WO1999024568A1

WO1999024568A1 - Proteine de liaison de l'hormone steroide

Info

Publication number: WO1999024568A1
Application number: PCT/JP1998/005010
Authority: WO
Inventors: Yuichi Hirata
Original assignee: Chugai Research Institute For Molecular Medicine, Inc.
Priority date: 1997-11-07
Filing date: 1998-11-06
Publication date: 1999-05-20
Also published as: AU9762098A; US20020177194A1; US7279284B2; EP1035204A1; EP1035204A4; US6432674B1

Description

明細 ^ ステロイ技術分野

本発明は、ステロイドホルモン結合タンパク質およびその遺伝子、並びにそれらの製造および用途に関する。背景技術

一般的にステロイドホルモンは、転写活性を調節することにより生理的な影響を及ぼすと考えられている。しかし、ごく最近になってこの理論では説明できない、遺伝子への作用に因らない迅速なステロイドの活性が広く知られるようになつた。このステロイドの迅速な活性は全てのステロイドで、また多くの種や組織でその証拠が示されている。例えば、アルドステロンのリンパ球や血管平滑筋への迅速な作用（Wehling M. ( 1995 ) Cardiovasc Res 29 (2)， 167-171 )、ビタミン D3の上皮細胞への作用、プロゲステロンの精子への作用（Revel l i A, Modotti M, Piffaretti-Yanez A, Massobrio M， Balerna M. ( 1994) Hum Reprod 9 ( 5 )， 7 60-766 )、神経系ステロイドのニューロンへの作用、エストロジ工ンの血管への作用等が知られている。これらの活性のシグナルの認識や伝達のメ力二ズムは現在研究されている段階ではあるが、これらの作用の多くは、フォスホリパーゼ Cゃホスホイノシチドターンオーバ一、細胞内 pH、細胞内カルシウム、プロテインカイネ一スチロシン力イネ一ス等が関与しており（Baran DT. ( 1994) J Cell Bioc hem 56 ( 3) , 303-306、 de Boland AR, Nemere I . ( 1992 ) J Cel l Biochem 49 ( 1 )， 32-36 ) 、カテコールアミンやペプチドホルモンの系のような膜受容体とセカンドメッセンジャーによるカスケ一ド系に似ていることが明らかになりつつある。生理的あるいは病理的な関与は明確ではないが、心臓血管、中枢神経、あるいは生殖系での迅速なステロイドの作用が in vivoでも観察されうると考えられている。これらの受容体は近いうちにクローニングされ、迅速なステロイドの作用と臨床との関係が明らかにされるものと予想された（Wehling M. ( 1997) Annu Re v Physiol 59， 365-393、 Wehl ing M. ( 1995 ) J Mol Med 73 ( 9) , 439-447)。そして近年、遂に従来の核内転写調節型のステロイドホルモン受容体とは異なり膜結合型であるプロゲステロン結合タンパク質（PMBP, Progesterone membrane binding protein )がブ夕から初めてクロ一ニングされた（Falkenstein E, Meye r C, Eisen C， Scriba PC, Wehling M. ( 1996 ) Biochem Biophys Res Co腿 un 22 9 ( 1 )， 86-89)。このタンパク質はミクロソーム画分から精製されたタンパク質であり、 N末近傍に疎水性領域が存在し、既存のステロイド受容体とのホモロジ一は全く存在しない。現在までに PMBPのヒ卜ホモログと考えられる遺伝子「putative progesterone binding proteiry (LOCUS ： HSPROGBIN_s ァクセッションナンバー： ACC. Y12711) とラットのホモログと考えられる遺伝子「25Dx」 (LOCUS ： RNU63 315、ァクセッションナンバー： Ac U63315) が単離されている。ブ夕 PMBPに関してはその性質が良く調べられており、プロゲステロンだけでなくコルチコステロン、コルチヅ一ル、プロメゲストン、テストステロンとも結合することが報告されている (Meyer C. ( 1996 )Eur. J. Biochem.239, 726-731) 。

このような膜結合型のステロイドホルモン結合タンパク質の発見は、生体において核内転写調節型の受容体とは異なるメカニズムによるホルモン作用の調節が存在することを示唆するものである。従って、膜結合型ステロイドホルモン結合タンパク質を利用することにより、核内転写調節型の受容体との親和性や生物活性の差を識別する新規な薬剤を開発できると考えられる。発明の開示

本発明は、 PMBPと相同性を有する新規なステロイドホルモン結合タンパク質およびその遺伝子、並びにそれらの製造方法および用途を提供することを課題とする。

本発明者等は、上記課題を解決するために、膜結合型のステロイド結合タンパク質である PMBP(Falkenstein E, Meyer C, Eisen C， Scriba PC, Wehling M. (1 996) Biochem Biophys Res Conanun 229 (1)， 86- 89)とホモロジ一を有するタンパク質をコードする cDNAの一部と推定される複数の ESTを見いだした。次いで、それらの配列情報からコンセンサス配列を抽出し、このコンセンサス配列を基に設計したプライマ一を用いてヒト遺伝子のポリメラーゼ連鎖反応を行った。その結果、本発明者等は PMBPと相同性を有する新規なステロイドホルモン結合タンパク質をコ一ドする遺伝子をヒ卜から単離することに初めて成功した。

本発明は、 PMBPと相同性を有する新規なステロイドホルモン結合タンパク質およびその遺伝子、並びにそれらの製造および用途に関し、より具体的には、

( 1 ) 配列番号： 4に記載のァミノ酸配列からなるタンパク質、

(2) 配列番号： 4に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、および/もしくは付加したアミノ酸配列からなり、ステロイドホルモンとの結合活性を有するタンパク質、

