WO1999034218A1 - Procede de depistage de la maladie de crohn et kit d'analyse prevu a cet effet - Google Patents

Procede de depistage de la maladie de crohn et kit d'analyse prevu a cet effet Download PDF

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WO1999034218A1
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amylase
disease
crohn
immunoglobulin
enzyme
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Takashi Shimoyama
Tatsuo Tozawa
Masamichi Satomi
Takanori Fukuda
Ryoki Takahashi
Ritsuko Mochida
Haruhisa Hirata
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Wakamoto Pharmaceutical Co., Ltd.
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    • G01N2800/06—Gastro-intestinal diseases
    • G01N2800/065—Bowel diseases, e.g. Crohn, ulcerative colitis, IBS

Definitions

  • the present invention relates to a method for testing Crohn's disease and a kit for testing. More specifically, the present invention relates to a Crohn's disease test method and a test kit which can be easily and rapidly carried out by immunological or enzymatic methods in the clinical test field.
  • Conventional technology relates to a Crohn's disease test method and a test kit which can be easily and rapidly carried out by immunological or enzymatic methods in the clinical test field.
  • Crohn's disease and ulcerative colitis are classified as idiopathic inflammatory bowel diseases for unknown reasons and are identified as intractable diseases of the Ministry of Health and Welfare.
  • the diagnosis is made in accordance with the diagnostic criteria (draft) prepared by the Research Group for Inflammatory Intestinal Intractable Diseases of the Ministry of Health and Welfare.
  • the diagnostic criteria (draft) prepared by the Research Group for Inflammatory Intestinal Intractable Diseases of the Ministry of Health and Welfare.
  • clinical findings, angiography, endoscopy, and histology are combined.
  • some cases are difficult to diagnose using these methods. In particular, it is often difficult to distinguish Crohn's disease from ulcerative colitis.
  • gastrointestinal angiography and endoscopy which are the main diagnostic tools, often involve the physical and mental distress of patients, and require skilled physicians. Therefore, there is a worldwide need for a simple, rapid, and highly accurate specific clinical test method for diagnosing Crohn's disease and ulcerative colitis.
  • Anti-neutrophil antibody (Targan, S., et al .: Gastroenterology, 96, A505, 1989) ⁇ Anti-small intestinal antibody (Bagchi, S., et al .: Cl in . Exp. Immunol, 55, 44-48, 1984), while serum from patients with ulcerative colitis contains anti-tropomyosin antibodies (Das, Kn., Et al .: J. Immunol., 150, 2487-). 2493, 1993) ⁇ Anti-casein antibodies (Knoflach, P., et al .: Gastroenterology, 92, 479-485, 1987) or the presence of anti-mucin antibodies have been reported.
  • An object of the present invention is to provide a simple, rapid, and highly accurate clinical test method for diagnosing Crohn's disease and ulcerative colitis in mammals, particularly humans, and a test kit for use in the method. .
  • the first aspect of the present invention is a method for detecting Crohn's disease, which comprises detecting the presence of an immunoglobulin that reacts with amylase in a sample.
  • the second aspect of the present invention is a method for testing for Crohn's disease, which comprises detecting the presence of immunoglobulin that reacts with amylase in a sample by an immunological assay or an enzymatic assay.
  • the third aspect of the present invention is to provide an immunoglobulin which reacts with amylase in a sample with a support. After reacting with the amylase immobilized on the sample, the labeled product of the substance that reacts with the immunoglobulin that reacts with the amylase is reacted, and the amount of the reaction product is measured.
  • a method for detecting Crohn's disease which comprises detecting the presence of immunoglobulin that reacts with amylase.
  • a fourth aspect of the present invention is that an immunoglobulin that reacts with amylase in a sample is reacted with amylase, and then the enzymatic measurement method includes a step of measuring the amylase activity of the reaction product.
  • This is a method for detecting Crohn's disease, which comprises detecting the presence of immunoglobulin that reacts with amylase.
  • a fifth aspect of the present invention is the method for testing for Crohn's disease, wherein the amylase is bushu's amylase or Pseudoamylase.
  • a sixth aspect of the present invention is a kit for testing for Crohn's disease, which comprises detecting an amylase-reactive immunoglobulin in a specimen, comprising an amylase and a reagent for measuring amylase activity or a reagent for measuring labeled enzyme activity.
  • a seventh aspect of the present invention is a support on which amylase is immobilized; an enzyme-labeled anti-human IgG antibody, an enzyme-labeled anti-human IgA antibody, an enzyme-labeled protein A, an enzyme-labeled protein G, and an enzyme-labeled protein.
  • An eighth aspect of the present invention is the above-mentioned test kit for Crohn's disease, wherein the amylase is bushu's amylase or Pseudoamylase.
  • FIG. 9 is a scatter diagram showing the results of detection of the presence of immunoglobulin that reacts with busha-amylase in serum and serum from normal subjects (Normal, 30 cases). *, Indicates the statistically significant difference between patients with Crohn's disease and patients with ulcerative colitis, stomach ulcer, duodenal ulcer, macroamylaseemia and other diseases and healthy subjects (*: 0.05, **: p ⁇ 0.01). 0.167 is the cut-off value determined from the measured value of the serum of a healthy subject.
  • FIG. 4 is a scatter diagram showing the results of detection of the presence of immunoglobulin that reacts with p-amylase in the serum of normal subjects (Normal, 18 cases). *, Indicates a statistically significant difference between Crohn's disease patients and ulcerative colitis patients, gastric ulcers, duodenal ulcers, macroamylasemic and other diseases and healthy subjects (*: p ⁇ 0.05, **: p ⁇ 0.01). 0.105 is the cut-off value determined from the measured value of the serum of a healthy individual.
