WO1999062541A1

WO1999062541A1 - Immunosuppresseurs contenant des clusterines

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Publication number: WO1999062541A1
Application number: PCT/JP1999/002474
Authority: WO
Inventors: Kazuhiro Yuda; Katsuhiko Akiyama; Takeshi Goto; Sigeru Goto
Original assignee: Hisamitsu Pharmaceutical Co., Inc.
Priority date: 1998-06-01
Filing date: 1999-05-13
Publication date: 1999-12-09
Also published as: JPH11349488A; AU3729699A

Description

明細書クラスタリンを含有する免疫抑制剤技術分野

本発明はクラスタリン（C 1 u s t e r i n ) を有効成分とする免疫抑制剤に関するものである。詳しくは、心臓、肝臓、肺、滕臓、腎臓、小腸、皮膚、骨髄等の臓器 ·組織移植における拒絶、あるいは、リウマチ、アトピー、全身性エリテマトーデス等の自己免疫疾患、花粉症などのアレルギー性疾患等の炎症性疾患の治療薬に関するものである。発明の背景

臓器移植の外科的技術が著しく向上した現在、臓器移植手術の成否は術後の移植拒絶反応をいかにして制御できるかにかかってきている。拒絶反応は、移植片を生体が異物と認識し、それを排除するために一連の免疫反応が惹起されることにより生じる。これらの免疫反応を抑制するために、臨床上従来より用いられている免疫抑制剤としては、ステロイド剤（プレドニゾロン等）、代謝拮抗剤（ァザチォプリン、ミゾリビン等）、抗生物質（シクロスポリン八、夕クロリムス等）等が用いられている。これら薬剤の登場により、腎、心、肝臓移植はすでに —般医療として定着し、肺、塍、小腸移植は、成績向上に伴い次第に普及しつつある（今日の移植 v o l . 1 1 N o . 1 5 3 1 9 9 8 ) 。

しかしながら、これら薬剤には、少なからぬ副作用があり、例えばステロイド剤は、他の免疫抑制剤と比較して、幅広い作用を有するが、免疫抑制作用は一般に弱く、長期連続投与により有効性の減少や抵抗性の発現が見られることがある。ァザチォプリンは、核酸合成を阻害することにより、免疫抑制効果を発揮するが、その使用は細菌などの感染症発症の危険性を増大させ、また、骨髄抑制作用（白血球減少 ·血小板減少 ·貧血）と肝臓障害を引き起こすことがある。ミゾリピンは、ァザチォプリンと比べ、骨髄抑制作用と肝臓障害が少ないという利点を持つ反面、免疫抑制効果がそれほど高くない。シクロスポリン八、夕クロリムスは、きわめて強力な免疫抑制活性を持ち、臓器移植の成績向上に貢献した薬剤である。しかしながら、これらには、重篤な中枢神経毒性、腎毒性等があることが明らかとなり、その使用に際しては、細心の注意が必要とされる（今日の移植 v o l . 1 1 No. 1 37 1998) 。

一方、臓器移植において、肝臓はきわめて特異な臓器として注目されている。それは、ある種の動物間の組み合わせにおいて、肝移植が免疫抑制剤の投与なしに成功することが示されたためである（N a t u r e v o l . 223 472 1969) 。また、肝炎等の肝細胞障害時には免疫抑制状態になり、障害肝や再生肝が免疫抑制物質を産生していることが示唆され（N a t u r e v o l . 2 51 655 1974) 、現在までに肝細胞由来の数種類の免疫抑制蛋白質が報告されている。以下にその例を示す。

L一アルギナーゼ

肝細胞内より分離された L一アルギナーゼは、肝が障害を受けた際に血中に放出されると考えられた免疫抑制蛋白質である。大量に放出された L一アルギナ一ゼは、 L—アルギニンを消化して L一オル二チンと尿素を生成させ、体内でアルギニン欠乏状態を作り出し、リンパ球の活発な増殖を抑えるものと考えられる ( J . Immun o l . v o l . 131 2427 1 983、特開平 3— 1 57 399) 。しかし、一方で、アルギニンを加えることにより、この状態は改善されることから、個々の細胞でアルギニン供給量の異なる生体内で、' 例えば、アルギニン供給能の高い肝臓で、長期にわたり拒絶反応を抑制することができるかに疑問点がある。また、大量にアルギニンを消化させることは、同時に大量の尿素を生成させるため、臨床上問題のある高窒素血症を生じさせ、投与が長期にわたれば、腎不全を引き起こす可能性が示唆される（Me d i c i n a v o 1. 31 No. 1 1 60 1994) 。

超低密度リポタンパク（v e r y l ow d e n s i t y l i p o p r o t e i n (VLDL) )

