WO1999028457A1

WO1999028457A1 - Gene tsa305

Info

Publication number: WO1999028457A1
Application number: PCT/JP1998/005306
Authority: WO
Inventors: Yosuke Harada; Kouichi Ozaki
Original assignee: Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority date: 1997-11-28
Filing date: 1998-11-25
Publication date: 1999-06-10
Also published as: EP1038957A1; JP4058567B2; CA2311646A1; US20040204574A1; US6822083B1; CN1173034C; CN1280617A; EP1038957A4; JPH11215987A; CA2311646C

Description

明細書

T S A 3 0 5遣伝子

m 分野

本発明は胖臓に特異的に発現する蛋白をコードする遺伝子 T S A 3 0 5、より詳しくは、線虫の s e l — 1 と高い相同性を有し、癌に対して抑制的に働くと考えられる上記脾臓特異的遺伝子に関する。また本発明は、かかる遺伝子によってコードされる新規な蛋白質及びその特異抗体にも関する。

¾ ^

脾臓癌は、日本人及び西側諸国の癌関連死亡順位において 4位及び 5位を占める、消化器系の悪性腫瘍の中でも最も予後不良な癌である（Poston, J. G.， et al. , Gut. , 32, 800- 812 ( 1991 ))。癌研究における最も重要なゴールは、癌化に至る早期の遺伝子変化を見分けることである。この変化の見極めができれば、早期診断のための遺伝子的なツールの開発とこの致死的な疾患をより効果的に治療するための新規な治療的アプローチとを導くことができる。

一方、線虫の s e 1 — 1遣伝子は、線虫において神経発生の際の外胚葉からニューロブラストへの分化を抑制する N o t c h Z l i n — 1 2 に対して、抑制的に働くことが報告されている（Genetics, 143 ( 1), 237-247 ( 1996 ) ： Development, 124 (3), 637 - 644 ( 1997)) 。該 N o t c h Z 】 i n — 1 2 は、その強制発現が乳癌や白血病を惹起させるため、癌関連遺伝子と考えられている。該癌関連遺伝子の抑制的な働きをなす上記 s e l — 1遺伝子は、従って癌に対しても抑制的に働くと考えられるが、現在尚之等遺伝子の役割については明確に解明されている訳ではない。

かかる遺伝子の生理的役割の解明とそれにより得られる情報は、癌化や炎症等の疾患の発症機能の解明に重要であり、これらは、基礎科学研究の分野はもとより、医薬品分野においても癌や炎症等の疾患の解明やその処置法等の開発面からも望まれているところである。

発明の _開示

本発明は、斯界で要望される前記の情報、殊に s e 1 一 1遣伝子と相同性を有する新規な蛋白相同物をコードする遺伝子を提供することを目的とする。

上記目的より、本発明者は、各種ヒト組織由来の遣伝子につき検索を重ねた結果、新たに脾臓に特異的に発現する蛋白をコードする遺伝子の単離、同定に成功し、該遺伝子が上記目的に合致することを見いだし、ここに本発明を完成するに至った。即ち、本発明によれば、配列番号： 1 で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコ一ドする塩基配列を含む脾臓特異的遺伝子 T S A 3 0 5、特にヒト遺伝子である当該遺伝子が提供される。

また本発明によれば、配列番号： 1 で示されるァミノ酸配列からなる脬臓特異的蛋白質（ T S A 3 0 5蛋白）及びこれに結合性を有する抗体が提供される。

更に本発明によれば、以下の（ a )及び（ b )のいずれかのポリヌクレオチドからなる胖臓特異的遺伝子 T S A 3 0 5、特にヒト遺伝子である当該遣伝子が提供される。

( a )配列番号： 2で示される塩基配列の全部又は一部を含むポリヌクレオチド、

( b )配列番号： 2 で示される塩基配列からなる D N Aとストリンジヱン卜な条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。

加えて、本発明によれば、遺伝子検出用の特異プロ一ブ又は特異プライマーとして使用される D N A断片である上記遺伝子が提供される。

以下、本明細書におけるアミノ酸、ペプチド、塩基配列、核酸等の略号による表示は、 1 11 ? 八（： _ 1 11 8の規定 C IUPAC-IUB Communication on Biological

Nomenclature, Eur. J. Biochem. , 138： 9 ( 1984)〕、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（特許庁編）及び当該分野における慣用記号に従うものとする。

本発明遣伝子の一具体例としては、後述する実施例に示される「 T S A 3 0 5 」と名付けられた P C R産物の D N A配列から演繹されるものを挙げることができる。その塩基配列は、配列番号： 3 に示されるとおりである。

該遺伝子は、配列番号： 1 に示される 7 9 4 アミノ酸配列の新規な眸臓特異的蛋白（ T S A 3 0 5蛋白という）をコードする、配列番号： 2 で示される塩基配列の、コード領域を含むヒト c D N Aであり、全長 7 8 8 5塩基からなつている。

本発明遺伝子 T S A 3 0 5 の発現産物である T S A 3 0 5蛋白は、 F A S T Aプログラム（ Person W. R. , et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. , USA. , 85, 2444 -