(3) ( 1) または（2) に記載のタンパク質をコードする DNA、

(4) (3) に記載の DNAが挿入されたベクター、

(5) (4) に記載の DNAを発現可能に保持する形質転換体、

(6) (5) に記載の形質転換体を培養する工程を含む、（ 1) または（2) に記載のタンパク質の製造方法、

(7) ( 1) に記載のタンパク質に結合する抗体、

(8) ( 1) または（2) に記載のタンパク質に被検試料を接触させ、（ 1) または（2) に記載のタンパク質に結合する化合物を選択する工程を含む、

( 1) または（2) に記載のタンパク質に結合する化合物のスクリーニング方法、

(9) ( 1) に記載のタンパク質に結合する化合物、

( 10) (8) に記載の方法により単離しうる（9) に記載の化合物、 ( 1 1) ( 1) 若しくは（2) に記載のタンパク質および核内転写調節型のステロイドホルモン受容体のそれそれに被検試料を接触させ、（ 1 ) 若しくは

(2) に記載のタンパク質または核内転写調節型のステロイドホルモン受容体のいずれかに特異的に結合する化合物を選択する工程を含む、（ 1 ) 若しくは

(2) に記載のタンパク質または核内転写調節型のステロイドホルモン受容体のいずれかに特異的に結合する化合物のスクリーニング方法、

( 12) ( 1) 若しくは（2) に記載のタンパク質または核内転写調節型のステロイドホルモン受容体のいずれかに特異的に結合する化合物、

( 1 3) ( 1 1) に記載の方法により単離しうる（ 12) に記載の化合物、

( 14) 配列番号： 3に記載の塩基配列からなる DNAに特異的にハイブリダイズし、少なくとも 15ヌクレオチドの鎖長を有する DNA、に関する。

本発明は、ブ夕の膜結合型プロゲステロン結合タンパク質（PMBP， Progesteron e membrane binding protein )(Falkenstein E, Meyer C, Eisen C， Scriba PC,

Wehling M. (1996) Biochem Biophys Res Commun 229 (1)， 86 - 89)と相同性を有するヒト由来のタンパク質「hSMBP2」に関する。本発明者等により単離された

「hSMBP2」 cDNAの塩基配列を配列番号： 3に、該 cDNAがコードするタンパク質のァミノ酸配列を配列番号： 4に示す。

また、図 1に「hSMBP2」とこれに相同性を有するタンパク質「ブ夕 PMBP」、

「ラット 25Dx」、「hSMBPl」の間のアミノ酸配列の比較を示す。「hSMBPl」は、

「hSMBP2」と同様に、「ブ夕 PMBP」とホモロジ一を有する複数の ESTから抽出したコンセンサス配列を基にプライマーを設計し、これを用いたポリメラーゼ連鎖反応により単離したヒト遺伝子である。「hSMBPl」に関しては、同一遺伝子がデー夕一ベースに登録されている（Ac Y12711) 。図 1から明らかなように「hSMBP 2」はプ夕「PMBP」と有意な相同性を示すものの、全体的に高い相同性を有する

「hSMBPl」と異なり、 C末端近辺以外の相同性が多少低いため、同じファミリ一に属するが、結合するステロイドのスぺクトルが異なるタンパク質であると考えられる。

本発明のステロイドホルモン結合タンパク質は、従来の核内転写調節型の受容体とは異なり膜結合型であると考えられる。このため生体において核内転写調節型の受容体とは異なるメカニズムによりホルモン作用を調節していると考えられ、本発明のステロイドホルモン結合タンパク質を標的として、例えば、ステロイドホルモンに対する核内転写調節型受容体との結合親和性の差を利用した副作用の少ない薬剤の開発などが可能である。特に、「hSMBP2」はヒト由来であるため、ブ夕など他の哺乳動物由来のタンパク質と比較して、臨床開発の点で有効である。本発明のステロイドホルモン結合タンパク質は、遺伝子組み換え技術を用いて調製される組み換えタンパク質として、また天然のタンパク質として調製することが可能である。組み換えタンパク質であれば、例えば、本発明のステロイドホルモン結合タンパク質をコードする DNA (例えば、配列番号： 3に記載の塩基配列を有する DNA) を適当な発現ベクターに組み込み、これを宿主細胞に導入して得た形質転換体から精製するなどの方法により調製することが可能である。また、天然のタンパク質であれば、例えば、調製した組み換えタンパク質を小動物に免疫することにより得た抗体を用いたカラムを調製し、本発明のステロイドホルモン結合タンパク質の発現の高い組織、細胞（例えば、精巣や癌細胞など）の抽出物に対し該カラムを用いたァフィ二ティークロマトグラフィーを行うなどの方法により調製することが可能である。

本発明には、また、「hSMBP2」タンパク質と機能的に同等なタンパク質が含まれる。ここで「機能的に同等」とは、対象のタンパク質が、「hSMBP2」タンパク質と同様に、ステロイドホルモンとの結合活性を有することを指す。「ステロイドホルモンとの結合活性を有する」とは、少なくとも 1種のステロイドホルモンとの結合活性を有することを指す。ステロイドホルモンとの結合活性は、例えば、市販されているトリチウム標識したステロイドホルモンを用いた結合活性の検出試験により検出することが可能である。「hSMBP2」タンパク質に機能的に同等なタンパク質は、例えば、「hSMBP2」夕ンパク質のアミノ酸配列を変異させることにより調製することが可能である。例えば、配列番号： 4に記載のアミノ酸配列を有する本発明のステロイドホルモン結合タンパク質において、その機能に影響を与えないアミノ酸を適宜置換などして、「hSMBP2」タンパク質と機能的に同等なタンパク質を単離することができる。このように配列番号： 4に記載のアミノ酸配列において 1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失および/もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、「hSMBP2」タンパク質と機能的に同等なタンパク質も本発明のステロイドホルモン結合タンパク質に含まれる。