同物質は、肝細胞より分泌され血清中に出てくるものと考えられている。 VL DLは、末梢血単核球の DNA合成を阻害し、その活性化を抑制する。（J . I mmu n o l . v o l . 1 19 2 129 1977) 。しかし、薬剤として、 VLDLの投与を長期に行うことは、血清 VLDLの上昇及び、リポプロテインリパーゼにより転換された、中間密度リポタンパク（ i n t e rme d i a t e d e n s i t y l i p o p r o t e i n ( I DL) ) 、低密度リポタンパク（ l ow d e n s i t y l i p o p r o t e i n (LDL) ) 値の上昇を慢性化させ、高脂血症、トリグリセライド血症、糖尿病、尿毒症、動脈硬化を引き起こす可能性がある（Me d i c i n a v o l . 3 1 No. 1 1 1 7

9 1 994) 。

ひ —フエトプロテイン及び初期妊娠因子（e a r 1 y p r e gn an c y f _a c t_ r )

特殊な状態で、肝より免疫抑制蛋白質が分泌されることも知られている。肝癌の腫瘍マーカ一として知られるひ —フエトプロテインも免疫抑制力があり、胎仔マウスから同定され調べられた（J. Ex p. Me d. v o l . 141 26 9 1975) 。初期妊娠因子は、妊娠初期の妊婦尿中、血中から検出された免疫抑制力を有した蛋白質（N a t u r e v o l . 278 649 1979) であり、また、肝葉切除後に分泌されることも確かめられた。これらの蛋白質は、非特異的にリンパ球の増殖を抑制する物質で、肝障害が生じた際の旺盛な肝再生力に随伴する物質と思われる。しかし、肝移植が誘導する免疫寛容を説明するに至っていない。

可溶性クラス I抗原

臨床の肝移植において、多量のドナ一型の可溶性クラス I抗原が移植直後からレシピエントの血液中に認められる。同物質が免疫寛容を誘導するものと考えられたが、 i n V i V oにおいて、同物質を投与しても免疫抑制が十分に誘導されない（T r an s p l an t a t i on v o l . 50 678 199 0) 。

肝抑制因子— 1 ( l i v e r s u p p r e s s o r f a c t o r - 1 (L S F - 1) )

ラット肝移植後の血清を経時的に採取し、 SDS— PAGEで電気泳動を行うことにより得られた免疫抑制蛋白質であり、その効果は、極めて高いと推測されるが、蛋白質の同定が行われておらず（T r an s p l a n t . I mmu n o 1. v o l . 3 1 74 1 995) 、薬剤として実用化するためには、今後さらなる検討が必要である。以上述べてきたように、現在、臨床上使用されている免疫抑制剤には、骨髄抑制作用、肝臓障害中枢神経毒性、腎毒性等の副作用が知られており、また、肝由来免疫抑制蛋白質は、臨床上応用可能な活性を持つ物質は未だ発見されていない。 ,

一方、クラスタリンは、脳、肝、塍、セルトリ細胞等の様々な組織、細胞で発現しており（B i o c h em i s t r y, v o l . 26， 3297, 1 987、 Eu r. J. B i o c h em. , v o l . 22 1, 3, 9 1 7, 1 994) 、補体溶解抑制因子（c omp l eme n t l y s i s i nh i b i t o r

(CL I ) ) 、アポリポ蛋白— J (a p o l i p o p r o t e i n— J) 、血清蛋白— 40， 40 (s e r um r o t e i n 40, 40 (S P— 40, 4 0) ) 、テストステロン抑制前立腺応答因子一 2 ( t e s t o s t e r on e— r e p r e s s e d p r o s t a t e me s s a g e— 2 (TRPM— 2 ) ) 、硫酸糖蛋白— 2 (S u l f a t e d g l y c o p r o t e i n— 2 (SGP- 2) ) と様々な名で知られている。このクラスタリンには、脂質輸送 (B i o c h em i s t r y v o l . 29 5380 1 990 ) 、補体活性化阻害（EMBO J . v o l . 8 7 1 1 1 989, T r e nd s B i o c h em. S c i . v o l . 1 7 1 54 1 989) 、精子成熟（B i o 1. R e p r o d. v o l . 45 195 199 1, Mo l . R e p r o d. D e v. v o l . 33 373 1992) 、アポトーシス抑制（C an c e r R e s . v o l . 55 243 1 1 995 ) 等と多くの機能を持つことが報告されている。しかしながら、移植臓器での免疫寛容の導入に、クラス夕リンが関与するという報告は、未だなされていない。発明の概要

本発明の目的は、臓器移植時の拒絶反応の防止や自己免疫疾患、アレルギー性疾患等炎症性疾患の治療に対し有効であり、かつ副作用無く使用可能な免疫抑制剤を提供することにある。発明の詳細な説明

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、肝臓移植後のラット血清中より通常ラット血清蛋白質と比較して特定の蛋白質量が増大していることを見出し、さらに、該蛋白質の N末端配列のペプチドシークェンスを解析した結果、通常ラット血清に微量に存在するクラスタリンと 1 0 0 %の相同性をもつことを確認し、該蛋白質はクラス夕リンであることを見出した。さらに、驚くべきことに該クラスタリンは、臓器移植時の拒絶反応の防止や自己免疫疾患、アレルギー性疾患等の治療に対し有効であり、かつ副作用がない薬効をもつことを見出した。

