ES2232126T3 - Extraccion, identificacion, utilizacion de principios activos de conchas de moluscos marinos. - Google Patents

Abstract

Procedimiento de extracción, separación e identificación, de los principios activos: proteínas, glicoproteínas, glicosaminoglicanos y proteoglicanos, contenidos en la concha de Tridacne Bénitier y Pinctada Maxima, caracterizado porque consiste en la hidrólisis a temperatura inferior a 5ºC bajo la acción del ácido acético de polvo de concha externa e interna obtenido a partir de fragmentos de conchas cortadas, asociada a la cromatografía y la electroforesis, así como a la acción de reactivos coloreados y de reacciones enzimáticas.

Description

Extracción, identificación, utilización de principios activos de conchas de moluscos marinos.

La presente invención se refiere a un procedimiento de extracción por hidrólisis en frío, separación e identificación, de los principios activos proteicos y no proteicos presentes en la concha de moluscos marinos gasterópodos a saber Tridacne Bénitier y Pinctada Maxima y su utilización en preparaciones que entran en la composición de sustancias medicamentosas, medios de diagnóstico y formulaciones cosméticas.

Se sabe que la concha de los moluscos está compuesta de dos tipos ultra-estructurales que son polimorfos del carbonato de calcio CaCo_{3}. Estos dos polimorfos son la calcita y el aragonito. La calcita constituye la parte externa de la concha y está compuesta de cristales que cristalizan en el sistema cristalino romboédrico, mientras que el aragonito también llamado nácar, constituye la parte media e interna cuyos cristales cristalizan en el sistema cristalino ortorómbico. Los biocristales de las partes internas y externas están envueltos de láminas y de membranas de materia orgánica.

Se conoce, de los documentos WO 9724133, WO 9530426 y J. KEITH et al., la extracción de los principios activos del nácar de un molusco, siendo la concha externa sistemáticamente eliminada.

Ningún documento propone la utilización de la concha entera del molusco y entonces la extracción de todos los componentes de elevado peso molecular.

Se ha puesto en evidencia en la matriz orgánica la presencia de constituyentes proteicos y no proteicos, pero los métodos de investigaciones clásicas no permitían la caracterización de todos los constituyentes especialmente los de elevado peso molecular, sobre todo porque estos métodos utilizan la hidrólisis en caliente con ácidos fuertes o la hidrólisis a temperatura ambiente con ácidos débiles, lo que provoca, no solamente la ruptura de los enlaces covalentes de las sustancias proteicas estudiadas, sino que además desnaturalizan las proteínas y alteran sus estructuras primaria y terciaria iniciales que provocan una perdida de su actividad química y biológica. Hacía falta pues encontrar un procedimiento que permita no solamente extraer y caracterizar los aminoácidos y las proteínas, sino además las glicoproteínas, glicosaminoglicanos y proteoglicanos e integrarlos en preparaciones dirigidas a terapéutica, diagnóstico y cosmética.

Para la preparación de 100 kg de polvo de concha externa e interna, se empieza por obtener por corte fragmentos de conchas. En el ejemplo según la invención, se toman separadamente 100 kg de conchas de Tridacne Bénitier y de Pinctada Maxima, cortadas a fin de obtener trozos de 5 cm de largo por 3 cm de ancho. Estos fragmentos después de lavarse bajo presión de 3 bares, se tratan con ultrasonidos durante 5 minutos, sin detergente, y se descontaminan por inmersión en una disolución de calbenio durante 1 hora, después se colocan en boles de circonio de 10 cm de diámetro y de profundidad, en los cuales se colocan 6 bolas de circonio, de 20 mm de diámetro. A continuación los boles se colocan en un triturador planetario, el dispositivo gira alternativamente en el sentido de las agujas de un reloj e inversamente, a una velocidad de rotación de 1500 revoluciones/minuto durante dos fases de 3 min hasta la obtención de un polvo cuya granulometría se sitúa entre 300 y 500 micrómetros.

El modo operatorio del procedimiento de extracción según la invención, consiste en colocar en un recipiente de materia plástica inerte, con una capacidad de 1100 litros, 300 l de agua (o sea 58%) apirógena, 80 kg de hielo (13%) groseramente triturado, obtenido a partir de la misma agua, 150 l de ácido acético (29%) a 80%, la mezcla se agita constantemente con un agitador comercial de potencia suficiente para 50 a 1000 litros. Un pHmetro controla permanentemente el pH de la disolución que debe ser siempre inferior a 4,5, un termómetro comercial controla la temperatura que debe quedar inferior a 5ºC y más frecuentemente cercana a 0ºC.

En esta preparación se vierte de manera muy lenta, por fracción de 20 kg cada tres horas, el polvo de concha, todo ello controlando la producción de espuma que puede ser recogida en un recipiente de guardia.

Un dispositivo compuesto de un circuito cerrado de tubos de plástico en el cual circula a velocidad reducida, polietilenglicol, que sirve de refrigerante a la preparación se coloca en el interior del recipiente de 1100 l.

