JP4162849B2 - 新規Ｆａｓリガンド誘導体 - Google Patents

Description

技術分野
本発明は、様々な疾患に関与するアポトーシスを制御することができるＦａｓリガンドに関する。
背景技術
Ｆａｓリガンド（以下、ＦａｓＬとする）はＦａｓＬ、ＴＮＦ、リンフォトキシン、ＴＲＡＩＬ（ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド）、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ２７リガンド（ＣＤ２７Ｌ）、ＣＤ３０リガンド（ＣＤ３０Ｌ）、およびＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）を含む腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーに属す（ナガタ、Ｃｅｌｌ，８８，３５５−３６５，１９９７；ウィリー等、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，３，６７３−６８２、１９９５）。リンフォトキシンのα鎖以外のＴＮＦファミリーの大部分はＩＩ型の膜タンパク質として合成される。しかしＦａｓＬの可溶型、ＴＮＦα、およびＣＤ４０Ｌはこれらの分子を発現する細胞の培養上清中で見つかり、これらのＴＮＦファミリーの構成員は膜から切断（切り出）されることを示す（ペレ等、Ｃｅｌｌ，６３，２５１−２５８，１９９０ ；ピエトラベール等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，５９６５−５９６７，１９９６ｂ；タナカ等、ＥＭＢＯＪ．，１４，１１２９−１１３５，１９９５）。メタロプロテアーゼの阻害剤はＴＮＦαと同様ＦａｓＬの放出を妨げるので、メタロプロテアーゼが膜結合型ＦａｓＬやＴＮＦαがその可溶型を生み出すのに関与すると考えられた（ジーリング等、Ｎａｔｕｒｅ ３７０，５５５−５５７，１９９４；マックジーハム等、Ｎａｔｕｒｅ，３７０，５５８−５６１，１９９４；モーラー等、Ｎａｔｕｒｅ，３７０，２１８−２２０，１９９４；タナカ等、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．２，３１７−３２２，１９９６）。最近、特異的にＴＮＦαを切断するメタロプロテアーゼがＡＤＡＭメタロプロテアーゼファミリーの一員として同定された（ブラック等、Ｎａｔｕｒｅ ３８５，７２９−７３３，１９９７；モス等、Ｎａｔｕｒｅ，３８５，７３３−７３６，１９９７）。これに対してＴＮＦファミリー構成員の膜からの放出の生理学的役割は十分には解析されていない。
ＦａｓＬは、ＴＮＦレセプターファミリーの一員であり、かつＣＤ９５やＡＰＯ−１とも呼ばれる、そのレセプターＦａｓに結合することによって、アポトーシスを引き起こす。ＦａｓＬは、主として、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）と同様、活性化されたＴ細胞で発現し（アラセ等、Ｊ．Ｅｘｐ，Ｍｅｄ．，１８１，１２３５−１２３８，１９９５；スダ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５４，３８０６−３８１３，１９９５；タナカ等、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．２，３１７−３２２，１９９６）、一方Ｆａｓは様々な細胞で普遍的に発現する（フレンチ等、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３３５−３４３，１９９６；レーザンサー等、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．