WO1999046388A1 - Enzyme d'acide nucleique ayant une activite de clivage d'arn allosterique sur un arn cible - Google Patents

Enzyme d'acide nucleique ayant une activite de clivage d'arn allosterique sur un arn cible Download PDF

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WO1999046388A1
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nucleic acid
abl
rna
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Kazunari Taira
Tomoko Kuwabara
Akio Hitoshio
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Taisho Pharmaceutical Co., Ltd.
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    • C12N2310/12—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes
    • C12N2310/121—Hammerhead

Definitions

  • the present invention relates to a nucleic acid enzyme and its use, and more particularly, to a nucleic acid enzyme exhibiting an allosteric RNA cleavage activity for target RNA and its use.
  • ribozyme ribozyme acid: ribonucleotide acid + enzyme
  • RNA having a catalytic function was found. Since then, various ribozymes have been discovered (RHSymons, Trend. Biochem. Sci., 14, 445-450 (1989); RH Symbols, A. Rev. Biochem., 61, 641-671 (1992); J Bratty, P. Chartrand, G. Fer beyre, R. Cedergren, Biochim. Biophys. Acta, 1216, 345-359 (1993); Haseho ff.
  • the hammerhead ribozyme is one of the best studied ribozymes to date. This is a ribozyme that functions as a self-cleaving reaction (cis type) in nature (TRCech, Annu. Rev. Biochem., 59, 543 (1990); ACFoster, RHSymons, Cell, 49). , 211 (1987); ACJeffries, RH Sy Awakes, Nucleic Acids Res., 17, 1371 (1989)), Uhlenbeck et al., Haseloff, and Gerlach et al. Region (trans.) (0. Uhlenbeck, Nature, 328, 596 (1987); J.
  • Ribozymes bind to substrate RNA by forming complementary base pairs with the substrate. Thereafter, cleavage of the substrate RNA molecule occurs in the presence of magnesium, which is essential for the reaction. Substrate recognition is determined by the substrate binding regions of both Steml and Stemlll.
  • the ribozyme has very high substrate specificity because it is formed by forming the appropriate base pairs with the corresponding substrate sequence. If the substrate specificity is very high, there are few side effects in cells, which is a great advantage when ribozyme is used as a gene expression inhibitor.
  • the ribozyme When attempting to suppress the expression of such a gene using a conventional hammerhead ribozyme, the ribozyme can be cleaved at the junction site of exon exon 3 which is a sequence portion specific to abnormal mRNA. If you have a GUC triplet with an unusual sequence (generally NUX (N; A, G, C, UX; A, C, U)), no problem occurs. Fortunately, however, ribozyme cleavage sequences are rarely found at or near junctions. If there is no cleavable sequence at the junction site, the only choice is to target the cleavage sequence at a site distant from the junction site.
  • the sequence of the cleavage site itself far from the junction, is present in both normal and abnormal mRNAs. In the end, it is inevitable that nonspecific cleavage of normal mRNA will occur. Even if there is a ribozyme cleavage sequence NUX sequence at or near the junction site, it is a triplet (GUC triplet) of a sequence that can be efficiently cleaved by a hammerhead ribozyme. The probability is even lower. Therefore, even in such a case, it was difficult to construct a ribozyme with extremely high specificity while maintaining high cleavage activity.
  • a well-known example of this particular chimeric mRNA causing disease is the formation of the Philadelphia chromosome, which causes CML (chronic myeloid leukemia) and ALL (acute lymphocytic leukemia).
  • CML chronic myeloid leukemia
  • ALL acute lymphocytic leukemia
  • a chromosome reciprocal translocation t (9; 22) q34; qll
  • K28 junction and L6 transcript two types of chromosomal translocation
  • K28 transcript and L6 transcript generate two types of BCR-ABL fusion genes, which ultimately result in two chimeric mRNAs.
  • K28 junction (b3a2) mRNA and L6 junction (b2a2) mRNA are generated as a result of splicing (K28 junction (b3a2) mRNA and L6 junction (b2a2) mRNA).
  • GUI triplet a sequence (GUU triplet) that can cleave a hammerhead ribozyme near the BCR-ABL junction site (K28 jankushiyon (b3a2) mRNA), but another type of mRNA has a junction site. There is no prominent cleavage sequence in the vicinity of (L6 junction (b2a2) mRNA). Therefore, conventional hammerhead ribozymes cannot specifically inhibit expression of the latter mRNA.
  • Abnormal protein from L6mRNA that have been reported to date - attempt to inhibit at Ribozaimu expression (p210 BCR AB L) is added a long antisense portion to the hammer first head type Ribozaimu, complementary it to the junction site Most of them try to obtain the specificity of the cut by binding to.
  • the substrate-binding portion of the ribozyme becomes longer due to the addition of the longer antisense moiety, the step of dissociating from the substrate once the ribozyme has bound to the substrate becomes very slow. As a result, the enzyme cannot be turned over and the cutting efficiency is reduced. Furthermore, the substrate specificity we tried to obtain was not as high as we expected.
  • nucleic acid enzyme that exhibits an allosteric cleavage activity on a substrate.
  • Another object of the present invention is to provide an expression vector containing a DNA encoding the nucleic acid enzyme.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising, as an active ingredient, an expression vector containing the nucleic acid enzyme or a DNA encoding the nucleic acid enzyme. I do.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for producing and using the nucleic acid enzyme. Disclosure of the invention
  • the present invention has been completed by constructing a nucleic acid enzyme (ribozyme) capable of binding to an efficient cleavage sequence far away from, and cleaving a substrate after the cleavage sequence. That is, the present invention provides a nucleic acid enzyme having an allosteric RNA cleavage activity for a target RNA.
  • the nucleic acid enzyme of the present invention preferably has a dimer structure formed by an RNA molecule containing the following nucleotide sequence (10) and an RNA molecule containing the following nucleotide sequence (20).
  • x ⁇ x ⁇ X 2 , ⁇ X 2 k , ⁇ ⁇ ⁇ 'Y 2 !- ⁇ ZZ ⁇ and ⁇ ⁇ are each independently A, U, T, C or G Yes,
  • h and k are integers of 1 or more (for example, integers from 1 to 100);
  • i and m are integers of 1 or more (for example, integers from 1 to 100),
  • j is an integer of 1 or more (for example, an integer from 1 to 100),
  • n is an integer of 1 or more (for example, an integer of 1 to 100).
  • X 1 ,... X and X 2 ,... X 2 k are nucleotide sequences complementary to a specific sequence in the target RNA;
  • Z 2 i ⁇ ⁇ 2 ⁇ are regions that are complementary to the sequence around the cleavage site of the target RNA and regions that can form cavities that capture Mg 2+ ions only in the presence of the target RNA. Is a nucleotide sequence containing )
  • Target RNAs include chimeric mRNAs that cause disease.
  • the chimeric mRNA may be of a L6 (b2a2) chimeric mRNA that causes chronic myeloid leukemia t
  • the nucleic acid enzyme of the present invention may have, for example, a dimer structure formed by an RNA molecule containing the following nucleotide sequence (1) and an RNA molecule containing the following nucleotide sequence (2).
  • the 21st to 29th nucleotides of the nucleotide sequence (1) and the 17th to 31st nucleotides of the nucleotide sequence (2) are complementary to the sequence around the cleavage site of the target RNA It may be modified as follows.
  • a linker sequence and a tRNAVa1 promoter sequence may be added upstream of each of the nucleotide sequences (1) and (2).
  • the linker sequence added upstream of the nucleotide sequence (1) contains the following nucleotide sequence (3), and the linker sequence added upstream of the nucleotide sequence (2) is the following nucleotide sequence (4) Should be included.
  • tRNA Val promoter sequence added upstream of each of the nucleotide sequences (1) and (2) may include the following nucleotide sequence (5).
  • an additional sequence and a terminal sequence may be added downstream of each of the nucleotide sequences (1) and (2).
  • the additional sequence added downstream of the nucleotide sequence (1) includes the following nucleotide sequence (6)
  • the additional sequence added downstream of the nucleotide sequence (2) includes the following nucleotide sequence (7)
  • the terminator sequence added downstream of each of the nucleotide sequences (1) and (2) may include the following nucleotide sequence (8).
  • the target RNA may be an abnormal mRNA that causes a disease.
  • This abnormal form of mRNA examples include abnormal mRNAs that cause HIV (AIDS), acute lymphocytic leukemia, acute promyelocytic leukemia, and the like.
  • the present invention also provides an expression vector containing a DNA encoding the nucleic acid enzyme.
  • the present invention provides the above-mentioned method for producing a nucleic acid enzyme, wherein the method is characterized in that expression vector DNA containing a DNA encoding the nucleic acid enzyme is transcribed into RNA and the RNA is transcribed into RNA. .
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising, as an active ingredient, an expression vector containing the nucleic acid enzyme or a DNA encoding the nucleic acid enzyme.
  • the pharmaceutical composition may be for preventing and treating or treating a disease caused by the target RNA.
  • Diseases caused by target RNA include diseases caused by Philadelphia chromosomal abnormalities, such as chronic myeloid leukemia.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be used, for example, to suppress or inhibit the expression of chimeric mRNA or abnormal mRNA that causes disease by expressing the nucleic acid enzyme in vivo. it can.
  • the present invention provides a method for specifically cleaving target RNA using the above-described nucleic acid enzyme.
  • the target RNA may be a disease-causing chimeric mRNA. Diseases include those caused by Philadelphia chromosomal abnormalities, such as chronic myeloid leukemia. Alternatively, the target RNA may be an abnormal mRNA that causes a disease. Such diseases include HIV (AIDS), acute lymphocytic leukemia, acute promyelocytic leukemia, and the like.
  • hammerhead ribozymes Before we talk about minizymes, we will first briefly describe hammerhead ribozymes.
  • the hammerhead ribozyme was named after its RNA secondary structure resembling the shape of a Kanazuchi head (hammerhead) (Hasehoff. J and WL Gerlach, Nature, 334, 585-591). (1988); CJ Hutchins, PD Rathjen, A. Forster, RHSymons, Nucleic Acids. Res., 14, 3627-3640 (1986)).
  • Extensive research has been carried out in both basic and applied fields, and it is a representative ribozyme with RNA strand cleavage activity.
  • RNA was found to be self-cleaving from the replication process in single-stranded circular RNA that is not infectious, and in satellite RNA that infects plants with the help of viroids.
  • a highly homologous secondary structure that is, a hammerhead structure was found (Haseho ff. J and WL Gerlach, Nature, 334, 585-591).
  • a hammer-head ribozyme is formed from an antisense region that recognizes and binds to substrate RNA, an active center region consisting of a loop (hole) in the immediate vicinity, and a stem-1 oopll region attached to the loop.
  • an active center region consisting of a loop (hole) in the immediate vicinity
  • a stem-1 oopll region attached to the loop.
  • the triplet with the highest cleavage efficiency is a sequence called GUC, and this GUC is often described as a ribozyme cleavage sequence.
  • the sequence of the antisense region that complementarily binds to the substrate can be freely set according to the base sequence of the substrate.
  • the riboribozyme can cut any RNA sequence in a site-specific manner. As a result, it has become possible to apply it to gene therapy as a specific gene expression inhibitor.
  • ribozyme can be said to be "molecule scissors” that can freely cut the "target RNA chain”.
  • divalent cations such as magnesium ions are essential for the RNA-cleaving activity of the hammerhead ribozyme described above. This magnesium ion is also required for the ribozyme to form an active structure, but its involvement in the detailed reaction mechanism is not fully understood. However, the results of experiments so far have revealed that magnesium ions are actually cutting the RNA chain, and ribozymes merely provide a scaffold for metal ions (SC Dahm, WB Derrick, 0. C. Uhlenbeck, Biochemistry 32, 13040 (1993); JAPiccirilli, JSVyle, Nature 361, 85 (1993); Michael.
  • ribozyme is a metalloenzyme.
  • the region that is considered to actually provide the scaffold is the loop portion near the cleavage site among the several regions that form the hammerhead ribozyme mentioned earlier, and captures this metal ion.
  • the region other than the loop is possible.
  • FIG. 2 shows the construction process of the dimer minizyme. With reference to this figure, the construction process of the mini-zyme and the dimer mini-zyme will be described.
  • the minizyme is a miniaturized hammer-head ribozyme.
  • This miniaturization has usually been achieved by replacing the stem-loopl I region of the hammer-head ribozyme consisting of the antisense region (steml and stemIII), the active center region and the stem-loopll region with a short linker.
  • the stem-loopll region was deleted. This was done to determine how each region of the hammerhead ribozyme plays a role in cleavage activity. As a result, it was revealed that the cleavage activity was significantly reduced when the stem-loopl I region was completely deleted.
  • MzL minizym Left
  • MzR minizyme Right
  • heterozygous molecules MzL and MzR each having a different sequence, combine to form a dimer as shown in FIG. Please look at the upper side and the lower side from the dotted line in this figure.
  • a metalloenzyme the active center region, which serves as a scaffold for capturing magnesium ions required for cleavage activity, and the substrate binding region, which determines where in the substrate RNA sequence is to be cut, are independent of each other. Notice that there is one by one. It was speculated that the dimer-type minizyme could simultaneously bind to one substrate in two places and cleave the substrate after the two NUX triplets.
  • the advantage of this construction is, of course, one that the substrate cleavage efficiency is higher than that of a conventional ribozyme that has only one cleavage site.
  • one of the substrate binding region of dimer first mold Minizaimu is very easy to bond the substrate (i.e., is sufficiently low k m values of binding of the substrate and Ribozaimu) If set to an array, and the other cleavage site Ribozaimu there outside GUC, be indicated even higher k n value (i.e., less likely to stick the substrate, even unstable sequences), can capable of cutting efficiently two places as long as selecting a high triplet of k cat values Have sex.
  • the binding between the other substrate-binding domain and the substrate is a reaction in the same molecule. Therefore, the collision probability is much higher than that between molecules.
  • the dimer-type minizyme has an active center region and a substrate binding region because of its dimer structure. It has two zones. Therefore, one substrate binding region binds to the abnormal BCR-ABL chimeric mRNA junction site, and the other substrate binding region becomes the most efficient cleavage sequence far away from the junction. It is possible to construct a system that binds and cleaves the substrate after its (GUC) triplet
  • one of the substrate-binding domains acts as an "eye” that recognizes an abnormal type of substrate
  • the other substrate-binding domain acts as an "actual” arm of the ribozyme that cleaves the substrate.
  • the side that recognizes and specifically binds to abnormal mRNA does not necessarily cleave the substrate.
  • the sequence of the active center region, which provides a scaffold for capturing metal ions, required for RNA strand cleavage can be deleted.
  • maxizyme maxi zyme
  • maximumzyme means minimized, active, x-shaped, x-shaped, heterodimeric, and ⁇ ntel 1 igent (intelligent, allosterically controlled) (Possible) means ribozyme.
  • FIG. 5 shows a maxim designed to actually cleave the BCR-ABL chimera mRNA specifically.
  • the active dimer structure is formed only when the target BCR-ABL chimera mRNA and the substrate binding region at the two key sites of the dimer type 1 minizyme are correctly bound (see figure). 5 displayed in the middle). In the presence of non-targeted normal ABL mRNA, it is designed so that only inactive structures can be formed.
  • the normal ABL mRNA sequence arrives at the substrate binding region on the side that recognizes the junction, it adopts an inactive structure (the structure shown at the top in the lower part of Fig. 5). You can see that the structure of the active center that captures the magnesium ion, which is essential for the cleavage activity of the hammerhead ribozyme, is collapsed, unlike the one shown in the activated dimer structure. As a result, non-specific cleavage of normal ABL mRNA by the dimer type 1 minizyme does not occur.
  • the binding substrate may be both normal ABL mRNA and BCR-ABL chimeric mRNA.
  • the sequence of the target BCR-ABL chimeric mRNA is present in the other substrate binding region, a structure in which the active site is closed as shown in the figure is formed (the structure shown in the lower part of the lower part of FIG. 5).
  • the magnesium ion which is essential for the cleavage, cannot be captured, so that the cleavage does not occur.
  • CML chronic myeloid leukemia
  • B3a2 (comprising BCR exon 3 and ABL exon 2)
  • b2a2 (comprising BCR exon 2 and ABL exon 2)
  • Both of these mRNAs are translated into a 210 kDa protein (p210 BCR - ABL ).
  • a hammerhead ribozyme designed by conventional methods could be expected to specifically cleave abnormal mRNAs resulting from the K28 translocation.
  • truncations have been reported (Shore et al., 1993; Snyder et al., 1993; Lange et al., 1993, 1994; Wright et al., 1993; Kearney et al., 1995; Leopold et al., 1995; Kronenwett et al., 1996).
  • L6 BCR-ABL (b2a2) mRNA Previous attempts to cleave L6 BCR-ABL (b2a2) mRNA required a combination of long antisense arms and ribozyme sequences (Pachuk et al., 1994; James et al., 1996).
  • An antisense sequence of about 10 to 30 nucleotides which has the potential to bind to the junction region and cover it a small distance beyond the cleavage site, is ligated to one of the substrate binding sites of the hammerhead ribozyme.
  • the length of the annealing arm is important for the activity of the ribozyme. Because its length affects both the efficiency and specificity of the cleavage reaction.
  • the maxizim of the present invention is a method for deprotection, desalting, and PAGE purification of RNA chemically synthesized using a DNA / RNA synthesizer (model 394; Applied Biosystems, Division of Perkin Elmer Co. (ABI), Foster City, CA). By doing so, it can be manufactured.
  • the cleavage activity and substrate specificity of this maximyme can be evaluated as follows.
  • Aberrant BCR- ABL mRNA (120mer) is prepared those labeled with two substrate RNA with a radioisotope (32 P) of the normal type ABL mRNA (92mer). Mix this with maxima and magnesium ions in Tris-HCl (pH 8.0) buffer and react at 37 ° C. After the reaction, the reaction mixture is separated by PAGE, and the presence or absence of cleavage is detected with a BAS2000 image analyzer, and the evaluation that BCR-ABL mRNA is specifically cut without cutting ABL mRNA is evaluated.
  • the expression vector containing the DNA encoding the ribozyme of the present invention is obtained by linking the promoter, terminator sequence, and maximimim sequence of RNA polymerase III (tRNA val -MzL, tRNA val -MzR) to pUC19 (Takara ), PGREEN LANTERN (manufactured by Lifetec Quality), pHaMDR (HUMAN GENE THERAPY 6: 905-915 (July 1995)) and the like.
  • the expression vector prepared as described above can be introduced into cells as follows.
  • the cell surface is negatively charged. Therefore, a complex is formed between the desired vector (DNA double-stranded circular plasmid) and a cationic lipid (lipofection reagent (lipofectin, etc.)) and is introduced into cells.
  • desired vector DNA double-stranded circular plasmid
  • a cationic lipid lipofection reagent (lipofectin, etc.)
  • RNA sequences that have therapeutic effects are transcribed from vector DNA introduced into cells by the action of RNA polymerase III, which originally functions in cells. As a result, ribozymes are expressed with high expression power.
  • a promoter sequence is required upstream of the ribozyme sequence.
  • the tRNA val sequence is an extra sequence in this expression system. (Promoter sequence other than the ribozyme part).
  • an expression vector for maxizyme was actually constructed, and the ribozyme component expressed from this vector is a short-chain linker downstream of the tRNA val sequence.
  • FIG. 6 shows that the sequences of the maxims are connected via a link. Looking at this figure, tRNA It was anticipated that the val sequence could be a very steric hindrance to maximizer. The maxim is based on MzL and MzR sequences (MzL: Minizim Left, MzR
  • Mini-Zim 'Light One of each of the two dimer components that form the maximizer (see activated dimer structure in Figure 5). The region underlined in Fig. 6) forms a base pair at the stem portion, and the first dimer-type structure is formed, and the cleavage activity is expressed. Before each of the MzL and MzR sequences, an extra tRNA val sequence with a chain length more than 5 times that of the MzL and MzR sequences was added, so there was a possibility that dimers would not form due to steric hindrance.