タンパク質のアミノ酸配列を変異させる方法としては、例えば、 PCI こよる部位特異的変異誘発システム（GIBCO-BRL, Gaithersburg, Maryland) 、オリゴヌクレオチドによる部位特異的変異誘発法（Kramer，W. and Fritz, HJ ( 1987) Methods in EnzymoL , 15 : 350-367) などが挙げられる。変異させるアミノ酸の数は、ステロィドホルモンとの結合活性が保持される限り特に制限はないが、通常、 30ァミノ酸以内であり、好ましくは 20アミソ酸以内であり、さらに好ましくは 10アミノ酸以内であり、さらに好ましくは 5ァミノ酸以内である。

なお、タンパク質中のアミノ酸の変異は自然界において生じることもあり、このようにして生じた変異タンパク質もまた本発明のステロイドホルモン結合タンパク質に含まれる。

また、「hSMBP2」タンパク質と機能的に同等なタンパク質を調製するための他の方法としては、ハイプリダイゼーシヨン技術を利用した方法が挙げられる。即ち、当業者であれば、周知技術であるハイブリダィゼ一シヨン技術（Sambrook, J et al . , Molecular Cloning 2nd ed.9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. press, 1989) を用いて、「hSMBP2」タンパク質をコードする DNA配列（配列番号： 3 ) またはその一部を基に、これと相同性の高い DNAを単離して、該 DNAから「hSMBP2」タンパク質と機能的に同等なタンパク質を得ることができる。このように配列番号： 3に記載の DNA酉己列からなる DNAとハイプリダイズする DNAがコードし、「hSM BP2j タンパク質と機能的に同等なタンパク質もまた本発明のステロイドホルモン結合タンパク質に含まれる。

機能的に同等なタンパク質をコードする DNAを単離するためのハイブリダイゼ一シヨンのス卜リンジエンシーは、通常、「42°C、 2xSSC、 0Λ% SDS」程度であり、好ましくは「50°C、 2xSSC、 0. 1¾ SDSj 程度であり、さらに好ましくは「65°C、 2 xSSC、 0. 1% SDSj 程度である。このように温度を上げる程により高い相同性を有する DNAの単離を期待することができる。なお、当業者であれば、ハイブリダィゼ —シヨンのストリンジエンシーとして、温度以外に、例えば、プローブ濃度、プローブの長さ、塩強度、反応時間などの諸要因を考慮して、上記と同様のストリンジニンシ一を実現することが可能である。

ハイブリダイズ技術を利用して得られる DNAがコードするタンパク質は、通常、「hSMBP2」タンパク質（配列番号： 4 ) とアミノ酸配列において高い相同性を有する。高い相同性とは、 40%以上の相同性、好ましくは 60%以上の相同性、さらに好ましくは 80%以上の相同性を指す。配列の相同性は、文献（Wi lbur, W. J. and Lipman, D . J . Pro Natl . Acad . Sci . USA( 1983 ) 80， 726-730) に記載のアルゴリズムを利用して決定することができる。

また、本発明は、本発明のステロイドホルモン結合タンパク質をコードする DN Aに関する。本発明の DNAとしては、本発明のステロイドホルモン結合タンパク質をコードしうるものであれば特に制限はなく、 cDNA、ゲノム DNA、化学合成 DNAなどが含まれる。 cDNAは、例えば、配列番号： 3に記載の塩基配列を基にプライマ一を調製し、 RT-PCRを行うことにより調製することが可能である。また、ゲノム DNAであれば、例えば、えファージを用いたプラークハイブリダィゼーシヨン法により調製することが可能である。得られた DNAの塩基配列は、市販の「dye termi nator sequenc ing kit」 (Appl ied Biosystems社製) などを用レヽて常法により決定することが可能である。また、本発明は、本発明の DNAが挿入されたべクタ一に関する。本発明の DNAが挿入されるべクタ一としては特に制限はなく、本発明のステロイドホルモン結合タンパク質を生体内で発現させるための（例えば、遺伝子治療のための）ベクタ ―、組み换ぇタンパク質を調製するためのベクタ一など目的に応じて種々のべク夕一が用いられる。本発明のステロイドホルモン結合タンパク質を生体内で発現させるために用いられるベクタ一としては、例えば、アデノウイルスベクタ一厂 pAdexLcwj やレトロウイルスベクター「pZIPneo」などが挙げられる。本発明のステロイドホルモン結合タンパク質を生産する目的においてベクターを使用する場合には、特に、発現べク夕一が有用である。発現べクタ一としては、例えば、大腸菌 (E. coli) を用いる場合には「pQEベクター」 (Qiagen社製, Hi lden, Germa ny) などが、酵母を用いる場合には rsp-QOlj (Stratagene社製， La Jolla，Cal i fornia) などが、昆虫細胞を用いる場合には「BAC- to- BAC baculovirus express ion systemj (GIBCO-BRL社製， Gaithersburg，Maryland) などが好ましい。また、哺乳動物細胞、例えば、 CH0細胞、 COS細胞、 NIH3T3細胞などを用いる場合には、例えは、 rtacSwitch I I expression systemj (Stratagene社製， !La Jolla,Cal i fornia) などが好適である。なお、ベクタ一への本発明の DNAの挿入は、常法（例えば、厂 The Qiaexpressionist handbook, Qiagen, Hi lden, Ge魔 ny」参照) により行うことができる。