Se añade regularmente hielo triturado a la preparación a fin de tener una temperatura inferior a 5ºC y más frecuentemente cercana a 0ºC, de la misma manera el pHmetro se acopla a un válvula electromagnética que permite la adición de ácido acético, cuando el pH aumenta. Se obtiene así en el recipiente, la siguiente reacción:

ácido \ acético \ + \ carbonato \ de \ calcio \ \rightarrow \ acetato \ de \ calcio \ + \ agua

CH_{3}COOH \ + \ CaCo_{3} \rightarrow \ CO_{2} \ + \ H_{2}O \ + \ Ca(CH_{3}-COO)_{2}

Una vez disueltos los 100 kg de polvo de conchas, la totalidad de la disolución se filtra sobre un tamiz, después se centrifuga en una super centrifugadora (Sharpless, bol de 6 litros) con una fuerza centrifuga de 18000 G. Se obtiene en las paredes del bol un sedimento (10 kg) de sustancias orgánicas húmedas que se reserva en un recipiente estéril, inerte y hermético. Se centrifuga una segunda vez el sobrenadante a fin de clarificarlo. Se obtiene un segundo sedimento de centrifugación, los dos sedimentos, reunidos, se lavan de la siguiente manera:

- en una cubeta de materia inerte con una capacidad de 100 l, provista del mismo dispositivo de enfriamiento por un circuito interno cerrado de polietilenglicol, siendo colocada la cubeta en un recipiente de guardia lleno de hielo picado renovable según las necesidades, esto a fin de mantener el baño a una temperatura inferior a 5ºC y más frecuentemente cercana a 0ºC, se colocan los dos sedimentos de centrifugación, a los cuales se añaden 65 l de ácido acético al 5%, se centrifuga la disolución, en una super centrifugadora con una fuerza de 18000 G, se obtiene un sedimento que se toma de nuevo en 65 l de agua apirógena. El pH de la disolución se lleva a pH 7 por adición de sosa 2,5 N, siendo todo agitado constantemente con un agitador durante 1 hora, después se centrifuga a 18000 G. El sedimento así obtenido se toma de nuevo en 65 litros de agua apirógena bajo agitación constante después se centrifuga de nuevo. Se obtiene un sedimento definitivo de materia orgánica húmeda que se seca por liofilización en frío. Se toman 10 cc de agua del último lavado que se tratan con ácido oxálico a fin de verificar la presencia o la ausencia de calcio por la siguiente reacción:

acetato \ de \ calcio \ + \ ácido \ oxálico \ \rightarrow \ oxalato \ de \ calcio \ + \ agua

Después de secado el producto según el procedimiento se presenta bajo la forma de polvo grosero de color gris oscuro con un peso (de 1,8 kg para Pinctada, y 2,3 kg para Tridacne Bénitier) que es finamente triturado en un mortero a fin de obtener un polvo de granulometría que varia entre 0,5 y 2 micrómetros.

La materia orgánica así obtenida contiene los constituyentes orgánicos insolubles contenidos en la concha de Tridacne Bénitier o de Pinctada Maxima.

Se retoman la totalidad de los sobrenandantes recuperados durante la extracción de los constituyentes proteicos insolubles, el conjunto que contiene los constituyentes proteicos solubles y las sales de calcio bajo la forma de acetato, se obtienen así 800 litros de disolución.

Después del paso a través de un filtro de tela, los sobrenadantes se desalan por paso en una batería de 17 casetes de ósmosis tangenciales de 1kg Dalton de 0,5 m^{2} cada una, montadas en serie, bajo una presión de 9 bares. El caudal de desalación es de 50 a 70 ml por minuto por casete, o sea para 17 casetes 1 litro por minuto. Cuando quedan 50 litros de disolución salada, se diluye con 50 litros de agua apirógena en un recipiente inerte estéril, con una capacidad de 150 litros, enfriado con los mismos dispositivos y procedimientos descritos anteriormente. A continuación se efectúa una serie de 6 diluciones, ultrafiltración con cada vez 50 litros de agua apirógena. En el curso de la penúltima dilución, se lleva el pH a pH 7 con sosa 2,5 N. Después de varias ultrafiltraciones sucesivas seguidas de lavados, se obtienen alrededor de 20 l de disolución que se concentra en 5 l en Rotavapor bajo vacío a menos de 40ºC. A continuación la disolución se liofiliza, el extracto a continuación se tritura en un mortero hasta la obtención de una granulometría comprendida entre 0,2 y 0,5 micrómetros. Se obtiene así un polvo que va del blanco al blanco grisáceo, que representa la fracción soluble de los constituyentes proteicos de la concha de Tridacne Bénitier (328 g) o de Pinctada Maxima (100 g).

Al final del procedimiento según la invención, se verifica en los sobrenadantes, la presencia o la ausencia de proteínas tomando una alicuota de disolución que se trata por el método colorimétrico de Biuret (coloración azul en presencia de proteínas, apareciendo rápidamente y quedando estable durante más de 2 horas). La intensidad de esta coloración varia linealmente con la concentración de proteínas. La ausencia de coloración significa que todas las proteínas se han extraído. Los sobrenadantes se tratan también por el método de Lowry, que es más sensible pero más largo. Una de las variantes de este método consiste en precipitar cuantitativamente en un primer momento, las proteínas por mezcla con tricloroacético o desoxicolato de sodio antes de proceder a la coloración. La ausencia de coloración muestra que todas las proteínas se han extraído. Estos dos métodos tienen la ventaja de ser relativamente rápidos y fiables, pero solo dan cuenta de la presencia o no de proteínas en el sobrenadante.

Las dos fracciones orgánicas así recogidas se colocan en recipientes estériles y esterilizados con rayos gamma 2,5 megarad y conservados a una temperatura de 3ºC.

La hidrólisis en frío, la centrifugación y la ultracentrifugacion sobre casetes en serie según el procedimiento según la invención, nos ha permitido extraer los constituyentes orgánicos insolubles y solubles de la concha de los bivalvos estudiados. Los diferentes componentes orgánicos serán caracterizados cualitativamente y cuantitativamente por los métodos analíticos habituales que serán utilizados bien sea separadamente bien sea en asociación. Estos métodos son la cromatografía analítica por intercambio ionico, que permite por reacción y derivación tomar alicuotas de las fracciones del efluente y de someterlos a una reacción específica, por ejemplo para los aminoácidos una reacción con la ninhidrina que provoca una coloración que se puede medir con la ayuda de un espectrofotómetro. Esta técnica utiliza columnas de cromatrografía que incluyen sustancias altamente polimerizadas que constituyen una red tridimensional y que llevan funciones ácidas o básicas. Estas sustancias sirven de soporte a los grupos químicos encargados de realizar este intercambio.