  • the present inventors have sought an ideal test method for Crohn's disease in mammals, especially humans, and have conducted epidemiological, immunological, and biochemical studies, and have found that they react with amylase in the blood of Crohn's disease patients. Found that the amount of immunoglobulin The invention has been completed.
  • the present invention provides a method for detecting Crohn's disease, which comprises detecting the presence of immunoglobulin that reacts with amylase in a sample using amylase.
  • an immunological assay such as an enzyme immunoassay, or a t or deviation of an enzymatic assay may be used.
  • an immunological assay such as an enzyme immunoassay, or a t or deviation of an enzymatic assay may be used.
  • the amylase used in the present invention a different type of amylase is used.
  • any non-human amylase other than human may be used.
  • amylase derived from edible animals that is, amylase derived from bush, sea bream, chicken, chicken, etc., is preferable, and amylase derived from bush or sea bream is particularly preferably used.
  • the present invention will be described with respect to a method for testing human Crohn's disease, but the present invention is not limited thereto.
  • a specimen to be subjected to the method of the present invention most of human body fluids can be used, and for example, whole blood, serum, plasma, urine, saliva and the like are preferable. Particularly preferred is serum or plasma of a patient.
  • the immunoassay any method may be used, but an enzyme immunoassay, an immunochromatography and the like are preferable. In each method, immunoglobulin that reacts with amylase in the sample is reacted with amylase immobilized on a support, and then a labeled product of a substance that reacts with the immunoglobulin that reacts with the amylase is reacted. Measuring the labeled amount of the substance.
  • a labeled amount of a reaction product is measured by enzyme activity using an enzyme-labeled product.
  • Imnochromat In the graphic method, a labeled amount of a reaction product is measured based on a colored amount using a labeled colored particle.
  • an enzyme immunoassay which can easily quantify the labeling amount of a reaction product, that is, the amount of immunoglobulin which reacts with amylase in a sample is preferably used.
  • an immunoglobulin that reacts with amylase in a sample is reacted with amylase immobilized on a support, and then a substance that reacts with immunoglobulin that reacts with the amylase, preferably an anti-human immunoglobulin antibody
  • a method comprising reacting an enzyme-labeled product of protein A, protein G, or jackalin and measuring the amount of the reaction product labeled by the enzyme activity is suitable.
  • the support for example, plastic or glass such as polystyrene resin, polycarbonate resin, silicone resin, and nylon resin are suitable.
  • the method of fixing the support hair mirror may be physical adsorption or chemical bonding.
  • a labeling enzyme peroxidase, 5-galactosidase and alkaline phosphatase are suitable.
  • an enzymatic measurement method a method based on the principle that immunoglobulin that reacts with amylase in a sample inhibits amylase activity is used.
  • the simplest method for measuring the degree of inhibition of the amylase activity is the in vitro reaction method. That is, an amylase solution of a known concentration is mixed 1: 1 with a sample in a test tube, and after standing for a certain period of time, the amylase activity of the mixture is measured by a known activity measurement method (Tholla, JA, et al: The Enzyme (3rd ed. ), 5, 115-189, 1971).
  • blood using a synthetic substrate such as 4-ditrophenyl-1-maltopenoside ⁇ p-l-trophenylbenzyl- ⁇ -maltopene-oside is used.
  • a medium amylase measurement kit is preferably used. The degree of inhibition of the amylase activity is calculated by subtracting the amylase activity of the 2-fold diluted sample and the amylase activity of the 2-fold diluted amylase solution, respectively, from the amylase activity of the mixture.
  • the immunoglobulin which reacts with amylase in a sample is reacted with amylase, then separated from human amylase using a serum protein separation carrier, and the degree of inhibition of the amylase activity of the reaction product is determined.
  • a method including a step of measuring is also preferably used.
  • Suitable carriers for separating serum proteins include cellulose acetate membranes, agarose gels, polyacrylamide gels, and dextran gels.
  • an electrophoresis method, a liquid chromatography method, or the like is used as the separation method on the carrier.
  • the electrophoresis method is preferred from the viewpoint of simplicity and speed.
  • the present invention further provides a kit for detecting Crohn's disease, which comprises detecting an amylase-reactive immunoglobulin in a sample, comprising an amylase and a reagent for measuring amylase activity or a reagent for measuring labeled enzyme activity. Is what you do.
  • the test kit of the present invention comprises an amylase-immobilized support; an enzyme-labeled anti-human IgG antibody, and an enzyme-labeled anti-human IgA antibody.
  • Body an enzyme-labeled product selected from the group consisting of enzyme-labeled protein A, enzyme-labeled protein G and enzyme-labeled jackpotrin; and a reagent for measuring a labeled enzyme activity.
  • the test kit of the present invention contains amylase and a reagent for measuring amylase activity.
  • the test kit of the present invention comprises, in addition to amylase and bull starch, a reagent for measuring amylase activity, a cellulose acetate membrane as a carrier for separating serum proteins. Including.
  • the kit for testing Crohn's disease of the present invention can further contain a buffer, a standard serum, and the like.
  • a buffer a standard serum
  • the present invention will be described in detail with reference to examples, but the present invention is not limited thereto.
  • Each of the 96-well microplates was prepared by diluting Buena's Tenamirase (Sigma, A6225) diluted to 10 ⁇ g / ml with phosphate buffered saline (PBS). Then, 0.2 ml was added to each of the pellets, and the mixture was reacted at 4 ° C. After the reaction, the solution in each well was removed, 0.25 ml of PBS was added for washing, and the solution was removed after stirring. After repeating this washing operation three times, 0.25 ml of PBS containing 0.1% skim milk was added as a masking reagent, and the mixture was incubated at 37 ° C for 1 hour. After the masking, the solution in each well was removed, 0.25 ml of PBS containing 0.1% NaN 3 and 0.1% skim milk was added to each well as a stock solution, and the solution was stored at 4 ° C.