６９，４１５−４２９，１９９３；スダ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５４，３８０６−３８１３，１９９５；ワタナベーフクナガ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８，１２７４−１２７９，１９９２）。ＦａｓやＦａｓＬが欠損しているマウスの分析によりＦａｓＬがＣＤ８Ｔ細胞やＣＤ４Ｔｈ１型Ｔ細胞のような細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の主要作用分子の１つであることが示された（ハナブチ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１，４９３０−４９３４，１９９４；スダ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５４，３８０６−３８１３，１９９５；ビグノークスおよびゴルステン、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２４，９２３−９２７，１９９４）。ＣＴＬの役割はウイルスに感染した細胞や癌細胞を除去し、動物体内でウイルスや癌細胞が拡散増殖するのを防ぐことである。しかし、この系が過剰に作用したとき、組織の破壊が引き起こされる。肝炎、インシュリン依存性糖尿病、および甲状腺炎（橋本病）のようなＣＴＬ介在自己免疫疾患ではＦａｓＬが誘導するアポトーシスが関与する可能性が示唆されてきた（シェルボンスキー等、Ｃｅｌｌ ８９，１７−２４，１９９７；ジオルダノ等、Ｓｉｅｎｃｅ，２７５，９６０−９６３，１９９７；コンドウ等、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．，３，４０９−４１３，１９９７）。
上述のとおり、膜結合型ＦａｓＬは切断されて可溶型になる。可溶型ヒトＦａｓＬは、少なくともＦａｓを過剰に発現するマウスＷＲ１９Ｌ細胞形質転換体にアポトーシスを誘導する機能がある（タナカ等、ＥＭＢＯ Ｊ．，１４，１１２９−１１３５，１９９５）。可溶型ＦａｓＬは、ＮＫリンパ腫、ＴやＮＫ型の大型顆粒白血病患者の血清中で高値を示す（タナカ等、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．２，３１７−３２２，１９９６）。これらの白血病患者はしばしば肝炎や好中球減少症を呈するので、ＴＮＦで見られるとおり、ＦａｓＬの可溶型が全身性組織破壊を引き起こすことが仮定される。一方、ヒト可溶型ＦａｓＬの組み換え型をマウスに投与した際、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ａｃｎｅｓによる前処理でＦａｓＬ誘導致死に対するマウスの感受性を挙げたにもかかわらず、大量のＦａｓＬが致死効果を示すのに必要であった（タナカ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８，２３０３−２３０９，１９９７）。
発明の開示
これらの結果は本発明者が可溶型と膜結合性のＦａｓＬの細胞障害活性を比較し、膜からのＦａｓＬの放出の生理学的役割を調べるきっかけとなった。
本発明者は、発現するマウスのＴ細胞形質転換体の培養上清からヒトＦａｓＬを精製した。そのＮ末端配列分析により本発明者はヒトＦａｓＬの切断部位を決定できた。切断部位近傍のアミノ酸欠失変異は膜結合型ＦａｓＬの切断を完全に阻害した。ヒトジャーカットＴ細胞株とマウス肝細胞はむしろ可溶型ＦａｓＬに耐性があることがわかったが、それらは効率的に膜結合型ＦａｓＬにより殺された。また、可溶型ＦａｓＬは肝細胞に対する膜結合型ＦａｓＬ誘導細胞障害を阻害する。これらの結果はＦａｓＬの細胞膜からの放出はＦａｓＬの細胞障害活性をダウンレギュレートすることを示唆する。
本発明はＦａｓアンタゴニストまたはアポトーシス調節物質として機能する可溶型Ｆａｓリガンド、アポトーシス誘導活性または細胞障害活性に優れた新規なＦａｓリガンド誘導体および該ペプチドをコードするＤＮＡを提供しようとする。
