WO1999014325A1 - NOUVEAU DERIVE DU LIGAND Fas - Google Patents

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WO1999014325A1
WO1999014325A1 PCT/JP1998/004187 JP9804187W WO9914325A1 WO 1999014325 A1 WO1999014325 A1 WO 1999014325A1 JP 9804187 W JP9804187 W JP 9804187W WO 9914325 A1 WO9914325 A1 WO 9914325A1
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fasl
fas
cells
soluble
membrane
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PCT/JP1998/004187
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Inventor
Shigekazu Nagata
Masato Tanaka
Original Assignee
Mochida Pharmaceutical Co., Ltd.
Osaka Bioscience Institute
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70575—NGF/TNF-superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/525—Tumour necrosis factor [TNF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a Fs ligand capable of controlling apoptosis involved in various diseases.
  • F as ligand includes F as L, TNF, lymphotoxin, TRAIL (TNF-related apoptosis-inducing ligand), CD40 ligand (CD40L), and CD27 ligand (CD27L), CD30 ligand (CD30L), and tumor necrosis factor (TNF) family containing 0X40 ligand ( ⁇ X40L) (Nagata, Cell, 88, 355) -365, 1997; Iri et al., I thigh, 3, 673-682, 1995).
  • the majority of the TNF family other than the alpha chain of lymphotoxin is synthesized as a type II membrane protein.
  • Fas L, TNFa, and CD40L are found in the culture supernatant of cells expressing these molecules, and these members of the TNF family are cleaved (excised) from the membrane (Pele et al., Cell, 63, 251-258, 1990; Pietravale et al., J. Biol. Chem., 271, 5965-5967, 1996b; Tanaka et al., EMBO J., 14, 1129-1135, 1995).
  • Meta-oral proteases like TNF ⁇ , block the release of FasL, so that meta-oral proteases are involved in the production of membrane-bound FasL and soluble forms of TNF ⁇ .
  • F as L is a member of the TNF receptor family, and causes apoptosis by binding to its receptor F as, also called CD95 or AP 0-1.
  • F asL is mainly expressed on activated T cells as well as natural killer cells (NK) (Arase et al., J. Exp. Med., 181, 1235-1238, 1995; Suda et al., J. I. Tanaka et al., Nature Med. 2, 317-322, 1996), while Fas is ubiquitously expressed in various cells (French et al., J. Cell. Biol. 335-343, 1996; Lasernsa et al., Lab. Invest. 69, 415-429, 1993; Suda et al., J.
  • NK natural killer cells
  • CTL cytotoxic T lymphocyte
  • FasL-induced apoptosis may be involved in CTL-mediated autoimmune diseases such as hepatitis, insulin-dependent diabetes mellitus, and thyroiditis (Hashimoto's disease) (Sherbonsky et al., Cell 89 Giordano et al., Sience, 275, 960-963, 1997; Conte et al., Nature Med., 3, 409413, 1997).
  • Soluble human FasL has the function of inducing apoptosis in mouse WR19L cell transformants that at least overexpress Fas (Tanaka et al., EMB0 J., 14, 1129). -1135, 1995). Soluble Fas L is highly expressed in the serum of patients with NK lymphoma, T and NK-type large granular leukemia (Tanaka et al., Nature Med. 2, 317 322, 1996). Because these leukemia patients often present with hepatitis and neutropenia, it is postulated that the soluble form of FassL causes systemic tissue destruction, as seen with TNF.
  • the present inventors purified human FasL from the culture supernatant of the expressing mouse T cell transformant. By analyzing its N-terminal sequence, the present inventors determined the cleavage site of human FasL. I was able to determine. The amino acid deletion mutation near the cleavage site completely inhibited the cleavage of membrane-bound FasL. The strength that the human germ-cut T cell line and mouse hepatocytes were found to be rather resistant to soluble FasL were efficiently killed by the membrane-bound FasL. In addition, soluble FasL inhibits membrane-bound FasL-induced cell damage to hepatocytes. These results suggest that the release of FasL from the plasma membrane down-regulates the cytotoxic activity of FasL.
  • the present invention is intended to provide a soluble Fas ligand that functions as a Fas antagonist or apoptosis regulator, a novel Fas ligand derivative excellent in apoptosis-inducing activity or cytotoxicity, and a DNA encoding the peptide. I do.
  • Fas ligand is a type II membrane protein that belongs to the tumor necrosis factor (TNF) family and induces apoptosis by binding to the receptor, Fas.
  • F as L is cleaved by a putative processing enzyme, meta-oral protease, resulting in a soluble form.
  • the present inventor purified human soluble FasL from the supernatant of a transformant of a mouse cell expressing human FasL, and identified the cleavage site. Deletion of 4 to 23 amino acids near the cleavage site prevented the release of human FasL from the membrane. The activity of inducing apoptosis was retained.
  • the present invention relates to an As ligand derivative that is resistant to, or resistant to, or has reduced sensitivity to proteases (protease), specifically, from the N-terminus of natural human Fas ligand.
  • the amino acid at position 13 to amino acid 13 was deleted or substituted, and at least one of the amino acids at positions 11 to 12 and 11 to 13 was deleted or substituted. It consists of an amino acid sequence or a sequence in which the 8th to 69th amino acids have been deleted.
  • a novel Fas ligand derivative containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or 2, and a DNA encoding these novel Fas ligand derivatives are provided.
  • the present invention provides a soluble Fas ligand which functions as a Fas antagonist or apoptosis regulator, and an apoptosis-regulating agent containing the soluble Fas ligand, and administers these.
  • the present invention provides a method for the prevention and treatment of a disease associated with.
  • FIG. 1 is a diagram showing a purified human soluble form of the Fas ligand.
  • (A) shows the results of analysis by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
  • (B) is a graph showing the cytotoxic activity of soluble Fas L.
  • FIG. 2 is a schematic diagram of the construction of FasL having a deletion or point mutation.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of immunological detection of human FasL in transformants.
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of expression of FasL on the cell surface.
  • FIG. 5 is a graph showing the results of cytotoxicity of mouse W4 cells that overexpress Fs of membrane-bound FassL.
  • FIG. 6 is a view showing the results of increased cytotoxic activity of membrane-bound FasL on human jerkat cells.
  • Fig. 7 shows the cytotoxic activity of soluble FasL on hepatocytes, (B) shows the cytotoxic activity of FasL on mouse hepatocytes, and (C) shows the soluble cytosolic activity. It is a figure which shows the cytotoxic activity result of membrane-bound FasL by FasL.
  • the novel FasL derivative according to the first aspect of the present invention is a Fas ligand derivative or mutant that is resistant to, or resistant to, or has reduced sensitivity to proteases.
  • the protease is particularly a meta-oral protease, and / or a protease having an action of releasing cell membrane-bound FasL from cells in vivo or in a test tube, that is, a processing enzyme.
  • It is a Fas ligand derivative.
  • those having some kind of amino acid residue mutation at or near the cleavage site of natural membrane-bound Fas L by the processing enzyme for example, deletion, substitution or insertion of one or more amino acids, As described above, for example, those having a deletion of 4 or more amino acids are preferable.
  • the novel FasL derivative of the present invention requires a minimal active portion required for Fas binding and no or apoptosis-inducing ability in the extracellular region of FasL. It preferably contains a membrane-bound region having a binding property to a membrane such as a cell membrane under physiological conditions. However, as shown in Examples, at least the entire intracellular region is not essential. The connection between the extracellular region and the membrane-bound region may be direct or indirect via a linker peptide or the like.
  • the transmembrane region does not necessarily need to be derived from natural FasL, and in some cases, may be a membrane-binding substance other than a polypeptide, or may have other functions, such as multimerization ability. Substances may be combined.
  • the membrane to be bound includes ribosomes in addition to the cell membrane.
  • amino acids at positions 129 to 130 from the N-terminus of a natural human Fas ligand are deleted or substituted;
  • Amino acid sequence in which at least one of amino acids 11 to 12 and 13 to 13 is deleted or substituted, or amino acids 8 to 69 are deleted It consists of a sequence that is Preferably, the sequence of SEQ ID NO: 1, or a sequence in which the 8th to 69th amino acids have been deleted (hereinafter referred to as D4), and the sequence of SEQ ID NO: 2, or 8 to 69th thereof (Hereinafter referred to as D5).
  • SEQ ID NO: 1 or D4 is the deletion of the 23rd amino acid at positions 11 to 133 from the N-terminus of the natural human Fas ligand
  • SEQ ID NO: 2 or D5 is the natural human G-Fas ligand in which the 128th to 31st 4-amino acids have been deleted from the N-terminus.
  • SEQ ID NO: 2 or D5 is the natural human G-Fas ligand in which the 128th to 31st 4-amino acids have been deleted from the N-terminus.
  • the amino acids at positions 129 to 130 from the N-terminus of the natural human Fas ligand shown as a specific example above are deleted or substituted, and the amino acids at positions 111 to 128, 131
  • the Fas ligand derivative of the present invention which is the sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or D5
  • amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2 has four sites to which a sugar chain can be added (N-glycosylation site).
  • amino acid numbers 76 to 78, 180 to 182, 246 to 248, and 256 to 258 correspond to the sites to which a sugar chain can be added.
  • a sugar chain may be added at this position.
  • the Fas ligand derivative of the present invention is produced by genetic engineering using eukaryotic cells such as yeast or animal cells as a host, a sugar chain may be added.
  • a sugar chain may be added.
  • the membrane-bound Fas ligand derivative of the present invention is produced by genetic engineering using a prokaryotic cell such as Escherichia coli as a host, no sugar chain is added.
  • the Fas ligand derivative of the present invention can be used for inducing apoptosis and removing cells unnecessary for a living body.
  • the Fas antigen is expressed in AIDS virus-infected cells
  • the Fas ligand derivative of the present invention can be used in the early stage of AIDS virus infection to artificially induce apoptosis and induce infected cells early.
  • the Fas ligand derivative of the present invention removes autoantigen-reactive T cells by artificially causing Fas antigen-mediated apoptosis against certain autoimmune diseases. be able to.
  • the Fas ligand derivative of the present invention can be used for treating cancer. Morimoto H. and others have shown that by inducing apoptosis via the Fas antigen in cancer cells, the anticancer effect of adriamycin and cisbratin is synergistically enhanced. (Cancer Res., 53, 2591-2596, 1993).
  • the soluble Fas ligand according to the second aspect of the present invention has at least one part of a natural Fas ligand, and is soluble in an aqueous solution without using a surfactant or the like.
  • a Fa antagonist There is no particular limitation as long as it functions as a Fa antagonist or has an apoptotic regulation action.
  • the term “Fas antagonist” is to be referred to as a “Fas / Fas ligand antagonist”. Mediated apoptosis.
  • the soluble Fas ligand of the present invention has at least a part of a natural Fas ligand, and is soluble in an aqueous solution without using a surfactant or the like. Interact with and compete with native FasL, May cause down-regulation of Fas.
  • a soluble Fas ligand include those comprising at least a part of the extracellular region of the Fas ligand, and preferably, G1n at the 130th position from the N-terminus of the human natural Fas ligand.
  • Peptides consisting of the amino acid sequence from to the C-terminus are exemplified.
  • native membrane-bound Fas ligands and polypeptides that are cleaved by meta-oral proteases in vivo or in vitro into soluble Fas ligands, like native membrane-bound Fas ligands, are: It is used as a precursor of the soluble Fas ligand of the present invention.
  • soluble Fas ligand suppresses FasL, in particular, membrane-bound FasL-induced cell damage, that is, acts as a Fas antagonist or apoptosis regulating substance to suppress apoptosis.
  • the inventors have found that the present invention inhibits or modulates the present invention, and completed the present invention.
  • FsL-induced apoptosis can be treated and prevented.
  • Also provided are a method for suppressing or regulating F a s function or apoptosis using soluble F a L, and an apoptotic antagonist or modulator containing a soluble F a L.
  • FasL-induced apoptosis has been implicated in CTL-mediated autoimmune diseases such as hepatitis, insulin-dependent diabetes, and thyroiditis (Hashimoto's disease).
  • CTL-mediated autoimmune diseases such as hepatitis, insulin-dependent diabetes, and thyroiditis (Hashimoto's disease).
  • apoptosis-related diseases include, for example, a decrease in immune function at the late stage of AIDS virus infection, which is thought to result from a marked decrease in tissue function due to apoptosis of immunocompetent cells or hepatocytes. In fulminant hepatitis Liver function decline.
  • diseases associated with apoptosis include heart disease,
  • GVHD GVHD
  • kidney disease ischemia-reperfusion injury-based disease
  • organ injury-based disease GVHD, kidney disease, ischemia-reperfusion injury-based disease, and organ injury-based disease.
  • examples of the heart disease include ischemic heart disease such as myocardial infarction, myocarditis due to various causes, cardiomyopathy, particularly dilated cardiomyopathy, heart failure, and ischemia reperfusion injury and heart disease based thereon;
  • ischemic heart disease such as myocardial infarction, myocarditis due to various causes, cardiomyopathy, particularly dilated cardiomyopathy, heart failure, and ischemia reperfusion injury and heart disease based thereon
  • GVHD occurring after bone marrow transplantation such as incompatible bone marrow transplantation and bone marrow transplantation for congenital immunodeficiency disease
  • GVHD occurring after organ transplantation
  • GVHD occurring after blood transfusion such as massive blood transfusion to immunocompromised hosts.
  • Ischemia-reperfusion injury includes ischemia-reperfusion injury and diseases based on liver, heart, kidney, lung, spleen, small intestine, large intestine, stomach, kidney, brain, muscle, skin, etc. , Liver insufficiency, reperfusion arrhythmia, renal insufficiency, necrotizing enteritis, and other organ damage and dysfunction.
  • diseases associated with apoptosis include the above-mentioned diseases based on ischemia-reperfusion injury, allergic contact dermatitis, rheumatoid arthritis, and the like, and furthermore, MODS associated with SIRS.