  • cleavage component BCR-ABL mRNA did not occur because only one of the maximization components, tRNA val -MzL and tRNA val -MzR, could not form a dimer-like structure capable of having activity.
  • a maximizer which may have a linker sequence and a promoter sequence upstream of the ribozyme sequence and a terminator sequence downstream thereof, uses a T7-based enzyme to convert the DNA encoding the above sequence into It can also be manufactured by transferring it to
  • L6 (b2a2) chimera-type mRNA that causes chronic myeloid leukemia can be specifically cleaved.
  • An example of the method is described below.
  • Maximaim has two substrate binding regions.
  • Specific to L6 (b2a2) chimeric mRNA on one side Cleavable GUC triplets that bind to specific junction sites, while being distant (45 residues) apart, can be specifically cleaved in the presence of magnesium ions.
  • the expression of p210 BCR — ABL from BCR-ABL mRNA can be inhibited without affecting the normal mRNA at all.
  • the maxizyme of the present invention can be used as a medicament, in particular, a medicament for preventing and / or treating a disease in which a Philadelphia chromosomal abnormality occurs.
  • RNA polymerase III RNA polymerase III
  • maizezyme RNA is chemically modified, and RNA that has resistance to in vivo ribonuclease is transferred into cells using a carrier (cationic lipid, ribosome, etc.). May be introduced.
  • a carrier cationic lipid, ribosome, etc.
  • Figure 1 shows the secondary structure of a hammerhead ribozyme.
  • Figure 2 shows the process of constructing the dimer type mini-zyme.
  • Figure 3 shows the secondary structure of the heterodimer minizyme.
  • FIG. 4 shows the structure and action of the dimer minizyme and maximize targeting the BCR-ABL chimeric mRNA.
  • Y and Y form a stem, and X recognizes a specific sequence in the target RNA.
  • FIG. 5 shows the sequence near the junction of BCR-ABL quinula mRNA and normal ABL mRNA, the secondary structure of an active maximizer, and the secondary structure of an inactive maximizer.
  • FIG. 6 shows the secondary structure of Maximaim to which the tRNA val sequence was added. It was added tR NA va l sequence as not to destroy only possible secondary structure of the case MZL, only MzR sequence shown in dotted in the frame (partial array of Makishizaimu shown underlined).
  • FIG. 7 shows the cleavage activity of a maximizer targeting a BCR-ABL chimeric mRNA with or without a tRNA val sequence.
  • FIG. 8 shows the velocity parameters of a maximizer targeting a BCR-ABL chimeric mRNA with or without a tRNA val sequence.
  • FIG. 9 shows BCR-ABL translocation and fusion mRNA.
  • the two types of chromosomal translocations associated with chronic myeloid leukemia [K28 (upper panel) and L6 (lower panel)] and their corresponding fusion mRNAs are shown.
  • White squares represent BCR exons and black squares represent ABL exons 2.
  • the dotted line connecting the BCR exon and the ABL exon indicates an alternative splicing pathway.
  • the hammerhead ribozyme-cleavable triplet sequence is absent close to the BCR-ABdin 'yanksion.
  • the GUC triplet which is generally the most susceptible to cleavage by a hammerhead ribozyme, is located 45 nucleotides from the junction. If such a triplet is selected as a cleavage site by the ribozyme, normal ABL mRNA that shares part of the abnormal BCR-ABL RNA sequence will also be cleaved by the ribozyme and harm the host cell. Yes (lower panel). nts represents a nucleotide.
  • FIG. 10 shows the nucleotide sequences of conventional hammerhead ribozymes and antisense-added ribozymes.
  • the sequence of L6 BCR-ABL mRNA near the junction is expanded.
  • the cleavage sites of the antisense addition ribozyme (asRz81 and asRz52) and the control ribozyme (wtRz) are shown.
  • the cleavage site by Maxima is the same as that by wtRz.
  • the recognition site of Maxima is indicated by an arrow.
  • FIG. 11 shows the secondary structures of active and inactive maxizim.
  • maxizim In order to achieve high substrate specificity, maxizim must adopt an active conformation only in the presence of the abnormal BCR-ABL junction (upper panel). On the other hand, in the presence of normal ABL mRNA or in the absence of the BCR-AB junction (lower panel), the conformation must remain inactive.
  • MzL and MzR as described above, depend on the presence or absence of aberrant b2a2 mRNA. It must allow conformational changes to occur.
  • FIG. 12 shows allosteric control of maximizim activity in vitro.
  • S16 short 16-mer substrate
  • ABL20 normal type ABL sequences
  • the specificity of maxizim-mediated cleavage was examined by incubating in the presence of a BCR-ABL sequence (BCR-ABL 28-mer)) or a short 28-mer BCR-ABL sequence.
  • the M z L and Roh or M z R at a concentration of 0. 1 mu Micromax, and incubated with substrate labeled at the 5 'end of the 2 Itamyu at 3 2 ⁇ (S16).
  • an effector (20-mer ABL or 28-mer BCR-ABL) was used, its concentration was 1.
  • FIG. 13 shows an Assay system for measuring the activity of tRNA Val -enzyme in HeLa cells.
  • 1 4 is a chimeric BCR-ABL-Lucifera t RNA Va and against Ichize gene and ABL-luciferase gene shows the effect of enzyme.
  • the luciferase activity was standardized with reference to the transfection efficiency measured by monitoring the activity of the co-transformed 3-galactosidase gene (see “Experimental Methods” in Example 7).
  • FIG. 15 schematically shows the dependence of BaF3 cells and transduced BaF3 cells expressing human L6 BCR-ABL mRNA on IL-3.
  • FIG. 16 shows the course of MzL transcript transport to the cytoplasm.
  • N represents the nuclear fraction and C represents the cytoplasmic fraction.
  • FIG. 17 shows the steady-state levels of expressed tRNA Val -enzymes and their localization.
  • N represents the nuclear fraction and C represents the cytoplasmic fraction.
  • FIG. 18 shows the results of measuring the survival rates of BaF3 / p210 BCR - ABL cells and H9 cells transduced with tRNA Va and enzymatically. Viability of BV173 cells expressing tRNA Val -enzyme is also shown.
  • FIG. 19 shows the morphology of BaF3 / p210 B (: R — cells and H9 cells transduced with tRNA Val -enzyme.
  • FIG. 20 shows the results of direct detection of L6 BCR-ABL mRNA cleavage products in BaF3 / p210 BCR — ABL cells by Northern blot analysis.
  • FIG. 21 shows the results of immunoblot analysis using the 32-kDa precursor of caspase-3 (procaspase-3) and the antibody aCPP32 that recognizes caspase-3 itself. After specific killing of the p210 BCR - ABL protein by Maximaim, cleavage of the inactive procaspase-3 resulted in active caspase-3.
  • Figure 22 shows pre-dissection of mice injected with tumor cells without maxizyme (control; Mz (-)) and mice injected with tumor cells with maxizyme (Maxizim; Mz (+)). It is a photograph.
  • Figure 23 shows photographs of the spleen of mice injected with tumor cells without maxizim (control; Mz (-)) and mice injected with tumor cells injected with maxizyme (maxizim; Mz (+)). It is.
  • Fig. 24 shows lymph around the thymus of mice injected with tumor cells without maxizim (control; Mz (-)) and mice injected with tumor cells with maxizyme (maxizim; Mz (+)). It is a photograph of a section.
  • Fig. 25 shows photographs of the bone marrow of mice injected with tumor cells without maxizim (control; Mz (-)) and mice injected with tumor cells injected with maxizyme (maxizim; Mz (+)). It is. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • RNA of the desired length was isolated by 20% denaturing PAGE.
  • DNA sequence of tRNA val -MzL, tRNA val -MzR (sequence of tRNA val -MzL, tRM va '-MzR in Fig. 6)
  • sequence of the T7 RNA polymerase promoter sequence 5′TAATACGACTCACTATA3 ′ (SEQ ID NO: 4) and GGG were added.
  • T7 RNA polymerase buffer T7 RNA polymerase
  • type I DNA NTP
  • T7 RNA polymerase buffer T7 RNA polymerase
  • type I DNA NTP
  • RNA of the desired length was isolated and purified by 5-8% denaturing PAGE.
  • a BCR-ABL substrate containing a BCR-ABL junction serving as a substrate, and an ABL substrate having a normal ABL exon ABL exon 2 junction sequence as a comparison were prepared. These substrates were labeled at the 5 'end with 32 P radioisotope. The labeled substrate and ribozyme were mixed as follows (in a test tube).
  • the reaction product (which was cleaved to a shorter chain length) was detected by 8-20% denaturing PAGE. Since maxizim only cleaves the BCR-ABL substrate, no cleavage product was detected from the ABL substrate, and only when the BCR-ABL substrate was added, the cleavage product was detected (Fig. 7).
  • RNA 16mer containing GUC triplet RNA 16mer containing GUC triplet
  • 20-mer pseudosubstrate containing a sequence near the BCR-ABL junction site were prepared.
  • S16 was labeled with 32 P, mixed with an excess of enzyme (maximizim) (single turnover), 25 mM MgCi 2 , and 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), and the cleavage reaction was performed at 37 ° C.
  • the initial velocity was observed and plotted on the Eadie-Hofstee plot to detect the rate constants k cat , k d pp ).
  • Fig. 8 shows the results.
  • tRNA val -MzL In Hela cells (obtained from National Institute of Infectious Institute), tRNA val -MzL, tRNA val by Ripofuekushiyon method - Create MzL / pUCdt, tRNA val -M zR / pUCdt, - vector one tRNA that incorporate DNA sequences of MzR val it was introduced into cells by Northern hybrida I peptidase one Chillon experiment, stable both tRNA va '-MzL, tRNA val - was confirmed that MzR RNA is highly expressed.
  • the plasmid pUCdt containing tRNA val in commercially available pUC119 is cleaved with the restriction enzymes Csp45I and Sail, and the DNA sequence of MzL and tRNA val -MzR in tRNA va is cleaved with Cs p45I and Sal I. the fragments were ligated with DNA Ligase, to create both vector one MZL / pUCdt and tRNA v al -MzR / pUCdt the tRNA va.
  • the vector was transfected (lipofection method) into cells using lipofectin (sold by Gibco-BRL), and the total RNA expressed in the cells was extracted from the cells cultured for 36 hours. Northern hybridization was performed using the RNA extracted from the cells, and the expression of minizyme in cells was detected using DNA having a sequence complementary to the MzL and MzR sequences as a probe.
  • Tris-HCl pH 8.0
  • the substrate was labeled with [ ⁇ - 32 P] -ATP using T4 polynucleotide kinase (Takara Shuzo, Kyoto, Japan).
  • Plasmid pABL-luc contained a 300 nucleotide sequence encompassing the junction between exon 1 and exon 2 of normal ABL mRNA. After transiently expressing both genes in each cell lysate, we estimated the intracellular activity of each enzyme by measuring luciferase activity.
  • the tRNA Val -enzyme expression vector shown in Fig. 13 was used as a DNA gun type for PCR to construct a DNA type I for transcription. Primers were synthesized for each type III and the sense strand contained the T7 promoter. T7 transcription and sperm in vitro was performed as described in the literature (Kuwabara et al., 1996).
  • Luciferase activity was measured using the PicaGene Kit (Toyo Ink, Tokyo, Japan) as described in the literature (Koseki et al., 1998).
  • To standardize the effect of transfection with reference to the activity of 3-galactosidase cells were transfected simultaneously using pSV- / 3-galactosidase control vector (Promega, Madison, WI). did.
  • the luminescence; the chemiluminescence signal by 3-galactosidase was quantified using the 9-galactosidase gene reporter system (C1 ontech, Palo Alto, CA) according to the method of Koseki et al. (Koseki et al. , 1998).
  • the luciferase activity recorded when the target gene expression plasmid (pB2A2-luc or pABL-luc) was used was set to 100% (Fig. 14).
  • the novel maxizyme (PV-MzL / R) was extremely effective at suppressing BCR-ABL-luciferase gene in cell culture (> 95% suppression) ( Figure 14, right) Panel). This maximim had no inhibitory effect on the expression of the ABL-luciferase gene (Fig. 14, left panel). This indicates the extremely high specificity of the maximizer.
  • Example 8 BaF3 cell line expressing human L6 BCR-ABL m RNA (BaF3 / p210 BCR - AB), and t RNA Va to the Makishizaimu to Ribozaimu or t RNA Va transduced BaF3 / p210 BGR - dishes and Generation of stable transformants of H9 cell line
  • This cell line differs from the cell line previously used by Daley and Baltimore (1988) and Choo et al. (1994) (BaF3 + p210 cells expressing K28 b3a2 mRNA). Should be emphasized.
  • the parental BaF3 cell line is an interleukin-3 (IL-3) -dependent hematopoietic cell line (Daley and Baltimore, 1988; left panel in Figure 15), but the transformed BaF3 / p210 BCR - ABL has p210 B (: R - ABL was IL-3 independent due to the tyrosine kinase activity of the ABL .
  • IL-3 interleukin-3
  • BaF3 / p210 BCR -cells were transfected separately using ( Figure 13). All of these plasmids encoded the puromycin resistance gene.
  • BaF3 / p210 Bt R stably transduced with tRNA Val , wt Rz or maximyz constructs—To generate cells, 24 hours after transfection, 10% FCS and 3 g / ml The RPMI medium supplemented with euromycin was replaced. The transduced cells were cultured for an additional 60 hours, and then IL-3 was removed from the medium to access apoptosis (see below; results are shown in FIGS. 18-21).
  • H9 cells carrying the maximimim or ribozyme constructs were generated using each of the above plasmids. Due to the very low efficiency of transfection, we generated transduced cells using a retroviral producer cell line (B0SC23 cells). The supernatant of B0SC23 cells transfected with the plasmids pV, pVwtRz or pV-MzL / R was filtered and added to H9 cells. The H9 cells were cultured for 72 hours, and then puromycin was added for selection of resistant cells. Various systems of transduced cells have allowed us to examine the activity and specificity of maxizim and ribozyme against endogenous target genes (as opposed to reporter constructs).
  • BaF3 cells grown in the presence of WEHI conditioned medium as a source of IL-3 were retrovirus-infected to obtain cells stably expressing human L6 BCR-ABL mRNA.
  • a retroviral stock lacking a helper in B0SC23 cells harboring the pMX-p210 BCR — ABL vector (encoding human L6 BCR-ABL mRNA). was produced.
  • Retroviral infection of BaF3 cells was performed according to the method of Pendergast et al. (Pendergast et al., 1993). At 72 hours post-infection, IL-3 was removed, allowing selection of a population expressing the fusion gene.
  • BaF3 / p 210 BGR ABL cells were RPMI-1640 supplemented with 10% fetal calf serum (FCS; Gibco-BRL, Rockville, MD) and 3 g / m1 puromycin (Gibco-BRL). Maintained in the medium.
  • FCS fetal calf serum
  • Gibco-BRL Gibco-BRL, Rockville, MD
  • 3 g / m1 puromycin Gabco-BRL
  • the total RNA of BaF3 / p210B (: R - ABL cells transfected with various plasmids was extracted at 2, 4, 6, 12, 18, 24, 30, and 36 hours after transfection. The total RNA sample was separated into a nuclear fraction and a cytoplasmic fraction.
  • T4 polynucleotide kinase (Takara Shuzo, Kyoto, Japan) by are labeled with 32 ⁇ ⁇ z L, Mz R , wt R z and L6 BCR-AB have sequence of the junction ( Figure 1 0) to the phase complementary synthetic
  • the nylon membrane was caught using an oligonucleotide as a probe. Prehybridization and hybridization were performed according to Koseki et al. (Koseki et al., 1998).
  • BaF3 cells stably expressing L6 BCR-ABL (b2a2) mRNA were transfected with the plasmid encoding (pV), and exposed to puromycin 24 hours later to select cells. After incubating for 60 hours in the presence of puromycin, dead cells were removed by Ficol and puromycin-resistant cells were cultured for various times in IL-3 free medium. Cell viability was assessed by its ability to exclude trypanble monochrom. In addition to BaF3 / p210 BCR - ABL cells, H9 cells expressing high levels of normal ABL mRNA were used as controls.
  • the time course of mRNA reduction is shown in the lower panel of FIG.
  • the basal level of L6 BCR-ABL mRNA in BaF3 / p210 BCR — ABL cells was set to 100%.
  • the graph entitled “Control” at the top of Figure 20 shows the level of L6 BCR-ABL mRNA expression at each measurement. Indicate the basic level).
  • tRNA Val RNA pV
  • the rate of L6 BCR-ABL mRNA elimination was clearly faster in cells producing maxizim than in cells producing wt R z.
  • L6 BCR-ABL mRNA The half-life of L6 BCR-ABL mRNA was about 3 days and about 10 days in cells producing maxizim and cells producing wtRz, respectively. Cleavage products of endogenous BCR-ABL mRNA resulting from maxizim expression were also identified in BV173 cells (data not shown). Detection of these fragments demonstrated that maxizyme and conventional ribozymes were catalytically active in cultured cells and specifically cleaved the target mRNA. Therefore, we show that apoptosis of the cells shown in FIGS.
  • pl45 c-ABL protein is a nuclear protein with low intrinsic tyrosine kinase activity.
  • the p210 BCR - ABL protein is a cytoplasmic membrane-bound protein with constitutively high levels of tyrosine kinase activity that prolongs hematopoietic stem cell survival by suppressing apoptosis.
  • ABL chimeric protein and P 14 5 c-ABL proteins are both negative regulator of Apoptosis one cis (CHAPM an, et al., 1994; Laneuville et al., 1994; Spooncer et al., 1994; Bedi et al., 1994, 1995 McGahon et al., 1994, 1995; Dubrez et al., 1998).
  • Low-specificity antisense molecules inhibit leukemia cells by blocking normal ABL mRNA expression in addition to blocking the BCR-ABL pathway. May induce apoptosis.
  • the cleavage activity of maxizim especially in cells, must require a three-molecule interaction (between the two monomer units driven by maxim tRNA Val and the target substrate).
  • the activity of conventional ribozymes requires two-molecule interactions (between one ribozyme driven by tRNA Val and its target). In principle, two-molecule interactions are faster than three-molecule interactions. This difference The differences seem to indicate that conventional ribozymes would be more effective than maxizim in cells.
  • tRNA Val driven dimers were always more active than the corresponding tRNA Va 1 driven ribozymes. We found something (the same target site was used for each set of ribozyme and maximizem).
  • the Klug group found that a carefully designed DNA-binding peptide consisting of three zinc finger motifs was unique in the BCR-ABL fusion oncogene rather than the parent genomic sequence in an elegant experiment. It was shown to specifically bind to a 9 base pair region (Choo et al., 1994). Furthermore, the mouse cells rendered growth factor (IL-3) -independent by the action of the above-mentioned oncogene are transformed into IL-3 dependent mice as a result of transient transfection using a vector expressing the above-mentioned DNA-binding peptide. I went back to sex.
  • IL-3 growth factor
  • the p210 BCR - ABL protein does not trigger the endogenous expression of IL-3 or other growth factors that can stimulate the growth of BaF3 cells in a photocrine fashion. Rather, the p210 BGR protein provides a stimulus for the growth of BaF3 cells, usually provided via the IL-3 signaling pathway (Daley and Baltimore, 1988).
  • the Klug group also found that BCR-ABL mRNA levels in transiently transfected cells were reduced by 15-18% within 24 hours compared to those in non-transfected cells. showed that.
  • a similar decrease in the level of BCR-ABL mRNA (35% decrease in the case of maxizim within 24 hours; FIG. 20) regained dependence on IL-3 (FIG. 18). ).
  • caspases which must cause apoptosis when overexpressed in cells, initially require cleavage at a distance from the aspartate residue to produce an active protease 1 It is synthesized as an inactive proenzyme of the main chain.
  • caspase activation in apoptosis occurs via proteolytic cascades.
  • caspase-4 activates procaspase-1 which in turn cleaves procaspase-3 to yield active caspase-3, which is Asp-G1U-Va1-Asp ( DEVD) recognizes the motif and cleaves the poly (ADP-ribose) polymerase (Enari et al., 1996).
  • mice lacking caspase-1 did not show any phenotype in programmed cell death (Li et al., 1995), whereas mice lacking caspase-3 showed hyperplasia and disordered development of cells in the brain.
