WO1999061638A1 - Vecteurs adenoviraux chimeres - Google Patents

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WO1999061638A1
WO1999061638A1 PCT/FR1999/001238 FR9901238W WO9961638A1 WO 1999061638 A1 WO1999061638 A1 WO 1999061638A1 FR 9901238 W FR9901238 W FR 9901238W WO 9961638 A1 WO9961638 A1 WO 9961638A1
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adenovirus
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packaging
region
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Majid Mehtali
Monika Lusky
Arend Jan Winter
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Transgene S.A.
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
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    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10344—Chimeric viral vector comprising heterologous viral elements for production of another viral vector

Definitions

  • the present invention relates to new adenoviral vectors which have the characteristic of containing a region essential for heterologous packaging with respect to the adenoviral genome from which they are derived. These vectors can be used as auxiliary or recombinant vectors, the former allowing the propagation of the latter.
  • the invention also relates to a process for preparing a viral preparation containing said adenoviral vectors, a cell, a pharmaceutical composition or a material comprising them as well as their use for therapeutic or prophylactic purposes.
  • the present invention also relates to an adenoviral genome of animal origin having attenuated packaging capacities compared to the native genome from which it is derived. The invention is of particular interest for gene therapy perspectives, especially in humans.
  • Gene therapy is defined as the transfer of genetic information into a host cell or organism.
  • the first protocol applied to humans was initiated in the United States in September 1990 on a genetically immunodeficient patient due to a mutation affecting the gene coding for Adenine Deaminase (AD A).
  • AD A Adenine Deaminase
  • the relative success of this first experiment encouraged the development of this technology for various diseases, both genetic (with the aim of correcting the dysfunction of a defective gene) and acquired (cancers, infectious diseases like AIDS, etc.).
  • Most current strategies use vectors to convey the therapeutic gene to its cell target.
  • Many vectors, both viral and synthetic have been developed in recent years and have been the subject of numerous publications accessible to those skilled in the art.
  • adenoviruses as gene therapy vectors has already been mentioned in many documents of the prior art. They infect many cell types, both dividing and quiescent, are non-integrative and not very pathogenic. In addition, they have a natural tropism for the respiratory tract. These particular properties make adenoviruses vectors of choice for many therapeutic and even vaccine applications. As an indication, their genome consists of a linear and double-stranded DNA molecule of approximately 36 b which carries around thirty genes involved in the viral cycle. The early genes (E1 to E4; E for early in English) are distributed in 4 regions dispersed in the genome.
  • the E1, E2 and E4 regions are essential for viral replication while the E3 region involved in the modulation of the anti-adenovirus immune response in the host is not.
  • the late genes (L1 to L5; L for late meaning late in English) mainly code for structural proteins and partially cover the early transcription units. They are mostly transcribed from the major late promoter MLP (for Major Late Promoter in 5 English).
  • the adenoviral genome carries at its ends regions in cis acting essential for the packaging consisting of inverted terminal sequences (ITR) located at the 5 'and 3' ends and an packaging region which follows the ITR 5 '.
  • ITR inverted terminal sequences
  • the adenoviral vectors currently used in gene therapy protocols lack most of the E1 region in order to avoid their dissemination in the environment and the host organism. Additional deletions in the E3 region allow increased cloning capabilities.
  • the genes of interest are introduced into viral DNA in place of either deleted region. If the feasibility of gene transfer using these so-called first generation vectors is now well established, the question of their safety remains unanswered. In addition to the risk of generating particles competent for replication, the potential immunogenicity of the viral proteins still expressed can, in certain particular applications, oppose the persistence of the transduced cells and the stable expression of the transgene.
  • adenoviral vectors The techniques for preparing adenoviral vectors are widely described in the literature.
  • the genome is constituted by homologous recombination in line 293 (see in particular Graham and Prevect, 1991, Methods in Molecular Biology, Vol 7, Gene Transfer and Expression Protocols; Ed EJ Murray, The Human Press Inc, Clinton, NJ) or in Esche chia coli (see for example international application WO96 / 17070). It is then necessary to propagate the vector in order to constitute a stock of viral particles containing it. This production stage is critical and must make it possible to reach high titers of infectious particles in order to be able to envisage large-scale development with a view to preparing clinical batches.
  • Complementation lines are used for this purpose, supplying in particular the viral expression products for which the vector is defective.
  • viruses deleted from E1 can be propagated in line 293, established from human embryonic kidney cells (Graham et al., 1977, J. Gen. Virol. 36, 59-72).
  • second generation vectors it is possible to have recourse to lines complementing two essential viral functions, such as those described by Yeh et al. (1996, J. Virol. 70, 559-565), Krougliak and Graham (1995, Human Gene Therapy 6, 1575-1586), Wang et al. (1995 Gene Therapy 2, 775-783), Lusky et al. (1998, J. Virol.
  • helper virus an additional viral element, designated "helper virus” to at least partially complement the defective functions of a recombinant adenoviral vector.
  • the helper viruses of the prior art consist of an adenoviral genome, possibly deleted from an essential region for which the recombinant vector does not require complementation.
  • the co-transfection in line 293 of a helper virus El " and of a recombinant adenoviral vector El " E4 " leads to the formation of viral particles of recombinant vector.
  • the El function is provided by the line 293 and the E4 function by the helper virus.
  • the cells produce a mixed population of viral particles, some comprising the recombinant vector and the others the auxiliary vector.
  • the preparations mainly contain auxiliary viral particles, these having a selective advantage, so that the contamination can reach and even exceed 90%.
  • the presence of the helper virus is not desirable in the context of therapy applied to humans and, therefore, requires the implementation of physical separation techniques, such as ultracentrifugation.
  • the present invention proposes to exploit the respective growth properties of human and animal adenoviruses.
  • Ad5 virions are obtained by infection of a bovine line.
  • the present invention notably proposes an encapsidation system taking place in two stages and using chimeric adenoviruses between Ad5 and BAV3.
  • the BAV3 genome provides the factors acting in trans allowing the packaging of the recombinant and auxiliary vectors and the latter at least partially complements the defective functions of the recombinant vector.
  • the mixture of the three types of virus is recovered from bovine cells and used to infect human cells 293.
  • the BAV3 genome and the helper vector having only an encapsidation region derived from BAV3 cannot propagate in the human line even in the presence Ad5 due to the absence of packaging factors recognizing the BAV3 sequences, which excludes the formation of corresponding viral particles.
  • the auxiliary vector can produce in trans the factors necessary for the packaging of the recombinant vector mediated by the packaging signal of origin Ad5 and complement, in association with the 293 cells, the defective early and late functions, with the aim of to generate mainly virions containing the recombinant vector.
  • the present invention meets safety objectives by considerably reducing the contamination of adenoviral preparations by the auxiliary vectors and thus avoids the use of long, costly and variable efficiency separation techniques.
  • the present invention relates to an adenoviral vector derived from an adenoviral genome characterized in that it comprises a region essential for heterologous packaging in relation to the adenoviral genome from which it derives.
  • an adenoviral vector is obtained from a parental adenovirus whose genome is modified.
  • a minimal modification is the insertion of a region essential to the packaging of a different origin (heterologous).
  • other modifications can also be envisaged. These can be diverse (deletion, addition, substitution of one or more nucleotides) and localized within or outside the coding regions of the adenoviral genome (regions involved in the expression of viral genes, in the encapsidation .%) and affected both early and late regions.
  • an adenoviral vector which is particularly suitable for the present invention is defective, that is to say incapable of propagating autonomously in a host cell in the absence of complementation.
  • D may be defective for one or more viral genes essential for replication. These genes can be deleted (in whole or in part), made non-functional (for example by mutation) or substituted by other sequences (in particular by a gene of interest whose expression is sought in a host cell or organism ).
  • the adenoviral vector of the present invention can be derived from a human or animal adenovirus and from any serotype.
  • Human adenoviruses of subgroup C and in particular adenoviruses 2 (Ad2) and 5 (Ad5) are very particularly suitable for implementing the invention.
  • Ad2 adenoviruses 2
  • Ad5 Ad5
  • animal adenoviruses which can be used in the context of the present invention, mention may be made of canine, avian, bovine, murine, porcine sheep, simian adenoviruses, etc.
  • murine adenoviruses Mavl canine CAV-1 or CAV-2 (Spibey and Cavanagh, J. Gen. Virol, 1989, 70, 165-172; Linné, 1992, Virus Research 23, 119-133; Shibata et al., 1989, Virol. 172, 460-467; Jouvenne et al., Gène, 1987, 60, 21-28), aviens DAV ( Zakharchuk et al., Arch. Virol., 1993, 128, 171-176) or also cattle BAV3 (Mittal et al., J. Gen.
  • region essential for encapsidation is meant a region acting in cis to ensure, in collaboration with protein factors in particular viral, the encapsidation of a viral vector genome in a viral capsid .
  • regions consist in particular, in the case of the adenoviral genome, of the 5 'and 3' ITRs, and the encapsidation region.
  • the characteristic of the adenoviral vector according to the invention is that it carries a region essential for heterologous packaging, that is to say of a different origin compared to the parental adenovirus.
  • a region essential for heterologous packaging consists of the packaging sequence and optionally at least one of the 5 'and 3' ITRs.
  • the regions essential for packaging may vary somewhat. However, they can be identified on the basis of available sequence data or by analogy with human adenoviruses.
  • the ITRs are naturally located at the 5 'and 3' ends of the adenoviral genome and are involved in the steps of replication and packaging of said genome. Generally, ITRs have between 100 and 200 base pairs. Many ITR sequences are proposed by the literature, by way of example, Hearing et al., 1987, J. Virol., 61, 2555-2558 for Ad5 or WO 95/16048 for BAV3.
  • the encapsidation region (noted ⁇ ) is localized following the ITR 5 ′ of the adenoviral genome and includes redundant motifs which participate in the encapsidation.
  • that of AdS comprises 7 motifs designated AI to AVII of consensus sequence 5 'AT AN A / T TTTG 3' (where N represents any nucleotide) and located at positions 241-248, 262-269, 304- 311, 314-321 and 339-346 of the viral genome (Grable and Hearing, 1990, J. Virol. 64, 2047-2056; Schmid and Hearing, 1998, J. Virol. 72, 6339-6347).
  • the packaging regions of various adenoviruses are described in the literature (see for example Hammarskjold and Winberg, 1980, Cell 20, 787-795 for Adl pour; Hearing et al., 1987, J. Virol. 61, 2555-2558 for Ad5; Robinson and Tibbets, 1984, Virology 137, 276-286 for Ad3; Shibata et al., 1989, Virology 172, 460-467 for CAV2; WO95 / 16048 for BAV3).
  • the packaging region of Ad5 extends from at least nucleotides (nt) 240 to 350.
  • BAV3 As for that of BAV3, it is included within a 0.3 kb fragment between positions about 185 to about 514.
  • the boundaries of the packaging region can vary and shorter or longer regions are also suitable. Those skilled in the art are capable of isolating a 5 ′ end fragment from an adenoviral genome, of inserting it into a suitable vector and of verifying its capacity for packaging in an appropriate line, for example by determining the viral titer or expression of a reporter gene.
  • sequences carrying the region essential for heterologous encapsidation can be isolated from a viral genome by conventional means (digestion by restriction enzyme, PCR, etc.) or produced by chemical synthesis.
  • they may include mutations (deletion, substitution and / or addition of one or more nucleotides) relative to the native sequences.
  • mutations mutations (deletion, substitution and / or addition of one or more nucleotides) relative to the native sequences.
  • other exogenous sequences (restriction sites, etc.).
  • They can be inserted into the adenoviral vector according to the invention in addition to or in replacement of the autologous region. The insertion can take place 5 'or 3' from the autologous region, in its place or in a different location (for example at the 3 'end just before the ITR 3').
  • the adenoviral vector according to the invention originates from an adenovirus of human origin and the region essential for the heterologous encapsidation of an adenovirus of animal origin.
  • a vector which is very particularly suitable for the present invention derives from a human adenovirus of the subgroup C and, in particular from an adenovirus 2 (Ad2) or 5 (Ad5).
  • Ad2 adenovirus 2
  • Ad5 Ad5
  • the region essential for heterologous encapsidation it preferably derives from an animal adenovirus selected from those previously mentioned.
  • the adenoviral vector according to the invention derives from an Ad5 and the region essential for the heterologous encapsidation of a bovine adenovirus, in particular of a BAV3.
  • adenoviral vector deriving from an Ad5 and comprising a region essential for heterologous encapsidation originating from another human adenovirus of different serotype Ad3, Ad7, etc.
  • Ad3, Ad7 Ad3, Ad7, etc.
  • the adenoviral skeleton may be of animal origin and the region essential for the packaging resulting from a human adenovirus.
  • the adenoviral vector according to the invention is preferably defective at least for the E1 function. Such a deficiency can be obtained by total or partial deletion of the corresponding region.
  • Many E1 " vectors are described in the prior art and can be used in the context of the present invention. In addition, it can comprise additional mutations / deletions affecting one or more other viral genes, in particular within E2, E4 and / or L1-L5 regions. All the combinations can be envisaged (El " E2 " , El “ E4 “ , El ' E2 * E4 " ).
  • Such vectors are notably described in international application WO94 / 28152.
  • the adenoviral vector according to the invention can be devoid of all or part of the nonessential region E3.
  • the adenoviral vector according to the invention can be used as an auxiliary viral vector to complement all or part of the defective functions of a recombinant adenoviral vector.
  • it is defective at least for the function E1.
  • it can be defective for additional functions such as E2.
  • E4 function can be performed by ORF 6 and 7 only. The presence of all or part of the E3 region is optional.
  • the auxiliary viral vector comprises the sequences coding for the functions E2, E4 and / or L1-L5 derived from a human adenovirus, in particular from an Ad5 and a region of heterologous packaging derived from a bovine adenovirus, in particular from a BAV3.
  • the auxiliary viral vector comprises the sequences coding for the functions E2, E4 and / or L1-L5 derived from a human adenovirus, in particular from an Ad5 and ITR 5 ′, ITR 3 ′ sequences and heterologous encapsidation region, derived from a bovine adenovirus, in particular of a BAV3.
  • An auxiliary adenoviral vector is obtained according to the invention by insertion into an adenoviral genome as defined above of at least one region essential for heterologous packaging.
  • a preferred way to do this is to replace the region essential for autologous packaging with the heterologous one.