また、本発明は、本発明の DNAを発現可能に保持する形質転換体に関する。本発明の形質転換体には、本発明の MAが挿入された上記ベクターを保持するもの、本発明の DNAが宿主ゲノム内に組み込まれているものなどが含まれるが、本発明の D NAを発現可能に保持している限り、あらゆる存在形態のものが含まれる。本発明のべクタ一が導入される細胞としては特に制限はなレ、。生体内で本発明のステロィドホルモン結合タンパク質を発現させるために用いる場合には、所望の細胞を標的細胞とすることが可能である。また、本発明のステロイドホルモン結合タンパク質を製造する目的の場合には、例えば、大腸菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞などを用いることが可能である。細胞へのベクタ一の導入は、例えば、電気的穿孔法、リン酸カルシウム法などの方法で行うことが可能である。なお、組み換えタンパク質を製造するために作製した形質転換体からの該組み換えタンパク質の分離、精製は、常法、例えば、文献「The Qiaexpressionist handbook, Qiagen,H ilden, Germany j 記載の方法を用いて行うことが可能である。

また、本発明は、本発明のステロイドホルモン結合タンパク質に結合する抗体に関する。本発明の抗体の形態には、特に制限はなく、ポリクロ一ナル抗体の他、モノクローナル抗体も含まれる。また、ゥサギなどに本発明のステロイドホルモン結合タンパク質を免疫して得た抗血清、すべてのクラスのポリクロ一ナル抗体およびモノクローナル抗体、さらに遺伝子組み換えによるヒト型化抗体、ヒト抗体も含まれる。また、一本鎖抗体、 Fab断片、 F(ab' )₂断片などの抗体の一部も含まれる。

本発明の抗体は、以下の方法により調製することが可能である。ポリクロ一ナル抗体であれば、例えば、まず、本発明のステロイドホルモン結合タンパク質をゥサギなどの小動物に免疫し血清を得て、これを本発明のステロイドホルモン結合タンパク質をカツプリングさせたァフィ二ティーカラムに通すことにより、本発明のステロイドホルモン結合タンパク質のみを認識する画分を得る。次いで、この画分から免疫グロプリン Gあるいは Mを、プロティン Aあるいはプロティン G力ラムにより精製することにより調製することができる。また、モノクロ一ナル抗体であれば、本発明のステロイドホルモン結合タンパク質をマウスなどの小動物に免疫を行い、同マウスより脾臓を摘出し、これをすりつぶして細胞にし、マウスミエロ一マ細胞とポリエチレングリコールなどの試薬により融合させ、これによりできた融合細胞（ハイプリドーマ）の中から、本発明のステロイドホルモン結合タンパク質に対する抗体を産生するクロ一ンを選択する。次いで、得られたハイブリド一マをマウス腹腔内に移植し、同マウスより腹水を回収し、得られたモノクローナル抗体を、例えば、硫安沈殿、プロテイン A、プロテイン Gカラム、 DEAEイオン交換クロマトグラフィー、本発明のステロイドホルモン結合タンパク質をカツプリングしたァフィ二ティ一カラムなどにより精製することで調製することが可能である。

本発明の抗体は、本発明のステロイドホルモン結合タンパク質の精製や検出に用いられる他、本発明のステロイドホルモン結合タンパク質のシグナル伝達を促進または阻害するための薬剤として用いることも可能である。抗体を薬剤として人体に投与する場合には、免疫原性の点で、ヒト抗体またはヒト化抗体が有効である。ヒ卜抗体は、例えば、免疫系をヒトと入れ換えたマウスに本発明のステロィドホルモン結合タンパク質を免疫することにより調製することが可能である。また、ヒト化抗体は、例えば、モノクローナル抗体産生細胞から抗体遺伝子をクローニングし、その抗原決定部位を既存のヒ卜抗体に移植する CDR graft法などにより調製することが可能である。

また、本発明は、本発明のステロイドホルモン結合タンパク質に結合する化合物のスクリーニング方法に関する。本発明のスクリーニング法は、本発明のステロイドホルモン結合タンパク質と被験試料とを接触させ、本発明のステロイドホルモン結合タンパク質に結合する化合物を選択する工程を含む。本発明のステロィドホルモン結合タンパク質に接触させる被検試料としては特に制限はなく、例えば、細胞抽出液、合成低分子化合物のライブラリ一、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成べプチドのライブラリーなどが挙げられる。

本発明のステロイドホルモン結合タンパク質を用いてこれに結合するタンパク質またはその遺伝子を単離する方法としては、例えば、以下の方法が当業者によく知られている。即ち、本発明のステロイドホルモン結合タンパク質と結合するタンパク質または遺伝子は、例えば、本発明のステロイドホルモン結合夕ンパク質と結合するタンパク質を発現してることが予想される細胞（例えば、精巣組織や卵巣組織など）よりファージベクタ一（人 gtl l, ZAPなど）を用いた cDNAライブラリーを作製し、これを LB-ァガロース上で発現させ、フィル夕一に発現させた夕ンパク質を固定し、本発明のステロイドホルモン結合タンパク質をピオチンラベル、あるいは GSTタンパク質との融合タンパク質として精製し、これを上記フィル夕一と反応させ、結合するタンパク質を発現しているプラークを、ストレブ卜ァビジン、あるいは抗 GST抗体により検出する「ウェストウエスタンブロッテイング法」 (Skolnik EY, Margolis B, Mohammad i M, Lowenstein E, Fischer R, Drep ps A, Ullrich A, and Schlessinger J ( 1991 )Cloning of PI3 kinase- associat ed p85 utilizing a novel method for expression/cloning of target protein s for receptor tyrosine kinases. Cell 65, 83-90) により調製することが可能である。

