを除去して、 （35S) メチォニン存在下で TNT T7. couple d reticulocyte lysate システム （プロメガ社） を用いて in vitroトランスレ一 ションを実施した。 反応液の一部を SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動法 (SD S— PAGE) により分離して、 BAS- 2000 (富士写真工業製） で解析した。 その結果、 第 2図に示すように、 約 80 kD aの位置に単一バンドを確認した。 実施例 3 動物細胞発現用ベクターの構築
1) OR Fを含む c DN Aの増幅
配列番号： 3の該蛋白質の開始コドンより上流の配列を有するオリゴヌクレオ チド （下記の配列一 1) と、 該蛋白質の終止コドンより下流の一部分と逆相補鎖 と配列を有するオリゴヌクレオチド （下記の配列一 2) を DNA合成機 （ABI社製
380B) で合成した。
配列一 1
5 ' - CTGGAGCTCACTGCACTCCAGCAGTC - 3 '
配列一 2 5 ' -AGCTCACACTCGGGAATCCTCTGGCTTC- 3 '
実施例 1で単離した配列番号： 3を含む組み替え c DN Aを铸型とし、 配列 - 1のオリゴヌクレオチドと配列一 2のオリゴヌクレオチドをプライマ一として、 夕カラ LA PCR Kit Ver.2と P C Rサ一マルサイクラ一 MP (いずれも宝酒造製） を用いて、 以下の P CR操作を行った。
cDNA 5 1 (10ng)
10 X PCRバッファ (25mM Mg+ +を含む） 5 n 1
2.5mM dNTP 8/i 1
lO^M 配列一 1 l 1
10 xM 配列一 2 2ii \
水 27.5 At 1
LA Taa °リメラ-セ' _0.5 ii \
総量 50 z l
P CRサイクルは、 94°Cで 2分保持後、 9 8 °Cで 20秒間反応させ、 6 8 °C まで一 1°CZ 2秒の速度で冷却し、 6 8 °Cで 3分保持し、 更に 72 °Cで 1 0分間 保持を 30回繰り返して行った。
上記方法により、 配列番号： 3の一部を有する DN A断片 （約 2. 2 k b) を増 幅させた。
2) 動物細胞用発現べクタ一へのサブクローニング
1) で増幅した DN A断片を、 1 %ァガロースゲル電気泳動で分画した。 ゲル をェチジゥムブ口マイドで染色した後、 紫外光照射して目的とするバンドを含む ゲルを切り出した。 ァガロースゲルからの DN A断片の抽出と精製は、 GENECLEA N II Kit (バイオ 1 0 1社製） を用いて行った。
この抽出精製した DNA断片を、 動物細胞用発現用ベクター pTARGET (プロメガ 社製） にサブクローニングした。 Ligation溶液は夕カラ DNA Ligation Kit Ver.2 (宝酒造製） を用い、 以下の組成で 1 6°Cで 1. 5時間反応させた。
抽出精製した DNA断片 1 / l(50ng)
pTARGET 1 u 1 (10ng)
水 3 1 Li gat ion溶液 5 1
総量 10
上記反応後の溶液を用いて、 大腸菌 K 1 2株 DH 5の形質転換を行った。 形質 転換体をアンピシリン （Amp) 50 g/m 1 , 5-Bromo-4-Ch loro-3-indoly 1 -^-D-galactoside( I P TG) 40 g/m l、 I s opr opy 1 - β -D-Th i o-Ga 1 ac t op yranoside (X— g a 1 ) 1 00 /x Mを含有する L B寒天培地にプレーティングし、 37 °Cで一晩培養した。
上記プレートに出現したコロニーを 5 0 g/m 1の Ampを含む LB液体培 地 1 0m 1 に接種して 3 7 °Cで一晩培養し、 遠心分離によって菌体を集めた後、 QIAprep Spin Plasmid Miniprep Kit (キアゲン社製） で組換え DNAを精製し、 pTARGETpgthを得た。
3) 導入 c DN Aの塩基配列の決定
塩基配列決定には DN Aシークェンサ一 （ABI社製 PRISM377) を用い、 ダイ夕一 ミネ一夕一法を用い、 プライマーウォーキング法で両鎖の全塩基配列を決定した。 当該クローンは配列番号： 3の配列のうち、 配列一 1及び配列一 2に挟まれるす ベての領域を含んでいたことから、 目的とする遺伝子 pTARGETpg t hがクローニング されたことを確認した。
