WO1999052940A1 - Extraction, identification, utilisation, des principes actifs des coquilles des mollusques marins - Google Patents

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WO1999052940A1
WO1999052940A1 PCT/FR1999/000866 FR9900866W WO9952940A1 WO 1999052940 A1 WO1999052940 A1 WO 1999052940A1 FR 9900866 W FR9900866 W FR 9900866W WO 9952940 A1 WO9952940 A1 WO 9952940A1
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Serge Camprasse
Georges Camprasse
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Serge Camprasse
Georges Camprasse
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a method of extraction by cold hydrolysis, of separation and of identification, of the protein and non-protein active ingredients present in the inner and outer shell of gastropod marine molluscs, such as the Nautile, the Conch and molluscs.
  • bivalves such as Tridacnes Beurtiers, Pinctadines such as Pinctada Maxima, Pinctada Martensi and their use in preparations used in the composition of medicinal substances, diagnostic media and cosmetic formulations.
  • the shell of molluscs is composed of two ultra-structural types which are polymorphs of calcium carbonate CaCo 3 . These two polymorphs are calcite and aragonite. Calcite constitutes the external part of the shell and is composed of crystals which crystallize in the rhombohedral crystalline system, while aragonite still called mother-of-pearl, constitutes the median and internal part whose crystals crystallize in the orthorhombic crystalline system. The biocrystals of the internal and external parts are surrounded by sheets and partitions of organic matter.
  • the extraction method according to the invention was applied separately to the shells of the Tridacne Beurtier and the Pinctada Maxima. 2
  • the shells of the Tridacne Beurtier and the Pinctada Maxima were cut separately, cut in order to obtain pieces 5 cm long and 3 cm wide.
  • the operating method of the extraction method according to the invention consists in placing in a container made of inert plastic material, with a capacity of 1100 liters, 300 l of water (i.e. 58%) pyrogen-free, 80 kg of ice (13 %) coarsely ground, obtained from the same water, 1501 acetic acid (29%) at 80%, the mixture is constantly stirred by a commercial agitator of sufficient power for 50 to 1000 liters.
  • a pH meter constantly monitors the pH of the solution, which must always be below 4.5, a commercial thermometer monitors the temperature, which must remain below 5 ° C and more often around 0 ° C.
  • a device composed of a closed circuit of plastic pipes in which circulates at low speed, polyethylene glycol, serving as a refrigerant for the preparation is placed inside the container of 11001.
  • the pH of the solution is brought to pH 7 by adding 2.5 N sodium hydroxide, the whole being constantly stirred by an agitator for 1 hour, then centrifuged at 18,000 G.
  • the pellet thus obtained is taken up in 65 liters of pyrogen-free water with constant stirring and then centrifuged again.
  • a final pellet of wet organic material is obtained which is dried by cold lyophilization.
  • the product according to the process is in the form of coarse powder of dark gray color of a weight (of 1.8 kg for the Pinctada, and 2.3 kg for the Tridacne Beurtier) which is finely ground in mortar in order to obtain a granulometry powder varying between 0.5 and 2 microns.
  • the organic matter thus obtained contains the insoluble organic constituents contained in the shell of Tridacne, Beurtier or Pinctada Maxima,
  • a series of 6 dilutions is then carried out, ultra filtration, each time with 50 liters of pyrogen-free water.
  • the pH is brought to pH 7 with 2.5N sodium hydroxide.
  • about 20 l of solution are obtained which is concentrated to 5 l on a Rotavapor under vacuum at less than 40 ° C.
  • the solution is then lyophilized, the extract is then ground in a mortar until a particle size between 0.2 and 0.5 microns is obtained. This gives a powder ranging from white to greyish white, representing the soluble fraction of the protein constituents of the shell of Tridacne Beurtier (328g) or Pinctada Maxima (100g).
  • the presence or absence of proteins is checked in the supernatants by taking an aliquot of solution which is treated by the colorimetric method of Biuret (blue coloring in the presence of proteins, appearing rapidly and remaining stable for more than 2 hours).
  • the intensity of this coloring varies linearly with the protein concentration.
  • the absence of coloring means that all the proteins have been extracted.
  • the supernatants are also treated by the Lowry method, which is more sensitive but longer.
  • One variant of this method consists in first quantitatively precipitating the proteins by mixing with trichloroacetic or sodium deoxycholate before coloring. The absence of coloration shows that all of the proteins have been extracted.
  • the two organic fractions thus collected are placed in sterile containers and sterilized by 2.5 mega rad gamma radiation and stored at a temperature of 3 ° C.
  • Cold hydrolysis, centrifugation and Pulfracentrifugation on cassettes in series according to the process according to the invention enabled us to extract the insoluble and soluble organic constituents from the shell of the bivalves studied.
  • the various organic components will be characterized qualitatively and quantitatively by the usual analytical methods which will be used either separately or in combination.
  • Another separation method used is high pressure chromatography (more than 30 Bars) which uses the reverse phase chromatography method suitable for the separation of low molecular weight molecules, and also for that of proteins which are macromolecules.
  • This type of high pressure chromatography also uses ion exchange columns for the separation of amino acids.
  • Electrophoresis which also allows the separation of proteins, is associated with chromatography. The revelation of the presence of proteins is carried out thanks to dyes (black a ide, Ponceau red), there are also more specific dyes like the reagent of Schiff which reveal the carbohydrate fractions of proteins.
  • Zone electrophoresis on polyacrylamide gel which allows separation according to charge and molecular weight
  • SDS sodium dodecylsulfate
  • HC1 acid hydrolysis
  • the qualitative and quantitative demonstration of tryptophan is obtained by enzymatic hydrolysis by crude trypsin of 100 g of internal and external shell powder of Pinctada Maxima and Tridacne Beurtier, whose particle size is 1 micron.
  • the hydrolyzate thus obtained is then treated with glyoxylic acid in a sulfuric medium, the violet coloration (Adamkiewicz reaction), characterizes the presence of tryptophan, also confirmed by the EHRLICH reaction (blue coloration in the presence of p-dimethylaminobenzaldehyde in an acid medium).
  • ⁇ H 2 can be attached to alpha gamma diaminobutyric acid which is a constituent of certain peptide antibiotics of general formula
  • glycoproteins While it is easy to identify amino acids and proteins using the methods listed above, it is more difficult to identify the presence of glycoproteins.
  • Glycoproteins are heteroproteins resulting from the union of a protein fraction with one or more carbohydrate sequences, they are heat stable, soluble in saline solutions near neutrality. These are very high molecular weight macromolecules. The carbohydrate content of these macromolecules varies widely from 1% to over 40%.
  • Maillard clearly indicates the presence of the glycoproteins contained in the internal and external shells of molluscs, such as Tridacne Beurtier and Pinctada Maxima.
  • This reaction consists in heating very strongly in an anhydrous medium, 100 g of constituents extracted by the method according to the invention: the oses present in the proteins react with the amino functions of the soluble proteins (-NH 2 of lysine, which enters their composition). A very dark brown residue is formed, the result of the condensation of the sugar or sugars contained in the glycoprotein and the amino functions of the proteins with an Amadori-type rearrangement, leading to decarboxylated products and a polymerization into brown compounds.
  • GAG glycosaminoglycans
  • Hyaluronic acid is believed to play a role in the resistance of tissues to compressive forces. Its presence in the composition of the external and internal shells of the molluscs studied by the method according to the invention, explains the value of the modulus of elasticity in compression (90
  • Hyaluronic acid is usually produced in large quantities during healing and is used as a lubricant in the joints. Its presence could be demonstrated experimentally during the perforation of the shell of the molluscs studied such as the Tridacne Beurtier and the Pinctada Maxima: during the process of repairing the loss of substance, we note the appearance of very early scar tissue with a high organic component, the analytical study of which has shown, in addition to the presence of scleroproteins or fibrous proteins, of sulfated glycosaminoglycans and of hyaluronic acid.