ＦａｓリガンドはＩＩ型の膜タンパク質であり、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーに属しており、レセプターであるＦａｓに結合することによりアポトーシスを誘発する。ＦａｓＬは推定されるプロセッシング酵素であるメタロプロテアーゼにより切断され、可溶型のタイプを生じる。本発明者はヒトの可溶型ＦａｓＬをヒトのＦａｓＬを発現するマウス細胞の形質転換体の上清から精製し、その開裂箇所を特定した。開裂箇所近傍の４〜２３アミノ酸の欠失はヒトＦａｓＬの膜からの放出を妨げた。しかし、アポトーシスの誘導活性は保持していた。Ｆａｓを過剰に発現するマウスＷＲ１９Ｌ細胞はＦａｓＬの可溶型タイプと同様に、膜結合ＦａｓＬに感受性がある。しかしながら、低濃度で内因性Ｆａｓを発現するジャーカット細胞やマウス初代培養肝細胞はむしろ可溶型ＦａｓＬに耐性がある。膜結合型ＦａｓＬがエフェクターとして用いられたとき、ヒトジャーカット細胞とマウス肝細胞は効率的に殺傷される。さらに、可溶型ＦａｓＬはマウス肝細胞に対する膜結合型ＦａｓＬの細胞障害性を阻害する。これらの結果は膜結合型は機能性の型で、その活性は膜からの可溶型ＦａｓＬの放出によりダウンレギュレーションされることを示す。
すなわち、本発明は、プロテアーゼ（蛋白分解酵素）に耐性の、又は抵抗性の、もしくは感受性の低下したＦａｓリガンド誘導体、具体的には天然型ヒトＦａｓリガンドのＮ末端から１２９〜１３０番目のアミノ酸が欠失または置換され、かつ、１１１〜１２８番目、１３１〜１３３番目のアミノ酸のうち少なくとも一つが欠失または置換されたアミノ酸配列からなるもの、またはその８〜６９番目のアミノ酸が欠失した配列からなるものである。好ましくは、配列番号１または２に記載したアミノ酸配列を含有する新規Ｆａｓリガンド誘導体、およびこれらの新規Ｆａｓリガンド誘導体をコードするＤＮＡを提供する。
さらに、本発明は、Ｆａｓアンタゴニストまたはアポトーシス調節物質として機能する可溶型Ｆａｓリガンド、および可溶型Ｆａｓリガンドを含有するアポトーシス調節剤を提供し、これらを投与するＦａｓリガンド誘導アポトーシスが関与する疾患の予防治療方法を提供する。
発明を実施するための最良の形態
本発明の第１の態様である新規ＦａｓＬ誘導体は、プロテアーゼに対して耐性の、または抵抗性の、もしくは感受性の低下したＦａｓリガンド誘導体又は変異体である。特に、前記プロテアーゼが特にメタロプロテアーゼであり、および／または細胞膜結合型ＦａｓＬを生体内又は試験管内で細胞から遊離する作用を有するプロテアーゼ、すなわちプロセッシング酵素である、Ｆａｓリガンド誘導体である。具体的には天然の膜結合型ＦａｓＬのプロセッシング酵素による切断部位又はその近傍に何らかのアミノ酸残基の変異を有するもの、例えば、１以上のアミノ酸の欠失、置換または挿入、特に１以上、例えば４以上のアミノ酸の欠失を有するものがよい。本発明の新規ＦａｓＬ誘導体には、ＦａｓＬの細胞外領域中、Ｆａｓ結合性および／またはアポトーシス誘導能に必要な最小活性部分は必須であり、生理的条件下で細胞膜等の膜に結合性を有する、膜結合領域を含有することが好ましいが、実施例に示すように、細胞内領域は少なくとも全体は必須ではない。細胞外領域と膜結合領域との結合は直接でもよいし、リンカーペプチド等を介して間接的であってもよい。また、膜貫通領域は必ずしも天然のＦａｓＬ由来のものである必要はなく、場合によっては、ポリペプチド以外の膜結合性物質でもよいし、他の機能、例えば、多量体化能を有する物質を結合してもよい。なお、結合する膜としては細胞膜以外にリポソーム等が挙げられる。