2448 (1988)) を禾 U用した GenBank/EMBLデーターベースの検索の結果、線虫の s e 1 - 1 遺伝子（前記文献参照）と非常に高い相同性を有していることが確認された。このことから、本発明遺伝子は、胚発生の全般に関わるとされている癌関連遺伝子である N o c t c h Z l i n — 1 2 に対して、上記 s e 1 — 1 と同様に、抑制的に働くと考元られる。また、本発明遺伝子の染色体上の位置は、インスリン依存性糖尿病（ I D D M ) の原因遺伝子が存在するとされる第 1 4染色体 q 2 4 . 3 - q 3 1 . 1 である。このことから、本発明遺伝子は、糖尿病との関連が強く示唆される。

更に、本発明遺伝子の発現産物は、フイブロネクチン T y p e l lコラーゲン結合ドメインを含む蛋白であることが明らかとなった。かかる N末端付近のコラーゲン結合部位は線維化との関わりを示唆するものであり、このことから本発明遣伝子は、線維症との関連も強く示唆される。

加えて、本発明遺伝子は、試験した脾癌標本の全てにおいてその発現の欠失が認められ、主に正常胖臓に発現することから、癌化における潜在的な予測の価値を提言する。

このように、本発明に係わる遺伝子 T S A 3 0 5及びその発現產物の提供は、乳癌、白血病、線維症、糖尿病、眸癌等の各種疾患、殊に脾癌の解明、把握、診断、予防及び治療等に極めて有用な情報乃至手段を与える。また、本発明遺伝子は、上記各種疾患の処置に利用される本発明遺伝子の発現を誘導する新規薬剤の開発の上でも好適に利用できる。更に、個体或は組織における本発明遺伝子の発現又はその発現産物の検出や、該遺伝子の変異

(欠失や点変異）又は発現異常の検出等は、上記疾患の解明や診断上において好適に利用できると考えられる。

本発明遺伝子は、具体的には配列番号： 1 で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする塩基配列を含む遺伝子又は配列番号： 2 で示される塩基配列を含むポリヌクレオチドからなる遺伝子として例示されるカ^ 特にこれらに限定されることなく、例えば、上記特定のァミノ酸配列において一定の改変を有する遣伝子や上記特定の塩基配列と一定の相同性を有する遣伝子であることができる。

即ち、本発明遺伝子には、配列番号： 1 に示されるァミノ酸配列において、 1 又は複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり T S A 3 0 5 と同様の活性を有する蛋白質をコードする塩基配列を含む遺伝子もまた包含される。ここで、「アミノ酸の欠失、置換又は付加」の程度及びそれらの位置等は、改変された蛋白質が、配列番号： 1 で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質と同様の機能を有する同効物であれば特に制限されない。尚、上記複数は、 2以上、通常数個を意味する。

上記アミノ酸配列の改変（変異）等は、天然において例えば突然変異や翻訳後の修飾等により生じることもある力、'、天然由来の遺伝子（例えば本発明の具体例遺伝子）に基づいて人為的に改変することもできる。本発明は、このような改変 · 変異の原因及び手段等を問わず、上記特性を有する全ての改変遣伝子を包含するものである。

上記の人為的手段としては、例えばサイトスぺシフィック · ミュータケ不シスし nlethods in Enzymology, 154 ： 350, 367-382 (1987) ；同 100： 468 (1983) ； Nucleic Acids Res. , 12： 9441 ( 1984) ；続生化学実験講座 1 「遣伝子研究法 II」、日本生化学会編， P1Q5 (1986)3 等の遺伝子工学的手法、リン酸トリエステル法やリン酸ァミダイト法等の化学合成手段〔 J. Am. Chera. Soc. , 89： 4801 ( 1967) ；同 ϋ: 3350 ( 1969) ； Science, 150： 178 ( 1968) ； Tetrahedron Lett. , 22： 1859 ( 19810 ；同 : 245 (1983)〕及びそれらの組合せ方法等が例示できる。本発明遣伝子のひとつの態様としては、配列番号： 3 で示される塩基配列の全部或は一部を含むポリヌクレオチドからなる遺伝子を例示できる。この塩基配列に含まれるオープンリーディングフレーム（配列番号： 2 に示す塩基配列）は、上記アミノ酸配列（配列番号： 1 ) の各ァミノ酸残基を示すコドンの一つの組合せ例でもあり、本発明遺伝子はこれらに限らず、各アミノ酸残基に対して任意のコドンを組合せ選択した塩基配列を有することも勿論可能である。該コドンの選択は、常法に従うことができ、例えば利用する宿主のコドン使用頻度等を考慮することができる〔 Ncleic Acids Res. , 9： 43 ( 1981 )〕。

また、本発明遺伝子は、例えば配列番号： 2 に示されるように、一本鎖 D N Aの塩基配列として表示されるが、本発明はかかる塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドゃこれらの両者を含むコンポーネントも当然に包含するものであり、また c D N A等の D N Aに限定されることもない。

更に、本発明の遺伝子には、前記のとおり、配列番号： 2 に示される塩基配列の全部又は一部を含むポリヌクレオチドからなるものに限定されず、当該塩基配列と一定の相同性を有する塩基配列からなるものも包含される。かかる遺伝子としては、少なくとも、下記に掲げるようなストリンジニントな条件下で、配列番号： 2 で示される塩基配列からなる D N Aとハイブリダィズし、一定の条件下での洗浄してもこれより脱離しないものが挙げられる。