  • caspase-1 is abundant in all types of cells, while caspase-3 plays an important role in apoptosis in certain parts of the brain (Nagata, 1997).
  • BCR-ABL-mediated repression of apoptosis the most recent finding was that the apoptotic pathway was interrupted upstream of ostial caspase-3 activation in the BCR-ABL + cell line (Dubrez et al., 1998).
  • mice in order to transform mice into cancerous cells, cells derived from b2a2 type CML human patients (CML translocation type L6 translocation type patients that have not yet undergone celllinization, Obtained from the Department of Clinical Pharmacology.
  • the virus vector pMX puro / Dimer maximal-incorporated pV-MzL / R in Examples 8, 10, and 11
  • the control virus vector pMX puro without any integration were incorporated into these tumor cells.
  • stroma cell l bone marrow stromal cells; fibroblast-like adherent cells that increase when cells taken from bone marrow are cultured. Secrete site force-in and promote proliferation of blood cells.
  • the virus was obtained from the Department of Pathology and Pharmacology of the Institute of Medical Science, The University of Tokyo. ml was infected (mo i .0.1) under 10 mi crogram / ml of polybrene. ⁇ Since Inorespecta has a puromycine resistance gene integrated, by adding 0.5 mg / ml of puromycine to the culture solution 72 hours after the start of infection, only cells incorporating maximizim can be selected ( The selection time is 72 hours). Mice were injected with these tumor cells from patients into which maxizim was introduced and those without maxizim, respectively.
  • mice used were N0D-SCID mice (non-obesity di abetes-systemic comb ined immunodeficiency mice; non-obese diabetic, combined immunodeficient mice, and had lower immunity than conventional SCID mice.
  • Mice capable of transplanting various types of human cells In this example, the pathological pharmacology study of the Institute of Medical Science, The University of Tokyo Obtained from O 9 P 11 parts. ). 1 ⁇ 10 6 tumor cells after puromycine selection were injected into the tail vein of this mouse. Mice may be irradiated prior to administration to further reduce immunity, but this time they were not.
  • Mz (-) is a mouse injected with tumor cells not transfected with maxizim
  • Mz (+) is a mouse injected with tumor cells transfected with maxizim
  • Figure 22 shows a photograph of the mouse before dissection (measured at this point, see Table 1)
  • Figure 23 shows a photograph of the spleen (site indicated by an arrow)
  • Figure 24 shows a photograph of lymph nodes around the thymus.
  • Mz (+) is swollen as a whole and is growing more vigorously than Mz (-).
  • Mz (+) is 34g and 1 Og
  • Mz (-) indicates that the cancer progresses and the body is getting thinner and weaker.
  • mice were dissected and their spleens were compared (Fig. 23). Mz (-) has clearly progressed canceration and the spleen is enlarged (0.21 g), whereas the mouse into which maxizim has been introduced is not different from the healthy body (0.08 g) and the spleen is not enlarged .
  • a comparison of the lymph nodes around the thymus is shown in Fig. 24.
  • the (-) lymph node (0.27 g) indicates a form in which canceration has progressed.
  • Figure 25 shows a photograph of the bone marrow of the mouse. Most of the bone marrow of Mz (-) is occupied by tumor cells, whereas the bone marrow of mouse Mz (+) into which maxizim has been introduced has a shape similar to that of healthy bone marrow fluid (not tumor cells). And cells such as lymphocytes) were observed.
  • the expression of abnormal L6 (b2a2) chimeric mRNA produced in chronic myeloid leukemia which is triggered by reciprocal translocation on the chromosome, has no effect on normal mRNA. , And can be specifically suppressed. Therefore, the maxizyme of the present invention can be used as a gene therapy for chronic myelogenous leukemia or an inhibitor of the expression of L6 (b2a2) chimeric mRNA that causes chronic myelogenous leukemia.
  • RNA catalysts containing non-nucleoside 1 inkers are active RNA catalysts.
  • BCR first exon sequences specifically activate the BCR / ABL tyrosine kinase oncogene of Philadelphia chromosome-positive human leukemias. Mol. Cell. Biol. 11, 1785-1792.
  • Antiisense BCR-ABL oligomers cause non-specific inhibition of chronic myeloid leukemia cell lines.Leukemia 8, 2156-2162.
  • SHI domain autophosphory 1 at i on of p210 BCR / ABL is required for transformation but not growth factor independence.Mol.Cell.
  • BCR-ABL antisense oligo-deoxyr i bonuc 1 eot i des suppress the growth of leukemic and normal hematopoietic eel Is by a sequence-specific but nonanti sense mechanism. 3891-3896.
  • Antisense oligodeoxy-ribonucleotides suppress hematologic cell growth through stepwise release of deoxyr i bonuc 1 eot i des Blood 90, 331-339.

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Description

W 明 細 書 標的 R N Aに対してァロステリックな R N A切断活性を示す核酸酵素 技術分野
本発明は、 核酸酵素およびその利用に関し、 より詳細には、 標的 RNAに対して ァロステリックな RNA切断活性を示す核酸酵素およびその利用に関する。 背景技術
1980年初頭、 米国コロラド大学の Cechらによるテトラヒメナの r RNAのセル フスプライシング現象の発見 （K.Kruger， P. J. Grabowski, A. J.Zaug, J. Sands, D.E.Gottschling, T. R. Cech, Cell, 31， 147-157(1982)) と、 米国エール大学の Altmanが行った RNAとタンパク質の複合体酵素であるリボヌクレアーゼ Pの解 析結果 (C.Guerrier-Takada, K. Gaydiner, T. Marsh, N.Pace, S. Altman, Cell, 35， 849-857(1983) ) から、 触媒機能を有する R N Aであるリボザィム（ribozym e: ribonucleotide acid+ enzyme) が見いだされた。 以降、 様々なリボザィムが 発見され (R.H.Symons, Trend. Biochem. Sci.， 14, 445-450(1989) ； R. H. Symo ns， A画. Rev. Biochem. , 61, 641-671(1992) ； J.Bratty, P.Chartrand, G.Fer beyre, R. Cedergren, Biochim. Biophys. Acta, 1216, 345-359(1993) ； Haseho ff. J and W.L.Gerlach, Nature, 334， 585-591(1988) ； C. J. Hutchins, P.D.Ra thjen, A.C.Forster, R.H.Symons, Nucleic Acids. Res., 14， 3627-3640(198 6)) 、 逆転写酵素、 イントロンの発見、 RNAediting などとあわせて、 不動の セントラルドグマの概念をゆるがしたのである。 同時に、 それまで DNAとタン パク質の間で情報の仲介屋程度にしか認識されていなかった RN Aが、 （遺伝） 情報と （触媒） 機能の二役を兼ね備えていることから、 RNA分子こそが生命の 起源とする "RNAワールド" 説の中心的分子として注目されるようになった
(G.F.Joyce, Nature, 338， 217-224(1989) ； N.R.Pace, T.L. Marsh, Origins o f Life, 16, 97(1985) ； A.Lazcano, R.Guerrero, J.Oro, J.Mol. Evol. , 27， 28 3(1988) ； L.E.Orgel, Nature, 358, 203(1992) ； R. F. Gesteland, J.F.Atkins, The 雇 World, Monograph 24, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plain view, New York(1993)) 。
なかでもハンマーヘッド型リボザィムは、 これまで最も良く研究がなされてき たリボザィムの一つである。 これは、 天然においては自己切断反応 （シス型） と して機能するリボザィムであるが （T.R.Cech, Annu. Rev. Biochem. , 59， 543(1 990) ； A.C.Foster, R.H.Symons, Cell, 49, 211(1987) ； A.C.Jeffries, R. H. Sy 醒 s， Nucleic Acids Res., 17， 1371(1989)) 、 Uhlenbeckらと Haseloffと Gerl ach らのグループによって 2本の RNA鎖 （基質領域と酵素活性保持領域） に分 割 （トランス化） されたことから （0. Uhlenbeck, Nature, 328， 596(1987) ； J.Hasehoff, W.L.Gerlach, Mature, 334, 585(1988) ) 、 リボザィムによる遺伝 子治療への応用の可能性が示唆された。 以降、 癌やエイズなどを標的とした様々 な応用研究が、 数多く報告されている （M.Cotten, M. L. Bimstiel, EMBO J8， 861 (1989)； N. Sarver, E. Cantin, 0. Chang, 0. Lande, D. Stephens, J. Zaia, J. Ross i， Science 247, 1222(1990) ； M.Homann, M. Tzortzakari, K. Rittner, S. Sczaki el, M. Tabler, Nucleic Acids Res 21, 2809(1993) ； R. C. Mul 1 igan, Science 0， 926(1993) ； S.Altman： Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90. 10898(1993) ； P. Marschall, J.B.Thompson, F.Eckstein, Cell. Mol. Neurobiol. , 14， 523(199 4) ； S.M.Sullivan, J. Invest. Dermatol. , 103， 85(1994) ； F. H. Cameron, P. A. Jennings, Ant i sense Res. Dev. , 4， 87(1994) ; L. Q. Sun, D. Warri low, L.Wang,
C. Witherington, J. Macpherson, G. Symonds, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91，
9715(1994) ； R. E. Christoffersen, J. J.Marr, J.Med. Chem. 38， 2023(1995) ； G. Ferbeyre, J.Bratty, H.Chen, R. Cedergern, Gene 155， 45(1995) ； M.Kie hntopf , E. L. Eaquivel, M. A. Brach, F. Herrmann, J. Mol. Med. , 73， 65(1995) ； J. D. Thompson, D. Macejak, L. Couture, D. T. Stinchcomb, Nat. Med. 1， 277
(1995) ； T. Tuschl, J. B. Thomson, F. Eckstein, Curr. Opin. Struct. Biol. 5，
296 (1995)) 。
リボザィムは、 基質と相補的な塩基対を形成することによって、 基質 RNAと 結合する。 その後、 反応に必須となるマグネシウム存在下で、 基質 RNA分子の 切断が起こる。 基質の認識は、 Steml と Stemlll の双方の基質結合領域がそれに 対応した基質配列と適切な塩基対を形成することによってなされるので、 リボザ ィムの基質特異性は非常に高い。 基質特異性が非常に高いと、 細胞内に於いてほ とんど副作用が起こらないため、 リボザィムを遺伝子発現阻害剤として用いる場 合の大きなメリットとなる。
しかし、 このリボザィムの高い基質特異性にも例外がある。 それは、 ターゲッ トとなる基質がキメラ （二つ以上の異なる遺伝子配列が結合して一つの遺伝子と して機能する） の場合である。 本来、 ある配列 （exon 2) に別の配列 （exon 3) がつながるべきところへ、 スプライシングのミスなどが起きて別のキメラ配列
(exon 1- exon 3)が誤って生じ、 癌などの発病を招く場合、 リボザィムを用いて この異常な R N Aの発現を抑制するという遺伝子治療が考えられる。 それぞれの 配列自体 （exon 1、 exon 2、 exon 3) は正常なメッセージであるので、 異常型の ジャンクション配列 （exon 卜 exon 3)をもつ mRNAのみを特異的に切断し、 その発 現を抑えることが重要となってくる。 つまり、 正常な mRNA ( exon 2-exon 3)には 全く影響を及ぼさないリボザィムを用いなくてはならない。
従来のハンマーへッド型リボザィムを用いてこのような遺伝子の発現抑制を行 おうとする場合、 異常型の mRNAに特異的な配列部分である exon 卜 exon 3 のジャ ンクシヨン部位に、 リボザィムの切断可能な配列の G U Cトリプレット （一般に は N U X ( N ； A , G , C , U X ； A , C , U ) ) がある場合には、 問題は生 じない。 しかし、 運良くジャンクション部位またはその近傍に、 リボザィムの切 断配列があることはまれである。 ジャンクション部位に切断可能な配列がな 、場 合、 ジヤンクシヨン部位から遠く離れた部位にある切断配列をターゲットとする しかない。 しかしジャンクションから遠く離れた切断部位自体の配列は、 正常な mRNAにも異常型の mRNAにも存在している。 結局、 正常型の mRNAへの非特異的な切 断が起こってしまうことがどうしても避けられなくなる。 また、 たとえジャンク ション部位またはその近傍にリボザィムの切断配列である N U X配列があつたと しても、 それがハンマーへッド型リボザィムが好んで効率的に切断できる配列の トリプレット （G U Cトリプレット） である可能性はさらに低い。 従って、 この ようなケースに於いても、 高い切断活性を保ったまま、 特異性の非常に高いリボ ザィムを構築することは困難であった。 実際このようなある特定のキメラ型 mRNAが発病の原因になる有名な例として、 C M L (慢性骨髄性白血病） や A L L (急性リンパ性白血病） の原因となるフィ ラデルフィァ染色体の形成がある。 これらの白血病では染色体相互転座 t (9 ; 22) (q34 ; q l l ) が生じて BCR- ABL 融合遺伝子が生成する。 C M Lでは K 28t rans l ocat i on と L 6 t rans l ocat i onの 2つのタイプの染色体相互転座により、 2つのタイ プの BCR-ABL 融合遺伝子が生じ、 最終的に 2種類のキメラ mRNAがスプライシング の結果生成する（K28ジャンクション（b3a2)mRNAと L6ジャンクション（b2a2) mRNA) 。 そのうちのひとつには BCR- ABL ジャンクション部位の近くにハンマーへッド型リ ボザィムが切断できる配列 （ G U Uトリプレット） があるが（K28ジヤンクシヨン (b3a2)mRNA) 、 もう一つのタイプの mRNAにはジャンクション部位の近傍に、 有力 な切断配列が存在しない（L6 ジャンクション（b2a2) mRNA) 。 そのため、 従来のハ ンマーへッド型リボザィムでは後者の mRNAからの発現を特異的に阻害することが できない。 現在までに報告されている L6mRNAからの異常なタンパク質 （p210BCR-AB L ) の発現をリボザィムで阻害する試みは、 ハンマ一ヘッド型リボザィムに長い アンチセンス部分を足し、 それをジャンクション部位に相補的に結合させて、 切 断特異性を獲得しょうとしたものがほとんどである。 しかし、 この長いアンチセ ンス部分の付加によってリボザィムの基質結合部分が長くなると、 いったんリボ ザィムが基質に結合した後、 基質から解離するステップが非常に遅くなる。 その ため、 酵素としてのターンオーバ一ができず切断効率が低下してしまう。 さらに そうまでして獲得しょうとした基質特異性は期待したほど高くない。 これは長す ぎるアンチセンス部分の配列が、 正常型 mRNAである ABLmRNA や BCRmRNA へ部分的 に結合してしまい、 リボザィムの基質認識力を甘くさせてしまうからである。 そ の結果正常型 mRNAへの非特異的切断が避けられないといった状況になっている。 従って、 本発明は、 基質に対してァロステリックな切断活性を示す核酸酵素を 提供することを目的とする。