  • glycosaminoglycans which bind to proteins to form proteoglycans.
  • Proteoglycans are distinguished from other proteins by their nature, the quantity and the arrangement of their lateral carbohydrate chain.
  • Proteoglycans are huge plurimolecular structures whose protein nuclei range from 10,000 to over 600,000 Daltons.
  • Proteoglycans are in fact very highly glycosylated glycoproteins, their identification and classification is very difficult to demonstrate.
  • phytohemagglutinins which bind to the specific carbohydrates carried by the protein molecules forming a bulky molecule easily visible under the electron microscope.
  • Proteoglycans are believed to play an important role in intercellular chemical signaling, they are able to bind in vivo and in vitro to informative molecules, such as protein growth factors; they can control the activity of other types of secreted proteins such as enzymes, they can also associate with collagen.
  • Proteoglycans are part of the soluble fraction of the organic components of the inner and outer shells of Tridacne Beurtier and Pinctada Maxima. Demonstration of monomeric glycosilated proteins with an atomic weight of around 40,000 Daltons, which are cytokines, has been carried out experimentally. Their action could be observed during healing phenomena 10 secondary to tissue damage by burning, most of these are growth factors or promoters, the role of which is to stimulate, potentiate, repair, induce or inhibit certain chemical and biological processes.
  • Daltons from the melanin family which are derived from tyrosine by oxidation and which give the insoluble fraction of organic constituents a color ranging from brown to black.
  • Certain metal atoms constitute trace elements, others are associated with proteins to form non-enzymatic metalloproteins or the metal acts as a form of transport or reserve, it is the case of iron, copper which is associated with a protein, to form a metalloprotein serving as a respiratory pigment in the mollusk, this is the case of zinc, which can also be taken as a trace element or associated with a protein to also form a metalloprotein, which is recognized as having a regulatory function in gene expression.
  • the calcium which is the mineral element of the shell, can also form a calciprotein, whose role is to regulate the enzymatic activity.
  • the metallic elements are also associated with an enzymatic protein to form metalloenzymes, such as manganese, iron and zinc. These metalloenzymes are involved in the destruction mechanism of superoxides (O 2 -) Besides, the metals and minerals which exist in the free state or which can be associated with proteins or enzymes are those with the highest concentration.
  • Chromatographic methods associated with fluorescence studies have also revealed pigments other than melaninic compounds, which are chromoproteins, as well as porphyrinic chromoproteins containing pigments. 11 respiratory and non-respiratory, as non-porphyrinic chromoproteins containing the same pigments. These chromoproteins can be linked to the metalloproteins already characterized. This is how we have highlighted, in addition to porphyrins, metalloporphyrins and carotenoids, the colors of which are found in the mother-of-pearl and in the pearly test.
  • porphyrins The main chemical property of porphyrins is their ability to combine with metals, especially those of the iron family (iron, chromium, manganese, nickel, cobalt), copper, zinc to give rise to non-ionizable complexes, which are metalloporphyrins, the properties of which are similar to those of metalloenzymes and nonenzymatic metalloproteins.
  • the epidermis which is the thin, flexible outer layer, consisting essentially of keratinocytes (97%), but also of melanocytes and Langherans cells (responsible for the rejection of grafts). These cells are made up of layers which protect the skin from light, by the melanin secreted by the melanocytes and against traumatic attacks by the layer of keratin secreted by the keratinocytes.
  • the underlying dermis consisting of a network of collagen, elastin and reticulin fibers, fibronectin, glycosaminoglycans and intercellular cement. It is the fibroblasts which synthesize the structural proteins which compose it.
  • the dermis is innervated and vascularized by nerve tears and vessels from the hypodermis.
  • the hypodermis underlying the dermis is a cellulo-fatty layer.
  • cytokines TNF. Tissue necrosis and cell death in the burned tissue cause a number of depressant immunity factors to be released into the blood.
  • JACQUES et al. and FJELLSTROM et al. have shown that the fibronectin level is very low in burn victims. Almost all the figured elements of the blood are affected (polynuclear, lymphocytes, etc.) all the proteins of inflammation are increased. The disappearance or decrease of local immune factors promotes infection. The treatment of these metabolic disturbances has so far been general. On the burned areas, an occlusive dressing is applied which is intended to prevent evaporation of the exudate and plasma leakage.
  • the preparation for therapeutic purposes obtained according to the process aims to locally treat protein loss at the level of burns by providing in situ essential amino acids of proteins, proteoglycans, glycoproteins, glycosaminoglycans, sugars, profectors growth, trace elements and melanin, extracted from the inner and outer shell of the mollusk.
  • the application of the preparation to a deep thermal lesion not only achieves skin recovery, pain sedation by inhibiting the production of in_jfo ⁇ mation products (bradykinin, serotonin, histamine etc.) which sensitize the skin receptor receptors, but promote also the regression of hypermetabolism. It stimulates factors 14 local cellular and tissue immunity whose action inhibits microbial proliferation and hence infection.
  • Another embodiment consists of an artificial biological membrane, the composition of which is as follows: on a polyglactin lattice support with a thickness of 0.5 mm and a dimension of 20 mm by 20 mm is spread over a thickness of 0 , 5 mm, the following preparation:
  • the biological membrane is sterilized with Gamma radiation and kept cold at 4 ° C in double sterile packaging.
  • the products obtained according to the process can enter into the preparation of a preparation for food supplements according to a formula which is as follows:
  • the products obtained according to the process can also be used in the preparation composition for cosmetic purposes in the form of a gel or cream, the composition of which is as follows Dry extracts of soluble active principles
  • Such a formulation was used in powder form in human and veterinary orthopedic surgery in 10 cases, where bone regrowth was desired. It involved a fracture with a bone crash and loss of bone substance. 16
  • the above preparation was placed at the level of the losses of substance in the form of powder, mixed with autologous blood so as to obtain a paste of mastic consistency in 5 cases. In 5 other cases, it was placed in the form of preformed prosthetic elements, plates, pellets and rods. These elements of variable shapes and dimensions were obtained by molding the powder under vacuum, in a device, under a progressive pressure of 10 tonnes.
  • a cooling system by a closed ethylene glycol circuit keeping the temperature below 40 ° C, so as not to destroy the tertiary structure of proteins and other active ingredients contained in the preparation. Indeed, during compression the temperature rises steadily to exceed 100 ° C.
  • Postoperative radiographs showed in all cases an organization and a mineralization of the repair callus twice as fast as in the control animals.
  • Biopsies performed at 15 days at the operating site highlighted a proliferation of osteoblasts (bone-forming cells), the presence of numerous blood capillaries testifying to an active angiogenesis essential for repair phenomena, and an absence of 'osteoclasts (bone-destroying cells) that appear later to reshape the bone callus and harmonize its contours.
  • Such a formulation has been used in a loss of substance from the hoof of a horse (seime, anthill) with damage to the perioplic bead (which ensures regrowth of the horn) and exposure of the third phalanx.
  • the preparation according to the invention is mixed with demineralized water to which a hardener is added until a mortar is obtained which is inserted into the loss of substance. The lesion is gradually filled in with newly formed horn after 5 weeks.
  • the preparation according to the invention was used during a total loss of the hoof without affecting the perioplical bead.
  • the third phalanx was completely covered by the preparation according to the invention in an occlusive dressing fixed to the lower third of the ball.
  • the hoof restoration was obtained in 8 weeks while in most cases the animal must be euthanized.
  • Another formulation of the substances obtained according to the process consists of a culture medium.
  • most culture media contain mixtures of macromolecules such as horse serum or fetal calf serum, as well as a precise quantity of small molecules such as salts, glucose, amino acids and vitamins.
  • Such media are still used today for most routine cell cultures, but they make it difficult to accurately determine the specific macromolecules necessary for the maintenance and normal functioning of a given cell type.