Estas sustancias son resinas o derivados de la celulosa o polímeros glucídicos. Se utiliza también para la separación de los aminoácidos y de las osas, la cromatografía sobre capas delgadas cuyo principio recurre al fraccionamiento por partición entre dos disolventes, otro modo de separación utilizado es la cromatrografia bajo alta presión (más de 30 bares) que utiliza el método de cromatografía en fase inversa adaptado a la separación de moléculas de bajo peso molecular, y también a la de proteínas que son macromoléculas. Este tipo de cromatografía de alta presión utiliza también columnas de intercambios de iones para la separación de aminoácidos. Se asocia a la cromatografía la electroforesis que permite también la separación de proteínas. La revelación de la presencia de proteínas se realiza gracias a colorantes (negroamida, rojo de Ponceau), existen también colorantes más específicos como el reactivo de Schiff que revela las fracciones glucídicas de las proteínas. La electroforesis de zona en gel de poliacrilamida que permite una separación según la carga y el peso molecular, la utilización de un gel de poliacrilamida en presencia de dodecilsulfato de sodio (SDS), asociado a un tratamiento con mercaptoetanol previamente a la migración de la sustancia proteica a separar, permite determinar el peso molecular, y el número de cadenas polipeptídicas que componen la proteína. Ya se han aislado, por hidrólisis ácida (HCl) en caliente, varios aminoácidos, exactamente 17.

Estos métodos de identificación aplicables a la fracción soluble de los constituyentes extraídos de Tridacne Bénitier y de Pinctada Maxima, ha permitido poner en evidencia, los aminoácidos siguientes, con su porcentaje en moles:

1

La puesta en evidencia cualitativa y cuantitativa del triptofano o sea 3,95% en moles se obtiene por hidrólisis enzimática por la tripsina bruta de 100 g de polvo de concha interna y externa de Pinctada Maxima y de Tridacne Bénitier, cuya granulometría fue de 1 micrómetro. El hidrolizado así obtenido se trata a continuación con ácido glioxílico en medio sulfúrico, la coloración violeta (reacción de Adamkiewicz), caracteriza la presencia de triptofano, confirmada igualmente por la reacción de EHRLICH (coloración azul en presencia de p-dimetilaminobenzaldehido en medio ácido).

La presencia y análisis cuantitativo de ciertos aminoácidos ha permitido por analogía poner en evidencia, la presencia de proteínas de las cuales son constituyentes, aunque estos aminoácidos existen en estado libre. Así el porcentaje elevado de glicocola (28,95) hace suponer la presencia confirmada de escleroproteínas como los colágenos de tipo I - III - IV o la elastina. La proporción elevada de Alanina (Ala) muestra que existe también bien en estado libre, bien como constituyente de una proteína. El ácido aspártico y glutámico son constituyentes importantes de las proteínas. La Lisina, Arginina e Histidina son aminoácidos de proteínas. La Lisina de fórmula general:

3

puede estar unida al ácido alfa gamma diaminobutírico que es un constituyente de ciertos antibióticos peptídicos de fórmula general:

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que hace de esta un homólogo inferior de la lisina.

Esta similitud de fórmula general explica ciertas propiedades antibiomiméticas de los constituyentes de los componentes orgánicos extraídos de la concha externa e interna de Tridacne Bénitier y de Pinctada Maxima por el procedimiento según la invención y la puesta en evidencia de S-hidroxilisina indica la presencia de colágenos igual que el de la Prolina.

Si es fácil identificar, por los métodos enumerados anteriormente, los aminoácidos y las proteínas, es más difícil identificar la presencia de glicoproteínas. Las glicoproteínas son heteroproteínas que resultan de la unión de una fracción proteínica con una o varias secuencias glucídicas, son estables al calor, solubles en disoluciones salinas cercanas a la neutralidad. Son macromoléculas de un peso molecular muy elevado. El contenido en glúcidos de estas macromoléculas es muy variable de 1% a más del 40%.

El problema de la disposición secuencial de los glúcidos en las cadenas glucídicas de las glicoproteínas hace muy difícil la resolución de estas secuencias, por esto hemos empleado una combinación de varias técnicas: químicas y enzimáticas. El enlace glúcido-polipéptido aparece en la mayoría de los casos a nivel de los residuos Seril y Treonil, por una parte, y de residuos asparaginil, por otra parte, de la cadena polipeptídica. Hemos utilizado los métodos siguientes: metilación por iodina o sulfato de metilo, acetolisis en medio anhidro que implica un corte de los enlaces osídicos, seguido de una saponificación; protocolo de la degradación secuencial de Smith, hidrólisis ácida en correlación con otros métodos, hidrólisis enzimática en metanol anhidro, hidrólisis enzimática con una aspartiglucosanimidasa y con hexosanimidasas, todos estos métodos requieren sistemas enzimáticos muy puros.