  • the adenoviral vector according to the invention is a recombinant adenoviral vector and comprises at least one gene of interest placed under the control of the elements necessary for its expression in a cell or a host organism.
  • the gene of interest in use in the present invention can come from a eukaryotic organism, from a prokaryote from a parasite or from a virus other than an adenovirus. It can be isolated by any conventional technique in the art, for example by cloning, PCR or chemical synthesis. It can be of genomic type (comprising all or part of all the introns), of complementary DNA type (cDNA, devoid of intron) or of mixed type (minigene). Furthermore, it can code for an antisense RNA and / or a messenger RNA (mRNA) which will then be translated into the polypeptide of interest, which may be (i) intracellular, (ii) incorporated into the membrane of the host cell or (iii) secreted. It may be a polypeptide as found in nature (native), a portion of it (truncated), a mutant exhibiting in particular improved or modified biological properties or else a chimeric polypeptide from the fusion of sequences of various origins.
  • a gene of interest coding for a cytokine interferon ⁇ , ⁇ or ⁇ , interleukin (IL), in particular EL-2, EL-6, TEL-10 or even EL-12, a tumor necrotizing factor (TNF), a colony stimulating factor (GM-CSF, C-CSF, M-CSF )
  • a cellular receptor in particular recognized by the HIV virus
  • a receptor ligand a receptor ligand
  • a coagulation factor a factor growth agent
  • FGF Fibroblast Growth Factor
  • VEGF Vascular Endothelial Growth Factor
  • an enzyme urease, renin, thrombin, metalloproteinase, nitric oxide synthetase NOS, SOD, catalase
  • an enzyme inhibitor ⁇ l-antitrypsin , antithrombin III, viral protease inhibitor, PAI-1 for plasminogen activator i hibitor
  • a functional copy of the defective gene will be used, for example a gene coding for factor VII or IX in the context of hemophilia A or B, dystrophin in the context of myopathies by Duchenne and Becker, insulin in the context of diabetes, the CFTR protein (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) in the context of cystic fibrosis.
  • factor VII or IX in the context of hemophilia A or B
  • dystrophin in the context of myopathies by Duchenne and Becker
  • insulin in the context of diabetes
  • the CFTR protein Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator
  • a gene of interest coding for an antisense RNA, a ribozyme, a cytotoxic product (thymidine kinase of virus simplex virus l herpes 1 (TK-HSV-1), ricin, cholera toxin, diphtheria, product of yeast genes FCY1 and FUR1 coding for uracyl phosphoribosyl transferase and cytosine deaminase), an antibody, an inhibitor of cell division or transduction signals, an expression product of a tumor suppressor gene (p53, Rb, p73 ....), a polypeptide stimulating the immune system, an antigen associated with a tumor (MUC-1, BRCA-1, early or late antigens (E6, E7, Ll, L2 ...) HPV papilloma virus ....), possibly in combination with a cytokine gene.
  • TK-HSV-1 thymidine kinase of virus simplex virus l herpes 1
  • ricin
  • an immunoprotective polypeptide for example a CD4-immunoglobulin IgG hybrid; Capon et al., 1989, Nature 337, 525-531; Bym et al., 1990, Nature 344, 667-670
  • an immunotoxin for example fusion of the antibody 2F5 or of immunoadhesin CD4-2F5 to angiogenin; Kurachi et al., 1985, Biochemistry 24, 5494-5499)
  • a trans-dominant variant for example fusion of the antibody 2F5 or of immunoadhesin CD4-2F5 to angiogenin
  • one of the genes of interest can also be a selection gene making it possible to select or identify the transfected or transduced cells.
  • neo genes coding for neomycin phosphotransferase which confer resistance to the antibiotic G418, dhfr (Dihydrofolate Reductase), CAT (Chloramphenicol Acetyl transferase), pac (Puromycin Acetyl-Transferase) or gpt (Xanthine Guanine Phosphoribosyl Transferase) ).
  • the selection genes are known to those skilled in the art.
  • the expression "elements necessary for expression” designates the genetic elements allowing the transcription of a gene of interest into RNA and the translation of an mRNA into polypeptide.
  • the promoter is of particular importance. It can be isolated from any gene of eukaryotic or even viral origin and can be constitutive or regulable. Alternatively, it may be the natural promoter of the gene in question. Furthermore, it can be modified so as to improve the promoter activity, to suppress a region inhibiting transcription, make a constitutive promoter regulable or vice versa, introduce a restriction site ....
  • PGK Phospho Glycerate Kinase
  • MT metalothioneine; Me Ivor et al., 1987, Mol. Cell Biol. 7, 838-848
  • ⁇ -1 antitrypsin CFTR
  • surfactant immunoglobulin
  • ⁇ -actin Tabin et al., 1982, Mol. Cell Biol. 2, 426-436
  • SR ⁇ Takebe et al., 1988, Mol. Cell. Biol.
  • the early promoter of the SV40 virus (Simian Virus), the RSV LTR (Rous Sarcoma Virus), the TK-HSV-1 promoter, the early promoter of the CMV virus (Cytomegalovirus) and the adenoviral promoters El A and MLP. It can also be a promoter stimulating expression in a tumor or cancer cell.
  • the promoters of the MUC-1 genes overexpressed in breast and prostate cancers Choen et al., 1995, J. Clin. Invest. 96, 2775-2782
  • CEA for carcinoma embryonic antigen overexpressed in colon cancers (Schrewe et al., 1990, Mol. Cell. Biol.
  • CMV Cytomegalovirus
  • the elements necessary for expression may, in addition, include additional elements improving the expression of the gene of interest or its maintenance in the host cell. Mention may in particular be made of intronic sequences, secretion signal sequences, nuclear localization sequences, internal sites for re-initiation of IRES-type translation, poly A transcription termination sequences, tripartite leaders and origins of replication. These elements are known to those skilled in the art.
  • the recombinant adenoviral vector according to the invention comprises several genes of interest, these can be placed under the control of the same genetic elements (polycistronic cassette using an internal site for initiation of the IRES-type translation to reinitiate the translation of the second cistron) or independent elements.
  • a particularly advantageous embodiment consists of a recombinant adenoviral vector comprising a second region essential for autologous packaging with respect to the adenoviral genome from which it derives.
  • it carries two packaging regions, one autologous and the other heterologous.
  • Their position in the adenoviral vector can be arbitrary. They can in particular be placed at one of the ends or separated at each of the ends of said vector.
  • the heterologous region is placed 3 'from the autologous region.
  • a recombinant adenoviral vector according to the invention is defective for the El function and at least one of the E2, E4 and / or L1-L5 functions.
  • a preferred example is provided by a vector defective for all of the adenoviral functions (minimum vector) which comprises, in addition to the gene (s) of interest, at least the 5 'and 3' ITRs and a region essential for the autologous packaging deriving from a human adenovirus, in particular from an " Ad5 and a region essential for heterologous packaging deriving from a bovine adenovirus, in particular from a BAV3.
  • the present invention also relates to the use of an auxiliary adenoviral vector according to the invention to complement all or part of the defective functions of a recombinant adenoviral vector defective for replication, in particular of a recombinant adenoviral vector according to the invention, said said auxiliary vectors and recombinant both deriving from the same adenovirus and, in particular from Ad5 and said regions essential for heterologous packaging carried by the auxiliary vector and, optionally, the recombinant vector deriving from the same adenovirus different from the preceding one and, in particular d 'a BAV3.
  • the present invention also relates to a composition
  • a composition comprising:
  • the present invention also relates to an adenoviral genome derived from an animal adenovirus, in particular from a bovine adenovirus and, in particular, from a BAV3 characterized in that it has an attenuated encapsidation capacity compared to the adenovirus of which it is drifting.
  • the aim of attenuation is to reduce the propagation of the adenoviral genome in favor of a genome carrying a native region (auxiliary and recombinant adenoviral vector according to the invention). It can be obtained by partial deletion of the packaging region or by mutation of one or more motifs controlling the packaging process.
  • An example of attenuation is provided in international application WO94 / 28152 and in Imler et al.
  • a region essential for attenuated packaging has a packaging efficiency reduced by a factor of 2 to 1000, advantageously 3 to 100 and, preferably, 5 to 50.
  • the animal adenoviral genome according to the invention may be competent for replication or include modifications affecting one or more viral genes, such as those mentioned above.
  • the total or partial deletion of the El region of said genome can be advantageous in the context of the present invention. It is indicated that the genome and or the vectors may be in the form of DNA or of virus.
  • the present invention also relates to a process for preparing a viral preparation comprising a recombinant adenoviral vector defective for replication, in particular of a recombinant adenoviral vector according to the invention, according to which:
  • said adenoviral genome (ii) being of the same origin as the regions essential for heterologous packaging carried by the vectors (i) and possibly (iii) and said adenoviral genome (ii) and the vectors (i) and (iii) being capable of replicating in said first cell line,
  • step c) recovering said viral particles obtained in step b) in cell culture,
  • step c) a second cell line is infected with said viral particles recovered in step c), said auxiliary vector (i) and said adenoviral genome (ii) having a zero or reduced capacity for packaging and / or replication in said second cell line,
  • step e) recovering said viral preparation obtained in step e) in cell culture.
  • the adenoviral vectors and genomes can be introduced by any means of the art into the first cell line, in particular by transfection and / or infection. It is possible to transfect the vectors in the line which is infected with particles of animal adenoviral genome (before, after or concomitantly with the transfection). Viruses containing the various elements (i) (ii) or (iii) can be formed according to the techniques of art. Furthermore, said recombinant adenoviral vector defective for replication can consist of a vector as described in WO 94/28152, WO
  • genome (ii) can be wild, according to the invention (attenuated) and / or comprise one or more modifications affecting the functionality of one or more viral genes.
  • the first cell comprises
  • an auxiliary adenoviral vector defective at least for the E1 function deriving from a human adenovirus (in particular from an Ad5) and carrying a region essential for heterologous packaging deriving from a bovine adenovirus (in particular from a BAV3 ),
  • an adenoviral genome derived from a bovine adenovirus (in particular from a BAV3) optionally according to the invention
  • said first cell line being of bovine origin.
  • the defective auxiliary adenoviral vector referred to in (i) of the methods described above comprises a region essential for heterologous packaging deriving from a bovine adenovirus (in particular from a BAV3 ) which includes the 5 'and 3' ITRs, and the packaging region.
  • an adenoviral genome (ii) defective for the El function can be used.
  • a BAV3 genome defective for the El function is described in international application WO95 / 16048.
  • a line of the same animal origin as said adenoviral genome (ii) will preferably be used. It can be an established line or a primary line.
  • complementation cell is classic in the field of art.
  • a cell for complementing an adenoviral function can be obtained by transfection of the corresponding viral genes into an appropriate cell line. All standard means for introducing DNA into a cell can be used (calcium phosphate transfection, electroporation, microinjection, lipofection, protoplast fusion, etc.).
  • the viral genes are carried by conventional vectors (synthetic, viral, plasmid vectors, etc.) and placed under the control of elements allowing their constitutive or regulated expression in said complementation cell.
  • a particularly suitable bovine line derives from an MDBK line
  • the second cell line is a cell for complementing the El function of a human adenovirus, in particular of an Ad5.
  • the line 293 will preferably be used. However, other lines such as those described in application WO94 / 28152 can also be used.
  • the viral particles of step c) and the viral preparation can be recovered from the culture supernatant but also from the cells.
  • One of the commonly used methods is to lyse the cells by consecutive freeze / thaw cycles to collect the virions in the lysis supernatant. These can then be amplified and purified according to the techniques of the art (chromatographic process, ultracentrifugation in particular through a cesium chloride gradient, etc.).
  • the present invention also relates to the viral preparation obtained according to the method according to the invention. According to an advantageous embodiment, it comprises at least 30% of infectious viral particles containing the adenoviral vector recombinant according to the invention. Advantageously, it comprises at least 50%, preferably at least 70% and, most preferably, at least 80% of said particles.
  • the present invention also relates to a host cell comprising an adenoviral vector according to the invention or infected with a viral preparation according to the invention.
  • a mammalian and in particular human cell is particularly suitable. It can comprise said vector in a form integrated into the genome or not (episome).
  • E can be a primary or tumor cell of hematopoietic origin (totipotent stem cell, leukocyte, lymphocyte, monocyte or macrophage ...), muscle (satellite cell, myocyte, myoblast ...), cardiac, pulmonary , tracheal, hepatic, epithelial or fibroblast.
  • the present invention also relates to a cell comprising:
  • Said cell is preferably a complement cell for an adenoviral function and, in particular, for the E1 function of an animal or human adenovirus. It has the characteristics defined above.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising, as a therapeutic or prophylactic agent, an adenoviral vector, a viral preparation or a host cell according to the invention in association with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the composition according to the invention is more particularly intended for the preventive or curative treatment of diseases by gene therapy and is intended both for genetic diseases (hemophilia, diabetes, cystic fibrosis, Duchenne or Becker's myopathy, autoimmune diseases) than acquired (cancers, tumors, cardiovascular diseases, diseases of infectious origin such as hepatitis B or C, AIDS, etc.).
  • a pharmaceutical composition according to the invention can be manufactured in a conventional manner for administration by the local, parenteral or digestive route.
  • a therapeutically effective amount of the therapeutic or prophylactic agent is combined with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • routes of administration Mention may be made, for example, of the intragastric, subcutaneous, intracardiac, intramuscular, intravenous, intraarterial, intraperitoneal, intratumoral, intranasal, intrapulmonary or intratracheal route.
  • administration by aerosol or instillation is advantageous.
  • the administration can take place in single dose or repeated one or more times after a certain interval of interval.
  • the appropriate route of administration and dosage vary depending on various parameters, for example, the individual or disease to be treated or the gene (s) of interest to be transferred.
  • the virus preparation according to the invention may be formulated in the form of doses of between 10 and 10 pfu (plaque forming units), advantageously 10 and 10 J pfu and preferably 10 and 10 pfu.
  • doses comprising from 0.01 to 100 mg of DNA, preferably 0.05 to 10 mg and, most preferably, 0.5 to 5 mg are possible.
  • the formulation may also include a pharmaceutically acceptable diluent, adjuvant or excipient. It can be presented in liquid or dry form (lyophylisate ... etc).
  • the vector or the viral preparation according to the invention can optionally be combined with one or more substances which improve transfection efficiency and / or stability.
  • substances which improve transfection efficiency and / or stability.