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Abstract

L'invention concerne un procédé d'extraction, séparation, identification, des principes actifs: protéines, aminoacides, glycoprotéines, glycosaminoglycanes, et protéoglycanes, contenus dans la coquille interne et externe des mollusques marins, par hydrolyse à froid, par l'acide acétique, et l'utilisation de ces substances ainsi obtenues dans l'élaboration de préparations à usage thérapeutique dans le traitement des brûlures, des fractures, perte de substances en médecine et chirurgie vétérinaire et humaine, à la formulation de préparations cosmétiques, de milieux de cultures, de membranes biologiques artificielles, et de compléments alimentaires.

Description

EXTRACTION, IDENTIFICATION, UTILISATION, DES PRINCIPES ACTIFS DES COQUILLES DES MOLLUSQUES MARINS.
La présente invention concerne un procédé d'extraction par hydrolyse à froid, de séparation et d'identification, des principes actifs protéiques et non protéiques présents dans la coquille interne et externe des mollusques marins gastéropodes, tels que le Nautile, la Conque et des mollusques bivalves tels que les Tridacnes Bénitiers, les Pinctadines telles que Pinctada Maxima, Pinctada Martensi et leur utilisation dans des préparations entrant dans la composition de substances médicamenteuses, de milieux de diagnostics et de formulations cosmétiques.
On sait que la coquille des mollusques est composée de deux types ultra-structuraux qui sont des polymorphes du carbonate de calcium CaCo3. Ces deux polymorphes sont la calcite et l'aragonite. La calcite constitue la partie externe de la coquille et est composée de cristaux qui cristallisent dans le système cristallin rhomboédrique, tandis que l'aragonite encore appelée nacre, constitue la partie médiane et interne dont les cristaux cristallisent dans le système cristallin orthorhombique. Les biocristaux des parties internes et externes sont entourés de feuillets et de cloisons de matière organique. On a mis en évidence dans la matrice organique la présence de constituants protéiques et non protéiques, mais les méthodes d'investigations classiques ne permettaient pas de caractériser tous les constituants notamment ceux de haut poids moléculaire, d'autant que ces méthodes utilisent l'hydrolyse à chaud par des acides forts ou l'hydrolyse à température ambiante par des acides faibles, ce qui provoque, non seulement la rupture des liaisons covalentes des substances proteiniques étudiées, mais encore dénaturent les protéines et altèrent leurs structures primaire et tertiaire initiales provoquant une perte de leur activité chimique et biologique. Il fallait donc trouver un procédé permettant non seulement d'extraire et de caractériser les aminoacides, les protéines, mais encore les glycoprotéines, les glycosaminoglycanes et les protéoglycanes et de les intégrer dans des préparations à visée thérapeutique, diagnostic et cosmétique.
Selon un mode de réalisation préférentielle et sans que l'exemple soit limitatif le procédé d'extraction selon l'invention a été appliqué séparément aux coquilles du Tridacne Bénitier et de la Pinctada Maxima. 2 Pour la préparation de 100 kg de poudre de coquille externe et interne, on commence par obtenir par découpage des fragments de coquilles. Dans l'exemple selon l'invention, on prend séparément 100 kg de coquilles de Tridacne Bénitier et de Pinctada Maxima, coupées afin d'obtenir des morceaux de 5 cm de longueur, sur 3 cm de largeur. Ces fragments après lavage sous pression de 3 bars, sont traités par ultra sons pendant 5 mn, sans détergent, et décontaminés par immersion dans une solution de calbénium pendant 1 heure, puis sont placés dans des bols en zirconium de 10 cm de diamètre et de profondeur, dans lesquels sont placées 6 billes en zirconium, de 20 mm de diamètre. Les bols sont ensuite placés dans un broyeur planétaire, le dispositif tournant alternativement dans le sens des aiguilles d'une montre et inversement, à une vitesse de rotation de 1500 tour/mn pendant deux phases de 3mn jusqu'à l'obtention d'une poudre dont la granulométrie se situe entre 300 et 500 microns.
Le mode opératoire du procédé d'extraction selon l'invention, consiste à placer dans un récipient en matériau plastique inerte, d'une contenance de 1100 litres, 300 1 d'eau (soit 58%) apyrogène, 80 kg de glace (13%) grossièrement broyée, obtenue à partir de la même eau, 1501 d'acide acétique (29%) à 80%, le mélange est constamment agité par un agitateur du commerce de puissance suffisante pour 50 à 1000 litres. Un pH mètre contrôle en permanence le pH de la solution qui doit être toujours inférieur à 4,5, un thermomètre du commerce contrôle la température qui doit rester inférieure à 5°C et plus souvent voisine de 0°C.
Dans cette préparation est versée de manière très lente, par fraction de 20 kg toutes les trois heures, la poudre de coquille, tout en contrôlant la production de mousse qui peut être recueillie dans un récipient de garde. Un dispositif composé d'un circuit fermé de tuyaux en plastique dans lequel circule à vitesse réduite, du polyéthylène glycol, servant de réfrigérant à la préparation est placé à l'intérieur du récipient de 11001.
De la glace broyée est régulièrement ajoutée à la préparation afin d'avoir une température inférieure à 5°C et plus souvent voisine de 0°C, de la même manière le pH mètre est couplé à une électrovanne qui permet l'addition de l'acide acétique, dès que le pH augmente. On obtient ainsi dans le récipient, la réaction suivante : acide acétique + carbonate de calcium — » acétate de calcium + eau CH3 COOH + CaCO3 → CO2 + H2O + Ca (CH3-COO)2 3 Une fois dissous les 100 kg de poudre de coquilles, la totalité de la solution est filtrée sur un tamis, puis centrifugée dans une super centrifugeuse (Sharpless, bol de 6 litres) à une force centrifuge de 18 000 G. On obtient sur les parois du bol un culot (10kg) de substances organiques humides qui est réservé dans un récipient stérile, inerte et hermétique. On centrifuge une deuxième fois le surnageant afin de le clarifier. On obtient un second culot de centrifugation, les deux culots, réunis, sont lavés de la façon suivante :
- dans une bassine en matériau inerte d'une contenance de 100 1, pourvue du même dispositif de refroidissement par un circuit interne fermé de polyéthylène glycol, la bassine étant placée dans un récipient de garde rempli de glace pilée renouvelée selon les besoins, ceci afin de maintenir le bain à une température inférieure à 5° C et plus souvent voisine de 0°C, on place les deux culots de centrifugation, auxquels on ajoute 65 1 d'acide acétique à 5%, la solution est centrifugée, dans une super centrifugeuse à une force de 18 000 G, on obtient un culot qui est repris par 65 1 d'eau apyrogène. Le pH de la solution est amené à pH 7 par adjonction de soude 2,5 N, le tout étant agité constamment par un agitateur pendant 1 heure, puis centrifiigé à 18000 G. Le culot ainsi obtenu est repris dans 65 litres d'eau apyrogène sous agitation constante puis à nouveau centrifugé. On obtient un culot définitif de matière organique humide qui est séché par lyophilisation à froid. On prélève lOcc des eaux du dernier lavage qui sont traitées par l'acide oxalique afin de vérifier la présence ou l'absence de calcium par la réaction suivante : acétate de calcium + acide oxalique — oxalate de calcium + eau
Après séchage le produit selon le procédé se présente sous la forme de poudre grossière de couleur gris foncé d'un poids (de 1.8 kg pour la Pinctada, et 2.3 kg pour le Tridacne Bénitier) qui est finement broyée au mortier afin d'obtenir une poudre de granulométrie variant entre 0,5 et 2 microns. La matière organique ainsi obtenue contient les constituants organiques insolubles contenus dans la coquille du Tridacne, Bénitier ou de la Pinctada Maxima,
On reprend la totalité des surnageants récupérés lors de l'extraction des constituants protéiques insolubles, l'ensemble contenant les constituants protéiques solubles et les sels de calcium sous la forme acétate, c'est ainsi que l'on a 800 litres de solution. Après passage au travers d'un filtre en tissu, les surnageants sont dessalés par passage dans une batterie de 17 cassettes d'osmoses tangentielles de lkdalton de 0,5 m2 chacune, montées en série, sous une pression de 9 bars. Le débit de dessalage est de 50 à 70 ml par mn par cassette, soit pour 17 cassettes 1 litre par minute. Lorsqu'il reste 50 litres de 4 solution salée, on dilue par 50 litres d'eau apyrogène dans un récipient inerte stérile, d'une contenance de 150 litres, refroidie par les mêmes dispositifs et procédés décrits plus haut.