また、 本発明は、 前記の核酸酵素をコードする DNAを含む発現べクタ一を提 供することも目的とする。
さらに、 本発明は、 前記の核酸酵素または前記の核酸酵素をコードする DNAを 含む発現ベクターを有効成分として含む医薬組成物を提供することも目的と する。
さらにまた、 本発明は、 前記の核酸酵素の製造方法および利用方法を提供する ことも目的とする。 発明の開示
本発明者らは、 1つの活性中心領域と 2つの基質結合領域を持ち、 一方の基質 結合領域で L6 (b2a2)キメラ型 mRNAのジャンクション部位に結合し、 もう一方の基 質結合領域でジャンクション部位から遠く離れた効率の良い切断配列に結合して、 その切断配列の後で基質を切断することができる核酸酵素 （リボザィム） を構築 し、 本発明を完成させるに至った。 すなわち、 本発明は、 標的 RNAに対してァロ ステリックな RNA切断活性を示す核酸酵素を提供する。 本発明の核酸酵素は、 下 記のヌクレオチド配列（10) を含む RNA分子および下記のヌクレオチド配列（20) を含む RNA分子が形成する二量体の構造を有するとよい。
5' X1! · · · X'h Yl! … Y' i Z\ · · · Ζ 3' ( 10)
5' Z2, ·· · 1 Y · · · Y X2, … X2 k 3， (20)
(配列中、 x^ x^ X2,~X2 k, Υ 〜Υ'い Y2!-^ Z Z^ および 〜∑ は、 各々独立に、 A、 U、 T、 Cまたは Gのいずれかであり、
hおよび kは 1以上の整数 （例えば、 1〜 1 0 0の整数） であり、
iおよび mは 1以上の整数 （例えば、 1〜 1 0 0の整数） であり、
j は 1以上の整数 （例えば、 1〜 1 0 0の整数） であり、
nは 1以上の整数 （例えば、 1〜 1 0 0の整数） であリ、
X1 , … X および X2, … X2 kは、 標的 RNA中の特異的配列に相補的なヌクレオチド 配列であり、
Y1 , … Υ および Y2, … Υ2 Πは、 ステムを形成するヌクレオチド配列であり、
1 … Ζ1および Z2i … Ζ2 Πは、 標的 RNAの切断部位周辺の配列に相補的である領 域および標的 RNAの存在下でのみ Mg2+イオンを捕捉する空洞を形成しうる領域を 含むヌクレオチド配列である。 ）
標的 RNAとしては、 疾病の原因となるキメラ型 mRNAが挙げられる。 このキメラ 型 mRNAは慢性骨髄性白血病の原因となる L6 (b2a2) キメラ型 mRNAであってもよい t 本発明の核酸酵素は、 例えば、 下記のヌクレオチド配列（1 )を含む RNA分子および 下記のヌクレオチド配列（2)を含む RNA分子が形成する二量体の構造を有するとよ い。
5' GAAGGGCUUC UUUCAUCGAA ACCCUGAGG 3' ( 1 ) (配列番号 1 )
5' CACUCACUGA UGAGAGUUAU UGAUGGUCAG 3' (2) (配列番号 2 )
(ただし、 ヌクレオチド配列（1)の 2 1番目〜 2 9番目のヌクレオチドおよびヌ クレオチド配列（2)の 1 7番目〜 3 1番目のヌクレオチドは標的 RNAの切断部位周 辺の配列に相補的になるように改変されてもよい。 ）
ヌクレオチド配列（1)および（2)のそれぞれの上流にリンカー配列および tRNAVa 1プロモーター配列が付加されていてもよい。 ヌクレオチド配列（1) の上流に付 加されているリンカ一配列は下記のヌクレオチド配列（3)を含み、 ヌクレオチド 配列（2)の上流に付加されているリンカ一配列は下記のヌクレオチド配列（4)を含 むとよい。
5' AAA 3' (3)
5' UUU 3' (4)
また、 ヌクレオチド配列（1)および（2)のそれぞれの上流に付加されている tRNA Valプロモーター配列は下記のヌクレオチド配列（5)を含むとよい。
5' ACCGUUGGUU UCCGUAGUGU AGUGGUUAUC ACGUUCGCCU AACACGCGAA AGGUCCCCGG UUCGAAACCG GGCACUACAA AAACCAAC 3' (5) (配列番号 3 )
さらに、 ヌクレオチド配列（ 1 )および（2)のそれぞれの下流に付加配列およびタ —ミネ一ター配列が付加されていてもよい。 ヌクレオチド配列（1)の下流に付加 されている付加配列は下記のヌクレオチド配列（6)を含み、 ヌクレオチド配列（2) の下流に付加されている付加配列は下記のヌクレオチド配列（7)を含み、 ヌクレ ォチド配列（1)および（2)のそれぞれの下流に付加されているターミネータ一配列 は下記のヌクレオチド配列（8)を含むとよい。
5' AAA 3' (6)
5' AACCGUA 3' (7)
5' UUUUU 3' (8)
標的 RNAは疾病の原因となる異常型 mRNAであってもよい。 この異常型 mRNAとし ては、 H I V (エイズ） 、 急性リンパ性白血病、 急性前骨髄球性白血病などの原 因となる異常型 mRNAを挙げることができる。
また、 本発明は、 前記の核酸酵素をコードする DNAを含む発現べクタ一を提供 する。
さらに、 本発明は、 前記の核酸酵素の製造方法であって、 該核酸酵素をコード する DNAを含む発現ベクター DNAを錄型として、 RNAに転写することを特徴とする、 前記の方法を提供する。
さらにまた、 本発明は、 前記の核酸酵素または該核酸酵素をコードする DNAを 含む発現ベクターを有効成分として含む医薬組成物も提供する。 この医薬組成物 は、 標的 RNAが原因となって生じる疾病を予防およびノまたは治療するためのも のであるとよい。 標的 RNAが原因となって生じる疾病としては、 フイラデルフィ ァ染色体異常により生じる疾病、 例えば、 慢性骨髄性白血病が挙げられる。 本発 明の医薬組成物は、 例えば、 前記の核酸酵素を生体内で発現させて、 疾病の原因 となるキメラ型 mRNAや異常型 mRNAの発現の発現を抑制または阻害するために用い ることができる。
さらに、 本発明は、 前記の核酸酵素を用いて、 標的 RNAを特異的に切断する方 法を提供する。 標的 RNAは、 疾病の原因となるキメラ型 mRNAであってもよい。 疾 病としては、 フィラデルフィア染色体異常により生じる疾病、 例えば、 慢性骨髄 性白血病が挙げられる。 あるいはまた、 標的 RNAは疾病の原因となる異常型 mRNA であってもよい。 このような疾病としては、 H I V (エイズ） 、 急性リンパ性白 血病、 急性前骨髄球性白血病などを挙げることができる。
以下、 本発明を詳細に説明する。
1 . ダイマー型ミニザィムの構築
まずハンマーヘッド型リボザィム、 ミニザィム、 および本明細書で紹介する非 常に高活性なミ二ザィムであるダイマ一型ミ二ザィムについて、 設計と構築過程 について述べる。
卜 1 ハンマ一ヘッド型リボザィム —金属酵素—
ミニザィムの話をする前に、 まずハンマーへッド型リボザィムについて簡単に 説明する。 ハンマーへッド型リボザィムとは、 その RN Aの二次構造の形状がカナヅチの 頭 （ハンマーヘッド） に似ているところから命名された （Hasehoff. J and W. L. Gerlach, Nature, 334， 585 - 591 (1988) ； C. J. Hutchins, P.D. Rathjen, A. For ster, R.H.Symons, Nucleic Acids. Res. , 14， 3627-3640(1986)) 。 基礎及び応 用の両分野にわたって幅広い研究がなされており、 R N A鎖切断活性を持つリボ ザィムのうちで代表的なものである。 植物に感染するウィルスのウイロイ ド （現 在までに知られている最も小さな病原体、 タンパク質の殻を持たない一本鎖の環 状 RNA) や、 ウィルソイド （RNAウィルスの中に存在している、 単独では感 染性のない一本鎖の環状 RNA) 、 またウイロイ ドの助けを借りることで植物に 感染するサテライ ト RNAなどにおいて、 その複製過程から自己切断を起こす R NAが見つかった。 活性に必要な部分だけを in vitroで再構築した結果、 高い相 同性のある二次構造、 即ちハンマーヘッド構造が見いだされたのである （Haseho ff. J and W.L. Gerlach, Nature, 334， 585 - 591(1988) ； C. J. Hutchins, P.D.Ra thjen, A. C. Forster, R.H.Symons, Nucleic Acids. Res.， 14, 3627-3640(198 6)； T.R. Cech, A画. Rev. Biochem. , 59， 543(1990) ； A.C.Foster, R.H.Symons, Cell, 49， 211(1987) ； A.C.Jeffries, R.H.Symons, Nucleic Acids Res., 17， 1371(1989) ； A.C.Foster, R.H.Symons, Cell, 50， 9(1987) ) 。 その後、 種々 のハンマーへヅド型リボザィム間で保存されている塩基配列が明らかになリ、 比 較的保存されている酵素活性領域と、 そうでない基質領域とに、 先程も述べたよ うなトランス化が行われた （図 1 ) (0. Uhlenbeck, Nature, 328, 596(1987) ； J. Hasehoff, W.L. Gerlach, Mature, 334, 585(1988) ) 。 これより、 ハンマ —ヘッド型リボザィムは、 基質 RNAを認識して結合するアンチセンス領域、 そ のすぐ近傍にあるループ （穴） から成る活性中心領域、 ループに付随する stem- 1 oopll 領域から形成される。 さらに基質 RNA上の切断可能配列として、 三つの 塩基配列の組 （トリプレット） の法則性が明らかにされ、 NUXという配列の後 でのみ切断が起こることが分かった （M.Koizumi, S. Iwai, E. Ohtsuka, FEBS Let t. , 228(1988) ； D.E.Ruffer, G.D. Stormo, 0. C. Uhlenbeck, Biochemistry, 29， 10695(1990)； C.C.Sheldon, R.H.Symons, Nucleic Acids Res. , 17, 5679(198 9) ； R.Perriman, A.Delver, W.L. Gerlach, Gene, 113， 157(1992) ； T.Shiraaya ma, S. Nishikawa, K. Tai ra, Biochemistry, 34， 3649(1995) ； M. Zoumadakis, M. Tabler, Nucleic Acids Res. , 23， 1192(1995)) 。 この N U Xルールのなかで、 最も切断効率の高いトリプレツトが GUCという配列であり、 通常この GUCが リボザィムの切断配列として説明されることが多い。 このトリプレット以外で、 基質と相補的に結合するアンチセンス領域の配列は、 基質の塩基配列あわせて自 由に設定できる。 つまリリボザィムはその設計次第で、 あらゆる RNA配列を部 位特異的に切断できる。 そのため、 特定の遺伝子の発現阻害剤として、 その遺伝 子治療などへの応用が可能となったのである。 いわばリボザィムは、 "狙った R NA鎖" を自由に切断できる "分子はさみ" だといえる。
ここで重要なことは、 これまで述べてきたハンマーへッド型リボザィムの RN A鎖切断活性には、 マグネシウムイオンなどの 2価陽ィォンが必須なことである。 このマグネシゥムイオンは、 リボザィムが活性型の構造を形成するためにも必要 になるのだが、 その詳細な反応機構への関与は十分には分かっていない。 しかし、 これまでの実験結果から、 実際に RN A鎖の切断を行っているのはマグネシウム イオンで、 リボザィムは単に金属イオンの足場を提供しているにすぎないことが 明らかとなっている (S. C.Dahm, W.B. Derrick, 0. C. Uhlenbeck, Biochemistry 3 2, 13040(1993) ； J. A.Piccirilli, J.S.Vyle, Nature 361， 85(1993) ； Michael.
Ya s, FASEB J7， 31(1993) ； T.Uchimaru, M. Uebayasi, K.Tanabe, K. Taira, F ASEB J7， 137(1993) ； T.A.Sreitz, J.A.Steitz, Pro Natl. Acad. Sci. USA, 90， 6498(1993)； M.A.Pyle, Science 261, 709(1993) ； T. Uebayasi, T.Uchimaru,
T. Koguma, T. Sawata, S. Shimayama, K. Taira, J. Org. Chem. , 59， 7414(199 4) ； S.Sawata, M. Koraiyama, K. Taira, J.Am. Chem. So ， 117， 2357(1995) ; P. K.R.Kumar, D.M.Zhou, K. Taira, Nucleic Acids and Molecular Biology 10， 21 7,(1996)) 。 つまり、 リボザィムは金属酵素なのである。 実際にその足場を提供 していると考えられる領域は、 先程述べたハンマーへッド型リボザィムを形成す る幾つかの領域のうち、 切断部位の近傍のループ部分であり、 この金属イオンを とらえるループ以外の領域は、 様々な改変が可能である。 例えば、 基質結合領域 を RN Aより安定な DN Aに置き換えることも可能であるし、 次に述べるように stem- loopll 領域を削って小型化することも可能となってくる （J. Goodchi ld， V. Kohli, Arch. Biochera. Biophys. , 284, 386(1991) ； M. J.McCall, P.Hendry, P. A.Jennings, Pros. Natl. Acad. Sci. USA, 89， 5710(1992) ； J.B.Thompson, T. Tuschl, F.Ekstein, Nucleic Acids Res. , 21, 5600 (1993) ； D.Fu, F.Benseler, L.W. McLaughlin, J.Am. Chem. Soc. , 116， 4591(1994) ； D.M.Long, 0. C.Uhlen beck, Pro Natl. Acad. Sci. USA, 91， 6977(1994) ) 。
1-2 ミニザィム
ダイマー型ミニザィムの構築過程を図 2に示す。 この図を参照しながらミ二ザ ィムおよびダイマー型ミニザィムの構築過程について説明する。
ミニザィムとは前述したように、 小型化したハンマ一ヘッド型リボザィムであ る。 この小型化は通常、 アンチセンス領域 （stemlおよび stemIII)、 活性中心領 域、 stem-loopll 領域からなるハンマ一ヘッド型リボザィムの stem- loopl I 領域 を短鎖のリンカ一で置き換えることによって構築されてきた。 初期の試みとして、 stem-loopll 領域の削除が行われた。 これは、 ハンマーヘッド型リボザィムのそ れぞれの領域が、 切断活性にどのような役割をはたしているのかを調べるために 行われた。 この結果、 完全に stem- loopl I 領域を削除してしまうと、 切断活性は 著しく低下することが明らかになった。 以降、 切断活性を保持しつつ、 小型化し たリボザィムを構築するために、 stem- loopll 領域をさまざまな長さのヌクレオ チドで代替する模索が行われた。 例えば、 stem- loopll 領域を全て削ってしまわ ずに、 この部分を 4残基のヌクレオチド （テトラループ） で置換することによつ て、 ミニザィムを構築する試みなどである。 しかし結局、 近年報告されている詳 細な解析から、 stem-loopll 領域の核酸塩基の数を減少させると、 その切断活性 に著しい影響を及ぼすことが明らかとなった。 実際に、 今まで報告されてきた 数々のミニザィムは、 その切断活性が野生型ハンマーヘッド型リボザィムの 100 分の 1以下で、 1000分の 1以下のものも少なくない （J.Goodchild, V. Kohli, Ar ch. Biochera. Biophys. , 284， 386(1991) ； M. J.McCall, P.Hendry, P. A. Jennin gs， Pros. Natl. Acad. Sci. USA, 89， 5710(1992) ； J. B. Thompson, T. Tuschl, F.Ekstein, Nucleic Acids Res. , 21, 5600 (1993) ； D.Fu, F.Benseler, L.W.Mc Laugh 1 in, J.Am. Chem. So ， 116， 4591(1994) ； D.M.Long, 0. C. Uhlenbeck, P roc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 6977(1994) ) 。 stem- loopl I 領域の削除また は減少は、 リボザィムが切断反応を行う上で必要となる活性型の構造をこわして しまうことにつながると考えられている。 これより、 ミニザィムは従来のハンマ 一へッド型リボザィムに比べて、 抗ウィルス剤や遺伝子治療への応用に実用的で はないと考えられた。 そして、 この分野の多くの研究者達の興味をそれほど引く ものではなくなつていた。
1-3 ダイマー型ミニザィムの構築 —高活性なミニザィム—
さて、 卜 2 で述べたようなミニザィムの構築を本発明者らも行ったところ、 幸 いにも非常に高活性 （野生型の 60%以上 （keat =2.5min-'： 1分子のリボザィ ムが 1分間に、 2. 5分子の基質を切断することを意味する） ） ものが得られた
(S.V.Amontov, K.Taira, J. Am. Chem. Soc.， 118， 1624(1996) ) 。 このミニザ ィムの高活性の理由として、 濃度変化の実験過程においてある示唆が得られた。 それは高濃度領域では全く違った機構で働くこと、 つまリダイマ一 （ホモダイマ —； 同じ配列を持つ同一分子が、 2つ結合してダイマーを形成する） として機能 することが塩基の配列上考えられたのである。 そこで、 ダイマ一として作用する のかどうかを調べるために、 ダイマー構造をとらない限り、 活性が得られないよ うなへテロダイマ一型ミニザィムをデザインした （図 2の下段） 。 このへテロダ イマ一型ミニザィムは、 それぞれ違う配列を持ったヘテロな分子である MzL (ミ 二ザィム · Left) と MzR (ミニザィム · Right)が結合してダイマーを形成する。 しかしダイマ一型構造をとらずに、 従来のハンマーへッド型リボザィムのように 1分子で基質と結合しょうとすると、 片方の基質結合領域の配列 （アンチセンス 領域にある基質と相補的に結合する steml または stemlll のどちらか） しか、 基 質と塩基対を形成できないように設計されているため、 正しく結合できず切断反 応は起こらないようになつている。
実際に切断実験を行ってみたところ、 明らかな切断活性が観測された。 そして、 これまで著しく高活性を示したミニザィムは、 ダイマ一として機能していたこと が明らかとなった (S.V.Amontov, K.Taira, J. Am. Chem. So , 118， 1624(199 6) ) 。 この新しく構築されたダイマ一型ミニザィムは、 ハンマーヘッド型リボ ザィムと同様、 マグネシウムイオンを必要とし、 ダイマ一を形成する stemll部分 の G— C塩基対が重要となる （S.V.Amontov, K.Taira, J.Am. Chem. Soc. , 118, 1624(1996) ； S. V. Amontov, S.Nishikawa, K.Taira, FEBS Lett., 386, 99(199 6)) 。
2. 基質 RN A分子を同時に 2力所で切断するダイマ一型ミニザィムの構築
ここではこのダイマ一型ミニザィム特性を生かした、 まったく新しいタイプの リボザィムである "一つの基質を同時に二箇所で切断するダイマ一型ミニザィ ム" の構築過程について述べる （T.Kuwabara, S. V. Amontov, M.Warashina, J. Oh kawa, K.Taira, Nucleic Acids Res.， 24, 2302(1996)) 。
2-1 基質 RN A分子を同時に 2力所で切断するリボザィムのメリット