また、ヒトの血清中にも該蛋白質と生理活性、薬理活性が類似したものが存在しており（ヒト血清由来クラス夕リン）、該ヒト血清由来クラスタリンも臓器移植時の拒絶反応の防止や自己免疫疾患、アレルギー性疾患等の治療に対し有効であり、かつ副作用がない薬効をもつことを見出した。

すなわち、本発明によれば、免疫抑制作用をもつクラス夕リンを含有する免疫抑制剤が提供される。

また、上記免疫抑制剤に含有される該クラス夕リンは、ラット由来または Zおよびヒト由来であってもよく、該クラス夕リンを構成するペプチドは、薬学的に許容できる修飾を施したペプチドを含有したものであってもよい。

以下、本発明について更に詳細に説明する。本発明の免疫抑制剤の有効成分であるヒト由来及びラット由来のクラスタリンは、例えば以下の方法により入手可能である。

肝臓移植後のラット血清中に増大しているクラスタリンの採取方法としては、

K a m a d aらにより開発されたカフ法（S u r g e r y v o l . 9 3 6 4 1 983) の手技を用いて同所性肝移植手術を行うことにより発現を誘導させる方法であり、 200— 350 gの雄の P VG系及び DA系ラットを用い、 DA系ラットの肝臓を PVG系ラッ卜へ移植を行う。肝移植手術後、少なくとも？〜 1 0日目以降の血液を採取し、 100 X gで遠心分離後上清を回収することで、クラスタリンを豊富に含む肝移植後の血清を得ることができる。

また、上記の肝臓移植後のラット血清中に増大しているラット由来のクラス夕リン及びヒ卜由来クラスタリンは、以下のような遺伝子工学的手法によっても調製することが可能である。

ヒト血清由来クラスタリン及びラット血清由来クラスタリンをコードする遺伝子配列は、 Wo n gら（Eu r. J. B i o c h em. v o l . 22 1 3 9 17 1 994、 J . B i o l . Ch e m. v o l . 268 No. 7 502 1 1 993、 B i o c h em i s t r y v o l . 26 3297 1 987) により既に公知となっている。そこで、その遺伝情報をもとに、プロ一ブ、あるいは、 P CRプライマ一を作成し、 c DNAライブラリ一あるいは細胞 RNAを用いて、公知の方法であるコロニー（プラーク）ハイブリダィゼ一ション法、 PCR法、あるいは、 RT— PCR法により、クラスタリン遺伝子を入手することができる。このように入手した遺伝子を、真核細胞用遺伝子発現べクタ ―、例えば、 pBK—CMV (ストラタジーン社）、 p Z e o SV2 ( + ) (ィンビトロジェン社）、 pCMV · S PORT (G I BC〇社）に揷入し、適当な動物細胞、例えば、 COS、 CH〇、 He L a、へパトーマ細胞等の動物細胞に上記遺伝子を導入することにより、ラット由来クラスタリンまたはヒト由来クラスタリンを生産することが可能である。

上記の方法により得られたクラスタリンを含む血清あるいは細胞培養上清からクラスタリンを精製する方法としては、例えば〇 d aらの方法（B. B. R. C v o l . 204 No. 3 1 1 3 1 1994) に準じて行うことにより可能である。すなわち、血清を 2 OmM T r i s -HC 1 , pH 7. 4で平衡化を行った DEAE セファロ一ス（S e ph a r o s e) カラムにアプライし、吸着した蛋白質画分を 0. 5M NaC lを含む 20mM T r i s -HC 1 , p H7. 4で溶出することで精製される。さらに純度を高めるためには、この溶出液を適当な緩衝液で透析した後、抗クラスタリン抗体を CNB r一活性化セファロース 4Bゲル（アマシャム ' フアルマシア社）に固定化したァフィ二ティー力ラムにアプライし、適当な溶出液、例えば 0. 1M グリシン， pH2. 5を用いてクラスタリンフラクションを溶出する。セントリコン 30 (ミリポア社）を用いて、この溶出液を濃縮後、ゲルろ過し、 0. 1 % SDS及び 0. 1 5M NaC lを含む 10mM 燐酸ナトリウム， pH6. 8を用いて溶出することによりさらに精製を行い、蒸留水で溶出液の透析を行う。クラス夕リンを再生するするため、 5Mとなるように、グァニジン塩酸塩を加え、セントリコン 30を用いて除去することにより精製を行うことができる。

上記方法で得られるラット由来のクラス夕リンは、 SDS— PAGEにおいて、非還元状態で分子量 73 kD aの泳動度を示し、還元状態で、 47 kD a

(αサブユニット）と 34 kD a ( ]3サブユニット）の泳動度を示す 2種のぺプチド鎖が、 S_S結合でつながれたヘテロダイマーよりなる。また、 αサブュニットに 4力所、 /3サブユニットには 2力所の糖鎖結合部位があり、それぞれが異なった構造の糖鎖が結合している。