また、本発明のステロイドホルモン結合タンパク質を SRF結合領域または GAL4結合領域との融合タンパク質として酵母細胞の中で発現させ、一方、本発明のステロイドホルモン結合タンパク質と結合するタンパク質を発現していることが予想される細胞より、 VP16または GAL4転写活性化領域と融合する形で発現する cDNAライブラリーを作製し、該 cDNAライプラリーを上記酵母細胞に導入し、検出された陽性クローンからライブラリー由来 cDNAを単離する（酵母細胞内で本発明のステロイドホルモン結合タンパク質と結合するタンパク質が発現すると、両者の結合によりレポーター遺伝子が活性化され、陽性のクローンが確認できる）「twoハイプリッドシステム」（「 ATCHMARKER Two-Hybrid Systemj , 「Mammalian MATCHM AKER Two-Hybrid Assay Kitj , 「MATC匪 ER One-Hybrid Systemj (いずれも clo ntech社製）、厂 HybriZAP Two-Hybrid Vector Systemj (stratagene社製）、文献 rDalton S, and Treisman R ( 1992)Characterization of SAP- 1， a protein r ecruited by serum response factor to the c-fos serum response element. C ell 68, 597-612」）に従い調製することも可能である。

さらに、本発明のステロイドホルモン結合タンパク質を固定したァフィ二ティ —カラムに本発明のステロイドホルモン結合夕ンパク質と結合するタンパク質を発現していることが予想される細胞の培養上清もしくは細胞抽出物をのせ、カラムに特異的に結合するタンパク質を精製することにより調製することも可能である。得られたタンパク質のアミノ酸配列を分析し、それを基にオリゴ MAを合成し、該 DNAをプローブとして cDNAライブラリ一をスクリーニングすることにより、該夕ンパク質をコ一ドする DNAを得ることも可能である。

また、固定した本発明のステロイドホルモン結合タンパク質に、合成化合物、天然物バンク、またはランダムファージぺプチドディスプレイライブラリーを作用させ、結合する分子をスクリーニングする方法や、コンビナトリアルケミストリ一技術によるハイスル一プヅトを用いたスクリーニング（Wrighton NC; Farr ell FX; Chang R Kashyap AK; Barbone FP; Mulcahy LS Johnson DL; Barret t RW; Joll iffe LK; Dower WJ . , Smal l peptides as potent mimetics of the p rotein hormone erythropoietin, Science (UNITED STATES) Jul 26 1996, 273 p458-64_N Verdine GL. , The combinatorial chemistry of nature. Nature (ENG LAND) Nov 7 1996, 384 pll- 13、 Hogan JC Jr. , Directed combinatorial chemis try. Nature (ENGLAND) Nov 7 1996, 384 pl7-9) により本発明のステロイドホルモン結合タンパク質に結合する、低分子化合物、タンパク質（またはその遺伝子）、ペプチドなどを単離する方法も当業者に周知の技術である。これにより単離される化合物には、本発明のステロイドホルモン結合タンパク質の活性を促進または阻害するための薬剤としての応用が考えられる。

また、核内転写調節型のステロイドホルモン受容体と本発明のステロイドホルモン結合タンパク質を用いて同様にスクリーニングを行うことにより、どちらか一方に特異的に結合する化合物をスクリーニングすることも可能である。即ち、本発明のステロイドホルモン結合タンパク質および核内転写調節型のステロイドホルモン受容体のそれそれに被検試料を接触させ、本発明のステロイドホルモン結合タンパク質または核内転写調節型のステロイドホルモン受容体のレ、ずれかに特異的に結合する化合物を選択することにより、本発明のステロイドホルモン結合タンパク質または核内転写調節型のステロイドホルモン受容体の、ずれかに特異的に結合する化合物をスクリーニングすることができる。このスクリ一ニングに用いる既知の核内転写調節型のステロイドホルモン受容体としては、例えば、プロゲステロン受容体（Ac 189935) 、グルココルチコィド受容体（Acc.12106 9) 、アンドロジヱン受容体（Acc.105325) 、ビタミン！)受容体（Acc.340203) 、ミネラルコルチコィド受容体（Ac 126885) 、エストロジヱン受容体（Acc .5442 57) 、ステロイドホルモン受容体 ERM (Acc .119560) 、ステロイドホルモン受容体 ERR2 (Acc .119561 ) が挙げられる。このような化合物は既知のステロイド系薬剤の副作用を抑える化合物として利用しうる。

本発明のスクリーニング方法により単離される化合物を薬剤として用いる場合には、公知の製剤学的製造法により製剤化して用いることが可能である。例えば、薬理学上許容される担体または媒体（生理食塩水、植物油、懸濁剤、界面活性剤、安定剤など）とともに患者に投与される。投与は、化合物の性質に応じて、経皮的、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、静脈内、または経口的に行うことが可能である。また、単離される化合物が DNAである場合には、上記した生体内で発現させるべクタ一を利用して人体に投与することが可能である。