  • These substances are widely documented in the literature accessible to those skilled in the art (see for example Felgner et al., 1987, Proc. West. Pharmacol. Soc. 32, 115-121; Hodgson and Solaiman, 1996, Nature Biotechnology 14, 339-342; Remy et al., 1994, Bioconjugate Chemistry 5, 647-654).
  • they may be polymers, in particular cationic lipids, liposomes, nuclear proteins or even neutral lipids. These substances can be used alone or in combination.
  • the present invention relates to the use of an adenoviral vector, a viral preparation or a host cell according to the invention for the transfer and expression of a gene of interest in a cell or a host organism.
  • a preferred use consists in the treatment of the human or animal body by gene therapy or immunotherapy.
  • the medicament can be administered directly in vivo (for example by intravenous injection, in an accessible tumor, in the lungs by aerosol ).
  • One can also adopt the ex vivo approach which consists in taking cells from the patient (stem cells of the bone marrow, lymphocytes in the peripheral blood, muscle cells, etc.), transfecting or infecting them in vitro according to the techniques of art and readminister them to the patient.
  • the preferred use is for the preparation of a medicament intended for the treatment of diseases by gene therapy or immunotherapy.
  • the invention also extends to a method of treatment in which a therapeutically effective amount of a recombinant adenoviral vector, a viral preparation or a host cell according to the invention is administered to a patient in need of a such treatment.
  • the constructions described below are produced according to the general techniques of genetic engineering and molecular cloning, detailed in Maniatis et al., (1989, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) or as recommended by the manufacturer when using a commercial kit.
  • the homologous recombination steps are preferably carried out in the E. coli BJ 5183 strain (Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166, 557-580).
  • the technique used consists of filling the protruding 5 ′ ends with the large fragment of DNA polymerase I from E. coli (Klenow).
  • the adenoviral genome elements used in the various constructions described below are indicated precisely according to their position in the nucleotide sequence of the Ad5 and BAV3 genomes as disclosed in the Genebank database under the reference M73260 and AFO30154 respectively.
  • the cells are transfected or transduced and cultured according to standard techniques well known to those skilled in the art.
  • use is made of cell lines 293 (Graham et al, 1977, supra; available from ATCC under the reference CRL1573) and MDBK (ATCC CRL-6071 or CCL-22). It is understood that other cell lines can be used.
  • the MDBK human line and the A549 human lines (ATCC CCL-1)
  • HeLa ATCC CCL-2
  • 293 ATCC CRL-1573
  • the cells are harvested 3 days after infection and the viral titers determined on the MDBK permissive cells.
  • the multiplication factor is less than 1 in the case of infection of human cells while it is between 50 and 100 for the bovine line.
  • the cells are collected and the polyA + RNAs are isolated according to conventional techniques.
  • the reverse transcription is carried out with an antisense primer specific for the E1 region and followed by an amplification by PCR with the same primer and a primer specific for E1.
  • the PCR products are subjected to analysis by Southern blot and detected by a probe. specific for EI making it possible to detect a band of 626 bp corresponding to genomic DNA and of 519 bp derived from polyA-f mRNA.
  • EI specific for EI making it possible to detect a band of 626 bp corresponding to genomic DNA and of 519 bp derived from polyA-f mRNA.
  • an expression of the viral gene E1 is observed which is maximum 16 hours after infection.
  • El is also expressed in line 293.
  • no expression of El mRNA can be detected in all the other human lines tested.
  • a vector comprising an expression cassette for the bacterial gene LacZ coding for ⁇ -galactosidase.
  • the Xhol-Sall fragment of pTG8595 (Lusky et al., 1998, J. Virol. 72, 2022-2033) carrying the LacZ coding sequences is cloned into the Xhol site of the plasmid pCI (Promega).
  • the latter is a eukaryotic expression vector comprising the CMV promoter, splicing sequences, multiple cloning sites and the polyA sequence of SV40.
  • the expression cassette for the LacZ gene flanked by the above-mentioned regulatory elements is isolated in the form of a BglII-BamHI fragment and introduced into the BglII site of the transfer vector pTG8343, to give pTG6452.
  • the transfer vector comprises the 5 ′ end of FAd5 deleted from the majority of the El (nt 1) sequences. at 458 and 3329 at 5788) inserted into a plasmid ppolyll (Lathe et al., 1987, Gene 57, 193-201).
  • the adenoviral genome is reconstituted by homologous recombination between the Pacl-Nsil fragment obtained from pTG6452 and the vector pTG3652 carrying the Ad5 genome deleted from the E3 region cleaved by the enzyme ClaI.
  • the vector thus obtained, called pTG6481 contains the Ad5 sequences devoid of the El (nt 459 to 3328) and E3 regions (nt 28249 to 30758) and the pCMV-LacZ-pA SV40 cassette cloned in place of the El region. packaging region is of Ad5 origin.
  • the next step is to insert the packaging region of BAV3 into the previous vector.
  • Two insertion sites were tested: the first upstream of the native packaging region, at the Afl ⁇ l site in position 151 of the Ad5 genome and the other downstream of this at the Sali site (in position 451 of Ad5).
  • the first construct pTG6466 is generated by Afl ⁇ l digestion of pTG6452, Klenow treatment and introduction of the Hae ⁇ -Pvui fragment of 844 bp covering the sequences at positions 141 to 984 of the BAV3 genome, this fragment having been subjected beforehand to the action of the Klenow.
  • the vector pTG6467 is generated according to the same protocol except that pTG6452 is linearized by Sali.
  • the vectors pTG6466 and ⁇ TG6467 contain two packaging regions, one of Ad5 origin and the other of BAV3 origin (approximately 0.8 kb).
  • BAV3 packaging region from the previous one by Thai or BstuI digestion (positions 185 to 514 of the BAV3 genome).
  • the BAV3 region of approximately 0.3 kb is inserted into the recombinant vectors Ad5 either at the Afl ⁇ l site (5 ′ of the autologous psi region) and at the Sali site (3 ′ of the psi region autologous).
  • Ad5 the recombinant vectors
  • Ad5 either at the Afl ⁇ l site (5 ′ of the autologous psi region) and at the Sali site (3 ′ of the psi region autologous.
  • the transfer vector pTG6458 is generated and the adenoviral genome is reconstituted by homologous recombination as previously to give pTG6482.
  • the modified regions are reintroduced into the adenoviral genome by homologous recombination as indicated above.
  • an auxiliary adenoviral vector derived from the Ad 5 genome comprising the encapsidation region and the 5 'and 3' ITRs of BAV3 was constructed.
  • the vector pTG13373 which is derived from the Ad5 genome deleted from the El and E3 regions is constructed, comprising the 5 'ITR and the packaging region of
  • the vector pTG 13373 is obtained by replacing the 5 'ITR and the Ad5 packaging region present in pTG 8343 with the 5' ITR and the BAV 3 packaging region present in pTG 5431; As an indication, pTG 5431 consists of the 5 ′ end (nucleotides 1 to 8217) of the BAV 3 genome. To do this, pTG 8343 is digested with Bgl III, subjected to the action of Klenow, then digested with Pac I, and pTG 5431 is digested with Ace I, treated with Klenow, and digested with Pac I. The fragments thus obtained are linked to give pTG 13372. Finally, pTG 13373 is obtained by homologous recombination between the fragments obtained from pTG 13372 digested with Bgl I and pTG 6401 digested with Pac I.
  • the vector pTG 14310 derived from the genome of PAd5 deleted from the El and E3 regions and comprising the ITRs 5 ′ and 3 ′ as well as the packaging region of BAV 3 is then obtained in the following manner.
  • the ITR 3 'of Ad5 is replaced in the vector pTG 13384 (consisting of the 3 'end (nucleotides 32800 to 35935) of the Ad 5 genome; a cloning cassette being inserted between nucleotides 35826 and 35827) by the 3' ITR of BAV 3.
  • pTG 13384 is digested by Xba I, subjected to the action of Klenow, then digested by Pac I.
  • pTG 5451 is digested by Apo I, treated with Klenow, and digested by Pac I.
  • the vector pTG 5451 comprises the 5 'ends (nucleotides 1 to 1651 deleted from the fragment 829-1077) and 3' of BAV 3 (nucleotides 33232 to 34446) separated by a unique Hind m restriction site. The fragments thus obtained are linked to give pTG 14261.
  • the ITR 3 'of Ad5 is then replaced in the vector pTG 14263 by the ITR 3' of BAV 3 of pTG 14262.
  • pTG 14263 and pTG 14262 are digested with Hind III and Pac I The fragments thus obtained are linked to give pTG 14266.
  • adenoviral genome is reconstituted by homologous recombination between pTG 14266 linearized by Hind III and pTG 13373 digested with Pac I.
  • the vector obtained named pTG 14310 derives from the genome of Ad 5 deleted from the regions El and E3 and contains the ITR 5 ' and 3 ′ as well as the packaging region of BAV 3.
  • pTG 8343 is digested with Bgl II, subjected to the action of Klenow, then digested with Pac I.
  • pTG 5431 is digested with Pvu ⁇ and Pac I. The fragments thus obtained are linked to give pTG 14313.
  • the adenoviral genome is reconstituted by homologous recombination between the Hind III fragments obtained from pTG 14315 and Pac I obtained from pTG 6401.
  • the vector thus obtained called pTG 14316, is derived from the genome of Ad 5 and comprises the ITR 5 'and 3 'as well as the 0.8 kb packaging region of BAV 3.
  • a further example of a vector according to the invention consists of a vector derived from the PAd5 genome deleted from the El and E3 regions and containing the 5 'and 3' ITRs as well as the 0.3 kb packaging region of BAV 3, in which the packaging region was inserted just upstream of the 3 'ITR.
  • pTG 13372 is digested with Afl 3, subjected to the action of Klenow, then digested by Pac
  • the deletion of the bovine encapsidation region of pTG 14266 is obtained by homologous recombination between the Xmn I / Dra III fragment obtained from pTG 14266 and the Pvu I / Sph I fragment obtained from pTG 14311.
  • the vector pTG 14328 is then obtained.
  • the ITR 3 'of Ad5 in pTG 13384 is then replaced by ITR 3' and the 0.3 kb packaging sequence of BAV 3 present on pTG 5431.
  • pTG 13384 is digested with Bam HI, subjected to the action of Klenow, then digested with Pac I.
  • pTG 5431 is digested with Afl III, treated with Klenow, and digested with Pac I. The fragments thus obtained are linked to give pTG 14271.
  • the introduction of the packaging sequence BAV 3 just upstream of the ITR 3 ' is carried out by ligation of the Eco RI / Hind III fragments obtained from pTG14328 and from pTG 14271.
  • the vector thus obtained is named pTG 14330.
  • the adenoviral genome is then reconstituted by homologous recombination between the Hind III fragments of pTG 14330 and Pac I of pTG 6401.
  • We then obtain the vector pTG prod 11 which derives from the genome of Ad5 deleted from regions E1 and E3 and contains the ITRs 5 'and 3' as well as the 0.3 kb packaging region of BAV 3 inserted just upstream of the ITR 3 '.
  • BAV3 bovine cells of the MBDK line. Then, the transfected cells are infected with a wild or attenuated BAV3 genome. Since Ad5 can spread in bovine cells in the presence of a BAV3 virus and the three viral elements contain a region of BAV3 packaging, they can be packaged in viral capsids and generate infectious viral particles. The mixture is recovered and an amplification step is optionally carried out by successive infection cycles of MBDK cells in order to constitute a viral stock of the three types of virus. During this first step on bovine cells, the BAV3 genome produces the factors acting in trans for the packaging of the helper vector which provides the viral functions necessary for the propagation of the recombinant vector. The packaging of the latter can be mediated by factors adenovirals of BAV3 and Ad5 origin insofar as it has the packaging regions of both origins and the capsids may contain structural proteins BAV3 or Ad5.
  • the viral mixture generated in the bovine line is used to infect human 293 cells.
  • the BAV3 virus cannot spread even in the presence of Ad5.
  • the helper vector of origin Ad5 can replicate its viral genome and express all of the early and late viral genes which it carries.
  • it cannot be packaged because it is provided with a single BAV3 packaging region.
  • the recombinant vector can be via the packaging region of origin Ad5 and packaging factors provided by the auxiliary vector.
  • the viral particles generated are recovered and can be used for therapeutic purposes.

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Abstract

La présente invention concerne des vecteurs adénoviraux qui présentent la caractéristique de contenir une région essentielle à l'encapsidation hétérologue par rapport au génome adénoviral dont ils dérivent. Elle a également pour objet un procédé pour préparer une préparation virale contenant lesdits vecteurs adénoviraux, une cellule, une composition pharmaceutique ou de matière les comprenant ainsi que leur utilisation à des fins thérapeutiques ou prophylactiques. Enfin, la présente invention à également trait à un génome adénoviral d'origine animale présentant des capacités d'encapsidation atténuées par rapport au génome natif dont il dérive.

Description

VECTEURS ADENOVIRAUX CHIMERES
La présente invention concerne de nouveaux vecteurs adénoviraux qui présentent la caractéristique de contenir une région essentielle à l'encapsidation hétérologue par rapport au génome adénoviral dont ils dérivent. Ces vecteurs peuvent être utilisés à titre de vecteurs auxiliaires ou recombinants, les premiers permettant la propagation des seconds. L'invention a également pour objet un procédé pour préparer une préparation virale contenant lesdits vecteurs adénoviraux, une cellule, une composition pharmaceutique ou de matière les comprenant ainsi que leur utilisation à des fins thérapeutiques ou prophylactiques. Enfin, la présente invention a également trait à un génome adénoviral d'origine animale présentant des capacités d' encapsidation atténuées par rapport au génome natif dont il dérive. L'invention présente un intérêt tout particulier pour des perspectives de thérapie génique, notamment chez l'homme.
La thérapie génique se définit comme le transfert d'information génétique dans une cellule ou un organisme hôte. Le premier protocole appliqué à l'homme a été initié aux Etats Unis en septembre 1990 sur un patient génétiquement immunodéficient en raison d'une mutation affectant le gène codant pour l'Adénine Désaminase (AD A). Le succès relatif de cette première expérimentation a encouragé le développement de cette technologie pour diverses maladies aussi bien génétiques (dans le but de corriger le dysfonctionnement d'un gène défectueux) qu'acquises (cancers, maladies infectieuses comme le SIDA...). La plupart des stratégies actuelles utilisent des vecteurs pour véhiculer le gène thérapeutique vers sa cible cellulaire. De nombreux vecteurs tant viraux que synthétiques ont été développés au cours de ces dernières années et ont fait l'objet de nombreuses publications accessibles à l'homme du métier.