即ち、配列番号： 2 の塩基配列を有する D N Aと、 6 X S S C中 6 5 °C—夜の条件下或は 5 0 %ホルムアミドを含む 4 X S S C 中 3 7 °C—夜の条件下においてハイブリダィズし、 2 X S S C中 6 5 °Cでの 3 0分間の洗浄条件下においても該 D N Aから脱離しない塩基配列を有する遺伝子が例示される。ここで、 S S C は、標準食塩一クェン酸緩衝液 ( standard saline citrate； 1 x SSC = 0.15M NaCl, 0.015M sodium citrate) である。

本発明の遺伝子は、その具体例についての配列情報に基づいて、一般的な遺伝子工学的手法により容易に製造 ' 取得することカヽ'できる〔 Molecular Cloning 2d Ed, Cold Spring Harbor Lab. Press ( 1989) ；続生化学実験講座「遺伝子研究法 I、 Π、 III」、日本生化学会編

( 1986 ) 等参照〕。

具体的には、本発明遣伝子が発現される適当な起源より、常法に従って c D N Aライブラリーを調製し、該ライブラリーから、本発明遺伝子に特有の適当なプローブや抗体を用いて所望クローンを選択することにより実施できる C Proc. Natl. Acad. Sci. , USA. , 78: 6613 (1981) ； Science, 222: 778 ( 1983)等〕 ₀

上記において、 c D N Aの起源としては、本発明遣伝子を発現する各種の細胞、組織やこれらに由来する培養細胞等、特に脾臓組織が例示され、これらからの全

R N Aの分離、 m R N Aの分離や精製、 c D N Aの取得とのクローニング等はいずれも常法に従い実施できる, 尚、 c D N Aライブラリ一は市販されてもおり、本発明においてはそれら c D N Aライブラリ一、例えばクローンテック社（ Clontech Lab. Inc. ) より市販の各種

c D N Aライブラリ一等を用いることもできる。

本発明遺伝子を c D N Aライブラリーからスクリ一二ングする方法も、特に制限されず、通常の方法に従うことができる。具体的には、例えば c D N Aにより産生される蛋白質の特異抗体を使用した免疫的スクリーニングにより対応する c D N Aクローンを選択する方法、目的の D N A配列に選択的に結合するプローブを用いたブラークハイブリダイゼーション、コロニ一ハイブリダイゼーション等ゃこれらの組合せ等を例示できる。

ここで用いられるプローブとしては、本発明遺伝子の塩基配列に関する情報をもとにして化学合成された

D N A等が一般的に例示できるが、勿論既に取得された本発明遣伝子そのものやその断片等も良好に利用できる。

また、本発明遣伝子のスクリーニングは、上記特異抗体に代えて T S A 3 0 5蛋白を利用した、蛋白質相互作用クローニング法 ( rotein interaction cloning proc edure) によることもでき、更に、本発明遺伝子の塩基配列情報に基づき設定したセンス ' プライマー、アンチセンス · プライマーをスクリーニング用プローブとして用いたスクリーニング方法によることもできる。

本発明では、またディファレンシャルディスプレイ法

(Liand P. , et al. , Science, 2_57, 967 - 971 ( 1992)) によって、異なる条件下の細胞もしくは複数の異なる細胞群間の m R N Aの発現を直接比較、検討することができる。

本発明遺伝子の取得に際しては、 P C R法〔 Science, 230: 1350 ( 1985 )] による D N A / R N A増幅法も好適に利用できる。殊に、ライブラリ一から全長の c D N A が得られ難いような場合にはレース法（ R A C E ：

Rapid amplification of cDNA ends ；実験医学、 12(6)： 35 (1994))、殊に 5 ' — レース（ 5 ' - R A C E ) 法〔Proc. Natl. Acad. Sci. , USA. , 8: 8998 (1988) 等の採用が好適である。かかる P C R法の採用に際して使用されるプライマーは、既に本発明によって明らかにされた本発明遺伝子の配列情報に基づいて適宜設定でき、これは常法に従い合成できる。

尚、増幅させた D N A Z R Ν Α断片の単離精製は、前記の通り常法に従うことができ、例えばゲル電気泳動法等によればよい。

上記で得られる本発明遺伝子或は各種 D N A断片は、常法、例えばジデォキシ法〔Pro Natl. Acad. Sci.， USA. , 74： 5463 ( 1977)3 やマキサム—ギルバート法

C Method in Enzymology, 65： 499 ( 1980)〕等に従って、また簡便には市販のシークェンスキット等を用いて、その塩基配列を決定することができる。

本発明遺伝子の利用によれば、一般の遺伝子工学的手法を用いることにより、その遺伝子産物を容易に大量に安定して製造することができる。従って、本発明は、本発明にかかる T S A 3 0 5遺伝子を含有するベクター

(発現ベクター）及び該ベクターによって形質転換された宿主細胞並びに該宿主細胞を培養して T S A 3 0 5蛋白を製造する方法をも提供するものである。

該製造方法は、通常の遺伝子組換え技術 [ Science, 224： 1431 (1984)； Biochem. Biophys. Res. Comm. , 130： 692 ( 1985)； Proc. Natl. Acad. Sci. , USA. , 80： 5990 ( 1983)及び前記引用文献等参照〕に従って実施できる。