また、本発明は、配列番号： 3に記載の塩基配列からなる DNA (その相補鎖を含む）と特異的にハイブリダィズし、少なくとも 15塩基の鎖長を有する DNAに関する c ここで「特異的にハイブリダィズする」とは、通常のハイブリダィゼ一シヨン条件下、好ましくはストリンジェン卜なハイブリダィゼーシヨン条件下で、他の夕ンパク質をコードする DNAとクロスハイプリダイゼ一シヨンが有意に生じないことを指す。このような DNAは、本発明のタンパク質をコードする DNAを検出、単離するためのプローブとして、また増幅するためのプライマーとして利用可能である。特異的なハイプリダイゼ一シヨンのためのストリンジエンシーは、ハイプリダイズ反応の温度、反応時間、プローブ又はプライマー濃度、プローブ又はプライマ一の長さ、塩強度などを考慮することにより、当業者であれば適宜選択することができる。また、本発明の「配列番号： 3に記載の塩基配列からなる DNAと特異的にハイプリダィズし、少なくとも 15塩基の鎖長を有する DNA」には、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドゃリボザィムも含まれる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、本発明のタンパク質の産生細胞に作用して、該タンパク質をコードする DNA又は m Aに結合することにより、その転写又は翻訳を阻害したり、 mRNAの分解を促進したりして、本発明のタンパク質の発現を抑制することにより、結果的に本発明のタンパク質の作用を抑制する効果を有する。アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、例えば、配列番号： 3に記載の塩基配列中のいずれかの箇所にハイプリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは配列番号： 3に記載の塩基配列中の連続する少なくとも 15個以上のヌクレオチドに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。さらに好ましくは、前記連続する少なくとも 15個以上のヌクレオチドが翻訳開始コドンを含む、前記のアンチセンスオリゴヌクレオチドである。

アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、それらの誘導体や修飾体を使用することができる。このような修飾体として、例えばメチルホスホネート型又はェチルホスホネート型のような低級アルキルホスホネート修飾体、ホスホロチォェ ―ト修飾体又はホスホロアミデ一ト修飾体等が挙げられる。

アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、 MA又は mRNAの所定の領域を構成するヌクレオチドに対応するヌクレオチドが全て相補的であるもののみならず、 DN A又は mRNAとオリゴヌクレオチドとが配列番号： 3に記載の塩基配列に選択的に安定にハイブリダィズできる限り、 1又は複数個のヌクレオチドのミスマッチが存在していてもよい。このような DNAとしては、少なくとも 15個の連続したヌクレオチド配列領域で、少なくとも 70%、好ましくは少なくとも 80°/。、より好ましくは 90°/。、さらに好ましくは 95%以上の塩基配列上の相同性を有するものを示す。なお、相同性を決定するためのアルゴリズムは、上記した文献に記載のァルゴリズムを使用すればよい。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、それらに対して不活性な適当な基剤と混和して塗布剤、パップ剤等の外用剤とすることができる。また、必要に応じて、賦形剤、等張化剤、溶解補助剤、安定化剤、防腐剤、無痛化剤等を加えて錠剤、散財、顆粒剤、カプセル剤、リボソームカプセル剤、注射剤、液剤、点鼻剤など、さらに凍結乾燥剤とすることができる。これらは常法にしたがって調製することができる。図面の簡単な説明

図 1は、「hSMBPl」タンパク質および「hSMBP2」タンパク質のアミノ酸配列を「pigPMBP」タンパク質および「rat25dx」タンパク質のアミノ酸配列と整列させた図である。

図 2は、「hSMBPl」タンパク質および「hSMBP2」タンパク質の疎水性ブロットを示す図である。

図 3は、「hSMBPl」および「hSMBP2」のノ一ザンブロット解析を示す電気泳動像である。図中、 1は肺、 2は小腸、 3は筋肉、 4は前立腺、 5は精巣、 6は卵巣、 7は脳、 8は心臓、 9は腎臓、 1 0は脾臓、 1 1は肝臓、 1 2はリンパ球を示す。発明を実施するための最良の形態

以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。

[実施例 1 ] 膜結合型ステロイドホルモン結合タンパク質（hSMBPl、 hSMBP2) の単離

ブ夕 PMBP ( Progesterone Membrane Binding Protein )とホモロジ一を持つ夕ンパク質をコードしている cDNAの一部と見られる EST配列を NCB Iの Uni - geneから収集し、ホモロジ一に基づいて並べコンセンサス配列を抽出した。その結果、 2つのグループに別れる事が判明し、どちらも新規ステロイド結合タンパク質であると考えられたため「hSMBPl」、「hSMBP2」（human Steroid Membrane Binding Pro tein )と名づけ以下の解析を行った。なお、「hSMBPl」については 20個の EST (A A021062, W56474, AA101294, AA116041 , AA166645, W25549, 難 52， AA081900, 薦 45, R59281 , AA232394, AA080939, N52291 , AA115422, H73490, N58287, H 48290, 画 95， R13334, AA179573), 「hSMBP2」については、 17個の EST (R3147 2, H02501 , N27670, T49867, 固 43， T85747, W47315, H72718, N36635, H7271 9， W47200, T90839, H55752, N20825, T49868, N26004, R30936 )を整列させコンセンサス配列を抽出した。

上記コンセンサス配列からそれそれ以下のプライマ一をデザインし合成した。厂 hSMBPl」用には、プライマー「hSMBPl-l」（配列番号： 5/ 5' -AAGAATTCCTGCC TAGCGCGGCCCAACCTTTACT-3' ) および「hSMBP卜 2」（配列番号： 6/ 5' -GGGGATCCA AAAATAGATATACTTCCACTGMTG- 3' )を、「hSMBP2」用には「hSMBP2- 1」（配列番号： 7/ 5， -ACGGATCCTGAAGGCCCCTGACTTTGGTTGTTTA-3' )を設計した。「hSMBPl」に関しては、 Marathon -Ready cDNA, Kidney (Clontech社製）をテンプレートとし、「h SMBP1- 1」および「hSMBP卜 2」をプライマーとして用い、メーカ一推奨の方法（to uchdownPCR ： 94°Cで 1分、次いで 94°Cで 30秒， 72°Cで 4分， 5サイクル、次いで 94°Cで 30秒， 70°Cで 4分， 5サイクル、次いで 94°Cで 20秒， 68°Cで 4分， 25サイクル。ただし、 Advantage KlenTaq Polymerase Mixの代わりに、 TaKaRa Ex Taq (宝酒造社製）及び添付のバッファ一を用いた）で増幅反応を行った。これにより得られた DNAを制限酵素 EcoRIと BamHIで処理しプラスミド pCOSlの EcoRI-BamHIサイトにクローニングした（このプラスミドを「pC0S- hSMBPlj と命名した）。塩基配列決定に際しては hSMBPl内部に以下のプライマー（表 1 ) を合成し利用した。表 1 プライマ一名配列 hSMBPl-3 (配列番号 8) 5， -GACCCAAGCGATCTGGAGAGC-3'