以上のようにして構築されたダイマ一型ミニザィムは、 図 3に示すようにそれ ぞれ違う配列を持ったヘテロな分子である MzL と MzR が結合してダイマ一を形成 する。 この図の点線より上側と下側に分けて眺めてみていただきたい。 金属酵素 であるリボザィムにとつて、 切断活性に必要なマグネシウムイオンをとらえる足 場となる活性中心領域、 そして、 基質 RNA配列のどこを切るかを決める基質結 合領域が、 双方に独立して一つずつあることに気付く。 すると、 このダイマ一型 ミニザィムは 1つの基質に同時に 2力所へ結合し、 その 2箇所の NUXトリプレ ットの後で基質を切断できるのではないかと考えられた。
この構築のメリットは、 一つは当然のことながら、 切断部位が 1箇所しかない 従来のリボザィムに比べて、 基質の切断効率が高くなることである。 しかしそれ 以外にもう一つメリットがある。 それは、 ダイマ一型ミニザィムの一方の基質結 合領域が、 基質と非常に結合しやすい （すなわち、 基質とリボザィムの結合の k m値が十分に低い） 配列に設定できれば、 他方はリボザィムの切断部位が GUC 以外で、 たとえ高い kn値を示しても （すなわち、 基質とくっつきにくい、 不安 定な配列であっても） 、 kcat 値の高いトリプレットを選択する限り効率よく 2 箇所を切断できる可能性を持つ。 つまり、 片方の基質結合領域がいったん基質に 結合してしまえば、 他方の基質結合領域と基質との結合は、 いってみれば同一分 子内の反応になる。 従って、 その衝突確率は分子間のものよりも著しく増大する ことになるからである。
2-2 BCR-ABL キメラ mRNAを特異的に切断するダイマ一型ミニザィム
ダイマ一型ミニザィムは、 そのダイマ一構造ゆえに活性中心領域と基質結合領 域を 2つずつ持っている。 そこで、 一方の基質結合領域で異常な BCR- ABL ch i mer i c mRNA のジャンクション部位に結合し、 もう一方の基質結合領域で、 ジャンク シヨンから遠く離れた箇所にある、 最も効率のよい切断配列に結合し、 その （G U C ) トリプレツトの後で基質を切断するというシステムの構築が可能である
(図 4 ) 。 いわば、 片方の基質結合領域は異常型の基質を認識する "目" として 働き、 もう片方の基質結合領域が基質を切断するリボザィムの働きの "実" を担 う腕として機能するわけである。
この構築で重要なことは、 ダイマー型ミ二ザィムの一方の基質結合領域が異常 な BCR- ABL キメラ mRNAのジャンクション部位に結合したときに初めて、 リボザィ ムとして活性を発現できる安定なダイマ一構造を形成する点にある。 このダイマ —の安定性を左右するのが、 steml l部分の塩基対の形成にある。 この塩基対の安 定性が高過ぎると、 ダイマー型ミニザィムは （基質がなくても） それ自体でダイ マー構造を形成してしまう。 その結果、 ダイマー型ミニザィムの基質を切断する 側の基質結合領域が、 "目" として基質を認識するもう片方の基質結合領域が機 能する、 しないにかかわらず、 対象となる基質領域に結合してしまう。 そうする と、 切断する部分の配列は正常型 mRNAである ABLmRNA や BCRmRNA 上にもあるので、 結局従来のハンマーへッド型リボザィムで問題となっている非特異的な切断が生 じることに変わりはなくなつてしまう。 そうかといって steml l部分の塩基対の安 定性が低過ぎると、 活性型のダイマ一構造が形成しにくくなリ、 基質切断効率の 非常に低い、 従来のミニザィムと同様の問題点が生じてくる。 この双方の問題を 克服できるような、 微妙な steml l部分の塩基対の安定性の獲得と異常 mRNA存在下 でのみ活性型リボザィムを形成するような塩基配列の工夫が、 このシステムの構 築の鍵を握っているのである。
またさらに、 このシステムの構築の場合、 異常型の mRNAを認識して特異的に結 合する側は、 基質を切断するわけではない。 そこで R N A鎖切断に必要な、 金属 イオンを捕らえる足場を提供する活性中心領域の配列を削ることができる。 よつ て、 これまでのダイマ一型ミニザィムをさらに小型化することができる （図 4の 右） 。 この、 さらに小型化したダイマ一型ミニザィムを極めて活性の低い単量体 形態の従来のミニザィムと区別するため、 我々はマキシザィム "maxi zyme"と名 付けた。 "maxizyme"は、 minimized (最小ィ匕された） 、 active (活性な） 、 x一 shaped (xの形をした、 ヘテロ二量体形の） そして丄 ntel 1 igent (インテリジェ ントな、 ァロステリックに制御可能な） ribozyme (リボザィム） を意味する。 実 際に BCR-ABLキメラ mRNAを特異的に切断するようにデザィンしたマキシザィムを 図 5に示す。 この図を見てわかるように、 活性型ダイマー構造は、 ターゲットと する BCR-ABL キメラ mRNAと、 ダイマ一型ミニザィムの 2力所の基質結合領域が正 しく結合したときのみに形成される （図 5の中段に表示） 。 ターゲットとしない 正常型 ABLmRNA の存在下では、 不活性型の構造しかできないように設計されてい る。 ジャンクションを認識する側の基質結合領域に正常型 ABLmRNA 配列がやって きた場合、 不活性型構造をとる （図 5の下段の上側に示した構造） 。 ハンマーへ ッド型リボザィムの切断活性にとつて必須なマグネシウムイオンを捕らえる活性 中心部位の構造が、 活性型ダイマ一構造に図示したものと違って、 崩れているの がわかると思う。 この結果、 このダイマ一型ミニザィムによる正常型 ABLmRNA へ の、 非特異的切断は起こらない。 また、 基質を切断する側の基質結合領域が、 単 独で基質と結合したとしても （※この場合、 結合する基質としては正常型 ABLmRN A と BCR- ABL キメラ mRNAの双方が考えられる。 ） 、 もう一方の基質結合領域に標 的の BCR- ABL キメラ mRNAの配列がこない限り、 図に示したような活性部位が閉じ た構造を形成する （図 5の下段の下側に示した構造） 。 この結果、 切断に必須と なるマグネシウムイオンを捕らえられないので、 切断は起こらない。
BCR- ABL融合 mRNAの翻訳産物は慢性骨髄性白血病 （CML)を引き起こす。 こ れはフィラデルフィア染色体陽性を伴う、 造血幹細胞のクローン性（clonal)骨髄 増殖疾患である （Nowellおよび Hungerford, 1960)。 染色体の相互転座 t(9; 22)
(q34; qll)は、 K28 転座および L6 転座の 2種類に分けられ、 それらは BCR-ABL 融合遺伝子の形成をもたらす。 これらの遺伝子は 2種類の mRNAをコードする。 すなわち、 b3a2 (BCRェキソン 3および ABLェキソン 2からなる） および b2a2 (BC Rェキソン 2および ABLェキソン 2からなる） である （図 9 ； Rowley, 1973; Bart ramら, 1983; Heisterkampら， 1983; Groffenら， 1984; Shtivelmanら， 1985, 1 986)。 これらの mRNAは両方とも 210 kDa のタンパク質 （p210BCR-ABL) に翻訳 される。 これは上記悪性細胞の表現型に独特のものである（Konopkaら， 1984)。 キメラ RNAを破壊することができるリボザィムを設計するためには、 ジヤン クシヨン配列を標的にする必要がある。 そうしなければ、 該キメラ RN Aの一部 を共有する正常な RN Aもリボザィムによって切断されてしまい、 宿主細胞に害 を与えることになる （図 9、 下段のパネル） 。 K28 BCR- ABLキメラ RNA配列 b3 a2の場合は、 リボザィムによる潜在的な切断部位である GUUトリプレツトがキ メラジャンクションから 3ヌクレオチド上流に位置している。 したがって、 従来 の方法で設計されたハンマーヘッド型リボザィムは、 K28 転座から生じた異常な mRNAを特異的に切断すると予想されうるであろう。 実際、 そのような切断の いくつかの例が報告されている （Shoreら， 1993; Snyderら， 1993; Langeら， 19 93， 1994; Wrightら， 1993; Kearneyら， 1995; Leopoldら， 1995; Kronenwettら， 1996)。 対照的に、 L6転座および幾つかの K28 転座から生じる b2a2配列の場合は、 問題のジャンクションから 2〜 3ヌクレオチド以内の所にはハンマーへッド型リ ボザィムが切断可能なトリプレット配列は存在しない。 一般的には、 GUCトリ プレツトがハンマーへッド型リボザィムによる切断を最も受けやすく、 該ジヤン クシヨンから 45ヌクレオチド離れた所にこのトリプレツトが 1つ存在している。 もしこの GUCトリプレットがリボザィムによって切断されるならば（ w t R z； 図 1 0) 、 異常型 BCR- ABL m R N Aの配列の一部を共有する正常型 ABL m R NAもまた該リボザィムによって切断され、 宿主細胞に害を与えるであろう。 b2 a2 mRNAを切断しうるリボザィムを設計するにあたって、 我々は正常型 ABL mRNAの切断を確実に回避しなければならない。
L6 BCR-ABL (b2a2) m R N Aの切断をめざした以前の試みは、 長いアンチセン スアームとリボザィム配列の組合せを必要とした（Pachukら， 1994; Jamesら， 19 96)。 ジャンクション領域に結合し、 切断部位を越えて若干の距離だけそこを覆 う潜在的能力を有する約 10〜30ヌクレオチドのアンチセンス配列がハンマ一へッ ド型リボザィムの基質結合部位の一方に連結された。 ァニ一リングアームの長さ はリボザィムの活性にとって重要である。 なぜなら、 その長さは切断反応の効率 および特異性の両方に影響するからである。 我々は、 上記のアンチセンス付加型 リボザィムが in vitroにおいて正常型 ABL m R N Aを非特異的に切断すること（K uwabaraら， 1997)を示した。 それは、 長さ 3ヌクレオチド程の小さな結合アーム さえあればハンマ一ヘッド型リボザィムが切断能を有するためである（Herte 1ら， 1996; Birikhら， 1997)。 そこで我々は、 L6 BCR-ABL (b2a2) mRNAのジヤン クション配列が存在する場合にのみ触媒的にコンビテントな構造を形成する新規 なマキシザィムを設計できないだろうかと考えたのである。
本発明のマキシザィムは、 DNA/RNA 合成機 （モデル 394; Applied Biosystems, Division of Perkin Elmer Co. (ABI), Foster City, CA) で化学合成した RNA を、 脱保護、 脱塩、 PAGEによる精製を行うことにより、 製造することができる。 このマキシザィムの切断活性および基質特異性は、 以下のようにして評価する ことができる。 異常型 BCR- ABL mRNA (120mer) 、 正常型 ABL mRNA (92mer)の 2つ の基質 RNA をラジオアイソトープ （32P)で標識したものを用意する。 これとマキ シザィム、 マグネシウムイオンを Tris-HCl (pH 8.0) 緩衝液中に混合させ、 37°C で反応させる。 反応後、 その反応液を PAGEにより分離し、 切断の有無を BAS2000 イメージアナライザーで検出し、 ABL mRNAは切らずに BCR-ABL mRNAを特異的に切 断していることの評価を行う。
後述の実施例 1および 3に記載のように、 実際にこのマキシザィムを合成して、 基質特異性の評価を行ったところ、 正常型 mRNAへの非特異的切断は in vitroにお いて全く起こらなかった。 またその切断効率の評価は、 BCR- ABL キメラ mRNAをタ —ゲットとした、 現在までに報告されているアンチセンス付加タイプのハンマー へッド型リボザィムや、 他のミニザィムと比べても高かった。
3. ダイマー型ミニザィムの遺伝子治療への応用
次に、 得られたマキシザィムの、 遺伝子治療への応用に向けた利用法の確立お よび in vivo での評価について説明する。
生体内でリボザィムを発現させる場合、 外部から合成リボザィムをカチオン性 の脂質膜などで包んで導入する方法 （Malone, RW. Feigner, PL.， Vermn, IM (1 989) Pro Natl. Acad. Sci. , USA 86， 6077)と、 ベクタ一 DNA (ウィルスべ クタ一などを用いて） として導入して細胞内で発現させる方法 （Friedmann. T.， Roblin. R. (1972) Science 175, 949)の 2種類がある。 後者の方法を用いるに あたっては使用するプロモーターや転写物の安定性を考慮する必要があるので、 ダイマー型ミニザィムについて検討することとした。 本発明のリボザィムをコードする DNAを含む発現べクタ一は、 RNA ポリメラー ゼ III のプロモータ一、 ターミネータ一配列及びマキシザィムの配列を連結した もの（tRNAval-MzL、 tRNAval- MzR)を pUC19 (Takara)、 pGREEN LANTERN (ライフテツ クオリエンタル株式会社製） 、 pHaMDR (HUMAN GENE THERAPY 6:905-915 (July 1 995)) などのベクターに組み込むことにより、 作製することができる。
上記のようにして作製した発現ベクターは、 以下のようにして細胞内へ導入す ることができる。
①リポフエクシヨン（Lipofection) 法
細胞の表面は負に荷電している。 そこで、 目的のベクタ一（DNA2本鎖環状ブラ スミ ド） とカチオン性の脂質 （リポフエクシヨン試薬 （リポフエクチンなど））と で複合体をつく り、 それを細胞内へ導入する。
②ウィルスベクタ一法
①に比べ効率が高い。 ウィルスの遺伝情報のうち遺伝子発現に必要な部分のみ を残し、 そこへ治療効果をもつ配列（tRNAval- MzL、 tR Aval-MzR の DNA 配列） を組 みこんだものを用意する。 このベクターをウィルスの力によつで目的細胞の DNA に組み込む。
ベクター配列中のマキシザィムには、 RNA ポリメラ一ゼ III のプロモーター配 列が付加されている（tRNAval- MzL、 tRNAval-MzR の DNA 配列） 。 細胞内に導入され たベクター DNA から、 元来細胞内で機能している RNA ポリメラーゼ III の働きに よリ、 治療効果をもつ RNA 配列（tRNAval- MzL、 tRNAval- MzR)が転写されることによ リ、 高い発現力でリボザィムが発現される。
細胞内でリボザィムを高発現させるには、 プロモータ一配列がリボザィム配列 の上流に必要となってくる。 polIIIの発現系 （Geiduschek, EP. , Tocchini-Vale ntin, GP. Transciption by RNA polymerase III, Anun. Rev. Biochem. o /, 87 3)を用いる場合、 この発現系では tRNAval配列が余分な配列 （リボザィム部分以 外のプロモーター配列） として付加されてくる。 後述の実施例 2に記載のように、 実際にマキシザィムの発現べクタ一を構築したのであるが、 このべクタ一から発 現するリボザィム成分は、 tRNAval配列の下流に短鎖のリンカ一を介してマキシ ザィムの配列がつながつている図 6に示したものである。 この図を見ると、 tRNA val配列がマキシザィムにとつて非常に大きな立体障害となり得ることが予想さ れた。 マキシザィムは、 MzL 配列と MzR 配列 （MzL ： ミニザィム · レフト、 MzR
： ミニザィム ' ライ ト。 マキシザィムを形成する 2つのダイマー成分のうちの それぞれ一つ （図 5の活性型ダイマ一構造参照） 。 図 6中アンダーラインで示し た領域） が s teml l部分で塩基対を形成して、 初めてダイマ一型構造ができ、 切断 活性を発現する。 その、 それぞれの MzL 配列と MzR 配列の前に、 その 5倍以上の 鎖長をもつ余分な tRNAval配列が付加されているのだから立体障害のためにダイ マーが形成しない可能性があつた。
tRNAval配列が付加したタイプのマキシザィムと、 何も余分な配列のないマキ シザィムについて、 切断活性および基質特異性の評価を i n v i troで行った （実施 例 3 ) 。 基質として BCR- ABL キメラ mRNA ( 121mer) 、 また比較として正常型 mRNA として ABLmRNA (97mer)を用意し、 50mM Tr i s-HC l (pH8. 0)、 25mM MgC l 2 、 37°C で切断反応を行った結果を図 7に示す。 すると、 驚くべきことに、 tRNAva l配列 が付加したタイプのマキシザィムにおいても明らかな切断活性が確認できた。 ま た、 正常型 ABLmRNA への非特異的切断は全く起こらず、 BCR-ABL キメラ mRNAに対 して非常に高い特異性をもっていることも確認できた。 なお、 それぞれ片方のマ キシザィムの形成成分 tRNAval - MzL と tRNAval - MzR だけでは、 活性を持ち得る ようなダイマ一構造は形成できないため基質の BCR- ABL mRNAの切断は起こらなか つた。
さらに短い鎖長の基質を用いた詳細な反応速度論的解析から、 tRNAval配列が 付加したタイプのマキシザィムと、 何も余分な配列のないマキシザィムの切断効 率の比較を行ってみた。 その結果を図 8に示すが、 これより我々は非常に興味深 い結果を得た。 何んと両者の k cat 値および k d(app)値がほとんど同じ値になった のである。 生体内の R N A分解酵素に対してマキシザィムの安定性を強化する tR NAval配列が、 全くマキシザィムの切断反応に影響を及ぼさないことがわかつた のである。 もう一度繰り返すが、 tRNAval配列が付加したタイプのマキシザィム は、 何も余分な配列のないマシキザィムと同様の、 非常に高い基質特異性を持ち、 同等の切断活性も有することが明らかとなった。
また、 我々は b2a2 m R N Aを特異的に切断することに興味があつたので、 従 来のハンマーヘッド型リボザィム （w t R z ) 、 2つのアンチセンス付加型ハン マ—ヘッド型リボザィム （asRz52および asRz81 ; Pachukら， 1994 ; Jamesら， 199 6)および我々の新規なマキシザィムの培養細胞における特異性および触媒活性を、 L6 BCR-ABLキメラ（b2a2) m R N Aの切断について比較した （実施例 1 0 ) 。 その 結果、 L6 BCR-ABL m R N Aのジャンクション配列の存在によって、 我々の新規 なマキシザィムの活性を i n v i t roのみならず培養細胞においてもァロステリック に制御できることを見いだした （図 1 2および 1 8〜 2 1 ) 。 マキシザィムの切 断活性による p210BGR— タンパク質の特異的減少は、 不活性なプロカスパーゼ（pr ocaspase) - 3の切断をもたらし、 活性なカスパーゼ（caspase) - 3 を生じ、 その結 果 BaF3/p210BGR—ABL細胞のアポト一シスが起こった。 同様に、 正常細胞ではなく、 白血病患者由来の BV173 細胞はマキシザィムに応答してアポトーシスを起こした。 対照的に、 従来のリボザィムは BaF3/p210BGR— 細胞および H 9細胞の両方に非特 異的にアポトーシスを引き起こした。 我々が知るかぎりでは、 これは i n v i troの みならず培養細胞においても完全なァロステリック制御下にある、 人為的に作製 されたリボザィムの最初の実例である。 異常型の m R N Aを特異的に認識するセ ンサーアームによって活性をァロステリックに制御しうる新規なマキシザィムは、 異常なキメラ標的を破壊するための強力な道具であるに相違なく、 また CMLの治 療のための将来の遺伝子療法への基礎を提供するであろう。
リボザィム配列の上流にリンカ一配列およびプロモータ一配列が、 下流にター ミネーター配列が付加されていてもよいマキシザィムは、 T7系の酵素を用いて、 上記の配列をコードする DNA を錡型として、 RNA に転写させることにより製造す ることもできる。
tRNAval- MzL、 tRNAval- MzRの DNA 配列の前に T7 RNAポリメラーゼのプロモーター となる配列を付加した錶型 DNA を用意する。 この錡型 DNA と T7 RNAポリメラ一ゼ 反応液 （Buffer、 酵素、 NTPs) を混合し、 37°Cで 2〜 4時間反応を行い、 PAGEに より精製する。
本発明のマキシザィムを用いて、 慢性骨髄性白血病の原因となる L6 (b2a2)キメ ラ型 mRNAを特異的に切断することができる。 その方法の一例を以下に記載する。 マキシザィムは 2つの基質結合領域をもつ。 片方で L6 (b2a2)キメラ型 mRNAに特異 的なジャンクション部位に結合し、 他方で遠く（45 残基） 離れた部位にある切断 可能な GUC トリプレットを、 マグネシウムイオン存在下で特異的に切断できる。 これにより、 正常型 mRNAには何ら影響を与えず、 BCR- ABL mRNAから p210BCR—ABLカ 発現することを阻害できる。
本発明のマキシザィムは、 医薬、 特に、 フィラデルフィア染色体異常が生じる 疾患を予防および または治療する医薬として使用することができる。
生体内の RNA ポリメラ一ゼ（RNAポリメラーゼ I I I など） のプロモータ一配列を 含むマキシザィムの DNA 配列を組み込んだ導入用べクタ一を作製する。 CML 患者 から p210BGR— ABLを発現している細胞をとリ出し、 細胞にベクターを投与、 培養す る。 それを再び生体内へ戻す。
導入用べクタ一の代用として、 マシキザィム RNA に化学修飾をほどこし、 生体 内の RNA 分解酵素に対して抵抗性をもたせた RNA を、 キャリアー （カチオン性の 脂質、 リボソームなど） などで、 細胞内へ導入してもよい。
本明細書は、 本願の優先権の基礎である日本国特許出願特願平 10— 60969号お よび特願平 10— 31 1098号の明細書および図面に記載される内容を包含する。 図面の簡単な説明