  • diseases involving apoptosis include not only the acute phase but also chronic disorders in organ damage due to endotoxin, particularly liver damage or endotoxinemia or sepsis.
  • diseases involving apoptosis include, in the liver, during surgical operations such as transplantation, or when hepatic blood flow (blood supply) is reduced due to shock and circulatory insufficiency, or when ischemia-reperfusion injury occurs during blockage.
  • liver failure and tissue damage and hepatic function decline are mentioned.
  • thrombus for myocardial infarction As a result of lysis, reperfusion after percutaneous intracoronary thrombolysis (PTCR) or percutaneous coronary lumen dilatation (PTCA), irreversible cell death due to overload of intracellular calcium ions, etc. Fatal arrhythmias.
  • glomerular endogenous cells endothelial cells, epithelial cells, mesangial cells, mesangial matrix, extracellular matrix of basement membrane Or disorders such as tubular epithelial cells.
  • the soluble Fas ligand and the Fas ligand derivative of the first and second aspects of the present invention can be used in a pharmaceutical composition.
  • a pharmaceutical carrier or medium such as sterile water or physiological saline, vegetable oil, mineral oil, higher alcohol, higher fatty acid, harmless organic solvent, etc., and, if necessary, excipients, coloring Agents, emulsifiers, suspending agents, surfactants, dissolution aids, anti-adsorption agents, stabilizers, preservatives, humectants, antioxidants, buffers, isotonic agents, soothing agents, etc.
  • a pharmaceutical composition kit such as an injection or an oral preparation.
  • the prophylactic / therapeutic agent of the present invention is preferably administered parenterally, for example, by intravenous injection, intracoronary injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection, etc., systemically or locally, and rapidly or continuously. Can be administered in a controlled manner.
  • the dose of the prophylactic / therapeutic agent of the present invention to humans varies depending on the disease state, age and administration method of the patient, but it is necessary to select an appropriate amount as appropriate. For example, in the case of systemic administration, an appropriate divided dose can be selected within the range of about 0.1 to 100 mg / kg.
  • the use of the pharmaceutical composition is not limited to these administration methods and dosages. Further, they may be used in combination with other drugs.
  • the Fas ligand of the first and second aspects of the present invention can be formulated according to a conventional method.
  • the preparation for injection is prepared by dissolving the purified Fas ligand of the first and second embodiments of the present invention in a solvent, for example, a physiological saline solution or a buffer solution, and optionally adding an anti-adsorption agent and the like.
  • Additives or lyophilized for reconstitution before use can be used, and common excipients for lyophilization can be used.
  • the Fs ligand of the first and second aspects of the present invention may be produced by any method.
  • chemical synthesis may be carried out using a peptide synthesizer (for example, Peptide Synthesizer-1430A, manufactured by PerkinElmer Japan KK).
  • a cell producing the novel polypeptide of the present invention can be appropriately selected and used. For example, spleen cells, thymocytes, lymphoid cells, and their cell lines are analyzed by Northern blot or Western blot, and those with high expression of the novel polypeptide of the present invention are analyzed. select.
  • cells can be transformed with PMA (phorbol myristate acetate) diiomycin, PHA (phytohemagglutinin), C on A (concanapalin A), IL-12 (interleukin-2), etc.
  • the polypeptide may be purified from cells or culture supernatant by stimulating with one or more suitable stimulants selected from stimulants to induce production. Purification is performed by appropriately combining commonly used methods for purifying polypeptides, such as concentration, various types of chromatography, and salting out, to bind to Fas antigen or to cells expressing Fas antigen.
  • Obstacle 9
  • the Fas ligands of the first and second aspects of the present invention are preferably those produced by genetic engineering, that is, recombinant polypeptides, in view of their purity.
  • the recombinant gene is obtained by incorporating the cDNA of the Fas ligand of the first and second aspects of the present invention or the DNA of the present invention into an appropriate vector, An appropriate host cell is transformed with the recombinant gene, the obtained transformant is cultured, a culture mixture is recovered, and the polypeptide is purified.
  • a method for synthesizing a cell-free system using the DNA or the recombinant DNA molecule (Sambrook, J. et al .: Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, New York) York (1989)).
  • the novel DNA of the third aspect of the present invention encodes the novel Fas ligand derivative of the present invention, particularly the amino acid sequence described in SEQ ID NOS: 1 or 2, or D4 and D5.
  • the DNA of the present invention may be of any sequence as long as it encodes the novel Fs ligand derivative of the present invention. It is known that there are 1 to 6 types of triplets of DNA encoding the same amino acid for each type of amino acid, and the nucleotide sequence encoding the same peptide is limited to one type. None, but any of these may be used.
  • the DNA of the present invention may be a cDNA or a chromosomal DNA having an intron, as long as it contains a nucleotide sequence encoding the novel Fas ligand derivative of the present invention.
  • the novel DNA of the present invention may be cDNA because of its ease of use in genetic engineering techniques, such as its ability to work, its power, and its ease of guiding to vectors. Preferred examples include those having the nucleotide sequences described in SEQ ID NOs: 4, 5, and 6.
  • novel DNA of the present invention may be single-stranded or may form a double or triple chain by binding to DNA or RNA having a sequence complementary thereto.
  • the sequence of the RNA, the complementary DNA and the sequence of the RNA are uniquely determined.
  • the DNA of the present invention can be used to produce the novel Fs ligand derivatives of the present invention using recombinant DNA technology. That is, the DNA of the present invention is inserted into an appropriate expression vector having a sequence necessary for expression of a promoter sequence and the like at an appropriate position, and transformed into an appropriate host cell with this vector. The transformant can express the novel Fas ligand derivative of the present invention. Further, the novel DNA of the present invention is incorporated into an appropriate vector and administered, for example, gene therapy for diseases in which apoptotic mechanism is genetically deficient, such as cancer, viral diseases, and autoimmune diseases. Can also be used.
  • cell therapy can also be performed by transforming a cell line or a cell taken out of a living body with the DNA of the present invention and returning it to the living body. Further, it can be used for producing a transgenic animal for providing an organ or tissue for transplantation that expresses a FsL derivative.
  • novel DNA of the present invention can be used for the development of an antisense drug, used for producing a model animal of a disease involving apoptosis such as transgenic mice, or labeled with an enzyme or the like. By examining the expression status of the Fas ligand and its derivative in tissues, it can be used for diagnosis of a disease involving apoptosis.
  • the novel DNA of the present invention can be obtained from chemical synthesis or from a DNA library. The chemical synthesis of the novel DNA of the present invention may be performed, for example, as follows.
  • DNA having a desired nucleotide sequence is divided into fragments of about 20 bases and synthesized using a DNA chemical synthesizer (for example, Model 394, manufactured by PerkinElmer Japan Co., Ltd.).
  • the 5 'end is phosphorylated according to the above, each fragment is annealed and ligated to obtain the desired DNA.
  • an appropriate genomic DNA library or cDNA library is screened by a screening method using hybridization, an immunoscreening method using an antibody, or the like. There is a method in which a clone having the desired DNA is grown and cut out therefrom using restriction enzymes or the like.
  • novel DNA of the present invention can also be obtained by PCR (Polymerase Chain Reaction) using a genomic DNA library or a cDNA library as type II.
  • a hamster anti-human Fas L monoclonal antibody (cl on e4H9) is described in Tanaka et al., Nature Med. 2, 317-322, 1996.
  • the conjugated antibody was covalently bound to the beads by incubation with 2 OmM dimethinolepimerimidate (DMP) dissolved in 200 mM sodium borate buffer.
  • DMP dimethinolepimerimidate
  • a mouse WR19L cell transformant (1A12 cell) expressing human FasL was described in Tanaka et al., Nature Med. 2, 317-322, 1996.
  • 1A12 cells (1 ⁇ 10 5 cells Zm 1) were cultured in RPM 1 1640 medium supplemented with 5% FCS for 3 days, and about 2 L of medium was collected. Protein in the medium was collected by ammonium sulfate precipitation (50-70%) and dialyzed against PBS. The protein was then applied to a column (1 ml) of anti-FasL antibody conjugated Protein A Sepharose equilibrated in PBS.
  • the column was washed with 50 mM Tris-HC1 buffer containing 150 mM NaCl, 20 ml of pH 8.6, and 1 Fas L adsorbed on the force column. It was eluted with 50 mM glycine HC1 buffer (pH 2.2) containing 50 mM NaC1. The eluate was immediately neutralized with 1 MT ris-HCl (pH 7.5), dialyzed against PBS, and concentrated using Centricon (Amicon).
  • N-terminal amino acid sequence was determined by Edman degradation at the request of Takara Shuzo Co., Ltd.
  • p BOSHFLD 1 An expression plasmid (p BOSHFLD 1) for human FasL lacking the intracellular domain (amino acids 8 to 69) was described in Naka Meda et al., Nature Med. 2, 317 322, 1996.
  • Recombinant PCR using pBOSHF LDl as the type ⁇ expression plasmid for human FasL mutants with a series of deletions and point mutations at the cleavage site (PB0SHF LD4, pB0SHF LD5, p B0SHFLD 6) Force Made.
  • pBOSHFLD4 lacking the amino acid at position 113
  • the 5 'portion of the FasL cDNA was replaced with the sense primer of the pEF BOS vector (BOS6; C CTC AGACAGTGG TTCAAAG) (Mizushima, Nagata, Nucleic Acids Res., 18, 5322, 1990) and antisense deletion primer (DA4; TTTTC AGGGGGTGGAC TGGGCTC CTTCTGTAGGTGGAAG, human Fas L) 105—110 And the sequence encoding amino acids 134-139).
  • the 3 'portion of the cDNA was a sense primer (DS4) complementary to the DA4 primer and a primer (HFLP) containing the sequence of the 3' non-coding region of the Fas L cDNA.
  • the PCR conditions were Takahashi et al. Cell, 76, 969-976, 1994.
  • the first PCR product was purified by agarose gel electrophoresis, mixed 1: 1 and then seconded with primers BOS6 and HFLP3. Amplified in the second PCR.
  • the obtained DNA fragment was digested with XbaI and transferred to pEF-BOS vector. Other deletions and point mutations were made in a similar manner using the following oligonucleotides as primers.
  • PBOSHFLD 5 deletion of amino acid at 128-131
  • DA5 TGGACTGGGGTGGCCCAAAG ATGATGCTGT
  • DS5 primer complementary to DA5
  • pBOSHF LD6 Lys For —129 replace A 1 a
  • DA 6 GGGGTGG CCTATTTGTGCCTCCAAAGATGATGC
  • DS 6 primer complementary to DA 6
  • Mouse WR19L cells were cotransfected with pPUR and an expression plasmid containing a pumamycin resistance gene (Clontech) using Electroporation (Ito et al., Cell, 66, 233-243, 1991).
  • Puromycin-resistant transformants were selected with 800 ng / m1 puromycin and transformants expressing human FasL were cloned using a biotinylated anti-human FasL antibody for flow cytometry. Selected by FACS analysis using (4H9) and PE-labeled streptavidin (Becton Dickinson).
  • the cytotoxic activity of human soluble FasL on Fas-expressing W4 cells and jerk cells was determined by the MTT method as described in Tanaka et al., EMBO J., 14, 1129-1135, 1995.
  • F the as expressing W4 cytotoxicity of F the as L expression transformant for cell and Jaka' DOO cells Suda, etc. Basically, Cell, 75, 1169 - 1178 , 1993 as described in 51 C r Determined by one-release analysis.
  • W4 and Jerkat cells (1 ⁇ 10 4 ) are labeled with 51 Cr and have various ratios. It was mixed with the FasL transformant. After a 4 hour incubation at 37 ° C, specific release of 51 Cr from target cells was measured.
  • cytotoxic activity of soluble FasL and FasL transformants on primary hepatocytes was measured as follows.
  • Mouse hepatocytes were prepared from 11-week-old female C 3 H / He mice (SLC, purchased from Shizuoka) as described by Adachi et al., Nature Genet. 11, 294-300, 1995.
  • Hepatocytes (1 X 1 0 5) is planted in play Bok of 4 8-hole which is co Bok at 0. 0 3% I collagen, and cultured in 24-hour in DMEM containing 5% FCS.
  • Hepatocytes were incubated with soluble FasL or FasL transformants at 37 ° C for 22 hours.
  • the concentration of GOT released into the medium was measured using a transaminase CII kit manufactured by Wako Chemical.
  • FasL transformants were cultured in PRMI 1640 medium containing 10% FCS, and FasL and cell lysates in the medium were analyzed by immunoprecipitation followed by western blotting.
  • cells were treated with 1% NP40, lmM [p_amino-phenyl] methanesulfonyl fluoride hydride chloride, l ⁇ g / ml pepstatin, and 1 Z g / m1 leupeptin. Lysis was achieved by incubation for 30 minutes on ice in TBS containing TBS. After centrifugation at 150,000 rpm for 20 minutes, the supernatant was collected for immunoprecipitation.
  • Protein A cell Faro Ichisu 4 FF beads (Pharmacia, Inc.) They were pre-absorbed and then incubated with protein A Sepharose modified with 10 ⁇ ⁇ 1 anti-FasL monoclonal antibody (4H9) at 4 ° C. Beads are 0.1 Washed carefully with TBS containing% NP40 and resuspended in 10 ⁇ 1 Remi-noresamprenole cuffer (Laemm 1i'ss amp lebuffer) without 3 mercaptoethanol.
  • the sample was electrophoresed on a 10-20% gradient polyacrylamide gel, and the protein was transferred to a PVDF membrane (Millipore) at 4 ° C and 30 V for 15 hours.
  • the FasL protein was detected by Western blotting using an anti-FasL polyclonal antibody, as described in Tanaka et al., EMBO J., 14, 1129 1135, 1995.
  • Table 1 shows the results of the production of the soluble form of human FasL by the wild type and the transformant expressing the mutant FasL.