hSMBPl-4 (配列番号 9) 5' -GGTGAAGTCGCGCCGCTTGAG-3'

hSMBPl-5 (配列番号 10) 5' -CTCAAGCGGCGCGACTTCACC-3'

hSMBPl-6 (配列番号 11) 5' -GGAAGCACTGAAGGATGA-3'

hSMBPl-7 (配列番号 12) 5， -CATCCTTCAGTGCTTCCT-3'

「hSMBP2」に関しては、 Marathon -Ready cDNA, Placenta (Clontech社製）をテンプレートとし、「hSMBP2- 1」及び Marathon -Ready cDNAに付属する AP- 1プライマー（配列番号： 13/5' -CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3' )を用い、メーカ一推奨の方法（touchdownPCR ： 94°Cで 1分、次いで 94°Cで 30秒， 72°Cで 4分， 5サイクル、次いで 94°Cで 30秒， 70°Cで 4分， 5サイクル、次いで 94°Cで 20秒， 68°Cで 4分， 2 5サイクル。ただし、 Advantage KlenTaq Polymerase Mixの代わりに、 TaKaRa Ex Taq (宝酒造社製）及び添付のバッファ一を用いた）で増幅反応を行った。これにより得られた DNAを制限酵素 EcoRIと BamHIで処理しプラスミド pCHOlの EcoRI-BamH Iサイトにクローニングした（このプラスミドを「pCH0- hSMBP2 A」と命名した）。その結果、「hSMBPl」はコーディング領域はカバーするものの内部に欠失のある cDNAが得られたため、多くのクローンを解析し全長を含むと考えられるクローンを 1個得ることに成功した。また、「hSMBP2」は N末端を含むクローンが得られなかったため、 N末の欠けたクローンをプローブとして、以下のようにヒト胎児心臓の； IgtlO ラィブラリ一からスクリ一二ングした。

Human fetal heart 5' -stretch plus cDNA library (Clontech社製)の 15万プラークから、 ExpressHyb Hybridization Solution (Clontech社製）を甩いてメ一力 —推奨の方法にしたがってスクリーニングを行った。プローブはプラスミド「pC

HO - hSMBP2A」を EcoRIと BajnHIで処理して得られる約 0.5kbの「hSMBP2」遺伝子断片用いた。その結果、 9個のポジティブクローンが得られそのうちの 1クロ一ンのィンサ一卜を人 gUO内の配列に基づいて合成したプライマー（GT10S1，GT10A1、表 2参照）によって増幅し、 EcoRIで処理した後 pCI- neoベクタ一（Promega社製）の EcoRI部位にサブクロ一ニングした。得られたクローンの塩基配列は、 ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit with Ampl itaq DNA Po lymerase FS及び 377 A DNA Sequencer (Perkin- elmer社製）を用い合成した以下のシークェンス用プライマ一（表 2 ) によって決定した。表 2 プライマ一名配列

GT10S1 (配列番号： 13) 5' -CTTTTGAGCAAGTTCAGCCT-3'

GT10A1 (配列番号： 14) 5' -AGAGGTGGCTTATGAGTATTTCTT-3' hSMBP2-2 (配列番号 15) 5' -GGAAATGCTGCTGAACGTG-3'

hSMBP2-3 (配列番号 16) 5' -GGGATGCCTCCAGAGGACT-3'

hS BP2-4 (配列番号 17) 5， -CCACGTTCAGCAGCATTTC-3'

hSMBP2-5 (配列番号 18) 5' -GGCATCCCTACCAGCAAAT-3' その結果、ほぼ全長を含むクローンを 3個得た。得られたクローンの塩基配列の解析から rhSMBPlj は 195アミノ酸からなり推定される分子量は 21643.90、「hSM BP2j は 223アミノ酸からなり推定分子量は 23817.09であった。予想された通りどちらのタンパク質も膜結合型のステロイドホルモン結合タンパク質のフアミリーであることが判明した。推定されるアミノ酸配列を並べると「hSMBPl」はブ夕 PM BPと非常に高いホモロジ一を示し、ヒトのホモログであると考えられた（図 1 )。なお、「hSMBPl」に関しては、同一遺伝子がハイデルベルグ大学により登録されていた（Ac Y12711) 。但し、それとの比較により、「hSMBPl」のコーディング領域内には PCRエラ一と考えられる 2塩基の相違があることが判明した。一方、「hSMBP2」は C近傍は「hSMBPl」とよく似ているものの N末端付近は他のファミリ一タンパク質よりも長く、またホモロジ一も低いため他のステロイドに結合する膜結合型のタンパク質であると予想された。疎水性プロット解析（図 2 )ではどちらも N末端近傍に疎水性領域が存在し、マイクロゾーム画分への局在に関与していることが予想された。