上記宿主細胞としては、原核生物及び真核生物のいずれも用いることができ、例えば原核生物の宿主としては、大腸菌や枯草菌といった一般的に用いられるものが広く挙げられ、好適には大腸菌、とりわけェシヱリヒア ' コリ（Escherichia coli) K 1 2株に含まれるものが例示できる。また、真核生物の宿主細胞には、脊椎動物、酵母等の細胞が含まれ、前者としては、例えばサルの細胞である C O S細胞 [Cell, 23： 175 ( 1981 )〕やチヤィニーズ . ハムスター卵巣細胞及びそのジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株 C Proc. Natl. Acad. Sci. , USA. , 77： 42 16 ( 1980 )〕等が、後者としては、サッカロミセス属酵母細胞等が好適に用いられている。勿論、これらに限定される訳ではない。

原核生物細胞を宿主とする場合は、該宿主細胞中で複製可能なベクターを用いて、このベクター中に本発明遺伝子が発現できるように該遺伝子の上流にプロモーター及び S D ( シャイン · アンド · ダルガーノ）塩基配列、更に蛋白合成開始に必要な開始コドン（例えば A T G ) を付与した発現プラスミドを好適に利用できる。上記べクタ一としては、一般に大腸菌由来のプラスミド、例えば p B R 3 2 2、 p B R 3 2 5、 p U C 1 2、 p U C

1 3等がよく用いられるが、これらに限定されず既知の各種のベクターを利用することができる。大腸菌を利用した発現系に用い得る上記べクターの市販品としては、例えば p G E X— 4 T ( Amersham Pharmacia Biotech社 ) 、 p M A L - C 2 , p M A 1 - P 2 (New England

Biolabs社）、 p E T 2 1， P E T 2 1 / 1 a c q

( Invitrogen社）、 p B A D / H i s ( Invitrogen社）等を例示できる。

脊椎動物細胞を宿主とする場合の発現べクターとしては、通常、発現しょうとする本発明遺伝子の上流に位置するプロモーター、 R N Aのスプライス部位、ポリアデニル化部位及び転写終了配列を保有するものが挙げられ、これは更に必要により複製起点を有していてもよい。該発現べクタ一の例としては、具体的には例えば S V 4 0 の初期プロモータ一を保有する P S V 2 dhfr 〔 Mol.

Cell. Biol. , 1： 854 (1981 )〕等が例'示できる。上記以外にも既知の各種の市販ベクターを用いることができる。動物細胞を利用した発現系に利用されるかかるベクターの市販品としては、例えば p E G F P — Ν, p E G F P — C ( Clontrech社）、 I N D ( I nvi trogen社）、 p c D N A 3. 1 ノ H i s ( I nvi trogen社 ) 等の動物細胞用ベクターや、 p F a s t B a c H T (GibciBRL社）、 p A c G H L T ( PharMingen社 ) . p A c 5 / V 5 - H i s, ρ Μ Τ/ν δ - H i s, p M T / B i p / V 5 - h i s (以上 Invitrogen社）等の昆虫細胞用ベクター等が挙げられる。

また、酵母細胞を宿主とする場合の発現ベクターの具体例としては、例えば酸性ホスファターゼ遺伝子に対すプロモーターを有する p A M 8 2 [ Proc. Natl. Acad. Sci. , USA. , 80： 1 (1983)〕等が例示できる。市販の酵母細胞用発現ベクターには、例えば p P I C Z

( Invitrogen社）， p P I C Z α ( Invitrogen社）等力包含される。

プロモーターとしても特に限定なく、エッシェリヒァ属菌を宿主とする場合は、例えばトリブトファン（trp)プ口モータ一、 lppプロモーター、 lacプロモータ一、 recA プロモーター、 PL/PRプロモータ一等を好ましく利用できる。宿主がバチルス属菌である場合は、 SP01プロモー夕一、 SP02プロモーター、 penPプロモーター等が好ましい。酵母を宿主とする場合のプロモータ一としては、例えば pH05プロモーター、 PGKプロモータ一、 GAPプロモーター、 ADHプロモーター等を好適に利用できる。また、動物細胞を宿主とする場合の好ましいプロモーターとしては、 S V 4 0 由来のプロモーター、レトロウイノレスのプロモ一ター、メタ口チォネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、サイトメガロウイノレスプロモーター、 S R aプロモーター等を例示できる。

尚、本発明遺伝子の発現ベクターとしては、通常の融合蛋白質発現ベクターも好ましく利用できる。該ベクタ —の具体例としては、グルタチオン一 S — トランスフエラ一ゼ（ G S T ) との融合蛋白質として発現させるための p G E X (Promega社）等を例示できる。

所望の組換え D N A (発現ベクター）の宿主細胞への導入方法 ■ 形質転換法にも特に制限はなく、一般的な各種方法を採用できる。また得られる形質転換体も、常法に従い培養することができ、該培養により本発明遺伝子によりコードされる目的の T S A 3 0 5蛋白が発現 ' 産生され、形質転換体の細胞内、細胞外若しくは細胞膜上に蓄積若しくは分泌される。

上記培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択利用でき、その培養も宿主細胞の生育に適した条件下で実施できる。