  • Mouse WR 19 L cell transformant clones expressing wild-type, deletion mutants (D4, D5), or point mutations (D6) were cloned in the presence of 20 ⁇ M BB2116 3 7. Is 2 4 h incubation in C, and then 4 X 1 0 5 cells Zm 1 concentration without BB 2 1 1 6, and 2 4 hours at 3 7 ° C.
  • the cytotoxic activity of the supernatant was determined by comparing W4 cells with target cells. It was measured by performing MTT analysis. One unit of cytotoxic activity was defined as the dilution that conferred half maximal cytotoxic activity on 7.5 x 10 cells in 100/1.
  • FIG. 1 shows the purified human soluble form of the Fas ligand.
  • FIG. 1 shows the results of analysis by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
  • Purified soluble human Fas L (6 ⁇ g) was analyzed by electrophoresis on a 10-20% gradient polyacrylamide gel in the presence of 0.1% 803 and stained with Coomassie Prilian blue.
  • M molecular weight standard
  • kD kilodaltons
  • FIG. 2 shows a schematic diagram of the construction of a F as L having a deletion or point mutation.
  • FIG. 3 shows the non-release of soluble FasL by the human FasL deletion mutation.
  • the immunoprecipitates were analyzed by Western blotting using ⁇ heron anti-human FasL antibody as described above.
  • a size marker a molecular weight standard (manufactured by Amersham, Rainbow Marker 1) was electrophoresed in parallel, and the size of the standard protein was indicated in kilodaltons (KD).
  • FIG. 4 shows the expression of FasL on the cell surface.
  • Wild-type Fas L (clone 1A12 and 1F10), D4 mutant (clone 41B, 44D), D5 mutant (clone 59A and 5—2—21), or D 6 Transformants of mouse WR19L cells expressing the mutants (clones 61B and 61C) were grown in medium with and without (dashed line) 20 ⁇ MBB2116 (solid line). Cultured for hours. Cells were stained with a biotinylated 4H9 anti-human Fas L antibody and PE-labeled streptavidin and analyzed by flow cytometry presented as above.
  • FIG. 5 shows the killing power of mouse W4 cells that overexpress Fas of membrane-bound FasL.
  • the cytotoxic activity of parental WR19L cells (open circles) and cell transformants expressing wild-type (clone 1F10, closed circles) and D4 mutant (clone 44D, open squares) was 51 Using Cr-labeled W4 as a target, measurements were made at the effecta-Z target (EZT) ratios presented above.
  • FIG. 6 shows the increased cytotoxic activity of membrane-bound FasL on human jerkat cells.
  • Parental mouse WR19L cells (WR19L) and their transformants expressing wild-type (clone 1F10) or D4 mutant (clone 44D) were 20 ⁇ 21 1
  • the cells were cultured for 24 hours with 6 (filled circles) and without (open circles).
  • the human Tojakatsu preparative cells cells cytotoxic activity is 5 'labeled with C r to have use as targets, as described above, was measured in the presented E / T ratio.
  • FIG. 7 shows the reactivity of soluble and membrane-bound FasL of mouse hepatocytes.
  • A shows the cytotoxic activity of soluble Fas L on hepatocytes.
  • Primary mouse hepatocytes have 10 g / m1 cycloheximide (filled circles) and no (open circles) at the indicated concentration of human soluble Fas L at 37 ° C for 22 hours. Was done. After the incubation, the GOT concentration of the supernatant was measured using a kit. Total GOT activity was measured in cell lysates after lysing the cells with 0.1% NP-40. Specific damage was expressed as a percentage of the released G0T concentration relative to the total G0T activity.
  • FIG. B shows the cytotoxic activity of membrane-bound Fas L on mouse hepatocytes.
  • Mouse hepatocytes were incubated with WR19L cells (open circles) or D4 mutants (clone D44, open squares) at 37 ° C for 22 hours at the indicated E / T ratios . After incubation, lesion activity was measured as described above.
  • C shows membrane-bound F as L with soluble F as L Showed inhibition of cytotoxic activity.
  • the present inventors have previously established stable transformants (1A12Cell) that constitutively express human FasL.
  • the transformant expressed FasL on the cell surface and produced a soluble form of FasL in the medium (Tanaka et al., Nature Med. 2, 317-322, 1996).
  • 1A12 cells were cultured in PRM I medium containing 5% FCS, and FasL was a protein immobilized with anti-FasL antibody (4H9). Affinity purified on A Sepharose. Approximately 200 g of purified Fas L was obtained from 2,000 ml of the condition medium.
  • polyacrylamide gel electrophoresis of purified Fas L shows a single band at a molecular weight of 26,000, which is produced by activated human peripheral blood lymphocytes. It resembled the soluble form of F as L (Tanaka et al., EMB0 J., 14, 1129-1135, 1995).
  • F the as L is analyzed F the as expression mouse W4 cells as the target, it has specific activity of 2 XI 0 7 U / mg, which is basically P ichia P It was the same as the recombinant soluble FasL produced by astoris (Yunaka et al., Immunol., 158, 2303- 2309, 1997).
  • Human Jurkat cells express endogenous Fas and are susceptible to anti-Fas antibody-induced apoptosis (Takahashi et al., Eur. J. Immunol., 23, 1935-1941, 1993).
  • the cytotoxic activity of soluble Fas L was analyzed targeting jar cells. Showed very weak activity. That is, only 30% of the soluble FasL cells can be killed by 1 1g / m1 force for 15 hours, and the Jerkat cells can be dissolved under the same conditions. Is more than 1000 times insensitive to mouse W4 cells.
  • the protein was electrophoretically separated on polyacrylamide and transferred to a PVDF membrane in order to determine the amino acid sequence of the N-terminal of the purified soluble form of Fab L.
  • Purified 26 kDa tanno in an automated sequencer, by Edman degradation. Analysis of the protein showed a single sequence of Gin—I1e—Gly—His—Pro—Ser—Pro—Pro. This sequence corresponded exactly to amino acids 130-137 of human FassL. From these results, the present inventors concluded that human 33 synthesized as a membrane-bound form was cleaved between 73-129 and 01-130 to become a soluble form.
  • each transformant was cultured in a medium containing the meta-oral protease inhibitor BB2116 for 24 hours. It was then transferred to medium without the inhibitor. After culturing them for 24 hours, the FsL activity and the FasL protein in the culture supernatant were analyzed. As shown in Table 1, the transformant of FasL having the original cleavage site secreted soluble FasL into the medium at a high concentration.
  • the 23 amino acid deletion mutant gene transformant (CD4) at the cleavage site did not show any FasL activity, and the 4 amino acid deletion mutant transformant (CD5) hardly produced any cytotoxic activity.
  • a point mutation from Lys to A1a at 11 still produced a soluble form of FasL.
  • the culture supernatant and cell lysate of the transformant were then immunoprecipitated with an anti-human Fas L monoclonal antibody (4H9), and the immunoprecipitation was analyzed by Western blotting using an anti-human Fas L polyclonal antibody.
  • FIG. 2B cell lysates from each of the FasL transformants showed a major band of 32-35 kDa, which was expected from the size of the deletion.
  • FasL expression on the cell surface was examined by flow cytometry. As shown in FIG. 4, when cultured in the presence of BB2116, all transformants expressed high concentrations of FasL on the cell surface. When transformants expressing wild-type strains or substitution mutants were cultured without BB2116, the expression level of FasL on the cell surface was significantly reduced (about 1 / 10th). On the other hand, transformants with deletion mutations (CD 4 and CD 5) are the same Under the conditions, little Fas L was lost from the cell surface.
  • the present inventor investigated whether or not a membrane-bound FassL that does not produce a soluble FassL has a function.
  • transformants expressing cleavable or non-cleavable FasL show comparable cytotoxic activity to W4 cells, asL was active, indicating that deletion of a few amino acids at the cleavage site did not affect the ability of FasL to bind to Fas and induce apoptosis.
  • cytotoxic activity of these transformants was examined using jerkat cells as targets.
  • a transformant expressing a non-mutated FasL was used as an effector, the cytotoxic activity was very low.
  • D4 transformants expressing non-cleavable FasL were used as effectors, they efficiently killed Jurkat cells.
  • the reactivity of Jurkat cells with membrane-bound FasL is comparable or slightly lower than W4 cells. In other words, about 50% of W4 cells are specifically killed at an E / T ratio of 5.0, while more than 20% of Jurkat cells are killed at an EZT ratio of 3.0.
  • soluble FasL In order to confirm that the cytotoxic activity of membrane-bound Fas L was stronger than that of soluble Fas L, the present inventors also used primary mouse hepatocytes as targets.
  • Mouse hepatocytes express the Fas receptor and are killed by the agonistic anti-Fas antibody, Jo2, in the presence of cycloheximide (Knee et al., Exp. Cell Res., 215, 332). -337, 1994). Similar results were obtained when soluble FasL was used as a cytotoxic effector. In other words, soluble FasL has almost no cytotoxic activity against hepatocytes, but cell death occurs with 10 gZm1 of cycloheximide (FIG. 7A).
  • the non-mutated F aS L transformant expresses the membrane-bound F a L at a high concentration (Fig. 3), but has low cytotoxic activity (Fig. 6).
  • FasL hepatocytes
  • FasL membrane-bound form of FasL (D4 mutant)
  • Figure 7C soluble Fas L dose-dependently Soluble Fas L of 0.4 gZm1 was sufficient to inhibit half of the cytotoxic activity at an E7T ratio of 2.0.
  • a soluble form of human Fas L was produced in a mouse T cell line transformed with a human Fas L expression plasmid. Determination of the N-terminal amino acid sequence of the purified human FasL revealed that soluble human Fasshig was cleaved and released between ysl29 and Glnl30. The amino acid sequence (G1u—Lys—G1n—I1e) near the FasL cleavage site has been observed in humans, rats, and mice (Takahashi et al., Int.
  • TNFa and CD40 ligand have been shown to be soluble (Pele et al., Cell, 63, 251-258, 1990; Pietravale). J. Biol. Chem., 271, 5965-5967, 1996).
  • the cleavage sites for TNF and CD40 ligand are eu—Ala_Gln—A1a / Val—Arg—Ser—Ser, and Asn—Ser—Phe-G1u t-Gin-Lys-Gly (Agawall et al., J. Biol. Chem., 260, 2345-2354, 1985; Graft et al., Eur. J.
  • TACE TNFa converting enzyme
  • the protease that cleaves F as L also appears to be a member of the ADAM family protease.
  • a 12 amino acid peptide having a sequence near the TNF ⁇ cleavage site identified TAC ⁇ and was successfully used to purify it (Black et al., Nature 385, 729-733, 1997; Moss et al., Nature, 385). , 733-736, 1997).
  • the information on the cleavage site of human FasL revealed in this study allows the present inventors to design peptide substrates used to identify the proteins involved in the cleavage of FasL.
  • F as L has a function, and F as L It is certain that there is no need to enter.
  • DISC D eat h- In du ci nng Signaling Complex
  • W4 cells express more Fas than jerkat cells and hepatocytes, The meter is enough to kill the cells. Furthermore, if soluble Fas L causes rapid down-regulation of the Fas receptor, it will inhibit the cytotoxic activity of membrane-bound Fas L. The present inventor cannot rule out the possibility of the presence of another membrane molecule that co-stimulates Fas-induced apoptosis (as opposed to membrane-bound FasL). Is considered a possible explanation.
  • the present inventor has recently suggested that when a transgenic mouse expressing the human HBV envelope gene in the liver was injected with a small amount (3 ⁇ 10 6 cells) of a CTL clone recognizing envelope proteins, the mouse developed hepatitis. It was shown to have died in a Fas-dependent manner (Kondo, et al., Nature Med., 3, 409-413, 1997). On the other hand, a large amount of recombinant soluble Fas L was required to show the same effect (Tanaka et al., 158, 2303-2309, 1997). These results are explained from the above results that membrane-bound FasL is the only functional FasL in vivo.
  • the present inventors when discovering soluble FasL, thought that soluble FasL causes systemic tissue destruction because the Fas receptor is expressed in many tissues (Tana Nature Med. 2, 317-322, 1996; Tanaka et al., EMBO J., 14, 1129-1135,
  • cytotoxic activity was found in membrane-bound, not soluble, F as L, suggesting that F as L-induced cell death is a local response.
  • cytotoxic lymphocytes recognize and activate virus-infected cells and cancer cells. Fass L expressed on the cell surface locally kills target cells and is down-regulated upon release. Ensures that this mechanism does not kill unrelated healthy cells. It has been shown that hepatitis and neutropenia, but not all human diseases that have soluble human F as L in serum (Tanaka et al., Nature Med. 2, 317-322,
  • soluble F a s L itself is non-toxic to normal cells. If cells are sensitized to Fas-induced apoptosis, for example, by positive regulation of Fas expression, these cells will be killed by soluble FasL.
  • Fas L is constitutively expressed in the eyes and testis, suggesting its role in immune evasion (Berg et al., Nature 377, 630-632, 1995; Griffith et al., Science, 270,
  • a soluble Fas ligand functioning as a Fas antagonist, a novel membrane-bound Fas ligand derivative excellent in cytotoxic activity and a DNA encoding the peptide are provided, It can contribute to the treatment, prevention, etc. of diseases associated with cis.