Estos métodos han puesto en evidencia la presencia de glicoproteínas en los constituyentes extraídos de la fracción orgánica de las conchas internas y externas de Tridacne Bénitier y de Pinctada Maxima, pero estas no se han sometido al análisis secuencial que permite compararlos con modelos glicoproteínicos ya conocidos. Se sabe sin embargo que las glicoproteínas están implicadas en el proceso de adhesividad y de reconocimiento celular y que las puestas en evidencia en los constituyentes orgánicos de las conchas de Tridacne Bénitier y de Pinctada Maxima, provienen de la membrana de las células del revestimiento que son fibroblastos, y que fabrican las capas internas y externas de las conchas, provienen también del tejido conjuntivo, del revestimiento, y de la matriz extra-celular que se encuentra en el liquido extra-paleal y que contiene una concentración muy elevada de macromoléculas necesarias para la edificación de la concha de estos moluscos. La reacción de Maillard indica claramente la presencia de las glicoproteínas contenidas en las conchas internas y externas de los moluscos, tales como Tridacne Bénitier y Pinctada Maxima. Esta reacción consiste en calentar muy fuertemente en medio anhidro, 100 g de constituyentes extraídos por el procedimiento según la invención: las osas presentes en las proteínas reaccionan con las funciones aminas de las proteínas solubles (-NH_{2} de la lisina, que entra en su composición). Se forma un residuo pardo muy oscuro, resultante de la condensación del o de los azúcares contenidos en la glicoproteína y las funciones aminas de las proteínas con una modificación de tipo Amadori, que conduce a productos decarboxilados y una polimerización en compuestos pardos.

La utilización de reactivos coloreados así como la utilización de enzimas específicas permite poner en evidencia en la concha interna y externa de los moluscos citados anteriormente, macromoléculas particulares que son los glicosaminoglicanos (GAG) término genérico que designa polisacáridos ácidos constituidos por cadenas lineales de residuos regularmente alternos de N-acetilhexosamina y de ácido hexurónico. Estos mucopolisacáridos están por sus estructuras próximas al ácido hialurónico, ya que están presentes en el tejido conjuntivo del revestimiento donde constituyen como el ácido hialurónico, una especie de cemento intercelular, cuya función capital es oponerse a la difusión de sustancias extrañas, como por ejemplo, agentes patógenos. Hemos utilizado para la puesta en evidencia de los glicosaminoglicanos contenidos en la concha interna y externa de los moluscos citados anteriormente, técnicas histoquímicas e inmunológicas; especialmente la coloración histoquímica con rojo de rutenio, ácido fosfotúngstico que provoca un precipitado negro en presencia de glicosaminoglicanos así como el examen al microscopio electrónico de los extractos de la concha interna y externa de los moluscos estudiados después de la incubación en un medio que contiene anticuerpos específicos que muestra un residuo filamentoso que corresponde al complejo antígeno anticuerpo. Así se puede explicar experimentalmente y por observación directa, que ciertos agentes patógenos como los vibrios, se encuentran bloqueados bien sea en el espesor de la concha interna, bien sea en el tejido conjuntivo del molusco, y que así hay inhibición de la difusión de las toxinas liberadas por este agente patógeno. De la misma forma la puesta en evidencia de hexosaminas sulfatadas, indica la presencia de glicosaminoglicanos cercanos a la condroitina sulfato, cuya importancia es capital en el proceso de formación de la concha en curso de edificación (fijación de cationes como el calcio).

Se conoce la importancia del ácido hialurónico que es el más simple de los glicosaminoglicanos y que proviene directamente de la superficie celular. Se piensa que el ácido hialurónico juega un papel en la resistencia de los tejidos a las fuerzas de compresión. Su presencia en la composición de las conchas externas e internas de los moluscos estudiados por el procedimiento según la invención, explica el valor del modulo de elasticidad de compresión (90000 N/mm^{2}) de la concha nacarada, tal como ha podido ser definida por el Laboratoire National d'Essais. Es también un glicosaminoglicano muy hidrófilo, en efecto una pequeña cantidad de GAG puede extenderse y ocupar un gran volumen. El ácido hialurónico se produce generalmente en gran cantidad en el curso de la cicatrización y sirve de lubricante en las articulaciones. Su presencia ha podido ser puesta en evidencia experimentalmente durante la perforación de la concha de los moluscos estudiados tales como Tridacne Bénitier y Pinctada Maxima: durante el proceso de reparación de la perdida de sustancia, se nota la aparición del tejido cicatricial muy precoz con elevado componente orgánico, cuyo estudio analítico ha mostrado, además de la presencia de escleroproteínas o proteínas fibrosas, de glicosaminoglicanos sulfatados y de ácido hialurónico.

A excepción del ácido hialurónico que es un glicosaminoglicano simple, existen glicosaminoglicanos que se asocian a proteínas para formar proteoglicanos. Los proteoglicanos se distinguen de otras proteínas por su naturaleza, la cantidad y la disposición de su cadena glucídica lateral. Los proteoglicanos son enormes edificios plurimoleculares cuyos núcleos proteicos, van de 10000 a más de 600000 Daltons. Los proteoglicanos son en realidad glicoproteínas muy fuertemente glicosiladas, su identificación y su clasificación es muy difícil de poner en evidencia. Sin embargo ha sido posible indirectamente por la utilización de fitohemaglutininas que se fijan sobre los glúcidos específicos llevados por las moléculas proteicas que forman una voluminosa molécula fácilmente visible al microscopio electrónico. Se piensa que los proteoglicanos juegan un papel importante en la señalización química intercelular, son capaces de asociarse in vivo e in vitro a moléculas informativas, tales como los factores de crecimiento proteicos; pueden controlar la actividad de otros tipos de proteínas secretadas tales como las enzimas, pueden igualmente asociarse al colágeno. Los proteoglicanos forman parte de la fracción soluble de los compuestos orgánicos de la concha interna y externa de Tridacne Bénitier y Pinctada Maxima. La puesta en evidencia de proteínas glicosiladas monoméricas de un peso atómico de alrededor de 40000 Daltons, que son las citoquinas se ha realizado experimentalmente. Su acción ha podido ser constatada durante fenómenos de cicatrización secundaria con una alteración de los tejidos por quemadura, esto es para la mayor parte de los factores o profactores de crecimiento, cuyo papel consiste en estimular, potenciar, reparar, inducir o inhibir, ciertos procesos químicos y biológicos.