実施例 4 CHO k 1細胞への導入と安定な形質転換体の取得
実施例 2で取得した pTARGETpgthは p g t hの上流に CMVプロモーターを有し ており、 当該組換え DN Aを動物細胞中に導入すれば、 p g t hを発現させるこ とが可能である。
CHOk 1細胞を直径 60mmのプラスチックシャーレで培養した。 培地とし ては 10%牛胎児血清（大日本製薬） 、 50ユニット/ m 1のペニシリン、 50 g Zm 1のストレプトマイシンを含む HamF- 12 (ギブコ社製、 以下増殖培地とする） を使用し、 3 7°C、 5 %C〇2存在下で培養した。 細胞密度が 50 %になった時点 で、 実施例 2で取得した pTARGETpgthを含む LIPOFECTAMINE試薬 （ギブコ社製） を、 細胞上に重層して 6時間培養した後、 増殖培地に置換して 48時間培養した。 ト リブシンで細胞を分散した後、 細胞懸濁液を直径 60mmのプラスチックシャ一 レに分注してさらに 24時間培養した。 培地を除いた後、 G418試薬 （ギブコ社製 ；終濃度 5 00 g/m 1 ) を含有する増殖培地に置換した。 G418試薬添加培地 を 3日毎に交換してして 2週間培養した。 細胞のコロニーが肉眼で確認できるよ うになつた時点で、 ステンレスカップを用いて を 3個単離した。 対照と して用いるために、 CHO k 1細胞に pTARGETベクター （プロメガ社製） のみを上 記と同様にして導入し、 安定な形質転換体を単離した。
2) 形質転換体中の遺伝子発現の確認
単離した各形質転換体を、 6穴のプレートで G418添加培地 （終濃度 500 z g /m 1 ) で培養し、 細胞密度が再度 8 0 %コンフルェントになった時点で培地を 除去し、 PB Sを添加し洗浄後、 Trizol (ギブコ社製） を用いて細胞から全 RN Aを精製した。 2 2 gの全 RNA铸型に、 Superscript逆転転写酵素 （ギブコ社製） を用いて c DN Aを合成した。
合成した c DNAを铸型に実施例 2— 1と同じオリゴヌクレオチド （配列一 1、 配列一 2) を用いて、 P CR反応を実施した。
cDNA (lOOng)
10XPCRバッファ (25mM Mg++を含む) 5 1
2.5mM dNTP 8 1
IOMM 配列一 1 2 1
IOMM 配列— 2 2 1
水 27.5 1
LA Taa*° — 0.5 1
総量 50 II 1
PCRサイクルは、 94 °Cで 2分保持後、 98 °Cで 2 0秒間反応させ、 68 °C まで一 1°CZ2秒の速度で冷却し、 6 8°Cで 3分保持し、 更に 7 2°Cで 1 0分間 保持を 3 0回繰り返して行った。
増幅した DN A断片を、 ァガロースゲル電気泳動 （ゲル濃度 1 %) で分画し、 ェチジゥムプロマイ ドで染色した後、 紫外光照射して目的とするバンドが増幅さ れるか否か調べた。
その結果、 pTARGETpgthを導入した CH〇 k 1細胞でのみ、 目的のバンドが増幅 され、 コントロールベクタ一を導入した CH〇k 1細胞では、 増幅は確認できな かった。
実施例 5 p g t hを導入した CHOkl細胞のプロスタグランジン輸送活性 実施例 3で確立した p g t hを導入した C HO k 1と、 コントロールベクタ一 を導入した C H 0 k 1細胞のプロスタグランジン輸送活性の比較を行った。
実施例 3と同様の増殖培地を使用して、 6穴培養プレートに 1穴あたり 500000 個の p g t hを導入した CHOk 1細胞、 コントロールベクターを導入した CH Ok 1細胞それぞれを培養した。 24時間後、 牛血清アルブミンを含む適当な緩 衝液で細胞を洗浄後、 （3H) 放射標識 PGE 2 (アマシャム社製） を含む緩衝液 で更に 20分培養した。 細胞を洗浄後、 細胞を回収し取り込まれた放射活性を測 定した。 その結果、 p g t hを導入した CHOk 1では、 コントロールベクタ一 を導入した CHOk 1細胞と比較して、 プロスタグランジン輸送活性が統計学的 に有為に高い値を示した。
実施例 6 ヒト酸化 LDL負荷マクロファージでの p g t h mRNAの発現
1) ヒト酸化 LDL負荷マクロファ一ジ並びに正常単球 c DNAの作成
