WO1999061905A1

WO1999061905A1 - Appareil hplc permettant de fractionner et de preparer des echantillons pour la spectrometrie rmn et procede de modification de la phase mobile

Info

Publication number: WO1999061905A1
Application number: PCT/JP1999/002783
Authority: WO
Inventors: Yumi Yokoyama; Naoya Kishi; Masayuki Tanaka; Naoki Asakawa
Original assignee: Eisai Co., Ltd.
Priority date: 1998-05-26
Filing date: 1999-05-26
Publication date: 1999-12-02
Also published as: EP1001263A4; EP1001263B1; JP3720058B2; EP1001263A1; US6498040B1; DE69942329D1

Description

明細書

NM R測定用試料の分取と調製を行う H P L C装置と移動相の変換方法技術分野

本発明は、核磁気共鳴（N M R ) 用の試料を効率的に分取できる高速液体クロマトグラフィ一における移動相の変換方法と装置に関する。従来背景

試料中の微量成分を分析する技術として、高速液体クロマトグラフィー（以下、 H P L Cと略すことがある）が汎用されている。

近年では、この H P L Cを質量分析装置と組み合わせて、成分の分離と同定とを同時に行うシステムも用いられている。

例えば、特開平 3— 1 7 5 3 5 5号公報には、高速液体ク口マトダラフィ一質量分析における移動相の変換方法と装置が開示されている。これには、高速液体クロマトグラフィーで、試料中の所望成分を捕捉するとともに、その成分を試料の分離とは異なる質量分析に適した移動相により質量分析装置に送ることが記載されている。

一方、 NM Rを用いて構造解析を行うには、少なくとも数百マイクログラムの試料が必要である。そのため、例えば、医薬物質中の 0.1%の不純物を分取するためには、数百ミリグラムの元試料を必要とする。

従来は、元試料から数回に分けて NM R用試料を分取していたが、試料を濃縮するために長時間を要する上、不安定な試料は濃縮中に分解することもあった。また、 NM R分析においては、水素原子をその同位体である重水素に置換した重水や重メタノール等の溶媒が使われる。これらの溶媒は、非常に高価であるので、できるだけ効率的に測定試料を調製することが求められている。

高速液体クロマトグラフィ一と NM Rを連結したシステムは公知であるが、分析用の H P L Cを使用するため、少量のサンプルしか注入することができないそのため、医薬物質中に 0.1%含まれる不純物などの微量成分を単離して、構造解析するのは困難である。また、専用のプローブを別途購入しなければならないので、経費が嵩むという不都合があるので、より簡便なシステムが求められている。

以上の従来技術の有する問題点を鑑みて、本発明は、混合物中の微量成分を単離精製、脱塩、濃縮、重水素化置換をオンラインで行い、特に、高価な重水や重メタノール等の重溶媒の使用量を極めて少なく済ますシステムを提供することを目的とする。発明の開示

上記目的を達成する本発明の N M R測定用試料の分取と調製を行う高速液体クロマトグラフィ一における移動相の変換方法は、高速液体クロマトグラフィ一により試料中の成分を分離し、別の移動相によりトラッビングカラムで成分を捕捉後、重水により軽水を置換し、次いで重水以外の重溶媒により、その目的成分をトラッピングカラムより溶出することを特徴とする。

これによると、高速液体クロマトグラフィ一による試料中の微量成分の分離に際し、濃縮操作と移動相の変換を行うことで、 NMR測定に適した所望化合物の分取と調製を同時にかつ効率的に行える。