本発明の第１の態様である新規Ｆａｓリガンド誘導体の具体例としては、天然型ヒトＦａｓリガンドのＮ末端から１２９〜１３０番目のアミノ酸が欠失または置換され、かつ、１１１〜１２８番目、１３１〜１３３番目のアミノ酸のうち少なくとも一つが欠失または置換されたアミノ酸配列からなるもの、またはその８〜６９番目のアミノ酸が欠失した配列からなるものである。好ましくは、配列番号１に記載の配列、又はその８〜６９番目のアミノ酸を欠失した配列（以下Ｄ４と称す）、および配列番号２に記載の配列、又はその８〜６９番目のアミノ酸を欠失した配列（以下Ｄ５と称す）に記載のアミノ酸配列からなるものである。配列番号１またはＤ４は天然型のヒトＦａｓリガンドのＮ末端から１１１〜１３３番の２３アミノ酸が欠失したものであり、配列番号２又はＤ５は天然型のヒトＦａｓリガンドのＮ末端から１２８〜１３１番の４アミノ酸が欠失したものである。これらは膜結合型Ｆａｓリガンドを１２９番のＬｙｓと１３０番のＧｌｎの間で切断して可溶型Ｆａｓリガンドを放出するメタロプロテアーゼの作用箇所近傍のアミノ酸が欠失している。上記の膜結合型Ｆａｓリガンド誘導体は欠失変異を有するが、その細胞障害活性は天然型の膜結合型Ｆａｓリガンドと同等以上である。
上述で具体例として示した天然型ヒトＦａｓリガンドのＮ末端から１２９〜１３０番目のアミノ酸が欠失または置換され、かつ、１１１〜１２８番目、１３１〜１３３番目のアミノ酸のうち少なくとも一つが欠失または置換されたアミノ酸配列、またはその８〜６９番目のアミノ酸が欠失した配列、並びに配列番号１に記載の配列、Ｄ４、配列番号２に記載の配列またはＤ５である、本発明のＦａｓリガンド誘導体は、メタロプロテアーゼ耐性、抵抗性、または感受性の低下した特性を有するため、メタロプロテアーゼによる分解を受けないので、膜から遊離せず、細胞障害活性が減少しないため、天然型の膜結合型Ｆａｓリガンドより、効率的に標的細胞表面のＦａｓに作用し、アポトーシスのより優れた細胞障害活性を示すことができる。
なお、配列番号１または２に示したアミノ酸配列には、それぞれ４ヶ所の糖鎖付加可能部位（Ｎ−グリコシレーションサイト）があり、配列番号１おいては、アミノ酸番号７６〜７８、１６１〜１６３、２２７〜２２９、２３７〜２３９が、配列番号２においては、アミノ酸番号７６〜７８、１８０〜１８２、２４６〜２４８、２５６〜２５８が糖鎖付加可能部位に相当する。本発明の新規Ｆａｓリガンド誘導体はこの位置に糖鎖が付加していてもよい。
本発明のＦａｓリガンド誘導体が、遺伝子工学的に酵母や動物細胞等の真核細胞を宿主として生産されたものである場合は、糖鎖が付加される場合があり、これに対し、本発明の膜結合型Ｆａｓリガンド誘導体が、大腸菌等の原核細胞を宿主として遺伝子工学的にポリペプチドを生産されたものである場合には、糖鎖の付加はない。
本発明のＦａｓリガンド誘導体は、アポトーシスを誘導し、生体にとって不必要な細胞を除去するために使用することが可能である。たとえば、エイズウイルス感染細胞ではＦａｓ抗原が発現されているので、本発明のＦａｓリガンド誘導体は、エイズウイルス感染初期に使用してアポトーシスを人工的に誘導し、感染細胞を早期に除去する事により、エイズ治療に用いることができる。また、本発明のＦａｓリガンド誘導体は、ある種の自己免疫疾患に対しても、人為的にＦａｓ抗原を介したアポトーシスを生じさせる事により、自己抗原反応性のＴ細胞を除去することができる。また、本発明のＦａｓリガンド誘導体は、癌治療するために使用することができる。なお、モリモト Ｈ．（Ｍｏｒｉｍｏｔｏ Ｈ．）等は、癌細胞にＦａｓ抗原を介したアポトーシスを誘導する事によって、アドリアマイシンやシスプラチンによる制癌効果が相乗的に増強されることを報告している（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５３巻、２５９１−２５９６頁、１９９３年）。
本発明の第２の態様である可溶型Ｆａｓリガンドは、天然型のＦａｓリガンドの少なくとも１部を有し、界面活性剤等を用いなくても水溶液に可溶性であるもののうち、Ｆａｓアンタゴニストとして機能するもの、またはアポトーシス調節作用を有するものであれば特に制限されない。本発明において、Ｆａｓアンタゴニストとは、Ｆａｓ／Ｆａｓリガンド系アンタゴニストというべきものであり、Ｆａｓによるシグナルの発生又は伝達をいずれかの段階で何らかの形で遮断し、Ｆａｓを介するアポトーシスを抑制又は阻害するものである。