L'intérêt des adénovirus à titre de vecteurs de thérapie génique a déjà été évoqué dans de nombreux documents de l'art antérieur. Ils infectent de nombreux types cellulaires, aussi bien des cellules en division que quiescentes, sont non intégratifs et peu pathogènes. En outre, ils possèdent un tropisme naturel pour les voies respiratoires. Ces propriétés particulières font des adénovirus des vecteurs de 5 choix pour de nombreuses applications thérapeutiques et même vaccinales. A titre indicatif, leur génome est constitué d'une molécule d'ADN linéaire et bicaténaire d'environ 36 b qui porte une trentaine de gènes intervenant dans le cycle viral. Les gènes précoces (El à E4 ; E pour early en anglais) sont répartis en 4 régions dispersées dans le génome. Les régions El, E2 et E4 sont essentielles à la replication o virale alors que la région E3 impliquée dans la modulation de la réponse immunitaire anti-adénovirus chez l'hôte ne l'est pas. Les gènes tardifs (Ll à L5 ; L pour late signifiant tardif en anglais) codent majoritairement pour les protéines de structure et recouvrent en partie les unités de transcription précoces. Ils sont pour la plupart transcrits à partir du promoteur majeur tardif MLP (pour Major Late Promoter en 5 anglais). En outre, le génome adénoviral porte à ses extrémités des régions agissant en cis essentielles à l'encapsidation constituées de séquences terminales inversées (ITR) situées aux extrémités 5' et 3' et d'une région d'encapsidation qui suit l'ITR 5'.
Les vecteurs adénoviraux actuellement utilisés dans les protocoles de thérapie génique sont dépourvus de la majeure partie de la région El afin d'éviter leur o dissémination dans l'environnement et l'organisme hôte. Des délétions supplémentaires dans la région E3 permettent d'accroître les capacités de clonage. Les gènes d'intérêt sont introduits dans l'ADN viral à la place de l'une ou l'autre région délétée. Si la faisabilité du transfert de gènes en utilisant ces vecteurs dits de première génération est maintenant bien établie, la question de leur innocuité reste posée. Outre le risque 5 de générer des particules compétentes pour la replication, l'immunogénécité potentielle des protéines virales encore exprimées peut dans certaines applications particulières s'opposer à la persistance des cellules transduites et à l'expression stable du transgène. Ces inconvénients ont justifié la construction de vecteurs de nouvelles - j -
générations. Ils conservent les régions en cis (ITRs et séquences d'encapsidation) essentielles à l'encapsidation mais comportent des modifications génétiques supplémentaires visant à supprimer l'expression in vivo de l'essentiel des gènes viraux (voir par exemple la demande internationale WO94/28152). A cet égard, un vecteur dît minimal, déficient pour l'ensemble des fonctions adénovirales représente une alternative de choix.
Les techniques de préparation des vecteurs adénoviraux sont largement décrites dans la littérature. Dans un premier temps, le génome est constitué par recombinaison homologue dans la lignée 293 (voir notamment Graham et Prevect, 1991 , Methods in Molecular Biology, Vol 7, Gène Transfer and Expression Protocols ; Ed E. J. Murray, The Human Press Inc, Clinton, NJ) ou dans Esche chia coli (voir par exemple la demande internationale WO96/ 17070). H est ensuite nécessaire de propager le vecteur afin de constituer un stock de particules virales le contenant. Cette étape de production est critique et doit permettre d'atteindre des titres élevés en particules infectieuses pour pouvoir envisager un développement à grande échelle en vue de la préparation de lots cliniques. On utilise à cet effet des lignées de complémentation fournissant en tra s les produits d'expression viraux pour lesquels le vecteur est defectif. Par exemple, les virus délétés de El peuvent être propagés dans la lignée 293, établie à partir de cellules de rein embryonnaire humain (Graham et al., 1977, J. Gen. Virol. 36, 59-72). Pour ce qui est des vecteurs de seconde génération, on peut avoir recours à des lignées complémentant deux fonctions virales essentielles, telles que celles décrites par Yeh et al. (1996, J. Virol. 70, 559-565), Krougliak et Graham (1995, Human Gène Therapy 6, 1575-1586), Wang et al. (1995 Gène Therapy 2, 775-783), Lusky et al. (1998, J. Virol. 72, 2022-2033) et dans les demandes internationales W094/28152 et WO97/04119. Du fait de la toxicité potentielle des produits d'expression viraux, ces lignées nécessitent d'être optimisées en terme de capacité de croissance et rendement en particules virales, avant d'envisager leur mise en oeuvre dans un processus industriel. De plus, une lignée complémentant l'ensemble des fonctions adénovirales adaptée à la propagation des vecteurs minimaux n'est à l'heure actuelle pas encore disponible.
Une autre alternative repose sur l'emploi d'un élément viral supplémentaire, désigné "virus auxiliaire" pour complémenter au moins en partie les fonctions défectives d'un vecteur adénoviral recombinant. Les virus auxiliaires de l'art antérieur consistent en un génome adénoviral, éventuellement délété d'une région essentielle pour laquelle le vecteur recombinant ne nécessite pas de complémentation. A titre d'exemple, la co-transfection dans la lignée 293 d'un virus auxiliaire El" et d'un vecteur adénoviral recombinant El" E4" conduit à la formation de particules virales de vecteur recombinant. La fonction El est fournie par la lignée 293 et la fonction E4 par le virus auxiliaire.
Cependant, un inconvénient majeur de cette méthode est que les cellules produisent une population mixte de particules virales, les unes comportant le vecteur recombinant et les autres le vecteur auxiliaire. En pratique, les préparations contiennent majoritairement des particules virales auxiliaires, celles-ci présentant un avantage sélectif, de sorte que la contamination peut atteindre et même dépasser 90%. La présence du virus auxiliaire n'est pas souhaitable dans le cadre d'une thérapie appliquée à l'homme et, de ce fait, nécessite la mise en oeuvre de techniques physiques de séparation, telles que l'ultracentrifugation.
La présente invention se propose d'exploiter les propriétés de croissance respectives des adénovirus humains et animaux. On a maintenant mis en évidence l'incapacité des adénovirus bovins BAV3 à se propager dans une lignée humaine alors que l'Ad5 peut être propagé dans des cellules bovines. En effet, l'infection d'adénovirus BAV3 seuls ou en présence d'Ad5 dans la lignée humaine 293 ne conduit pas à la formation de particules virales infectieuses BAV3. Par contre des virions Ad5 sont obtenus par infection d'une lignée bovine. En outre, il n'y a pas d'expression des protéines virales BAV3 dans les cellules humaines. Sur la base de ces observations, la présente invention propose notamment un système d'encapsidation se déroulant en deux étapes et mettant en oeuvre des adénovirus chimères entre l'Ad5 et BAV3. On a maintenant construit (i) un vecteur auxiliaire dérivé d'un génome Ad5 dans lequel la région d'encapsidation native est remplacée celle de l'adénovirus bovin BAV3 et (ii) un vecteur adénoviral défectif recombinant dérivant d'un Ad5 et comprenant deux régions d'encapsidation, la première d'origine Ad5 (autologue) et la seconde d'origine BAV3 (hétérologue). La transfection des deux vecteurs dans une lignée cellulaire bovine infectée par un adénovirus BAV3 conduit à l'amplification des trois génomes viraux et à la production de particules virales des trois types. Au cours de cette première étape d'amplification, le génome BAV3 fournit les facteurs agissant en trans permettant l'encapsidation des vecteurs recombinant et auxiliaire et ce dernier complémente au moins en partie les fonctions défectives du vecteur recombinant. Le mélange des trois types de virus est récupéré des cellules bovines et utilisé pour infecter des cellules humaines 293. Le génome BAV3 et le vecteur auxiliaire possédant uniquement une région d'encapsidation dérivée de BAV3 ne peuvent pas se propager dans la lignée humaine même en présence d'Ad5 du fait de l'absence des facteurs d'encapsidation reconnaissant les séquences BAV3, ce qui exclut la formation de particules virales correspondantes. Néanmoins, le vecteur auxiliaire peut produire en trans les facteurs nécessaires à l'encapsidation du vecteur recombinant médiée par le signal d'encapsidation d'origine Ad5 et complémenter, en association avec les cellules 293, les fonctions précoces et tardives défectives, dans le but de générer de façon majoritaire des virions contenant le vecteur recombinant. La présente invention répond à des objectifs de sécurité en réduisant considérablement la contamination des préparations adénovirales par les vecteurs auxiliaires et évite ainsi la mise en oeuvre de techniques de séparation longues, coûteuses et d'efficacité variable.
C'est pourquoi la présente invention a pour objet un vecteur adénoviral dérivant d'un génome adénoviral caractérisé en ce qu'il comprend une région essentielle à l'encapsidation hétérologue par rapport au génome adénoviral dont il dérive.
Au sens de la présente invention, un vecteur adénoviral est obtenu à partir d'un adénovirus parental dont le génome est modifié. Une modification minimale est l'insertion d'une région essentielle à l'encapsidation d'une origine différente (hétérologue). Bien entendu, d'autres modifications peuvent également être envisagées. Celles-ci peuvent être diverses (délétio , addition, substitution d'un ou plusieurs nucléotides) et localisées au sein des régions codantes du génome adénoviral ou en dehors de celles-ci (régions impliquées dans l'expression des gènes viraux, dans l'encapsidation....) et touchées aussi bien les régions précoces que tardives. A cet égard, un vecteur adénoviral particulièrement adapté à la présente invention est défectif, c'est à dire incapable de se propager de façon autonome dans une cellule hôte en l'absence de complémentation. D peut être défectif pour un ou plusieurs gènes viraux essentiels à la replication. Ces gènes peuvent être délétés (en totalité ou en partie), rendus non fonctionnels (par exemple par mutation) ou substitués par d'autres séquences (notamment par un gène d'intérêt dont l'expression est recherchée dans une cellule ou un organisme hôte).
Le vecteur adénoviral de la présente invention peut dériver d'un adénovirus humain ou animal et d'un sérotype quelconque. Les adénovirus humains du sous groupe C et notamment les adénovirus 2 (Ad2) et 5 (Ad5) conviennent tout particulièrement à la mise en oeuvre de l'invention. Parmi les adénovirus animaux utilisables dans le cadre de la présente invention, on peut citer les adénovirus canins, aviaires, bovins, murins, ovins porcins, simiens... etc. A titre illustratif, on peut employer les adénovirus murins Mavl (Beard et al., 1990, Virology 175, 81-90), canins CAV-1 ou CAV-2 (Spibey et Cavanagh, J. Gen. Virol, 1989, 70, 165-172; Linné, 1992, Virus Research 23, 119-133 ; Shibata et al., 1989, Virol. 172, 460-467; Jouvenne et al., Gène, 1987, 60, 21-28), aviaires DAV (Zakharchuk et al., Arch. Virol., 1993, 128, 171-176) ou encore bovins BAV3 (Mittal et al., J. Gen. Virol., 1995, 76, 93-102). D'une manière générale, les adénovirus précités sont disponibles dans les collections et notamment à l'ATCC et ont fait l'objet de nombreuses études publiées dans l'art antérieur. Concernant l' adénovirus 5 (Ad5), il convient de noter que la séquence complète de son génome est disponible auprès de GenBank sous le numéro d'accession M73260. Cette séquence est intégralement incorporée par référence dans la présente demande.
Aux fins de la présente invention, par "région essentielle à l'encapsidation", on entend une région agissant en cis pour assurer, en collaboration avec des facteurs protéiques notamment viraux, l'encapsidation d'un génome de vecteur viral dans une capside virale. De telles régions consistent notamment, dans le cas du génome adénoviral, en les ITR 5' et 3', et la région d'encapsidation. Ces termes sont bien connus dans le domaine de l'art considéré.
La caractéristique du vecteur adénoviral selon l'invention est qu'il porte une région essentielle à l'encapsidation hétérologue c'est à dire d'une origine différente par rapport à F adénovirus parental. Bien que celle-ci puisse être issue d'un virus quelconque (rétrovirus, poxvirus...etc), on préfère une origine adénovirale dès lors qu'il s'agit d'un adénovirus de genre ou sérotype différent de l'adénovirus parental. De manière préférée, selon la présente invention, ladite région essentielle à l'encapsidation hétérologue consiste en la séquence d'encapsidation et éventuellement en l'un au moins des ITR 5' et 3'.
Selon l'origine de l'adénovirus, les régions essentielles à l'encapsidation peuvent varier quelque peu. Néanmoins, elles peuvent être identifiées sur la base des données de séquence disponibles ou par analogie avec les adénovirus humains. Les ITR sont naturellement localisés aux extrémités 5' et 3' du génome adénoviral et sont impliqués dans les étapes de replication et d'encapsidation dudit génome. Généralement, les ITR comportent entre 100 et 200 paires de bases. De nombreuses séquences d'ITR sont proposées par la littérature, citons à titre d'exemple Hearing et al., 1987, J. Virol., 61, 2555-2558 pour l'Ad5 ou WO 95/16048 pour BAV3. La région d'encapsidation (notée ψ) est localisée à la suite de l'ITR 5' du génome adénoviral et comporte des motifs redondants qui participent à l'encapsidation. Par exemple, celle de l'AdS comporte 7 motifs désignés AI à AVII de séquence consensus 5' AT AN A/T TTTG 3' (où N représente un nucléotide quelconque) et situés aux positions 241-248, 262-269, 304-311, 314-321 et 339-346 du génome viral (Grable et Hearing, 1990, J. Virol. 64, 2047-2056; Schmid et Hearing, 1998, J. Virol. 72, 6339-6347). Les régions d'encapsidation de divers adénovirus sont décrites dans la littérature (voir par exemple Hammarskjold et Winberg, 1980, Cell 20, 787- 795 pour l'Adlό ; Hearing et al., 1987, J. Virol. 61, 2555-2558 pour l'Ad5 ; Robinson et Tibbets, 1984, Virology 137, 276-286 pour l'Ad3 ; Shibata et al., 1989, Virology 172, 460-467 pour CAV2 ; WO95/16048 pour BAV3). A titre purement illustratif, on indique que la région d'encapsidation d'Ad5 s'étend au moins des nucleotides (nt) 240 à 350. Quant à celle de BAV3, elle est comprise au sein d'un fragment de 0,3 kb entre les positions environ 185 à environ 514. Néanmoins, les limites de la région d'encapsidation peuvent varier et des régions plus courtes ou plus longues conviennent également. L'homme du métier est capable d'isoler un fragment de rextrémité 5' d'un génome adénoviral, de l'insérer dans un vecteur adéquat et de vérifier ses capacités d'encapsidation dans une lignée appropriée, par exemple en déterminant le titre viral ou l'expression d'un gène reporter.
