ES2348656T3 - Human tsc403 gene and human ing1l gene. - Google Patents
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Abstract
Polinucleótido que tiene una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID nº: 1 o una secuencia complementaria a la misma.
Description
Gen TSC403 humano.
La invención se refiere a un gen de uso como un
índice en la profilaxis, diagnóstico y terapia de enfermedades
humanas, y más particularmente a un nuevo gen humano específico del
pulmón que es homólogo a lamp-1 y 2 humana
[glucoproteína de membrana lisosómica; Saito, O. et al., J.
Biol. Chem., 261, 5700-5711 (1992); Sawada, R. et
al., J. Biol. Chem., 268, 12615-12681 (1993);
Sawada, R. et al., J. Biol. Chem., 269,
1425-1431 (1994)] y que se sospecha que actúa como
oncogén.
La invención se refiere además a un nuevo gen
humano que es análogo a los genes de rata, ratón, levadura,
nemátodo, y ser humano conocidos y otros genes, y, a través del
análisis de ADNc, cartografiado cromosómico y análisis funcional de
su ADNc, se puede utilizar en el diagnóstico génico y para el
desarrollo de nuevos fármacos terapéuticos.
Además, la invención se refiere a nuevas
proteínas codificadas por dichos genes, y a anticuerpos específicos
para ellas.
La información genética en organismos se acumula
en conjuntos (ADN) de cuatro tipos de bases, a saber, A, C, G y T,
en el núcleo celular, y esta información genética se conserva para
el mantenimiento del linaje y ontogénesis. En un ser humano, se
afirma que el número de tales bases es aproximadamente tres mil
millones (3 x 10^{9}), y se estima que esta población incluye
50-100 mil genes. La información genética está
implicada en el mantenimiento de fenómenos vitales a través de la
creación de proteínas reguladoras, proteínas estructurales, enzimas,
etc., a lo largo del flujo de transcripción de ARNm de genes (ADN) y
la traducción subsiguiente en proteínas.
Generalmente se sabe que cualquier anormalidad
del flujo anterior a partir de un gen en su proteína del producto de
la traducción conduce a un error del sistema de mantenimiento de la
vida, incluso de la proliferación y diferenciación de células, y
puede ser la causa de diversas enfermedades. Los resultados de
análisis génicos hechos hasta la fecha sugieren que los genes de
diversos receptores, tales como la insulina, LDL y otros receptores,
y aquellos de enzimas metabólicas asociadas con el crecimiento y
diferenciación de células, tales como proteasa, ATPasa, superóxido
dismutasa, etc., se consideran que son herramientas útiles para el
desarrollo de fármacos.
Sin embargo, el análisis de genes humanos y el
estudio de sus funciones y relaciones con diversas enfermedades
todavía están en la etapa incipiente, y todavía queda mucho por
conocer. Por lo tanto, el análisis de nuevos genes, las
exploraciones analíticas en las funciones y relaciones con las
enfermedades de tales genes, y los estudios para el establecimiento
de diagnóstico génico que explotan los genes así analizados, y los
estudios de la aplicación farmacéutica sobre tales genes son sujetos
de inmenso interés para esta industria.
Mientras tanto, el carcinoma del páncreas es uno
de los tumores malignos del sistema digestivo con el peor
pronóstico, detentando el cuarto y quinto puesto en la lista de
causas para la muerte relacionada por cáncer en Japón y países
Occidentales, respectivamente (Poston, J. G., et al., Gut.,
32, 800-812 (1991)). El objetivo más importante en
la investigación sobre el cáncer es identificar cambios en los genes
en la fase temprana de la oncogénesis. La identificación de tales
cambios debería de conducir al desarrollo de herramientas genéticas
para el diagnóstico temprano y nuevas modalidades terapéuticas para
el tratamiento eficaz de esta enfermedad mortal.
La elucidación de los papeles fisiológicos de
tales genes y la información resultante son importantes para la
explicación de los mecanismos de la génesis y el comienzo de
enfermedades neoplásicas, y se han demandado no sólo en el campo de
la investigación científica fundamental, sino también desde el punto
de vista de la caracterización y tratamiento de tumores malignos en
el campo farmacéutico.
De este modo, asumiendo que se proporciona un
nuevo gen humano, se podría elucidar sus niveles de expresión en
diversas células, así como su estructura y funciones, y, a través
del análisis de los productos de la expresión del gen, sería
factible la clarificación de la patología, diagnóstico y terapia de
las enfermedades asociadas con el gen, tales como enfermedades
hereditarias y cánceres. El objetivo de la invención consiste en
proporcionar tales genes humanos nuevos.
Teniendo en cuenta el objetivo anterior, se ha
investigado intensamente como se describe a continuación. De este
modo, para empezar, se han sintetizado ADNc a partir de los ARNm
extraídos de diversos tejidos humanos, tales como cerebro fetal
humano, vaso sanguíneo adulto y placenta, se los clonó en vectores
para construir librerías, se cultivaron células de Escherichia
coli transformadas con cada librería en medio agar, se
recogieron colonias transformantes al azar y se transfirieron a
placas de microtitulación para preparar y registrar clones de E.
coli que contienen diversos genes humanos. Después, cada uno de
estos clones se cultivó, el ADN se extrajo y se purificó, y, usando
como molde el ADNc así obtenido, se llevó a cabo una reacción de
amplificación con terminación de cadena específica para dichas 4
bases mediante el método terminador de desoxi, y, usando un
secuenciador automático de ADN, se determinó la secuencia de
alrededor de 400 nucleótidos desde el extremo 5' del gen humano en
cada clon registrado. Basándose en la información de la secuencia
nucleotídica así obtenida en genes humanos, se exploraron nuevos
genes de la familia similares a los genes conocidos de bacterias,
levaduras, nemátodos, murinos, humanos y otros animales y plantas.
La tecnología anterior para el análisis de ADNc se describe con
detalle en el informe de Fujiwara et al. [Fujiwara, Tsutomu,
Saibo Kogaku (Cell Engineering), 14, 645-654
(1995)].
Como resultado, entre los clones de ADNc
recogidos arbitrariamente de la librería de ADNc de cerebro fetal
humano, se encontró un clon que alberga un nuevo gen que codifica
una secuencia de aminoácidos que tiene una elevada homología con
p33^{ING1}, que se considera que es una proteína que suprime el
cáncer [GenBank A. C. nº AF001954, Garkavetsev, et al.,
Nature, Genet., 14, 415-420 (1996); Garkavetsev,
et al, Mol. Cell. Biol., 17, 2014-2019
(1997); reescrito -GenBank A. C. nº AF044076].
Adicionalmente, con el fin de proporcionar dicha
información demandada por la industria, en particular un gen que
codifica una nueva proteína que tiene homología con el gen
lamp-1 y con el gen lamp-2, se
realizó una intensa exploración en los genes derivados de diversos
tejidos humanos, y se tuvo éxito en aislar y caracterizar un nuevo
gen específico del pulmón que satisface el fin anterior. Esta
invención se ha desarrollado basándose en el hallazgo anterior.
De este modo, en primer lugar, la invención
proporciona un gen que contiene una secuencia nucleotídica que
codifica la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 1 (en lo sucesivo
denominada como gen TSC403), en particular aquel gen que es un gen
humano.
Además, la invención proporciona una nueva
proteína codificada por dicho gen TSC403 (en lo sucesivo denominada
como proteína TSC403), y un anticuerpo que tiene una afinidad de
unión por dicha proteína.
Además, la invención proporciona un gen TSC403
que es uno cualquiera de los siguientes polinucleótidos (a) y (b),
particularmente aquel gen que es un gen humano.
- (a)
- un polinucleótido que contiene la secuencia nucleotídica de SEC ID nº: 2 o una cadena complementaria a ella;
- (b)
- un polinucleótido que se hibrida específicamente a dicho polinucleótido (a) en las condiciones de 6 x SSC a 65ºC toda la noche o 4 x SSC suplementado con formaldehído al 50% a 37ºC toda la noche, y lavado en 2 x SSC a 65ºC durante 30 minutos, y que es útil como un marcador del cáncer.
La invención proporciona además un gen TSC403
que tiene la secuencia nucleotídica de SEC ID nº: 3.
La invención proporciona además sondas y
cebadores oligonucleotídicos como se definen en las
reivindicaciones.
Adicionalmente, se describe un gen humano (en lo
sucesivo denominado como gen ING1L humano) que contiene una
secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de
SEC ID nº: 4.
Se describe adicionalmente aquí además una
proteína (en lo sucesivo denominada como proteína ING1L humana) que
es codificada por dicho gen ING1L humano, y un anticuerpo que se une
a dicha proteína.
Se describe además un gen ING1L humano que
comprende uno cualquiera de los siguientes polinucleótidos (a), (b)
y (c).
- (a)
- un polinucleótido que contiene la secuencia nucleotídica de SEC ID nº: 5;
- (b)
- un polinucleótido que contiene una secuencia nucleotídica que se hibrida a un ADN que tiene la secuencia nucleotídica de SEC ID nº: 5, en condiciones restrictivas; y
- (c)
- un polinucleótido que tiene por lo menos un 95% de homología con un polinucleótido que codifica un polipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 4.
Se describe además un gen ING1L humano que tiene
la secuencia nucleotídica de SEC ID nº: 6.
Además, se describe un oligonucleótido que tiene
una secuencia que consiste en por lo menos 15 nucleótidos
consecutivos en la secuencia nucleotídica de SEC ID nº: 5 y un
fragmento de ADN para uso como una sonda o cebador específico para
detectar genes que tienen dicha secuencia oligonucleotídica.
La representación de aminoácidos, péptidos,
secuencias nucleotídicas, nucleótidos, etc., mediante abreviaturas
en esta memoria descriptiva está de acuerdo con las reglas
recomendadas por la IUPAC-IUB
[IUPAC-IUB Communication on Biological Nomenclature,
Eur. J. Biochem., 138, 9 (1984)], "Guideline for Preparation of a
Specification or Equivalent Referring to a Nucleotide Sequence
and/or an Amino Acid Sequence" (editado por la Oficina de Patente
de Japón) y las convenciones que se refieren al uso de códigos o
símbolos en la técnica.
Ahora se describe con detalle el gen TSC403
según la invención.
Como ejemplo específico del gen TSC403 según la
invención, se puede mencionar el gen deducido a partir de la
secuencia de ADN de un producto de PCR denominado "TSC403" como
se describe en el Ejemplo que aparece en lo sucesivo. Su secuencia
nucleotídica está representada en SEC ID nº: 3.
Este gen es un ADNc humano que codifica una
nueva proteína específica del pulmón que tiene una secuencia de 416
restos de aminoácidos como se muestra en SEC ID nº: 1 (en lo
sucesivo denominada como "proteína TSC403"), y su ADNc tiene
una longitud completa de 3198 nucleótidos.
La proteína TSC403 de la invención aparece como
un producto de expresión del gen de la invención. Una búsqueda de
homología usando el programa FASTA [Person, W. R., et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85, 2444-2448 (1988)]
frente a la base de datos GenBank/EMBL reveló que este gen es
homólogo con el gen lamp-1 y el gen
lamp-2 humanos (véase la bibliografía citada
anteriormente).
A este respecto, se sabe que dichos genes lamp
humanos son expresados a altos niveles en una estirpe celular de
cáncer colorrectal altamente metastásica y se une a
E-selectina en la célula endotelial vascular. Por lo
tanto, se sospecha que estos genes están asociados con la
tumorigenicidad de los cánceres (véase la bibliografía citada
anteriormente).