本発明の可溶型Ｆａｓリガンドは、天然型のＦａｓリガンドの少なくとも１部を有し、界面活性剤等を用いなくても水溶液に可溶性であるもののうち、例えば、Ｆａｓ細胞外領域と相互作用し、天然型のＦａｓＬと競合したり、または、Ｆａｓのダウンレギュレーションを引き起こすものが挙げられる。このような可溶型Ｆａｓリガンドとしては、Ｆａｓリガンドの細胞外領域の少なくとも一部からなるものが例示され、好ましくはヒト天然型ＦａｓリガンドのＮ末端から１３０番目のＧｌｎからＣ末端までのアミノ酸配列からなるペプチドが例示される。
さらに、天然の膜結合型Ｆａｓリガンド、および天然の膜結合型Ｆａｓリガンドと同様に生体内または試験管内でメタロプロテアーゼにより切断されて可溶性Ｆａｓリガンドになるポリペプチドは、本発明の可溶型Ｆａｓリガンドの前駆体として用いられる。
本発明者は可溶型ＦａｓリガンドがＦａｓＬ、特に膜結合型のＦａｓＬ誘導細胞障害を抑制すること、すなわち、Ｆａｓアンタゴニストまたはアポトーシス調節物質として作用し、アポトーシスを抑制、阻害または調節することを見出し本発明を完成させた。このような本発明のＦａｓアンタゴニストとして機能する可溶型Ｆａｓリガンドを用いることにより、ＦａｓＬ誘導アポトーシスの治療、予防を行なうことができる。また、可溶型ＦａｓＬを用いるＦａｓ機能またはアポトーシスの抑制若しくは調節方法、および可溶型ＦａｓＬを含有するアポトーシス拮抗剤若しくは調節剤が提供される。
肝炎、インシュリン依存性糖尿病、および甲状腺炎（橋本病）のようなＣＴＬ介在自己免疫疾患においてＦａｓＬ誘導アポトーシスが関与することが示されてきた。さらに、アポトーシスが関与する疾患としては、例えば、免疫担当細胞あるいは肝細胞のアポトーシスにより組織の機能が著しく低下した結果生じると考えられる、エイズウイルス感染後期の免疫能の低下や、劇症肝炎における肝機能低下が挙げられる。また、アポトーシスが関与する疾患として、心疾患、ＧＶＨＤ、腎疾患、虚血再灌流障害に基づく疾患及び臓器障害に基づく疾患が挙げられる。
例えば、心疾患としては、特に心筋梗塞等の虚血性心疾患、種々の原因による心筋炎、心筋症、特に拡張型心筋症、心不全、並びに虚血再灌流障害及びそれに基づく心疾患等が；ＧＶＨＤとしては、不適合性骨髄移植や先天性免疫不全症への骨髄移植等の骨髄移植後に起るＧＶＨＤ、臓器移植後に起るＧＶＨＤ、免疫低下した宿主に対する大量輸血等の輸血後に起るＧＶＨＤ等が；虚血再灌流障害としては、肝臓、心臓、腎臓、肺、脾臓、小腸、大腸、胃、膵臓、脳、筋肉、皮膚などにおいて認められる虚血再灌流障害及びそれに基づく疾患、例えば、肝不全、再灌流不整脈、腎不全、壊死性陽炎などで各臓器の損傷や機能障害が挙げられる。
さらに、アポトーシスが関与する疾患として、上述した虚血再灌流障害に基づく疾患、アレルギー性接触皮膚炎または関節リウマチなどが、さらには、ＳＩＲＳに伴うＭＯＤＳ挙げられる。
また、アポトーシスが関与する疾患として、エンドトキシンによる臓器障害、特に肝臓障害又はエンドトキシン血症もしくは敗血症において、急性期のみならず、慢性的な障害が挙げられる。
さらに、アポトーシスが関与する疾患として、肝臓においては、移植などの外科的手術時、あるいはショックおよび循環不全などによる肝血流量（血液供給）の減少、あるいは遮断の際の虚血再灌流障害において、肝不全や組織障害ならびに肝機能低下が挙げられる。心臓においては、心筋梗塞に対する血栓溶解療法、経皮的冠動脈内血栓溶解療法（ＰＴＣＲ）や経皮的冠動脈内腔拡張術（ＰＴＣＡ）後の再灌流の結果、細胞内カルシウムイオンの過負荷等に起因する不可逆的な細胞死や致死的な不整脈が挙げられる。また、腎臓においては、術後、または腎移植等に起因する虚血再灌流による腎不全や糸球体固有細胞（内皮細胞、上皮細胞、メサンギウム細胞）、メサンギウム基質、基底膜の細胞外基質または尿細管上皮細胞などの障害が挙げられる。