この本発明方法を実施する本発明装置は、高速液体クロマトグラフィーにより試料中の成分を分離する分離 'サンプリングセクション、別の移動相によりトラッピングカラムで成分を捕捉するトラッピングセクシヨン、重水により軽水を置換する重水置換セクション、重水以外の重溶媒により、その目的成分をトラッピングカラムより溶出する重溶媒送出セクシヨンを備えることを特徴とする。その好適な装置の詳細は、分離 'サンプリングセクションが、ポンプ（P 1) から試料分離用移動相を送出し、検出器で所望の化合物ピークを検出し、バルブ (V I) を通って、両端をバルブ（V 2) 及び（V 3) に挟まれたループ（LO OP) に所望の化合物を蓄積する手段を備え、トラッピングセクションが、ボンプ（P 2) から送出される試料濃縮用移動相を、バルブ（V l)、バルブ（V 2)、ループ（LOOP)、バルブ（V 3)、バルブ（V4)、バルブ（V5)、卜ラッピングカラム（TC)、バルブ（V4) の順に流し、バルブ（V3) とバルブ（V 4) の間に分配バルブ（R) を介して試料濃縮用移動相を混合しながら所望の化合物をトラッピングカラム（TC) 中に濃縮する手段を備え、重水置換セクションが、重水を、ポンプ（P 3)、バルブ（V 5)、トラッピングカラム（TC)、バルブ（V4) の順に送出して軽水を重水に置換する手段を備え、重溶媒送出セクシヨンが、重水以外の重溶媒を、ポンフ：（P 4)、バルブ（V4)、卜ラッビングカラム（TC)、バルブ（V 5)、バルブ（V 4)、分離カラム 2 (AC), 検出器（D 2) の順に流し、所望の化合物を収集して、 NMR分析に供する装置である。

なお、ポンプとは、高速液体クロマトグラフィ一用の送液ポンプであり、バルブとは、高速クロマトグラフィー用の六方バルブ等である。

分離用カラムとは、通常の高速液体クロマ卜グラフィ一に使用される分離カラムであり、いわゆる順相カラム、逆相カラム、 G P Cカラム等特に限定されず、試料中の目的とする微量成分を分離することができるカラムを適宜選択できる..：トラッピングカラムとは、目的成分を捕捉し、濃縮するためのカラムであり、必ずしも高速液体クロマトグラフ用のカラムでなくてもある程度耐圧性のカラムであれば使用できる。

サンプリングループとは、分離力ラムにより試料から分離された成分を蓄積するための細管であり、通常ステンレス管を用いる。その長さは、成分濃度等により適宜調節する。

また、ポンプ、カラム、バルブ等は、通常ステンレス管により連結される。重溶媒とは、溶媒中の水素原子を重水素に置換した溶媒（ただし重水を除く）を意味し、例えば、重メタノール、重クロ口ホルム、重メチレンクロライド等である。中でも重メタノールが汎用される。

本発明おいては、高速液体クロマトグラフィ一に用いる移動相を数回変換するが、その手順等については以下の発明の実施の形態において具体的に説明する:：しかし、本発明は、その説明に限定されるものではなく適宜設計変更可能である _:> 図面の簡単な説明

第 1図は、本発明による装置の一例を示す説明図である。第 2図は、本発明装置における検出器 D 1及びレコーダ一により得られたクロマトグラムである。第 3図は、本発明装置における検出器 D ²及びレコーダ一により得られたクロマトグラムである。第 4図は、本発明装置により得られた NMR測定用試料を用いて得られた NMRチヤ一トである。発明を実施するための最良の形態

図面を基に、本発明を詳述する。

第 1図は、高速液体ク口マトグラフィ一による試料濃縮と溶媒変換装置を示すポンプ（P 1 ) に連結する部分が、分離 ·サンプリングセクションである。分離 .サンプリングセクションは、目的成分を分離するための移動相を入れた容器に連通したポンプ（P l)、インジェクター ( 1 )、分離カラム（P C)、検出器（D l)、レコーダ一（R e し'）、並びに、ラインの切り替えを行う六方バルブ（V l)、バルブ（V2、 V3)、ループ（LOOP) からなる _c

六方バルブ（V I) に接続された排出ドレイン（DR 1) は、不要な成分を移動相とともに排出するためのものであり、これらのドレイン（DRA I N) は、通常ステンレス管からなるラインで接続されている。

六方バルブ（V I ) を切替えることにより、ラインは切替えバルブ（V2、 V 3) に接続するサンプリングループ（LOOP) に接続し、移動相は排出ドレイン（DR 1 ) から排出される。