El gen TSC403 según la invención es también un
gen relacionado con el cáncer, que se espera que encuentre
aplicación como un marcador del cáncer.
Adicionalmente, el locus cromosómico de este gen
de la invención es 3q27, donde se detecta una aberración cromosómica
en diversos cánceres. Este hecho, incluso solo, sugiere fuertemente
la relación que tiene este gen de la invención con diversas
enfermedades neoplásicas.
Además, se encontró que el gen TSC403 según la
invención muestra una elevada expresión en diversas muestras de
cáncer, sugiriendo su valor como un marcador para predecir la
oncogénesis y tumorigenicidad.
De este modo, el gen TSC403 o un producto génico
del mismo según la invención proporciona la información o medio de
inmensa importancia para la elucidación, comprensión, diagnóstico,
profilaxis y terapia de diversas enfermedades neoplásicas tales como
cáncer colorrectal, cáncer del útero, cáncer del ovario, cáncer del
pulmón, y cáncer del páncreas, entre otros. Además, este gen de la
invención se puede usar con ventaja en el desarrollo de nuevos
fármacos que podrían inducir la expresión del gen para uso en el
tratamiento de dichas enfermedades neoplásicas.
Además, la detección de la expresión del gen de
la invención o la expresión de su producto en un individuo o un
tejido dado, así como la detección de una mutación (supresión o
mutación de punto) o anormalidad de la expresión de dicho gen, se
pueden explotar ventajosamente en la explicación y diagnóstico de
dichas diversas enfermedades neoplásicas.
Ahora se describe con detalle el gen ING1L
humano.
Como ejemplo específico del gen ING1L humano, se
puede mencionar el gen deducido de la secuencia de ADN albergada por
el clon denominado "GEN-146F11" y descrito en
el Ejemplo que aparece en lo sucesivo. La secuencia nucleotídica de
este gen se presenta en el Listado de secuencias. De este modo, el
gen albergado por este clon tiene un marco de lectura abierto de 840
nucleótidos (región traducida de aminoácidos deducida; la secuencia
se muestra en SEC ID nº: 5), que codifica la secuencia de 280 restos
de aminoácidos como se muestra en SEC ID nº: 4 en el Listado de
secuencias, y la secuencia nucleotídica de longitud completa del
clon de ADNc consiste en 1018 nucleótidos como se muestra en SEC ID
nº: 6.
En la secuencia anterior de SEC ID nº: 6, el
codón de iniciación está situado en la posición
92-94, y el codón de terminación está en la posición
932-934. La secuencia de tipo señal de
poliadenilación (ATTAAA) está situada en la posición
1058-1063.
Como se ha mencionado anteriormente, el gen
ING1L humano descrito aquí tiene una elevada homología con
p33^{ING1}, y se puede utilizar en el análisis de genes humanos
basándose en su información genética y estudios sobre las relaciones
de diversas funciones de los genes así analizados con diversas
enfermedades, y se puede explotar además en el diagnóstico génico y
la terapia génica de las enfermedades relacionadas con genes y
estudios de aplicación en los genes en la industria farmacéutica. De
este modo, las funciones de la proteína (producto génico) codificada
por el gen ING1L humano de la invención se pueden predecir a partir
de aquellas de los genes homólogos conocidos, y, como resultado de
la provisión del gen descrito aquí, ahora es posible construir una
proteína recombinante clonando el gen candidato en un vector de
expresión e investigar su actividad enzimática, actividad de unión y
otras funciones. Particularmente, puesto que se sospecha que el gen
descrito aquí funciona como un oncogén, esta función se puede
utilizar con ventaja en el desarrollo de fármacos, tales como
fármacos contra el cáncer.
La proteína (en lo sucesivo denominada como
"proteína ING1L humana"), codificada por el gen ING1L humano
descrito aquí, tiene una secuencia similar a un motivo de dedo de Zn
en su región C-terminal, y se considera que esta
región en particular tiene una homología elevada con dicho
p33^{ING1}.
A este respecto, se ha dado a conocer que dicho
p33^{ING1} está inactivado en varias estirpes celulares derivadas
de cáncer, incluyendo una estirpe celular de cáncer mamario [véase
la bibliografía citada anteriormente]. Además, se ha demostrado
recientemente que dicho p33^{ING1} regula negativamente la
proliferación celular a través de p53, que se sabe que es un
producto génico supresor del cáncer [Garkavetsev, et al.,
Nature, 391, 295-298 (1998)]. Adicionalmente, en
diversos tejidos neoplásicos humanos, el nivel de expresión del gen
ING1L humano está específicamente elevado. A partir de estos
hallazgos, se sospecha que la proteína ING1L humana modula
positivamente la proliferación celular a través de su interacción
con p53.
Adicionalmente, en el análisis de transferencia
Northern, se encontró que una expresión del gen ING1L humano
descrito aquí en los 16 tejidos derivados de órganos de adultos
humanos ensayados, y se observó un potenciamiento de su expresión en
varios tejidos neoplásicos, incluyendo cáncer colorrectal, cáncer
del esófago, cáncer de la trompa uterina, y cáncer de estómago, en
comparación con los tejidos normales. Estos hallazgos sugieren que
el gen descrito aquí se puede usar para el diagnóstico de
enfermedades neoplásicas y otras enfermedades asociadas con él
mediante la comprobación de su expresión en diversos tejidos, y,
como corolario, encuentra aplicación en la identificación de
compuestos antimitóticos o compuestos contra el cáncer.
El gen de la invención incluye específicamente
polinucleótidos que contienen las secuencias nucleotídicas de SEC ID
nº: 2 que codifican las secuencias de aminoácidos de SEC ID nº: 1, y
polinucleótidos que se hibridan a los ADN que contienen las
secuencias nucleotídicas de SEC ID nº: 2 en condición restrictiva
como se define en las reivindicaciones.
Por lo tanto, el gen de la invención incluye
aquellos genes que codifican secuencias de aminoácidos que
corresponden a ciertas modificaciones de las secuencias de
aminoácidos definidas anteriormente.
De este modo, el gen de la invención incluye
genes que contienen secuencias nucleotídicas que codifican las
secuencias de aminoácidos que resultan de la supresión, sustitución
o adición de uno o una pluralidad de aminoácidos de, en o a la
secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 1 (es decir, secuencias de
aminoácidos modificadas). El gen que tiene una secuencia
nucleotídica que codifica tal secuencia de aminoácidos modificada
sólo necesita ser tal que, utilizándolo, se puede detectar el gen de
la invención que codifica la secuencia de aminoácidos no
modificada.
A propósito, aunque tales modificaciones
(mutación, etc.) de las secuencias de aminoácidos pueden ser
espontáneas, por ejemplo mutaciones y modificaciones
post-traduccionales, las modificaciones se pueden
realizar artificialmente, así como utilizando un gen de origen
natural (por ejemplo, un gen específico de la invención).
El medio para realizar tales modificaciones
artificiales incluye técnicas de manipulación mediante ingeniería
genética, tales como mutagénesis (dirigida) específica del sitio
[Methods in Enzymology, 154: 350, 367-382 (1987);
ditto 100: 468 (1983); Nucleic Acids Res., 12: 9441 (1984); Zoku
Seikagaku Jikken Koza 1 "Idenshi Kenkyuho II" [Experimental
Biochemistry Series 1 "Methods for Gene Research II" (editado
por la Sociedad Bioquímica Japonesa), p. 105 (1986) ], etc., y
técnicas de síntesis química tales como el método de fosfotriéster y
el método de fosfoamidato [J. Am. Chem. Soc., 89: 4801 (1967); ditto
91: 3350 (1968); Science, 150: 178 (1968); Tetrahedron Lett., 22:
1859 (1981); ditto 24: 245 (1983)], así como una combinación
adecuada de tales técnicas.
Como ejemplo del gen según la invención, se
puede mencionar el gen que comprende un polinucleótido que tiene la
secuencia nucleotídica de SEC ID nº: 2 o una secuencia
complementaria a aquella. Esta secuencia nucleotídica representa un
ejemplo de combinación de codones para cada resto de aminoácidos de
la secuencia de aminoácidos anterior (SEC ID nº: 1). Por supuesto,
el gen de la invención no está limitado a la combinación anterior,
sino que se puede emplear el gen que tiene una secuencia
nucleotídica diseñada para seleccionar una combinación arbitraria de
codones para cada uno de dichos restos de aminoácidos. La selección
de dichos codones se puede hacer de manera habitual. En esta
selección, se puede tener en cuenta la frecuencia de codones del
hospedante a usar [Nucleic Acids Res., 9: 43 (1981)].
Además, aunque el gen de la invención se muestra
como la secuencia nucleotídica de un ADN monocatenario como, por
ejemplo, se muestra en SEC ID nº: 3, la invención engloba por
supuesto un polinucleótido que comprende una secuencia nucleotídica
complementaria a tal secuencia nucleotídica y un componente que
asimismo las contiene a ambas, y, además, no está limitada a ADN tal
como ADNc.
Adicionalmente, como se menciona anteriormente,
el gen de la invención no está limitado a aquel que comprende un
polinucleótido que tiene la secuencia nucleotídica de SEC ID nº: 2 o
una secuencia complementaria a ella, sino que incluye aquel que
comprende una secuencia nucleotídica que tiene un grado dado de
homología con tal secuencia nucleotídica. Más particularmente, se
incluye el gen que comprende un polinucleótido que tiene por lo
menos 95% de homología con un polinucleótido que codifica un
polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº:
1.
Además, el gen de dicha secuencia nucleotídica
que tiene una homología definida incluye aquel que se hibrida a un
ADN que tiene la secuencia nucleotídica de SEC ID nº: 2 en
condiciones restrictivas tales como las descritas más abajo, y no
pierde el ADN incluso cuando el híbrido se lava en condiciones
dadas.
Como ejemplo, se puede mencionar un gen que
tiene una secuencia nucleotídica que, cuando se hibrida a un ADN que
tiene la secuencia nucleotídica de SEC ID nº: 2 en 6 X SSC a 65ºC
toda la noche o en 4 X SSC suplementado con formaldehído al 50% a
37ºC toda la noche, y lavado después en 2 X SSC a 65ºC durante 30
minutos, no se desenganchará del ADN. Aquí, SSC representa tampón de
citrato sódico salino estándar (citrato salino estándar; 1 X SSC =
0,15 M de NaCl, 0,015 M de citrato de sodio). Un ejemplo preferido
de dicho gen es un gen que tiene una secuencia nucleotídica que,
incluso cuando se hibrida a un ADN que tiene la secuencia
nucleotídica de SEC ID nº: 2 en polietilenglicol al 7%
(PEG)/dodecilsulfato de sodio al 10% (SDS) a 65ºC toda la noche y
lavado en 0,1 X SSC/0,1% de SDS a 65ºC durante 30 minutos, no se
desenganchará del ADN.
El gen de la invención se puede producir
fácilmente y adquirir mediante las técnicas estándar de ingeniería
genética [Molecular Cloning 2ª Ed, Cold Spring Harbor Lab. Press
(1989); Zoku Seikagaku Jikken Koza "Idenshi Kenkyuho I, II,
III" [New Experimental Biochemistry Series "Methods for Gene
Research I, II, III" (editado por la Sociedad Bioquímica
Japanesa), (1986), etc.] basándose en la información de secuencia en
los ejemplos específicos mostrados en SEC ID nº: 3.