力、くして得られる組換え蛋白（ T S A 3 0 5蛋白）は、所望により、その物理的性質、化学的性質等を利用した各種の分離操作従って分雜、精製することができる

C 「生化学データブック II」、 1175-1259頁、第 1 版第 1 刷、 1980年 6月 23日株式会社東京化学同人発行； Bioche mistry, 25(25)： 8274 ( 1986)； Eur. J. Biochem. , 163 ： 313 (1987) 等参照〕。該方法としては、具体的には例えば通常の再構成処理、蛋白沈澱剤による処理（塩析法）、遠心分離、浸透圧ショック法、超音波破砕、限外濾過、分子篩クロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ァフィ二ティクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー

( H P L C ) 等の各種液体クロマトグラフィー、透析法、これらの組合せ等が挙げられ、特に好ましい上記方法としては、本発明の T S A 3 0 5蛋白の特異抗体を結合させたカラムを利用するァフィ二ティクロマトグラフィーを例示できる。

しかして、本発明は、例えば上記の如くして得られる、新規な T S A 3 0 5蛋白自体をも提供するものである。該蛋白は、前記のとおり、線虫の s e l — 1 と高い相同性を有し、各種癌に対して抑制的に働く作用を奏し得るところから、医薬分野において有用である。

また、この T S A 3 0 5蛋白は、該蛋白の特異抗体を作成する為の免疫抗原としても利用できる。ここで抗原として用いられるコンポーネントは、例えば上記遺伝子工学的手法に従って大量に産生された蛋白或はそのフラグメントであることができ、これら抗原を利用することにより、所望の抗血清（ポリクローナル抗体）及びモノクローナル抗体を収得することができる。該抗体の製造方法自体は、当業者によく理解されているところであり- 本発明においてもこれら常法に従うことができる〔続生化学実験講座「免疫生化学研究法」、日本生化学会編

( 1986) 等参照〕。例えば、抗血清の取得に際して利用される免疫動物としては、ゥサギ、モノレモット、ラット、マウスやニヮトリ等の通常動物を任意に選択でき、上記抗原を使用する免疫方法や採血等もまた常法に従い実施できる。

また、モノクローナル抗体の取得も、常法に従い、上記免疫抗原で免疫した動物の形質細胞（免疫細胞）と形質細胞腫細胞との融合細胞を作成し、これより所望抗体を産生するクローンを選択し、該クローンの培養により実施することができる。免疫動物は、一般に細胞融合に使用する形質細胞腫細胞との適合性を考慮して選択され、通常マウスやラット等が有利に用いられている。免疫は、上記抗血清の場合と同様であり、所望により通常のアジュバント等と併用して行なうこともできる。

尚、融合に使用される形質細胞腫細胞としても、特に限定なく、例えば p 3 (_P3/x63-Ag8) C Nature, 256: 495-497 (1975)] 、 p 3 - U 1 C Current Topics in Microbiology and Immunology, 81： 1-7 ( 1978 ) 3 、 N S - 1 [ Eur. J. Immunol. , 6 : 511-519 ( 1976)〕、 M P C - 1 1 〔 Cell, 8: 405- 415 ( 1976 )〕、 S P 2 / 0 [ Nature, 216： 269-271 (1978)〕等、ラットにおける R 2 1 0 [Nature, 277： 131-133 ( 1979)〕等及びそれらに由来する細胞等の各種の骨髄腫細胞をいずれも使用できる。

上記免疫細胞と形質細胞腫細胞との融合は、通常の融合促進剤、例えばポリエチレングリコール（ P E G ) やセンダイウィルス（ H V J ) 等の存在下に公知の方法に準じて行なうことができ、所望のハイブリドーマの分離また同様 ίこ行な^、得る eth. in Enzymol. , 13： 3 (1981) ；上記続生化学実験講座等〕。

また、目的とする抗体産生株の検索及び単一クローン化も常法により実施され、例えば抗体産生株の検索は、上記の本発明抗原を利用した E L I S Α法〔Meth. in Enzymol. , 70： 419-439 ( 1980)〕、プラーク法、スポッ卜法、凝集反応法、ォクテロ二一（Ouchterlony) 法、ラジオイムノアッセィ等の一般に抗体の検出に用いられている種々の方法に従い実施することができる。

かくして得られるハイブリドーマからの本発明抗体の採取は、該ハイプリドーマを常法により培養してその培養上清として得る、また、ハイプリドーマをこれと適合性のある哺乳動物に投与して増殖させその腹水として得る方法等により実施される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。このようにして得られる抗体は、更に塩析、ゲル濾過、ァフィ二ティクロマトグラフィー等の通常の手段により精製することができる。

かくして得られる抗体は、本発明の T S A 3 0 5蛋白に結合性を有することによって特徴付けられ、これは、前述した T S A 3 0 5蛋白の精製及びその免疫学的手法による測定乃至識別等に有利に利用できる。本発明は、かかる新規な抗体をも提供するものである。

また、本発明によって明らかにされた本発明遺伝子の配列情報を基にすれば、例えば該遺伝子の一部又は全部の塩基配列を利用することにより、個体もしくは各種組織における本発明遣伝子の発現の検出を行うことができる。

かかる検出は常法に従って行うことができ、例えば

R T — P C R L Reverse transcribed- Polymerase chain reaction; E. S. Kawasaki, et al. , Ampliiication of RNA. In PCR Protocol, A Guide to methods and applications, Academic Press, Inc. , SanDiego, 21- 27 ( 1991 )3 による R N A増幅やノーザンブロット解析 C Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Lab. (1989 ) 、 in situ R T— P C R C Nucl. Acids Res.， 21 : 3159- 3166 (1993)〕や in situ ハイブリダィゼーシヨン等の細胞レベルでのそれら測定、 N A S B A法！： Nucleic acid sequence-based amplification, Nature, 350 : 91 - 92 ( 1991 )〕及びその他の各種方法によりいずれも良好に実施し得る。