Los métodos habituales de cromatografía, ultracentrifugación así como los ensayos específicos y colorimétricos (ensayo de Awapara, ensayo de solubilidad en los disolventes) así como las medidas cromatométricas han permitido poner en evidencia en los productos de las extracciones de las conchas externas e internas de los moluscos estudiados, la presencia de compuestos macromoleculares insolubles de un peso molecular que va de 100 a 10000 Daltons, de la familia de las melaninas que proceden de la tirosina por oxidación y que da a la fracción insoluble de los constituyentes orgánicos una coloración que va del pardo al negro. El análisis cualitativo y cuantitativo de los minerales y de los metales contenidos en la concha de los moluscos, tal como Pinctada Maxima, ha sido ya realizado. Los procedimientos de análisis idéntico aplicados a Tridacne Bénitier por el procedimiento según la invención, ha mostrado la presencia de estos mismos elementos minerales y metálicos, que son el Samario (Sm) en estado de traza, Lutecio (Lu), Zinc (Zn), Bromo (Br), Cerio (Ce), Hierro (Fe), Manganeso (Mn), Cloro (Cl), Potasio (K), Estroncio (Sr), Sodio (Na), Calcio (Ca). Ciertos átomos de metales constituyen oligoelementos, otros están asociados a proteínas para formar metaloproteínas no enzimáticas donde el metal interviene como forma de transporte o de reserva, es el caso del hierro, del cobre que está asociado a una proteína, para formar una metaloproteína que sirve de pigmento respiratorio en el molusco, es el caso del zinc, que puede ser tomado igualmente como un oligoelemento o asociado a una proteína para formar también una metaloproteína, a la cual se reconoce una función reguladora en la expresión de los
genes.

El calcio que es el elemento mineral de la concha, puede formar también una calciproteína, cuyo papel es regular la actividad enzimática. Los elementos metálicos están igualmente asociados a una proteína enzimática para formar metaloenzimas, es el caso del manganeso, hierro y zinc. Estas metaloenzimas intervienen en el mecanismo de destrucción de los superóxidos (O_{2}^{-}).

Por otra parte los metales y minerales que existen en estado libre o que pueden estar asociados a proteínas o a enzimas son aquellos cuya concentración es la más elevada.

Los métodos cromatográficos asociados a estudios de fluorescencia igualmente han puesto en evidencia pigmentos distintos de los compuestos melanínicos, que son cromoproteínas, tanto cromoproteínas porfirínicas que contienen pigmentos respiratorios o no respiratorios, como cromoproteínas no porfirínicas que contienen los mismos pigmentos. Se pueden asociar estas cromoproteínas a las metaloproteínas ya caracterizadas. Así se ha puesto en evidencia, además de las porfirinas, metaloporfirinas y carotenoides en los cuales se encuentran las tintas en el nácar de las perlas y en el ensayo nacarado.

La principal propiedad química de las porfirinas es sus aptitudes para combinarse con metales, sobre todo de la familia del hierro (hierro, cromo, manganeso, níquel, cobalto) cobre, zinc para dar origen a complejos no ionizables, que son las metaloporfirinas, cuyas propiedades son semejantes a las de las metaloenzimas y metaloproteínas no enzimáticas. La extracción de lípidos del complejo organomineral de las conchas externas e internas de los moluscos estudiados ha sido realizada por saponificación de 100 g de extractos solubles e insolubles de conchas de los moluscos estudiados, con la ayuda de un exceso de disolución alcohólica de potasa llevada a ebullición en un tubo de ensayo, la adición de éter de petróleo permite trasvasar una fase hidroalcoholica básica que es acidificada, lo que hace precipitar los ácidos grasos, estos pueden ser recogidos en el éter de petróleo por evaporación. Esta extracción ha permitido poner en evidencia sustancias liposolubles que son carotenoides que dan a la concha interna su coloración, amarilla anaranjada. Estos carotenoides de los cuales los principales son los carotenos de fórmula general C_{40}H_{56} de los que se conocen 3 isómeros, son provitaminas A.

La importancia de los elementos constitutivos ya conocidos, de las conchas internas y externas de los moluscos citados en la descripción, y estos caracterizados según el procedimiento, el conocimiento de sus propiedades químicas, biológicas y farmacodinámicas, permiten poner en práctica preparaciones dirigidas a la terapéutica, diagnóstico y cosmética tales como los ejemplos siguientes que forman parte igualmente del objetivo de la invención sin por otra parte ser limitativos.

Como ejemplo, se encontraran a continuación algunas formulaciones de base preparadas a partir de extractos de principios activos solubles e insolubles obtenidos según el procedimiento.

Ejemplo 1 Formulación para una preparación dirigida a la curación de quemaduras de primero, segundo y tercer grado

Extractos secos de principios activos solubles	0,5 g
Extractos secos de principios activos insolubles	0,5 g
Vitamina C	1 g
Vitamina B_{5}	0,5 g
Hidróxido de calcio	0,5 mg
Glucosa	4 g
Copra	0.5 g
Carbonato de calcio	1 \mug
Zinc	14,2 \mug
Cobre	15 \mug
Sodio	5 \mug
Potasio	7 \mug
Manganeso	12,3 \mug
Hierro	12 \mug
P Cresol	0,1 mg
Conservante
Vaselina c.s.p	100 g

Tal preparación se esterilizó con rayos gamma y se conservó en un embalaje estéril.