図 1は、 ハンマーへッド型リボザィムの二次構造を示す。
図 2は、 ダイマ一型ミニザィムの構築過程を示す。
図 3は、 ヘテロダイマー型ミニザィムの二次構造を示す。
図 4は、 BCR-ABL キメラ mRNAをターゲットとしたダイマー型ミニザィムとマ キシザィムの構造と作用を示す。 図 4右のマキシザィムの構造において、 Y同志 がステムを形成し、 Xは標的 RNA中の特異的配列を認識する。
図 5は、 BCR- ABL キヌラ mRNAと正常型 ABLmRNA のジャンクション付近の配列 及び活性型マキシザィムの二次構造並びに不活性型マキシザィムの二次構造を示 す。
図 6は、 tRNAval配列を付加したマキシザィムの二次構造を示す。 点線の枠 内に示した MzL 、 MzR 配列のみの場合の二次構造をできるだけ崩さないように tR NAva l配列を付加した （アンダーラインで示した部分がマキシザィムの配列） 。 図 7は、 BCR- ABL キメラ mRNAをターゲットとする、 tRNAval配列を付加した あるいは付加しないタイプのマキシザィムの切断活性を示す。
図 8は、 BCR-ABL キメラ mRNAをターゲットとする、 tRNAval配列を付加した あるいは付加しないタイプのマキシザィムの速度パラメータ一を示す。
図 9は、 BCR- ABL転座および融合 m R N Aを示す。 慢性骨髄性白血病を伴う 2種類の染色体転座 〔K28型 （上段パネル） および L6型 （下段パネル） 〕 、 およ びそれらに対応する融合 m R N Aを示す。 白の四角は BCRェキソンを、 黒の四角 は ABLェキソン 2を表す。 BCRェキソンと ABLェキソンを結ぶ点線は選択的スプラ イシング経路を示す。 L6転座および幾つかの K28転座から生じる L6 b2a2 m R N Aにおいては、 ハンマーへッド型リボザィムが切断可能なトリプレツト配列は BC R-ABぃン'ヤンクシヨンの近くには存在しない。 一般にハンマーへッド型リボザィ ムによって最も切断されやすいトリプレツトである G U Cトリプレツトが、 ジャ ンクシヨンから 45ヌクレオチド離れた所に位置している。 このようなトリプレツ トがリボザィムによって切断部位として選択されるならば、 異常型 BCR- ABL R N A配列の一部を共有する正常型 ABL m R N Aもまたそのリボザィムによって切断 され、 宿主細胞に害を与えるであろう （下段パネル） 。 nts はヌクレオチドを表 す。
図 1 0は、 従来のハンマーヘッド型リボザィムおよびアンチセンス付加型リ ボザィムのヌクレオチド配列を示す。 ジャンクション付近の L6 BCR-ABL m R N Aの配列を拡大してある。 アンチセンス付加型リボザィム （asRz81および asRz5 2) およびコントロールリボザィム（wtRz)による切断部位を示す。 マキシザィム による切断部位は wtRzによるそれと同じである。 マキシザィムの認識部位を矢印 で示す。
図 1 1は、 活性および不活性なマキシザィムの二次構造を示す。 高い基質特 異性を達成するためには、 マキシザィムは異常型 BCR- ABL ジャンクションの存在 下 （上段パネル） でのみ活性なコンホメーシヨンを取らなければならない。 他方、 正常型 ABL m R N Aの存在下または BCR-ABいジャンクションの不在下 （下段パネ ル） では、 そのコンホメーシヨンは不活性のままでなければならない。 M z Lお よび M z Rは、 異常型 b2a2 m R N Aの存在または不在によって、 上記のような コンホメーション変化が起こるのを可能としなければならない。
図 1 2は、 i n v i troにおけるマキシザィム活性のァロステリック制御を示す。 t R N A Vaiによって駆動される構成要素を、 5'末端を32 Pで標識した短い 16量体 基質（S16)と共にァロステリックエフェクター分子 〔すなわち、 短い 20量体の正 常型 ABL配列 （ABL20量体） または短い 28量体の BCR- ABL配列 (BCR-ABL 28量体） ] の存在下でィンキュベ一トすることによって、 マキシザィム媒介切断の特異性 を調べた。 M z Lおよびノまたは M z Rを 0. 1 μ Μ の濃度で、 2 ηΜ の 5'末端を3 2Ρ で標識した基質（ S16)と共にインキュベートした。 エフェクター（20量体 ABL または 28量体 BCR- ABL)を用いた場合、 その濃度は 1 であった。
図 1 3は、 HeLa細胞における t R N AVal -酵素の活性を測定するためのアツ セィ系を示す。
図 1 4は、 キメラ BCR- ABL-ルシフェラ一ゼ遺伝子および ABL-ルシフェラーゼ 遺伝子に対する t R N AVaし酵素の効果を示す。 同時トランスフエクシヨンした )3 -ガラクトシダーゼ遺伝子の活性をモニターすることによって測定したトラン スフエクシヨン効率を参考にして、 ルシフェラーゼ活性を標準化した （実施例 7 の 「実験方法」 参照） 。
図 1 5は、 BaF3細胞、 およびヒト L6 BCR-ABL m R N Aを発現する形質導入さ れた BaF3細胞の IL- 3への依存を図式的に示す。
図 1 6は、 M z L転写物の細胞質への輸送の経過を示す。 Nは核画分を、 Cは 細胞質画分を表す。
図 1 7は、 発現された t R N AVal-酵素の定常レベルおよびそれらの局在を示 す。 Nは核画分を、 Cは細胞質画分を表す。
図 1 8は、 t R N AVaし酵素を形質導入した BaF3/p210BCR—ABL細胞および H 9細 胞の生存率の測定結果を示す。 t R N AVal-酵素を発現する BV173細胞の生存率も 示した。
図 1 9は、 t R N AVal-酵素を形質導入した BaF3/p210B(:R— 細胞および H 9細 胞の形態を示す。
図 2 0は、 BaF3/p210BCR—ABL細胞中の L6 BCR-ABL m R N A切断産物のノーザン ブロット分析による直接検出の結果を示す。 図 2 1は、 カスパーゼ- 3の 32-kDa前駆体 （プロカスパーゼ- 3) およびカスバ一 ゼ- 3そのものを認識する抗体 aCPP32 を用いたィムノブロット分析の結果を示す。 マキシザィムによる p210BCR - ABLタンパク質の特異的枯渴が起こった後、 不活性な プロカスパーゼ- 3の切断が活性なカスパーゼ -3を生じた。 図 2 2は、 マキシザィムを導入していない腫瘍細胞を注入したマウス （コント ロール； Mz(- )) とマキシザィムを導入した腫瘍細胞を注入したマウス （マキシ ザィム ； Mz(+)) の解剖前の写真である。
図 2 3は、 マキシザィムを導入していない腫瘍細胞を注入したマウス （コント ロール； Mz (-）） とマキシザィムを導入した腫瘍細胞を注入したマウス （マキシ ザィム ； Mz(+)) の脾臓の写真である。
図 24は、 マキシザィムを導入していない腫瘍細胞を注入したマウス （コント ロール； Mz (-）） とマキシザィムを導入した腫瘍細胞を注入したマウス （マキシ ザィム ； Mz(+)) の胸腺周辺のリンパ節の写真である。
図 2 5は、 マキシザィムを導入していない腫瘍細胞を注入したマウス （コント ロール； Mz( -)) とマキシザィムを導入した腫瘍細胞を注入したマウス （マキシ ザィム ； Mz(+)) の骨髄の写真である。 発明を実施するための最良の形態
本発明を以下の実施例によりさらに具体的に説明する。 本発明の範囲は、 これ らの実施例に限定されることはない。
〔実施例 1〕 マキシザィムの合成
保護基のついた担体 Si基が固定化してある CPG カラムを用いて、 配列番号 1お よび 2のマキシザィムの配列に従い、 脱トリチル基、 カップリング、 キヤッピン グ、 酸化を繰り返し、 RNA を DNA/RNA 合成機 （モデル 394; Applied Biosystems,
Foster City, CA) で化学合成した。 合成終了後、 カラムより RNA を NH30H/Et0H で溶出し、 脱保護、 脱塩処理を行った。 最終的に 20% 変性 PAGEにて目的の鎖長 の RNA を単離した。
〔実施例 2〕 tRNAval配列が付加したタイプのマキシザィムの製造
tRNAval-MzL, tRNAval- MzRの DNA 配列 （図 6の tRNAval- MzL、 tRMva'-MzRの配列） の前に T7 RNAポリメラ一ゼのプロモーター配列 5'TAATACGACTCACTATA3' (配列番 号 4) と GGG の配列を付加した、 2本鎖の DNA を用意した。
これを錶型 DNA として、 試験管内に、 T7 RNAポリメラ一ゼバッファ一、 T7 RNA ポリメラーゼ、 錡型 DNA および NTP を入れ、 37°Cで 2〜 4時間転写反応を行った。 反応後、 5〜 8 %変性 PAGEにより、 目的の鎖長の RNA を単離、 精製した。
〔実施例 3〕 tRNAval配列が付加したあるいは付加しないタイプのマキシザィム の切断活性および基質特異性の評価（in vitro 試験）
基質となる BCR-ABL のジャンクションを含む BCR- ABL 基質、 比較として、 正常 型 ABL exon 卜 ABL exon 2 のジャンクション配列をもつ ABL 基質を用意した。 こ れらの基質をラジオアイソトープ32 P で 5'末端標識した。 この標識した基質とリ ボザィムを次のように混ぜ合わせた （試験管内） 。
50 mM Tris-HCl (pH 8.0)
25 mM MgCl2
1 M マキシザィム
(又は tRNAval付加型マキシザィム）
2 fi la- 32P]標識した基質 （BCR- ABL 基質または ABL 基質）
37°Cで 60分間反応させた後、 8 〜20% 変性 PAGEで反応生成物 （切断され、 短い 鎖長となったもの） を検出した。 マキシザィムは BCR-ABL 基質のみを切断するの で、 ABL 基質からは切断生成物は検出されず、 BCR-ABL 基質を加えたときのみ、 切断による生成物が検出された （図 7 ) 。
〔実施例 4〕 tRNAval配列が付加したあるいは付加していないタイプのマキシザ ィムの反応速度論的解析
速度論的解析を容易に行うために、 短い鎖長の基質、 S16 (GUCトリプレッ トを 含む RNA 16mer)と BCR-ABL ジャンクション部位近傍の配列を含む 20mer の擬基質 (pseudosubstrate)を用意した。 S16 は32 P で標識し、 酵素 （マキシザィム） 過 剰 （シングルターンオーバー） 、 25 mM MgCi2 、 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) と混 ぜ、 切断反応を 37°Cで行った。 その初速度を観察し、 それを Eadie- Hofstee プロ ットにプロットし、 速度定数 kcat 、 kd pp)を検出した。 結果を図 8に示す。
これより、 tRNAval配列が付加していないマキシザィムと、 tRNAva)配列が付加 したタイプのマキシザィムのもつ速度パラメ一ターがほぼ同じであることが分か つた。 これは、 tRNAval配列が、 活性型ダイマ一構造を形成する上で、 不利な状 況を作りだしていないことを意味し、 細胞内での応用に高い期待がもてることが 分かった。
〔実施例 5〕 tRNAval配列が付加したタイプのマキシザィムの発現
Hela 細胞 （国立感染研究所より入手） では、 リポフエクシヨン法により tRNAval -MzL、 tRNAval- MzRの DNA 配列を組み込んだベクタ一 tRNAval- MzL/pUCdt、 tRNAval-M zR/pUCdtを作成し、 それを細胞内へ導入し、 ノーザンハイブリダィゼ一シヨン実 験により、 安定に両 tRNAva'-MzL、 tRNAval- MzR RNAが高発現していることを確認し た。
簡単に説明すると、 市販の pUC119に tRNAvalをくみこんだプラスミ ド pUCdtを制 限酵素 Csp45I 、 Sailで切断し、 そこへ tRNAvaに MzL及び tRNAval-MzRの DNA配列を Cs p45I 、 Sal Iで切断した断片を DNA Ligaseで連結し、 tRNAvaに MzL/pUCdt及び tRNAv al-MzR/pUCdtの両ベクタ一を作成した。 リポフエクチン （Gibco- BRLにて販売） を用いて、 細胞内へベクタ一をトランスフエクシヨン （リポフエクシヨン法） し、 3 6時間培養した細胞から、 細胞内で発現している全 RNA を抽出した。 この細胞 抽出 RNA を用いてノーザンハイブリダィゼ一シヨンを行い、 MzL及び MzR配列に相 補的な配列をもつ DNAをプローブとして、 ミニザィムの細胞内での発現を検出し た。
〔実施例 6〕 ヒト t RNAVal-プロモータ一の制御下にある新規なマキシザィム の具体的設計、 および BCR- ABL mRN Aのジャンクション配列によるその活性の ァロステリック制御の in vitro実証
CMLの治療のための遺伝子療法にマキシザィムを適用するためには、 マキシザ ィムが構成的に、 かつ強いプロモーターの制御下で、 in vivoにおいて発現され ることが重要である。 我々は各単量体ユニットを RNAポリメラ一ゼ III (Geidu schekおよび Tocchini- Valentini, 1988; Perrimanおよび de Feyter, 1997)によ つて認識されるヒト t RNAVal -プロモーター配列（Baierら， 1994; Yuら， 1995;
Kawasakiら， 1996, 1998; Bertrandら， 1997) の下流に組み込み、 Mz L (マ キシザィム左） および M z R (マキシザィム右 ； 図 6) を創出した。 ポリメラー ゼ 111プロモーターの制御下における高レベル発現は、 マキシザィムを治療剤と して用いる場合、 明らかに有利であろう。 そして、 そのような発現は二量体化の 可能性をも増大させるであろう。
高い基質特異性を達成するため、 我々のマキシザィムは異常型 BCR-ABぃジャン クシヨンの存在下でのみ活性なコンホメ一ションを取らなければならない （図 1 1、 上段のパネル） 。 他方、 そのコンホメーシヨンは正常型 ABL mRNAの存在 下および異常型 BCR- ABLジャンクシヨンの不在下では不活性のままでなければな らない （図 1 1、 下段のパネル） 。 図 1 1に示す具体的に設計された配列 （セン サ一アームの長さおよび配列、 ならびに共通ステム IIのそれらが変数であること に留意されたい） は、 異常型 b2a2 mRNAの存在または不在に依存する上記の ようなコンホメ一シヨン変化を可能としなければならない。 この現象は、 ァロス テリックなタンパク質性酵素の、 エフェクター分子に応答したコンホメ一シヨン 変化に似ているであろう。 我々のマキシザィムの活性および特異性を、 同一の切 断部位を標的とする従来の野性型リボザィム（ wt R z) および従来のアンチセ ンス付加型リボザィム （asRz52および asRz81; 図 1 0) のそれらと比較するため、 後者の 2種類のリボザィムを t RNAVal遺伝子の 3' 部分に組み込んだ。
コンホメ一シヨン変化が異常型 L6 b2a2 mRNAの存在または不在に依存する ことを in vitroにおいて証明するため、 我々は図 1 1の上段パネルに大文字で示 す標的部位に対応する短い、 16ヌクレオチド（nt)からなる BCR- ABL基質（S16)を調 製した。 in vitroで転写されたマキシザィムを、 5' 末端を32 Pで標識した短い 1 6量体基質（S16)と共に、 20量体正常 ABLエフェクター分子または 28量体 L6 BCR-AB Lエフェクター分子の存在下および不在下でィンキュペートすることによって、 特異性を試験した。 これらのエフェクター分子は、 図 1 1の下段パネル左側の正 常型 ABL mRNAおよび図 1 1の上段パネルの異常型 L6 b2a2 mRNAに大文字 で示す配列にそれぞれ対応していた。
実験方法
t RN Aを組み込んだ酵素の発現のためのプラスミ ドの構築
各酵素 （Mz L、 Mz R、 wt R z, asRz52および asRz81) およびポリメラ一 ゼ III終止配列 （Geiduschekおよび Tocchini- Valentini, 1988) をコードする化 学的に合成したオリゴヌクレオチドを P C Rによって 2本鎖配列に転換した。 Cs P 45 Iおよび Sail で消化した後、 適切な断片をそれぞれ pVの t RNAVal-プロ モータ一の下流にクローン化した （pVは、 pMX puroベクタ一の EcoR Iおよび Sail 部位の間にヒト t RNAVal遺伝子の化学的に合成したプロモータ一を含んでい た ； Kitarauraら， 1995)。 構築物の配列は直接配列決定によって確認した。
マキシザィムおよびリボザィムの活性の in vitroアツセィ
マキシザィムおよびリボザィムの活性のアツセィは、 25 mM MgC 12および 50
Tris-HCl (pH 8.0)を用いて、 酵素飽和 （ 1代謝回転） 条件下で 35°Cで 60分間の インキュベーションを行なって実施した （図 1 2) 。 T 4ポリヌクレオチドキナ —ゼ （宝酒造、 京都、 日本） により基質を [γ—32 P]-ATPで標識した。 各酵素を
1 μΛ の濃度で、 2 ηΜ の 5'末端を32 Ρ で標識した S16と共にィンキュベ一トし た （ 「結果」 参照） 。 各酵素および基質を含む緩衝化溶液に MgCl2を加えること によリ反応を開始させ、 次に得られた各反応混合物を 37°Cでインキュベートした。 最後に、 反応混合物を 8%ポリアクリルアミ ド Z7 M 尿素ゲルを用いた電気泳動に かけた。
果
b2a2 mRN Aのジャンクション配列に対応する 28量体 L6 BCR-ABLェフエクタ 一分子は、 トランスに作用した。 この分子は Mz Lおよび Mz Rというセンサー アームによって認識されてァ二一リングされるに違いなく、 そして活性な二量体 の形成を引き出すのに役立つに違いない。 マキシザィムの他の認識アームは短い 16量体 BCR-ABL基質 RNAにおける切断トリプレツトを認識し、 そして特異的切 断が起こった （図 1 2、 右側） 。 BCR- ABいジャンクションの不在下、 または正常 型 ABL 配列 （エフェクター分子） の存在下では、 基質の切断産物は全く検出され なかった。 このことは、 予想されたマキシザィムの高い基質特異性を示すもので ある。
エフェクター分子の存在下および不在下において、 M z Lまたは M z Rは単独 では何ら切断活性をもたなかったので、 活性種は明らかに図 1 2の下段右側に示 す二量体形のマキシザィムであり、 これが 4分子相互作用に関与したのである。 原則として、 従来のリボザィムによる 2分子相互作用は、 4分子相互作用よりも 有利なはずである。 それにもかかわらず、 マキシザィムの切断活性はハンマーへ ッド型リボザィムのそれにほぼ等しかった （w t R z ; データは記載していな い） 。 培養細胞中でマキシザィムの活性が従来のハンマ一ヘッド型リボザィムの それよりも大きいことも、 以下の文節に示すように実証された。 エフェクター配 列を図 1 1に示すように切断配列に連結した場合にも、 同様の結果が得られ、 マ キシザィムは 3分子相互作用に関与した （データは記載していない） 。 図 1 2に 示す結果は以下のことを証明している。 すなわち、 マキシザィムはトランスに付 加されたエフェクター分子 （BCR-ABいジャンクション配列） に応答して起こるに 相違ないコンホメーシヨン変化 （図 1 1に示す） にしたがって完全なァロステリ ック制御を in vi troにおいて受けた。 さらに、 上記の結果により、 t R N AVal部 分はァロステリック制御を妨げないことが確認された。
〔実施例 7〕 哺乳動物細胞におけるマキシザィムおよび従来のハンマーへッド型 リボザィムの細胞内活性の比較
次に、 我々はレポーター構築物を用いて哺乳動物細胞におけるマキシザィムの 作用を検討した。 マキシザィムの細胞内活性を評価するため、 我々はヒト t R N AVal -プロモーターの制御下にある適切な酵素ュニットをコードする発現プラス ミ ド、 ならびに標的キメラ BCR- ABL (または ABL単独） 配列およびルシフェラーゼ 遺伝子をコードする標的遺伝子発現プラスミ ド pB2A2- luc (または pABL- luc) を用いて、 HeLa細胞を同時トランスフエクシヨンした。 ジャンクション配列発現 プラスミ ド pB2A2-luc は、 BCR-ABLジャンクションを包含する 300ヌクレオチドの 配列を含んでいた。 プラスミ ド pABL-lucは、 正常型 ABL m R N Aのェキソン 1 と ェキソン 2の間のジャンクションを包含する 300ヌクレオチドの配列を含んでい た。 それぞれの細胞溶解物中で両遺伝子を一過性に発現させた後、 我々はルシフ エラーゼ活性を測定することにより各酵素の細胞内活性を推定した。
実験方法
転写による t R N AVaに酵素の調製
図 1 3に示す t R N AVal-酵素発現べクタ一は、 転写用の D N A錡型を構築す るための P C Rの D N A銃型として用いた。 各鋅型についてプライマーを合成し、 センス鎖は T 7プロモータ一を含んでいた。 i n vi troにおける T 7転写および精 製を文献に記載されているように実施した （Kuwabaraら， 1996)。
一過性トランスフエクシヨン後のレポ一タ一活性のァッセィ