尚、 R T — P C R法を採用する場合において、用いられるプライマーは、本発明遣伝子のみを特異的に増幅できる該遺伝子特有のものである限り何等限定されず、本発明の遺伝情報に基いてその配列を適宜設定することができる。通常、これは 2 0〜 3 0 ヌクレオチド程度の部分配列を有するものとすることができる。

このように、本発明は、本発明にかかる T S A 3 0 5 遣伝子の検出用の特異プライマー及び又は特異プロ一ブとして使用される D N A断片をも提供するものである。

図面の簡単な説明

図 1 は実施例 1 の（ 2 )に従うノーザンブロット分析により調べた本発明遺伝子のヒト組織における分布を示す図面代用写真である。

図 2 は実施例 1 の（4)に従う、正常陴臓細胞（ノーマル， Normal) 、 4種の細胞株（Cell line) を R T — P C R分析した結果を示す図面代用写真であり、上段は T S A 3 0 5の結果を、下段はコントロールとしての ₂— ミクログロブリンの結果を示す。

図 3 は実施例 1 の（5)に従う、脬癌サンプルその他を R T - P C R分析した結果を示す図面代用写真であり、上段は T S A 3 0 5 の結果を、下段はコントロールとしての）S ₂ — ミクログロブリンの結果を示す。

明実施するための最良の形態

以下、本発明を更に詳しく説明するため、実施例を挙げる。

実施例 1

(1-1) C α -^{3 3} P ) Α Τ Ρで標識した表出方法

組織特異的な手法において発現したヒト遺伝子を確認するために〔 α -^{3 3} Ρ〕 A T Pで標識した表出方法を用いた。該方法の手順は本質的に以下に示すリアングの方法 (Liang P.， et al.， Science, 257, 967 - 971 ( 1992))によって行なった。

即ち、 1 3 のヒト組織（成人脳、胎児脳、肺、肝臓、胃、眸臓、脾臓、乳、膀胱、胎盤、睾丸、腎臓及び心臓：クローンテック社製）の各々から単離したポリ A R N A ( 0. 2 g ) を、ジェチルピロカーボネート処理された水の 8 μ 1中で 3 ' -アンカード ' オリゴ d Τプライマー G ( T ) 1 5 M A ( Mは G、 A及び Cの混合液である）の 2 5 pmolと混合し、 6 5 °Cで 5分間加熱した。この溶液に 4 μ Ι の 5 x ファースト ' ストランド緩衝液

( B R L社製）.、の 0. 1 M D T T ( B R L社製）、 l /z lの 2 5 0 m M d N T P s ( B R L社製）、 1 1 のリボヌクレアーゼ ' インヒビター（ 4 0単位； T0Y0B0 社製）及び 1 μ 1 のスーパースクリプト II逆転写酵素

( 2 0 0単位； B R L社製）を加えた。各反応液の最終容量は 2 0 1 であった。各溶液を 3 7 °Cで 1 時間培養した後、 3 0 1 の蒸留した水の付加により 2. 5倍までに希釈し、使用時まで一 2 0 °Cで貯蔵した。

c D N Aは、〔な -³³ P 〕 A T Pで標識した（アマシャム社製） 3 ' —アンカード ' プライマーの存在下で

P C Rによって増幅した。この c D N Aの P C R増幅は、以下のとおり実施された。即ち、各 2 0 / 1 の P C R混合液は、 2 / 1 の R T反応混合液、 2 ; 1 の 1 0 X

P C R緩衝液（タカラ社製）、 4 1 の 2. 5 m M d N T P s、 0. 2 5 μ 1 の E x T a q D N Aポリメラーゼ（ 5単位 Zm l ：夕カラ社製）、〔 -³³ P〕 A T P で標識した 2 5 pmolの 3 ' —アンカ一ド ' オリゴ— d T プライマ一及び 2 5 pmolの 5 ' 一プライマー（No. 2 0、配列番号： 4 に示す塩基配列の任意配列を有する 1 0 — m e r デォキシオリゴヌクレオチド · プライマ一）を含んでいた。また、 P C R反応は以下の条件で行なった。即ち、 9 5 °Cで 3分間、 4 0 °Cで 5分間及び 7 2 °Cで 5 分間を 1 サイクノレとして行ない、それから 9 5 °Cで

0. 5分間、 4 0 Cで 2分間及び 7 2 °Cで 1 分間を 4 0 サイクル行ない、最後に 7 2 °Cで 5分間反応させた。

P C R反応サンプルをエタノーノレで抽出し、フオノレムアミド . シークェンシング染料中に再懸濁して、 6 %ァクリノレアミド 7. 5 Mゥレア · シークェンシング ' ゲル上で反応させた。ゲルは固定することなしに乾燥させ、 —晚ォ一トラジオグラフィ一を実施した。