本発明の第１および第２の態様の、可溶型ＦａｓリガンドおよびＦａｓリガンド誘導体は医薬組成物に用いることができる。この場合は、少なくとも一種の医薬用担体、または媒体、例えば滅菌水や生理食塩水、植物油、鉱油、高級アルコール、高級脂肪酸、無害性有機溶媒等、さらには必要に応じて賦形剤、着色剤、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、溶解補助剤、吸着防止剤、安定化剤、保存剤、保湿剤、酸化防止剤、緩衝剤、等張化剤、無痛化剤等と適宜組み合わせて注射剤や経口剤などの医薬組成物やキットの形態をとることができる。本発明の予防・治療剤は、好ましくは非経口的に、たとえば、静脈内注射、冠動脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等により全身あるいは局部的に、ならびに急速もしくは持続的に投与することができる。本発明の予防・治療剤のヒトに対する投与量は患者の病態、年齢あるいは投与方法により異なるが、適宜適当な量を選択することが必要である。例えば、全身投与の場合、約０．１−１００ｍｇ／ｋｇの範囲で適当な分割容量を選択することができる。しかしながら、当該医薬組成物の使用はこれらの投与方法および投与量に制限されるものではない。さらに、他の薬剤と併用してもよい。
本発明の第１および２の態様のＦａｓリガンドを医薬組成物に用いる場合は、常法に従って、製剤化することができる。たとえば、注射用製剤は、精製された本発明の第１および２の態様のＦａｓリガンドを溶剤、たとえば、生理食塩水、緩衝液などに溶解し、それに、必要に応じて吸着防止剤などを加えたものであり、または、使用前に溶解再構成するために凍結乾燥したものであってもよく、凍結乾燥のための一般的な賦形剤を使用することができる。
本発明の第１および第２の態様のＦａｓリガンドはいかなる方法で生産されたものであってもよい。例えば、ペプチド合成機（例えば、ペプチドシンセサイザー４３０Ａ型、パーキンエルマージャパン（株）製）を使用して化学合成してもよい。
また、ヒトおよびヒト以外のいかなる生物の組織や細胞、体液から精製してもよい。ヒトや動物の体液としては、血液や尿が挙げられる。細胞としては、本発明の新規ポリペプチドを産生する細胞を適宜選択して用いることができる。例えば、脾細胞や胸腺細胞、リンパ球系細胞、および、それらの株化細胞などを、ノーザンブロットあるいはウエスタンブロット等で解析し、本発明の新規ポリペプチドの発現量の高いものを選択する。
必要があれば、細胞をＰＭＡ（ホルボールミリステートアセテート）やイオノマイシン、ＰＨＡ（フィトヘムアグルチニン）、ＣｏｎＡ（コンカナバリンＡ）、ＩＬ−２（インターロイキン−２）等の刺激剤から選ばれる、１種もしくは２種以上の適切な刺激剤で刺激して産生誘導し、細胞もしくは培養上清から、当該ポリペプチドを精製してもよい。精製は、濃縮や、各種クロマトグラフィー、塩折なと一般的に行われているポリペプチドの精製方法を適宜組み合わせ、Ｆａｓ抗原への結合性、もしくは、Ｆａｓ抗原を発現している細胞への細胞障害活性等を指標として行うことができる。
しかし、本発明の第１および第２の態様のＦａｓリガンドは、その純度の面から、遺伝子工学的に生産されたもの、すなわち、組換え型ポリペプチドであることが好ましい。当該ポリペプチドを遺伝子工学的に生産するには、適当なベクターに本発明の第１および第２の態様のＦａｓリガンドのｃＤＮＡや本発明のＤＮＡ等を組み込み組換え遺伝子を得て、該組換え遺伝子で適当な宿主細胞を形質転換し、得られた形質転換体を培養して培養混合物を回収し、当該ポリペプチドを精製する。また、該ＤＮＡや組換えＤＮＡ分子を利用して無細胞系の合成方法（サムブルック Ｊ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．）ｅｔ ａｌ．：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９年））で得る方法も例示される。