PicaGene Kit (東洋インキ、 東京、 日本） を用いて文献 （Kosekiら， 1998) に 記載されているようにルシフェラ一ゼ活性を測定した。 |3 -ガラクトシダ一ゼ活 性を参考にしてトランスフエクシヨンの効果を標準化するために、 pSV- /3-ガラ クトシダ一ゼコントロールベクター（Promega, Madison, WI)を用いて細胞を同時 トランスフエタトした。 次に、 発光 ;9-ガラクトシダ一ゼ遺伝子レポ一タ一系（C1 ontech, Palo Alto, CA)を用いて Kosekiらの方法に従って；3 -ガラクトシダ一ゼ による化学発光シグナルを定量化した（Kosekiら， 1998)。 標的遺伝子発現プラスミ ド （pB2A2-luc または pABL- luc) を用いた場合に記 録されたルシフェラ一ゼ活性を 100%とした （図 1 4) 。 t RNAVal部分 （pV) 単 独の発現は、 何ら抑制効果を示さなかった。 対照的に、 新規なマキシザィム（PV - MzL/R)は細胞培養物中で BCR- ABL-ルシフェラーゼ遺伝子を抑制するのに極めて効 果的であった（>95% 抑制） （図 1 4、 右パネル） 。 そして、 このマキシザィムは ABL-ルシフェラ一ゼ遺伝子の発現に対しては何ら抑制効果を有さなかった （図 1 4、 左パネル） 。 このことは上記マキシザィムの極めて高い特異性を示している。 予想された通り、 上記マキシザィムと同一の部位を標的とする従来のハンマーへ ッド型リボザィム （pVwtRz) は、 BCR- ABL-ルシフェラ一ゼ遺伝子および ABL-ルシ フェラ一ゼ遺伝子の両方の発現を抑制した。 高い特異性をもつものと最初に予想 されたにもかかわらず、 従来のアンチセンス付加型リボザィム （pVasRz8Iおよび pVasRz52) もまた BCR- ABL-ルシフェラ一ゼ遺伝子および ABL-ルシフェラ一ゼ遺伝 子の両方の発現を抑制し、 非特異的に作用したことに注意することが重要である。 このことは in vitroにおける我々の以前の発見と一致していた （Kuwabaraら， 19 97)。 さらに、 従来の （アンチセンス付加型） リボザィムによる抑制の程度はマ キシザィムによる抑制ほど大きくなかった。
マキシザィムの各サブユニット （Mz L·ぉょびM z R) は何ら抑制効果を有さ なかった。 したがって、 マキシザィムの活性は哺乳動物細胞中での活性なヘテロ 二量体の形成から生じるに違いない。 さらに、 マキシザィムは、 マキシザィムに よる潜在的切断部位を有する関連した ABL-ルシフェラーゼ遺伝子に影響を及ぼす ことなく BCR-ABL-ルシフェラ一ゼ遺伝子の発現を特異的に抑制したので、 完全な ァロステリック制御が哺乳動物細胞中で働いたに違いない。 我々の知るかぎり、 これは人為的に作製された酵素の活性の、 哺乳動物細胞中における完全なァロス テリック制御の最初の実例である。
〔実施例 8〕 ヒト L6 BCR-ABL m R N Aを発現する BaF3細胞系 （BaF3/p210BCR-AB ) 、 および t RNAVaにリボザィムまたは t RNAVaにマキシザィムを形質導入 した BaF3/p210BGR—皿および H 9細胞系の安定な形質転換体の作製
マキシザィムは HeLa細胞中でレポーター遺伝子構築物に対して効率的に且つ特 異的に作用したので （実施例 7) 、 我々は内因性の BCR-ABL (L6 b2a2 mRNA) 標的に対するマキシザィムの活性を調べることにした。 我々は、 p210BGR—ABLを発 現するプラスミ ド構築物 (pMX/p210BCR-ABL； p210BCR—ABLはヒト L6 b2a2 mRNAか ら作製した） を組み込むことにより、 ヒト L6 b2a2 mRNAを持続的に発現する マウス細胞系 BaF3/p210BCR-ABLを確立した。 この細胞系 （L6 b2a2 mRNAを発 現する） は、 Daley および Baltimore (1988)および Chooら（1994)が以前に用いた 細胞系 （K28 b3a2 mRN Aを発現する BaF3+p210 細胞） とは異なることを強調 すべきであろう。 親である BaF3細胞系はインターロイキン 3 (IL-3) 依存性造血 細胞系 （Daleyおよび Baltimore, 1988;図 1 5の左パネル） であるが、 形質転換 された BaF3/p210BCR-ABLは p210B(:R-ABLのチロシンキナ一ゼ活性のゆえに IL- 3非依存 性であった。 したがって、 後者の形質転換細胞は IL-3の不在下で増殖することが できた （図 1 5、 右） 。 しかし、 p210B —ABLの発現が抑制されたならば、 BaF3/p2 10B(;R- 細胞は IL- 3依存性となり、 IL- 3の不在下では該細胞はアポトーシスを起 こすに違いない。 したがって、 マキシザィムまたはリボザィムを形質導入した Ba F3/p210BCR— 細胞の選択の際には、 我々は IL- 3の供給源として 10% WEHIでならし た RPMI培地を用いた。 IL-3の存在下で、 プラスミ ド pV、 pVwtRzおよび pV- MzL/R
(図 1 3) を用いて BaF3/p210BCR- 細胞を別々にトランスフエクトした。 これら のプラスミ ドは全てピューロマイシン耐性遺伝子をコードしていた。 t RNAVal、 w t R zまたはマキシザィム構築物を安定に形質導入した BaF3/p210Bt:R— 細胞を 作製するため、 トランスフエクシヨンの 24時間後に 10% FCSおよび 3 g/mlのピ ユーロマイシンを補充した RPMI培地に交換した。 形質導入細胞をさらに 60時間培 養し、 次にアポト一シスをアツセィするため IL- 3を培地から除去した （下記参 照； 図 1 8〜 2 1に結果を示す） 。
マキシザィムの特異性を調べるため、 我々はヒト T細胞由来の H 9細胞も使用 し、 コントロールとして正常型 ABL mRNAの発現に対する効果も調べた。 マキ シザィムまたはリボザィム構築物を担持する安定に形質導入された H 9細胞は、 上記の各プラスミ ドを用いて作製した。 トランスフエクシヨンの効率が非常に低 かったため、 我々はレトロウイルスのプロデューサ一細胞系 （B0SC23細胞） を用 いて形質導入細胞を作製した。 プラスミ ド pV、 pVwtRzまたは pV- MzL/Rを用いてト ランスフエクトした B0SC23細胞の上清を濾過し、 H 9細胞に加えた。 この H 9細 胞を 72時間培養し、 次に耐性細胞の選択のためにピューロマイシンを添加した。 形質導入細胞の種々の系は、 我々が （レポ一ター構築物ではなく） 内因性標的遺 伝子に対するマキシザィムおよびリボザィムの活性および特異性を調べることを 可能とした。
実験方法
BaF3/p210BGR—ABL細胞系の構築
IL-3の供給源として WEHIならし培地の存在下で増殖させた BaF3細胞をレトロゥ ィルス感染させることによって、 ヒト L6 BCR-ABL m R N Aを安定に発現する細 胞を得た。 Mullerらの手順にしたがって （Mullerら， 1991)、 pMX- p210BCR— ABLべク タ一 （ヒト L6 BCR-ABL mRNAをコードする） を有する B0SC23細胞中にヘルパ —をもたないレトロウィルスストツクを産生させた。 BaF3細胞のレトロウィルス 感染を、 Pendergastらの方法に従って実施した（Pendergastら， 1993)。 感染の 72 時間後に IL- 3を除去し、 融合遺伝子を発現する集団の選択を可能とした。 BaF3/p 210BGR—ABL細胞は、 10%ゥシ胎児血清（FCS; Gibco-BRL, Rockville, MD)および 3 g/m 1のピューロマイシン（ G i bco- BRL )を補充した RPM I - 1640培地中で維持した。 〔実施例 9〕 マキシザィムの効率的発現および細胞質への効率的輸送
発現レベルおよび発現されたリボザィムの半減期に加えて、 リボザィムとその 標的との共局在は明らかにリボザィムの in vivoにおける有効性の決定要素であ る （Sul lengerおよび Cech、 1993; Ecksteinおよび Li 1 ley, 1996; Bertrandら， 1 997)。 それゆえ、 我々の t RNAVa'-酵素のそれぞれの細胞内局在を確認するこ とが不可欠である。 BaF3/p210BGR-ABL細胞におけるマキシザィムの発現および相対 的安定性を確認するため、 我々はノーザンプロッ ト分析を実施した （図 1 6およ び 1 7) 。 種々のプラスミ ドを用いてトランスフエクトした BaF3/p210B(:R-ABL細胞 の全 RN Aをトランスフエクシヨンの 2、 4、 6、 12、 18、 24、 30および 36時間 後に抽出した。 また、 全 RNAのサンプルは核画分および細胞質画分に分離した。 実験方法
ノーザンブロット分析
BaF3/p210BCR-ABL細胞における標的 mRNAおよび t R N AVal-酵素転写物の発 現をアツセィするため、 IS0GEN™ (二ツボンジーン、 富山） を用いて全 RNAを 単離した。 細胞質 RN Aおよび核 RN Aを Huang および Carmichaelの方法に従つ て分離した（Huangおよび Carmichael, 1996)。 1レーンあたり 30 の全 RN A をァガロースゲル（FMC Inc. , Rockland, ME)に負荷し、 次に RNAバンドを Hyb ond- N™ナイロン膜 （Amersham Co.， Buckinghams ire, UK)に転写した。 T4ポ リヌクレオチドキナーゼ （宝酒造、 京都、 日本） によって32 Ρ で標識してある Μ z L、 Mz R、 wt R zおよび L6 BCR-ABいジャンクションの配列 （図 1 0) に相 補的な合成オリゴヌクレオチドをプローブとして上記ナイロン膜を釣り上げた。 プレハイブリダイゼ一シヨンおよびハイブリダイゼーションを Koseki らの方法 に従って実施した（Kosekiら， 1998)。
結果
サイズが Mz Lに一致する、 長さ約 130ヌクレオチドの転写物が検出された (図 1 6) 。 最初から Mz L転写物は細胞質画分に見いだされ、 核画分には全く 検出されなかった （図 1 6) 。 細胞質におけるマキシザイムレベルの経時変化を 図 1 6の右側のパネルに示す。 M z Lは 4時間以内に検出され、 その発現レベル はトランスフエクションの 24時間後に平坦域に達した。
次に、 我々は各マキシザィムおよびリボザィムをコードするプラスミ ドを用い て安定に形質導入した BaF3/p210BCR—ABL細胞における M z L、 M z Rおよび w t R zの定常レベルおよび局在を調べた。 この分析には、 前の文節に記載した IL-3の 除去後 3日目に単離した全 RNA (図 1 7) を用いた。 図 1 7の結果は、 各 t R NAVaに酵素が有意なレベルで発現されたこと、 およびそれらの転写物が明らか に安定であったこと、 を明確に示している。 さらに、 全ての t RNAVal-酵素が 細胞質画分に見いだされた。 核画分に有意なレベルで見いだされたものはなかつ た。 核内にとどまる U 6 snRN Aの局在の分析（Ternsら， 1993)を対照として本 研究に含めた （図 1 6、 1 7) 。 H 9細胞における各 t RNAVal-転写物の類似 した安定性および細胞質への局在もまたノ一ザンプロット分析によリ確認された (データは記載していない） 。
一過性に発現された転写物 （図 1 6) および安定な形質転換体における転写物 (図 1 7) の両方が安定でぁリ、 かつ標的と細胞質中に共局在していたという発 見は、 我々の改変した t RNAVal-発現系が包蔵する将来の遺伝子療法における 有用性を強調するのに役立つ。
〔実施例 1 0〕 内因性の BCR-ABL細胞性標的に対するマキシザィムの活性および 特異性
我々はアポトーシスの調節におけるマキシザィムの機能的重要性を検討した。 我々は野性型リボザィム（pVwtRz)、 マキシザィム（pV-MzL/R)または親べクタ一
(pV) をコードするプラスミ ドを用いて、 L6 BCR-ABL (b2a2) mRNAを安定に 発現する BaF3細胞をトランスフエクトし、 24時間後にピューロマイシンに暴露し て細胞を選択した。 ピューロマイシンの存在下で 60時間ィンキュベ一トした後、 死滅細胞を Ficolによって除去し、 ピューロマイシン耐性細胞は IL- 3を含まない 培地で種々の時間培養した。 トリパンブル一色素を排除する能力によって細胞の 生存率をアツセィした。 BaF3/p210BCR—ABL細胞の他に、 正常型 ABL mRNAを高レ ベルで発現する H 9細胞をコントロールとして用いた。
実験方法
細胞生存率およびアポトーシス
細胞生存率はトリパンブル一排除によって測定した。 アポト一シスは Reuther らの方法に従って測定し（Reutherら， 1998)、 核形態を調べるため lO^g/mlの Hoe chst33342 (二ツボンジーン、 富山） を用いて細胞を 15分間染色した。 洗浄し、 9 0¾ グリセ口一ル /20 mM Tris (pH 8.0)/0.1% N-没食子酸プロピルを用いてマウ ントした後、 蛍光顕微鏡 （ニコン、 東京） を用いてスライ ドを検査した。 結果
図 1 8に示すように、 マキシザィムを発現する BaF3/p210ra—肌細胞は、 コント ロールプラスミ ドを用いてトランスフエク卜した BaF3/p210BGR— ABL (pV) 細胞と較 ベて加速された速度で死亡した。 結果を図に示したこの実験において、 マキシザ ィムをトランスフエタトした BaF3/p210BCR—ABL細胞は、 例えば、 IL-3除去の 10日後 には約 20%しか生き残っていなかった。 これに対して、 BaF3/p210BCR—ABL (pV) 細 胞はほぼ 100%生き残つていた （図 1 8、 左） 。 さらに、 マキシザィムは正常型 AB L m R N Aを発現する H 9細胞を殺さなかった （図 1 8、 中央） 。 これは、 キメ ラ BCR-ABL遺伝子を標的とする高い特異性を示す結果である （直接証拠について は下記参照） 。 対照的に、 従来のハンマーヘッド型リボザィム w t R zは、 BaF3 /p210BcR^L細胞および H 9細胞の両方にアポトーシスを誘導した （図 1 8、 左お よび中央） 。 このことは、 w t R zが in vi troおよび培養細胞において BCR- ABL 遺伝子と正常な ABL遺伝子の両方の転写物を標的にしうるという観察 （図 1 2お よび 1 4 ) に一致する。 さらに、 マキシザィムは、 野性型リボザィムまたは親べ クタ一を発現する細胞と比較して、 フィラデルフィア染色体を有する白血病患者 由来の BV173細胞 （東京大学医科学研究所より入手） に大々的に細胞死を引き起 こした （図 1 8、 右） 。
死亡細胞を D N A結合蛍光色素 Hoechst33342で染色して顕微鏡で調べると、 濃縮されたクロマチン、 断片化された核および縮まった細胞サイズを含む典型的 なアポト一シス形態が明らかになった （図 1 9 ) 。 マキシザィム （pV- MzL/R) が 正常な H 9細胞に影響を及ぼすことなく BaF3/P210B(;8— 細胞に特異的にアポトー シス的細胞死を引き起こしたことは明らかであった。 これに対して、 リボザィム
(pVwtRz) は BaF3/p210BGR—ABL細胞および H 9細胞の両方にアポトーシスを誘導し た。 予想されたように、 コントロール t R N AVal R N A単独 （pV) の発現はど ちらの細胞の形態も変化させなかった。 BaF3/p210BCR- 細胞において、 マキシザ ィムによって誘導されたアポトーシスのレベルは w t R zによって誘導されたそ れよりも高かった。 これは、 マキシザィムの内因性標的に対する従来のリボザィ ムょリも高い切断活性を示すものである。
〔実施例 1 1〕 マキシザィムおよびリボザィムによる L6 BCR-ABL m R N Aの切 断および増強されたプロカスバ一ゼ -3の活性化の直接証拠
マキシザィムおよびリボザィムはアポト一シスの BCR- ABL媒介抑制を克服した ので、 我々はノーザンプロット分析によって予想される切断産物の直接検出を試 みた （図 20) 。 IL-3除去の 0.5、 1、 3および 5日後に、 t RNAVal-酵素を形 質導入した BaF3/p210BCR - ABL細胞の全 RN Aを抽出した。 L6 BCR-ABL mRNAの レベルをオートラジオグラムから測定した。 切断産物の長さは正確に予想通りで あった （約 3 kb)。 t RNAVal-酵素の存在下における L6 BCR-ABL
mRNAの減少の経時変化を図 2 0の下段パネルに示す。 このグラフでは、 BaF3 /p210BCR—ABL細胞中の L6 BCR-ABL mRNAの基礎レベルを 100%とした （図 20上 段の 「コントロール」 と題するグラフは各測定時における L6 BCR-ABL mRNA 発現の基礎レベルを示す） 。 コントロールである t RNAValRNA (pV) の場合、 発現された L6 BCR-ABL m R N Aのレベルに減少は全く見られなかった。 L6 BCR- ABL mRNAの消失速度は、 マキシザィムを産生する細胞における方が w t R z を産生する細胞におけるよりも明らかに速かった。 L6 BCR-ABL mRNAの半減 期は、 マキシザィムを産生する細胞および w t R zを産生する細胞においてそれ ぞれ約 3日および約 10日であった。 マキシザィムの発現の結果生じる内因性 BCR -ABL mRNAの切断産物は、 BV173 細胞においても確認された （データは記載 していない） 。 これらの断片の検出は、 マキシザィムおよび従来のリボザィムが 培養細胞中で触媒的に活性であり、 標的 mRNAを特異的に切断したことを証明 した。 したがって我々は、 図 1 8および 1 9に示す細胞のアポト一シスは、 L6 B CR-ABL mRNAがマキシザィムによって、 または L6 BCR- ABLおよび ABL mRN Aがリボザィムによって切断され、 その結果、 各造血幹細胞において p210BGR— ABL およびノまたは P 145 c-ABLタンパク質が枯渴したことから生じたことを確認した。 pl45 c-ABL タンパク質は低い固有のチロシンキナーゼ活性を有する核タンパク 質である。 他方、 p210BCR—ABLタンパク質はアポトーシスを抑制することによって 造血幹細胞の生存を延ばす、 構成的に高レベルのチロシンキナーゼ活性を有する 細胞質性の膜結合タンパク質である。
アポトーシスシグナルの伝達およびアポトーシスの達成には、 いくつかのァス パラギン酸特異的システィンプロテア一ゼ 〔カスパーゼ（caspase)として知られ ている〕 の協調作用（coord i nated act i ons )が必要である。 アポト一シスの BCR - A BL媒介抑制とプロカスパーゼ- 3の活性化の間の逆の（inverse)関係が最近 Dubrez ら（1998)によって証明された。 それゆえ、 我々はマキシザィム （またはリボザィ ム） 媒介アポトーシス経路が実際に白血病性細胞におけるプロカスパーゼ- 3の活 性化をもたらすかどうかを検討した。 我々はマキシザィムによる p210BCR—肌タン パク質の特異的枯渴が不活性なプロカスパーゼ -3の切断をもたらし、 活性なプロ カスパーゼ- 3を生じて、 その結果 BaF3/ p210BCR— ABL細胞にアポトーシスを起こすの かどうか、 を問うた。 カスパーゼ- 3の 32 kDaの不活性な前駆体 （プロカスパーゼ -3) およびプロセシングされた活性なプロテアーゼであるカスパーゼ -3の両方を 認識する抗体 a CPP32 を用いたィムノブロット分析は、 我々が成熟プロセスを追 跡するのを可能とした。 マキシザィムの特異性を調べるため、 我々は H 9細胞を 用いて類似の試験を行なった。
実験方法
ウェスタンブロット分析
細胞溶解物を 15% ポリアクリルアミ ドゲルを用いた SDS- PAGEにかけた。 プロ力 スパ一ゼ -3およびプロセシングされた pl7 (カスパーゼ -3) の両方を認識するゥ サギポリクロ一ナル抗体 a CPP32 (Univers i ty of South Fl ori da, Co l l ege of M ed i c ineの Hong-Gang Wang教授から好意により提供された） を用いて、 アポト一 シスを起こした BaF3/p210B(:R-AB1"細胞および H 9細胞におけるプロカスパーゼ- 3の 活性化を検出した。 ブロッキングおよび検出は Dub r ezらの方法に従って実施した
(Dubrezら， 1998)。
結果
プロカスバ一ゼ- 3の基礎レベルは、 BaF3/p210BCR-ABL細胞および H 9細胞におい てほぼ同一であった （図 2 1 ) 。 マキシザィムを形質導入した BaF3/p210BGR—ABL細 胞においては、 プロカスパーゼ -3のレベルは低下し、 カスパーゼ- 3の pl7 活性サ ブュニットのレベルが増大した。 安定にマキシザィムを形質導入した H 9細胞に おいては、 プロカスパーゼ- 3のレベルは変化しなかった。 対照的に、 野性型リボ ザィムの発現は、 BaF3/p210BGR—ABL細胞および H 9細胞の両方においてプロカスバ —ゼ- 3のプロセシングを伴った。 安定にマキシザィムを形質導入した BaF3/p210B GR-ABL細胞におけるプロカスパーゼ- 3からカスパーゼ- 3への転換率は、 wt R zを 形質導入した BaF3/p210BCR— 細胞における転換率よりも高かった。 これらのデー タは、 マキシザィムは p210BGR - ABLタンパク質を特異的に枯渴させ、 それにより白 血病性細胞におけるカスパーゼ- 3の活性化を促進し、 その結果アポトーシスを誘 導した、 という我々の結論を強化した。
〔考察〕