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Description

明 細 書 新規 F a sリガンド誘導体 技術分野
本発明は、 様々な疾患に関与するアポト一シスを制御することができる F a s リガンドに関する。 背景技術
F a s リガン ド （以下、 F a s Lとする） は F a s L、 TNF、 リ ンフォ トキシン、 TRA I L (TNF関連アポト一シス誘導リガン ド） 、 C D 4 0 リガンド （C D 40 L) 、 C D 27リガンド （C D 27 L) 、 C D 30リガンド (C D 3 0 L) 、 および 0 X 4 0 リガンド （〇 X 4 0 L ) を含む腫瘍壊死 因子 （TNF) ファミ リ一に属す （ナガタ、 Cell, 88， 355- 365， 1997 ； ゥイリ一 等、 I腿 un y， 3， 673-682、 1995) 。 リンフォ トキシンの α鎖以外の TN Fファ ミリーの大部分は II型の膜タンパク質として合成される。 しかし F a s Lの可溶 型、 TNFa、 および CD 40 Lはこれらの分子を発現する細胞の培養上清中で 見つかり、 これらの TNFファミ リ一の構成員は膜から切断 （切り出） されるこ とを示す （ペレ等、 Cell, 63， 251- 258， 1990 ； ピエトラベール等、 J.Biol. Chem. , 271, 5965-5967, 1996b ； タナカ等、 EMBO J.， 14， 1129- 1135， 1995) 。 メタ 口プロテア一ゼの阻害剤は TNF αと同様 F a s Lの放出を妨げるので、 メタ口 プロテア一ゼが膜結合型 F a s Lや TNF αがその可溶型を生み出すのに関与す ると考えられた （ジ一リ ング等、 Nature 370, 555- 557， 1994； マックジ一ハ ム等、 Nature, 370, 558-561, 1994；モーラ一等、 Nature, 370, 218-220, 1994； 夕 ナカ等、 Nature Med.2, 317-322, 1996) 。 最近、 特異的に TN F を切断するメ タロプロテア一ゼが ADAMメタロプロテアーゼファミリーの一員として同定さ れた （ブラック等、 Nature 385, 729-733， 1997；モス等、 Nature, 385, 733-736, 1997) 。 これに対して TNFファミ リ一構成員の膜からの放出の生理学的役割は 十分には解析されていない。
F a s Lは、 TNFレセプタ一ファミ リ一の一員であり、 かつ C D 9 5や A P 0— 1とも呼ばれる、 そのレセプター F a sに結合することによって、 アポ ト一シスを引き起こす。 F a s Lは、 主として、 ナチュラルキラー細胞 （NK) と同様、 活性化された T細胞で発現し （ァラセ等、 J.Exp. Med., 181, 1235-1238, 1995 ; スダ等、 J. I讓 unol.， 154， 3806- 3813， 1995； タナカ等、 Nature Med. 2, 317-322, 1996) 、 一方 F a sは様々な細胞で普遍的に発現する （フレンチ等、 J. Cell. Biol.335-343, 1996 ； レーザンサ一等、 Lab. Invest.69, 415-429, 1993 ； スダ等、 J. Immunol.， 154， 3806-3813， 1995； ワタナベ一フクナガ等、 J. Immunol., 148, 1274-1279, 1992 ) 。 F a sや F a s Lが欠損しているマウスの分 析により F a s Lが C D 8 T細胞や C D 4 Th 1型 T細胞のような細胞障害性 T リ ンパ球 （CTL) の主要作用分子の 1つであることが示された （ハナプチ等、 Pro Natl. Acad. Sci. USA, 91， 4930-4934, 1994 ；スダ等、 J. Immunol.， 154, 3806 -3813, 1995； ビグノークスおよびゴルステン、 Eur. J. Immunol.， 24， 923- 927， 1994) 。 CTLの役割はウィルスに感染した細胞や癌細胞を除去し、 動物体内で ウィルスや癌細胞が拡散増殖するのを防ぐことである。 しかし、 この系が過剰に 作用したとき、 組織の破壊が引き起こされる。 肝炎、 インシュリン依存性糖 尿病、 および甲状腺炎 （橋本病） のような CTL介在自己免疫疾患では F a s L が誘導するアポトーシスが関与する可能性が示唆されてきた （シェルボンスキー 等、 Cell 89, 17-24, 1997 ； ジォルダノ等、 Sience, 275， 960- 963， 1997； コント" ゥ等、 Nature Med.， 3， 409413， 1997 ) 。
上述のとおり、 膜結合型 F a s Lは切断されて可溶型になる。 可溶型ヒ ト F a s Lは、 少なく とも F a sを過剰に発現するマウス WR 1 9 L細胞形 質転換体にアポト一シスを誘導する機能がある （タナカ等、 EMB0 J.，14， 1129- 1135， 1995) 。 可溶型 F a s Lは、 NKリ ンパ腫、 Tや NK型の大型 顆粒白血病患者の血清中で高値を示す （タナカ等、 Nature Med.2， 317 322， 1996) 。 これらの白血病患者はしばしば肝炎や好中球減少症を呈するので、 TNFで見られるとおり、 F a s Lの可溶型が全身性組織破壊を引き起こすこと が仮定される。 一方、 ヒト可溶型 F a s Lの組み換え型をマウスに投与した際、 P r o p i on i b a c t e r i um Ac n e sによる刖処理で F a s Ls^¾ 致死に対するマウスの感受性を挙げたにもかかわらず、 大量の F a s Lが致死効 果を示すのに必要であった （タナカ等、 J. I難 unol. , 158， 2303- 2309, 1997 ) 。 発明の開示
これらの結果は本発明者が可溶型と膜結合性の F a s Lの細胞障害活性を比較 し、 膜からの F a s Lの放出の生理学的役割を調べるきっかけとなった。
本発明者は、 発現するマウスの T細胞形質転換体の培養上清からヒト F a s L を精製した。 その N末端配列分析により本発明者はヒト F a s Lの切断部位を決 定できた。 切断部位近傍のァミノ酸欠失変異は膜結合型 F a s Lの切断を完全に 阻害した。 ヒ トジャーカツ ト T細胞株とマウス肝細胞はむしろ可溶型 F a s Lに 耐性があることがわかった力 それらは効率的に膜結合型 F a s Lにより殺され た。 また、 可溶型 F a s Lは肝細胞に対する膜結合型 F a s L誘導細胞障害を阻 害する。 これらの結果は F a s Lの細胞膜からの放出は F a s Lの細胞障害活性 をダウンレギュレ一卜することを示唆する。
本発明は F a sアンタゴニストまたはアポトーシス調節物質として機能する可 溶型 F a sリガンド、 アポトーシス誘導活性または細胞障害活性に優れた新規な F a s リガンド誘導体および該ぺプチドをコ一ドする D N Aを提供しょうと する。
F a sリガンドは I I型の膜タンパク質であり、 腫瘍壊死因子 （T N F ) フアミ リ一に属しており、 レセプターである F a sに結合することによりアポトーシス を誘発する。 F a s Lは推定されるプロセッシング酵素であるメタ口プロテア一 ゼにより切断され、 可溶型のタイプを生じる。 本発明者はヒ トの可溶型 F a s L をヒ トの F a s Lを発現するマウス細胞の形質転換体の上清から精製し、 その開 裂箇所を特定した。 開裂箇所近傍の 4〜 2 3アミノ酸の欠失はヒト F a s Lの膜 からの放出を妨げた。 し力、し、 アポトーシスの誘導活性は保持していた。 F a s を過剰に発現するマウス WR 1 9 L細胞は F a s Lの可溶型タイプと同様に、 膜 結合 F a s Lに感受性がある。 し力、しな力 <ら、 低濃度で内因性 F a sを発現する ジャーカツ ト細胞やマウス初代培養肝細胞はむしろ可溶型 F a s Lに耐性が ある。 膜結合型 F a s Lがエフヱクタ一として用いられたとき、 ヒトジャ一カツ ト細胞とマウス肝細胞は効率的に殺傷される。 さらに、 可溶型 F a s Lはマウス 肝細胞に対する膜結合型 F a s Lの細胞障害性を阻害する。 これらの結果は膜結 合型は機能性の型で、 その活性は膜からの可溶型 F a s Lの放出によりダウンレ ギュレ一ションされることを示す。
すなわち、 本発明は、 プロテア一ゼ （蛋白分解酵素） に耐性の、 又は抵抗 性の、 もしくは感受性の低下した F a s リガンド誘導体、 具体的には天然型ヒト F a s リガンドの N末端から 1 2 9〜 1 3 0番目のァミノ酸が欠失または置換さ れ、 かつ、 1 1 1〜1 2 8番目、 1 3 1〜 1 3 3番目のアミノ酸のうち少なくと も一つが欠失または置換されたアミノ酸配列からなるもの、 またはその 8〜6 9 番目のアミノ酸が欠失した配列からなるものである。 好ましくは、 配列番号 1ま たは 2に記載したァミノ酸配列を含有する新規 F a s リガンド誘導体、 およびこ れらの新規 F a s リガンド誘導体をコ一ドする D N Aを提供する。
さらに、 本発明は、 F a sアンタゴニストまたはアポトーシス調節物質として 機能する可溶型 F a s リガンド、 および可溶型 F a s リガンドを含有するァ ポトーシス調節剤を提供し、 これらを投与する F a sリガンド誘導アポトーシス が関与する疾患の予防治療方法を提供する。 図面の簡単な説明
図 1は、 精製されたヒト可溶型 F a sリガンドを示す図である。
(A) は、 S D S—ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動による分析の結果を示 す。
( B ) は、 可溶性 F a s Lの細胞障害活性を示すグラフである。
図 2は、 欠失や点変異を有する F a s L構築の概要図である。 図 3は、 形質転換体におけるヒ 卜 F a s Lの免疫的検出結果を示す図で ある。
図 4は、 細胞表面上での F a s Lの発現結果を示す図である。
図 5は、 膜結合型 F a s Lの F a sを過剰に発現するマウス W 4細胞の細胞障 害結果を示す図である。
図 6は、 ヒトジャーカツ ト細胞に対する膜結合型 F a s Lの増大された細胞障 害活性の結果を示す図である。
図 7 (A) は、 肝細胞に対する可溶型 F a s Lの細胞障害活性を示し、 （B ) は、 マウス肝細胞に対する F a s Lの細胞障害活性を示し、 （C ) は、 可溶 型 F a s Lによる膜結合型 F a s Lの細胞障害活性結果を示す図である。 発明を実施するための最良の形態
本発明の第 1の態様である新規 F a s L誘導体は、 プロテアーゼに対して耐性 の、 または抵抗性の、 もしくは感受性の低下した F a sリガンド誘導体又は変異 体である。 特に、 前記プロテア一ゼが特にメタ口プロテア一ゼであり、 および/ または細胞膜結合型 F a s Lを生体内又は試験管内で細胞から遊離する作用を有 するプロテア一ゼ、 すなわちプロセッシング酵素である、 F a sリガンド誘導体 である。 具体的には天然の膜結合型 F a s Lのプロセッシング酵素による切断部 位又はその近傍に何らかのァミノ酸残基の変異を有するもの、 例えば、 1以上の アミノ酸の欠失、 置換または挿入、 特に 1以上、 例えば 4以上のアミノ酸の欠失 を有するものがよい。 本発明の新規 F a s L誘導体には、 F a s Lの細胞外領域 中、 F a s結合性およびノまたはアポトーシス誘導能に必要な最小活性部分は必 須であり、 生理的条件下で細胞膜等の膜に結合性を有する、 膜結合領域を含有す ることが好ましいが、 実施例に示すように、 細胞内領域は少なくとも全体は必須 ではない。 細胞外領域と膜結合領域との結合は直接でもよいし、 リンカ一ぺプチ ド等を介して間接的であってもよい。 また、 膜貫通領域は必ずしも天然の F a s L由来のものである必要はなく、 場合によっては、 ポリべプチド以外の膜 結合性物質でもよいし、 他の機能、 例えば、 多量体化能を有する物質を結合して もよい。 なお、 結合する膜としては細胞膜以外にリボソーム等が挙げられる。 本発明の第 1の態様である新規 F a sリガンド誘導体の具体例としては、 天然 型ヒト F a s リガンドの N末端から 1 2 9〜1 3 0番目のアミノ酸が欠失または 置換され、 かつ、 1 1 1〜1 2 8番目、 1 3 1〜 1 3 3番目のアミノ酸のうち少 なくとも一つが欠失または置換されたァミノ酸配列からなるもの、 またはその 8 〜6 9番目のアミノ酸が欠失した配列からなるものである。 好ましくは、 配列番 号 1に記載の配列、 又はその 8〜6 9番目のアミノ酸を欠失した配列 （以下 D 4 と称す） 、 および配列番号 2に記載の配列、 又はその 8〜6 9番目のアミノ酸を 欠失した配列 （以下 D 5と称す） に記載のアミノ酸配列からなるものである。 配 列番号 1または D 4は天然型のヒト F a sリガンドの N末端から 1 1 1〜 1 3 3 番の 2 3アミノ酸が欠失したものであり、 配列番号 2又は D 5は天然型の ヒ ト F a sリガンドの N末端から 1 2 8〜 1 3 1番の 4ァミノ酸が欠失したもの である。 これらは膜結合型 F a s リガンドを 1 2 9番の L y sと 1 3 0番の G 1 nの間で切断して可溶型 F a sリガンドを放出するメタ口プロテア一ゼの作 用箇所近傍のァミノ酸が欠失している。 上記の膜結合型 F a sリガンド誘導体は 欠失変異を有するが、 その細胞障害活性は天然型の膜結合型 F a sリガンドと同 等以上である。