  • Buena's Tenamirase Sigma, A6225
  • PBS phosphate buffered
  • the sandwich method was used to detect the presence of immunoglobulin that reacts with human amylase in human serum. That is, after removing the preservation solution from the microplate plate with the immobilized bush and amylase prepared above, the test serum or plasma, which had been diluted 80-fold with PBS containing 0.05% skim milk in advance, was added to each well for 0.2 times. After adding for 1 minute, the mixture was stirred for about 1 minute with a microplate mixer, and reacted at 37 ° C for 1 hour. After removing the liquid in each well, the wells were washed three times with 0.25 ml of PBS containing 0.05% Tween20.
  • a peroxidase-labeled anti-human IgG antibody was diluted to an optimum concentration, 0.2 ml was added to each gel, and the reaction was performed again at 37 ° C for 1 hour. After the reaction, remove the solution and wash again. After completely removing the solution in each well, add 0.2 ml of a substrate solution (1.5 mg / ml o-phenylenediamine aqueous solution with 0.01% hydrogen peroxide) and add room temperature. For 10 minutes. The reaction was stopped by adding 0.05 ml of 3.5 N sulfuric acid to each well. The plate after the reaction was stopped was measured for absorbance (absorbance at 492 nm-absorbance at 630 nm) using a colorimeter for microplate (manufactured by BioRad).
  • Example 1 shows the serum of patients with Crohn's disease (75 cases), ulcerative colitis (84 cases), gastric ulcer, duodenal ulcer, macroamylaseemia and other diseases (48 cases) and healthy subjects (30 cases).
  • the presence of immunoglobulin that reacts with bush amylase was detected using the indicated method.
  • the results are shown as a scatter diagram in FIG. Each point in the figure is the average of three measurements. Based on this result, a significant difference test was performed between Crohn's disease patients and ulcerative colitis patients, other disease patients, and healthy subjects. Globulin abundance was significantly higher.
  • the degree of inhibition of amylase activity was calculated by (activity of mixed solution) / (activity of 2-fold diluted test serum) / (activity of 2-fold diluted busur-rouramylase solution) and expressed as inactivation activity.
  • Serum of patients with other diseases such as Crohn's disease (86 cases), ulcerative colitis (86 cases), gastrointestinal disease, liver disease, and healthy subjects (25 cases) was measured by this measurement method.
  • the activity of the serum of healthy volunteers to inactivate amylase was in the range of 0 to 30 units / 1.
  • Tris' borate buffer pH 9.1 (Helena Research Labs., Titan, trade name)
  • use Apriquet Ichiyo to apply Of a test serum or physiological saline (control) to which was added at about 600 units / ml was applied.
  • the electrophoresis buffer used was 0.26 M Tris-borate buffer (pH 9.1) on the anode side, and Veronal buffer (pH 8.6) on the cathode side. Electrophoresis was performed at 120 V for 2 hours.
  • Example 3 Detection of presence of immunoglobulin that reacts with blood amylase in blood by enzyme immunoassay
  • phosphate buffered saline PBS
  • a plate with an immobilized calcium amylase was prepared in the same manner as in Example 1, and measurement was performed using human serum as a sample.
  • the immunoglobulin that reacts with cis-amylase is based on the cut-off value (0.104, mean value + 2 ⁇ standard deviation) set from the mean value (0.052) and the standard deviation (0.026) of the serum serum values of healthy subjects. Comparing the number of positive cases, there were only 19 cases of Crohn's disease, and none were found in other diseases. These results indicate that the detection of the presence of immunoglobulin that reacts with serum calcium amylase can be used for differential diagnosis of Crohn's disease. Industrial applicability
  • the present invention provides a method for detecting Crohn's disease characterized by detecting the presence of immunoglobulin that reacts with amylase in blood by an immunoassay or an enzymatic assay using amylase. It provides an inspection kit. As is clear from the examples, the use of the test method and test kit of the present invention enables simple and rapid diagnosis of Kuhn's disease, especially differential diagnosis from ulcerative colitis.