On effectue ensuite une série de 6 dilutions, ultra filtration avec chaque fois 50 litres d'eau apyrogène. Au cours de l'avant dernière dilution, on amène le pH à pH 7 par de la soude 2,5N. Après plusieurs ultra filtrations successives suivis de rinçages, on obtient environ 20 1 de solution que l'on concentre à 5 1 au Rotavapor sous vide à moins de 40 °C. La solution est ensuite lyophilisée, l'extrait est ensuite broyé au mortier jusqu'à l'obtention d'une granulométrie comprise entre 0.2 et 0.5 microns. On obtient ainsi une poudre allant du blanc au blanc grisâtre, représentant la fraction soluble des constituants protéiques de la coquille du Tridacne Bénitier (328g) ou de Pinctada Maxima(100g).
A la fin du procédé selon l'invention, on vérifie dans les surnageants, la présence ou l'absence de protéines en prélevant une aliquote de solution qui est traitée par la méthode colorimétrique de Biuret (coloration bleue en présence de protéines, apparaissant rapidement et restant stable pendant plus de 2 heures). L'intensité de cette coloration variant linéairement avec la concentration en protéines. L'absence de coloration signifie que toutes les protéines ont été extraites. Les surnageants sont aussi traités par la méthode de Lowry, qui est plus sensible mais plus longue. Une des variantes de cette méthode consiste à précipiter quantitativement dans un premier temps, les protéines par mélange avec trichloracétique ou désoxycholate de sodium avant de procéder à la coloration. L'absence de coloration montre que toutes les protéines ont été extraites. Ces deux méthodes ont l'avantage d'être relativement rapides et fiables, mais ne rendent compte que de la présence ou non de protéines dans le surnageant.
Les deux fractions organiques ainsi recueillies sont placées dans des récipients stériles et stérilisés par rayonnement Gamma 2.5 mégarad et conservées à une température de 3°C. L'hydrolyse à froid, la centrifugation et Pulfracentrifugation sur cassettes en série d'après le procédé suivant l'invention, nous ont permis d'extraire les constituants organiques insolubles et solubles de la coquille des bivalves étudiés. Les différentes composantes organiques seront caractérisées qualitativement et quantitativement par les méthodes analytiques habituelles qui seront utilisées soit séparément soit en association. Ces méthodes sont la chromatographie analytique par échange ionique, qui permettent par réaction et dérivation de prélever des aliquotes des fractions de Peffluent et de leur faire subir une réaction spécifique, par exemple pour les acides aminés une réaction à la ninhydrine qui provoque une coloration que l'on peut mesurer à l'aide d'un spectrophotomètre. Cette 5 technique utilise des colonnes de chromatographie comportant des substances hautement polymérisées constituant un réseau tridimensionnel et portant des fonctions acides ou basiques. Ces substances servent de support aux groupements chimiques chargés de réaliser cet échange. Ces substances sont des résines ou des dérivés de la cellulose ou des polymères glucidiques. On utilise aussi pour la séparation des acides aminés et des oses, la chromatographie sur couches minces dont le principe fait appel au fractionnement par partage entre deux solvants, un autre mode de séparation utilisé est la chromatographie sous haute pression (plus de 30 Bars) qui utilise la méthode de chromatographie en phase inverse adaptée à la séparation de molécules de faible poids moléculaire, et aussi à celle des protéines qui sont des macromolécules. Ce type de chromatographie à haute pression utilise aussi des colonnes d'échanges d'ions pour la séparation d'acides aminés. On associe à la chromatographie l'électrophorèse qui permet aussi la séparation des protéines. La révélation de la présence de protéines est réalisée grâce à des colorants (noir a idé, rouge de Ponceau), il existe aussi des colorants plus spécifiques comme le réactif de Schiff qui révèlent les fractions glucidiques des protéines. L'électrophorèse de zone sur gel de polyacrylamide qui permet une séparation selon la charge et le poids moléculaire, l'utilisation d'un gel de polyacrylamide en présence de dodécylsulfate de sodium (SDS), associé à un traitement au mercaptoéthanol préalable à la migration de la substance protéique à séparer, permet de déterminer le poids moléculaire, et le nombre de chaînes polypeptidiques composant la protéine. On a déjà, par hydrolyse acide (HC1) à chaud, isolé plusieurs acides aminés, exactement 17.
Ces méthodes d'identification appliquées à la fraction soluble des constituants extraits du Tridacne Bénitier et de la Pinctada Maxima, a permis de mettre en évidence, les acides aminés suivants, avec leur pourcentage en moles : moles %
Pinctada Maxima Tridacne Bénitier
Asp 11,8 15,2
Thr 1,12 3,5 S Seerr 4 4,,1100 7,3
Glu 2,58 6,15
Pro 1,14 3,64
Figure imgf000007_0001
Gly 28, 95 32,95 6
Ala 29,27 33,27
Cys/2 0,71 3,71
Val 8,02 11,06
Met 1,07 3,15
Ile 1,16 3,72
Leu 6,42 9,65
Tyr 1,99 4,25
Phe 1,68 4,10
His 0,15 3,12
LLyyss 11,,5577 3,86
Figure imgf000008_0001
Arg 4,23 7,66
La mise en évidence qualitative et quantitative du tryptophane soit 3,95 moles % est obtenue par hydrolyse enzymatique par la trypsine brute de 100 g de poudre de coquille interne et externe de Pinctada Maxima et de Tridacne Bénitier, dont la granulométrie est de 1 micron. L'hydrolysat ainsi obtenu est ensuite traité par l'acide glyoxylique en milieu sulfurique, la coloration violette (réaction d'Adamkiewicz), caractérise la présence de tryptophane, confirmée également par la réaction d'EHRLICH (coloration bleue en présence de p-diméthylaminobenzaldéhyde en milieu acide).
La présence et l'analyse quantitative de certains acides aminés nous ont permis par analogie de mettre en évidence, la présence de protéines dont ils sont constitutifs, bien que ces acides aminés existent à l'état libre. C'est ainsi que le pourcentage élevé de glycocolle (28,95) laisse supposer la présence confirmée de scléroprotéines comme les collagènes de type I - m - IV ou Pélastine. La proportion élevée d'Alanine (Ala) montre qu'elle existe aussi bien à l'état libre, que comme constituant d'une protéine. L'acide aspartique et glutamique sont des constituants importants des protéines. La Lysine, PArginine, et l'Histidine sont les acides aminés des protéines. La Lysine de formule générale
^ COOH N2H - (CH2)4 - CH
\ H2 peut être rattachée à l'acide alpha gamma diaminobutyrique qui est un constituant de certains antibiotiques peptidiques de formule générale
.--' COOH
H2N - (CH2)2 - CH
^\ NH2 7 qui en fait un homologue inférieur de la lysine.
Cette similitude de formule générale explique certaines propriétés antibiomimétiques des constituants des composants organiques extraits de la coquille externe et interne du Bénitier et de la Pinctada Maxima par le procédé selon l'invention et la mise en évidence de la S- hydroxylysine signe la présence de collagènes de même que celle de la Proline.