Les séquences portant la région essentielle à l'encapsidation hétérologue peuvent être isolées d'un génome viral par des moyens conventionels (digestion par enzyme de restriction, PCR ...) ou produites par synthèse chimique. Eventuellement, dans le cadre de la présente invention, elles peuvent comprendre des mutations (délétion, substitution et/ou addition d'un ou plusieurs nucleotides) par rapport aux séquences natives. Il est également possible d'inclure d'autres séquences exogènes (sites de restriction... etc). Elles peuvent être insérée dans le vecteur adénoviral selon l' invention en sus de la région autologue ou en remplacement de cette dernière. L'insertion peut avoir lieu en 5' ou en 3' de la région autologue, à sa place ou à un endroit différent (par exemple à l'extrémité 3' juste avant l'ITR 3').
Avantageusement, le vecteur adénoviral selon l'invention est originaire d'un adénovirus d'origine humaine et la région essentielle à l'encapsidation hétérologue d'un adénovirus d'origine animale. A cet égard, un vecteur convenant tout particulièrement à la présente invention dérive d'un adénovirus humain du sous groupe C et, notamment d'un adénovirus 2 (Ad2) ou 5 (Ad5). Quant à la région essentielle à l'encapsidation hétérologue, elle dérive de préférence d'un adénovirus animal sélectionné parmi ceux précédemment cités.
Selon un mode de réalisation tout à fait préféré, le vecteur adénoviral selon l'invention dérive d'un Ad5 et la région essentielle à l'encapsidation hétérologue d'un adénovirus bovin, notamment d'un BAV3.
On indique que les modes de réalisation précités sont préférés mais que d'autres combinaisons peuvent être mises en oeuvre dans le cadre de la présente invention. On peut par exemple envisager un vecteur adénoviral dérivant d'un Ad5 et comprenant une région essentielle à l'encapsidation hétérologue issue d'un autre adénovirus humain de sérotype différent (Ad3, Ad7 ...etc). Alternativement, le squelette adénoviral peut être d'origine animale et la région essentielle à l'encapsidation issue d'un adénovirus humain.
Comme indiqué auparavant, le vecteur adénoviral selon l'invention est de préférence défectif au moins pour la fonction El. Une telle déficience peut être obtenue par délétion totale ou partielle de la région correspondante. De nombreux vecteurs El" sont décrits dans l'art antérieur et peuvent être utilisés dans le cadre de la présente invention. En outre, il peut comprendre des mutations /délétions supplémentaires affectant un ou plusieurs autres gènes viraux, notamment au sein des régions E2, E4 et/ou L1-L5. Toutes les combinaisons peuvent être envisagées (El" E2", El" E4", El' E2* E4" ...). De tels vecteurs sont notamment décrits dans la demande internationale WO94/28152. Pour illustrer ces modes de réalisation, on peut citer la mutation thermosensible affectant le gène DBP (pour DNA Binding Protein en anglais) de la région E2A (Ensinger et al., 1972, J. Virol. 10, 328-339). Une délétion partielle de la région E4 à l'exception des séquences codant pour les cadres de lecture ouverts (ORF) 6 et 7 est également envisageable (Ketner et al., 1989, Nucleic Acids Res. 17, 3037-3048). Une autre possibilité est la délétion totale de l'unité transcriptionnelle E4. Par ailleurs, le vecteur adénoviral selon l'invention peut être dépourvu de tout ou partie de la région non essentielle E3. Selon cette alternative, il peut être intéressant de conserver néanmoins les séquences E3 codant pour les polypeptides permettant l'échappement au système immunitaire de l'hôte, notamment la glycoprotéine gpl9k (Gooding et al., 1990, Critical Review of Immunology 10, 53- 71). Dans certaines applications (vecteur recombinant), la non-fonctionnalité de l'ensemble des gènes viraux est préférée.
Selon une première variante, le vecteur adénoviral selon l'invention peut être employé à titre de vecteur viral auxiliaire pour complémenter tout ou partie des fonctions défectives d'un vecteur adénoviral recombinant. Selon un mode de réalisation avantageux, il est défectif au moins pour la fonction El. Eventuellement, il peut être défectif pour des fonctions supplémentaires telles que E2. Un homme du métier est apte à définir les déficiences requises en fonction du vecteur recombinant que l'on cherche à complémenter et de la lignée cellulaire choisie. On indique que la fonction E4 peut être assurée par l'ORF 6 et 7 uniquement. La présence de tout ou partie de la région E3 est facultative. Selon un mode de réalisation particulier, il comprend les séquences ITR 5' et 3' et les séquences codant pour les fonctions E2, E4 et/ou L1-L5 dérivant d'un adénovirus humain, notamment d'un Ad5 et une région d'encapsidation hétérologue dérivant d'un adénovirus bovin, notamment d'un BAV3. Selon un autre mode de réalisation, le vecteur viral auxiliaire comprend les séquences codant pour les fonctions E2, E4 et/ou L1-L5 dérivant d'un adénovirus humain, notamment d'un Ad5 et des séquences ITR 5', ITR 3' et région d'encapsidation hétérologues, dérivant d'un adénovirus bovin, notamment d'un BAV3.
On obtient un vecteur adénoviral auxiliaire selon l'invention par insertion dans un génome adénoviral tel que défini ci-avant d'au moins une région essentielle à l'encapsidation hétérologue. Une manière préférée de procéder est de remplacer la région essentielle à l'encapsidation autologue par l'hétérologue. L'homme du métier est apte à réaliser une telle construction en appliquant les techniques classiques de biologie moléculaire.
Selon une seconde variante, le vecteur adénoviral selon l'invention est un vecteur adénoviral recombinant et comprend au moins un gène d'intérêt placé sous le contrôle des éléments nécessaires à son expression dans une cellule ou un organisme hôte.
Le gène d'intérêt en usage dans la présente invention, peut être issu d'un organisme eucaryote, d'un procaryote d'un parasite ou d'un virus autre qu'un adénovirus. Il peut être isolé par toute technique conventionnelle dans le domaine de l'art, par exemple par clonage, PCR ou synthèse chimique. Il peut être de type génomique (comportant tout ou partie de l'ensemble des introns), de type ADN complémentaire (ADNc, dépourvu d'intron) ou de type mixte (minigène). Par ailleurs, il peut coder pour un ARN antisens et/ou un ARN messager (ARNm) qui sera ensuite traduit en polypeptide d'intérêt celui-ci pouvant être (i) intracellulaire, (ii) incorporé dans la membrane de la cellule hôte ou (iii) sécrété. Il peut s'agir d'un polypeptide tel que trouvé dans la nature (natif), d'une portion de celui-ci (tronqué), d'un mutant présentant notamment des propriétés biologiques améliorées ou modifiées ou encore d'un polypeptide chimère provenant de la fusion de séquences d'origines diverses.
Dans le cadre de la présente invention, il peut être avantageux d'utiliser un gène d'intérêt codant pour une cytokine (interféron α, β ou γ, interleukine (IL), notamment l'EL-2, l'EL-6, TEL- 10 ou encore l'EL-12, un facteur nécrosant des tumeurs (TNF), un facteur stimulateur de colonies (GM-CSF, C-CSF, M-CSF...), un récepteur cellulaire (notamment reconnu par le virus HIV), un ligand de récepteur, un facteur de coagulation, un facteur de croissance (FGF pour Fibroblast Growth Factor, VEGF pour Vascular Endothelial Growth Factor), une enzyme (uréase, rénine, thrombine, métalloprotéinase, nitric oxide synthétase NOS, SOD, catalase...), un inhibiteur d'enzyme (αl-antitrypsine, antithrombine III, inhibiteur de protéase virale, PAI-1 pour plasminogen activator i hibitor), un antigène du complexe majeur d'histocompatibilité de classe I ou II ou un polypeptide agissant sur l'expression des gènes correspondants, un polypeptide capable d'inhiber une infection virale, bactérienne ou parasitaire ou son développement, un polypeptide agissant positivement ou négativement sur l'apoptose (Bax, Bcl2, BclX...), un agent cytostatique (p21, p 16, Rb), une apolipoprotéine (ApoAI, ApoATV, ApoE...), un inhibiteur d'angiogénèse (angiostatine, endostatine...), un marqueur (β-galactosidase, luciférase....) ou tout autre gène d'intérêt ayant un effet thérapeutique pour l'affection ciblée. Plus précisemment, dans le but de traiter un dysfonctionnement héréditaire, on utilisera une copie fonctionnelle du gène défectueux, par exemple un gène codant pour le facteur Vïïl ou IX dans le cadre de l'hémophilie A ou B, la dystrophine dans le cadre des myopathies de Duchenne et Becker, l'insuline dans le cadre du diabète, la protéine CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) dans le cadre de la mucoviscidose. S'agissant d'inhiber l'initiation ou la progression de tumeurs ou cancers, on mettra de préférence en oeuvre un gène d'intérêt codant pour un ARN anti-sens, un ribozyme, un produit cytotoxique (thymidine kinase de virus simplex de l'herpès 1 (TK-HSV-1), ricine, toxine cholérique, diphtérique, produit des gènes de levure FCY1 et FUR1 codant pour l'uracyle phosphoribosyl transférase et la cytosine désaminase ), un anticorps, un inhibiteur de la division cellulaire ou des signaux de transduction, un produit d'expression d'un gène suppresseur de tumeur (p53, Rb, p73....), un polypeptide stimulateur du système immunitaire, un antigène associé à une tumeur (MUC-1, BRCA-1, antigènes précoces ou tardifs (E6, E7, Ll, L2...) d'un virus à papillome HPV....), éventuellement en combinaison avec un gène de cytokine. Enfin, dans le cadre d'une thérapie anti-HIV, on peut avoir recours à un gène codant pour un polypeptide immunoprotecteur, un épitope antigénique, un anticorps (2F5; Buchacher et al., 1992, Vaccines 92, 191-195), le domaine extracellulaire du récepteur CD4 (sCD4 ; Traunecker et al., 1988, Nature 331, 84-86) une immunoadhésine (par exemple un hybride CD4-immunoglobuline IgG ; Capon et al., 1989, Nature 337, 525-531 ; Bym et al., 1990, Nature 344, 667-670), une immunotoxine (par exemple fusion de l'anticorps 2F5 ou de immunoadhésine CD4- 2F5 à l'angiogénine ; Kurachi et al., 1985, Biochemistry 24, 5494-5499), un variant trans-dominant (EP 0614980, WO95/16780), un produit cytotoxique tel que l'un de ceux mentionné ci-dessus ou encore un IFNα ou β.
Par ailleurs, un des gènes d'intérêt peut également être un gène de sélection permettant de sélectionner ou identifier les cellules transfectées ou transduites. On peut citer les gènes néo (codant pour la néomycine phosphotransférase) conférant une résistance à l'antibiotique G418, dhfr (Dihydrofolate Réductase), CAT (Chloramphenicol Acetyl transférase), pac (Puromycine Acétyl-Transferase) ou encore gpt (Xanthine Guanine Phosphoribosyl Transférase). D'une manière générale, les gènes de sélection sont connus de l'homme de l'art.
La locution "éléments nécessaires à l'expression" désigne les éléments génétiques permettant la transcription d'un gène d'intérêt en ARN et la traduction d'un ARNm en polypeptide. Parmi ceux-ci, le promoteur revêt une importance particulière. Il peut être isolé d'un gène quelconque d'origine eucaryote ou même virale et peut être constitutif ou régulable. Alternativement, il peut s'agir du promoteur naturel du gène en question. Par ailleurs, il peut être modifié de manière à améliorer l'activité promotrice, supprimer une région inhibitrice de la transcription, rendre un promoteur constitutif régulable ou vice versa, introduire un site de restriction.... On peut mentionner, à titre d'exemples, les promoteurs eucaryotes des gènes PGK (Phospho Glycérate Kinase), MT (metallothioneine ; Me Ivor et al., 1987, Mol. Cell Biol. 7, 838-848), α-1 antitrypsine, CFTR, surfactant, immunoglobuline, β- actine (Tabin et al., 1982, Mol. Cell Biol. 2, 426-436), SRα (Takebe et al., 1988, Mol. Cell. Biol. 8, 466-472), le promoteur précoce du virus SV40 (Simian Virus), le LTR du RSV (Rous Sarcoma Virus), le promoteur TK-HSV-1, le promoteur précoce du virus CMV (Cytomegalovirus) et les promoteurs adénoviraux El A et MLP. H peut également s'agir d'un promoteur stimulant l'expression dans une cellule tumorale ou cancéreuse. On peut citer notamment les promoteurs des gènes MUC-1 surexprimé dans les cancers du sein et de la prostate (Chen et al., 1995, J. Clin. Invest. 96, 2775-2782), CEA (pour carcinoma embryonic antigen) surexprimé dans les cancers du colon (Schrewe et al., 1990, Mol. Cell. Biol. 10, 2738-2748), tyrosinose surexprimé dans les mélanomes (Vile et al., 1993, Cancer Res. 53, 3860- 3864), ERB-2 surexprimé dans les cancers du sein et du pancréas (Harris et al., 1994, Gène Therapy 1, 170-175) et α-fétoprotéine surexprimée dans les cancers du foie (Kanai et al., 1997, Cancer Res. 57, 461-465). Le promoteur précoce du Cytomegalovirus (CMN) est tout particulièrement préféré.
Les éléments nécessaires à l'expression peuvent, en outre, inclure des éléments additionnels améliorant l'expression du gène d'intérêt ou son maintien dans la cellule hôte. On peut citer notamment les séquences introniques, séquences signal de sécrétion, séquences de localisation nucléaire, sites internes de réinitiation de la traduction de type IRES, séquences poly A de terminaison de la transcription, leaders tripartites et origines de replication. Ces éléments sont connus de l'homme de l'art.
Lorsque le vecteur adénoviral recombinant selon l'invention comporte plusieurs gènes d'intérêt, ceux-ci peuvent être placés sous le contrôle des mêmes éléments génétiques (cassette polycistronique utilisant un site interne d'initiation de la traduction de type IRES pour réinitier la traduction du second cistron) ou d'éléments indépendants.