Más particularmente, el gen objetivo se puede
adquirir construyendo una librería de ADNc a partir de una fuente
adecuada que contiene el gen de la invención, y seleccionando el
clon deseado a partir de esta librería de ADNc usando una sonda o
anticuerpo adecuado específico para el gen de la invención de una
manera conocida per se [Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 78:
6613 (1981); Science, 222: 778 (1983), etc.].
En el procedimiento anterior, la fuente de ADNc
incluye diversas células o tejidos en los que el gen de la invención
se expresa, y células cultivadas derivadas de ellos. Particularmente
en el caso del gen TSC403 de la invención, a título de ejemplo, se
pueden mencionar tejidos pulmonares. El aislamiento del ARN completo
a partir de tal fuente, el aislamiento y purificación de ARNm, la
síntesis de ADNc, y su clonación, se pueden llevar a cabo todos
ellos de manera habitual. También existen comercialmente librerías
de ADNc. En la práctica de la invención, también se pueden emplear
tales librerías de ADNc comerciales, por ejemplo las disponibles de
Clontech Lab. Inc.
El método de identificación del gen de la
invención a partir de una librería de ADNc no está particularmente
limitado, sino que se puede emplear selectivamente un método
convencional. Para ser específicos, a título de ejemplo, se puede
mencionar la selección de un clon de ADNc mediante una técnica de
inmunoidentificación usando un anticuerpo específico contra la
proteína producida por el ADNc, la técnica hibridación en placa o de
hibridación de colonias usando una sonda que tiene una afinidad de
unión selectiva por la secuencia de ADN objetivo, o una combinación
de las mismas.
En cuanto a la sonda a usar en el procedimiento
anterior, generalmente es útil usar un ADN sintetizado químicamente
según la información de secuencia nucleotídica en el gen de la
invención. Por supuesto, también es posible usar el gen ya obtenido,
o un fragmento del mismo, como dicha sonda.
La secuencia nucleotídica que se puede usar como
dicha sonda incluye una secuencia nucleotídica parcial que
corresponde a SEC ID nº: 2 pero que consiste en por lo menos 15
nucleótidos consecutivos, preferentemente en el intervalo de
20-30 nucleótidos. Además, como dicha sonda, también
se pueden utilizar clones positivos que contienen las secuencias
respectivas anteriores.
Dicha identificación se puede llevar a cabo
mediante el procedimiento que usa, como la sonda de identificación,
un conjunto de cebadores sentido y antisentido basándose en la
información de secuencia de aminoácidos parcial sobre un extracto
natural aislado y purificado a partir de una estirpe celular o
tejido dado.
Además, dicha identificación también se puede
llevar a cabo mediante el procedimiento de clonación de interacción
de proteínas, usando la proteína TSC403 en lugar de dicho anticuerpo
específico.
En la invención, la expresión de ARNm en células
bajo diferentes condiciones o entre una pluralidad de grupos
celulares se puede estudiar mediante comparación directa usando el
método de presentación diferencial [Liang, P., et al.,
Science, 257, 967-971 (1992)].
En la obtención del gen de la invención, también
se puede usar ventajosamente la amplificación de ADN/ARN mediante
PCR [Science, 230, 1350 (1985)]. Particularmente en el caso en el
que apenas se puede obtener un ADNc de longitud completa a partir de
una librería, se puede usar ventajosamente el método de RACE
[amplificación rápida de extremos de ADNc] [Jikken Igaku
(Experimental Medicine), 12(6): 35 (1994)], en particular el
método de 5'-RACE [Frohman, M. A., et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 8: 8998 (1988)]. Los cebadores para
uso en tales métodos de PCR se pueden establecer juiciosamente según
la información de secuencia en el gen de la invención, y se pueden
sintetizar mediante el procedimiento convencional.
El aislamiento y purificación del fragmento de
ADN/ARN amplificado se puede llevar a cabo mediante las técnicas
convencionales como se mencionan aquí anteriormente, por ejemplo
mediante electroforesis en gel.
La secuencia nucleotídica del gen de la
invención, o cualquiera de sus diversos fragmentos de ADN, se puede
determinar de manera habitual, por ejemplo mediante el método de
didesoxi [Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 74: 5463 (1977)], el método
de Maxam-Gilbert [Methods in Enzymology, 65: 499
(1980)], o, más oportunamente, por medio de un kit de secuenciación
comercial.
\newpage
Con el gen de la invención, el producto génico
se puede producir fácilmente, en una escala de producción elevada, y
con buena reproducibilidad mediante tecnología de ingeniería
genética estándar.
La invención proporciona además un vector
(vector de expresión) que contiene dicho gen TSC403, células
hospedantes transformadas mediante el uso de dicho vector, y un
método para producir la proteína TSC403, que comprende hacer crecer
dichas células hospedantes.
La producción de dicha proteína TSC403 se puede
llevar a cabo mediante la tecnología de ADN recombinante estándar
[Science, 224: 1431 (1984): Biochem. Biophys. Res. Comm., 130: 692
(1985): Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 80: 5990 (1983), y la
bibliografía de referencia citada anteriormente].
Como dichas células hospedantes, se pueden
emplear células procariotas y células eucariotas. Como hospedante
procariota, se puede emplear libremente diversos procariotas que se
emplean habitualmente, tales como Escherichia coli y
Bacillus subtilis. Las células hospedantes preferidas son las
derivadas de Escherichia coli, particularmente células de
E. coli K12.
Las células hospedantes eucariotas incluyen
células de vertebrados y levaduras, entre otras. Entre las primeras
células, se pueden mencionar como ejemplos la estirpe celular de
mono COS [Cell, 23: 115 (1981)], células de ovario de hámster chino
y su estirpe defectuosa en dihidrofolato reductasa [Proc. Natl.
Acad. Sci., USA., 11: 4216 (1980)]. En cuanto a las últimas células,
se pueden mencionar como ejemplos células de levaduras que
pertenecen al género Saccharomyces, pero éstas no son
elecciones exclusivas.
Cuando se usan células procariotas como las
células hospedantes, se selecciona un vector que se puede replicar
en la célula hospedante, y, para la expresión del gen, se puede
emplear ventajosamente un plásmido de expresión provisto de un
promotor y la secuencia de SD (Shine-Dalgarno) en
dirección 5' del gen de la invención, así como un codón de
iniciación (por ejemplo ATG) necesario para comenzar la síntesis
proteica. En cuanto al vector mencionado anteriormente,
habitualmente se emplea un plásmido derivado de E. coli, tal
como pBR322, pBR325, pUC12, pUC13, etc., aunque estos no son
elecciones exclusivas y se pueden utilizar otros diversos vectores
conocidos. Como vectores comerciales para los sistemas de expresión
que usan E. coli, se pueden mencionar a título de ejemplo,
entre otros, pGEX-4T (Amersham Pharmacia Biotech),
pMAL-c2, pMAL-p2 (New England
Biolabs), pET21, pET21/lacq (Invitrogen), pBAD/His (Invitrogen).
En cuanto al vector de expresión a usar cuando
se emplean células de un animal vertebrado, se puede mencionar
habitualmente un vector que tiene una región promotora en dirección
5' del gen a expresar, sitios de corte y empalme de ARN, sitio de
poliadenilación, secuencia de terminación de la transcripción, etc.,
y, cuando sea necesario, el vector tiene además un origen de
replicación. Como ejemplo específico del vector anterior, se puede
mencionar, por ejemplo, pSV2dhfr que contiene un promotor temprano
de SV40 [Mol. Cell. Biol., 1: 854 (1981)].
Además de lo expuesto anteriormente, se pueden
usar otros diversos vectores comerciales conocidos. Como vectores
comerciales que se pueden usar en sistemas de expresión que utilizan
células animales, se pueden mencionar diversos vectores disponibles
para uso en células animales, tales como pEGFP-N,
pEGFP-C (Clontech), pIND (Invitrogen), pcDNA3.1/His
(Invitrogen), etc., y vectores disponibles para uso en células de
insectos, tales como pFastBacHT (Gibco BRL), pAcGHLT (PharMingen),
pAc5/V5-His, pMT/V5-His y
pMT/Bip/V5-His (todos de Invitrogen).
Como ejemplo específico del vector de expresión
que se puede usar cuando se usan células de levaduras como las
células hospedantes, se puede mencionar pAM82 que tiene un promotor
para el gen de fosfatasa ácida [Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 80:1
(1983)]. Los vectores de expresión comerciales para uso en células
de levaduras incluyen pPICZ (Invitrogen) y pPICZ (Invitrogen).
El promotor tampoco está particularmente
restringido. Cuando se usa como hospedante una cepa bacteriana del
género Escherichia, se puede usar ventajosamente el promotor
de triptófano (trp), el promotor de lpp, el promotor de lac, el
promotor de recA, el promotor de PL/PR, etc. Cuando el hospedante es
un organismo del género Bacillus, las elecciones preferidas son el
promotor de SP01, el promotor de SP02, el promotor de penP, etc. El
promotor que se puede usar ventajosamente cuando se usa una levadura
como hospedante incluye el promotor de PH05, el promotor de PGK, el
promotor de GAP y el promotor de ADH, entre otros. El promotor
preferido en los casos en los que se usan células de animales como
dichas células hospedantes incluye el promotor derivado de SV40, el
promotor de retrovirus, el promotor de metalotioneína, el promotor
de choque térmico, el promotor de citomegalovirus y el promotor de
SR, entre otros.
Como vectores de expresión para el gen de la
invención, también se puede usar ventajosamente el promotor de
expresión de la proteína de fusión convencional. Como ejemplo del
vector de este tipo, se puede mencionar pGEX (Promega) para la
expresión de una proteína de fusión con
glutationa-S-transferasa (GST).
El método para introducir dicho ADN recombinante
objetivo (vector de expresión) en la célula hospedante (método de
transformación) tampoco está particularmente restringido, sino que
se pueden utilizar diversos métodos estandarizados. El cultivo del
transformante resultante también se puede llevar a cabo de manera
habitual. Mediante tal cultivo, la proteína objetiva codificada por
el gen de la invención es expresada, producida y acumulada en la
célula transformante, o es segregada extracelularmente o en la
membrana celular.
El medio para dicho cultivo se puede seleccionar
juiciosamente entre los medios convencionales según el tipo de
células hospedantes adoptadas, y el cultivo también se puede llevar
a cabo en condiciones adecuadas para la proliferación de las células
hospedantes.
La proteína recombinante así producida se puede
aislar opcionalmente y purificar mediante diversos procedimientos de
aislamiento que utilizan sus propiedades físicas, químicas u otras
propiedades [Seikagaku (Biochemical) Data Book II, p.
1175-1259, 1ª Ed., 1ª Impresión, 23 de junio de
1980, Tokyo Kagaku Dojin; Biochemistry, 25(25): 8274 (1986);
Eur. J. Biochem., 163: 313 (1987); etc.]. Los procedimientos
mencionados anteriormente incluyen específicamente el tratamiento de
reconstitución estándar, el tratamiento con un agente que precipita
la proteína (precipitación de proteínas por sales), centrifugación,
método de choque osmótico, destrucción sónica, ultrafiltración,
diversos tipos de cromatografía, por ejemplo cromatografía mediante
tamices moleculares (filtración en gel), cromatografía de adsorción,
cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad,
cromatografía de líquidos de altas prestaciones (HPLC), etc.,
diálisis, y sus combinaciones. El procedimiento particularmente
preferido es la cromatografía de afinidad que usa una columna
conjugada con un anticuerpo específico contra la proteína TSC403
según la invención.
La invención proporciona además la nueva
proteína TSC403 obtenible como antes, y la tecnología para producir
esta proteína. La proteína según la invención encuentra aplicación
en el campo farmacéutico como se menciona aquí anteriormente.