S'il est facile d'identifier, par les méthodes énumérées plus haut, les acides aminés et les protéines, il est plus difficile d'identifier la présence de glycoprotéines. Les glycoprotéines sont des hétéroprotéines résultant de l'union d'une fraction protéinique avec une ou plusieurs séquences glucidiques, elles sont stables à la chaleur, solubles dans les solutions salines au voisinage de la neutralité. Ce sont des macromolécules d'un poids moléculaire très élevé. La teneur en glucides de ces macromolécules est très variable de 1% à plus de 40%.
Le problème de l'arrangement séquentiel des glucides dans les chaînes glucidiques des glycoprotéines rend très difficile la résolution de ces séquences, pour cela nous avons employé une combinaison de plusieurs techniques : chimiques et enzymatiques. La liaison glucide - polypeptide apparaît dans la majorité des cas au niveau des résidus Séryl et thréonyl, d'une part, et de résidus asparaginyl, d'autre part, de la chaîne polypeptidique. Nous avons utilisé les méthodes suivantes : la méthylation par Piodine ou le sulfate de méthyle, l'acétolyse en milieu anhydre entraînant une coupure des liaisons osidiques, suivie d'une saponification ; le protocole de la dégradation séquentielle de Smith, l'hydrolyse acide en corrélation avec d'autres méthodes, l'hydrolyse enzymatique dans le méthanol anhydre, l'hydrolyse enzymatique par une aspartylglucosanimidase et par des hexosanimidases, toutes ces méthodes demandent des systèmes enzymatiques très purs. Elles ont mis en évidence la présence de glycoprotéines dans les constituants extraits de la fraction organique des coquilles internes et externes du Tridacne Bénitier et de la Pinctada Maxima, mais celles-ci n'ont pas subi d'analyse séquentielle permettant de les comparer aux modèles glycoprotéiniques déjà connus. On sait cependant que les glycoprotéines sont impliquées dans le processus d'adhésivité et de reconnaissance cellulaire et que celles mises en évidence dans les constituants organiques des coquilles du Tridacne Bénitier et de la Pinctada Maxima, proviennent de la membrane des cellules du manteau qui sont des fibroblastes, et qui fabriquent les couches internes et externes des coquilles, elles proviennent aussi du tissu conjonctif, du manteau, et de la matrice extra-cellulaire que l'on retrouve dans le liquide extra-palléal et qui contient une très forte concentration de 8 macromolécules nécessaires à l'édification de la coquille de ces mollusques. La réaction de
Maillard indique nettement la présence des glycoprotéines contenues dans les coquilles internes et externes des mollusques, tels que le Tridacne Bénitier et de la Pinctada Maxima.
Cette réaction consiste à chauffer très fortement en milieu anhydre, 100 g de constituants extrait par le procédé selon l'invention : les oses présents dans les protéines réagissent avec les fonctions aminés des protéines solubles (-NH2 de la lysine, qui entre dans leur composition). Il se forme un résidu brun très foncé, résultat de la condensation du ou des sucres contenus dans la glycoprotéine et les fonctions aminés des protéines avec un remaniement de type Amadori, conduisant à des produits décarboxylés et une polymérisation en composés bruns.
L'utilisation de réactifs colorés ainsi que l'utilisation d'enzymes spécifiques permettent de mettre en évidence dans la coquille interne et externe des mollusques cités plus haut, des macromolécules particulières que sont les glycosaminoglycanes (GAG) terme générique qui désigne des polysaccharides acides constitués par des chaînes linéaires de résidus régulièrement alternés de N-acétyl hexosamine et d'acide hexuronique. Ces mucopolysaccharides sont par leurs structures proches de l'acide hyaluronique, car ils sont présents dans le tissu co jonctif du manteau où ils constituent comme l'acide hyaluronique, une espèce de ciment intercellulaire, dont la fonction capitale est de s'opposer à la diffusion des substances étrangères, comme par exemple, les agents pathogènes. Nous avons utilisé pour la mise en évidence des glycosaminoglycanes contenus dans la coquille interne et externe des mollusques cités plus haut, les techniques histochimiques et immunologiques ; notamment la coloration histochimique par le rouge de ruthénium, l'acide phosphotungstique qui provoque un précipité noir en présence de glycosaminoglycanes ainsi que l'examen au microscope électronique des extraits de la coquille interne et externe des mollusques étudiés après incubation dans un milieu contenant des anticorps spécifiques qui montre un résidu filamenteux correspondant au complexe antigène anticorps. C'est ainsi que l'on peut expliquer expérimentalement et par observation directe, que certains agents pathogènes comme les vibrios, se retrouvent bloqués soit dans l'épaisseur de la coquille interne, soit dans le tissu conjonctif du mollusque, et qu'ainsi il y a inhibition de la diffusion des toxines libérées par cet agent pathogène. De la même façon la mise en évidence d'hexosamines sulfatées, signe la présence de glycosaminoglycanes voisins de la chondroitine sulfate, dont l'importance est capitale dans le processus de formation de la coquille en cours d'édification (fixation de cations comme le calcium). 9 On connaît l'importance de l'acide hyaluronique qui est le plus simple des glycosaminoglycanes et qui provient directement de la surface cellulaire. On pense que l'acide hyaluronique joue un rôle dans la résistance des tissus aux forces de compression. Sa présence dans la composition des coquilles externes et internes des mollusques étudiés par le procédé selon l'invention, explique la valeur du module d'élasticité en compression (90
000 N/mm2) de la coquille nacrée, tel qu'il a pu être défini par le Laboratoire National d'Essais. C'est aussi un glycosaminoglycane très hydrophile, en effet une petite quantité de
GAG peut s'étendre et occuper un grand volume. L'acide hyaluronique est généralement produit en grande quantité au cours de la cicatrisation et sert de lubrifiant dans les articulations. Sa présence a pu être mise en évidence expérimentalement lors de la perforation de la coquille des mollusques étudiés tels que le Tridacne Bénitier et la Pinctada Maxima : durant le processus de réparation de la perte de substance, on note l'apparition du tissu cicatriciel très précoce à forte composante organique, dont l'étude analytique a montré, outre la présence de scléroprotéines ou protéines fibreuses, de glycosaminoglycanes sulfatés et d'acide hyaluronique.
A l'exception de l'acide hyaluronique qui est un glycosaminoglycane simple, il existe des glycosaminoglycanes qui se lient à des protéines pour former des protéoglycanes. Les protéoglycanes se distinguent des autres protéines par leur nature, la quantité et l'agencement de leur chaîne glucidique latérale. Les protéoglycanes sont d'énormes édifices plurimoléculaires dont les noyaux protéiques, vont de 10 000 à plus 600 000 Daltons. Les protéoglycanes sont en fait des glycoprotéines très fortement glycosilées, leur identification et leur classification est très difficile à mettre en évidence. Cependant elle est rendue possible indirectement par l'utilisation des phytohémagglutinines qui se fixent sur les glucides spécifiques portés par les molécules protéiques formant une volumineuse molécule fecilement visible au microscope électronique. On pense que les protéoglycanes jouent un rôle important dans la signalisation chimique intercellulaire, ils sont capables de se lier in vivo et in vitro à des molécules informatives, tels que les facteurs de croissance protéiques ; ils peuvent contrôler l'activité d'autres types de protéines sécrétées tels les enzymes, ils peuvent également s'associer au collagène. Les protéoglycanes font partie de la fraction soluble des composants organiques de la coquille interne et externe du Tridacne Bénitier et de la Pinctada Maxima. La mise en évidence de protéines glycosilées monomériques d'un poids atomique d'environ 40 000 Daltons, que sont les cytokines a été réalisée expérimentalement. Leur action a pu être constatée lors de phénomènes de cicatrisation 10 secondaire à une altération des tissus par brûlure, ce sont pour la plupart des facteurs ou des profacteurs de croissance, dont le rôle consiste à stimuler, potentialiser, réparer induire ou inhiber, certains processus chimiques et biologiques.