Se sabe que durante una quemadura, dos tipos de consecuencias deben ser tomadas en cuenta para apreciar el pronostico vital y funcional: la profundidad y la gravedad.

Siendo la piel un órgano en sí mismo, es de lejos el más extendido y el más pesado.

Está constituida de dos tejidos diferentes pero complementarios:

La epidermis que es la capa externa fina, flexible, constituida esencialmente de queratinocitos (97%), pero también de melanocitos y de células de Langhérans (responsable de los rechazos de los injertos). Estas células están constituidas por capas que protegen la piel de la luz, por la melanina secretada por los melanocitos y contra las agresiones traumáticas por la capa de queratina secretada por los queratinocitos.

La dermis subadyacente constituida de una red de fibras de colágeno, elastina y reticulina, fibronectina, glicosaminoglicanos y de cemento intercelular. Son los fibroblastos los que sintetizan las proteínas de estructura que la componen. La dermis está inervada y vascularizada por las terminaciones nerviosas y los vasos que provienen de la hipodermis.

La hipodermis subyacente a la dermis es una capa celulo-grasa.

La respuesta fisiológica a una agresión térmica, se traduce por un gran número de perturbaciones en casi todas las funciones del organismo, en función de la gravedad de la quemadura.

Hay primero el edema, inmediato, no solamente a nivel de la lesión sino también en los otros tejidos en caso de quemadura grave. Las causas de este edema son de tres tipos:

-

aumento de la permeabilidad capilar que es debido a la producción de histamina y de mediadores vasoactivos tales como (serotonina, bradiquinina, prostaglandinas, leucotrienos) y a la liberación de radicales oxigenados libres citotóxicos.

-

aumento de la osmolaridad que es debido a la liberación de osmoles intracelulares por la lesión térmica y a la fijación de moléculas de sodio en las fibras de colágeno.

-

aparición de una perdida plasmática debida a la evaporación tanto más importante cuanto más extensa es la quemadura.

Pero las perturbaciones más importantes son metabólicas. Es precisamente a este nivel que la preparación según el procedimiento está destinada a intervenir.

En efecto, cuando una lesión afecta el 25% de superficie quemada, se asiste a un hipermetabolismo con predominancia catabólica, con aumento de gastos energéticos, una lipolisis, una hiperglucemia y un hipercatabolismo proteídico.

Es sobre todo el "turn-over" de las proteínas que aumenta con una predominancia del catabolismo sobre el anabolismo y transferencia de aminoácidos desde los músculos hacia las vísceras.

Se observa un aumento de citoquinas y de TNF. La necrosis tisular y la muerte celular a nivel del tejido quemado, provocan una descarga en la sangre de un cierto número de factores depresores de la inmunidad. JACQUES et al., y FJELLSTROM et al., han mostrado que la proporción de fibronectina es muy baja en los grandes quemados. Casi todos los elementos figurados de la sangre están afectados (polinucleares, linfocitos, etc) todas las proteínas de la inflamación están aumentadas. La desaparición o bajada de los factores inmunitarios locales favorecen la infección. El tratamiento de estas perturbaciones metabólicas es hasta ahora general. Sobre las zonas quemadas, se aplica un apósito oclusivo que tiene por objetivo impedir la evaporación del exudado y la perdida plasmática.

La preparación dirigida a la terapéutica obtenida según el procedimiento tiene por objetivo tratar localmente la perdida proteica a nivel de la quemadura por aporte in situ de los aminoácidos esenciales de proteínas, proteoglicanos, glicoproteínas, glicosaminoglicanos, azúcares, profactores de crecimiento, oligoelementos y melanina, extraídos de la concha interna y externa del molusco.

La aplicación de la preparación sobre una lesión térmica profunda realiza no solamente un recubrimiento cutáneo, una sedación del dolor inhibiendo la producción de productos de la inflamación (bradiquinina, serotonina, histamina, etc) que sensibilizan los nocireceptores cutáneos, sino que también favorecen la regresión del hipermetabolismo. Estimula los factores locales de inmunidad celular y tisular cuya acción inhibe la proliferación microbiana y entonces la infección.

Igualmente hemos podido observar una reducción de dos tercios del tiempo de cicatrización por aumento de la proporción de proteínas del estres térmico, que protegen la síntesis del colágeno; así como una regulación del tejido de granulación con disminución del tamaño de los botones carnosos que se acompañan de un aumento de su número. Además, la disminución de la puesta en tensión de los fibroblastos impide así la formación de cicatrices queloides. Otro modo de realización consiste en una membrana biológica artificial cuya composición es la siguiente: en un soporte en malla de poliglactina de un espesor de 0,5 mm y de dimensión 20 mm por 20 mm se extiende con un espesor de 0,5 mm, la preparación siguiente:

1 mg de extractos secos de los principios activos solubles e insolubles obtenidos según el procedimiento

0,5 g de carbonato de calcio

0,1 g de hidróxido de calcio

100 mg de vitamina C

25 Uph EUR de aprotinina (DCI)

trombina

fibrinógeno

La membrana biológica se esterilizó con rayos gamma y se conservó en frío a 4ºC bajo doble embalaje estéril.

La misma formulación a la cual se añadió eugenol se utilizó en forma de ungüento para el tratamiento de la podredumbre de la horquilla del casco del caballo.