一方、ヒト由来のクラスタリンも aサブュニットが 36 kD aから 39 kD a よりなり、 βサブュニットが 34 kD aから 36 kD aよりなるヘテロダイマ一である。ラット由来のクラスタリンとヒト由来のクラスタリンのアミノ酸配列は 77 %の相同性がある。

上記手法により精製したラット由来のクラスタリンを臓器移植拒絶のモデル系であるラット異所性、移植手術 (Ex p e r ime n t a l l i v e r t r a n s p l an t a t i on. 1 9 : C R C P r e s s, 1988) において、その拒絶抑制効果を検討したところ、有効成分としてクラス夕リンを投与した群において、著しい生着日数の増加が見られた。また、クラスタリン投与群は、副作用と考えられる組織所見は認められなかった。

また、精製後のヒト由来のクラスタリンをラット脾細胞を用いた混合リンパ球反 J心 (m i x e d l ymp h o c y t e r e a c t i on , MLR (免疫実験法 289 西村書店））を用いて、その抑制効果の検討を行った。この結果、有効成分としてクラス夕リンを用いた群において、対照群と比較して、トリチウムの取り込みが、著しく減少しており、免疫細胞の活性化が抑えられていた。

また、ヒト由来のクラス夕リンをラッ卜異所性心移植手術において、その拒絶抑制効果を検討したところ、クラスタリンを投与した群において、著しい生着日数の増加が見られた。また、クラス夕リン投与群は、副作用と考えられる組織所見は認められなかった。

このことから、ヒト血清由来のクラスタリンもまた、ラット由来のクラスタリンと同じく、免疫抑制活性を持ち、更に副作用の無いものであった。

以上のことより、本発明者らは、ラット由来のクラス夕リンまたはヒト由来のクラスタリンの新規生理活性を発見し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明はラット由来のクラスタリンまたは/およびヒト由来のクラスタリンを有効成分とする免疫抑制物質であり、この免疫抑制剤は、臓器 ·組織移植における拒絶の防止に有用であり、また、自己免疫疾患、アレルギー性疾患等の炎症性疾患の治療薬としても有効である。

本発明の免疫抑制剤は、ラッ卜由来のクラスタリン、ヒト由来のクラスタリンをそれぞれ単独で使用してもよいし、両方の由来のクラスタリンを混合して用いることも可能である。

本発明のラット由来のクラスタリンまたは Zおよびヒト由来のクラスタリンを有効成分とする免疫抑制剤は、例えば、臓器移植時の拒絶反応や、自己免疫疾患等の治療に有効であり、かつ副作用が無く、単回投与あるいは反復投与を行うことにより、効果的に免疫反応を抑制する。

本発明のクラスタリンを含有する免疫抑制剤は、クラスタリンを薬学的に許容し得る限り適当な修飾をすることが可能である。

修飾の一つの形態として、クラスタリンを構成するペプチドにポリエチレングリコールゃデキストラン等を用いることも可能である。この場合は、本蛋白質の活性を低下させることが無く、かつ、望まざる毒性を生体に与えることがない限りにおいて、血中半減期を長期化させるために有効である。

さらに別の修飾の形態として、活性の強化、血中安定性の増強、抗原性の低減、副作用の軽減等のために、 1個のアミノ酸、あるいは、 2個以上のアミノ酸を置換、挿入、欠失させたクラス夕リン変異体を用いることができる。また、そのようなクラス夕リン変異体は、置換、挿入、欠失させる 1個のアミノ酸、あるいは、 2個以上のアミノ酸に対応する変異クラス夕リン遺伝子配列を構築し、適当な動物細胞に導入することにより、生産することができる。

本発明のクラスタリンは薬学的に許容されうる物質と混合して調製した形で投与可能である。

例えば、注射剤の場合には、本発明のクラス夕リンを水に溶解して調製し、必要に応じて生理食塩水、ブドウ糖溶液等に溶解させても良く、また、緩衝剤、保存剤、あるいは、安定化剤を含有させてもよい。さらに、これらの製剤は、薬理学的に許容できる治療上価値のある他の成分を含有しても良い。

本発明に係わる免疫抑制剤の投与方法としては、移植の際の拒絶反応を治療する場合、経口、注射、直腸内投与、門脈内投与、移植臓器の灌流、移植臓器への局所投与、バルーンカテーテルを利用した投与等いずれの投与方法でも可能である。好ましくは、注射による投与、より好ましくは、筋肉内投与が望ましい。投与量は、投与方法、患者の状態、年齢等により異なるが、通常、 1回 3 0〜5 0 O m g、好ましくは、 5 0〜 1 0 O m gを 1回投与あるいは、数日から数力月の間をおいて反復投与を行えば良い。