Les méthodes habituelles de chromatographie, d'ultracentrifugation ainsi que les tests spécifiques et colorimétriques (test d'Awapara, test de solubilité dans les solvants) de même que les mesures chromatométriques ont permis de mettre en évidence dans les produits d'extractions des coquilles externes et internes des mollusques étudiés, la présence de composés macromoléculaires insolubles d'un poids moléculaire allant de 100 à 10000
Daltons, de la famille des mélanines qui sont issus de la tyrosine par oxydation et qui donne à la fraction insoluble des constituants organiques une coloration allant du brun au noir.
L'analyse qualitative et quantitative des minéraux et des métaux contenus dans la coquille des mollusques, telle que Pinctada Maxima, a déjà été réalisée. Les procédés d'analyse identique appliqués au Tridacne Bénitier par le procédé selon l'invention, ont montré la présence de ces mêmes éléments minéraux et métalliques, que sont le Sémarium (Sm) à l'état de trace, le Lutérium (La), le Zinc (Zn), le Brome (Br), le Cérium (Ce), le Fer (Fe), le Manganèse (Mn), le Chlore (Cl), le Potassium (K), le Strontium (Sr), le Sodium (Na), le Calcium (Ca). Certains atomes de métaux constituent des oligo-éléments, d'autres sont associés à des protéines pour former des métalloprotéines non enzymatiques ou le métal intervient comme forme de transport ou de réserve, c'est le cas du fer, du cuivre qui est associé à une protéine, pour former une métalloprotéine servant de pigment respiratoire chez le mollusque, c'est le cas du zinc, qui peut être pris également comme un oligoélément ou associé à une protéine pour former aussi une métalloprotéine, à laquelle on reconnaît une fonction régulatrice dans l'expression des gènes. Le calcium qui est l'élément minéral de la coquille, peut aussi former une calciprotéine, dont le rôle est de régler l'activité enzymatique. Les éléments métalliques sont également associés à une protéine enzymatique pour former des métalloenzymes, c'est le cas du manganèse, du fer et du zinc. Ces métalloenzymes interviennent dans le mécanisme de destruction des superoxydes (O2-) D'ailleurs les métaux et minéraux qui existent à l'état libre ou pouvant être associés à des protéines ou à des enzymes sont ceux dont la concentration est la plus élevée.
Les méthodes chromatographiques associées à des études de fluorescence ont également mis en évidence des pigments autres que les composés mélaniniques, qui sont des chromoprotéines, aussi bien des chromoprotéines porphyriniques contenant des pigments 11 respiratoires et non respiratoires, que des chromoprotéines non porphyriniques contenant les mêmes pigments. On peut rattacher ces chromoprotéines aux métalloprotéines déjà caractérisées. C'est ainsi que l'on a mis en évidence, outre les porphyrines, des métalloporphyrines et des caroténoides dont on retrouve les teintes dans la nacre des perles et dans le test nacré.
La principale propriété chimique des porphyrines est leurs aptitudes à se combiner aux métaux, surtout ceux de la famille du fer (fer, chrome, manganèse, nickel, cobalt) au cuivre, au zinc pour donner naissance à des complexes non ionisables, que sont les métalloporphyrines, dont les propriétés sont semblables à celles des métalloenzymes et des métalloprotéines non enzymatiques. L'extraction des lipides du complexe organominéral des coquilles externes et internes des mollusques étudiés a été réalisée par saponification de 100g d'extraits solubles et insolubles de coquilles des mollusques étudiés, à l'aide d'un excès de solution alcoolique de potasse portée à ébullition dans un tube à essai, l'addition d'éther de pétrole permet de soutirer une phase hydroalcoolique basique qui est acidifiée, ce qui fait précipiter les acides gras, ceux ci peuvent être recueillis dans l'éther de pétrole par évaporation. Cette extraction a permis de mettre en évidence des substances liposolubles qui sont des caroténoides qui donnent à la coquille interne sa coloration, jaune orangé. Ces caroténoides dont les principaux sont les carotènes de formule générale C 0Hs6 dont on connaît 3 isomères, sont des pro vitamines A L'importance des éléments constitutifs déjà connus, des coquilles internes et externes des mollusques cités dans la description, et ceux caractérisés selon le procédé, la connaissance de leurs propriétés chimiques, biologiques, phaπracodynamiques, permettent la mise en oeuvre de préparations à visée thérapeutique, diagnostic et cosmétique tels que les exemples suivants qui font également l'objet de l'invention sans pour autant être limitatifs. A titre d'exemple, on trouvera ci-après quelques formulations de base préparées à partir d'extraits des principes actifs solubles et insolubles obtenus selon le procédé. Exemple 1 - Formulation pour une préparation à visée curative pour brûlures de 1er, 2ème et 3ème degré. Extraits secs de principes actifs solubles 0,5g Extraits secs de principes actifs insolubles 0,5g
Vitamine C 1 g
Vitamine Bβ 0,5 g
Hydroxyde de calcium 0,5 g 12 Glucose 4 mg
Coprah 0,5g
Carbonate de calcium lg
Zinc 14,2 μg Cuivre 15 μg
Sodium 5 μg
Potassium 7 μg
Manganèse 12,3 μg
Fer 12 μg P Crésol 0,1 mg
Conservateur
Vaseline Q.S. pour 100g
Une telle préparation est stérilisée au rayonnement Gamma et conservée dans un emballage stérile. On sait que lors d'une brûlure, deux types de conséquences doivent être pris en compte pour en apprécier le pronostic vital et fonctionnel : la profondeur et la gravité.
La peau étant un organe à part entière, est de loin le plus étendu et le plus lourd.
Elle est constituée de deux tissus différents mais complémentaires : l'épiderme qui est la couche externe fine, souple, constituée essentiellement de kératinocytes (97%), mais aussi de mélanocytes et de cellules de Langhérans (responsable du rejet des greffes). Ces cellules sont constituées en couches qui protègent la peau de la lumière, par la mélanine sécrétée par les mélanocytes et contre les agressions traumatiques par la couche de kératine sécrétée par les kératinocytes.
Le derme sous-jacent constitué d'un réseau de fibres de collagène, élastine et réticuline, de fîbronectine, de glycosaminoglycanes et de cément intercellulaire. Ce sont les fibroblastes qui synthétisent les protéines de structure qui le composent. Le derme est innervé et vascularisé par les teπriinaisons nerveuses et les vaisseaux provenant de l'hypoderme.
L'hypoderme sous-jacent au derme est une couche cellulo-graisseuse.
La réponse physiologique à une agression thermique, se traduit par un grand nombre de perturbations dans quasiment toutes les fonctions de l'organisme, en fonction de la gravité de la brûlure.
Il y a d'abord l'œdème, immédiat, non seulement au niveau de la lésion mais aussi dans les autres tissus en cas de brûlure grave. Les causes de cet œdème sont de trois sortes : 13 - l'augmentation de la perméabilité capillaire qui est due à la production d'histamine et de médiateurs vasoactifs tels que (sérotonine, bradyldnine, prostaglandines, leukotriènes) et à la libération de radicaux oxygénés libres cytotoxiques.
- l'augmentation de l'osmolarité qui est due à la libération d'osmoles intracellulaires par la lésion thermique et à la fixation de molécules de sodium sur les fibres de collagène.
- l'apparition d'une perte plasmatique due à Pévaporation d'autant plus importante que la brûlure est étendue. ,
Mais les perturbations les plus importantes sont métaboliques. C'est précisément à ce niveau que la préparation selon le procédé est destinée à intervenir. En effet, dès qu'une lésion atteint 25% de surface brûlée, on assiste à un hypermétabolisme à prédominance catabolique, avec augmentation des dépenses énergétiques, une lipolyse, une hyperglycémie, un hypercatabolisme protidique.