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Description

クローン病の検査方法及び検査用キッ ト 技術分野
本発明は、 クローン病の検査方法及び検査用キッ トに関する。 さらに詳しくは、 臨床検査分野において、 免疫学的あるいは酵素学的方法により簡便、 迅速に実施 できるクローン病の検査方法及び検査用キッ 卜に関する。 従来の技術
炎症性腸疾患のうち、 クローン病と潰瘍性大腸炎は、 原因不明で特発性炎症性 腸疾患として区分され、 厚生省の難治性疾患として特定されている。 診断は厚生 省特定疾患難治性炎症性腸管調査研究班で作製された診断基準 （案） に従ってな されている。 具体的には、 便培養などで感染性腸炎を除外した後、 臨床所見、 消 化管造影検査、 内視鏡検査、 組織検査を組み合わせて行われている。 しかし、 こ れらの方法によっても診断が困難な症例も見られる。 特にクローン病と潰瘍性大 腸炎の鑑別に難渋する症例が多い。 一方、 診断の中心となる消化管造影検査や内 視鏡検査は、 患者の肉体的，精神的な苦痛を伴うことが多く、 熟練した医師が必 要とされている。 このためクローン病や潰瘍性大腸炎の診断のための簡便で迅速 かつ高精度で行える特異的な臨床検査法が世界的に求められている。
ク ロ ー ン病患者の血清に は、 抗好中球抗体（Targan, S.， et al.： Gastroenterology, 96, A505 , 1989) ゃ抗小腸抗体 (Bagchi , S.， et al .： Cl in. Exp. Immunol, 55, 44〜48， 1984) が、 一方、 潰瘍性大腸炎患者の血清には、 抗 トロポミオシン抗体 （Das, K. n.，et al.： J. Immunol. ,150, 2487-2493, 1993) ゃ抗カゼイン抗体 (Knoflach, P.,et al.： Gastroenterology, 92, 479- 485, 1987) あるいは抗ムチン抗体などの存在が報告されている。 これらの中に は、 疾患特異的抗体と報告されているものもあるが、 いずれの抗体検査も診断に 応用されるに至っていない。 というのは、 クローン病や潰瘍性大腸炎に特異的な 抗体と報告されていても例数が少ないケース （小腸タンパク、 トロポミオシン、 ムチン） あるいは特異性がない （好中球、 カゼイン） など臨床検査に応用しうる 程のデータが得られていないためである。 上記のような視点から、 特異的な血清 抗体を応用して、 クローン病や潰瘍性大腸炎の診断を、 簡便、 迅速かつ高精度に 実施できる臨床検査方法を開発することは臨床上極めて重要と言える。 発明の開示
本発明の目的は、 哺乳類、 特にヒ 卜のクローン病や潰瘍性大腸炎の診断を、 簡 便、 迅速かつ高精度に実施できる臨床検査方法及びそれに使用する検査用キッ ト を提供することである。
本発明の第 1は、 検体中の、 アミラーゼと反応する免疫グロブリンの存在を検 出することを特徴とするクローン病の検査方法である。
本発明の第 2は、 免疫学的測定法、 あるいは酵素学的測定法により検体中の、 アミラーゼと反応する免疫グロプリンの存在を検出することを特徴とするクロー ン病の検査方法である。
本発明の第 3は、 検体中の、 アミラーゼと反応する免疫グロブリンを、 支持体 に固定したアミラーゼと反応せしめた後、 上記アミラーゼと反応する免疫グロブ リンと反応する物質の標識化物を反応させ、 反応生成物の標識量を測定する工程 を含む免疫学的測定法により検体中の、 アミラーゼと反応する免疫グロプリンの 存在を検出することを特徴とするクローン病の検査方法である。
本発明の第 4は、 検体中の、 アミラーゼと反応する免疫グロブリンを、 ァミラ —ゼと反応せしめた後、 反応生成物のアミラーゼ活性を測定する工程を含む酵素 学的測定法により検体中の、 アミラーゼと反応する免疫グロプリンの存在を検出 することを特徴とするクローン病の検査方法である。
本発明の第 5は、 アミラーゼがブ夕 'アミラーゼまたはゥシ · アミラーゼであ る上記クローン病の検査方法である。
本発明の第 6は、 アミラーゼ、 及びアミラーゼ活性測定用試薬または標識酵素 活性測定用試薬を含む、 検体中の、 アミラーゼと反応する免疫グロブリンの存在 を検出するクローン病の検査用キッ トである。
本発明の第 7は、 アミラーゼを固定した支持体；酵素標識化抗ヒ卜 I g G抗体、 酵素標識化抗ヒト I g A抗体、 酵素標識化プロテイン A、 酵素標識化プロテイン G及び酵素標識化ジャッカリンから成る群から選ばれる酵素標識化物；及び酵素 活性測定用試薬を含み、 免疫学的測定法により、 検体中の、 アミラーゼと反応す る免疫グロプリンの存在を検出するクロ一ン病の検査用キッ トである。
本発明の第 8は、 アミラーゼがブ夕'アミラーゼまたはゥシ ·アミラーゼであ る上記クローン病の検査用キットである。 図面の簡単な説明
図 1は、 酵素免疫測定法により、 クローン病 （CD、 75例） 、 潰瘍性大腸炎 （UC、 84例） 、 胃潰瘍 '十二指腸潰瘍、 マクロアミラーゼ血症などその他疾病 （Other、 48例） の患者血清および健常者血清 （Normal、 30例） 中のブ夕 ·アミラーゼと反 応する免疫グロプリンの存在を検出した結果を散布図として表した図である。 *、 はクローン病患者と潰瘍性大腸炎患者、 胃潰瘍，十二指腸潰瘍、 マクロアミ ラーゼ血症などその他疾病患者および健常者との統計学的有意差を表す （* ： pく 0. 05、 * * ： pく 0. 01 ) 。 0. 167は健常者血清の測定値から決定したカツ トオフ 値である。