上述で具体例として示した天然型ヒ ト F a s リガンドの N末端から 1 2 9 〜 1 3 0番目のアミノ酸が欠失または置換され、 かつ、 1 1 1〜 1 2 8番 目、 1 3 1〜1 3 3番目のアミノ酸のうち少なくとも一つが欠失または置換され たアミノ酸配列、 またはその 8〜6 9番目のアミノ酸が欠失した配歹 IJ、 並びに配 列番号 1に記載の配列、 D 4、 配列番号 2に記載の配列または D 5である、 本発 明の F a s リガンド誘導体は、 メタ口プロテアーゼ耐性、 抵抗性、 または感受性 の低下した特性を有するため、 メタ口プロテア一ゼによる分解を受けないので、 膜から遊離せず、 細胞障害活性が減少しないため、 天然型の膜結合型 F a s リガンドより、 効率的に標的細胞表面の F a sに作用し、 アポト一シスのより優 れた細胞障害活性を示すことができる。
なお、 配列番号 1または 2に示したアミノ酸配列には、 それぞれ 4ケ所の糖鎖 付加可能部位 （N—グリコシレ一シヨンサイ ト） があり、 配列番号 1おいては、 アミノ酸番号 76〜78、 161 〜163 、 227 〜229 、 237 〜239 力く、 配列番号 2にお いては、 アミノ酸番号 76〜78、 180 〜182 、 246 〜248 、 256 〜258 が糖鎖付加 可能部位に相当する。 本発明の新規 F a sリガンド誘導体はこの位置に糖鎖が付 加していてもよい。
本発明の F a s リガンド誘導体が、 遺伝子工学的に酵母や動物細胞等の真核細 胞を宿主として生産されたものである場合は、 糖鎖が付加される場合があり、 こ れに対し、 本発明の膜結合型 F a sリガンド誘導体が、 大腸菌等の原核細胞を宿 主として遺伝子工学的にポリべプチドを生産されたものである場合には、 糖鎖の 付加はない。 本発明の F a s リガンド誘導体は、 アポトーシスを誘導し、 生体にとって不必 要な細胞を除去するために使用することが可能である。 たとえば、 エイズウィル ス感染細胞では F a s抗原が発現されているので、 本発明の F a sリガンド誘導 体は、 エイズウイルス感染初期に使用してアポト一シスを人工的に誘導し、 感染 細胞を早期に除去する事により、 エイズ治療に用いることができる。 また、 本発 明の F a s リガンド誘導体は、 ある種の自己免疫疾患に対しても、 人為的に F a s抗原を介したアポトーシスを生じさせる事により、 自己抗原反応性の T細 胞を除去することができる。 また、 本発明の F a s リガンド誘導体は、 癌治療す るために使用することができる。 なお、 モリモト H. (Morimoto H. )等は、 癌細胞 に F a s抗原を介したアポ ト一シスを誘導する事によって、 ア ドリアマイ シンやシスブラチンによる制癌効果が相乗的に増強されることを報告してい る (Cancer Res.， 53 巻、 2591-2596 頁、 1993年) 。
本発明の第 2の態様である可溶型 F a sリガンドは、 天然型の F a sリガンド の少なくとも 1部を有し、 界面活性剤等を用いなくても水溶液に可溶性であるも ののうち、 F a sアンタゴニストとして機能するもの、 またはアポト一シス調節 作用を有するものであれば特に制限されない。 本発明において、 F a sアンタゴ ニス卜とは、 F a s / F a s リガンド系アンタゴニス卜というべきものであり、 F a sによるシグナルの発生又は伝達をいずれかの段階で何らかの形で遮断し、 F a sを介するアポト一シスを抑制又は阻害するものである。
本発明の可溶型 F a sリガンドは、 天然型の F a s リガンドの少なくとも 1部 を有し、 界面活性剤等を用いなくても水溶液に可溶性であるもののうち、 例えば、 F a s細胞外領域と相互作用し、 天然型の F a s Lと競合したり、 また は、 F a sのダウンレギュレーションを引き起こすものが挙げられる。 このよう な可溶型 F a s リガンドとしては、 F a sリガンドの細胞外領域の少なくとも一 部からなるものが例示され、 好ましくはヒト天然型 F a s リガンドの N末端から 1 3 0番目の G 1 nから C末端までのアミノ酸配列からなるぺプチドが例示され る。
さらに、 天然の膜結合型 F a s リガンド、 および天然の膜結合型 F a s リガン ドと同様に生体内または試験管内でメタ口プロテア一ゼにより切断されて可溶性 F a s リガンドになるポリぺプチドは、 本発明の可溶型 F a sリガンドの前駆体 として用いられる。
本発明者は可溶型 F a sリガンドが F a s L、 特に膜結合型の F a s L誘導細 胞障害を抑制すること、 すなわち、 F a sアンタゴニストまたはアポトーシス調 節物質として作用し、 アポトーシスを抑制、 阻害または調節することを見出し本 発明を完成させた。 このような本発明の F a sアンタゴニストとして機能する可 溶型 F a s リガンドを用いることにより、 F a s L誘導アポトーシスの治療、 予 防を行なうことができる。 また、 可溶型 F a s Lを用いる F a s機能またはアポ トーシスの抑制若しくは調節方法、 および可溶型 F a s Lを含有するアポト一シ ス拮抗剤若しくは調節剤が提供される。
肝炎、 インシュリン依存性糖尿病、 および甲状腺炎 （橋本病） のような C T L 介在自己免疫疾患において F a s L誘導アポト一シスが関与することが示されて きた。 さらに、 アポトーシスが関与する疾患としては、 例えば、 免疫担当細胞あ るいは肝細胞のアポ ト一シスにより組織の機能が著しく低下した結果生じ ると考えられる、 エイズウイルス感染後期の免疫能の低下や、 劇症肝炎における 肝機能低下が挙げられる。 また、 アポト一シスが関与する疾患として、 心疾患、
G V H D、 腎疾患、 虚血再灌流障害に基づく疾患及び臓器障害に基づく疾患が挙 げられる。
例えば、 心疾患としては、 特に心筋梗塞等の虚血性心疾患、 種々の原因による 心筋炎、 心筋症、 特に拡張型心筋症、 心不全、 並びに虚血再灌流障害及びそれに 基づく心疾患等が； G V H Dとしては、 不適合性骨髄移植や先天性免疫不全症へ の骨髄移植等の骨髄移植後に起る G V H D、 臓器移植後に起る G V H D、 免疫低 下した宿主に対する大量輸血等の輸血後に起る G V H D等が；虚血再灌流障害と しては、 肝臓、 心臓、 腎臓、 肺、 脾臓、 小腸、 大腸、 胃、 脖臓、 脳、 筋肉、 皮膚 などにおいて認められる虚血再灌流障害及びそれに基づく疾患、 例えば、 肝 不全、 再灌流不整脈、 腎不全、 壊死性腸炎などで各臓器の損傷や機能障害が挙げ られる。
さらに、 アポト一シスが関与する疾患として、 上述した虚血再灌流障害に基づ く疾患、 アレルギー性接触皮膚炎または関節リウマチなどが、 さらには、 S I R Sに伴う M O D S挙げられる。
また、 アポトーシスが関与する疾患として、 エンドトキシンによる臓器障害、 特に肝臓障害又はェンドトキシン血症もしくは敗血症において、 急性期のみなら ず、 慢性的な障害が挙げられる。
さらに、 アポトーシスが関与する疾患として、 肝臓においては、 移植などの外 科的手術時、 あるいはショックおよび循環不全などによる肝血流量 （血液供給） の減少、 あるいは遮断の際の虚血再灌流障害において、 肝不全や組織障害な らびに肝機能低下が挙げられる。 心臓においては、 心筋梗塞に対する血栓 溶解療法、 経皮的冠動脈内血栓溶解療法 （P T C R) や経皮的冠動脈内腔拡張術 ( P T C A) 後の再灌流の結果、 細胞内カルシウムイオンの過負荷等に起因する 不可逆的な細胞死や致死的な不整脈が挙げられる。 また、 腎臓においては、 術後、 または腎移植等に起因する虚血再灌流による腎不全や糸球体固有細胞 （内 皮細胞、 上皮細胞、 メサンギゥム細胞） 、 メサンギゥム基質、 基底膜の細胞外基 質または尿細管上皮細胞などの障害が挙げられる。
本発明の第 1および第 2の態様の、 可溶型 F a s リガンドおよび F a s リガン ド誘導体は医薬組成物に用いることができる。 この場合は、 少なくとも一種の医 薬用担体、 または媒体、 例えば滅菌水や生理食塩水、 植物油、 鉱油、 高級 アルコール、 高級脂肪酸、 無害性有機溶媒等、 さらには必要に応じて賦形剤、 着 色剤、 乳化剤、 懸濁剤、 界面活性剤、 溶解補助剤、 吸着防止剤、 安定化剤、 保存 剤、 保湿剤、 酸化防止剤、 緩衝剤、 等張化剤、 無痛化剤等と適宜組み合わせて注 射剤や経口剤などの医薬組成物ゃキッ 卜の形態をとることができる。 本発明の予 防 ·治療剤は、 好ましくは非経口的に、 たとえば、 静脈内注射、 冠動脈内注射、 筋肉内注射、 腹腔内注射、 皮下注射等により全身あるいは局部的に、 ならびに急 速もしくは持続的に投与することができる。 本発明の予防 ·治療剤のヒ卜に対す る投与量は患者の病態、 年齢あるいは投与方法により異なるが、 適宜適当な量を 選択することが必要である。 例えば、 全身投与の場合、 約 0 . 1 - 1 0 0 mg/kg の範囲で適当な分割容量を選択することができる。 しかしながら、 当該医薬組成 物の使用はこれらの投与方法および投与量に制限されるものではない。 さらに、 他の薬剤と併用してもよい。
本発明の第 1および 2の態様の F a sリガンドを医薬組成物に用いる場合は、 常法に従って、 製剤化することができる。 たとえば、 注射用製剤は、 精製された 本発明の第 1および 2の態様の F a s リガンドを溶剤、 たとえば、 生理食塩水、 緩衝液などに溶解し、 それに、 必要に応じて吸着防止剤などを加えたもの であり、 または、 使用前に溶解再構成するために凍結乾燥したものであってもよ く、 凍結乾燥のための一般的な賦形剤を使用することができる。
本発明の第 1および第 2の態様の F a s リガンドはいかなる方法で生産された ものであってもよい。 例えば、 ペプチド合成機 （例えば、 ペプチドシンセサ ィザ一 430A型、 パーキンエルマ一ジャパン （株） 製） を使用して化学合成しても よい。
また、 ヒトおよびヒ ト以外のいかなる生物の組織や細胞、 体液から精製しても よい。 ヒトゃ動物の体液としては、 血液や尿が挙げられる。 細胞としては、 本発 明の新規ポリべプチドを産生する細胞を適宜選択して用いることができる。 例え ば、 脾細胞や胸腺細胞、 リ ンパ球系細胞、 および、 それらの株化細胞など を、 ノーザンブロッ トあるいはウェスタンブロッ ト等で解析し、 本発明の新規ポ リペプチドの発現量の高いものを選択する。
必要があれば、 細胞を P MA (ホルボールミリステートアセテート） ゃィオノ マイシン、 P H A (フィ トヘムァグルチニン） 、 C o n A (コンカナパリ ン A) 、 I L一 2 (インタ一ロイキン- 2) 等の刺激剤から選ばれる、 1種もしくは 2種以上の適切な刺激剤で刺激して産生誘導し、 細胞もしくは培養上清から、 当 該ポリペプチドを精製してもよい。 精製は、 濃縮や、 各種クロマトグラフィー、 塩析など一般的に行われているポリベプチドの精製方法を適宜組み合わせ、 F a s抗原への結合性、 もしくは、 F a s抗原を発現している細胞への細胞障害 9
活性等を指標として行うことができる。
しかし、 本発明の第 1および第 2の態様の F a s リガンドは、 その純度の面か ら、 遺伝子工学的に生産されたもの、 すなわち、 組換え型ポリペプチドであるこ とが好ましい。 当該ポリペプチドを遺伝子工学的に生産するには、 適当なベ クターに本発明の第 1および第 2の態様の F a sリガンドの c D N Aや本発明の D N A等を組み込み組換え遺伝子を得て、 該組換え遺伝子で適当な宿主細胞を形 質転換し、 得られた形質転換体を培養して培養混合物を回収し、 当該ポリべ プチドを精製する。 また、 該 D N Aや組換え D N A分子を利用して無細胞 系の合成方法 （サムブルック J. (Sambrook, J. )et al.： Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, New York(1989 年） ） で得る方法も例示される。
本発明の第 3の態様の新規 D N Aは、 本発明の新規 F a sリガンド誘導体、 特 に配列番号 1および 2に記載されたァミノ酸配列、 または D 4、 D 5をコードす るものである。 本発明の D N Aは、 それが本発明の新規 F a s リガンド誘導体を コードする限り、 いかなる配列からなる D N Aであってもよい。 同じアミノ酸を コードする D N Aのトリプレッ トは、 ァミノ酸の種類ごとに 1〜 6種類迄存在す ることが知られており、 同じべプチドをコ一ドする塩基配列は 1種類には限定さ れないが、 このうちいずれのコドンを使用してもよい。
また、 本発明の D N Aは、 それが本発明の新規 F a s リガンド誘導体をコ一ド する塩基配列を含有する限り、 c D N Aであってもイン トロンを有する染色 体 D N Aであってもよい。 し力、しな力くら、 ベクタ一への導人の容易さ等、 遺伝子 工学的手法における扱い易さから、 本発明の新規 D N Aは c D N Aであることが 好ましく、 配列番号 4， 5および 6に記載された塩基配列を有するものが例示さ れる。
本発明の新規 D N Aは、 1本鎖であっても、 それに相補的な配列を有する D N Aや R N Aと結合して 2重鎖、 3重鎖を形成していても良い。
また、 本発明の D N Aの塩基配列が提供されることにより、 R N Aの配列、 相 補的な D N Aおよび R N Aの配列が一義的に決定される。
本発明の D N Aは、 本発明の新規 F a s リガンド誘導体を組み換え D N A技術 を使用して製造するために用いることができる。 すなわち、 本発明の D N Aを、 プロモータ一配列等の発現に必要な配列を有する適当な発現べクタ一の適当な位 置に挿入し、 このベクターで適当な宿主細胞を形質転換することによって、 形質 転換体に本発明の新規 F a s リガンド誘導体を発現させることができる。 また、 本発明の新規 D N Aを適当なベクタ一に組み込んで、 投与し、 例えば、 ガン、 ゥ ィルス疾患、 自己免疫疾患等の遺伝的にアポト一シスの機構が欠損している疾患 等の遺伝子治療にも使用する事ができる。 さらに細胞株や生体外に取り出した細 胞を本発明の D N Aにより形質転換し、 それを生体に戻すことにより細胞治療を 行なうこともできる。 また、 F a s L誘導体を発現する移植用の臓器や組織を提 供するためのトランスジヱニック動物の作製に使用できる。