C'est surtout le « turn-over » des protéines qui est augmenté avec une prédominance du catabolisme sur l'anabolisme et transfert des acides aminés depuis les muscles vers les viscères.
On observe une augmentation des cytokines, des TNF. La nécrose tissulaire et la mort cellulaire au niveau du tissu brûlé, provoquent un relargage dans le sang d'un certain nombre de facteurs dépresseurs de l'immunité. JACQUES et coll. et FJELLSTROM et coll. ont montré que le taux de fîbronectine est très bas chez les grands brûlés. Presque tous les éléments figurés du sang sont atteints (polynucléaires, lymphocytes, etc.) toutes les protéines de l'inflammation sont augmentées. La disparition ou la baisse des facteurs immunitaires locaux favorisent l'infection. Le traitement de ces perturbations métaboliques est jusqu'à maintenant général. Sur les zones brûlées, on applique un pansement occlusif qui a pour but d'empêcher Pévaporation de Pexsudat et la fuite plasmatique. La préparation à visée thérapeutique obtenue d'après le procédé à pour but de traiter localement la perte protéique au niveau de la brûlure par apport in situ des acides aminés essentiels de protéines, de protéoglycanes, de glycoprotéines, de glycosaminoglycanes, de sucres, de profecteurs de croissance, d' oligo-éléments et de mélanine, extraits de la coquille interne et externe du mollusque. L'application de la préparation sur une lésion thermique profonde réalise non seulement un recouvrement cutané, une sédation de la douleur en inhibant la production des produits de l'in_jfoπιmation (bradykinine, sérotonine, histamine etc.) qui sensibilisent les nocirécepteurs cutanés, mais favorisent aussi la régression de hypermétabolisme. Elle stimule des facteurs 14 locaux de l'immunité cellulaire et tissulaire dont l'action inhibe la prolifération microbienne et partant l'infection.
Nous avons pu également observer un raccourcissement des deux tiers du temps de cicatrisation par augmentation du taux des protéines du stress thermique, qui protègent la synthèse du collagène ; ainsi qu'une régulation du tissu de granulation avec diminution de la taille des bourgeons charnus s'accompagnant d'une augmentation de leur nombre. De plus, la diminution de la mise en tension des fibroblastes empêche de ce Irait la formation de cicatrises chéloïdes. Un autre mode de réalisation consiste en une membrane biologique artificielle dont la composition est la suivante : sur un support en treillis de polyglactine d'une épaisseur de 0,5 mm et de dimension de 20 mm sur 20 mm est étendue sur une épaisseur de 0,5 mm, la préparation suivante :
1 mg d'extraits secs des principes actifs solubles et insolubles obtenus selon le procédé
0,5 g de carbonate de calcium
0,1 g d'hydroxyde de calcium 100 mg de vitamine C
25 Uph EUR d'aprotinine (DCI) thrombine fibrinogène
La membrane biologique est stérilisée au rayonnement Gamma et conservée au froid à 4°C sous double emballage stérile.
La même formulation à laquelle a été ajouté de l'eugénol a été utilisée sous forme d'onguent pour le traitement du pourrissement de la fourchette du sabot du cheval.
Selon un autre mode de réalisation les produits obtenus selon le procédé peuvent rentrer dans la réalisation d'une préparation pour compléments alimentaires selon une formule qui est la suivante :
- extraits secs de principes actifs solubles 0,1 mg
- extraits secs de principes actifs insolubles 0,1 mg
- vitamine C 200 mg
- vitamine E 1 μg - vitamine B 2 μg
- cuivre 1 μg
- fer 1 μg
- zinc 1 μg 15 - amidon Q.S pour 1 g
Les produits obtenus d'après le procédé, peuvent également rentrer dans la composition de préparation à visée cosmétique sous forme de gel ou de crème, dont la composition est la suivante Extraits secs de principes actifs solubles
- extraits secs de principes actifs insolubles
- eau
- glycérine
- alcool dénaturé - acide ascorbique
- α-tocophérol
- acide citrique
- extraits de coco - miel - propolis
- alginate
- méthyl paraben
- propyl paraben
- excipient QS. pour 100g La formulation suivante pour applications orthopédiques est préparée à partir des produits obtenus suivant le procédé :
- extraits secs de principes actifs solubles 0,5 g
- extraits secs de principes actifs insolubles 0,5 g
- carbonate de calcium (granulométrie 350 microns) 80 g - hydroxyde de calcium (granulométrie 10 microns) 10 g
- acide ascorbique 300 mg
- cuivre 0,001 mg
- zinc 0,001 mg
- manganèse 0,001 mg - vitamine E 0,001 mg
Une telle formulation a été utilisée sous forme de poudre en chirurgie orthopédique humaine et vétérinaire dans 10 cas, où une repousse osseuse était souhaitée. Il s'agissait de fracture avec fracas osseux et perte de substance osseuse. 16 La préparation ci-dessus a été placée au niveau des pertes de substance sous forme de poudre, mélangée au sang autologue de manière à obtenir une pâte de consistance mastic dans 5 cas. Dans 5 autres cas, elle a été placée sous forme d 'éléments prothétiques préformés, de plaques, de pastilles et de tiges. Ces éléments de formes et de dimensions variables ont été obtenus par moulage de la poudre sous vide, dans un dispositif, sous une pression progressive de 10 tonnes. Un système de refroidissement par un circuit fermé d'éthylène glycol maintenant la température en dessous de 40°C, de manière à ne pas détruire la structure tertiaire de protéines et des autres principes actifs contenus dans la préparation. En effet, lors de la compression la température s'élève de manière constante jusqu'à dépasser 100°C.
Les radiographies postopératoires ont montré dans tous les cas une organisation et une minéralisation du cal de réparation deux fois plus rapide que chez les animaux témoins. Les biopsies pratiquées à 15 jours au niveau du site opératoire, ont mis en évidence une prolifération des ostéoblastes (cellules formatrices d'os), la présence de nombreux capillaires sanguins témoignant d'une angiogénèse active indispensable aux phénomènes de réparation, et une absence d'ostéoclastes (cellules destructrices d'os) qui apparaissent plus tardivement pour remodeler le cal osseux et en harmoniser les contours. Cette apparition précoce d'ostéoblastes dans le site de réparation et l'absence prolongée d'ostéoclastes, tout au plus au début du processus, prouvent de façon irréfutable la présence de facteurs ou de profecteurs de croissance, qui stimulent Postéogénèse, et par conséquent la prolifération des ostéoblastes, et d'autres profecteurs ou facteurs de croissance inhibant la prolifération des ostéoclastes. Cette dernière propriété à été mise en évidence par l'expérimentation suivante : deux cultures d'ostéoclastes ont été réalisées dans deux boites de Pétri en atmosphère stérile et mise en incubation à 37°C. Dans l'une, il a été placé un fragment de coquille de Tridacne Bénitier et un fragment de Pinctada Maxima, ainsi qu'un fragment osseux d'origine animale, sur lequel il a été saupoudré une couche fine d'extraits obtenus d'après le procédé. Dans l'autre boite, a été mis un fragment osseux d'origine animale, seul. Après 3 semaines, l'examen microscopique a montré que dans la première boite, aucun des fragments n'avaient subi d'altération par les ostéoclastes (absence de lacunes de Aoschip), alors que dans la deuxième boite, on a noté, sur le fragment osseux une érosion en coup d'ongle à bords déchiquetés caractéristiques de l'action des ostéoclastes. 17 Une variante de la formulation précédente, destinée à être injectée au niveau des lésions, est obtenue avec l'adjonction d'un gel à base d' alginate.