我々は本明細書に、 特定のリン酸ジエステル結合を選択的に切断する、 ァロス テリックに調節された RNA触媒 （マキシザィム） の我々の知るかぎり最初の新 規な設計を記載した。 この設計は、 活性部位から少し離れた所に位置するセンサ 一アームによって認識される特定の短い配列 （目的配列； 図 1 ) との相互作用に よって触媒的に活性化される二量体 RNAモチーフに基づいていた。 t RNAVal を組み込んだマキシザィムの設計は、 ヒト t RNA遺伝子の t RNAVal部分の 3' 改変側にリボザィム配列を結合させるのに我々が以前成功したことに基づい て実施した。 この成功は、 培養細胞において高い特異性を有する非常に活性なリ ボザィムをもたらした （Kawasakiら， 1996， 1998)。 我々は初め転写物の t RN AVal部分が t RNAVaI駆動 RNAの二量体化を妨げるのではないかと恐れていた 力 \ 二量体化の間双方の t RNAVal部分は相手から若干離れた所に位置し、 した がってそれらは二量体化プロセスを妨げないことが我々の分析によって示された (Kuwabaraら， 1998)。 今回の分析は、 マキシザィムの t R N AValによって駆動さ れる単量体ユニットの二量体化を確認した。 より重要なことに、 t RNAValによ つて駆動されるマキシザィムは、 in vitroにおいてのみならず （図 1 2) 白血病 患者由来の細胞を含む種々の培養細胞においても、 ァロステリックエフェクター (図 5) に応答してコンホメ一シヨン変化を受ける。
人工的なァロステリック酵素の創成は現在大きな関心を呼んでいるが （Porta および Lizardi, 1995; Tangおよび Breaker, 1997a, 1997b) 、 我々が知るかぎり、 そのような酵素がこれまで動物細胞または培養細胞において試験されたことは全 くなかった。 我々の新規なマキシザィムは、 培養細胞中で正常型 ABL mRNAを 損なうことなく L6 BCR-ABL m R N Aを特異的に切断し、 人工的に作製したァロ ステリック酵素の活性のァロステリック制御の最初の成功例を提供した。 L6 BCR -ABL mRN Aをアンチセンス分子によって破壊しょうとした過去の努力におい ては、 特異性を示すことが困難であった。 P210BCR—ABLキメラタンパク質および P 14 5 c-ABLタンパク質は共にアポト一シスの負のレギュレーターであるので （Chapm anら， 1994; Laneuvilleら， 1994; Spooncerら， 1994; Bediら， 1994, 1995; Mc Gahonら， 1994, 1995; Dubrezら， 1998)、 特異性の低いアンチセンス分子は BCR - ABL経路をブロックすることに加えて正常型 ABL mRN Aの発現を抑制すること によって白血病性細胞にアポトーシスを誘導する場合がある。 実際、 最近の刊行 物には、 アンチセンス分子で処理したアポトーシス性細胞において p210BGR—ABLタ ンパク質レベルの低下が全く観察されなかった、 また、 そのようなアンチセンス オリゴヌクレオチドによる非特異的抑制はそれらの非アンチセンス様式の作用に よってもたらされた、 と報告されている（O'Brienら， 1994; Maekawaら， 1995; M ahonら， 1995; Smetsersら， 1995, 1997; Vaermanら， 1995, 1997)。 我々もまた、 ホスホロチォエート部分の導入等のアンチセンス分子への改変の導入が、 配列特 異的ではない様式で細胞死を引き起こすことを認識した。 我々の掌中では、 BCR - ABLジャンクションに標的を定めた未改変アンチセンス D N Aおよびァンチセン ス付加型の従来のリボザィム （図 1 0および 1 4) さえも、 哺乳動物細胞におい て何ら特異性を示さなかった。 それゆえ、 この種の研究においては、 細胞死が実 際にアンチセンス分子による特異的抑制から生じることを確認することが重要で ある。 この点は少なくとも抑制効果の推定と同じくらい重要である。 我々のマキ シザィムの特異性は相当高かったので、 またセンサーアームおよび共通ステム 11 の長さおよび配列は非常に容易に調節できる変数なので、 マキシザィム全般を他 のキメラ mRNAも切断できるに違いない新しい種類の潜在的に強力な遺伝子不 活性化剤と考えるべきである。
マキシザィムの切断活性、 特に細胞におけるそれは 3分子相互作用 （マキシザ ィムの t RNAValによって駆動される 2つの単量体ュニットと標的基質の間の） を必要とするに相違ない。 対照的に、 従来のリボザィムの活性は 2分子相互作用 ( t RNAValによって駆動される 1つのリボザィムとその標的の間の） を必要と する。 原則として、 2分子相互作用は 3分子相互作用よりも迅速である。 この差 異は、 従来のリボザィムの方が細胞中でマキシザィムよりも効果的であろうとい うことを示すように思われる。 しかし、 我々の実験において幾つかの標的配列を 培養細胞中で試験した際、 我々は t R N AValに駆動される二量体は対応する t R N A Va 1に駆動されるリボザィムよりも常に一層活性であることを見いだした （リ ボザィムとマキシザィムの各セットについて同一の標的部位が用いられた） 。 こ の結論は今回の分析の結果によってさらに強化された。 マキシザィムはリボザィ ムよりも効果的に L6 BCR-ABL m R N Aのジャンクションを切断した。 レポ一タ 一構築物 （図 1 4 ) ばかりでなく、 標的が内因性分子の場合も （図 1 8〜2 1 ) 切断した。 したがって、 我々の t R N AVal発現系を用いる限り、 二量体化プロセ スが関与するにも関わらず、 マキシザィムの細胞内活性は従来のハンマーへッド 型リボザィムのそれよリも有意に高い。
Klugのグループは正確ですつきりした（e l egant)実験において、 3個のジンク フィンガーモチーフからなる注意深く設計された D N A結合べプチドが、 親ゲノ ム配列よりはむしろ BCR-ABL融合ガン遺伝子の独特な 9塩基対領域と特異的に結 合することを示した （Chooら， 1994)。 さらに、 上記ガン遺伝子の作用によって 増殖因子（IL-3)非依存性とされたマウス細胞が、 上記 D N A結合べプチドを発現 するベクターを用いた一過性トランスフエクシヨンの結果、 IL- 3依存性に逆戻り した。 p210BCR—ABLタンパク質は、 IL-3またはォ一トクリン様式で BaF3細胞の増殖 を刺激することができる他の増殖因子の内因性発現の引き金を引かないことに注 意されたい。 むしろ、 p210BGR_ タンパク質は、 通常は IL-3シグナル伝達経路を 介して提供される BaF3細胞の増殖のための刺激を提供する （Daleyおよび Bal timo re, 1988)。 Klugのグループはさらに、 一過性にトランスフエクトされた細胞に おける BCR- ABL m R N Aのレベルが、 トランスフエクトされていない細胞中のそ れに較べて 24時間以内に 15〜18% 低下することを示した。 我々は、 BCR- ABL m R N Aのレベルにおける同様の低下 （マキシザィムの場合、 24時間以内に 35% 低 下；図 2 0 ) が IL- 3への依存性を取り戻すことを見いだした （図 1 8 ) 。
脱調節された BCR-ABLチロシンキナーゼがアポト一シス性細胞死を遅延させる 機構はまだ殆ど解明されていない。 アポト一シスシグナルの伝達およびアポトー シスの達成は、 幾つかのカスパーゼの協調作用を必要とする。 今日までに同定さ れた 10個のヒトカスバ一ゼは、 構造およびヒト始原型であるィンタ一ロイキン 1 /3転換酵素 （I CE) および線虫始原型である CED- 3との相同性の程度に基づいて 4 つのサブファミリーに分類することができる（A l nemr iら， 1996)。 細胞中で過剰 に発現されるとアポトーシスを引き起こすに違いないこれらカスパーゼの全ては、 最初は、 活性なプロテア一ゼを生じるためにはァスパラギン酸残基から遠く離れ た位置で切断を必要とする 1本鎖の不活性なプロ酵素として合成される。 最近の 証拠が、 アポト一シスにおけるカスパーゼの活性化はタンパク質分解カスケ一ド を介して起こることを示した。 例えば、 カスパーゼ -4はプロカスバ一ゼ- 1を活性 化し、 これが次にプロカスパーゼ -3を切断して活性なカスパーゼ -3を生じ、 これ が A s p - G 1 U - V a 1 - A s p ( D E V D ) モチーフを認識してポリ （A D P - リボース） ポリメラーゼを切断する（Enariら， 1996)。 カスパーゼ- 1をもたない マウスはプログラムされた細胞死においていかなる表現型も示さなかった（L iら， 1995)が、 カスパーゼ- 3を欠くマウスは脳における過形成および細胞の無秩序な 発生を示した（Kuidaら， 1996)という発見は、 カスパーゼ- 1はあらゆる種類の細 胞において過多であるのに対し、 カスバ一ゼ- 3は脳のある部分でアポト一シスに おいて重要な役割を果たすのではないかと示唆している（Nagata, 1997)。 アポト 一シスの BCR- ABL媒介抑制において、 BCR- ABL+細胞系ではアポト一シス経路がプ 口カスパーゼ- 3活性化の上流で中断される （Dubrezら， 1998)というごく最近の 発見が、 本研究によって確認された。 マキシザィムの発現による P210bGR—ablの枯 渴は、 不活性なプロカスパーゼ- 3のプロセシングを明らかに促進し、 活性なカス パ―ゼ—3を生じた （図 2 1 ) 。 マキシザィムによる L6 BCR-ABL
m R N Aの選択的切断およびその結果としてのカスパーゼ- 3の活性化 （これは白 血病性細胞にアポトーシスをもたらしたが、 正常細胞にはもたらさなかった） は、 我々の設計した新規なマキシザィムが細胞中で十分機能性であることを実証した。 結論として、 （ 1 ) 我々の新規なマキシザィムは、 L6 BCR-ABL m R N Aの切 断のために、 細胞中で高レベルの活性を有するヘテロ二量体構造を形成したこと、 および （2 ) 切断活性は、 L6 BCR-ABL m R N Aのジャンクションの存在下での みマキシザィムが活性な触媒コアを形成するように細胞内でァロステリックにう まく制御されたこと、 を我々は示した。 マキシザィムは同じように転写された標 準的リボザィムよりも細胞中で一層効果的であった。 我々の知るかぎり、 我々の 新規なマキシザィムはその極めて高い基質特異性ゆえに今日までに報告された他 の核酸に基づく薬物よリも優れている。 この種類のマキシザィムは慢性骨髄性白 血病 （CML )の治療、 特に L 6転座の場合に有用であろう。
[実施例 1 2 ] マキシザィムの in vivo (動物実験） での効果
このマキシザィムは in vivo (動物実験レベル） でも効いた実験結果が得られ た。 簡単に説明すると、 慢性骨髄性白血病にしたマウスにマキシザィムを導入し たところ、 非常に良く癌化が抑制されたのである。
実験方法
まず、 マウスを癌化させるために、 b2a2 typeの CMLヒト患者由来の細胞 （CML の転座型のうち L6転座型の患者由来、 まだ ce l l l ine化していないもので、 東京 大学医科学研究所病態薬理学研究部より入手した。 ） を用いた。 この腫瘍細胞に、 マキシザィムを組み込んだウィルスベクタ一 pMX puro/Dimer (実施例 8， 1 0及 び 1 1の pV- MzL/R) と、 コントロールとなる何も組み込んでいないウィルスべク ター pMX puro(Ki tamuraら， 1995) を感染させた。 詳しい感染条件は、 stroma cel l (骨髄間質細胞；骨髄から取り出した細胞を培養する際に増えてくる線維芽 細胞様の接着細胞。 サイ ト力インを分泌し， 血球系細胞の増殖を促進する。 本実 施例では、 東京大学医科学研究所病態薬理学研究部より入手した。 ） の上で上記 の CML細胞 lx 10の 7乗に、 ウィルスベクタ一 （t i ter 1x10の 5乗） 10 mlを polybrene 10 mi crogram/ ml 下で感染 （m. o. i . 0. 1 ) させた。 ゥイノレスべクタ ―には puromycine耐性遺伝子が組み込まれてあるため、 感染開始 72時間後から puromyc ine 0. 5 mg/mlを培養液中に加えることにより、 マキシザィムが組み込ま れた細胞のみを選択できる （選択時間は 72時間） 。 これらの、 マキシザィムが導 入された患者由来の腫瘍細胞と、 マキシザィムを導入していない腫瘍細胞を、 そ れぞれマウスに注入した。 用いたマウスは N0D-SCIDマウス （Non obes i ty di abetes-systemi c comb ined immunodef i c i ency mouse ; 非肥満型糖尿病一 ¾合 型免疫不全マウス， 従来の SCIDマウスに比べて免疫能がより低く， 種々のヒトの 細胞移植が可能なマウス。 本実施例では、 東京大学医科学研究所病態薬理学研究 O 9 P 11 部より入手した。 ） である。 このマウスの尾静脈に、 puromycineで選択後の腫瘍 細胞 1 X 10の 6乗を注入した。 マウスには投与前に放射線照射して更に免疫能を 落とすこともあるが、 今回は照射していない。
結果
細胞注入後、 1 1週目にマウスを解剖した結果を図 2 2〜 24に示す。 Mz (-） はマキシザィムを導入していない腫瘍細胞を注入したマウス、 Mz(+)はマキシザ ィムを導入した腫瘍細胞を注入したマウスである。 図 22は解剖前のマウスの写 真 （この時点で体重を測定、 表 1参照） 、 図 2 3は脾臓の写真 （矢印で示した 部位） 、 図 24が胸腺周囲のリンパ節の写真である。 図 2 2をみて分かるように、 Mz (-)に比べて、 Mz(+)は全体にふつくらしていて元気良く生育していることが分 かる。 実際に体重を測定すると （表 1) 、 Mz (-)が 24g、 Mz(+)は 34gで 1 Ogも
(通常の N0D-SCIDマウスの 3分の 1 ) 体重差があることが分かった。 つまり、 Mz (-)は癌化が進行し、 痩せ衰えていることを示したものである。 次に、 マウス を解剖して脾臓を比較した （図 2 3) 。 Mz (-)は明らかに癌化が進行して脾臓が 肥大 （0.2 1 g) しているのに対し、 マキシザィムを導入したマウスは、 健常体 と変わらず (0.08g) 脾臓は肥大していない。 同様に、 胸腺周囲のリンパ節を 比較したものが図 24であるが、 マキシザィムを導入したマウスのリンパ節に
(0.0 3g) に対して、 (-)のリンパ節 （0. 2 7g) は、 癌化が進行した形態 を示している。
さらに、 同マウスの骨髄の写真を図 2 5に示す。 Mz (-)の骨髄はほとんどが腫 瘍細胞で占められているのに対して、 マキシザィムを導入したマウス Mz(+)の骨 髄は、 健常体の骨髄液と同様の形状 （腫瘍細胞ではなく、 リンパ球等の細胞が混 在している） が観察された。
現在、 臨床で行われている白血病の治療法のうち、 有効性が確認されているも のは骨髄移植しかない。 しかし、 骨髄移植はどの患者にも適用できるわけではな く、 またその骨髄提供者も多くない。 そのため、 より一般的に適用でき、 かつ安 全な治療法が切望されている。 今回の結果では、 マキシザィムは動物実験レベル でも、 非常に高活性で CMLの癌化を効率良く抑制し、 毒性も認められなかった。 P マキシザィムは、 従来の治療法に比べて患者への適用性も幅広いことから、 慢性 骨髄性白血病の今後の遺伝子治療に大きく貢献するであろう。 表 1
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産業上の利用可能性
本発明のマキシザィムを用いれば、 染色体上の相互転座などが引き金となリ発 病する慢性骨髄性白血病において産生される異常な L6(b2a2)キメラ型 mRNAの発現 を、 正常型 mRNAに全く影響を与えることなく、 特異的に抑制することができる。 従って、 本発明のマキシザィムは、 慢性骨髄性白血病の遺伝子治療や慢性骨髄性 白血病の原因となる L6(b2a2)キメラ型 mRNAの発現抑制剤として利用できる。
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Claims

請 求 の 範 囲
1. 標的 RNAに対してァロステリ ックな RNA切断活性を示す核酸酵素。
2. 下記のヌクレオチド配列（10) を含む RNA分子および下記のヌクレオチド配列
(20) を含む RNA分子が形成する二量体の構造を有する請求項 1記載の核酸酵素。
5'
Figure imgf000056_0001
3' (10)
5' Z2, ··· 1 Y2, … Υ2 Π X , … 2 k 3' (20)
(配列中、 χ^ χ1^ χ^ χ2い 丫^〜丫1い Υ 〜Υ Ζ^ Ζ^および ^〜 2 は、 各々独立に、 A、 U、 T、 Cまたは Gのいずれかであり、
hおよび kは 1以上の整数であり、
iおよび mは 1以上の整数であり、
j は 1以上の整数であり、
nは 1以上の整数であり、
X1, - Χ および X … X2 kは、 標的 RNA中の特異的配列に相補的なヌクレオチド 配列であり、
Y\ ··· Υ および Υ … Υ2 Πは、 ステムを形成するヌクレオチド配列であり、
1 ■■■ Ζ および Ζ ··■ Ζ2 Πは、 標的 RNAの切断部位周辺の配列に相補的である領 域および標的 RNAの存在下でのみ Mg2+イオンを捕捉する空洞を形成しうる領域を 含むヌクレオチド配列である。 ）
3. 標的 RNAが疾病の原因となるキメラ型 mRNAである請求項 1または 2に記載の 核酸酵素。
4. キメラ型 mRNAが慢性骨髄性白血病の原因となる L6 (b2a2) キメラ型 mRNAであ る請求項 3記載の核酸酵素。
5. 下記のヌクレオチド配列（1)を含む RNA分子および下記のヌクレオチド配列 (2)を含む RNA分子が形成する二量体の構造を有する請求項 4記載の核酸酵素。
5' GAAGGGCUUC UUUCAUCGAA ACCCUGAGG 3' (1) (配列番号 1 )
5' CACUCACUGA UGAGAGUUAU UGAUGGUCAG 3' (2) (配列番号 2 )
(ただし、 ヌクレオチド配列（1)の 2 1番目〜 2 9番目のヌクレオチドおよびヌ クレオチド配列（2)の 1 7番目〜 3 1番目のヌクレオチドは標的 RNAの切断部位周 辺の配列に相補的になるように改変されてもよい。 ）
6 . ヌクレオチド配歹 lj (l)および（2)のそれぞれの上流にリンカー配列および tRNA Valプロモーター配列が付加されている請求項 5記載の核酸酵素。
7 . ヌクレオチド配列（1) の上流に付加されているリンカ一配列が下記のヌクレ ォチド配列（3)を含み、 ヌクレオチド配列（2)の上流に付加されているリンカー配 列が下記のヌクレオチド配列（4)を含む請求項 6記載の核酸酵素。
5' AAA 3' (3)
5' UUU 3' (4)
8 . ヌクレオチド配列（1)および（2)のそれぞれの上流に付加されている tRNAVal プロモーター配列が下記のヌクレオチド配列（5)を含む請求項 6記載の核酸酵素。 5' ACCGUUGGUU UCCGUAGUGU AGUGGUUAUC ACGUUCGCCU AACACGCGAA AGGUCCCCGG
UUCGAAACCG GGCACUACAA AAACCAAC 3' (5) (配列番号 3 )
9 . ヌクレオチド配列（1)および（2)のそれぞれの下流に付加配列およびターミネ 一ター配列が付加されている請求項 6記載の核酸酵素。
1 0 . ヌクレオチド配列（1)の下流に付加されている付加配列が下記のヌクレオ チド配列（6)を含み、 ヌクレオチド配列（2)の下流に付加されている付加配列が下 記のヌクレオチド配列（7)を含み、 ヌクレオチド配列（1)および（2)のそれぞれの 下流に付加されているターミネータ一配列が下記のヌクレオチド配列（8)を含む 請求項 9記載の核酸酵素。
5' AAA 3' (6)
5' AACCGUA 3' (7)
5' UUUUU 3' (8)
1 1 . 標的 RNAが疾病の原因となる異常型 mRNAである請求項 1または 2に記載の 核酸酵素。
1 2 . 請求項 1〜1 1のいずれかに記載の核酸酵素をコードする DNAを含む発現 ベ タ■ ~ 0
1 3 . 請求項 1記載の核酸酵素をコードする DNAを含む発現べクタ一 DNAを铸型と して、 RNAに転写することを特徴とする、 請求項 1記載の核酸酵素の製造方法。
1 4 . 請求項 1〜 1 1のいずれかに記載の核酸酵素または請求項 1 2記載の発現 ベクターを有効成分として含む医薬組成物。
1 5 . 標的 RNAが原因となって生じる疾病を予防および または治療するための 請求項 1 4記載の医薬組成物。
1 6 . 請求項 3〜 1 0のいずれかに記載の核酸酵素を生体内で発現させて、 疾病 の原因となるキメラ型 mRNAの発現を抑制または阻害するための請求項 1 5記載の 医薬組成物。
1 7 . フィラデルフィア染色体異常により生じる疾病を予防および Zまたは治療 するための請求項 1 6記載の医薬組成物。
1 8 . フィラデルフィア染色体異常により生じる疾病が慢性骨髄性白血病である 請求項 1 7記載の医薬組成物。
1 9 . 請求項 1 1記載の核酸酵素を生体内で発現させて、 疾病の原因となる異常 型 mRNAの発現を抑制または阻害するための請求項 1 5記載の医薬組成物。
2 0 . 請求項 1記載の核酸酵素を用いて、 標的 RNAを特異的に切断する方法。 2 1 . 標的 RNAが疾病の原因となるキメラ型 mRNAである請求項 2 0記載の方法。 2 2 . 疾病がフィラデルフィア染色体異常により生じるものである請求項 2 1記 載の方法。
2 3 . フィラデルフィア染色体異常により生じる疾病が慢性骨髄性白血病である 請求項 2 2記載の方法。
2 4 . 標的 RNAが疾病の原因となる異常型 mRNAである請求項 2 0記載の方法。
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