また、別の投与方法として、例えば、マウス白血病ウィルスベクター、アデノウィルスベクタ一、アデノ随伴ウィルスベクタ一、ヒト免疫不全ウィルス（H I V) ベクター、ヘルぺスシンプレックスベクタ一等に、クラス夕リン遺伝子を挿入したウィルスベクタ一、あるいは、例えば、ポリリジン等のポリアミノ酸キヤリア一、カチオン性の合成高分子、リボソーム等の適当なキャリアーを用いて、クラス夕リン遺伝子をコードするプラスミドを e X v i v oあるいは、 i n v i v oで生体内に投与することにより、遺伝子治療を行うことも可能である。実施例

以下、実施例を示し、この発明の実施の形態を具体的に説明するが、この発明は以下の例に限定されるものではない。

実施例 1—：肝臓移植後に増大するクラスタリンの発現誘導ラットに、肝臓移植後に増大するクラス夕リンの発現を誘導させるために、 K ama d aらにより開発されたカフ法（S u r g e r y v o l . 93 64 1983) の手技を用いて同所性肝移植手術を行った。手術に用いる動物は、 2 00 _ 350 gの雄の P VG系および DA系ラットを用いた。肝移植手術後、 7 日目の血液を採取し、 1 0 O x gで遠心分離後上清を回収し、肝移植後の血清を得た。

実施例 2 ：ラット血清由来クラスタリンの精製

ラット血清由来クラスタリンの精製は、 Od aらの方法（B. B. R. C v 0 1. 204 No. 3 1 13 1 1994) に準じて行うことにより調製した。すなわち、肝移植後のラット血清 5m 1を 2 OmM T r i s -HC 1 , p H 7. 4で平衡化を行った、 DEAEセファロ一スカラムにアプライし、 0. 5 M NaC lを含む20mM T r i s— HC 1 , H 7. 4で溶出を行った。抗クラスタリン抗体を CNB r—活性化セファロ一ス 4 Bゲル（アマシャム · フアルマシア社）に固定化したァフィ二ティ一カラムに上記溶出液をアプライし、 0. 1 M グリシン， pH2. 5を用いてクラスタリン分画を溶出した。セントリコン 30 (ミリポア社）を用いて、この溶出液を濃縮後、ゲルフィルトレ一シヨンにかけ、 0. 1 % 303及び0. 15M N a C 1を含む 1 OmM燐酸ナトリウム， pH6. 8を用いて溶出することによりさらに精製を行い、蒸留水で溶出液の透析を行った。クラス夕リンを再生するするため、 5Mとなるように、グァニジン HC 1を加え、セントリコン 30を用いて除去した。精製した蛋白質の定量は、 DCプロテインアツセィ（バイオラッド社）を用いて行った。

実施例 3 ：精製蛋白質のシークェンス

精製した蛋白質 1 z g相当を入れた 1. 5mlチューブを 1 0本用意し、それに、 3倍濃縮サンプル緩衝液（62. 5mM T r i s -HC 1 H 6. 8、 5 % 2—メルカプトエタノール、 1 % SDS、 1 0% グリセロール、 0. 01 % ブロモフエノールブル一）を蛋白質溶液の 1ノ 3容量加え、 1 00t：、 5分間煮沸し、氷冷した。マーカーとして用いた、レインボウ 'カラード ' プロティン · MW 'マーカー（R a i nb ow Co l o u r e d P r o t e i n MW Ma r k e r) (アマシャム . フアルマシア社）についても、同様の操作を行った。これを、 10 %SDS— PAGE (TEFCO社）にアプライし、 1 50 Vで 2時間泳動を行った。泳動終了後、ゲルをカセットから外し、ブロッテイングバッファ一（ 1 OmM CAPS ； 3 - [シクロへキシルァミノ] 一 1― プロナンスルホン酸 pH l l) 中で 30分浸とうした後、ゲルと同じ大きさの PVDFメンブレン（AB I社）を気泡が入らないように密着させ、濾紙で挟み、さらにブロッテイング用スポンジで挟み、これを陽極側に P VDFメンブレンが向くようにセットした。 50 OmAで 6時間トランスファーを行った後、 P VDFメンブレンを取り出し、染色液（0. 1 %クマーシーブリリアントブルー R- 250を含むメタノール）で 1分間染色を行い、脱色液（50%メタノ一ル、 10%酢酸）に浸けた。その結果現れた分子量約 47 kD aと約 34 kD a のバンドをメンブレンより切り出し、それぞれの分子量のバンドを集め、これらをプロテインシークェンサ一（476 Aプロテインシークェンサ一、 AB I社）で解析した。

その結果、約 47 kD aのバンドは、ラットクラスタリン αサブユニットと、約 34 kD aのバンドは、ラットクラスタリン ]3サブュニットと N末端配列が一致（表 1) した。

精製後の蛋白質およびラッ小クラスタリンの N末端配列

実施例 4 ：ラット血清由来クラスタリンの EL I S Aによる確認試験

ィムノプレート（Nun c社）に、実施例 2で精製した蛋白質の濃度が 1 0 μ g/m 1となるように調製した溶液（0. 05% NaN₃ (和光純薬社）を含む 0. 1M N a ₂C0₃ (和光純薬社）溶液）を 0. 1m lずつゥエルに加え、 4 で一晩放置した。同様に、対照群として、同じ濃度のラットアルブミン