Además, la proteína de la invención se puede
usar como un inmunógeno para la construcción de un anticuerpo
específico contra dicha proteína. El componente para uso aquí como
antígeno puede ser la proteína producida en gran cantidad mediante
cualquiera de dichas técnicas de ingeniería genética, o un fragmento
de la misma, y, usando tal antígeno, se puede obtener el antisuero
objetivo (anticuerpo policlonal) y el anticuerpo monoclonal.
La tecnología de producción para tales
anticuerpos es bien conocida por los expertos en la materia, y la
producción de anticuerpos pertinentes para la invención también se
puede realizar según tal tecnología consolidada [Zoku Seikagaku Koza
"Meneki Seikagaku Kenkyuho" (New Immunobio chemistry Series,
"Methods in Immuno biochemistry"), editada por Japanese
Biochemical Society (1986), entre otros].
Por ejemplo, el animal inmune para uso en la
producción del antisuero se puede seleccionar libremente entre
animales normales tales como el conejo, cobaya, rata, ratón, pollo,
cabra y oveja, y la inmunización con dicho antígeno y la recogida de
sangre también se pueden llevar a cabo de manera habitual.
La preparación de dicho anticuerpo monoclonal
también se puede llevar a cabo de la manera habitual, es decir,
construyendo una célula de fusión a partir de la célula plasmática
(célula inmune) de un animal inmunizado con dicho inmunógeno y una
célula de plasmocitoma, seleccionando un clon que produce el
anticuerpo objetivo, y haciendo crecer el clon. El animal inmune se
selecciona generalmente teniendo en cuenta su compatibilidad con la
célula de plasmocitoma a usar para la fusión celular, y
habitualmente se usa ventajosamente el ratón o la rata. La
inmunización se puede llevar a cabo de la misma manera que en la
preparación de dicho antisuero, y opcionalmente se puede usar el
adyuvante habitual en combinación con el antígeno.
La célula de plasmocitoma a usar para dicha
fusión no está particularmente restringida, sino que puede ser
cualquiera de diversas células de mielomas, tales como p3
(p3/x63-Ag8) [Nature, 256: 495-497
(1975)], p3-U1 [Current Topics in Microbiology and
Immunology, 81: 1-7 (1978)], NS-1
[Eur. J. Immunol., 6: 511-519 (1976)],
MPC-11 [Cell, 8: 405-415 (1976)],
SP2/0 [Nature, 276: 269-271 (1978)], etc., R210
[Nature, 277: 131-133 (1979)], etc. para ratas y
células derivadas de ellas.
La fusión entre dicha célula inmune y la célula
de plasmocitoma se puede efectuar en presencia de un promotor de
fusión convencional, tal como polietilenglicol (PEG), el virus de
Sendai (HVJ) o similar, según un protocolo conocido. El aislamiento
del hibridoma objetivo también se puede llevar a cabo mediante el
procedimiento conocido [Meth. in Enzymol., 73: 3 (1981); dicha Zoku
Experimental Biochemistry Series; etc.].
La búsqueda de la estirpe celular productora del
anticuerpo objetivo, y la preparación del anticuerpo monoclonal, se
pueden llevar a cabo también de manera convencional. Por ejemplo, la
búsqueda de una estirpe productora del anticuerpo se puede realizar
mediante diversas técnicas que se usan generalmente para la
detección de anticuerpos, tales como ELISA [Meth. in Enzymol., 70:
419-439 (1980)], el método de placa, el método de
mancha, el método de reacción de aglutinamiento, el método de
Ouchterlony, radioinmunoensayo, etc., usando como antígeno la
proteína de la invención.
El aislamiento del anticuerpo de la invención a
partir del hibridoma obtenido según lo anterior se puede llevar a
cabo mediante el método que comprende hacer crecer el hibridoma de
manera habitual y recuperar el anticuerpo como un sobrenadante de
cultivo, o mediante el método que comprende administrar el hibridoma
a un mamífero compatible para dejar que se multiplique in
vivo y recuperar el anticuerpo en forma de un fluido ascítico.
El primer método es adecuado para la preparación de un anticuerpo de
pureza elevada, mientras que el último método es adecuado para la
producción elevada. El anticuerpo producido de esta manera se puede
purificar mediante el procedimiento habitual tal como precipitación
de proteínas por sales, filtración en gel, cromatografía de
afinidad, o similar.
\newpage
El anticuerpo así obtenido se caracteriza porque
es capaz de unirse a la proteína de la invención. Esta
característica se puede explotar para la purificación de la proteína
de la invención y el ensayo e identificación de la proteína mediante
una técnica inmunológica. La invención proporciona además tal nuevo
anticuerpo.
Basándose en la información de secuencia del gen
de la invención, que se ha generado mediante la invención, se puede
detectar la expresión del gen de la invención en el individuo o en
diversos tejidos utilizando una parte o toda la secuencia
nucleotídica de dicho gen.
En la invención, con el fin de detectar la
presencia de un gen TSC403 cuyo nivel de expresión es elevado en un
tejido canceroso, se puede preparar una muestra biológica, tal como
una muestra de sangre o de suero, opcionalmente se puede extraer el
ADN, y se puede llevar a cabo un análisis para ver si la muestra
contiene un gen TSC403 suscep-
tible.
tible.
Según la invención, con el fin de detectar la
presencia de un marcador de neoplasia en células o tejidos, la
progresión de la neoplasia hasta un trastorno prodrómica, o el
pronóstico, una muestra biológica de cáncer se prepara y analiza
para determinar la presencia de un oncogén TSC403. Utilizando esta
técnica, se puede detectar la presencia de tal marcador de neoplasia
en células o un tejido, la progresión de la neoplasia hasta un
trastorno prodrómica, o el pronóstico. Por lo tanto, la invención
permite el diagnóstico de un cáncer, la evaluación del efecto de una
terapia contra el cáncer, o la predicción del pronóstico de un
cáncer.
La detección anterior se puede llevar a cabo
según lo siguiente. Por ejemplo, basándose en la información sobre
el gen TSC403 según se obtiene usando una muestra procedente de un
paciente que tiene un tumor, en primer lugar se prepara un fragmento
de ADN diseñado para uso en la identificación del gen TSC403 y/o la
amplificación del gen. El fragmento de ADN mencionado anteriormente
incluye lo siguiente.
- (1)
- El fragmento que tiene la naturaleza de una sonda para la hibridación en placa, hibridación en colonia, transferencia Southern, transferencia Northern, etc.
- (2)
- El fragmento que tiene la naturaleza de una sonda para la preparación del fragmento de ADN completo o parcial del gen TSC403 según se amplifica mediante PCR, esto es, una reacción en cadena de la polimerasa para amplificar una secuencia nucleotídica con una polimerasa.
Para la construcción de tales fragmentos de ADN,
en primer lugar se prepara un cebador que tiene la misma secuencia
que el gen TSC403. Usando este cebador como sonda de identificación,
se hace reaccionar con una muestra biológica (muestra de ácido
nucleico) para confirmar la presencia de un gen que tiene la
secuencia del gen TSC403.
La muestra de ácido nucleico anterior se puede
preparar mediante diversos métodos que proporcionan una detección
fácil de la secuencia diana, tal como desnaturalización, digestión
restringida, electroforesis o transferencia de punto.
El método de dicha identificación es
preferentemente PCR, desde el punto de vista de la sensibilidad.
Este método no está particularmente restringido puesto que emplea un
fragmento del gen TSC403 como el cebador, y puede ser cualquiera de
los protocolos conocidos [Science, 230: 1350-1354
(1985)] y todas las versiones de PCR que se desarrollan
recientemente o que se espera que se usen en el futuro [Sakaki, Y.
et al. (ed.), Jikken Egaku (Experimental Medicine),
Suplemento 8(9) (1990), Yodosha; Protein \cdot Nucleic Acid
\cdot Enzyme; Suplemento Especial, Kyoritsu Publishing Co.,
35(11) (1990)].
Los fragmentos de ADN para uso como cebadores
son oligo-ADN químicamente sintetizados. Esos
oligo-ADN se pueden sintetizar usando un
sintetizador automático de ADN, por ejemplo Pharmacia LKB Gene
Assembler Plus (Pharmacia). La longitud del cebador (cebador sentido
o cebador antisentido) puede ser por ejemplo el equivalente a
alrededor de 10-50 nucleótidos, más preferentemente
alrededor de 15-30 nucleótidos.
La sonda para uso en la identificación anterior
es habitualmente una sonda marcada, pero puede ser una sonda no
marcada. La identificación puede depender de la unión específica con
un ligando marcado directa o indirectamente. El método para marcar
una sonda o un ligando es conocido en la técnica, y la técnica
anterior pertinente incluye la traducción por muescas, el cebado al
azar, y el tratamiento con cinasas, entre otros. La sustancia que se
puede usar como el marcador incluye radioisótopos, biotina, grupos
fluorescentes, grupos quimioluminiscentes, enzimas y anticuerpos que
pueden ser recibidos por medio de tales métodos conocidos.
La detección mencionada anteriormente se puede
realizar de la manera habitual. Por ejemplo, se pueden usar
invariablemente con éxito la amplificación de ARN mediante
RT-PCR [reacción en cadena de la polimerasa
transcrita de forma inversa; E. S. Kawasaki, et al.,
Amplification of RNA. En PCR Protocol, A Guide to Methods and
Applications, Academic Press, Inc., San Diego, 21-21
(1991)], análisis de transferencia Northern [Molecular Cloning, Cold
Spring Harbor Lab. (1989)], determinación del nivel celular, por
ejemplo RT-PCR in situ [Nucl. Acids Res., 21:
3159-3166 (1993)] e hibridación in situ,
método de NASBA [amplificación a base de secuencias de ácidos
nucleicos, Nature, 350: 91-92 (1991)], cuyas
modificaciones de estas técnicas son conocidas en la técnica, y
otros diversos métodos.
\newpage
\global\parskip0.900000\baselineskip
El método para el ensayo según la invención se
puede llevar a cabo convenientemente utilizando un kit de reactivo
de ensayo para la detección del gen TSC403 en muestras. La invención
proporciona además un kit de ensayo para la detección del gen
TSC403, que contiene dicho fragmento del gen TSC403.
Es importante que este kit de ensayo contenga
por lo menos un fragmento de ADN que se hibrida a una parte o a toda
la secuencia nucleotídica de SEC ID nº: 2 o una secuencia
nucleotídica complementaria a ella como componente esencial. Como
los otros componentes, el kit puede contener un agente marcador y
reactivos necesarios para la PCR, tal como Taq ADN polimerasa,
trifosfato de desoxinucleótido, y cebadores, entre otros.
El agente marcador incluye radioisótopos y
modificadores químicos tales como sustancias fluorescentes. Estos se
pueden usar como preconjugados al fragmento de ADN.
Por conveniencia en la práctica del ensayo, el
kit de ensayo de la invención puede contener un diluyente de la
reacción adecuado, un anticuerpo estándar, un tampón, un tampón de
lavado, una disolución de detención de la reacción, etc.
La invención proporciona además un método para
el diagnóstico del cáncer utilizando el método de ensayo anterior,
un reactivo de diagnóstico para uso en dicho diagnóstico, y un kit
de diagnóstico.