Un mode de réalisation particulièrement avantageux consiste en un vecteur adénoviral recombinant comprenant une seconde région essentielle à l'encapsidation autologue par rapport au génome adénoviral dont il dérive. En d'autres termes, il porte deux régions d'encapsidation l'une autologue et l'autre hétérologue. Leur position dans le vecteur adénoviral peut être quelconque. Elles peuvent être notamment placées à l'une des extrémités ou séparées à chacune des extrémités dudit vecteur. Avantageusement, la région hétérologue est placée en 3' de la région autologue.
Dans le cadre de la présente invention, un vecteur adénoviral recombinant selon l'invention est défectif pour la fonction El et l'une au moins des fonctions E2, E4 et/ou L1-L5. Un exemple préféré est fourni par un vecteur défectif pour l'ensemble des fonctions adénovirales (vecteur minimum) qui comprend outre le(s) gène(s) d'intérêt au moins les ITRs 5' et 3' et une région essentielle à l'encapsidation autologue dérivant d'un adénovirus humain, notamment d'un "Ad5 et une région essentielle à l'encapsidation hétérologue dérivant d'un adénovirus bovin, notamment d'un BAV3.
Il est à la portée de l'homme du métier de générer un vecteur adénoviral recombinant selon l'invention par les techniques de biologie moléculaire. H saura bien évidemment adapter la technologie en fonction des données spécifiques (type de vecteur, gène d'intérêt...).
La présente invention concerne également l'utilisation d'un vecteur adénoviral auxiliaire selon l'invention pour complémenter tout ou partie des fonctions défectives d'un vecteur adénoviral recombinant défectif pour la replication, notamment d'un vecteur adénoviral recombinant selon l'invention, lesdits vecteurs auxiliaire et recombinant dérivant tous deux d'un même adénovirus et, en particulier d'un Ad5 et lesdites régions essentielles à l'encapsidation hétérologues portées par le vecteur auxiliaire et, éventuellement, le vecteur recombinant dérivant du même adénovirus différent du précédent et, en particulier d'un BAV3.
La présente invention concerne également une composition comprenant :
(a) un vecteur adénoviral auxiliaire selon l'invention,
(b) un vecteur adénoviral recombinant défectif pour la replication, notamment d'un vecteur adénoviral recombinant selon l'invention, et
(c) de manière optionnelle, un génome adénoviral dérivant d'un adénovirus animal de la même origine que les régions essentielles à l'encapsidation hétérologues portées par les vecteurs auxiliaire et recombinant a) et éventuellement b).
La présente invention concerne également un génome adénoviral dérivant d'un adénovirus animal, notamment d'un adénovirus bovin et, en particulier, d'un BAV3 caractérisé en ce qu'il présente une capacité d'encapsidation atténuée par rapport à l'adénovirus dont il dérive. L'atténuation a pour but de réduire la propagation du génome adénoviral au profit d'un génome portant une région native (vecteur adénoviral auxiliaire et recombinant selon l'invention). Elle peut être obtenue par délétion partielle de la région d'encapsidation ou par mutation d'un ou plusieurs motifs contrôlant le processus d'encapsidation. Un exemple d'atténuation est fourni dans la demande internationale WO94/28152 et dans Imler et al. (1995, Human Gène Therapy 6, 711-721). L'homme de l'art connaît les techniques qui permettent de vérifier l'atténuation, par exemple en déterminant le titre viral (Graham et Prevec, 1991, supra) ou l'expression d'un gène reporter par rapport à un virus équivalent portant une région essentielle à l'encapsidation native. Une région essentielle à l'encapsidation atténuée présente une efficacité d'encapsidation réduite d'un facteur 2 à 1000, avantageusement 3 à 100 et, de manière préférée, 5 à 50.
Le génome adénoviral animal selon l'invention peut être compétent pour la replication ou comprendre des modifications touchant un ou plusieurs gènes viraux, telles que celles citées précédemment. En particulier, la délétion totale ou partielle de la région El dudit génome peut être avantageuse dans le cadre de la présente invention. On indique que le génome et ou les vecteurs peuvent être sous forme d'ADN ou de virus.
La présente invention concerne également un procédé pour préparer une préparation virale comprenant un vecteur adénoviral recombinant défectif pour la replication, notamment d'un vecteur adénoviral recombinant selon l'invention, selon lequel :
(a) on introduit dans une première lignée cellulaire
(i) un vecteur adénoviral auxiliaire selon l'invention,
(ii) un génome adénoviral dérivant d'un adénovirus animal, et
(iii) ledit vecteur adénoviral recombinant
ledit génome adénoviral (ii) étant de la même origine que les régions essentielles à l'encapsidation hétérologues portées par les vecteurs (i) et éventuellement (iii) et ledit génome adénoviral (ii) et les vecteurs (i) et (iii) étant capables de se répliquer dans ladite première lignée cellulaire,
(b) on cultive ladite première lignée cellulaire dans des conditions appropriées pour permettre la production de particules virales comportant les vecteurs (i) et (iii) et le génome adénoviral (ii),
(c) on récupère lesdites particules virales obtenues à l'étape b) dans la culture cellulaire, (d) on infecte une seconde lignée cellulaire avec lesdites particules virales récupérées à l'étape c), ledit vecteur auxiliaire (i) et ledit génome adénoviral (ii) ayant une capacité d'encapsidation et/ou de replication nulle ou réduite dans ladite seconde lignée cellulaire,
(e) on cultive ladite seconde lignée cellulaire dans des conditions appropriées pour permettre l'encapsidation dudit vecteur adénoviral recombinant (iii) et produire ladite préparation virale, et
(f) on récupère ladite préparation virale obtenue à l'étape e) dans la culture cellulaire.
Aux fins de la présente invention, les vecteurs et génomes adénoviraux peuvent être introduits par tous les moyens de l'art dans la première lignée cellulaire, notamment par transfection et/ou infection. Il est possible de transfecter les vecteurs dans la lignée qui est infectée par des particules de génome adénoviral animal (préalablement, postérieurement ou de manière concomitante à la transfection). Les virus contenant les différents éléments (i) (ii) ou (iii) peuvent être constitués selon les techniques de l'art. Par ailleurs, ledit vecteur adénoviral recombinant défectif pour la replication peut consister en un vecteur tel que décrit dans WO 94/28152, WO
94/08026, WO 93/19191 ou WO 94/12649.
Par ailleurs, le génome (ii) peut être sauvage, selon l'invention (atténué) et/ou comprendre une ou plusieurs modifications affectant la fonctionnalité d'un ou de plusieurs gènes viraux.
Selon un mode de mise en oeuvre avantageux, la première cellule comprend
(i) un vecteur adénoviral auxiliaire défectif au moins pour la fonction El, dérivant d'un adénovirus humain (notamment d'un Ad5) et portant une région essentielle à l'encapsidation hétérologue dérivant d'un adénovirus bovin (notamment d'un BAV3), (ii) un génome adénoviral dérivant d'un adénovirus bovin (notamment d'un BAV3), éventuellement selon l'invention, et
(iii) vecteur adénoviral recombinant défectif pour la fonction El et au moins l'une des fonctions E2, E4 et/ou L1-L5 et portant une seconde région d'encapsidation autologue telle que définie ci-avant, dérivant d'un adénovirus humain
(notamment d'un Ad5) et portant une région essentielle à l'encapsidation hétérologue dérivant d'un adénovirus bovin (notamment d'un BAV3),
ladite première lignée cellulaire étant d'origine bovine.
Selon un mode de réalisation tout à fait avantageux, le vecteur adénoviral auxiliaire défectif dont il est question en (i) des procédé décrits ci-dessus comprend une région essentielle à l'encapsidation hétérologue dérivant d'un adénovirus bovin (notamment d'un BAV3) qui comporte les ITR 5' et 3', et la région d'encapsidation.
De manière alternative on peut avoir recours à un génome adénoviral (ii) défectif pour la fonction El. S'agissant de la variante préférée, un génome BAV3 défectif pour la fonction El est décrit dans la demande internationale WO95/16048. Dans ce cas, on aura recours à une première lignée cellulaire capable de complémenter la fonction El dudit génome adénoviral d'origine animale. On emploiera de préférence une lignée de la même origine animale que ledit génome adénoviral (ii). Il peut s'agir d'une lignée établie ou d'une lignée primaire.
Le terme cellule de complémentation est classique dans le domaine de l'art.
Dans le cadre de la présente invention, il se réfère à une cellule eucaryote capable de fournir en trans au moins une partie des fonctions défectueuses d'un vecteur ou génome adénoviral selon l'invention. D'une manière générale, une cellule de complémentation d'une fonction adénovirale peut être obtenue par transfection des gènes viraux correspondant dans une lignée cellulaire appropriée. Tous les moyens standards pour introduire un ADN dans une cellule peuvent être employés (transfection au phosphate de calcium, electroporation, microinjection, lipofection, fusion de protoplastes....). Par ailleurs, les gènes viraux sont portés par des vecteurs conventionnels (vecteurs synthétiques, viraux, plasmides...) et placés sous le contrôle d'éléments permettant leur expression constitutive ou régulée dans ladite cellule de complémentation. Les lignées de complémentation adaptées aux vecteurs adénoviraux sont connues de l'homme de l'art (voir par exemple la demande internationale WO94/28152, WO97/04119 et Graham et al., J. Gen. Virol., 1977, 36: 59-72).
Une lignée bovine convenant particulièrement dérive d'une lignée MDBK
(ATCC CCL-22 ou CRL-6071) ou de cellules primaires, notamment de rétine ou de rein foetal et comprend les séquences codant pour la région El d'un adénovirus bovin et, en particulier d'un BAV3 placées sous le contrôle des éléments nécessaires à leur expression dans ladite lignée.
Selon un mode de réalisation préféré, la seconde lignée cellulaire est une cellule de complémentation de la fonction El d'un adénovirus humain, notamment d'un Ad5. On aura de préférence recours à la lignée 293. Mais d'autres lignées telles que celles décrites dans la demande WO94/28152 peuvent également être employées.
Les particules virales de l'étape c) et la préparation virale peuvent être récupérées du surnageant de culture mais également des cellules. Une des méthodes couramment employée consiste à lyser les cellules par des cycles consécutifs de congélation/décongélation pour recueillir les virions dans le surnageant de lyse. Ceux- ci peuvent ensuite être amplifiés et purifiés selon les techniques de l'art (procédé chromatographique, ultracentrifugation notamment à travers un gradient de chlorure de césium....).
La présente invention concerne également la préparation virale obtenue selon le procédé selon l'invention. Selon un mode de réalisation avantageux, elle comporte au moins 30% de particules virales infectieuses contenant le vecteur adénoviral recombinant selon l'invention. Avantageusement, elle comporte au moins 50%, de préférence, au moins 70% et, de manière tout à fait préférée, au moins 80% desdites particules.
La présente invention concerne également une cellule hôte comprenant un vecteur adénoviral selon l'invention ou infectée par une préparation virale selon l'invention. Une cellule de mammifère et notamment humaine convient tout particulièrement. Elle peut comprendre ledit vecteur sous forme intégrée dans le génome ou non (épisome). E peut s'agir d'une cellule primaire ou tumorale d'une origine hématopoïétique (cellule souche totipotente, leucocyte, lymphocyte, monocyte ou macrophage...), musculaire (cellule satellite, myocyte, myoblaste...), cardiaque, pulmonaire, trachéale, hépatique, épithéliale ou fibroblaste.
La présente invention concerne également une cellule comprenant :
(i) un vecteur adénoviral auxiliaire selon l'invention,
(ii) un génome adénoviral dérivant d'un adénovirus animal, et
(iii) un vecteur adénoviral recombinant défectif pour la replication, notamment d'un vecteur adénoviral recombinant selon l'invention.
Ladite cellule est de préférence une cellule de complémentation d'une fonction adénovirale et , en particulier, de la fonction El d'un adénovirus animal ou humain. Elle a les caractéristiques définies ci-avant.
La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant à titre d'agent thérapeutique ou prophylactique, un vecteur adénoviral, une préparation virale ou une cellule hôte selon l'invention en association avec un support acceptable d'un point de vue pharmaceutique. La composition selon l'invention est plus particulièrement destinée au traitement préventif ou curatif de maladies par thérapie génique et s'adresse aussi bien aux maladies génétiques (hémophilie, diabète, mucoviscidose, myopathie de Duchenne ou de Becker, maladies auto immunes) qu'acquises (cancers, tumeurs, maladies cardiovasculaires, maladies d'origine infectieuse comme l'hépatite B ou C, le SIDA....).
Une composition pharmaceutique selon l'invention peut être fabriquée de manière conventionnelle en vue d'une administration par voie locale, parentérale ou digestive. En particulier, on associe une quantité thérapeutiquement efficace de l'agent thérapeutique ou prophylactique à un support acceptable d'un point de vue pharmaceutique. Les voies d'administration envisageables sont multiples. On peut citer par exemple la voie intragastrique, sous-cutanée, intracardiaque, intramusculaire, intraveineuse, intraartérielle, intrapéritonéale, intratumorale, intranasale, intrapulmonaire ou intratrachéale. Pour ces trois derniers modes de réalisation, une administration par aérosol ou instillation est avantageuse. L'administration peut avoir lieu en dose unique ou répétée une ou plusieurs fois après un certain délai d'intervalle. La voie d'administration et le dosage appropriés varient en fonction de divers paramètres, par exemple, de l'individu ou de la maladie à traiter ou encore du ou des gène(s) d'intérêt à transférer. La préparation virale selon l'invention peuvent être formulées sous forme de doses comprises entre 10 et 10 ufp (unités formant des plages), avantageusement 10 et 10 J ufp et, de préférence, 10 et 10 ufp. Pour ce qui est du vecteur adénoviral recombinant selon l'invention, des doses comprenant de 0,01 à 100 mg d'ADN, de préférence 0,05 à 10 mg et, de manière tout à fait préférée, 0,5 à 5 mg sont envisageables. La formulation peut également inclure un diluant, un adjuvant ou un excipient acceptable d'un point de vue pharmaceutique. Elle peut être présentée sous forme liquide ou sèche (lyophylisat ... etc).
Le vecteur ou la préparation virale selon l'invention peut être éventuellement associé à une ou plusieurs substances améliorant l'efficacité transfectionnelle et/ou la stabilité. Ces substances sont largement documentées dans la littérature accessible à l'homme de l'art (voir par exemple Felgner et al., 1987, Proc. West. Pharmacol. Soc. 32, 115-121 ; Hodgson et Solaiman, 1996, Nature Biotechnology 14, 339-342; Remy et al., 1994, Bioconjugate Chemistry 5, 647-654). A titre illustratif mais non limitatif, il peut s'agir de polymères, de lipides notamment cationiques, de liposomes, de protéines nucléaires ou encore de lipides neutres. Ces substances peuvent être utilisées seules ou en combinaison.