サンプリングル一プ（LOOP) には、多数のループが接続されていて、切り替えバルブ（V 2、 V 3) の操作で、移動相の流路を任意のループに連結するように選択できる。

こうして、分離 'サンプリングセクションで分離した成分を、成分毎に異なるループに分けて蓄積する。ループの数は適宜任意に設定する。

ポンプ（P 2) に連結する部分が、トラッピングセクションである。

トラッピングセクションは、上述の分離移動相とは異なる組成からなる移動相を送出するポンプ（P 2)、分離 'サンプリングセクションと共通の六方バルブ (V I), バルブ（V 2、 V3)、ループ（LOOP)、共通ではない六方バルブ (V4、 V 5)、トラッピングカラム（TC)、ミキシングチャンバ一（MG)、更に、上記流路中に設けられた副流路中に配設した分配バルブ（R) からなり、移動相は、バルブ（V4) に接続される排出ドレイン（DR 2) から排出される _:）トラップカラムは、目的成分を吸着できるように分離カラム（PC) と同じ分離モードのカラムを使用するが、必ずしも高速液体クロマトグラフ用のカラムでなくてもよく、ある程度の耐圧性があるカラムであれば使用できる:：

カラム（PC) とカラム（TC) は、例えば、順相カラム、逆相カラム、ィォン交換カラム、ァフィ二ティーク口マトカラム、 G P Cカラム等の種々の分離モ一ドのカラムを、分離分析しょうとする物質に応じて適宜選択する。

ポンプ（P 3) に連結する部分が、重水置換セクションである _c

重水置換セクションは、重水を送出するポンプ（P 3) とトラッピングセクシヨンと共通の六方バルブ（V 5)、トラッピングカラム（TC)、ミキシングチヤンバ一（MG)、六方バルブ（V4) からなり、各バーッは、通常ステンレス管で接続されていて、重水は排出ドレイン（DR2) から排出される。

ポンプ（P4) に連結する部分が、重溶媒送出セクションである。

重溶媒送出セクションは、重メタノール等の重溶媒（重水を除く）を送出するポンプ（P 4) と、重水置換セクションと共通の六方バルブ（V4)、ミキシングチャンバ一（MG)、トラッピングカラム（TC)、六方バルブ（V5)、並びに、共通でない分離カラム（AC)、検出器（D2) からなる ₌

ミキシングチヤンバ一は、特開平 5— 1 80820号公報に開示された溶媒混合力ラムであり、チャンバ一内に移動相とは異なる溶媒をあらかじめ充填しておくことにより、簡便にグラジェント分析を行うことができる装置である _c 本発明においては、 NMR用サンプルを分取する前に更に分離分析を行い目的成分のより一層の精製濃縮を行うために有用であるが、本発明に必須の構成要素ではない。次に、上記のように構成された装置を使用して溶媒を変換する方法を説明する ₍：まず、ポンプ（P 1) を稼動して成分分離用移動相をライン（30)、（3 1) に送り込み、インジェクター（ I ) から目的とする成分を含有する試料を注入する。

試料は、移動相とともに分離カラム（PC) を通過し、カラム中で試料中に含有される種々の成分に分離され、各成分は、検出器（D 1) 及びレコーダー（R e c ) でモニタ一される。

目的成分以外は、排出ドレイン（DR 1 ) より排出される。

分離された各々の目的成分は、六方バルブ（V I ) を切替えることによりライン（3 2) を通り、両端が切替えバルブ（V 2)、 (V 3 ) に連結したサンプリングループ（LOOP) に送り込まれる。各成分は、切替えバルブ（V 2)、 (V 3) を操作することにより、それぞれ所定のループに蓄積される c