Secuenciando el gen TSC403 en una muestra de
ensayo según se obtiene usando el método de ensayo anterior de la
invención, ya sea directa o indirectamente mediante el procedimiento
convencional, es posible descubrir un nuevo gen relacionado con
TSC403 (gen mutante) que es muy homólogo al gen TSC403 de tipo
salvaje. Por lo tanto, la invención proporciona además un método de
identificación de un gen relacionado con TSC403 en una muestra de
ensayo, que comprende llevar a cabo dicho ensayo y secuenciar el gen
TSC403 en la muestra.
Además, utilizando la proteína codificada por el
gen TSC403 de SEC ID nº: 1, una proteína que tiene una secuencia de
aminoácidos que resulta de la supresión, sustitución, o adición de
uno o una pluralidad de aminoácidos de, en o a dicha secuencia de
SEC ID nº: 1, o un anticuerpo frente a tal fragmento (anticuerpo
policlonal o anticuerpo monoclonal; en lo sucesivo denominado como
"anticuerpo anti-TSC403"), se puede evaluar con
éxito dicho gen TSC403 de tipo salvaje y un gen TSC403 mutante.
La invención proporciona además un método para
evaluar tal gen TSC403 de tipo salvaje o un gen TSC403 mutante.
Según la metodología de ensayo, la gravedad del
trastorno en un estado neoplásico o el tumor de un neoplasma se
puede detectar a partir de un cambio en el gen TSC403 de tipo
salvaje. El cambio mencionado anteriormente se puede determinar o
detectar secuenciando el gen TSC403 mediante cualquiera de las
técnicas de secuenciación convencionales mencionadas anteriormente,
y más preferentemente mediante el método de ensayo que usa dicho
anticuerpo anti-TSC403. De esta manera, se puede
detectar la presencia de una anomalía (mutación) en la proteína
TSC403 en una muestra de ensayo, o la presencia o ausencia de la
proteína TSC403.
En el procedimiento de ensayo que utiliza un
anticuerpo anti-TSC403 de la invención, el
anticuerpo se puede usar para inmunoprecipitar la proteína TSC403 de
una disolución que contiene un material biológico obtenido de un
sujeto humano, tal como sangre o suero, o se puede hacer que
reaccione con la proteína TSC403 en la transferencia Western en gel
de poliacrilamida o en la inmunotransferencia.
Adicionalmente, utilizando el anticuerpo
anti-TSC403 en un procedimiento de ensayo
inmunohistoquímico, se puede detectar la proteína TSC403 en una
sección de parafina o en una muestra de tejido congelada. La
tecnología de producción y el procedimiento de purificación que se
pueden usar para dicho anticuerpo anti-TSC403 son
bien conocidos en la técnica. Tales técnicas conocidas se pueden
utilizar para la producción y purificación de dicho anticuerpo.
El protocolo más preferido pertinente para la
detección de un TSC403 de tipo salvaje, o un mutante del mismo,
incluye un ensayo de sándwich que usa un anticuerpo monoclonal y/o
un anticuerpo policlonal. Entre otras técnicas de detección
preferidas están el ensayo inmunoabsorbente enlazado a enzimas
(ELISA), el radioinmunoensayo (RIA), el ensayo inmunorradiométrico
(IRMA) y el ensayo inmunoenzimométrico (IEMA).
Se proporciona además un receptor de la proteína
TSC403 que existe en una fracción de membrana celular o una
superficie celular, y que tiene actividad de unión para la proteína
TSC403. Este receptor de la proteína TSC403 se puede producir y
obtener, por ejemplo añadiendo una proteína TSC403 marcada a una
fracción de membrana celular que contiene el receptor, o una muestra
biológica que contiene la muestra, extrayendo, aislando y
purificando el conjugado resultante de
receptor-proteína (producto de la reacción de unión
a la proteína TSC403), e identificando la secuencia de aminoácidos
del producto aislado. La preparación y secuenciación de la proteína
TSC403 se puede llevar a cabo fácilmente por los expertos en la
materia según los procedimientos establecidos.
El receptor de la proteína TSC403, o sus
fragmentos, se puede aplicar a la identificación de diversos
fármacos. Mediante tal tecnología, se pueden identificar compuestos
capaces de reaccionar con dicho receptor (compuestos moleculares
pequeños, compuestos moleculares grandes, proteínas, fragmentos
proteicos, antígenos, anticuerpos, etc.). El receptor, o un
fragmento del mismo, que se va a usar en tal identificación se puede
poner en uso como inmovilizado en una matriz sólida adecuada o en
forma de una sustancia libre en una disolución transportada a la
superficie celular.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Un ejemplo de la farmacoidentificación anterior
es la identificación en la que células hospedantes procariotas o
eucariotas transformadas de forma estable con una proteína
recombinante que expresa la proteína TSC403, o un fragmento de la
misma, se usan en, preferentemente, un ensayo de unión competitiva.
Como alternativa, dichas células hospedantes, ya sea en forma libre
o inmovilizadas, se usan en el ensayo de unión estándar. Más
particularmente, la farmacoidentificación anterior puede comprender
hacer reaccionar el receptor de la proteína TSC403, o un fragmento
del mismo, con la proteína TSC403, o un fragmento de la misma, en
presencia de un fármaco candidato, para provocar la formación de un
complejo y detectar el grado de inhibición de la formación del
complejo por el fármaco candidato anterior.
De este modo, se puede proporcionar un método
para la farmacoidentificación, que comprende poner en contacto un
fármaco candidato con el receptor de la proteína TSC403, o un
fragmento del mismo, y, después, detectar la presencia del complejo
resultante o la presencia de un complejo del receptor de la proteína
TSC403, o un fragmento del mismo, y el ligando mediante una técnica
conocida per se.
Adicionalmente, evaluando la actividad del
receptor de la proteína TSC403, es posible evaluar si un fármaco
candidato es capaz de antagonizar el receptor de la proteína TSC403
y en consecuencia inhibir la actividad de la proteína TSC403, por
ejemplo la actividad que promueve la mitosis.
En tal ensayo de unión competitiva, el receptor
de la proteína TSC403, o un fragmento del mismo, se marca. Cuando el
receptor de la proteína TSC403 libre, o un fragmento del mismo, se
separa del complejo correspondiente y se mide la cantidad marcadora
de la sustancia libre (que no forma complejo), el valor medido sirve
como una vara de medir de la unión del fármaco candidato al receptor
de la proteína TSC403. Además, dicho valor medido sirve también como
una medida de la inhibición de la unión del receptor de la proteína
TSC403 a la proteína TSC403. Analizando de esta manera un pequeño
péptido (pseudopéptido) de la proteína TSC403, se puede evaluar el
fármaco candidato como una sustancia que tiene una actividad
antagonizante del receptor de la proteína TSC403.
Otro protocolo para la farmacoidentificación es
aquel de la identificación de un compuesto que tiene una afinidad de
unión adecuada por el receptor de la proteína TSC403. De forma
breve, este procedimiento comprende sintetizar un gran número de
compuestos peptídicos de ensayo diferentes sobre un soporte sólido,
tal como la superficie de un alfiler de plástico u otro material,
hacer reaccionar los compuestos de ensayo con el receptor de la
proteína TSC403, y, tras lavar, detectar los productos de la
reacción de unión mediante un método conocido (por ejemplo,
publicación de patente PCT nº WO 84-03564].
El receptor de la proteína TSC403 purificado se
puede revestir directamente sobre la placa a usar en dicho
procedimiento de farmacoidentificación. Además, el anticuerpo se
puede capturar con un anticuerpo no neutralizante frente al
polipéptido, y el receptor de la proteína TSC403 se puede
inmovilizar en una fase sólida.
La memoria descriptiva se refiere además al uso
de un ensayo de farmacoidentificación competitivo. Para la unión al
receptor de la proteína TSC403, o un fragmento del mismo, se provoca
que un anticuerpo neutralizante capaz de unirse específicamente al
receptor de la proteína TSC403 compita con el compuesto candidato.
Mediante tal reacción competitiva con el anticuerpo neutralizante,
se puede detectar la presencia de cualquier péptido que tenga uno o
más determinantes antigénicos del receptor de la proteína
TSC403.
Además, en relación con la
farmacoidentificación, todavía otro método comprende el uso de una
estirpe celular eucariota hospedante o células que contienen un gen
TSC403 no funcional. Se provoca que la estirpe celular hospedante o
las células se multipliquen en presencia de un fármaco candidato
durante un tiempo predeterminado, y se determina la velocidad de
crecimiento de las células hospedantes para ver si, por ejemplo, el
fármaco candidato es capaz de inhibir el crecimiento de las células.
El método para medir dicha velocidad de crecimiento incluye un
método para determinar la actividad biológica del receptor de la
proteína TSC403.
Además, según la invención, para el desarrollo
de un derivado más activo o estable de la proteína TSC403 o de un
fármaco que potenciará o interferirá con la función de la proteína
TSC403 in vivo, es posible construir proteínas bioactivas, o
sus análogos estructurales, con las cuales interaccionará dicha
proteína, tal como un agonista del receptor de la proteína TSC403,
un antagonista del receptor de la proteína TSC403, o un inhibidor de
la proteína TSC403, por ejemplo. Los análogos estructurales
mencionados anteriormente se pueden caracterizar mediante análisis
de la estructura tridimensional de un complejo entre la proteína
TSC403 y una proteína ajena mediante cristalografía de rayos X o
modelado por ordenador, o una combinación de tales técnicas. La
información estructural de tales análogos estructurales también se
puede obtener mediante formación de modelos proteicos basados en las
estructuras de proteínas homólogas.
Como método para proporcionar dicho derivado más
activo o estable de la proteína TSC403, se puede mencionar una
técnica de barrido de alanina. Esta técnica comprende sustituir un
resto de alanina por cada uno de ciertos restos de aminoácidos de
dicha proteína, y determinar el efecto de la sustitución sobre la
actividad de la proteína resultante. En otras palabras, esta técnica
es tal que, mediante sustitución de restos de aminoácidos de la
proteína y análisis, se determina el dominio de significancia de la
actividad o estabilidad de la proteína. Esta técnica permite el
diseño de un derivado más activo o estable de la proteína
TSC403.
\newpage
Además, ahora es posible aislar un anticuerpo
específico de la diana seleccionado mediante un ensayo funcional, y
analizar su estructura cristalina. Como regla, mediante este enfoque
se puede obtener el farmacóforo que proporciona una base para el
diseño subsiguiente del fármaco. A través de la generación de un
anticuerpo anti-idiotípico para un anticuerpo
farmacoactivo funcional, se puede identificar o aislar un péptido a
partir de un banco peptídico química o biológicamente construido.
Por tanto, se espera que también el péptido seleccionado sirva como
farmacó-
foro.
foro.
De este modo, ahora es posible diseñar y
desarrollar fármacos que tienen actividad inhibidora, agonista o
antagonista de la proteína TSC403 para la proteína TSC403, que
tienen actividad, estabilidad y otras características mejoradas.
También es posible preparar una cantidad
suficiente de proteína TSC403 usando un gen TSC403 clonado y llevar
a cabo investigaciones cristalográficas mediante rayos X y otras
investigaciones analíticas. Además, como resultado de la provisión
de la proteína TSC403 de SEQ ID NO:1 según la invención, ahora es
posible proporcionar un programa o técnica de modelado por ordenador
como sustituto de la cristalografía de rayos X, o como un adjunto a
ella.
La invención permite la construcción de un ratón
atímico que posee el gen TSC403 (ratón mutante). Mediante este
enfoque, se puede averiguar qué región de la secuencia nucleotídica
del gen TSC403 influye sobre dichas actividades divergentes de la
proteína TSC403 in vivo, es decir, qué funciones tendrían
in vivo los productos del gen TSC403 o los productos del gen
TSC403 modificado.