Enfin, la présente invention est relative à l'utilisation d'un vecteur adénoviral, d'une préparation virale ou d'une cellule hôte selon l'invention pour le transfert et l'expression d'un gène d'intérêt dans une cellule ou un organisme hôte. Une utilisation préférée consiste en le traitement du corps humain ou animal par thérapie génique ou immunothérapie. Selon une première possibilité, le médicament peut être administré directement in vivo (par exemple par injection intraveineuse, dans une tumeur accessible, dans les poumons par aérosol...). On peut également adopter l'approche ex vivo qui consiste à prélever des cellules du patient (cellules souches de la moelle osseuse, lymphocytes du sang périphérique, cellules musculaires...), de les transfecter ou infecter in vitro selon les techniques de l'art et de les réadminister au patient. L'utilisation préférée est pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des maladies par thérapie génique ou immunothérapie.
L'invention s'étend également à une méthode de traitement selon laquelle on administre une quantité thérapeutiquement efficace d'un vecteur adénoviral recombinant, d'une préparation virale ou d'une cellule hôte selon l'invention à un patient ayant besoin d'un tel traitement.
EXEMPLES
La présente invention est illustrée, sans pour autant être limitée, par les exemples suivants.
Les constructions décrites ci-dessous sont réalisées selon les techniques générales de génie génétique et de clonage moléculaire, détaillées dans Maniatis et al., (1989, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) ou selon les recommandations du fabricant lorsqu'on utilise un kit commercial. Les étapes de recombinaison homologue sont de préférence réalisées dans la souche E. coli BJ 5183 (Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166, 557-580). S'agissant de la réparation des sites de restriction, la technique employée consiste en un remplissage des extrémités 5' protubérantes à l'aide du grand fragment de l'ADN polymérase I d'E. coli (Klenow). Par ailleurs, les f agments de génome adénoviral employés dans les différentes constructions décrites ci-après, sont indiqués précisément selon leur position dans la séquence nucléotidique du génome de l'Ad5 et de BAV3 telle que divulguée dans la banque de données Genebank sous la référence M73260 et AFO30154 respectivement.
En ce qui concerne la biologie cellulaire, les cellules sont transfectées ou transduites et cultivées selon les techniques standards bien connues de l'homme du métier. Dans les exemples qui suivent, on a recours aux lignées cellulaires 293 (Graham et al, 1977, supra ; disponible à l'ATCC sous la référence CRL1573) et MDBK (ATCC CRL-6071 ou CCL-22). H est entendu que d'autres lignées cellulaires peuvent être utilisées.
EXEMPLE 1 : Absence de multiplication des virus BAV3 dans les lignées humaines
La lignée humaine MDBK et les lignées humaines A549 (ATCC CCL-
185), HeLa (ATCC CCL-2) et 293 (ATCC CRL-1573) sont infectées par un virus sauvage BAV3 à différentes MOI (1, 2 et 10). Les cellules sont récoltées 3 jours après l'infection et les titres viraux déterminés sur les cellules permissives MDBK. Le facteur de multiplication est inférieur à 1 dans le cas de l'infection des cellules humaines alors qu'il est compris entre 50 et 100 pour la lignée bovine. Ces résultats indiquent l'incapacité du vecteur BAV3 à se propager dans les lignées humaines. L'expression des gènes viraux de BAV3 est vérifiée par PCR réverse après infection du virus BAV3 dans des lignées humaines établies (A549, HeLa, 293, MRC5, RPMI) ou primaires (lignée primaire de muscle PHM). La lignée contrôle est constituée par la lignée MDBK. Les cellules sont recueillies et on isole les ARN polyA+ selon les techniques conventionnelles. La transcription réverse est réalisée avec une amorce antisens spécifique de la région El et suivie d'une amplification par PCR avec la même amorce et une amorce sens spécifique de El. Les produits PCR sont soumis à une analyse par Southern blot et détectés par une sonde spécifique de El permettant de détecter une bande de 626 pb correpondant à l'ADN genomique et de 519 pb dérivé de l'ARNm polyA-f . Dans les cellules MDBK, on observe une expression du gène viral El qui est maximale 16 heures après l'infection. El est également exprimée dans la lignée 293. Par contre aucune expression d'ARNm El ne peut être détectée dans toutes les autres lignées humaines testées.
Ces résultats montrent que les cellules humaines sont infectées par le virus
BAV3 mais que celui-ci ne peut pas s'y répliquer.
EXEMPLE 2 : Construction de vecteurs adénoviraux chimères Ad5/BAV3
On construit tout d'abord un vecteur comprenant une cassette d'expression du gène bactérien LacZ codant pour la β-galactosidase. Pour ce faire, le fragment Xhol-Sall de pTG8595 (Lusky et al., 1998, J. Virol. 72, 2022-2033) portant les séquences codantes LacZ est clone dans le site Xhol du plasmide pCI (Promega). Ce dernier est un vecteur d'expression eucaryote comprenant le promoteur CMV, des séquences d'épissage, des sites multiples de clonage et la séquence polyA de SV40. La cassette d'expression du gène LacZ flanqué des éléments de régulation précités est isolée sous forme d'un fragment Bglïï-BamHI et introduit dans le site BglII du vecteur de transfert pTG8343, pour donner pTG6452. A titre indicatif, le vecteur de transfert comporte l'extrémité 5' de FAd5 délété de la majorité des séquences El (nt 1 à 458 et 3329 à 5788) insérée dans un plasmide ppolyll (Lathe et al., 1987, Gène 57, 193-201). Le génome adénoviral est reconstitué par recombinaison homologue entre le fragment Pacl-Nsil obtenu de pTG6452 et le vecteur pTG3652 portant le génome Ad5 délété de la région E3 clivé par l'enzyme Clal. Le vecteur ainsi obtenu, nommé pTG6481, contient les séquences Ad5 dépourvues des régions El (nt 459 à 3328) et E3 (nt 28249 à 30758) et la cassette pCMV-LacZ-pA SV40 clonée en lieu et place de la région El. La région d'encapsidation est d'origine Ad5.
L'étape suivante est d'insérer la région d'encapsidation de BAV3 dans le vecteur précédent. Deux sites d'insertion ont été testés : le premier en amont de la région d'encapsidation native, au niveau du site Aflïïl en position 151 du génome Ad5 et l'autre en aval de celle-ci au niveau du site Sali (en position 451 de l'Ad5). La première construction pTG6466 est générée par digestion Aflïïl de pTG6452, traitement à la Klenow et introduction du fragment Haeïï-Pvuïï de 844 pb recouvrant les séquences en positions 141 à 984 du génome BAV3, ce fragment ayant été soumis au préalable à l'action de la Klenow. Le vecteur pTG6467 est généré selon le même protocole mis à part que pTG6452 est linéarisé par Sali. Ainsi les vecteurs pTG6466 et ρTG6467 contiennent deux régions d'encapsidation, l'une d'origine Ad5 et l'autre d'origine BAV3 (environ 0,8 kb).
On a également mis en oeuvre une région d'encapsidation BAV3 réduite issue de la précédente par digestion Thaï ou BstuI (positions 185 à 514 du génome BAV3). Comme précédemment, la région BAV3 d'environ 0,3 kb est insérée dans les vecteurs recombinants Ad5 soit au niveau du site Aflïïl (en 5' de la région psi autologue) en au niveau du site Sali (en 3' de la région psi autologue). Dans ce dernier cas, on génère le vecteur de transfert pTG6458 et le génome adénoviral est reconstitué par recombinaison homologue comme précédemment pour donner pTG6482.
Puis on génère une construction dans laquelle la région d'encapsidation d'Ad5 est échangée contre son homologue BAV3. Le vecteur pTG6452 est digéré par Aflïïl (nt 151) et Sali (nt 451) puis traité à la polymérase Klenow. Le fragment de 300 pb portant la région d'encapsidation Ad5 est remplacé par le fragment Haeïï- Pvuïï (844 pb) isolé de BAV3 et rendu franc par l'action de la Klenow. On obtient pTG6468 qui porte la seule région d'encapsidation de BAV3 dans un contexte Ad5. Une construction identique met en oeuvre la région d'encapsidation BAV3 de 0,3 kb.
Les régions modifiées sont réintroduites dans le génome adénoviral par recombinaison homologue comme indiqué précédemment.
De manière identique, un vecteur adénoviral auxiliaire dérivé du génome de l'Ad 5 comportant la région d'encapsidation et les ITR 5' et 3' de BAV3 a été construit. Pour cela, le vecteur pTG13373 qui est dérivé du génome d'Ad5 délété des régions El et E3 est construit, comportant l'ITR 5' et la région d'encapsidation de
0,3 kb du génome de BAV3.
Le vecteur pTG 13373 est obtenu par le remplacement de l'ITR 5' et de la région d'encapsidation d'Ad5 présents dans pTG 8343, par l'ITR 5' et la région d'encapsidation de BAV 3 présents dans pTG 5431 ; à titre indicatif, pTG 5431 est constitué de l'extrémité 5' (nucleotides 1 à 8217) du génome de BAV 3. Pour ce faire, pTG 8343 est digéré par Bgl ÏÏ, soumis à l'action de la Klenow, puis digéré par Pac I, et pTG 5431 est digéré par Ace I, traité à la Klenow, et digéré par Pac I. Les fragments ainsi obtenus sont liés pour donner pTG 13372. Finalement, pTG 13373 est obtenu par recombinaison homologue entre les fragments obtenus de pTG 13372 digéré par Bgl I et de pTG 6401 digéré par Pac I.
Le vecteur pTG 14310 dérivé du génome de PAd5 délété des régions El et E3 et comprenant les ITR 5' et 3' ainsi que la région d'encapsidation de BAV 3 est ensuite obtenu de la manière suivante.
On procède au remplacement de l'ITR 3' d'Ad5 dans le vecteur pTG 13384 (constitué par l'extrémité 3' (nucleotides 32800 à 35935) du génome de l'Ad 5 ; une cassette de clonage étant insérée entre les nucleotides 35826 et 35827) par l'ITR 3' de BAV 3. Pour ce faire, pTG 13384 est digéré par Xba I, soumis à l'action de la Klenow, puis digéré par Pac I. D'autre part, pTG 5451 est digéré par Apo I, traité à la Klenow, et digéré par Pac I. A titre indicatif, le vecteur pTG 5451 comprend les extrémités 5' (nucleotides 1 à 1651 délétés du fragment 829-1077) et 3' de BAV 3 (nucleotides 33232 à 34446) séparées par un site de restriction unique Hind m. Les fragments ainsi obtenus sont liés pour donner pTG 14261.
Par ailleurs, la recircularisation de pTG 14261 après digestion par Xbal et Bam HI et action de la Klenow permet l'élimination du site de clivage Hind lïï en amont de l'ITR bovin de pTG 14261. On obtient ainsi le vecteur pTG 14262.
Parallèlement, on procède à la recirculrisation de pTG 13373 digéré par Hind ÏÏI pour obtenir pTG 14263 qui contient l'ITR 5' et la séquence d'encapsidation de 0,3 kb de BAV 3 ainsi que l'ITR 3' de l'Ad5.
On procède ensuite au remplacement de l'ITR 3' de l'Ad5 dans le vecteur pTG 14263 par l'ITR 3' de BAV 3 de pTG 14262. Pour ce faire, pTG 14263 et pTG 14262 sont digérés par Hind III et Pac I. Les fragments ainsi obtenus sont liés pour donner pTG 14266.
Enfin, le génome adénoviral est reconstitué par recombinaison homologue entre pTG 14266 linéarisé par Hind Lïï et pTG 13373 digéré par Pac I. Le vecteur obtenu nommé pTG 14310 dérive du génome d'Ad 5 délété des régions El et E3 et contient les ITR 5' et 3' ainsi que la région d'encapsidation de BAV 3.
Un génome adénoviral similaire à celui de pTG 14310 mais comportant une région d'encapsidation de BAV3 de 0,8 kb a également été obtenu. On a pour cela procédé au remplacement de l'ITR 5' et de la région d'encapsidation d'Ad5 présents dans pTG 8343 par l'ITR 5' et la région d'encapsidation de 0,8 kb de BAV 3 présents dans pTG 5431. Pour ce faire, pTG 8343 est digéré par Bgl II, soumis à l'action de la Klenow, puis digéré par Pac I. D'autre part, pTG 5431 est digéré par Pvu ïï et Pac I. Les fragments ainsi obtenus sont liés pour donner pTG 14313.
On procède ensuite au remplacement de l'ITR 5' et de la région d'encapsidation de 0,3 kb de BAV 3 présents dans pTG 14266 par l'ITR 5' et la région d'encapsidation de 0,8 kb de BAV 3 présents dans pTG 14313. Pour ce faire, on procède à un recombinaison homologue entre les fragments Ssp I / Mfe I obtenu de pTG 14266 et Sca I / Nsi I obtenu de pTG 14313. Le vecteur ainsi obtenu est nommé pTG 14315.
Finalement le génome adénoviral est reconstitué par recombinaison homologue entre les fragments Hind ÏÏI obtenu de pTG 14315 et Pac I obtenu de pTG 6401. Le vecteur ainsi obtenu, nommé pTG 14316, dérive du génome de l'Ad 5 et comporte les ITR 5' et 3' ainsi que la région d'encapsidation de 0,8 kb de BAV 3.
Un exemple supplémentaire de vecteur selon l'invention consiste en un vecteur dérivé du génome de PAd5 délété des régions El et E3 et contenant les ITR 5' et 3' ainsi que la région d'encapsidation de 0,3 kb de BAV 3, dans lequel la région d'encapsidation a été insérée juste en amont de l'ITR 3'.
Pour construire un tel vecteur, on procède tout d'abord à la délétion de la région d'encapsidation de BAV 3 dans pTG 13372 et dans pTG 14266. Pour cela, pTG 13372 est digéré par Afl ÏÏI, soumis à l'action de la Klenow, puis digéré par Pac
I et pTG 14262 est digéré par Pvu ïï et Pac I. Les fragments ainsi obtenus sont liés pour donner pTG 14311.