(1-2) 増幅された c D N A断片のサブ ' クローニング予め乾燥ゲルを載せた 3 MM濾紙上にラジオアクティブインクで印を付けておき、これとオートラジオグラムをあわせることにより、目的の c D N Aを含むバンド力、' 含まれるゲルを、 3 MM濾紙ごと切り出した後、 3 0 0 1 の d H ₂0にて 1 時間攪袢した。ポリアクリルアミド ' ゲルと濾紙を取り除いた後、 c D N Aを担体として 1 μ 1 の 1 O m g Zm l グリコーゲンと 0. 3 M NaOAcの存在下、エタノール沈澱によって再回収し、 1 0 1 の d H ₂0に再溶解した。再増幅のために、 5 1 のこの溶液が用いられた。 P C Rの条件とプライマ一は最初の P C Rに対してと同じであった。適当な大きさの再増幅産物を第一の P C R産物として再回収し、それからその P C R産物を pUC118ベクター（タカラ社製）の Hinc II部位にクローンニングした。核酸配列は A B I 3 7 7 自動シークェンサー（アプライド ' ノィォ · システムズ社製）によって決定した。

上記方法にて、 1 3 のヒト組織から単離した m R N A を用いて異なる表出パターンを比較した結果、脾臓に特異的に発現した一つの P C R産物を確認した。これを T S A 3 0 5 と命名した。

この産物は、 3 7 1 ヌクレオチドからなっていた。

F A S T Aプログラム (Person W. R. , et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. , USA, 85, 2444-2448 ( 1988"を使用する GenBanckZ E M B Lデータ ' ベース中の D N A配列とこのヌクレオチド · データとの比較より、この P C R 産物が他の如何なる公知の D N A配列と相同性がないことが明らかとなつた。

(1-3) c D N Aのスクリーニング

ヒト正常脾臓 c D N Aライブラリ一は、オリゴ（ dT) +ランダムへキサマ——プライムド ' ヒト正常脬臓 c D N A と U n i -Z A P™ X R (ストラタジーン社製）を用いて、構築した。 1 X 1 0 ⁸個のクローンの全体を上記方法によって単雜し、〔 α — ³²P〕一 d C T P にて標識された c D N A断片を用いてそのスクリーニングを行なった。陽性クローンを選択し、それらの挿入 c D N A 部を pBluescript II SK (-)中のイン ' ビボに切り出した。

その結果、 T S A 3 0 5 に対して約 1 0 0のプラークが確認された。この結果より、全 R N A間の転写量は、およそ 0. 0 1 %であると計算された。 T S A 3 0 5 に相同する集合した c D N A配列（ T S A 3 0 5 ) は、計算された分子量 8 8 7 6 8 D a を有する 7 9 4 アミノ酸の蛋白をコードする 2 3 8 2 ヌクレオチドのオープン ' リーディング · フレームを含む 7 8 8 5 ヌクレオチドを含んでいた。

一次配列からこの遺伝子の産物（ T S A 3 0 5蛋白）は、フイブロネクチン T y p e llコラーゲン結合ドメィンを含む蛋白であることが明らかとなった。

その染色体上の位置は、インスリン依存性糖尿病

( I D D M ) の原因遣伝子が存在するとされる第 1 4染色体 q 2 4. 3 - q 3 1. 1 であった。

また、本発明遺伝子 T S A 3 0 5 は、線虫の s e 1 — 1 と高いホモロジ一を有していた。

( 2 ) 組織における発現

組織における T S A 3 0 5 の発現プロファイルを調べるため、各種のヒト組織を用いたノーザンブロット分析を行った。

ノーザン ' プロット分析には、ヒト M T N (Multiple- Tissue Northern)ブロット I と II (クローンテック社製）を使用した。 c D N A断片は、 T 3 と T 7 プロモーター配列のプライマー ' セットを用い、 P C Rによって〔な一 ³² P 〕一 d C T Pで標識した。増幅産物を含むメンブランをプレハイブリダィズ（条件は製品のプロトコールに従った）し、そしてそれから製品のプロトコールに従い、ハィブリダイゼーションを行なつた。

ハイブリダィゼーシヨン後、洗浄した膜を一 8 0 °Cで 2 4時間オートラジオグラフに露光した。その結果は図 1 に示すとおりである。

該図において、用いたヒト組織は、心臓（Heart：)、脳 (brain). 睪丸（Placenta)、肺（Lung：)、肝臓（Liver)、骨格筋（Skeletal muscle). 腎臓（Kidney：)、脾臓（Pancreas )、脾臓（Spleen)、胸腺（Thymus), 膀胱（Prostate)、胎盤

(Testis), 卵巣（Ovary)、小腸（Small intestine). 結腸 (Colon)及び末稍血白血球 (Peripheral blood leukocyte) である。

該図より、 T S A 3 0 5 に相同する転写体が脬臓

(Pancreas)において特異的に観察された。

(3) F I S H

染色体の整列のための F I S Hは、公知の方法

(Takahashi E. , et al. , Hum. Genet. , 86. 14 - 16

(1990))に従って、各コスミド D N Aの 0. 5 gをプロ —ブとして使用して実施した。 F I S Hはプロビア 1 0 0 フイノレム（フジ社製、 I S O 1 0 0 ) 又は C C D カメラ · システム（アプライド * イメージング、サイトビジョン社製）によって捕えられた。

その結果、 1 0 0 の典型的な R—バンド（前）分裂中期の細胞を試験したシグナルは、第 1 4染色体のバンド Q 2 4. 3 - q 3 1. 1 に局在していた。従って、 T S A 3 0 5染色体の局在部位は、 1 4 q 2 4. 3 - q 3 1. 1 と同定できた。