(シグマ社）を 0. 1m lずつゥエルに加え、 4でで一晩放置した。上清を捨て、ブロッキングバッファ一（5 % スキムミルク（雪印社）、 0. 1 % Tw e e n - 20 (コスモバイオ社）を含む PB S (G I B CO社））を、 0. lm 1 ウエルずつ加え、室温で 2時間放置した後、ゥォッシュバッファー 200 X 1を加え、上清を捨てた。この洗浄操作を計 3回繰り返した。 1次抗体液（プロッキングバッファ一 990 X 1に、シープ由来抗ラットクラスタリン抗血清（コスモバイオ社）を 10 x l加えた溶液）を 0. 1m l ウエルずつ加え、室温で 3時間放置した後、ゥォッシュバッファ一 200 1を加え、上清を捨てた。この洗浄操作を計 3回繰り返した。次に、 2次抗体液（ブロッキングバッファー 3 m 1にパ一ォキシダ一ゼ標識抗シープ I gG (C a p p e l社）を 1 ^ 1加えた溶液）を 0. 1m lノウエルずつ加え、室温で 2時間放置した後、ゥォッシュバッファー 200 1を加え、上清を捨てた。この洗浄操作を計 3回繰り返した。基質溶液（0. 05M クェン酸— 0. 1 5M Na₂HPO^、ファー（p H6. 0) 12m lに、 30 %過酸化水素水（和光純薬社） 6 1、 o—フエ二レンジアミンジヒドロクロリド（OPD :和光純薬社）を 10mg溶解させた溶液）を 0. 1m lずつゥエルに加え、室温で 10分間反応させた後、反応停止液 (2N硫酸溶液）を 0. l m 1 ゥエルずつ加え、 EL I S Aプレートリーダ一 (S TL R a i nB ow T h e r m o (和光純薬））を用いて波長 490 n mでの吸光度を測定した。

その結果、実施例 2で精製した蛋白質をコートした群は、対照群と比較して、抗クラスタリン抗体に対して強い反応性が認められたことから（表 2) 、精製した蛋白質は、クラス夕リンであることを確認した。表 2 ラット由来精製蛋白質のェライザ検定（N=3)

490 nmでの吸光度

精製蛋白質 0. 902±0. 0 13

ラットアルブミン 0. 025 ± 0. 003 実施例 5 ：ラット血清由来クラスタリンの免疫抑制活性の検定

ラット移植手術の拒絶系である異所性心移植手術（Ex p e r ime n t a l l i v e r t r an s p l an t a t i o n. 1 9 : C R C P r e s s， 1988) を行った。 Kama d aらの方法に従い DA系ラットの心臓を PVG系ラットの類部に移植し、術後 1時間以内に、生理食塩水（大塚製薬）で 300 g/m 1に調製した lm 1のラットクラスタリン溶液を筋肉内投与した。対照群として、生理食塩水のみを lm 1筋肉内投与した群、あるいは、無処理の群をもうけた。

その結果、表 3に示したように、クラスタリンを用いた群において、移植された心臓は、著しく生着日数が増加した。表 3 異所性心移植におけるラットクラスタリン単回投与の効果（N=6) レシピエン卜ドナー m 平均生着日数（日）

PVG系ラット D A系ラット無処理 7. 8

PVG系ラット D A系ラット生理食塩水 1m l 8. 1

PVG系ラット DA系ラットクラス夕リン 300 g >60 また、クラスタリンを投与した群のラットを開腹して各臓器を観察したが、対照群である、生理食塩水のみを lm l筋肉内投与した群、及び、無処理の群と同様に、特に異常は、認められなかった。

実施例 6：ヒト血清由来クラスタリンの精製

実施例 2に記載の方法により、ヒト血清由来クラスタリンを同様に精製した。すなわち、健常人血清 5m 1を 2 OmM T r i s— HC 1， H 7. 4で平衡化を行った、 DEAE セファロ一スカラムにアプライし、 0. 5M N a C 1 を含む 2 OmM T r i s—HC l， pH 7. 4で溶出を行った。抗クラスタリン抗体（コスモバイオ社）を CNB r—活性化セファロ一ス 4 Bゲル（アマシャム · フアルマシア社）に固定化したァフィ二ティーカラムに上記溶出液をァプラィし、 0. 1M グリシン， pH2. 5を用いてクラス夕リン分画を溶出した。セントリコン 30を用いて、この溶出液を濃縮後、ゲルフィルトレーシヨンにかけ、 0. 1 % 503及び0. 1 5M NaC lを含む 1 0mM 燐酸ナトリウム， pH6. 8を用いて溶出することによりさらに精製を行い、蒸留水で溶出液の透析を行った。クラス夕リンを再生するするため、 5Mとなるように、グァニジン HC 1を加え、セントリコン 3 0 (ミリポア社）を用いて除去した。精製した蛋白質の定量は、 DCプロテインアツセィ（バイオラッド社）を用いて行つた。