バルブ（V 2)、 (V 3 ) の切替えは、試料中の各々の成分が所定のル一ブに蓄積できるように検出器（D 1 ) の検出信号に応じて行われる

なお、成分分離用移動相は、ライン（3 3)、バルブ（V I ) を通って排出ドレイン（DR 1 ) より排出される。

このようにして、サンプリングループ（LOOP) に適当量の目的成分が蓄積された後、六方バルブ（V I) を切替えてライン（34) と（3 2) を連通させそして、ポンプ（P 2) を稼動して成分分離用移動相とは異なる組成の移動相 (以下、トラップ用移動相と称する）をライン（34)、（3 2)、バルブ（V 2) から、サンプリングループ（LOOP) に送り込む：これによつて、サンブリングループ（LOOP) に蓄積された成分をトラップ用移動相とともに押出して、ライン（33)、バルブ（V I) 及びライン（3 5)、六方バルブ（V4)、ライン（3 6)、六方バルブ（V 5)、ライン（3 7)、 (3 8) を通ってトラッピングカラム（TC) に送り込み目的成分を捕捉する。

トラップ用移動相はライン（3 9)、ミキシングチャンバ一（MG)、ライン (40)、六方バルブ（V4) を通って排出ドレイン（DR 2) へ排出される。この時、副流路（34 ') をライン（34) に接続し、トラップ用移動相をライン（34) の流路へ混合すると、トラッピングカラム（TC) に成分が捕捉されやすくなる。

即ち、トラッピングカラム（TC) に目的成分を捕捉するためには、成分分離用移動相とは異なる組成の移動相を流す必要があるが、サンプリングループ（L OOP) 内に蓄積された成分及び分離用移動相を副流路からの移動相の混合なしにトラップ用移動相により押出すと、一時的に分離用移動相濃度が高くなり、目的成分がトラッブされにくレ、。副流路からトラップ用移動相を混合し分離用移動相を希釈することにより、トラップ効率を高めることができる。副流路には、分配バルブ（R) を設置して流量を調節することができる。

また、トラップ用移動相は、目的成分をトラッピングカラム（TC) に捕捉させるとともに、サンプリングループ（LOO P) 中に貯留された分離用移動相で用いた緩衝成分を取り除く役割を果たす。トラップ用移動相としては、例えば逆相系では水などが使用でき、順相系ではへキサン等の炭化水素ゃクロロホルム等のハロゲン化炭化水素などが使用できる- 次に、六方バルブ（V 5) を切替えてライン（4 1 ) とライン（3 8) を連通させ、ポンプ（P 3) を稼動させることにより、重水をトラッピングカラム（T C) に送り込んで、トラッピングカラム（TC) 及びライン（3 8)、（3 9)、 (40) 中に存在する卜ラップ用移動相を重水に置換する。

なお、この時、トラッピングカラム（TC) 中の成分は、カラム中に蓄積されたまま溶出されない。

最後に、バルブ（V 4)、 (V 5) を切替えて、ライン（4 3)、（4 0)、ミキシングチャンバ一（MG)、ライン（3 9)、トラッピングカラム（TC)、ライン（3 8)、バルブ（V 5 )、ライン（3 7)、 (3 6 ) バルブ（V 4 )、ライン (4 2)、分離カラム（AC)、並びに、検出器（D 2) を連通させ、ポンプ（P 4) を稼動する。

これにより、重メタノール等の重溶媒（重水を除く）を送出し、トラッピングカラム（TC) 内に貯留された目的成分を溶出させる。そして、その目的成分は分離カラム（AC) により更に分離精製されるとともに、より濃縮された状態となって、検出器（D 2) を通過し分取される。

以下に、実験例を示す。

試料として、不純物を約 2.5%含有するクロタミトン（Crotamiton) を用い、次の条件により、本発明による装置及び方法の効果を確認した。

実験条件；

ポンプ 1 (P 1) TOSOH CCPM

移動相 H ₂0： CH ₃ CN=100： 40 分離用カラム 1 (PC) ' · · · ODS-AM, 10x300mm(YMC)

検出器（D 1 ) 検出波長 UV230nm (Shimazu SPD-6A) 流速 4.0ml/min

ポンプ 2 (P 2) · · · · · · · TOSOH CCPM

移動相 · · · · · H ₂ O (軽水）

流速 2.0ml/min

トラッピングカラム（T C) · · 4.6x34mm(Inertsil)