Según otro modo de realización los productos obtenidos según el procedimiento pueden entrar en la realización de una preparación para complementos alimentarios según una fórmula que es la siguiente:

- extractos secos de principios activos solubles	0,1 mg
- extractos secos de principios activos insolubles	0,1 mg
- vitamina C	200 mg
- vitamina E	1 \mug
- vitamina B	2 \mug
- cobre	1 \mug
- hierro	1 \mug
- zinc	1 \mug
- almidón c.s.p.	1 g

Los productos obtenidos según el procedimiento, igualmente pueden entrar en la composición de la preparación dirigida a cosmética en forma de gel o de crema, cuya composición es la siguiente:

- extractos secos de principios activos solubles

- extractos secos de principios activos insolubles

- agua

- glicerina

- alcohol desnaturalizado

- ácido ascórbico

- \alpha-tocoferol

- ácido cítrico

- extractos de coco

- miel

- propoles

- alginato

- metil paraben

- propil paraben

- excipiente c.s.p. 100 g

La formulación siguiente para aplicaciones ortopédicas se preparó a partir de los productos obtenidos según el procedimiento:

- extractos secos de principios activos solubles	0,5 g
- extractos secos de principios activos insolubles	0,5 g
- carbonato de calcio (granulometría 350 micrómetros)	80 g
- hidróxido de calcio (granulometría 10 micrómetros)	10 g
- ácido ascórbico	300 mg
- cobre	0,001 mg
- zinc	0,001 mg
- manganeso	0,001 mg
- vitamina E	0,001 mg

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Tal formulación se utilizó en forma de polvo en cirugía ortopédica humana y veterinaria en 10 casos, donde un nuevo crecimiento óseo fue el deseado. Se trata de fractura con ruptura ósea y perdida de sustancia ósea.

La preparación anterior se colocó a nivel de las perdidas de sustancia en forma de polvo, mezclada con sangre autóloga de manera que se obtuvo una pasta de consistencia de masilla en 5 casos. En los otros 5 casos, se colocó en forma de elementos proteicos preformados, de placas, de pastillas y de varillas. Estos elementos de formas y de dimensiones variables se obtuvieron por fundición del polvo bajo vacío, en un dispositivo, bajo una presión progresiva de 10 toneladas. Un sistema de enfriamiento por un circuito cerrado de etilenglicol mantiene la temperatura por debajo de 40ºC, de manera que no se destruya la estructura terciaria de proteínas y de otros principios activos contenidos en la preparación. En efecto, durante la compresión la temperatura se eleva de manera constante hasta pasar los
100ºC.

Las radiografías postoperatorias mostraron en todos los casos una organización y una mineralización del callo de reparación dos veces más rápida que en los animales testigos. Las biopsias practicadas a los 15 días a nivel del sitio operatorio pusieron en evidencia una proliferación de osteoblastos (células formadoras de hueso), la presencia de numerosos capilares sanguíneos testimonian una anglogénesis activa indispensable en los fenómenos de reparación, y una ausencia de osteoclastos (células destructoras de hueso) que aparecen más tardíamente para remodelar el callo óseo y armonizar los contornos.

Esta aparición precoz de osteoblastos en el sitio de reparación y la ausencia prolongada de osteoclastos, a lo sumo al principio del proceso, prueban de manera irrefutable la presencia de factores o de profactores de crecimiento, que estimulan la osteogénesis, y en consecuencia la proliferación de los osteoblastos, y de otros profactores o factores de crecimiento que inhiben la proliferación de los osteoclastos. Esta última propiedad ha sido puesta en evidencia por la experimentación siguiente: se realizaron dos cultivos de osteoclastos en dos cajas Petri en atmósfera estéril y se pusieron a incubar a 37ºC. En una, se colocó un fragmento de concha de Tridacne Bénitier y un fragmento de Pinctada Maxima, así como un fragmento óseo de origen animal, sobre el cual se espolvoreó una capa fina de extractos obtenidos según el procedimiento. En la otra caja, se colocó un fragmento óseo de origen animal, solo. Después de 3 semanas, el examen microscópico mostró que en la primera caja, ningún fragmento había experimentado alteración por los osteoclastos (ausencia de lagunas de Auschip), mientras que en la segunda caja, se notó, sobre el fragmento óseo una erosión con excavación cóncava con bordes desgarrados característicos de la acción de los osteo-
clastos.

Una variante de la formulación anterior, destinada a ser inyectada a nivel de las lesiones, se obtuvo con la adición de un gel a base de alginato.

Tal formulación se utilizó en una perdida de sustancia del casco de un caballo (grieta, hormiguero) con alcance del reborde perióplico (que asegura el nuevo crecimiento del cuerno) y puesta al desnudo de la tercera falange. La preparación según la invención se mezcló con agua desmineralizada a la cual se añadió un endurecedor hasta la obtención de una pasta que se insertó en la perdida de sustancia. La lesión se rellenó progresivamente por el cuerno formado de nuevo al final de 5 semanas. En otro caso la preparación según la invención se utilizó durante una perdida total del casco sin alcanzar el reborde perióplico. La tercera falange se recubrió enteramente con la preparación según la invención en un apósito oclusivo fijado en el tercio inferior de la bola. La restauración del casco se obtuvo en 6 semanas mientras que en la mayor parte de los casos, el animal debe ser sacrificado.

Otra formulación de las sustancias obtenidas según el procedimiento, consiste en un medio de cultivo.

En efecto, la mayor parte de los medios de cultivo contienen mezclas de macromoléculas como suero de caballo o suero de ternera fetal, así como una cantidad exacta de pequeñas moléculas tales como sales, glucosa, aminoácidos y vitaminas. Tales medios son todavía utilizados hoy en día para la mayor parte de los cultivos celulares de rutina, pero hacen difícil la determinación exacta de macromoléculas específicas necesarias para el mantenimiento y para la función normal de un tipo celular dado.