[実施例 2 ] 「hSMBPl」および「hSMBP2」の各種組織における発現の解析「hSMBPl」プローブは「pC0S- hSMBPlj を EcoRI-BamHI処理して得られた約 600b Pの断片を用い、また「hSMBP2」プローブは「pCH0- hSMBP2A」の EcoM-BamHI処理して得られた約 600bpの断片を用いた。これらのプローブを Ready- to Go DNA lab ell ing beads (Phannacia社製）を用いたランダムプライマ一法により [ひ-^{3 2} P]dC TPラベルし、 Multiple Choice Northern Blot (Human) #1 , #6 (OriGene Techno logies社製)のフィル夕一に対し ExpressHyb Hybridization Solution (Clontech 社製）中でメーカー推奨の方法に従ってハイプリダイゼーシヨンを行った。その結果、「hSMBPl」は調べた全ての組織で検出されたが、特に肺、小腸、前立腺、精巣、卵巣、脳、腎臓、肝臓で強く発現し、筋肉、心臓、脾臓、リンパ球での発現は少なかった（図 3 A )。一方、「hSMBP2」も調べた全ての組織で検出され特に卵巣、腎臓、肝臓、リンパ球での発現が高く、脳、心臓、脾臓での発現は少なかつた（図 3 B )。

[実施例 3 ] 「hSMBP2」のインビトロトランスレ一シヨン（in vitro transla tion)

得られた hSMBP2の cDNAを、合成したプライマ一「hSMBP2-ATG」（配列番号： 19 /AAGAATTCCACCATGGCGGCTGGTGATGGGGACGT) および「hSMBP2MIC」 (配列番号： 20 /CCGAATTCAATGATGATGATGATGATGCAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTCATCCTGTTTATTG TGATCCTT) で PCRを行い、制限酵素 EcoRIで処理した後、プラスミド pC I- neo (Pro mega社製）の EcoRI部位に挿入し、プラスミド「pC I - hSMBP2MIC」を得た。このべクタ一は N末端上流に T7プロモーターを持ち、また発現するタンパク質の C末端には抗 Myc抗体で認識される MI Cェピトープと 6個の Hi sからなる HisTagが付加してある。該ベクタ一を Single Tube Protein System 2 (Novagen社製）のプロトコールに従い、インビトロトランスレーシヨンを行った後、ゥサギ抗 c- mic抗体（Santa cruz社製）と ProteinA Fast Flow (Pharmac ia社製) で免疫沈降を行い、 SDSサンプルバッファーで溶出した。免疫沈降上清液と得られたサンプルに対し SDS- PAGE を行い、 PVDF膜（Bio- Rad社製）に転写し、マウス抗 c- Mycモノクローナル抗体、およびアル力リフォスファタ一ゼの結合した抗マウス IgG抗体を用いて発色を行つた。その結果、免疫沈降上清や、逆向きに hSMBP2遺伝子を挿入した免疫沈降では何も検出されず、正しく遺伝子が挿入された免疫沈降物のレーンにのみ見かけの分子量約 32000のバンドが検出された。このことより、インビトロでの hSMBP2遺伝子の発現が確認された。なお、計算上の分子量より 6000程大きめの移動度を示しているのは、 HisTagを付加した影響と考えられる。産業上の利用の可能性

本発明のステロイドホルモン結合タンパク質は、従来の核内転写調節型の受容体とは異なり膜結合型であると考えられ生体において核内転写調節型の受容体とは異なるメカニズムによりホルモン作用を調節していると考えられるため、本発明のステロイドホルモン結合タンパク質を標的として、例えば、ステロイドホルモンに対する核内転写調節型受容体との結合親和性の差を利用した副作用の少ない薬剤の開発などが可能である。それにより、アレルギーや自己免疫疾患等の免疫関連新規治療薬の開発ゃステロィド依存性悪性腫瘍治療薬の開発等への応用が可能である。

Claims

求の範囲

1 . 配列番号： 4に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。

2 . 配列番号： 4に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、および/もしくは付加したアミノ酸配列からなり、ステロイドホルモンとの結合活性を有するタンパク質。

3 . 請求項 1または 2に記載のタンパク質をコードする DNA。

4 . 請求項 3に記載の DNAが挿入されたべクタ一。

5 . 請求項 4に記載の DNAを発現可能に保持する形質転換体。

6 . 請求項 5に記載の形質転換体を培養する工程を含む、請求項 1または 2に記載のタンパク質の製造方法。

7 . 請求項 1に記載の夕ンパク質に結合する抗体。

8 . 請求項 1または 2に記載の夕ンパク質に被検試料を接触させ、請求項 1または 2に記載のタンパク質に結合する化合物を選択する工程を含む、請求項 1または 2に記載のタンパク質に結合する化合物のスクリーニング方法。

9 . 請求項 1に記載のタンパク質に結合する化合物。

1 0 . 請求項 8に記載の方法により単離しうる請求項 9に記載の化合物。

1 1 . 請求項 1若しくは 2に記載のタンパク質および核内転写調節型のステロィドホルモン受容体のそれそれに被検試料を接触させ、請求項 1若しくは 2に記載のタンパク質または核内転写調節型のステロイドホルモン受容体のいずれかに特異的に結合する化合物を選択する工程を含む、請求項 1若しくは 2に記載の夕ンパク質または核内転写調節型のステロイドホルモン受容体のいずれかに特異的に結合する化合物のスクリーニング方法。

1 2 . 請求項 1若しくは 2に記載のタンパク質または核内転写調節型のステロィドホルモン受容体のいずれかに特異的に結合する化合物。

1 3 . 請求項 1 1に記載の方法により単離しうる請求項 1 2に記載の化合物。

1 4 . 配列番号： 3に記載の塩基配列からなる DNAに特異的に少なくとも 15ヌクレオチドの鎖長を有する DNA。