さらに、 本発明の新規 D N Aは、 アンチセンス医薬の開発に使用したり、 トランスジヱニックマウス等、 アポト一シスが関与する疾患のモデル動物の作製 に使用したり、 酵素等で標識して、 組織における F a s リガンドおよびその誘導 体の発現状況を検査し、 アポトーシスが関与する疾患の診断に使用することがで さる。 本発明の新規 DN Aは化学合成や DN Aライブラリ一から得ることができる。 本発明の新規 DNAを化学合成するには、 たとえば、 次のように行えばよい。 すなわち、 所望の塩基配列を有する DN Aを約 2 0塩基程度からなる断片に分け て DNA化学合成機 （例えば、 394型、 パーキンエルマ一ジャパン （株） 製） を用いて合成し、 その後、 必要に応じて 5'末端のリン酸化を行い、 各断片を ァニ一リングし、 ライゲ一ションして目的とする DN Aを得る。
本発明の新規 D N Aを D N Aライブラリ一から得る例としては、 適当なゲノム DNAライブラリ一や cDNAライブラリーを、 ハイブリダィゼ一ションによる スクリ一ニング法や、 抗体を用いたィムノスクリ一ニング法等でスクリーニング し、 目的の DN Aを有するクローンを増殖させ、 そこから制限酵素等を用いて切 り出す方法がある。
本発明の新規 DNAはまた、 ゲノム DN Aライブラリ一もしくは cDNAライ ブラリーを铸型とする P CR (Polymerase Chain Reaction)によっても得る事が できる。
以下に記載の条件に従って、 本発明の 1例を実施した。
( 1 ) ヒト可溶型 F a s Lの生産と精製
ハムスター抗ヒト F a s Lモノクロ一ナル抗体 （c l on e 4H9) はタナカ 等、 Nature Med.2， 317-322， 1996に記載されている。 3. 5 m 1のリン酸緩衝化 生理食塩水 （PB S) 中の抗体 （ 1 0. 5 mg) が 5 m lのプロテイン A— セファロ一ス 4 FFビーズ （フアルマシア社製） と混ぜられ、 4°Cで 1時間保温 した。 ビーズは念入りにトリス緩衝化生理食塩水 （TB S, 5 OmM T r i s -HC 1 , pH 7. 4， 1 5 OmM NaC l) で洗浄し、 20 OmMのほう酸 ナトリウム緩衝液 （pH9. 0) で 1度洗浄し、 結合していないタンパク質を取 り除いた。 結合抗体は 200 mMほう酸ナトリウム緩衝液に溶かした 2 OmMジ メチノレピメノレイ ミアイ ト (d i me t h y l p i m e r i m i d a t e) (DMP) とインキュベートすることにより、 ビーズに共有結合的に結合さ れた。
ヒ ト F a s Lを発現するマウス WR 1 9 L細胞形質転換体 （1 A 1 2細胞） は タナカ等、 Nature Med.2， 317-322， 1996に記載された。 1 A 1 2細胞 （ 1 x 1 05 細胞 Zm 1 ) が 5 %F C Sが補充された R PM 1 1 64 0培地で 3日間培 養され、 約 2 Lの培地が集められた。 培地中のタンパク質は硫安沈殿 （5 0 - 7 0%) で集められ、 PBSで透析された。 タンパク質は、 次いで、 PBSで 平衡化された抗 F a s L抗体結合プロティン Aセファロースのカラム （1m l) にかけられた。 カラムは 1 5 0 mMの N a C 1を含んだ 5 0 mM T r i s — H C 1バッファ一、 p H 8. 6の 2 0 m 1で洗浄され、 力ラムに吸着し た F a s Lは 1 50 mMの N a C 1を含む 50 mMグリシン HC 1バッファ一 (pH 2. 2) で溶出された。 溶出液は直ぐに 1 M T r i s—HC l (pH 7. 5) で中和され、 PBSに透析され、 セントリコン （アミコン社製） を用い て濃縮された。
N末端アミノ酸配列を決定するために、 6 gの精製された F a s Lが 0. 1 %の SDSが入っている 1 0— 20%のポリアクリルアミ ドゲル （第一純正化学 社製） の電気泳動で分離された。 タンパク質は、 ブロッテイング用のバッファ一 が 0. 0 7 5 %S D Sを含んでいた以外はフクナガ等、 J. Biol. Chem.， 265， 14008-14015， 1990に記載のとおり P V D F膜に 3 0 Vで 1 6時間、 電気ブ ロッティングされた。 膜上のタンパク質はクマジープリリアントブル一で染色す ることにより検出され、 宝酒造株式会社に依頼して N末端のァミノ酸配列がェド マン分解で決定された。
(2) 様々なヒト F a s Lの変異体を発現する形質転換体の確立
細胞内領域 （8— 6 9番のァミノ酸） が欠けたヒト F a s Lの発現プラスミ ド (p BOSHFLD 1 ) が夕ナカ等、 Nature Med.2, 317 322， 1996に記載さ れた。 铸型として p BOSHF LD lを用いた組み換え P C Rにより、 切断 部位に一連の欠失と点変異を有するヒ ト F a s L変異体用の発現プラスミ ド (P B0SHF LD 4, p B0SHF LD 5, および p B0SHFLD 6) 力 作られた。 要約すると、 1 1 1 1 3 3番のアミ ノ酸が欠失している p BOSHFLD 4を構築するために、 F a s L cDNAの 5' 部分が pEF BOSベクタ一のセンスプライマ一 （BOS 6 ； C CTC AGACAGTGG TTCAAAG) (ミズシマ、 ナガタ、 Nucleic Acids Res.， 18， 5322， 1990) と、 アンチセンス欠失プライマ一 （DA4 ； TTTTC AGGGGGTGGAC TGGGCTC CTTCTGTAGGTGGAAG、 ヒ ト F a s Lの 1 0 5— 1 1 0番と 1 34— 1 39番のァミノ酸をコ一ドする配列） により増幅された。 cDNAの 3' 部分は DA 4プライマ一に相補的なセンスプライマ一 （DS 4) と、 F a s L cDNAの 3' 非コード領域の配列を有するプライマ一 （HFLP た。 P CRの条件はタカハシ等、 Cell, 76， 969-976， 1994 に記載されたとおりで ある。 最初の P CR産物はァガロースゲル電気泳動で精製され、 1 ： 1で混合さ れ、 次いでプライマ一 BOS 6と HFLP 3で第 2回目の P CRで増幅された。 得られた DNA断片は Xb a Iで消化され、 p E F— B 0 Sベクタ一に揷人され た。 他の欠失や点変異は以下のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて同 様な手法で作成された。 つまり、 PBOSHFLD 5 ( 1 2 8— 1 3 1番のアミ ノ酸の欠失） に対しては、 DA5 (TGGACTGGGGTGGCCCAAAG ATGATGCTGT) と DS 5プライマ一 （D A 5に相補的） 、 pBOSHF LD 6 (L y s— 1 29を A 1 aに置換） に対しては、 DA 6 (GGGGTGG CCTATTTGTGCCTCCAAAGATGATGC) と DS 6プライマ一 (D A 6に相補的） である。 マウス WR 1 9 L細胞は p PURと一緒にピュー口 マイシン耐性遺伝子 （クローンテック社製） を有する発現プラスミ ドを、 エレク トロポーレーシヨンでコートランスフエクシヨンされた （ィ トウ等、 Cell, 66, 233-243, 1991 ) 。 ピューロマイシン耐性形質転換体は 8 0 0 n g/m 1 ピュー口マイシンで選択され、 ヒト F a s Lを発現する形質転換体のクローンは フローサイ トメ トリ一用のピオチン化された抗ヒト F a s L抗体 （4 H 9) およ び PE標識ストレプトアビジン （べク トンディキンソン社製） を用いた F ACS 分析により選択された。
( 3 ) 細胞障害活性の分析
F a s発現 W 4細胞やジャーカツ ト細胞に対するヒト可溶型 F a s Lの細胞障 害活性はタナカ等、 EMBO J.， 14， 1129-1135， 1995に記載のとおり MTT法により 決定された。 これに対し、 F a s発現 W4細胞やジャーカッ ト細胞に対する F a s L発現形質転換体の細胞障害活性は基本的にはスダ等、 Cell, 75， 1169 - 1178， 1993に記載されたとおり 51 C r一放出分析で決定された。 要約する と、 W4やジャーカツ ト細胞 （1 X 1 04 ) は51 C rでラベルされ、 様々な比で F a s L形質転換体と混合された。 37 °Cで 4時間のインキュベーションの後、 標的細胞からの51 C rの特異的な放出が測定された。
初代肝細胞に対する可溶型 F a s Lや F a s L形質転換体の細胞障害活性 は以下のように測定された。 マウス肝細胞は 1 1週齢の雌の C 3 H/H eのマウ ス （SLC, 静岡から購入） から、 ァダチ等、 Nature Genet.11， 294- 300， 1995に 記載のとおり調製された。 肝細胞 （1 X 1 05 ) は 0. 0 3 % I型コラーゲンで コー卜された 4 8穴のプレー卜に植えられ、 5%FCSを含むDMEMで24時 間培養された。 肝細胞は、 可溶型 F a s Lや F a s L形質転換体と一緒に 3 7 °C で 22時間インキュベートされた。 培地に放出された GOTの濃度は和光化学社 製のトランスアミナーゼ C I Iキッ トで測定された。
( 4 ) 免疫沈降とウェスタンブロッテイ ング
F a s L形質転換体は 1 0%FCSを含むPRMI 1 64 0培地で培養され、 培地中の F a s Lと細胞溶解物が免疫沈降に続くウェスタンプロッティ ング で分析された。 要約すると、 細胞は、 1 %NP 40、 lmM 〔p_アミノーフエ ニル〕 メタンスルホニルフルオライ ドハイ ド口クロライ ド、 l〃 g/m lのぺプ スタチン、 および 1 Z g/m 1のロイぺプチンを含む TB S中で氷上で 3 0 分インキュベーションすることより溶解した。 1 5, 0 0 0 r pmで 20分間遠 心した後、 免疫沈降の為に上清が集められた。 4 X 1 05 細胞の細胞溶解物 (1 00〃 1) や 1 0 0〃 1の培地が 4 °Cで 45分間 25〃 1のプロティン Aセ ファロ一ス 4 F Fビーズ （フアルマシア社製） に前もって吸収され、 次い で、 1 0〃 1の抗 F a s Lモノクロ一ナル抗体 （ 4 H 9 ) で修飾されたプロ ティン Aセファロースと 4 °Cでー晚インキュベーションされた。 ビーズは 0. 1 %NP 4 0を含む TB Sで念入りに洗浄され、 3メルカプトエタノールを含まな い 1 0〃 1のレミ一ノレサンプノレノくッファー （L a e mm 1 i ' s s amp l e b u f f e r) と懸濁された。 サンプルは 1 0— 2 0 %勾配ポリアクリルァミ ドゲルで電気泳動し、 タンパク質は 4°C、 3 0 Vで、 1 5時間で PVDF膜 （ミ リポア社製） に転写された。 F a s Lタンパク質はタナカ等、 EMBO J.， 14， 1129 1135， 1995に記載のとおり、 抗 F a s Lポリクロ一ナル抗体を用いたウェスタン ブロッテイ ングで検出された。
実施例で得られた結果は、 以下のように表 1、 および図 1〜 7に表された。 表 1には、 野生型と変異 F a s Lを発現する形質転換体によるヒト F a s Lの 可溶型の生産の結果が示された。 表 1
Figure imgf000023_0001
野生型、 欠失変異体 （D 4， D 5) 、 または点変異 （D 6) を発現するマウス WR 1 9 L細胞形質転換体クローンは 2 0〃 Mの B B 2 1 1 6の存在下で 3 7。C で 2 4時間培養され、 次いで 4 X 1 05 細胞 Zm 1濃度で B B 2 1 1 6なしで、 3 7°Cで 2 4時間培養した。 上清の細胞障害活性は W 4細胞をターゲッ ト細胞と して用いて MTT分析を行なうことにより測定された。 細胞障害活性の 1ュニッ トは 1 0 0 / 1中の 7. 5 X 1 0 細胞に対して極大の 2分の 1の細胞障害活性 を付与する希釈率として定義された。
図 1には、 精製されたヒト可溶型 F a sリガンドが示された。
(A) は SDS—ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動による分析の結果である。 精製された可溶型ヒト F a s L (6〃 g) が 0. 1 %803の存在下1 0— 20 %勾配ポリアクリルアミ ドゲルで電気泳動により分析され、 クマジープリリアン トブルーで染色された。 サイズマーカーとして、 分子量スタンダー ド （ァ マ一シャム社、 レイ ンボウ TM着色タンパク質マ一力一） が並行して流され (M) 、 標準タンパク質のサイズがキロダルトン （kD) で示された。 （B) は 可溶型 F a s Lの細胞障害活性を示したものである。 7. 5 X 1 04 マウス W4 ゃヒトジャーカツ ト細胞が、 96穴マイクロタイタ一プレート中で提示した濃度 の可溶型 F a s Lと 37°Cで 1 5時間ィンキュベ一ションされた。 細胞生存率は MTT分析を用いて測定され、 F a s Lなしで観察された生存率に対する パーセンテージとして表された。
図 2には欠失や点変異を有する F a s L構築の概要図が示された。