実施例 7：ヒト血清由来クラスタリンのシークェンシング

実施例 3に記載の方法と同様に、ヒト血清由来のクラスタリンのシークェンシングを行った。すなわち、精製した蛋白質 1 / g相当を入れた 1. 5m lチューブを 1 0本用意し、それに、 3倍濃縮サンプルバッファ一（6 2. 5mM T r i s— HC 1 H 6. 8、 5 % 2—メルカプトエタノール、 1 % SD S、 1 0 % グリセロール、 0. 0 1 % ブロモフエノールブルー）を蛋白質溶液の 1/3容量加え、 1 0 0 、 5分間煮沸し、氷冷した。マーカーとして用いた、レインボウ 'カラード ' プロティン MWマーカ一（アマシャム · フアルマシア社）についても、同様の操作を行った。これを、 1 0 %SDS— PAGE (TE FC〇社）にアプライし、 1 50 Vで 2時間泳動を行った。泳動終了後、ゲルをカセットから外し、ブロッテイングバッファ一（ 1 OmM CAP S ; 3— [シクロへキシルァミノ] 一 1一プロナンスルホン酸 pH l l) 中で 30分浸とうした後、ゲルと同じ大きさの PVDFメンブレン（AB I社）を気泡が入らないように密着させ、濾紙で挟み、さらにブロッテイング用スポンジで挟み、これを陽極側に PVDFメンブレンが向くようにセットした。 5 0 OmAで 6時間トランスファーを行った後、 PVDFメンブレンを取り出し、染色液（0. 1 %クマ —シープリリアントブルー R— 2 50を含むメタノール）で 1分間染色を行い、脱色液（50 %メタノール、 1 0 %酢酸）に浸けた。その結果現れた分子量約 4 0 kD付近の 2本のバンドをメンブレンより切り出し、それぞれの分子量のバンドを集め、これらをプロテインシークェンサ一（47 6 Aプロテインシークェンサー、 AB I社）で解析した。

その結果、約 40 kD a付近の 2本のバンドは、ヒトクラスタリンひサブュニットと) 3サブユニットに N末端配列が一致（表 4) した。表 4 精製後の蛋白質およびヒトクラスタリンの N末端配列

実施例 8：ヒト血清由来クラスタリンの EL I S Aによる確認試験

実施例 4に記載の方法と同様に、ヒト血清由来のクラスタリンの EL I S Aによる確認試験を行った。すなわち、ィムノプレート（Nun c社）に、実施例 6 で精製した蛋白質の濃度が 1 0 a g/m 1となるように調製した溶液（0. 0 5 % N aN₃ (和光純薬社）を含む 0. 1M N a ₂C0₃ (和光純薬社）溶液）を 0. 1m lずつゥエルに加え、 4°Cで一晩放置した。同様に、対照群として、同じ濃度のヒトアルブミン（シグマ社）を 0. 1m lずつゥエルに加え、 4°Cで一晩放置した。上清を捨て、ブロッキングバッファ一を含む PB Sを、 0. 1m l ウエルずつ加え、室温で 2時間放置した後、ゥォッシュバッファ一 200 ^ 1を加え、上清を捨てた。この洗浄操作を計 3回繰り返した。 1次抗体液（ブロッキングバッファー 990 /X 1に、シ一プ由来抗ラットクラスタリン抗血清（コスモバイオ社）を 10 l加えた溶液、ヒトクラス夕リンに対しても交差性がある。）を 0. 1m l /ゥエルずつ加え、室温で 3時間放置した後、ゥォッシュバッファー 200 1を加え、上清を捨てた。この洗浄操作を計 3回繰り返した。次に、 2次抗体液（ブロッキングバッファー 3m 1にパ一ォキシダーゼ標識抗シ一プ I gG (C a p p e l社）を 1 1加えた溶液）を 0. 1 m 1 ウエルずつ加え、室温で 2時間放置した後、ゥォッシュバッファー 200 μ 1を加え、上清を捨てた。この洗浄操作を計 3回繰り返した。洗浄後、基質溶液を 0. 1m lずつゥエルに加え、室温で 10分間反応させた後、反応停止液（2N硫酸溶液）を 0. 1 m 1 ゥエルずつ加え、 EL I S Aプレートリーダー（STL R a i nB ow Th e r mo (和光純薬））を用いて波長 490 nmでの吸光度を測定した。

その結果、実施例 6で精製した蛋白質をコートした群は、対照群と比べ、抗クラスタリン抗体と強い反応性が認められたことから（表 5) 、精製した蛋白質は、クラスタリンであることを確認した。表 5 ヒト由来精製蛋白質のェライザ検定（N=3)