Esta es una técnica para modificar
intencionadamente la información genética de un organismo utilizando
una recombinación homóloga de genes, y se conoce un protocolo que
usa células madre embriónicas de ratón (células ES) [Capeccchi. M.
R., Science, 244, 1288-1292 (1989)].
La construcción anterior de ratones mutantes
pertenece a la pericia de los expertos en la materia, y el gen
TSC403 de tipo salvaje o el gen TSC403 mutante según la invención se
puede someter a esta modificación [Tetsuo Noda (ed.): Jikken Igaku
(Experimental Medicine), Suplemento, 14(20) (1996), Yodosha]
para construir de ese modo dichos ratones mutantes respectivos de
manera conveniente. Utilizando esta técnica, es posible diseñar y
desarrollar fármacos que tienen actividad inhibidora, agonista o
antagonista de la proteína TSC403 para la proteína que tiene
actividad o estabilidad mejorada de la proteína TSC403.
De este modo, la invención proporciona además un
cebador específico para la detección del gen TSC403 de la invención
y/o un fragmento de ADN para uso como cebador específico, un método
para el diagnóstico del cáncer que los utiliza, y un kit de
diagnóstico para el mismo.
Por ejemplo, la sonda del gen TSC403 según la
invención se puede producir y adquirir mediante la técnica de PCR
estándar usando dos tipos de cebadores (cebador sentido y cebador
antisentido) que son específicos para el gen TSC403 de la invención.
Con la sonda así construida, se puede detectar la expresión de los
genes de la invención en diversos tejidos neoplásicos y otros
tejidos.
La Fig. 1 es una fotografía que sustituye un
dibujo que muestra una distribución del gen TSC403 de la invención
en tejidos humanos según se encuentra mediante el análisis de
transferencia Northern de acuerdo con el Ejemplo 1-(2).
La Fig. 2 es una fotografía que sustituye un
dibujo que muestra los resultados del análisis de
RT-PCR de diversos tejidos normales y tejidos de
cáncer según el Ejemplo 1-(4).
La Fig. 3 es una fotografía que sustituye un
dibujo que muestra la expresión del gen TSC403 en tejidos humanos
según se encuentra mediante el análisis Northern de acuerdo con el
Ejemplo 1-(5).
La Fig. 4 es una fotografía que sustituye un
dibujo que muestra la expresión del gen TSC403 en tejidos humanos
según se encuentra mediante el análisis Northern de acuerdo con el
Ejemplo 1-(5).
La Fig. 5 es una fotografía que sustituye un
dibujo que muestra la expresión del gen TSC403 en tejidos humanos
según se encuentra mediante el análisis Northern de acuerdo con el
Ejemplo 1-(5).
La Fig. 6 es una fotografía que sustituye a un
dibujo que muestra células del control en el ensayo formador de foco
según el Ejemplo 1-(6).
La Fig. 7 es una fotografía que sustituye a un
dibujo que muestra células transformantes según se transforman con
el gen TSC403 de la invención en el ensayo formador del foco de
acuerdo con el Ejemplo 1-(6).
La Fig. 8 muestra el resultado de un estudio de
homología entre la secuencia de aminoácidos predicha de la proteína
codificada por el gen ING1L humano descrito aquí y la de
p33^{ING1} [GenBank A. C. No. AF044076].
\newpage
La Fig. 9 es una fotografía que sustituye a un
dibujo que muestra los resultados de un análisis de transferencia
Northern de 16 células derivadas de órganos de adultos humanos de
acuerdo con el Ejemplo 2-(2).
La Fig. 10 es una fotografía que sustituye a un
dibujo que muestra los resultados de un análisis de transferencia
Northern del tejido de paciente con cáncer colorrectal de acuerdo
con el Ejemplo 2-(2).
\vskip1.000000\baselineskip
Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar la
invención con más detalle.
\vskip1.000000\baselineskip
Para la confirmación del gen humano expresado
mediante una técnica específica de tejidos, se usó el método de
formación de imágenes marcadas con
[\gamma-^{33}P]ATP. Este método se llevó
a cabo esencialmente según el protocolo de Liang [Liang P., et
al., Science, 257, 967-971 (1992)].
De este modo, el ARN poly A (0,2 \mug) aislado
de cada uno de 13 tejidos humanos (cerebro adulto, cerebro fetal,
pulmón, hígado, estómago, páncreas, bazo, glándula mamaria,
próstata, placenta, testículo, riñón y corazón; Clontech) se mezcló
con 25 pmoles de cebador oligo-dT anclado a 3'
G(T) 15 MA (M representa una mezcla de G, A y C) en 8 \mul
de agua tratada con pirocarbonato de dietilo, y la mezcla se calentó
a 65ºC durante 5 minutos. A esta disolución, se añadieron 4 \mul
de tampón de primera hebra 5 x (BRL), 2 \mul de 0,1 M de DTT
(BRL), 1 \mul de 250 mM de dNTP (BRL), 1 \mul de inhibidor de
ribonucleasa (40 unidades; Toyobo) y 1 \mul de transcriptasa
inversa Superscript II (200 unidades; BRL). El volumen final de cada
mezcla de reacción fue 20 \mul. Cada disolución se incubó a 37ºC
durante 1 hora y se diluyó 2,5 veces añadiendo 30 \mul de agua
destilada, y la disolución se almacenó a -20ºC hasta que se usó.
El ADNc se amplificó mediante PCR en presencia
de cebador anclado en 3' marcado con
[\gamma-^{33}P]ATP (Pharmacia). Esta
amplificación del ADNc mediante PCR se llevó a cabo según lo
siguiente.
De este modo, 20 \mul de cada mezcla de PCR
contenían 2 \mul de mezcla de reacción RT, 2 \mul de tampón de
PCR 10 X (Takara), 4 \mul de 2,5 mM de dNTP, 0,25 \mul de ADN
polimerasa de ExTaq (5 U/ml; Takara), 25 pmoles de cebador
oligo-dT anclado a 3' marcado con
[\alpha-^{33}P]ATP, y 25 pmoles de
cebador de 5' (nº 20, un cebador desoxioligonucleotídico 10 mérico
que tiene una secuencia aleatorizada de la secuencia SEC ID nº: 7).
La PCR se llevó a cabo en las siguientes condiciones: un ciclo de
95ºC durante 3 min., 40ºC durante 5 min., y 72ºC durante 5 min.; 40
ciclos de 95ºC durante 0,5 min., 40ºC durante 2 min., y 72ºC durante
1 min.; e hibridación a 72ºC durante 5 min.
La muestra de PCR se extrajo con etanol, se
resuspendió en colorante secuenciador de formamida, y se hizo
reaccionar en el gel de secuenciación de 6% de
acrilamida-7,5 M de urea. El gel se secó sin
fijarlo, y la autorradiografía se llevó a cabo toda la noche.
\vskip1.000000\baselineskip
Un papel de filtro 3 MM, sobre el que se colocó
previamente el gel seco, se marcó en una tinta radioactiva, y el
autorradiograma se ajustó en registro con el marcador. El gel que
contiene la banda de ADNc objetivo se cortó junto con el papel de
filtro 3 MM y se agitó en 300 \mul de dH_{2}O durante 1 hora.
Tras la eliminación del gel de poliacrilamida y del papel de filtro,
el ADNc se recuperó mediante precipitación en etanol en presencia de
1 \mul de 10 mg/ml de glucógeno y 0,3 M de NaOAc como portador, y
se redisolvió en 10 \mul de dH_{2}O. Para la reamplificación, se
usaron 5 \mul de esta disolución. Las condiciones de PCR y los
cebadores usados fueron los mismos que los usados para la primera
PCR. El producto de la reamplificación de un tamaño adecuado se
recuperó como el primer producto de PCR, y este producto de PCR se
clonó en el sitio HincII del vector pUC118 (Takara). La
secuencia de ácido nucleico se determinó usando un secuenciador
automático ABI377 (Applied BioSystems).
Comparando los diversos patrones de imágenes
obtenidos con los ARNm aislados de 13 tipos de tejidos humanos, se
pudo identificar un producto de PCR expresado específicamente en el
pulmón. Este producto se denominó TSC403DD.
Este producto consiste en 252 nucleótidos. La
comparación de estos datos nucleotídicos con las secuencias de ADN
en la base de datos de GenBank/EMBL usando el Programa FASTA
[Person, W. R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85,
2444-2448 (1988)] reveló que este producto de PCR no
tiene homología con ninguna secuencia de ADN conocida.
\vskip1.000000\baselineskip
Se construyó una librería de ADNc de pulmón
normal humano usando oligo(dT) + ADNc de pulmón normal humano
cebado con hexámero al azar y Uni-ZAP^{TM} XR
(Stratagene). Los 1 x 10^{6} clones se aislaron mediante el
procedimiento descrito anteriormente, y la identificación se llevó a
cabo usando el fragmento de ADNc marcado con
[\alpha-^{32}P]dCTP. Los clones positivos
se seleccionaron, y los sitios clonados de ADNc se cortaron in
vivo en pBluescript II SK(-).
Como resultado, se identificaron alrededor de
100 placas para dicho TSC403DD. Basándose en este resultado, se
calculó que la cantidad de transcripción en la población de ARN
total era alrededor de 0,01%.
La secuencia de ADNc ensamblada (TSC403)
homóloga a TSC403DD comprendía 3198 nucleótidos que incluye un marco
de lectura abierta de 1248 nucleótidos que codifica una proteína con
416 restos de aminoácidos que tiene una masa molecular calculada de
44316 Da.
A partir de la secuencia principal, se encontró
que este producto génico (proteína TSC403) era una proteína que
contiene un dominio transmembranal.
Se encontró que su locus cromosómico era 3q27,
en el que se observaron aberraciones cromosómicas en diversos tipos
de cánceres.
Además, el gen TSC403 de la invención tiene una
homología de alrededor de 30% con lamp-1 y
lamp-2 humanos.
\vskip1.000000\baselineskip
Para delinear el perfil de expresión de TSC403
en tejidos, se llevó a cabo una transferencia Northern usando
diversos tejidos humanos.
En el análisis de la transferencia Northern, se
usaron la transferencia I y II de MTN (Northern de múltiples
tejidos) humanos (Clontech). El fragmento de ADNc se preparó usando
un conjunto de cebadores de secuencias de los promotores T3 y T1, y
se marcó con
[\alpha-^{32}P]-dCTP mediante
PCR. La membrana que contiene el producto de amplificación se
sometió a la prehibridación (en las condiciones del protocolo del
producto) y después a hibridación según el protocolo del
producto.
Tras la hibridación, la membrana se lavó y se
expuso para autorradiografía a -80ºC durante 24 horas. Los
resultados se muestran en la Fig. 1.
Los tejidos humanos usados y representados en el
dibujo son corazón, cerebro, placenta, pulmón, hígado, músculo
esquelético, riñón, páncreas, bazo, timo, próstata, testículo,
ovario, intestino delgado, colon y leucocito de sangre periférica
(P.B.L.).
Como se puede observar a partir del dibujo, se
detectó específicamente en el pulmón un transcrito homólogo a
TSC403.
\vskip1.000000\baselineskip
La FISH para el cartografiado cromosómico se
llevó a cabo mediante el método conocido [Takahashi E., et
al., Hum. Genet., 86, 14-16 (1990)] usando como
sonda 0,5 \mug de cada ADN cosmídico. La FISH se captó mediante
una película Provia 100 (Fuji; iSo 100) o con un sistema de cámara
CCD (Applied Imaging, Cyto Vision).