野生型ヒ ト F a s L (w i 1 d) 、 欠失 （D 4および D 5 ) 、 および点変 異 （D6) の構造が概要的に示された。 CYT， TMおよび EXTは、 それぞれ ヒト F a s Lの細胞内、 膜貫通、 および細胞外領域をあらわす。 ヒト F a s Lの 切断部位のアミノ酸配列 （EKQ I ) が示された。 D 4と D 5の構築では、 それぞれ、 1 1 1一 1 3 3番と 1 2 8— 1 3 1番のァミノ酸配列が欠失させ られ、 D 6の構築では、 L y s 1 29が A 1 aに置換された。 図 3には、 ヒ ト F a s L欠失変異による可溶型の F a s Lの非放出が示さ れた。
形質転換体におけるヒ ト F a s Lの免疫的検出が示された。 親株である WR 1 9 L細胞 （WR 1 9 L) や、 野生型のヒト F a s L (w i I d) や D 4、 D 5や D 6変異体を発現する形質転換体が 20 /Mの BB 2 1 1 6を含有する培 地で 4 X 1 05 細胞/ m 1の濃度で 2 4時間培養された。 細胞は次いで B B 2 1 1 6のはいっていない培地に移され、 さらに 2 4時間ィンキュベートさ れた。 形質転換体の細胞溶解物 (C) と上清 （S) は抗ヒト F a s Lモノクロ一 ナル抗体 （4 H 9) と免疫沈降に供された。 免疫沈降物は上記のとおり、 ゥ サギ抗ヒ ト F a s L抗体を用いてウェスタンプロッティ ングで分析された。 サイズマーカ一として分子量スタンダード （アマ一シャム社製、 レインボー マーカ一） が並行して電気泳動され、 標準タンパク質のサイズはキロダル トン （KD) で示された。
図 4は細胞表面上での F a s Lの発現を示す。 野生型 F a s L (クローン 1 A 1 2と 1 F 1 0) 、 D4 変異体 （クローン 4 1 B， 4 4 D) 、 D 5変異 体 （クローン 59Aと 5— 2— 2 1) 、 または D 6変異体 （クローン 6 1 Bおよ び 6 1 7 C) を発現するマウス WR 1 9 L細胞形質転換体が 2 0〃 M B B 2 1 1 6あり （破線） となし （実線） の培地で 24時間培養された。 細胞はピオ チン化された 4 H 9抗ヒト F a s L抗体と PE標識ストレプトアビジンで染色さ れ、 上記のとおり提示したフローサイ トメ トリーで分析された。
図 5は膜結合型 F a s Lの F a sを過剰に発現するマウス W 4細胞の殺傷力を 示す。 親の WR 1 9 L細胞 （白丸） と、 野生型 （クローン 1 F 1 0、 黒丸） 、 D4 変 異体 （クローン 4 4 D、 白四角） を発現する細胞形質転換体の細胞障害活 性が51 C rで標識した W4をタ一ゲッ トとして用いて、 上記のとおり提示したェ フエクタ一 Zタ一ゲッ ト （EZT) 比で測定された。
図 6はヒ トジャーカツ ト細胞に対する膜結合型 F a s Lの増大された細胞障害 活性を示す。 親のマウス WR 1 9 L細胞 （WR 1 9 L) と、 野生型 （クローン 1 F 1 0) 、 または D4 変異体 （クローン 4 4 D) を発現するその形質転換体 が 2 0 Μ 2 1 1 6あり （黒丸） となし （白丸） で 2 4時間培養された。 細 胞障害活性が5' C rで標識したヒ トジャーカツ ト細胞をターゲッ トとして用 いて、 上記のとおり、 提示した E/T比で測定された。
図 7はマウス肝細胞の可溶型と膜結合型の F a s Lの反応性を示す。 （A) に は肝細胞に対する可溶型 F a s Lの細胞障害活性が示された。 初代マウス肝細胞 は 1 0 g/m 1のシクロへキシミ ドがあり （黒丸） となし （白丸） でヒト可溶 型 F a s Lの提示した濃度で 3 7°Cで 2 2時間ィンキュベ一シヨンされた。 ィン キュベーシヨ ンの後、 キッ トを用いて上清の GOT濃度が測定された。 合計 の GOT活性は 0. 1 %NP— 4 0で細胞を溶解させた後で、 細胞の溶解物 中で測定された。 特異的障害は合計の G 0 T活性に対する放出された G 0 T濃度 のパーセンテージとして表された。 （B) にはマウス肝細胞に対する膜結 合型 F a s Lの細胞障害活性が示された。 マウス肝細胞は、 WR 1 9 L細胞 （白 丸） 、 または D 4変異体 （クローン D 4 4、 白四角） と、 提示した E/T比で、 3 7°Cで 2 2時間インキュベーションされた。 インキュベーションの後、 障害活 性は上記のとおり測定された。 （C) は可溶型 F a s Lによる膜結合型 F a s L の細胞障害活性の阻害を示した。 マウス肝細胞が E/T比 2. 0で、 可溶型 F a s Lが提示した濃度で存在して、 D 4変異体を発現する WR 1 9 L細胞形質 転換体と一緒に 3 7°Cで 22時間ィンキュベ一卜された。 ィンキュベ一卜の後、 特異的障害活性が上記のとおり測定された。
<ヒト可溶型 F a sリガンドの精製〉
本発明者は以前、 構成的にヒ ト F a s Lを発現する安定な形質転換体 (1 A 1 2 C e l l) を確立した。 形質転換体は細胞表面に F a s Lを発現し て、 また培地中にも機能を持った可溶型 F a s Lを生産した （タナカ等、 Nature Med.2, 317-322, 1996 ) 。 可溶型ヒト F a s Lを精製するために、 1 A 1 2細胞 は 5 %の F C Sを含む PRM I培地で培養され、 F a s Lは抗 F a s L抗体 (4 H 9) を固定したプロテイン Aセファロ一スで親和的に精製された。 およそ 20 0 gの精製された F a s Lがコンディシヨンドメディゥム 2000 m 1カヽ ら得られた。 図 1 aに提示したとおり、 精製した F a s Lのポリアクリルアミ ド ゲル電気泳動は分子量 26， 000に単一バンドを示し、 これは活性化されたヒ ト末梢血りンパ球により生産される可溶型 F a s Lに似ていた （タナカ等、 EMB0 J.， 14， 1129-1135, 1995 ) 。 精製した F a s Lの細胞障害活性が F a s発現マウ ス W4細胞をターゲッ トとして分析された時、 それは 2 X I 07 U/mgの比活 性を有し、 これは基本的に P i c h i a P a s t o r i sにより生産された組 み換え可溶型 F a s Lと同じであった （夕ナカ等、 Immunol., 158,2303- 2309， 1997) 。 ヒトジャーカッ ト細胞は内因性 F a sを発現し、 抗 F a s抗体誘導アポ ト一シスに感受性がある （タカハシ等、 Eur. J. Immunol. , 23, 1935-1941, 1993) 。 可溶型 F a s Lの細胞障害活性がジャー力ッ ト細胞を標的として分析され たとき、 非常に弱い活性を示した。 すなわち、 可溶型 F a s Lの 1〃 g/m 1力く 1 5時間でたった 3 0 %の細胞しか殺すことができず、 ジャーカツ ト細胞が、 同 じ条件で、 可溶型 F a s Lに対し、 マウス W 4細胞より 1 00 0倍以上非感受性 であることを示す。
<F a s Lの切断位置〉
精製された可溶型 F a s Lの N末端のアミノ酸配列を決定するために該タンパ ク質はポリアクリルアミ ド上で電気泳動で分離され、 PVDF膜に転写された。 エドマン分解法による自動シークェンサ一における精製された 26 kDaタンノ、。 ク質の分析の結果、 G i n— I 1 e— G l y— H i s— P r o— S e r— P r o —P r oの単一の配列が示された。 この配列はヒト F a s Lの 1 30〜 1 37番 のアミノ酸に正確に対応した。 これらの結果から本発明者は、 膜結合型として合 成されたヒト 3 3 はし7 3— 1 29と0 1 1 — 1 30の間で切断されて可溶 型になると結論づけた。
く切断されない F a s Lを発現する細胞株の確立〉
切断されない F a s Lを発現する形質転換体を確立するために、 切断部位に欠 失や点変異がある一連の発現プラスミ ドを構築した。 04ゃ05は、 それぞれ、 - 1 9〜十 4と一 2〜十 2のアミノ酸が欠失した欠失変異である。 D 6は Ly s 1 29を A l aに置き換えた点変異を持っている。 これらの変異した遺伝子はヒ トェロンゲ一シヨンファクタ一 （pEF) 1 遺伝子のプロモータ一の制御下に おかれ、 マウス WR 1 9 L細胞へ導人された。
変異 F a s Lが切断されるか否かを調べるために、 それぞれの形質転換体は、 メタ口プロテア一ゼ阻害剤 BB 2 1 1 6を含有する培地中で 24時間培養され、 次いで、 阻害剤がはいっていない培地へ移された。 それらを 2 4時間培養し た後、 培養上清中の F a s L活性と F a s Lタンパク質が分析された。 表 1に示 すとおり、 本来の切断部位を持つ F a s Lの形質転換体は高濃度で培地中に可溶 型 F a s Lを分泌した。 切断部位における 23アミノ酸欠失変異遺伝子形質転換 体 （CD 4) は全く F a s L活性を示さず、 4アミノ酸欠失変異形質転換体 (CD 5) も、 ほとんど、 細胞障害活性を生じなかった。 一方、 一 1での Ly s から A 1 aへの点変異は依然 F a s Lの可溶型を生じた。 形質転換体の培養上清 と細胞破砕物は、 次いで、 抗ヒト F a s Lモノクローナル抗体 （4H9) で免疫 沈降され、 免疫沈降は抗ヒト F a s Lポリクローナル抗体を用いたウェスタンブ ロッテイ ングで分析された。 図 2 Bで示すとおり、 それぞれの F a s L形質転換 体から得られた細胞破碎物は 32〜3 5 kD aの主要バンドを示し、 それは欠失 のサイズから予想されるものであった。 野生型と点変異 （D 6) の上清は分子量 2 60 00の可溶型 F a s Lを含むが、 一方、 可溶型 F a s Lタンパク質は欠失 変異を発現する形質転換体 （CD 4と CD 5) の上清中では見られなかった。 こ れらの結果は野生型と D 6変異の上清中では F a s L活性が検出され、 D 4 と D 5では検出されなかったことと一致する。
タンパク質切断に対する変異 F a s Lの耐性を確かめるために、 細胞表面 での F a s L発現をフローサイ トメ ト リ一で調べた。 図 4で示すとおり、 BB 2 1 1 6の存在下で培養した場合、 全ての形質転換体が細胞表面に高濃度の F a s Lを発現した。 野生株や置換変異体を発現する形質転換体を BB 2 1 1 6 なしで培養した場合、 細胞表面での F a s Lの発現濃度は著しく減少した (約 1 0分の 1) 。 一方、 欠失変異の形質転換体 （CD 4および CD 5) は同じ 条件下で細胞表面からほとんど F a s Lを失わなかった。 これらの結果は F a s Lの細胞外領域の切断部位の E K Q Iの配列は膜結合型 F a s Lの開裂に 不可欠であることを示した。 一方、 一 1位での単一置換変異は効果がないこ とは、 一 1位のアミノ酸 （L y s ) は開裂に重要ではないことを示唆した。 <膜結合型 F a s Lの増大された細胞障害活性〉
本発明者は次いで、 可溶型 F a s Lを生じない膜結合型 F a s Lが機能を有す るか否かを調べた。 図 5に示すとおり、 開裂可能または開裂不可能 F a s L (w tまたは D 4変異体） を発現する形質転換体は W 4細胞に対して同程度の細 胞障害活性を示し、 膜結合型 F a s Lは活性があり、 切断部位での 2 3アミノ酸 の欠失は F a s Lが F a sに結合してアポト一シスを誘導する能力に影響しない ことを示した。
次いで、 標的としてジャーカツ ト細胞を用いて、 これらの形質転換体の細胞障 害活性が調べられた。 図 6に示すとおり、 非変異の F a s Lを発現する形質転換 体がエフェクタ一として用いられた場合、 細胞障害活性は非常に低かった。 一方、 開裂できない F a s Lを発現する D 4形質転換体がエフヱクタ一として用 いられた場合、 それらは効率的にジャーカッ ト細胞を殺傷した。 ジャーカッ ト細 胞の膜結合型 F a s Lへの反応性は W 4細胞に匹敵するか僅かに劣る。 つまり、 約 5 0 %の W 4細胞が E/T比 5 . 0で特異的に殺傷されるのに対し、 2 0 %以 上のジャーカッ ト細胞が EZT比 3 . 0で殺傷される。 これらの結果は、 少なく ともヒトジャーカツ ト細胞に対して、 膜結合型 F a s Lが可溶型 F a s Lより潜 在的な細胞障害性が強いことを示した。 従って、 非変異の F a s Lを発現する形 質転換体が B B 2 1 1 6で前処理された場合、 その細胞は開裂できない D 4変異 体で観察されたのと同様な、 ジャ一カツ 卜細胞に対する強い細胞障害活性を示し た （図 6 ) 。
.膜結合型 F a s Lの細胞障害活性が可溶性 F a s Lのそれより強いことを確認 するために、 さらに本発明者はマウス初代培養肝細胞を標的として用いた。 マウ ス肝細胞は F a s受容体を発現し、 シクロへキシミ ドの存在下で、 ァゴニス ティックな抗 F a s抗体、 J o 2により殺される （ニー等、 Exp. Cel l Res. , 215， 332-337, 1994) 。 可溶型 F a s Lが細胞障害のエフヱクタ一として用いられた場 合、 同様な結果が得られた。 つまり、 可溶型 F a s Lは肝細胞に対してほとんど 細胞障害活性を示さないが、 1 0 gZm 1のシクロへキシミ ドがあれば細胞死 がおこる （図 7 A) 。 一方、 開裂することができない欠失変異 F a s L (D 4 ) を発現する形質転換体をエフヱクタ一として用いると、 シクロへキシミ ドなしで 効果的に肝細胞を殺す （図 7 B ) 。 同様に、 開裂できる F a s L (w t ) を発現 する形質転換体は弱い細胞障害活性を肝細胞に対して示すけれども、 その細胞障 害活性はそのエフヱクタ一細胞を B B 2 1 1 6で前処理することにより、 大幅に 増大する （データは省略する） 。
<可溶型 F a s Lの阻害効果 >