図 2は、 酵素免疫測定法により、 クローン病 （CD、 30例） 、 潰瘍性大腸炎 （U 13例） 、 胃潰瘍 '十二指腸潰瘍、 マクロアミラーゼ血症などその他疾病 （Other、 8例） の患者血清および健常者血清 （Normal、 18例） 中のゥシ 'アミラーゼと反 応する免疫グロプリンの存在を検出した結果を散布図として表した図である。 *、 はクローン病患者と潰瘍性大腸炎患者、 胃潰瘍 '十二指腸潰瘍、 マクロアミ ラーゼ血症などその他疾病患者および健常者との統計学的有意差を表す （* ： pく 0.05、 * * ： p<0.01 ) 。 0. 105は健常者血清の測定値から決定したカツ トオフ 値である。 発明を実施するための最善の態様
本発明者らは、 哺乳類、 特にヒトのクローン病の理想的な検査方法を求め、 疫 学的、 免疫学的、 生化学的研究を重ねた結果、 クローン病患者の血中にアミラー ゼと反応する免疫グロプリンが量的に有意に多く存在していることを見出し、 本 発明を完成するに至った。
すなわち、 本発明は、 アミラーゼを用いて検体中の、 アミラーゼと反応する免 疫グロプリンの存在を検出することを特徴とするクローン病の検査方法を提供す るものである。
アミラーゼと反応する免疫グロプリンの存在の検出法としては、 酵素免疫測定 法などの免疫学的測定法、 あるいは酵素学的測定法の t、ずれを用いてもよい。 本発明に使用するアミラーゼとしては、 異種のアミラーゼを使用する。 ヒトの クローン病を検査する場合には、 ヒト以外の異種のアミラーゼであればいずれを 用いてもよい。 例えば、 食用の動物由来のアミラーゼ、 すなわちブ夕、 ゥシ、 二 ヮトリ、 ゥマ由来のアミラーゼ等が好ましく、 特に、 ブ夕またはゥシ由来のアミ ラ一ゼが好適に用いられる。 以下、 本発明をヒトのクローン病の検査方法につい て説明するが、 本発明はこれに限定されるものではない。
本発明の方法に供する検体としては、 ヒト体液のほとんどを用いることが可能 であるが、 例えば全血、 血清、 血漿、 尿、 だ液等が好ましい。 特に好ましくは患 者の血清または血漿である。 免疫学的測定法としては、 いずれの方法を用いてもよいが、 酵素免疫測定法、 ィムノクロマトグラフィー法などが好ましい。 いずれの方法も検体中の、 ァミラ —ゼと反応する免疫グロプリンを、 支持体に固定したアミラーゼと反応せしめた 後、 上記アミラーゼと反応する免疫グロブリンと反応する物質の標識化物を反応 させ、 反応生成物の標識量を測定する工程を含む。 酵素免疫測定法は、 酵素標識 化物を用いて、 反応生成物の標識量を酵素活性により測定する。 ィムノクロマト グラフィ一法は、 着色粒子標識化物を用いて、 反応生成物の標識量を着色量によ り測定する。
本発明には反応生成物の標識量、 すなわち検体中の、 アミラーゼと反応する免 疫グ口ブリンの存在量を容易に数値化できる酵素免疫測定法が好適に用いられる。 酵素免疫測定法には、 検体中のアミラーゼと反応する免疫グロブリンを、 支持体 に固定したアミラーゼと反応せしめた後、 上記アミラーゼと反応する免疫グロブ リンと反応する物質、 好ましくは抗ヒト免疫グロブリン抗体、 プロテイン A、 プ 口ティン G又はジャッカリンの酵素標識化物を反応させ、 反応生成物の標識量を 酵素活性により測定する工程を含む方法が適している。 支持体としては、 たとえ ば、 ポリスチレン樹脂、 ポリカーボネート樹脂、 シリコン樹脂、 ナイロン樹脂な どプラスチックやガラスが適している。 この支持体ヘアミラ一ゼを固定する方法 は物理吸着であってもよいし、 化学的結合であってもよい。 標識用酵素としては、 ペルォキシダ一ゼ、 5—ガラクトシダーゼ、 アルカリホスファタ一ゼが好適であ る。 '
一方、 酵素学的測定法としては、 検体中の、 アミラーゼと反応する免疫グロブ リンがアミラーゼの活性を阻害することを測定原理とした方法が用いられる。 ァ ミラーゼ活性の阻害度を測定するのに最も簡便な方法は試験管内反応法である。 すなわち、 試験管内で既知濃度のアミラーゼ液を検体と 1 ： 1に混合し、 一定時 間放置後、 混合液のアミラーゼ活性を公知の活性測定法 （Tholla, J. A. ， et al： The Enzyme (3rd ed. )， 5， 115 - 189 , 1971) により測定する。 活性測定法 はいずれの方法を用いてもよいが、 4-二トロフェニル一マル卜ヘプ夕オシドゃ p 一二トロフエニルベンジルー α—マル卜ペン夕オシドなどの合成基質を用いた血 中アミラーゼ測定キッ トが好適に用いられる。 アミラーゼ活性の阻害度は、 混合 液のァミラ一ゼ活性から、 別途測定した 2倍希釈検体のアミラーゼ活性と 2倍希 釈アミラーゼ液のアミラーゼ活性をそれぞれ差し引くことにより算出する。
また、 血中にはアミラーゼと反応する免疫グロプリンによって阻害されないヒ ト ·アミラーゼ活性が認められる。 従って、 本発明には、 検体中の、 アミラーゼ と反応する免疫グロブリンをアミラーゼと反応せしめた後、 血清タンパク質分離 用担体を用いてヒト 'アミラーゼと分離し、 反応生成物のアミラーゼ活性の阻害 度を測定する工程を含む方法も好適に用いられる。 血清夕ンパク質分離用担体と しては、 セルロースアセテート膜、 ァガロースゲル、 ポリアクリルアミ ドゲル、 デキストランゲルなどが適している。 この担体上での分離法としては、 電気泳動 法、 液体クロマトグラフィー法などが用いられるが、 本発明では簡便、 迅速さの 点から電気泳動法が好適である。 本発明は、 さらに、 アミラーゼ、 及びアミラーゼ活性測定用試薬または標識酵 素活性測定用試薬を含む、 検体中の、 アミラーゼと反応する免疫グロブリンの存 在を検出するクローン病の検査用キッ トを提供するものである。