Une telle formulation a été utilisée dans une perte de substance du sabot d'un cheval (seime, fourmilière) avec atteinte du bourrelet périoplique (qui assure la repousse de la corne) et mise à nu de la troisième phalange. La préparation selon l'invention est mélangée avec de l'eau déminéralisée à laquelle est ajouté un durcisseur jusqu'à obtention d'un mortier qui est inséré dans la perte de substance. La lésion est progressivement comblée par de la corne néoformée au bout de 5 semaines. Dans un autre cas la préparation selon l'invention à été utilisé lors d'une perte totale du sabot sans atteinte du bourrelet périoplique. La troisième phalange a été entièrement recouverte par la préparation selon l'invention dans un pansement occlusif fixé au tiers inférieur du boulet. La restauration du sabot a été obtenue en 8 semaines alors que dans la plupart des cas, l'animal doit être euthanasie. Une autre formulation des substances obtenues d'après le procédé, consiste en un milieu de culture. En effet, la plupart des milieux de culture contiennent des mélanges de macromolécules comme du sérum de cheval ou du sérum de veau fœtal, ainsi qu'une quantité précise de petites molécules telles que les sels, le glucose, les acides aminés et les vitamines. De tels milieux sont encore utilisés aujourd'hui pour la plupart des cultures cellulaires de routine, mais ils rendent difficile la détemiination précise des macromolécules spécifiques nécessaires au maintien et au fonctionnement normal d'un type cellulaire donné.
Cette difficulté a conduit à la mise au point de divers milieux sans sérum, de composition chimique connue. Ces milieux contiennent différentes protéines spécifiques dont les cellules ont besoin pour survivre et proliférer en culture. Ces protéines incluent les facteurs de croissance qui stimulent la prolifération cellulaire et la transférrine qui transporte le fer aux cellules. De nombreuses molécules informatives extracellulaires, jouant un rôle vital dans le développement et où la prolifération de types cellulaires spécifiques ont été découvertes grâce à l'étude des cellules en culture, et la recherche de nouveaux facteurs est devenue plus aisée depuis que l'on dispose de milieux de composition chimique définie, sans sérum. La formulation proposée avec les substances obtenues d'après le procédé selon l'invention à la composition suivante :
Extraits secs de principes actifs solubles et insolubles
Dont :
- Asp (25mg/litre) - C1K (50mg/litre) 18
- Thr (37 mg/litre) - Cu (200mg/litre)
- Ser (27 mg/litre) - Mn (20mg/litre)
- Glu (57 mg/litre) - ClNa (100mg/litre)
- Pro (35mg/litre) - Zn (20mg/litre)
- Gly (40 mg/litre) - Ca (50mg/Litre)
- Ala (2 mg/litre) - Insuline (1 mg/litre)
- Cys/2 (75mg/litre) - Transférrine (1 mg/litre)
- Val (40mg/litre) - Acide folique (lμg/litre)
- Met (12mg/litre) - Pyridoxal (2μg/litre)
- Ile (48mg/litre) - Thiamine (lμg/Litre)
- Leu (48mg/litre) - Riboflavine (0,2μg/litre)
- Tyr (35 mg/litre) - Vit C (lμg/litre)
- Phe (30mg/litre) - Carbonate de calcium (0,1 g/litre)
- His (35m/litre) - Eau apyrogène Q.S pour 1 litre
- Lys (73mg/litre)
- Arg (lOOmg/litre)
La présence de sérum et de facteurs de croissance n'est pas nécessaire dans un tel milieu, compte tenu du fait, que les produits d'extractions contiennent tous ces éléments. Dans le milieu obtenu d'après le procédé, il a été mis en œuvre, avec succès, des cultures de cellules osseuses (ostéoblastes, de fibroblastes, de chondroblastes, mélanocytes, de kératinocytes).

Claims

19 REVENDICATIONS
1) Procédé d'extraction, de séparation, d'identification, des principes actifs : protéines, glycoprotéines, glycosaminoglycanes et protéoglycanes, contenus dans la coquille interne et externe des mollusques marins tels que le Tridacne Bénitier, les Pinctadines du genre Pinctada Maxima et Pinctada Martensi, caractérisé en ce qu'il consiste d'une part, en l'hydrolyse à froid sous l'action de l'acide acétique des fragments de coquilles réduits en poudre, associé à la chromatographie et l'électrophorèse, ainsi qu'à l'action de réactifs colorés et de réactions enzymatiques, et d'autre part, à la formulation de préparations à visée thérapeutique, diagnostic et cosmétique.
2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que, les fragments de coquilles sont lavés sous pression de 3 bars, traités aux ultra sons, sans détergent pendant 5 mn, décontaminés pendant 1 heure par immersion dans une solution de calbénium, séchés puis placés dans des bols en zirconium contenant 6 billes en zirconium de 20 mn de diamètre, et placés dans un broyeur planétaire tournant alternativement à une vitesse de 1500 tr/mn pendant 2 périodes de 3 mn jusqu'à obtention d'une poudre de granulométrie de 300 à 500 microns qui est ensuite placée dans un récipient inerte contenant 58% d'eau apyrogène, 13% de glace broyée fabriquée à partir d'eau apyrogène et 29% d'acide acétique à 80%.
3) Procédé selon les revendications 1 et 2, caractérisé en ce que le mélange est agité par un agitateur, maintenu à un pH inférieur à 4,5 par un pH mètre couplé à une électrovanne, à une température constante inférieure à 5°C et plus souvent voisine de 0°C grâce à un circuit fermé dans lequel circule du polyéthylène glycol, la solution étant filtrée sur un tamis et centrifugée à une force de 18000 G. Le culot ainsi obtenu est lavé dans l'acide acétique à 5% puis centrifugé à nouveau à une force de 18000 G avant d'être repris dans de l'eau apyrogène à un pH 7 obtenu par adjonction de soude 2,5 N et refroidi par le même dispositif réfrigérant. La solution est ensuite agitée pendant 1 heure, puis centrifugé à nouveau à 18 000 G.
4) Procédé selon les revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le culot est repris dans de l'eau apyrogène sous agitation constante, centrifugé à 18000 G, puis séché par lyophilisation à froid et broyé à une granulométrie de 0,2 à 0,5 microns.
5) Procédé selon les revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les surnageants récupérés sont filtrés sur filtre en tissu, puis dessalés par passage sous pression de 9 bars, sur une batterie de 17 cassettes d'osmose tangentielle de 1 kg Dalton et de 0,5 m2 chacune montées en série, puis dilués et filtrés à 6 reprises consécutives avec de l'eau apyrogène. 20 6) Procédé selon les revendications 1 à 5, caractérisé en ce que, au cours de Pavant dernière dilution le pH de la solution est amené à pH 7 par adjonction de soude 2,5N, concentrée au
Rotavapor sous vide à moins 40°C lyophilisée à froid, l'extrait ainsi obtenu étant broyé au mortier à une granulométrie de 0,2 à 0,5 microns.
7) Procédé selon les revendications 1 à 6, caractérisé en ce que les protéines, les aminoacides, les glycoprotéines, les glycosaminoglycanes et les protéoglycanes extraits de la coquille de Tridacne Bénitier et de Pinctada Maxima, sont séparés par chromatographie et électrophorèse et identifiés par des réactifs colorés et des réactions enzymatiques spécifiques.
8) Application du procédé selon l'une quelconque des revendications de 1 à 7, à la formulation de préparations à visée curative pour brûlures de 1er, 2ème, 3ème degré et d'une membrane biologique artificielle.
9) Application du procédé selon l'une quelconque des revendications de 1 à 8, à la formulation d'une préparation à usage orthopédique en chirurgie humaine et vétérinaire, sous forme de poudre, de gel et de plaques, de pièces, de tiges, de pastilles, moulées sous vide, sous pression de 10 tonnes.
10) Application du procédé selon l'une quelconque des revendications de 1 à 9, à la formulation de milieux de cultures, de préparations cosmétiques et de compléments alimentaires.
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