トラップ時間 30分

ポンプ 3 (P 3 ) TOSOH CCPM

移動相 D _: 0 (重水）

流速 l.Oml/min

変換時間 10分

ポンプ 4 (P 4 ) TOSOH CCPM

移動相 CD ₃ OD (重メタノール）

分離用カラム（AC) ODS,2.1x250mm(Inertsil)

検出器（D2) 検出波長 UV230nm(Shimazu SPD-6A) 流速 0.2ml/min

NMR JEOL JNM-a 400

実験の結果は、図 2ないし 4に示す通りであり、重水使用量は 10ml、重メタノ一ル使用量は 4 mlであつた。

従来は、分取、濃縮、乾燥後に NMR測定を行っていたが、本発明による装置及び方法では、オンラインによる連続操作により NMR測定試料を得ることができ、また、高価な重水や重メタノール等の重溶媒の使用量が極めて少量で済むことが確認された。産業上の利用可能性

本発明によると、構造解析試料の単離精製 ·脱塩 ·濃縮 ·重水素化置換がオンライン操作により行えるため、試料のドライアップが不要であり、特に不安定なサンプルの構造解析に有用であるまた、例えば医薬品として有望な生理活性物質中の極微量な不純物の単離精製 •脱塩 ·濃縮 ·重水素化置換を、短時間で行うことができる _c

更に、試料中の複数の微量成分を分離するとともに、 NM R分析に適した重メタノ一ル等の重溶媒への置換を、容易に行うことができ、しかも、重メタノールの使用量を極めて少量で済ませられる。

Claims

請求の範囲

1. 高速液体クロマトグラフィーにより試料中の成分を分離し、別の移動相によりトラッピングカラムで成分を捕捉後、重水により軽水を置換し、次いで重水以外の重溶媒により、その目的成分をトラッビングカラムより溶出することを特徴とする NMR測定用試料の分取と調製を行う高速液体クロマトグラフ Y—における移動相の変換方法。

2. 高速液体クロマトグラフィ一により試料中の成分を分離する分離 ·サンブリングセクション、別の移動相によりトラッピングカラムで成分を捕捉するトラッピングセクシヨン、重水により軽水を置換する重水置換セクシヨン、重水以外の重溶媒により、その目的成分をトラッビングカラムより溶出する重溶媒送出セクシヨンを備えることを特徴とする N M R測定用試料の分取と調製を行う高速液体クロマトグラフィ一装置 _c

3. ポンプ、インジェクター、分離用カラム、切り替えバルブ、検出器、分配バルブ、サンプリングループ、トラッビングカラムを備えた高速液体クロマトグラフィーシステムであって、

分離 .サンブリングセクシヨンが、ポンプ（ P 1 ) から試料分離用移動相を送出し、検出器で所望の化合物ピークを検出し、バルブ（V I) を通って、両端をバルブ（V 2) 及び（V 3) に挟まれたループ（LOOP) に所望の化合物を蓄積する手段を備え、

トラッピングセクションが、ポンプ（P 2) から送出される試料濃縮用移動相を、バルブ（V l)、バルブ（V2)、ループ（LOOP)、バルブ（V 3)、バルブ（V4)、バルブ（V 5)、トラッピングカラム（TC)、バルブ（V4) の順に流し、バルブ（V3) とバルブ（V4) の間に分配バルブ（R) を介して試料濃縮用移動相を混合しながら所望の化合物をトラッピングカラム（TC) 中に濃縮する手段を備え、

重水置換セクションが、重水を、ポンプ（P 3)、バルブ（V 5)、トラツビングカラム（TC)、バルブ（V4) の順に送出して軽水を重水に置換する手段を備え、

重溶媒送出セクションが、重水以外の重溶媒を、ポンプ（P 4)、バルブ（V 4)、トラッピングカラム（TC)、バルブ（V 5)、バルブ（V4)、分離カラム 2 (AC), 検出器（D2) の順に流し、所望の化合物を収集して、 NMR分祈に供する請求の範囲第 2項に記載の NMR測定用試料の分取と調製を行'）高速液体クロマトグラフィー装置。