免疫学的測定法が酵素免疫測定法の場合、 本発明の検査用キッ トは、 アミラー ゼを固定した支持体；酵素標識化抗ヒト I g G抗体、 酵素標識化抗ヒ ト I g A抗 体、 酵素標識化プロテイン A、 酵素標識化プロテイン G及び酵素標識化ジャッ力 リンからなる群から選ばれる酵素標識化物；及び標識酵素活性測定用試薬を含む。 酵素学的測定法が試験管内反応法の場合、 本発明の検査用キットは、 アミラー ゼ、 及びアミラーゼ活性測定用試薬を含む。 酵素学的測定法が電気泳動法の場合、 本発明の検査用キッ トは、 アミラーゼ、 アミラーゼ活性測定用試薬であるブル一スターチの他に、 血清夕ンパク質分離用 担体であるセルロースアセテート膜を含む。
本発明のクローン病検査用キッ トはさらに、 緩衝液、 標準血清などを含むこと ができる。 次に、 実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、 これによつて本発明が限定 されるものではない。 実施例
実施例 1 酵素免疫測定法による血液中のブ夕 ·アミラーゼと反応する免疫グロ プリンの存在の検出
1 ) ブ夕 'アミラーゼを固定した支持体の調製
リン酸緩衝生理食塩水 （P B S ) にて 10〃g/mlとなるよう希釈したブ夕 '滕ァ ミラ一ゼ （シグマ社製、 A6225 ) を 96穴マイクロプレート （コース夕一社製） の 各々のゥヱルに 0.2 mlずつ加え、 4°Cでー晚反応させた。 反応後、 各ゥエルの液 を除去した後、 洗浄のため P B Sを 0.25 mlずつ加え撹拌後、 液を除去した。 こ の洗浄操作を 3回繰り返した後、 マスキング試薬として 0. 1 %スキムミルク加 P B Sを 0.25 ml加え、 37°C、 1時間インキュベートした。 マスキングの後、 各ゥェ ル内の液を除去し、 保存液として 0.1 % NaN3、 0. 1%スキムミルク加 P B Sを各ゥ エルに 0.25 mlずつ加え、 4 °Cで保存した。
2 ) 血中ブ夕 'アミラーゼと反応する免疫グロブリンの存在の検出 ヒト血清中のブ夕 ·アミラーゼと反応する免疫グロプリンの存在の検出にはサ ンドイッチ法を用いた。 すなわち、 先に作製したブ夕 ·アミラーゼ固相化マイク 口プレートの保存液を除去した後、 あらかじめ 0.05%スキムミルク加 PB Sで 80 倍に希釈しておいた被検血清または血漿を各ゥエルに 0.2 mlずつ加え、 マイクロ プレートミキサーにて約 1分間撹拌の後、 37°C、 1時間反応させた。 各ゥエルの液 を除去した後、 0.05%Tween20加 P B S0.25 mlにより 3回洗浄を行った。 次に、 ペルォキシダ一ゼ標識抗ヒト I gG抗体を至適濃度に希釈し、 各ゥヱルに 0.2 ml ずつ加え、 再び 37°C、 1時間反応させた。 反応後、 液を除去し再度洗浄を行い、 各ゥヱル中の液を完全に除去した後、 基質液 （0.01%過酸化水素加 1.5 mg/ml o —フエ二レンジァミン水溶液） を 0.2 ml加え、 室温にて 10分間反応させた。 3.5 N硫酸を各ゥエルに 0.05 ml添加することで反応を停止させた。 反応停止したプ レートはマイクロプレート用比色計 （バイオラッ ド社製） で吸光値 （492 nmの吸 光値一 630 nmの吸光値） を測定した。
3 ) 反応性の確認
クローン病患者血清 2検体と健常者血清 1検体を用いて、 血清希釈倍率を 40〜 1280倍に変えた時の反応性の確認を行った。 表 1に結果を示した。 クローン病患 者血清は血清希釈にともない吸光値の低下が認められた。 健常者血清では 80倍以 上では著しい低下は認められなかった。 この結果より測定時の血清希釈倍率は 80 倍と決定した。 表 1 反応性の確認
血清希釈倍率 クローン病患者 クローン病患者 健常者血清
1 2
40 0.834 0.630 0.187
80 0.811 0.525 0. 109
160 0.430 0.416 0.092
320 0.245 0.256 0.064
640 0. 135 0. 167 0.070
1280 0.081 0.093 0.070
4 ) 再現性の確認
クローン病患者血清と健常者血清を用いて同時再現性と測定日間再現性の確認 を行った。 表 2に同時再現性を示した。 変動係数は 1 · 7〜3.3%であった。 また表 3に測定日間再現性を示した。 変動係数は 1.8〜3.8%であった。
いずれの試験においても十分な再現性が得られ、 またクローン病患者と健常者 の吸光値は、 有意水準 1 %で有意な差が見られた。
同時再現性
n クローン病患者 健常者
1 0.608 0. 118
2 0.596 0.120
3 0.600 0.122
4 0.602 0. 114
5 0.616 0.123
6 0.599 0.122
7 0.586 0. 120
8 0.598 0.118
9 0.606 0.129
1 0 0.623 0.120 平均値 0.603 0.121 標準偏差 0.010 0.004 変動係数 ） 1.7 3.3
表 3 測定日間再現性
測定 クローン病患者 健常者
1 0.608 0.129