； 490 nmでの吸光度

精製蛋白質 0. 936 ±0. 024

ヒトアルブミン 0. 031 ± 0. 004 実施例 9 ：ヒト血清由来のクラスタリンの免疫抑制活性の検定

MLRは、リンパ球混合試験（免疫実験法 289 西村書店）に記載の方法に準じて行った。脾臓より採取した無処理の PVG系ラット由来の脾臓リンパ球 (応答細胞）及び、放射線照射（2， 00 OR) を行った DA系ラット由来の細胞を用いた。それぞれ、 5 X 10⁵細胞を RPM I - 1640 (G I B CO社） + 1 0 %F C S培地 200 1に懸濁し、 96穴プレート（コ一ニング社）で 3 日間培養を行い、アツセィに供する 20時間前に、 0. 5 C iの [³H] —チミジンを培地に加えて前処理を行なった。 MLRは、種々の濃度のヒトクラス夕リン存在下で反応を行った。陰性対照群として、ヒトアルブミン（シグマ社）を用いた。取り込まれた [³H] —チミジン量は、液体シンチレーシヨンカウンタ一（ヒューレット 'パッカード）で測定した。

その結果、表 6に示したように、ヒトクラスタリンを添加した群において、クラスタリンの濃度依存的にトリチウムの取り込みが阻害された。表 6 混合リンパ球反応の結果（N=3) 刺激細胞応答細胞蛋白質添加量（ g) [³H]—チミジン

DA PVG クラスタリン（ヒ卜） 0. 1 23785 ± 1 588

DA PVG クラス夕リン（ヒ卜） 0. 5 3327土 287

DA PVG クラスタリン（ヒ卜） 1. 0 2983土 47 1

DA PVG クラスタリン（ヒ卜） 5. 0 260 1土 55 1

DA PVG アルブミン（ヒト） 0. 1 16238± 10 1 5

DA PVG アルブミン（ヒト） 0. 5 150 10 ±2575

D A PVG アルブミン（ヒト） 1. 0 15923 ±5083

DA PVG アルブミン（ヒト） 5. 0 16042 ± 1 9 14 (表 6中 D Aおよび P VGは各々 DA系ラットおよび P VG系ラットを示す。）実施例 10 ：ヒト血清由来のクラスタリンの i n v i v o免疫抑制活性の検定実施例 5に記載の方法により、ヒト血清由来のクラスタリンの免疫抑制活性の検定を行った。ラット移植手術の拒絶系である異所性心移植手術（Ex p e r i me n t a l l i v e r t r a n s p l an t a t i on. 19 : C R C P r e s s , 1 988 ) を行った。 K a m a d aらの方法に従い D A系ラットの心臓を PVG系ラットに移植し、術後 1時間以内に、生理食塩水（大塚製薬）で 300 g/m 1に調製した l m 1のヒトクラスタリン溶液を筋肉内投与した。対照群として、生理食塩水のみを lm 1筋肉内投与した群、あるいは、無処理の群をもうけた。

結果は表 7に示した。表 7 異所性心移植におけるヒトクラス夕リン単回投与の効果（N-6) レシピエン卜ドナー処理平均生着日数（日）

PVG系ラッ卜 D A系ラッ卜無処理 8. 3

PVG系ラッ卜 D A系ラッ卜生理食塩水 1m l 8. 5

PVG系ラッ卜 D A系ラットクラスタリン 300 ^ g > 60 表 7に示されるように、クラスタリンを用いた群において、移植された心臓は、著しく生着日数が増加した。また、クラスタリンを投与した群のラットを開腹して各臓器を観察したが、対照群である、生理食塩水のみを lm l筋肉内投与した群、及び、無処理の群と同様に、特に異常は、認められなかった。発明の効果

本発明はラット由来のクラスタリンまたはおよびヒト由来クラスタリンを有効成分とする免疫抑制剤である。本発明により、単回投与あるいは反復投与を行うことにより、臓器 ·組織移植における拒絶の防止に有用であり、あるいは、自己免疫疾患、アレルギー性疾患等の炎症性疾患の治療薬として有効である、副作用のない免疫抑制剤が提供される。

Claims

請求の範囲

1 . クラスタリンを含有する免疫抑制剤。

2 . クラスタリンがラット由来またはおよびヒト由来である請求項 1に記載の免疫抑制剤。

3 . クラスタリンを構成するべプチドに薬学的に許容できる修飾を施した請求項 1または 2に記載の免疫抑制剤。

4 . 臓器 ·組織移植における拒絶、自己免疫疾患あるいは炎症性疾患に適用される請求項 1ないし 3のいずれか 1項に記載の免疫抑制剤。

5 . 薬学的に許容できる修飾が、クラス夕リンを構成するペプチドにポリエチレンダリコールまたはデキストランを付加させたもの、あるいは 1個または 2 個以上のアミノ酸を置換、挿入、欠失させたクラスタリン変異体である請求項 3 に記載の免疫抑制剤。

6 . 請求項 1ないし 5のいずれか 1項に記載の免疫抑制剤の有効量を投与することを含む、臓器 ·組織移植における拒絶、自己免疫疾患あるいは炎症性疾患を治療する方法。