Como resultado, las 100 señales obtenidas con
las células en la (pro)metafase de banda R típica se
localizaron en la banda 3q27. Por lo tanto, se pudo identificar que
el locus cromosómico de TSC403 es 3q27.
\vskip1.000000\baselineskip
Para investigar si la expresión del gen TSC403
estaría mutado en estirpes celulares de cáncer humano y tejidos de
cáncer, se sometieron a análisis mediante RT-PCR
cuatro estirpes celulares [Aspc1 (adenocarcinoma metastásico, J.
Natl. Cancer Inst., 67, 563-569 (1981)), Bxpc3
(adenocarcinoma, no diferenciado; Cancer Invest., 4,
15-23 (1986)), MiaPaca2 (adenocarcinoma, Int. J.
Cancer, 19, 128-135 (1977)) y PANC1 (epiteloide,
carcinoma de tubo pancreático, Int. J. Cancer, 15,
741-747 (1975)) y 9 tejidos cancerosos (donados por
Dr. Nakamura, The Institute of Medical Science, the University of
Tokyo)].
De este modo, se trataron 10 \mul del ARN
completo aislado de cada estirpe celular o tejido canceroso usando
ISOGEN (Wako Chemical Ind.) con 10 unidades de ADNasa I libre de
ARNasa (Boehringer Mannheim) durante 15 minutos, se extrajeron dos
veces con fenol-cloroformo, y se precipitaron en
etanol. El ADNc monocatenario se sintetizó por medio de
transcriptasa inversa-Superscript I^{TM} ARNasa H
(Life Technology) usando oligo-(dT) y cebadores al azar. Una
porción de 2 \mul de cada producto se usó para la amplificación
mediante PCR.
Los cebadores P1 y P2 que tienen las secuencias
nucleotídicas representadas en SEC ID nº: 8 y SEC ID nº: 9 se usaron
para la amplificación mediante PCR de 25 ciclos.
La PCR se llevó a cabo en 20 \mul de una
disolución de ADN 25 ng, cebadores 10 \muM cada uno, dNTP 2,5 mM y
ADN polimerasa de ExTaq (Takara) 0,25 U. El producto de PCR se
disolvió en gel de agarosa al 1,5% teñido con bromuro de etidio.
Los resultados del análisis de
RT-PCR de 4 estirpes celulares (línea 1 =
AsPc-1, línea 2 = BxPc-3, línea 3 =
MIApaca, línea 4 = PANC-1), tejido pancreático
normal (páncreas normal, líneas 1 y 2), tejido de cáncer pancreático
(cáncer pancreático, líneas 1-11) y tejido pulmonar
normal (pulmón normal) mediante el procedimiento anterior se
muestran en la Fig. 2.
Está claro de la Fig. 2 que la expresión de
TSC403 no se encontró en el tejido pancreático normal (páncreas
normal, líneas 1 y 2), sino que se encontró exclusivamente en el
tejido de cáncer pancreático (cáncer pancreático, líneas
1-11 y estirpes celulares, líneas
1-4).
A propósito, las 4 estirpes celulares usadas
anteriormente se han depositado en la ATCC, y sus números de acceso
son los siguientes.
Aspc-1;
CRL-1682
BxPc-3;
CRL-1687
MIApaca; CRL-1420
PANC-1;
CRL-1469
\vskip1.000000\baselineskip
La expresión del gen TSC403 se estudió
hibridando el gen TSC403 a la transferencia (Invitrogen) que posee
las siguientes diversas muestras de ARNm de tejido canceroso y
tejido normal (análisis de transferencia Northern del tumor). Todos
los tejidos cancerosos y tejidos normales usados se adquirieron de
Invitrogen.
Los resultados se muestran en las Fig. 3, Fig. 4
y Fig. 5. Los tejidos cancerosos y tejidos normales representados en
cada dibujo son los siguientes:
Fig. 3:
- tumor de cerebro, cerebro normal, tumor renal, riñón normal, tumor hepático, hígado normal, tumor pulmonar, pulmón normal, tumor de mama, mama normal, tumor uterino, útero normal, tumor de la trompa de Falopio, trompa de Falopio normal, tumor ovárico, ovario normal.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig. 4:
- tumor esofágico, esófago normal, tumor estomacal, estómago normal, tumor de colon, colon normal, tumor de recto, recto normal, tumor de tiroides, tiroides normal, tumor suprarrenal, glándula suprarrenal normal, tumor de la parótida, parótida normal, linfoma, nódulo linfático normal.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig. 5:
- tumor renal, riñón normal, tumor de uréter, uréter normal, tumor de vejiga, vejiga normal, tumor estomacal, estómago normal, tumor ovárico (4 casos), ovario normal (4 casos).
\vskip1.000000\baselineskip
A partir de los dibujos anteriores, se puede
encontrar una expresión significativa de TSC403 en el pulmón normal.
Además, se observó la expresión del gen TSC403 en tumor de mama
(Fig. 3), tumor de la trompa de Falopio (Fig. 3), tumor esofágico
(Fig. 4), tumor de colon (Fig. 4), tumor de recto (Fig. 4), tumor de
tiroides (Fig. 4), tumor de parótida (Fig. 4), tumor de uréter (Fig.
5), tumor ovárico (Fig. 5, 2 de 4 casos).
\vskip1.000000\baselineskip
El marco de lectura abierta de longitud completa
del gen TSC403 se ligó al sitio BamHI-XhoI del vector
pCDNA 3.1/His (Invitrogen), para obtener un vector de expresión del
gen TSC403.
Después, usando el vector de expresión obtenido
anteriormente, se llevó a cabo un ensayo de formación de foco usando
células NIH3T3 según el método descrito en la bibliografía [Shin,
C., Shilo, B., Goldfarb, M. P., et al., Proc. Natl. Acad.
Sci., USA., 76, 5714-5718 (1979)], para ver si el
gen TSC403 tiene un efecto tumorigénico sobre las células.
Los resultados se muestran en la Fig. 6 (células
de control no transformadas con el gen TSC403) y la Fig. 7 (células
transformadas con el gen TSC403).
Como es manifiesto a partir de la comparación de
las dos figuras, se formó un foco definitivo, como se muestra en la
Fig. 7, cuando el gen TSC403 se expresó de forma forzada en células
mediante introducción del gen. De este modo, es manifiesto que el
gen TSC403, cuando se sobreexpresa a la fuerza, provoca una pérdida
de sensibilidad al fenómeno de inhibición por contacto que es una de
las transformaciones malignas de las células, estando así
profundamente implicado en la tumorigénesis de las células.
\vskip1.000000\baselineskip
Secuenciando clones de ADNc seleccionados
arbitrariamente a partir de una librería de ADNc de cerebro fetal
humano y una búsqueda en base de datos, se aisló mediante el
siguiente procedimiento un clon (GEN-146F11) que
posee un ADNc que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene
una homología elevada con p33^{ING1}, una proteína que se
considera que es una proteína supresora de tumores.
De este modo, el ARNm extraído de cerebro fetal
humano se adquirió de Clontech y se usó como material de partida. A
partir del ARNm, se sintetizó ADNc y se clonó en el vector
\lambdaZAPII (Stratagene) para construir una librería de ADNc
(Otsuka GEN Research Institute, Otsuka Pharmaceutical). Mediante el
método de escisión in vivo [Short, J. M. et al.,
Nucleic Acids Res., 16, 7583-7600 (1988)], se
provocó que se formasen en medio agar y se recogieron al azar
colonias de Escherichia coli que poseen el gen humano, y
clones de E. coli que poseen el gen humano se registraron en
una placa de microtitulación de 96 pocillos. Los clones registrados
se almacenaron a -80ºC.
Después, cada clon registrado se cultivó en 1,5
ml de medio LB durante 24 horas y, usando un extractor automático de
plásmido PI-100 (Kurabo), el ADN se extrajo y se
purificó. El ARN de E. coli contaminado se descompuso
mediante tratamiento con ARNasa, y se eliminó. Finalmente, el ADN se
disolvió hasta 30 \mul, y se usó una porción de 2 \mul para una
estimación aproximada del tamaño y cantidad del ADN mediante el
método de minigel. Se usó otra porción de 7 \mul para la reacción
de secuenciación, y la porción restante de 21 \mul se almacenó
como ADN plasmídico a 4ºC.
Después, se llevó a cabo el método terminador de
didesoxi de Sanger [Sanger, F., et al., Proc. Natl. Acad.
Sci., U.S.A., 74, 5463-5467 (1977)] usando un
cebador oligonucleotídico de T3, T7 o sintético, o un método de
secuenciación por ciclos, que es el método terminador de didesoxi
combinado con el método de PCR [Carothers, A. M., et al.,
Bio. Techniques, 7, 494-499 (1989)]. Estos son los
métodos para la reacción de extensión de la cadena con terminación
específica para 4 tipos de bases usando una pequeña cantidad de ADN
plasmídico (aprox. 0,1-0,5 g) como molde.
Usando como el cebador de la secuencia un
cebador marcado con FITC (isotiocianato de fluoresceína), se
llevaron a cabo alrededor de 25 ciclos de reacción usando Taq
polimerasa. Del fragmento de ADN marcado con fluorescencia, se
determinó la secuencia de alrededor de 400 nucleótidos a partir del
extremo 5' del ADNc con el secuenciador de ADN automático ALF^{TM}
DNA Sequencer (Pharmacia).
La región no traducida de 3' es rica en
heterogeneidad entre genes y adecuada para la diferenciación de
genes individuales. Por lo tanto, en algunos casos también se llevó
a cabo la secuenciación de la región del extremo 3'.
La gran información de secuencia nucleotídica
generada con el secuenciador de ADN se transmitió al ordenador de 64
bit DEC3400 para el análisis de homología computerizado. Este
análisis de homología se llevó a cabo mediante una búsqueda en base
de datos (Gen-Bank, EMBL) según el programa FASTA de
UWGCG [Pearson, W. R. y Lipman, D. J., Proc. Natl. Acad. Sci., USA.,
85, 2444-2448 (1988)].
El método anterior de análisis para una librería
de ADNc de cerebro fetal humano es descrito con detalle por Fujiwara
et al. [Fujiwara, T., et al., DNA Res., 2,
101-111 (1991)].
\newpage
Entonces se secuenciaron alrededor de 5040 EST
(etiquetas de secuencias expresadas: secuencias de ADN parciales de
fragmento génico expresado) seleccionadas al azar a partir de una
librería de ADNc de cerebro fetal humano construida como antes.
Se encontró que el clon denominado
GEN-146F11 en la búsqueda de secuencias de
GenBank/EMBL según el programa FASTA posee un gen que codifica una
secuencia de aminoácidos que tiene una homología elevada con
p33^{ING1} [GenBank A. C. nº AF001954].
Para aclarar la secuencia de longitud completa
en dicho clon GEN-146F11, se llevó a cabo una
reacción de secuenciación de AND usando T1ADN polimerasa y un
cebador sintético. Además, usando como molde un AND bicatenario
insertado en un vector (vector pBluescript; Stratagene), y como
cebador un oligonucleótido sintético, se determinó la secuencia
nucleotídica del ADNc incluida en la región codificante completa
mediante el método de terminación de cadena de didesoxi de Sanger, y
la secuencia se comparó con las secuencias de ADN de otros varios
genes relacionados.