正常単球 c DNAは、 ヒ卜末梢血より CD 14陽性単球より T r i z o 1 (ギ ブコ BRL社） より調製した RN Aを铸型として、 Superscript II逆転写酵素キット (ギブコ BRL社） を用いて作成した。 ヒト酸化 LDL負荷マクロファージは、 正 常単球をヒト 20 %AB型血清、 抗生物質を含む RPMI-1640 (大日本製薬） を 14 日間培養後、 常法に従い硫酸銅で酸化させたヒト LDL (酸化 LDL) を再終濃 度 40 / m 1になるように添加し、 更に 24時間培養し調製した。 正常単球と同様 な方法で c DN Aを調製した。
2) RT— P CR法による p g t h mRNAの発現の確認
配列番号： 2に含まれる配列を有するオリゴヌクレオチド （下記の配列一 3) と逆相補鎖と配列を有するオリゴヌクレオチド （下記の配列一 4) のそれぞれを を DNA合成機 （ABI社製 380B) で合成した。
配列一 3
5 ' -GCTCCTGCCCATTGGACGGCTTTAACC- 3 '
配列— 4
5 ' -TCACACTCGGGAATCCTCTGGCTTC-3 ' (1)で作成した c DNAを铸型とし、 配列一 3のオリゴヌクレオチドと配列— 4のオリゴヌクレオチドをプライマーとして、 夕カラ LA PCR Kit Ver.2と PCR サーマルサイクラ一 MP (いずれも宝酒造製） を用いて、 以下の PC R操作を行 つた。
cDNA 2 1 ( 40 ng)
10XPCRバッファー（25mM Mg+ +を含む) 1.5 1
2.5mM dNTP 2.4 I
IO M 配列一 3 0.4 1
lO^M 配列— 4 0.4 i 1
水 10.15 1
LA Taa リメラ-セ" 0.15 a I
総量 15 l
PCRサイクルは、 94 °Cで 5分保持後、 94°〇で1分反応させ、 58 °C 1分保 持し、 更に 72°Cで 1分間保持を 30回繰り返して行った。 PCR反応液を、 1 %ァ ガロースゲル電気泳動で分画した。 ゲルをェチジゥムブ口マイ ドで染色した後、 紫外光照射して増幅される約 500 b pのバンドを検出した。 また同様に、 標準 c DN Aとして G ceraldehyde3- Phosphate Dehydrogenase遺伝子増幅プライマ一 (G 3 PDH： クローンテック社製） を用いて P CRを行い検定した。 その結果、 第 3図に示すように、 酸化 LDL負荷マクロファ一ジにおいて p g t h mRNA の発現が強く誘導されていた。
正常単球、 あるいは酸化 LDL負荷したマクロファージあるいは、 同等の培養 細胞に化合物を添加して培養後、 上記方法で P GTHの mRNAの変動を測定す ることで、 P GTHの mRNA発現を調節する物質をスクリーニングすることが できる。 図面の簡単な説明
第 1図は、 h P GTと本発明である P GTHとの、 アミノ酸配列の相同性の比 較を示す。
第 2図は、 p g t hを用いて in vitroトランスレーション法により発現させた P GTHの S D S— PAGEの結果を示す。
第 3図は、 ヒト酸化 LDL負荷マクロファージでの p g t hの発現を、 RT— PCR法を用い、 mRNAで検出した結果を示す。 図中において、 oはヒト酸化 LDL負荷マクロファージでの、 mはヒト正常単球でのそれぞれの検出結果を示 す。

Claims

請 求 の 範 囲
1. 以下の （a) または （b) の蛋白質；
(a) 配列番号： 1に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質；
(b) 配列番号： 1のアミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、 置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつプロスタグランジ ン輸送活性を有する蛋白質。
2. 以下の （a) または （b) の DNA
(a) 配列番号： 2に記載の塩基配列からなる DN A
(b) 配列番号： 2の DN Aとストリンジェン卜な条件でハイブリダィズし、 かつプロスタグランジン輸送活性を有する蛋白質をコードする DNA。
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