La délétion de la région d'encapsidation bovine de pTG 14266 est obtenue par recombinaison homologue entre le fragment Xmn I / Dra III obtenu de pTG 14266 et le fragment Pvu I / Sph I obtenu de pTG 14311. On obtient alors le vecteur pTG 14328. On procède ensuite au remplacement de l'ITR 3' d'Ad5 dans pTG 13384 par l'ITR 3' et la séquence d'encapsidation de 0,3 kb de BAV 3 présents sur pTG 5431.
Pour cela, pTG 13384 est digéré par Bam HI, soumis à l'action de la Klenow, puis digéré par Pac I. D'autre part, pTG 5431 est digéré par Afl III, traité à la Klenow, et digéré par Pac I. Les fragments ainsi obtenus sont liés pour donner pTG 14271.
L'introduction de la séquence d'encapsidation BAV 3 juste en amont de l'ITR 3' est réalisée par ligature des fragments Eco RI / Hind ÏÏI obtenus de pTG14328 et de pTG 14271. Le vecteur ainsi obtenu est nommé pTG 14330.
Le génome adénoviral est ensuite reconstitué par recombinaison homologue entre les fragments Hind ÏÏI de pTG 14330 et Pac I de pTG 6401. On obtient alors le vecteur pTG prod 11 qui dérive du génome de l'Ad5 délété des régions El et E3 et contient les ITR 5' et 3' ainsi que la région d'encapsidation de 0,3 kb de BAV 3 insérée juste en amont de l'ITR 3'.
EXEMPLE 3 : Production de particules virales.
Les génomes viraux pTG6468 (auxiliaire) et pTG6467 ou pTG6466
(recombinant) sont transfectés dans les cellules bovines de la lignée MBDK. Puis, les cellules transfectées sont infectées par un génome BAV3 sauvage ou atténué. Puisque l'Ad5 peut se propager dans les cellules bovines en présence d'un virus BAV3 et que les trois éléments viraux contiennent une région d'encapsidation de BAV3, ils peuvent être empaquetés dans les capsides virales et générer des particules virales infectieuses. Le mélange est récupéré et on procède éventuellement à une étape d'amplification par cycles d'infection successifs de cellules MBDK afin de constituer un stock viral des trois types de virus. Lors de cette première étape sur cellules bovines, le génome BAV3 produit les facteurs agissant en trans pour l'encapsidation du vecteur auxiliaire lequel fournit les fonctions virales nécessaires à la propagation du vecteur recombinant. L'encapsidation de ce dernier peut être médiée par des facteurs adénoviraux d'origine BAV3 et Ad5 dans la mesure où il possède les régions d'encapsidation des deux origines et les capsides peuvent contenir des protéines structurales BAV3 ou Ad5.
Le mélange viral généré dans la lignée bovine est utilisé pour infecter des cellules humaines 293. Dans ces cellules, le virus BAV3 ne peut se propager même en présence d'Ad5. Cependant le vecteur auxiliaire d'origine Ad5 peut répliquer son génome viral et exprimer l'ensemble des gènes viraux précoces et tardifs qu'il porte. Par contre, il ne peut être encapsidé du fait qu'il est muni d'une seule région d'encapsidation BAV3. Au contraire, le vecteur recombinant peut l'être par l'intermédiaire de la région d'encapsidation d'origine Ad5 et des facteurs d'encapsidation fournis par le vecteur auxiliaire. Les particules virales générées sont récupérées et peuvent être utilisées à des fins thérapeutiques.

Claims

REVENDICATIONS
1- Vecteur adénoviral dérivant d'un génome adénoviral caractérisé en ce qu'il comprend une région essentielle à l'encapsidation hétérologue par rapport audit génome adénoviral.
2. Vecteur adénoviral selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il dérive d'un adénovirus d'origine humaine et que ladite région essentielle à l'encapsidation hétérologue dérive d'un adénovirus d'origine animale.
3. Vecteur adénoviral selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il dérive d'un adénovirus humain du sous groupe C et notamment d'un adénovirus 2 (Ad2) ou 5 (Ad5).
4. Vecteur adénoviral selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ladite région essentielle à l'encapsidation hétérologue dérive d'un .adénovirus animal sélectionné parmi les adénovirus canins, aviaires, bovins, murins, ovins, porcins et simiens.
5. Vecteur adénoviral selon la revendication 3 ou 4, caractérisé en ce qu'il dérive d'un Ad5 et que ladite région essentielle à l'encapsidation hétérologue dérive d'un adénovirus bovin.
6. Vecteur adénoviral selon la revendication 5, caractérisé en ce que ledit adénovirus bovin est BAV3.
7. Vecteur adénoviral selon l'un des revendication 1 à 6, caractérisé en ce que ladite région essentielle à l'encapsidation comprend la région d'encapsidation.
8. Vecteur adénoviral selon la revendication 7, caractérisé en ce que ladite région essentielle à l'encapsidation comprend en outre les ITR 5' et 3'.
9. Vecteur adénoviral selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il est défectif au moins pour la fonction El.
10. Vecteur adénoviral selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il est en outre défectif pour l'une au moins des fonctions sélectionnées parmi les fonctions E2, E3,
E4 et Ll-L5.
11. Vecteur adénoviral selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur auxiliaire permettant de complémenter tout ou partie des fonctions défectives d'un vecteur adénoviral recombinant.
12. Vecteur adénoviral auxiliaire selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il comprend les séquences ITR 5' et 3' et les séquences codant pour les fonctions E2, E4 et ou L1-L5 dérivant d'un adénovirus humain, et une région d' encapsidation hétérologue dérivant d'un adénovirus bovin.
13Necteur adénoviral auxiliaire selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il comprend les séquences codant pour les fonctions E2, E4 et/ou L1-L5 dérivant d'un adénovirus humain, et les séquences ITR 5' et 3' et la région d' encapsidation hétérolo -Ogu"e dérivant d'un adénovirus bovin.
14 . Vecteur adénoviral selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu'il est recombinant et comprend au moins un gène d'intérêt placé sous le contrôle des o éléments nécessaires à son expression dans une cellule ou un organisme hôte.
15. Vecteur adénoviral recombinant selon la revendication 14, caractérisé en ce que ledit gène d'intérêt est sélectionné parmi les gènes codant pour un ARΝ antisens, une cytokine, un récepteur cellulaire ou nucléaire, un ligand, un facteur de coagulation, la protéine CFTR, l'insuline, la dystrophine, un facteur de croissance, une enzyme, un inhibiteur d'enzyme, un polypeptide à effet anti-tumoral, un polypeptide capable d'inhiber une infection bactérienne, parasitaire ou virale et, notamment le VTH, un anticorps, une toxine, une immunotoxine, un inhibiteur d'angiogénèse et un marqueur.
5 16. Vecteur adénoviral recombinant selon la revendication 14 ou 15, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une seconde région d'encapsidation autologue par rapport au génome adénoviral dont il dérive.
17. Vecteur adénoviral recombinant selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'il est défectif pour l'ensemble des fonctions adénovirales et comprend outre ledit gène i o d'intérêt, au moins les ITRs 5' et 3' et ladite région d'encapsidation autologue dérivant d'un adénovirus humain, et ladite région d'encapsidation hétérologue dérivant d'un adénovirus bovin.
18. Vecteur adénoviral recombinant selon la revendication 16 ou 17, caractérisé en ce que la région d'encapsidation hétérologue est insérée en 3' de la région
15 d'encapsidation autologue.
19. Utilisation d'un vecteur adénoviral auxiliaire selon l'une des revendications 11 à 13 pour complémenter tout ou partie des fonctions défectives d'un vecteur adénoviral recombinant défectif pour la replication, lesdits vecteurs auxiliaire et recombinant dérivant d'un même premier adénovirus et, en particulier d'un Ad5 et lesdites régions
20 essentielles à l'encapsidation hétérologues portées par le vecteur auxiliaire dérivant d'un second adénovirus différent du premier et, en particulier d'un BAV3.
20. Utilisation selon la revendication 19 caractérisée en ce que le vecteur adénoviral recombinant défectif pour la replication est un vecteur selon l'une des revendications 1 à 10 et 14 à 18, lesdits vecteurs auxiliaire et recombinant dérivant d'un même
25 premier adénovirus et lesdites régions essentielles à l'encapsidation hétérologues portées par le vecteur auxiliaire et ledit vecteur recombinant dérivant d'un second adénovirus différent du premier .
21 . Composition comprenant :
(a) un vecteur adénoviral auxiliaire selon l'une des revendications 1 1 à 13,
(b) un vecteur adénoviral recombinant défectif pour la replication , et
(c) de manière optionnelle un génome adénoviral dérivant d'un adénovirus animal de la même origine que les régions essentielles à l'encapsidation hétérologues portées par le vecteur a).
22. Composition selon la revendication 21 caractérisée en ce que ledit vecteur recombinant adénoviral défectif pour la replication (b) est un vecteur adénoviral recombinant selon l'une des revendications 1 à 10 et 14 à 18 et en ce que l'on a en (c) de manière optionnelle, un génome adénoviral dérivant d'un adénovirus animal de la même origine que les régions essentielles à l'encapsidation hétérologues portées par les vecteurs a) et b).
23. Génome adénoviral dérivant d'un adénovirus animal, notamment d'un adénovirus bovin et en particulier d'un BAV3, caractérisé en ce qu'il présente une capacité d'encapsidation atténuée par rapport à l'adénovirus dont il dérive.
24. Procédé pour préparer une préparation virale comprenant un vecteur adénoviral recombinant défectif pour la replication, selon lequel :
o (a) on introduit dans une première lignée cellulaire
(i) un vecteur adénoviral auxiliaire selon l'une des revendications 11 à 13,
(ii) un génome adénoviral dérivant d'un adénovirus animal, et (iii) ledit vecteur adénoviral recombinant,
ledit génome adénoviral (ii) étant de la même origine que les régions essentielles à l'encapsidation hétérologues portées par le vecteur (i) et ledit génome adénoviral (ii) et les vecteurs (i) et (iii) étant capables de se répliquer dans ladite première lignée cellulaire,
(b) on cultive ladite première lignée cellulaire dans des conditions appropriées pour permettre la production de particules virales comportant les vecteurs (i) et (iii) et le génome adénoviral (ii),
(c) on récupère lesdites particules virales obtenues à l'étape b) dans la culture cellulaire,
(d) on infecte une seconde lignée cellulaire avec lesdites particules virales récupérées à l'étape c), ledit vecteur auxiliaire (i) et ledit génome adénoviral (ii) ayant une capacité d'encapsidation et/ou de replication nulle ou réduite dans ladite seconde lignée cellulaire,
(e) on cultive ladite seconde lignée cellulaire dans des conditions appropriées pour permettre l'encapsidation dudit vecteur adénoviral recombinant (iii) et produire ladite préparation virale, et
(f) on récupère ladite préparation virale obtenue à l'étape e) dans la culture cellulaire.
25. Procédé selon la revendication 24 caractérisé en ce que ledit vecteur adénoviral recombinant défectif pour la replication est un vecteur selon l'une des revendications 1 à 10 et 14 à 18 et en ce que ledit génome adénoviral (ii) est de la même origine que les régions essentielles à l'encapsidation hétérologues portées par les vecteurs (i) et (iii) et ledit génome adénoviral (ii), et les vecteurs (i) et (iii) sont capables de se répliquer dans ladite première lignée cellulaire.
26. Procédé selon la revendication 25, selon lequel on introduit dans ladite première lignée cellulaire :
(i) un vecteur adénoviral auxiliaire selon l'une des revendications 11-13 défectif au moins pour la fonction E 1 ,
(ii) un génome adénoviral dérivant d'un adénovirus bovin, notamment d'un BAV3, éventuellement selon la revendication 23, et
(iii) un vecteur adénoviral recombinant défectif pour la fonction El et au moins l'une des fonctions E2, E4 et/ou L1-L5, notamment un vecteur selon l'une des revendications 14 à 18,
ladite première lignée cellulaire étant d'origine bovine.
27. Procédé selon l'une des revendications 24 à 26, selon lequel ledit génome adénoviral (ii) est défectif pour la fonction El et ladite première lignée cellulaire est une cellule de complémentation de la fonction El dudit génome adénoviral (ii).
28. Procédé selon la revendication 27, selon lequel ladite première lignée cellulaire dérive d'une lignée MDBK ou de cellules primaires bovines de rétine ou de rein foetal et comprend les séquences codant pour la région El d'un adénovirus bovin et en particulier d'un BAV3 placées sous le contrôle des éléments nécessaires à leur expression.
29. Procédé selon l'une des revendications 24 à 28, selon lequel ladite seconde lignée cellulaire est une cellule de complémentation de la fonction El d'un adénovirus humain, notamment d'un Ad5.
30. Procédé selon la revendication 29, selon lequel ladite seconde lignée cellulaire est la lignée 293.
31. Préparation virale obtenue selon le procédé selon l'une des revendications 24 à 30.
32. Préparation virale selon la revendication 31, comprenant au moins 30 % de particules virales infectieuses contenant un vecteur adénoviral recombinant selon l'une des revendications 1 à 10 et 14 à 18.
33. Cellule hôte comprenant un vecteur adénoviral selon l'une des revendications 1 à 18 ou infectée par une préparation virale selon la revendication 31 ou 32.
34. Cellule comprenant :
(i) un vecteur adénoviral auxiliaire selon l'une des revendications 11 à 13, et
(ii) un génome adénoviral dérivant d'un adénovirus animal.
35 . Cellule selon la revendication 34 renfermant en outre (iii) un vecteur adénoviral recombinant défectif , et notamment un vecteur selon l'une des revendications 1 à 10 et 14 à 18,
36. Composition pharmaceutique comprenant à titre d'agent thérapeutique ou prophylactique un vecteur adénoviral selon l'une des revendications 1 à 10 et 14 à 18, une préparation virale selon la revendication 31 ou 32 ou une cellule hôte selon la revendication 33.
37. Utilisation d'un vecteur adénoviral selon l'une des revendications 1 à 10 et 14 à 18, d'une préparation virale selon la revendication 31 ou 32 ou d'une cellule hôte selon la revendication 33, pour le transfert et l'expression d'un gène d'intérêt dans une cellule ou un organisme hôte.
38. Utilisation d'un vecteur adénoviral selon l'une des revendications revendications 1 à 10 et 14 à 18, d'une préparation virale selon la revendication 31 ou 32 ou d'une cellule hôte selon la revendication 33, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des maladies par thérapie génique ou immunothérapie.
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