2 0.616 0. 121
3 0.598 0.130
4 0.600 0. 127
5 0.584 0.135
6 0.608 0.133 平均値 0.602 0.129 標準偏差 0.011 0.005 変動係数 1.8 3.8 実施例 2 潰瘍性大腸炎、 その他の疾病との比較
クローン病 （75例） 、 潰瘍性大腸炎 （84例） 、 胃潰瘍 '十二指腸潰瘍、 マクロ アミラーゼ血症などその他疾病 （48例） の患者血清及び健常者血清 （30例） につ いて実施例 1に示した方法を用いてブ夕 ·アミラーゼと反応する免疫グロプリン の存在の検出を行った。 結果を散布図として図 1に示した。 図中の各点は 3回の 測定値の平均値である。 この結果に基づいて、 クローン病患者と、 潰瘍性大腸炎 患者、 その他疾病患者、 健常者との有意差検定を行ったところ、 いずれもクロ一 ン病患者の血清ブ夕 ·アミラーゼと反応する免疫グロブリンの存在量が有意に高 値を示した。 また、 健常者血清の測定値の平均値 （0. 105) と標準偏差 （0.031) から設定したカッ トオフ値 （0.167、 平均値 + 2 X標準偏差） を基準にしてブ 夕 ·アミラーゼと反応する免疫グロブリン陽性の例数を比較すると、 クローン病 23例、 潰瘍性大腸炎 1例であった。 これらの結果より、 本測定法をクローン病の 鑑別診断に利用できることが示された。 実施例 3 酵素学的測定法 （試験管内反応法） による血液中のブ夕 'アミラーゼ と反応する免疫グロプリンの存在の検出
被検血清 ΙΟΟμΙとブ夕 '臈アミラーゼ溶液 ΙΟΟμΙ (約 1000〜2000単位） を混合し、 室温で、 2時間から一夜放置した後、 ρ—ニトロフエ二ルペンジルー α—マルトべ ン夕オシドを基質とするアミラーゼ測定キッ ト （Lタイプヮコ一アミラーゼ、 和 光純薬社製） と、 自動分析装置 （日立 7350) を用いて、 混合液のアミラーゼ活性 を測定した。 また、 被検血清およびブ夕 '脬アミラーゼ溶液をそれぞれ生理食塩 水で 2倍希釈した液のアミラーゼ活性を測定した。 アミラーゼ活性の阻害度は、 (混合液の活性）一（ 2倍希釈被検血清の活性）一（ 2倍希釈ブ夕 ·臈アミラーゼ溶 液の活性）により算出し、 失活活性として表した。 本測定法によりクローン病 (86例） 、 潰瘍性大腸炎 （86例） 、 胃腸疾患、 肝疾患などその他疾病の患者およ び健常者 （25例） の血清について測定を行った。 その結果、 健常者血清のァミラ —ゼ失活活性はいずれも 0から— 30単位 /1の範囲内であった。 そこで、 一 30単位 /1をカットオフ値とすると、 失活活性が陽性の例数は、 クローン病患者血清 29例 に対して、 潰瘍性大腸炎患者血清 1例、 その他疾病および健常者血清 0例であつ た。 したがって、 本測定法によっても血中のブ夕 ·アミラーゼと反応する免疫グ ロブリンの存在を検出でき、 クローン病の鑑別診断に利用できることが示された。 実施例 4 酵素学的測定法 （電気泳動法） による血液中のプ夕 'アミラーゼと反 応する免疫グ口ブリンの存在の検出
1 ) セルロースアセテート膜電気泳動法
0.26Mトリス 'ホウ酸緩衝液 （pH 9. 1 ) にて平衡化したセルロースァセテ一ト 膜 （商品名タイタン、 ヘレナ研究所製） に、 アプリケ一夕一を用いて、 ブ夕 '滕 ァミラーゼを約 600単位 /mlとなるように添加した被検血清あるいは生理食塩水 (対照） を 0. 3 z l塗布した。 泳動用緩衝液は、 陽極側に 0.26Mトリス ·ホウ酸緩 衝液 （pH 9. 1 ) 、 陰極側にベロナ一ル緩衝液 （pH 8.6) を用いた。 泳動は 120Vで 2時間行った。
2 ) ァミラ一ゼ活性阻害の測定
ブルース夕一チ （ネオアミラーゼテス ト 「第一」 第一化学薬品社製） 0.8gを 5.5mlの水に溶解し、 基質溶液とした。 泳動後のセルロースアセテート膜をトレ ィの上に置き、 ブル一スターチ 5.5mlを膜上に均一にのせ別のトレイでふたをし、 37°C、 40〜50分間インキュベートした。 反応後、 メタノールでブルースターチを 洗い落とし、 セルロースアセテート膜をメタノール中に入れ、 10分間静置した。 ブ夕 ·アミラーゼ阻害活性は、 ブルースターチが分解して生じた青色バンドの色 の濃さと泳動パターンの変化によって目視判定した。 実施例 3で示した血清を用 いて試験を行った結果、 失活活性陽性であったクローン病患者血清にブ夕 'アミ ラ一ゼを添加した液は、 いずれも対照と比べてブ夕 ， アミラーゼ活性が低下した 活性バンドを示したり、 ヒト 'マクロアミラーゼ血症に特徴的なテ一リングなど の異常泳動パターンに類似した泳動パターンを示した。 一方、 潰瘍性大腸炎患者 血清や健常者血清にプ夕 ·アミラーゼを添加した液は、 いずれも対照と同等のブ 夕 ·アミラーゼ活性バンドを示した。 したがって、 本測定法によっても血中のブ 夕 .アミラーゼと反応する免疫グロプリンの存在を検出できることが示された。 実施例 5 酵素免疫測定法による血液中のゥシ 'アミラーゼと反応する免疫グ口 ブリンの存在の検出
1 ) ゥシ ·アミラーゼの精製