Esta dificultad ha conducido a la puesta a punto de diversos medios sin suero, de composición química conocida. Estos medios contienen diferentes proteínas específicas de las cuales las células tiene necesidad para sobrevivir y proliferar en cultivo. Estas proteínas incluyen factores de crecimiento que estimulan la proliferación celular y la transferrina que transporta el hierro a las células. Numerosas moléculas informativas extracelulares, juegan un papel vital en el desarrollo y donde la proliferación de tipos celulares específicos se han descubierto gracias al estudio de células en cultivo, y la búsqueda de nuevos factores ha sido más fácil después de que se ha dispuesto de medios de composición química definida, sin suero.

La formulación propuesta con las sustancias obtenidas según el procedimiento según la invención tiene la composición siguiente:

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- Asp (25 mg/litro)	- ClK (50 mg/litro)
- Thr (37 mg/litro)	- Cu (200 mg/litro)
- Ser (27 mg/litro)	- Mn (20 mg/litro)
- Glu (57 mg/litro)	- ClNa (100 mg/litro)
- Pro (35 mg/litro)	- Zn (20 mg/litro)
- Gly (40 mg/litro)	- Ca (50 mg/litro)
- Ala (2 mg/litro)	- Insulina (1 mg/litro)
- Cys/2 (75 mg/litro)	- Transferrina (1 mg/litro)
- Val (40 mg/litro)	- Ácido fólico (1 \mug/litro)
- Met (12 mg/litro)	- Piridoxal (2 \mug/litro)
- Ile (48 mg/litro)	- Tiamina (1 \mug/litro)
- Leu (48 mg/litro)	- Riboflavina (0,2 \mug/litro)
- Tyr (35 mg/litro)	- Vit C (1 \mug/litro)
- Phe (30 mg/litro)	- Carbonato de calcio (0,1 g/litro)
- His (35 mg/litro)	- Agua apirógena c.s.p.1 litro
- Lys (73 mg/litro)
- Arg (100 mg/litro)

La presencia de suero y de factores de crecimiento no es necesaria en tal medio, teniendo en cuenta el hecho, que los productos de extracciones contienen todos estos elementos. En el medio obtenido según el procedimiento, se han puesto en práctica, con éxito, cultivos de células óseas (osteoblastos, fibroblastos, condroblastos, melanocitos, queratinocitos).

Claims (7)

1. Procedimiento de extracción, separación e identificación, de los principios activos: proteínas, glicoproteínas, glicosaminoglicanos y proteoglicanos, contenidos en la concha de Tridacne Bénitier y Pinctada Maxima, caracterizado porque consiste en la hidrólisis a temperatura inferior a 5ºC bajo la acción del ácido acético de polvo de concha externa e interna obtenido a partir de fragmentos de conchas cortadas, asociada a la cromatografía y la electroforesis, así como a la acción de reactivos coloreados y de reacciones enzimáticas.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque, los fragmentos de concha se lavan bajo presión de 3 bares, se tratan con ultrasonidos, sin detergente durante 5 minutos, se descontaminan durante 1 hora por inmersión en una disolución de calbenio, se secan, después se colocan en boles de circonio que contienen 6 bolas de circonio de 20 mm de diámetro, y se colocan en un triturador planetario que gira alternativamente a una velocidad de 1500 revoluciones/minuto durante 2 periodos de 3 min hasta la obtención de un polvo de granulometría de 300 a 500 micrómetros que se coloca a continuación en un recipiente inerte que contiene 58% de agua apirógena, 13% de hielo triturado fabricado a partir de agua apirógena y 29% de ácido acético al 80%.

3. Procedimiento según las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque la mezcla se agita con un agitador, se mantiene a un pH inferior a 4,5 con un pHmetro acoplado a una válvula electromagnética, a una temperatura constante inferior a 5ºC y más frecuentemente cercana a 0ºC gracias a un circuito cerrado en el cual circula polietilenglicol, siendo la disolución filtrada sobre un tamiz y centrifugada a una fuerza de 18000 G; el sedimento así obtenido se lava en ácido acético al 5%, después se centrifuga de nuevo a una fuerza de 18000 G antes de recuperarlo en agua apirógena a un pH 7 obtenido por adición de sosa 2,5 N y enfriado por el mismo dispositivo refrigerante; a continuación la disolución se agita durante 1 hora, después se centrifuga de nuevo a 18000 G.

4. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el sedimento se recupera en agua apirógena bajo agitación constante, se centrifuga a 18000 G, después se seca por liofilización en frío y se tritura con una granulometría de 0,2 a 0,5 micrómetros.

5. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque los líquidos sobrenadantes recuperados se filtran sobre filtro de tela, después se desalan por paso bajo presión de 9 bares, sobre una batería de 17 casetes de ósmosis tangencial de 1 kg Dalton y de 0,5 m^{2} cada una montadas en serie, y después se diluyen y filtran 6 veces consecutivas en agua apirógena.

6. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque, en el curso de la penúltima dilución el pH de la disolución se lleva a pH 7 por adición de sosa 2,5 N, se concentra en rotavapor bajo vacío a menos 40ºC, se liofiliza en frío, siendo el extracto así obtenido triturado con mortero con una granulometría de 0,2 a 0,5 micrómetros.

7. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque las proteínas, aminoácidos, glicoproteínas, glicosaminoglicanos y proteoglicanos extraídos de la concha de Tridacne Bénitier y de Pinctada Maxima, se separan por cromatografía y electroforesis y se identifican con reactivos coloreados y reacciones enzimáticas específicas.