上述したとおり、 非変異の F a s Lの形質転換体は膜結合型の F a s Lを高濃 度で発現する （図 3 ) が、 その細胞障害活性は低い （図 6 ) 。 これらの結果は形 質転換体により産生された可溶型 F a s Lが細胞障害活性に対して阻害的に働く ことを示唆した。 この可能性を調べるために、 肝細胞が様々な濃度の可溶型
F a s Lで前処理され、 肝細胞の F a s Lの膜結合型 （D 4変異体） に対する反 応性が調べられた。 図 7 Cに示すとおり、 可溶型 F a s Lは用量依存的に細胞障 害活性を阻害し、 0. 4 gZm 1の可溶型 F a s Lは E7T比 2. 0で細胞障 害活性の半分を阻害するのに十分であつた。
本発明において、 ヒ ト F a s Lの可溶型はヒト F a s L発現プラスミ ドにより 形質転換されたマウス T細胞株で生産された。 精製されたヒ ト F a s Lの N末端 ァミノ酸配列の決定は可溶型ヒト F a sしがし y s l 29と G l n l 3 0の間で 開裂して、 放出されることを明らかにした。 F a s Lの切断部位近傍のアミノ酸 配列 （G 1 u— Ly s— G 1 n— I 1 e) はヒト、 ラッ ト、 およびマウスで観察 され （タカハシ等、 Int. ί麵 unol.， 6， 1567-1574， 1994) 、 そして切断部位近傍の 4〜2 3アミノ酸の欠失は可溶型ヒト F a s Lの上清中への放出を阻害した。 こ の結果は、 F a s Lを認識して分解するプロテアーゼにとつて、 切断部位近傍の 該アミノ酸配列が重要であることを示唆する。
II型の膜タンパク質として合成される TNFファミ リ一構成員のなかで、 TNFaと CD40リガンドは可溶型になることが示された （ペレ等、 Cell, 63， 251-258, 1990； ピエトラベール等、 J. Biol. Chem. , 271, 5965-5967, 1996) 。 TNF と CD 40リガンドの切断部位は、 それぞれし e u— A l a_G l n— A 1 a/V a l— A r g— S e r— S e r、 および A s n— S e r— P h e -G 1 uノ Me t— G i n— L y s— G l yである （ァガ一ウォール等、 J. Biol. Chem.， 260, 2345-2354, 1985 ； グラフト等、 Eur. J. Immunol. , 25, 1749-1754, 1995) 。 これらの配列は Fa s L (S e r— L e u_G l u— Ly sZG l n— I 1 e-G 1 y-H i s) と明白な類似性は示さず、 TNF 、 F a s L、 およ び C D 40リガンドは異なつた基質特異性をもつた別個のプ口テア一ゼにより分 解されることを示す。 これに対し、 F a s Lと TNF αの放出はどちらもマ ト リ ックスメタ口プロテアーゼ （MMP) 阻害剤 （ B B 2 1 1 6 ) により 阻害され （ジーリ ング等、 Nature 370, 555-557, 1994 ； マックジ一ハム等、 Nature, 370, 558-561, 1994 ； モ一ラー等、 Nature, 370， 218 220， 1994 ； タナ 力等、 Nature Med.2， 317-322, 1996 ) 、 TNF αと F a s Lを開裂するプロ テア一ゼは似た活性部位を有することを示唆する。 最近、 TNFaを分解するプ 口テア一ゼ （TAC E, TNF a変換酵素） が同定され A Disintegrin And Metalloproteaseドメィンを有する膜タンパク質である ADAMファミリ一プロ テアーゼの構成員であることが示された （ブラック等、 Nature 385, 729-733, 1997； モス等、 Nature, 385, 733-736, 1997) 。 今まで、 このファミリーの 1 0以 上が知られている （ハワード等、 Biochem.J., 1996； ウォルフスバーグ等、 Develop. Biol.， 169， 378-383, 1995；ャガミ等、 Nature, 377, 652-6, 1995) 。 ある ものは精巣や筋肉で特異的に発現して、 特異的な機能を有しているが、 これに対 し他のものはむしろ至るところで発現し、 機能は不明である。 F a s Lを切断す るプロテア一ゼも ADAMファ ミ リ一プロテア一ゼの一員であるようだ。 TNF α切断部位近傍の配列を有する 1 2アミノ酸ペプチドは T A C Εを特 定し、 それを精製するためにうまく用いられた （ブラック等、 Nature 385， 729- 733， 1997； モス等、 Nature, 385， 733- 736， 1997) 。 この研究で明らかにされたヒ ト F a s Lの切断部位の情報により本発明者は F a s Lの開裂に関与するプロテ ァ一ゼを特定するのに用いるぺプチド基質を設計できる。
TNF αと CD 4 0 リガンドで示されたとおり （ペレ等、 Cel 1， 63， 251- 258， 1990； ピエトラベール等、 Eur. J. Immunol. , 26, 725-728, 1996 ) 、 膜結合型 F a s Lは機能を有しており、 F a s Lはその機能を発揮するのに細胞内に 入る必要はないことは確実である。 F a s Lの F a sへの結合は F ADDや F L I C Eのようないくつかのシグナル要素と F a s受容体を含む D I S C (D e a t h- I n du c i ng S i gn a l i n g Comp l e x) の形 成を誘導し、 細胞を殺す。 本発明者はある細胞は可溶型および膜結合型 Fa s L に異なった反応性を有することを見出した。 過剰に F a sを発現するマウス W4 細胞は可溶型の F a s Lで効率的に殺されるが、 適当な濃度の内因性 F a sを発 現するヒトジャー力ッ ト細胞やマウス初代培養肝細胞は可溶型 F a s Lに耐性で ある。 一方、 ジャーカッ ト細胞と肝細胞は効果的に膜結合型 F a s Lで殺さ れる。 この現象はどのように説明できるであろう力、。 TNFがレセプターに結合 した場合、 その TNFZTNFレセプタ一複合体は、 インタ一ナライズし、 分解 され、 レセプターのダウンレギュレーションを引き起こす （ッジモト等、 Pro. Natl.Acad.Sci., 82, 7626-7630, 1985； ワタナベ等、 J. Biol. Cheni. , 263, 10262- 10266， 1988) 。 同様なィンターナリゼ一ションと分解が F a s L/F a s系でも 生じるのかもしれない。 可溶型 F a s L/F a s複合体は容易にィンターナライ ズするかもしれない。 膜結合型 F a s Lと F a sのインタ一ナリゼ一ションは遅 延するようだ。 最近、 メデマ等 （メデマ等、 EMBO J. , 16, 2794-2804, 1997) は、 F a s誘導アポトーシスの最も早いシグナル伝達分子の 1つである FL I CEは 細胞質膜で D I S C中のみで活性化されるに違いないと報告した。 F a s受容体 が可溶型 F a s Lにより迅速にィンターナライズされる場合、 膜結合型 F a s L により誘導される D I S Cは長く とどまり FL I CEを活性化するのに対し て、 可溶型 F a s Lによる FL I C Eの活性化は非常に少ない。 W4細胞は ジャーカツ ト細胞や肝細胞より F a sを数多く発現するため、 弱いシグナルの合 計は細胞を殺すのに十分である。 さらに可溶型 F a s Lが F a s受容体の急 速なダウンレギュレ一シヨンを起こしたら、 膜結合型 F a s Lの細胞障害活性を 阻害するだろう。 本発明者は、 F a sが誘導するアポトーシスを協調して刺激す る （膜結合性 F a s Lとは） 別の膜分子の存在の可能性を除外することはできな いが、 上記の説明は可能性のある説明であると考える。
本発明者は、 最近ヒト HBVのエンベロープ遺伝子を肝臓で発現するトランス ジエニックマウスがエンベロープ類蛋白を認識する CTLクローンを少量 （3 X 1 06 細胞） 注射されたとき、 マウスは肝炎を起こして F a s依存性態様で死ん だことを示した （コンドウ等、 Nature Med. , 3, 409-413, 1997) 。 一方、 同様の効 果を示すには大量の組み換え可溶型 F a s Lが必要であった （タナカ等、 158， 2303-2309, 1997) 。 これらの結果は膜結合型 F a s Lこそがインビボで機能 性 F a s Lであるという上述の結果から説明される。 同様の発見が、 前に TNF で報告された、 つまり、 可溶型 TNFでなく膜結合型 TN Faが細胞死 を起こす TNFタイプ II受容体を活性化し （ダレル等、 Cell, 83， 793-802， 1995) 、 可溶型 TNFでなく膜結合型 TNF がリーシュマニアに対する防御活 性化に関与することが示された （シペックとウィ リー、 J. Exp. Med.， 174,755 -759, 1991 ) 。 最近、 サロルザノ等がメタ口プロテア一ゼ阻害剤 （BB 2 1 1 6) がマウスにおける C 0 n A誘導肝炎を起こし得ることが示された （サロル ザノ等、 J. Immunol., 158,414-419, 1997) 0 C o n A活性化 T細胞からの TN F と F a s Lの放出の抑制はより多くの肝細胞の細胞死を起こし得る。
本発明者は、 可溶型 F a s Lを発見したとき、 F a s受容体は多くの組織で発 現されるので可溶型 F a s Lが全身性組織破壊を引き起こすと考えた （タナ 力等、 Na ture Med. 2， 317- 322， 1996； タナカ等、 EMBO J.， 14, 1129- 1135，
1995) 。 しかし可溶型でなく膜結合型 F a s Lに細胞障害活性が見つかつたので F a s L誘導細胞死は局所的な反応であることが示唆される。 免疫系の監 視では、 細胞障害性リンパ球がウイルス感染細胞や癌細胞を認識し、 活性化され る。 細胞表面で発現した F a s Lは標的細胞を局所的に殺し、 放出によりダウン レギユレ一卜される。 この機構が無関係な健康な細胞を殺さないことを保 証する。 血清中に可溶型のヒト F a s Lを保有するヒト疾患全てではなく、 一部 のみが肝炎と好中球減少症を示したことは （タナカ等、 Nature Med. 2， 317- 322，
1996) 、 可溶型 F a s Lそのものは普通の細胞に対して無毒である事と一致 する。 細胞が例えば F a s発現の正の調節により F a s誘導アポトーシスに感作 させれば、 これら細胞は可溶型 F a s Lで殺されるだろう。
F a s Lは目や精巣で構成的に発現され、 免疫回避に対するその役目が示唆さ れる （ベルグ口等、 Nature 377， 630-632， 1995； グリフィス等、 Sci ence, 270,
1189-1192, 1995) 。 この現象を応用して、 いくつかのグループは最近移植で免疫 の攻撃から逃げるために F a s Lを発現しょうとした。 ある報告では、 F a s L を発現する筋芽細胞と共に移植したランゲルハンス 3細胞は長く生き残った (口一等、 Sci ence, 273, 109- 112, 1996 ) が、 一方、 他の報告では、 F a s Lを 発現する 5細胞または腫瘍細胞は好中球を増やし、 F a s Lを発現しない細胞よ り速やかに殺された （ァリソン等、 Proc. Nat l. Acad. Sci. , 94, 3943-3947, 1997； セイノ等、 Nature Med i c i ne, 3, 165-170, 1997 ) 。 以前、 クラップ等は可溶 型 T N Fを生産する腫瘍細胞が炎症をおこすが、 一方、 膜結合型 T N Fを生産す る細胞は炎症をおこさないことを報告した （クラップ等、 I腿 unol. , 149, 2076 -2081, 1992) 。 これにより、 移植片で膜結合型 F a s Lだけを産生する様に設計 された F a s Lを発現することは興味深いかもしれない。 産業上の利用可能性
本発明により、 F a sアンタゴニストとして機能する可溶性 F a sリガンド、 細胞障害活性に優れた新規な膜結合性 F a sリガンド誘導体および該ぺプチドを コ一ドする D N Aが提供され、 F a s L誘導アポ卜一シスが関与する疾患の、 治 療および予防等に寄与することができる。

Claims

請求の範囲
1 . プロテア一ゼ抵抗性を有する新規 F a s リガンド誘導体。
2 . 天然型ヒト F a s リガンドの N末端から 1 2 9〜 1 3 0番のァミノ酸が欠 失または置換され、 かつ、 1 1 1〜 1 2 8番、 1 3 1〜 1 3 3番のアミノ酸のう ち少なくとも一つが欠失または置換されたァミノ酸配列を含有する新規 F a s リ ガンド誘導体。
3 . 天然型ヒ ト F a s リガンドの N末端から 8〜 6 9番のァミノ酸が欠失 され、 かつ 1 2 9〜 1 3 0番のァミノ酸が欠失または置換され、 かつ、 1 1 1〜 1 2 8番、 1 3 1〜 1 3 3番のァミノ酸のうち少なくとも一つが欠失または置換 されたァミノ酸配列を含有する新規 F a sリガンド誘導体。
4 . 配列番号 1または 2に記載したァミノ酸配列を含有する新規 F a sリガン ド誘導体。
5 . 請求項 1〜 4の 、ずれかに記載の新規 F a s リガンド誘導体をコードする D N A。
6 . 可溶型 F a s リガンドを含有するアポトーシス調節剤。
7 . 請求項 1、 2、 3、 4または 6に記載の F a sリガンド誘導体またはアポ トーシス調節剤を投与することを特徴とする F a sリガンド誘導ァポト一シスが 関与する疾患の予防 ·治療方法。
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