La SEC ID nº: 6 muestra la secuencia de ácido
nucleico del clon GEN-146F11 (ADNc); la SEC ID nº: 5
muestra la secuencia de ácido nucleico de la región codificante de
dicho clon; y la SEC ID nº: 4 muestra la secuencia de aminoácidos
deducida codificada por dicha secuencia de ácido nucleico.
En las secuencias nucleotídicas anteriores, la
secuencia de la señal de iniciación se encontró en la posición
92-94, y se sospecha que es el codón de partida de
la traducción. El codón de parada predicho se encontró en la
posición 932-934.
El ADNc tiene una longitud de 1018 nucleótidos y
contenía un marco de lectura abierta de 840 pares de bases que
codificaron una proteína de 280 restos de aminoácidos predicha.
Mediante la búsqueda de homología usando el
programa FASTA, se encontró que este gen codifica una secuencia de
aminoácidos que tiene una homología elevada con p33^{ING1}
[GenBank A. C. nº AF044016]. La homología de la secuencia
nucleotídica fue 60,0%.
A nivel de la secuencia de aminoácidos, se
investigó la homología entre la secuencia de aminoácidos deducida de
la proteína codificada por el gen descrito aquí y la secuencia de
p33^{ING1} [GenBank A. C. nº AF044016]. El resultado se muestra en
la Fig. 8.
La Fig. 8 muestra la secuencia de aminoácidos
representada en letras individuales; la fila superior representa la
secuencia de la proteína ING1L humana codificada por el gen descrito
aquí (indicado como hING1L), y la fila inferior representa la
secuencia de p33^{ING1} [Garkavetsev, et al., Nature.
Genet., 14, 415-420 (1996); Garkavetsev, et
al., Mol. Cell. Biol., 17, 2014-2019 (1997),
GenBank A. C. nº AF001954; sin embargo, esta secuencia se ha
revisado subsiguientemente, y la secuencia corregida se muestra en
GenBank A. C. nº AF044076; indicada como p33^{ING1} en el
dibujo].
Además, en el mismo dibujo, el área oscura
(marco negro) indica los restos de aminoácidos idénticos, y el área
sombreada (marco sombreado) indica restos de aminoácidos análogos.
El símbolo - - - - en la fila de hING1L representa
un salto.
Se puede observar a partir del dibujo que la
secuencia de aminoácidos codificada por el gen descrito aquí tiene
una homología del 58,9% (según se calcula basándose en la secuencia
corregida de p33^{ING1}) con la secuencia de aminoácidos de
P33^{ING1}.
\vskip1.000000\baselineskip
La expresión de ARNm de ING1L humano en tejidos
humanos normales se evaluó mediante transferencia Northern usando
como sonda un clon de ADNc humano marcado mediante el método de
cebado oligonucleotídico al azar.
El análisis de transferencia Northern se llevó a
cabo usando una transferencia de MTN humana (transferencia Northern
de múltiples tejidos humanos; Clontech) según el protocolo del
producto.
De este modo, la secuencia de longitud completa
de dicho clon GEN-146F11 se amplificó mediante PCR,
y el producto de la PCR se marcó con [^{32}P] - dCTP (kit de
marcado de ADN cebado al azar, Boehringer Mannheim), para uso como
sonda.
La transferencia se sometió a una prehibridación
de 4 horas, y después a una hibridación en una disolución de
formamida al 50%/5 x SSC/10 x disolución de Decherd/disolución de
SDS al 2% (que contiene 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón
desnaturalizado) a 42ºC toda la noche. Después de 2 lavados con 2 x
SSC/0,1% de SDS a temperatura ambiente, se llevaron a cabo 2 lavados
con 0,2 x SSC/0,1% de SDS a 65ºC durante 15 minutos. El filtro se
expuso frente a una película de rayos X (Kodak) a -70ºC.
En la Fig. 9 se muestran los resultados de la
exposición durante 18 horas.
Como se puede observar en la Fig. 9, se encontró
expresión en los 16 tejidos derivados de órganos adultos humanos
ensayados (corazón, cerebro, placenta, pulmón, hígado, músculo
esquelético, riñón, páncreas, bazo, timo, próstata, testículo,
útero, intestino delgado, colon, sangre periférica y leucocito; se
aplica la misma nomenclatura a las leyendas en el dibujo), y se
detectaron dos transcritos de 1,5 kb y 1,3 kb.
Adicionalmente, para los varios tejidos
tumorales de cáncer colorrectal, cáncer de esófago, cáncer de trompa
uterina y cáncer de estómago, también, se llevó a cabo un análisis
de transferencia Northern similar usando una transferencia TP humana
(transferencia de panel de tumor humana; Invitrogen) según el
protocolo del producto.
Los resultados en los tejidos de pacientes con
cáncer colorrectal se muestran en la Fig. 10.
En el dibujo, T representa el tejido de tumor
colorrectal (indicado como T:Tumor en el dibujo), y N representa el
tejido colorrectal normal (indicado como N:Normal en el dibujo). Un
conjunto de T y N es el tejido derivado de un paciente, y el dibujo
muestra los resultados para tejidos derivados de 4 pacientes.
Está claro a partir del dibujo que en cada
paciente individual, el nivel de expresión del gen ING1L humano es
elevado en el tejido canceroso en comparación con el tejido
normal.
Basándose en los hallazgos anteriores, se piensa
que el gen ING1L humano descrito aquí es útil para la investigación
y terapia del cáncer, particularmente para la aplicación al
diagnóstico del cáncer, y que si se puede desarrollar en el futuro
cualquier inhibidor antagonista de productos de expresión del gen
ING1L humano, debería de encontrar aplicación como un agente
anticancerígeno.
\vskip1.000000\baselineskip
La FISH para el alineamiento cromosómico se
llevó a cabo mediante el procedimiento conocido [Takahashi, E. et
al., Hum. Genet., 86, 14-16 (1990)] usando como
sonda 0,5 \mug de cada ADN cosmídico. La FISH se capturó mediante
película Provia 100 (Fuji, ISO 100) o con un sistema de cámara CCD
(Applied Imaging, Cyto Vision).
Como resultado, las señales de 100 células de
(pro)metafase de banda R típicas indicaron que el locus del
gen ING1L humano en un cromosoma era 4q35.1.
\vskip1.000000\baselineskip
Según la invención, se proporciona no sólo un
nuevo gen TSC403 específico del pulmón sino también una proteína
codificada de ese modo. Mediante su utilización, se proporciona una
tecnología mediante la cual se puede arrojar más luz sobre cánceres,
por ejemplo cáncer de pulmón y cáncer pancreático, y el proceso de
la oncogénesis, y que encuentra aplicación en el diagnóstico,
profilaxis y terapia del mismo.
Se describe además un nuevo gen ING1L humano que
permite la detección de la expresión del gen en diversos tejidos, la
producción de una proteína ING1L humana, que es el producto de
expresión del gen, mediante tecnología de ingeniería genética, y la
construcción de un anticuerpo específico frente a dicha proteína.
Estos, a su vez, permiten la investigación en el ciclo celular, la
inhibición del crecimiento o activación de diversas células, el
estudio del envejecimiento metabólico y apoptosis de células, y la
exploración, tratamiento o diagnóstico de enfermedades relacionadas,
tales como cánceres, como se menciona aquí anteriormente. Además, la
descripción permite el desarrollo, o identificación, de inhibidores
antagonistas de dicha proteína ING1L humana, principalmente
supresores del crecimiento celular y fármacos contra el cáncer.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> Ostuka Pharmaceutical Co., ltd.
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Gen TSC403 y gen ING1L humano
\vskip0.400000\baselineskip
<130> P99-04
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip0.400000\baselineskip
<150> JP H10-38133, JP
H10-73234 y JP H10-134679
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 03/02/1998, 05/03/1998 y
28/04/1998
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 416
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Librería de ADNc de pulmón normal
humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1248
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Librería de ADNc de pulmón normal
humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3198
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Librería de ADNc de pulmón normal
humano
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (64)..(1311)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 280
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Librería de ADNc de cerebro
embriónico humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 840
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Librería de ADNc de cerebro
embriónico humano
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1078
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Librería de ADNc de cerebro
embriónico humano
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (92)..(931)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia del cebador de la PCR para
TSC403
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400>7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatctgacac
\hfill10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cebador de PCR P1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatcggatcc aggaggatgc gggtccgg
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cebador de PCR P2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatcctcgag ttactgtggt ggctgctgct
\hfill30
Claims (9)
1. Polinucleótido que tiene una secuencia
nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en
SEC ID nº: 1 o una secuencia complementaria a la misma.
2. Polinucleótido seleccionado de entre los
siguientes (a) y (b):
- (a)
- un polinucleótido que contiene la secuencia nucleotídica mostrada en SEC ID nº: 2 o una secuencia complementaria a ella,
- (b)
- un polinucleótido que se hibrida específicamente a dicho polinucleótido (a) en las condiciones de 6 x SSC a 65ºC toda la noche o 4 x SSC suplementado con formaldehído al 50% a 31ºC toda la noche, y lavando en 2 x SSC a 65ºC durante 30 minutos, y que es útil como un marcador del cáncer.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Polinucleótido según la reivindicación 2, que
tiene la secuencia nucleotídica mostrada en SEC ID nº: 3.
4. Método para el diagnóstico de cáncer, que
comprende detectar la expresión del polinucleótido según las
reivindicaciones 1 y 2 usando una sonda que tiene una secuencia que
consiste en por lo menos 15 nucleótidos consecutivos en la secuencia
nucleotídica mostrada en SEC ID nº: 2 o un cebador que tiene una
secuencia que consiste en por lo menos 15 nucleótidos consecutivos
en la secuencia nucleotídica mostrada en SEC ID nº: 2.
5. Método de diagnóstico según la reivindicación
4, en el que el cáncer es un miembro seleccionado de entre cáncer de
la glándula mamaria, cáncer de la trompa uterina, cáncer del
esófago, cáncer del colon, cáncer del recto, cáncer de la glándula
tiroides, cáncer de la glándula parótida, cáncer de la uretra,
cáncer del ovario y cáncer de páncreas.
6. Oligonucleótidos, sondas y cebadores que
comprenden una secuencia que consiste en por lo menos 15 nucleótidos
consecutivos en la secuencia nucleotídica mostrada en SEC ID nº: 2 o
SEC ID nº: 3, adecuados para uso en un método tal como se describe
en las reivindicaciones 4 y 5.
7. Kit de diagnóstico para el cáncer, que
comprende una sonda que tiene una secuencia que consiste en por lo
menos 15 nucleótidos consecutivos en la secuencia nucleotídica
mostrada en SEC ID nº: 2, o un cebador que tiene una secuencia que
consiste en por lo menos 15 nucleótidos consecutivos en la secuencia
nucleotídica mostrada en SEC ID nº: 2, como componente esencial.
8. Proteína que tiene una secuencia de
aminoácidos mostrada en SEC ID nº: 1.
9. Anticuerpo que tiene una afinidad de unión
específica por la proteína definida en la reivindicación 8.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10-38133 | 1998-02-03 | ||
| JP3813398 | 1998-02-03 | ||
| JP10-73234 | 1998-03-05 | ||
| JP10-134679 | 1998-04-28 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2348656T3 true ES2348656T3 (es) | 2010-12-10 |
Family
ID=43413397
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES99901209T Expired - Lifetime ES2348656T3 (es) | 1998-02-03 | 1999-02-02 | Human tsc403 gene and human ing1l gene. |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| ES (1) | ES2348656T3 (es) |
-
1999
- 1999-02-02 ES ES99901209T patent/ES2348656T3/es not_active Expired - Lifetime
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