(4) R T - P C R分析による脬臓癌細胞株と眸臓癌組織における転写物の発現

T S A 3 0 5遣伝子の発現がヒト陴臓癌細胞株と脾臓癌組織において変異するかどうかを調べるために、 4つの細胞株 ( Aspcl (転移性腺癌， J. Natl. Cancer Inst. , 67, 563-569 ( 1981)) ， Bxpc3 (腺癌 · 未分ィ匕， Cancer Invest. , 4, 15-23 ( 1986)) , MiaPaca2 (腺癌， Int. J. Cancer, 19, 128- 135 ( 1977)) 及び PANC1 (類上皮性、脾管癌， Int. J. Cancer, 15, 741-747 (1975)) と 9の脾臓の癌組織（東京大学医科研究所、中村先生より供与）の R T— P C R分析を行なった。

即ち、全 R N Aを I S O G E N (和光社製）を使用して細胞株と脾臓癌組織から単離した 1 0 n 1 の全 R N A *· 1 0単位の R N a s e フリー D N a s e I (ベーリンガ一 . マインハイム社製）で 1 5分間処理し、フヱノールークロロフオルムで 2 回抽出し、エタノールで沈澱させた。一本鎖 c D N Aをオリゴ d ( T ) とランダムブライマ一を使用して Superscript I™ R N a s e H -逆転写酵素（ライフ ' テクノロジ一社製）によって合成した。 2 β 1 の各産物を P C R増幅のために用いた。

配列番号： 5及び配列番号： 6 として示す塩基配列のプライマ一 P 1 及び P 2 Sを、 2 5サイクソレの P C R増幅のために使用した。

尚、 P C R反応は 2 5 n g c D Ν Α、 Ι Ο Μ各プライマ一、 2. 5 m M d N T P及び 0. 2 5 U ©Extaq D N Aポリメラーゼ（夕カラ社製）を含む 2 0 fi 1 溶液中で行なった。 P C R産物は、ェチジゥム ' ブロマイト染色した 1. 5 %ァガロースゲル中に溶解させた。

上記に従い、 4種の細胞株（レーン 1 = Aspcl, レーン 2 = Bxpc3, レーン 3 = MiaPaca2, レーン 4 -PANC1) と正常脾臓組織（ Normal Pancreas^ レーン 5 ) を R T — P C R分析した結果は、図 2 に示す通りである。尚、図の上段は T S A 3 0 5の結果を、下段はコントロールとしての /3 ₂ — ミクログロブリン（ /S z— microglobulin) の結果を示す。

該図より、 T S A 3 0 5発現は、全ての癌組織においては見当らず、正常脾臓組織（レーン 5参照）にのみ認められることが判った。

(5) 脬癌における T S A 3 0 5遺伝子の発現（ R T— P C R )

T S A 3 0 5遺伝子の発現を、脾癌患者サンプル（ 1 T、 2 Τ、 3 Τ、 5 Τ、 6 Τ、 7 Τ、 1 0 T及び 1 1 Τ ) 、脾癌（Tumor Pancreas)及び正常陴（ I nvitrogen社；

Human Normal Pancreas) 並びに同一患者脬臓の癌部

( 2 3 T ) 及び非癌部（ 2 3 N ) にっき、以下の通り、 R T — P C R法により検出した。

各サンプルより m R N Aを抽出し、 T S A 3 0 5 の 1 5 8 1 - 2 3 8 2 b p ( 8 0 1塩基対）を R T - P C Rにて増幅させ、発現の有無を検出した。濃度コントローノレとして /9₂— ミクログロブリン（ microglobulin) を用いた。結果を図 3 に示す。

該図より、正常脾臓の発現に比べて、眸臓癌サンプル全例において T S A 3 0 5遺伝子の発現の低下或いは欠損が観察された。

卜-の利用可能性

本発明によれば新規な脾臓特異的遺伝子 T S A 3 0 5 及びこれによりコードされる蛋白が提供され、これらの利用により、陴臓癌等の癌や癌化の解明、その診断、予防及び治療等に有用な技術が提供される。

Claims

請求の範囲

1. 配列番号： 1 で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする塩基配列を含む脾臓特異的遺伝子。

2. ヒト遺伝子である請求の範囲第 1項に記載の遺伝子。

3. 塩基配列が配列番号： 2 で示されるものである請求の範囲第 1 項に記載の遺伝子。

4. ヒト遺伝子である請求の範囲第 3項に記載の遺伝子。

5. 以下の（ a ) 及び（ b ) のいずれかのポリヌクレオチドからなる脾臓特異的遣伝子：

( a ) 配列番号： 2 で示される塩基配列の全部又は一部を含むポリヌクレオチド、

( b ) 配列番号： 2 で示される塩基配列からなる D N A とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。

6. ヒト遣伝子である請求の範囲第 5項に記載の遣伝子 _c

7. 請求の範囲第 1 項に記載の脾臓特異的遣伝子の検出用の特異プローブ又は特異プライマーとして使用される D N A断片である請求の範囲第 5項に記載の遺伝子 ₍

8. 配列番号： 1 で示されるアミノ酸配列からなる脾臓特異的蛋白質。

9. 請求の範囲第 8項に記載の胖臓特異的蛋白質に結合性を有する抗体。