ゥシ · アミラーゼの精製は次のように行った。 以下の操作は全て 4°C以下で行 つた。 牛塍ァセ トン粉（Pancreas acetone powder, Bovine :シグマ社製） 2 gに 5 mM CaCl2、 50 mM NaClを含む 0. 1 M Tris- HCl緩衝液（pH 7.2 ) [緩衝液 A] 40 ml を 加えて 15分間撹拌した。 ll , 400 x g、 10分間遠心して上清を回収し、 硫酸アンモ 二ゥムを添加して 65%飽和にした。 25，600 x g、 15分間遠心して得られた沈殿を緩 衝液 Aで溶解した 20 飽和硫酸アンモニゥム溶液 30 mlに溶解した。 不溶物を遠心 して除去した後、 あらかじめ 20%飽和硫酸ァンモニゥム溶液を含む緩衝液 Aで平衡 化した Butyl- Toyopearl 650C (東ソ一社製）のカラム（2.1 x7.3 cm)に負荷した。 20%飽和硫酸アンモニゥム溶液を含む緩衝液 Aでカラムを洗浄した後、 10%飽和硫 酸アンモニゥム溶液を含む緩衝液 A、 緩衝液 Aで順次溶出した。 アミラーゼ活性を 有する画分を回収し、 60%飽和になるように硫酸アンモニゥムを添加した。 25,600xg、 15分間遠心して得られた沈殿をゥシ ' アミラーゼ精製品とした （酵 素活性： 130単位、 夕ンパク質量： 3.98 mg) 。
2) ゥシ 'アミラーゼを固定した支持体の調製および測定
リン酸緩衝生理食塩水 （PB S) にて 10 zg/mlとなるよう希釈したゥシ .滕ァ ミラ一ゼ精製品を 96穴マイクロプレート （コース夕一社） の各ゥエルに 0.2 mlず つ加え、 4°Cで一晩反応させた後、 実施例 1と同様にゥシ 'アミラーゼ固相化マ イク口プレートを作成し、 ヒト血清を検体として測定を行った。
3) 反応性の確認
クローン病患者血清 3検体と健常者血清 3検体を用いて、 血清希釈倍率 80倍で 反応性の確認を行った。 表 4に結果を示した。 クローン病患者血清は健常者血清 よりも高い値を示した。
表 4 血清ゥシ ·アミラーゼと反応する免疫グロプリンの存在の検出結
No. クローン病患者血 健常者血清
1 0. 57 1 0. 027 2 0. 279 0. 082 3 1. 220 0. 067
4) 潰瘍性大腸炎、 その他の疾病との比較 クローン病 （30例） 、 潰瘍性大腸炎 （13例） 、 胃潰瘍 '十二指腸潰瘍、 マクロ アミラーゼ血症などその他疾病 （ 8例） の患者血清および健常者血清 （18例） に ついて実施例 5に示した方法を用いて測定を行った。 測定結果を散布図として図 2に示した。 この結果に基づいて、 クローン病患者と、 潰瘍性大腸炎患者、 その 他疾病患者、 健常者との有意差検定を行ったところ、 いずれもクローン病患者の 血清ゥシ ·アミラーゼと反応する免疫グロブリンの存在量が有意に高値を示した。 また、 健常者血清の測定値の平均値 （0.052) と標準偏差 （0.026) から設定した カツ トオフ値 （0.104、 平均値 + 2 X標準偏差） を基準にしてゥシ ·アミラーゼ と反応する免疫グロプリン陽性の例数を比較すると、 クローン病 19例のみであり、 他の疾患では認められなかった。 これらの結果より、 血清ゥシ 'アミラーゼと反 応する免疫グロブリンの存在の検出がクローン病の鑑別診断に利用できることが 示された。 産業上の利用可能性
本発明は、 アミラーゼを用いて、 免疫学的測定法、 あるいは酵素学的測定法に より血液中の、 アミラーゼと反応する免疫グロプリンの存在を検出することを特 徴とするクローン病の検査方法及び検査用キッ トを提供するものである。 実施例 から明らかなように、 本発明の検査方法及び検査用キッ トを用いれば、 簡便、 迅 速なク口ーン病の診断、 特に潰瘍性大腸炎との鑑別診断が可能となる。

Claims

請求の範囲
1. 検体中の、 アミラーゼと反応する免疫グロブリンの存在を検出することを特 徴とするクローン病の検査方法。
2. 免疫学的測定法、 あるいは酵素学的測定法により検体中の、 アミラーゼと反 応する免疫グロブリンの存在を検出することを特徴とするクロ一ン病の検査方 法。
3. 検体中の、 アミラーゼと反応する免疫グロブリンを、 支持体に固定したアミ ラーゼと反応せしめた後、 上記アミラーゼと反応する免疫グロプリンと反応す る物質の標識化物を反応させ、 反応生成物の標識量を測定する工程を含む免疫 学的測定法により検体中の、 アミラーゼと反応する免疫グロプリンの存在を検 出することを特徴とするクローン病の検査方法。
4. 検体中の、 アミラーゼと反応する免疫グロブリンを、 アミラーゼと反応せし めた後、 反応生成物のアミラーゼ活性を測定する工程を含む酵素学的測定法に より検体中の、 アミラーゼと反応する免疫グロプリンの存在を検出することを 特徴とするクローン病の検査方法。
5. アミラーゼがブ夕 'アミラーゼまたはゥシ ·アミラーゼである請求項 1から 4 のいずれか 1項記載のクローン病の検査方法。
6. アミラーゼ、 及びアミラーゼ活性測定用試薬または標識酵素活性測定用試薬 を含む、 検体中の、 アミラーゼと反応する免疫グロブリンの存在を検出するク ローン病の検査用キット。
7. アミラーゼを固定した支持体；酵素標識化抗ヒ ト I g G抗体、 酵素標識化抗 ヒ ト I g A抗体、 酵素標識化プロテイン A、 酵素標識化プロテイン G及び酵素 標識化ジャッカリン空成る群から選ばれる酵素標識化物、 及び酵素活性測定用 試薬を含み、 免疫学的測定法により、 検体中の、 アミラーゼと反応する免疫グ 口プリンの存在を検出するクローン病の検査用キッ ト。
8. アミラーゼがブ夕 'アミラーゼまたはゥシ ·アミラーゼである請求項 6又は請 求項 7記載のクローン病の検査用キット。
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