本発明の第３の態様の新規ＤＮＡは、本発明の新規Ｆａｓリガンド誘導体、特に配列番号１および２に記載されたアミノ酸配列、またはＤ４、Ｄ５をコードするものである。本発明のＤＮＡは、それが本発明の新規Ｆａｓリガンド誘導体をコードする限り、いかなる配列からなるＤＮＡであってもよい。同じアミノ酸をコードするＤＮＡのトリプレットは、アミノ酸の種類ごとに１〜６種類迄存在することが知られており、同じペプチドをコードする塩基配列は１種類には限定されないが、このうちいずれのコドンを使用してもよい。
また、本発明のＤＮＡは、それが本発明の新規Ｆａｓリガンド誘導体をコードする塩基配列を含有する限り、ｃＤＮＡであってもイントロンを有する染色体ＤＮＡであってもよい。しかしながら、ベクターへの導入の容易さ等、遺伝子工学的手法における扱い易さから、本発明の新規ＤＮＡはｃＤＮＡであることが好ましく、配列番号４，５および６に記載された塩基配列を有するものが例示される。
本発明の新規ＤＮＡは、１本鎖であっても、それに相補的な配列を有するＤＮＡやＲＮＡと結合して２重鎖、３重鎖を形成していても良い。
また、本発明のＤＮＡの塩基配列が提供されることにより、ＲＮＡの配列、相補的なＤＮＡおよびＲＮＡの配列が一義的に決定される。
本発明のＤＮＡは、本発明の新規Ｆａｓリガンド誘導体を組み換えＤＮＡ技術を使用して製造するために用いることができる。すなわち、本発明のＤＮＡを、プロモーター配列等の発現に必要な配列を有する適当な発現ベクターの適当な位置に挿入し、このベクターで適当な宿主細胞を形質転換することによって、形質転換体に本発明の新規Ｆａｓリガンド誘導体を発現させることができる。また、本発明の新規ＤＮＡを適当なベクターに組み込んで、投与し、例えば、ガン、ウイルス疾患、自己免疫疾患等の遺伝的にアポトーシスの機構が欠損している疾患等の遺伝子治療にも使用する事ができる。さらに細胞株や生体外に取り出した細胞を本発明のＤＮＡにより形質転換し、それを生体に戻すことにより細胞治療を行なうこともできる。また、ＦａｓＬ誘導体を発現する移植用の臓器や組織を提供するためのトランスジェニック動物の作製に使用できる。
さらに、本発明の新規ＤＮＡは、アンチセンス医薬の開発に使用したり、トランスジェニックマウス等、アポトーシスが関与する疾患のモデル動物の作製に使用したり、酵素等で標識して、組織におけるＦａｓリガンドおよびその誘導体の発現状況を検査し、アポトーシスが関与する疾患の診断に使用することができる。
本発明の新規ＤＮＡは化学合成やＤＮＡライブラリーから得ることができる。
本発明の新規ＤＮＡを化学合成するには、たとえば、次のように行えばよい。すなわち、所望の塩基配列を有するＤＮＡを約２０塩基程度からなる断片に分けてＤＮＡ化学合成機（例えば、３９４型、パーキンエルマージャパン（株）製）を用いて合成し、その後、必要に応じて５’末端のリン酸化を行い、各断片をアニーリングし、ライゲーションして目的とするＤＮＡを得る。
本発明の新規ＤＮＡをＤＮＡライブラリーから得る例としては、適当なゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーを、ハイブリダイゼーションによるスクリーニング法や、抗体を用いたイムノスクリーニング法等でスクリーニングし、目的のＤＮＡを有するクローンを増殖させ、そこから制限酵素等を用いて切り出す方法がある。
本発明の新規ＤＮＡはまた、ゲノムＤＮＡライブラリーもしくはｃＤＮＡライブラリーを鋳型とするＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）によっても得る事ができる。
以下に記載の条件に従って、本発明の１例を実施した。
（１）ヒト可溶型ＦａｓＬの生産と精製
ハムスター抗ヒトＦａｓＬモノクローナル抗体（ｃｌｏｎｅ４Ｈ９）はタナカ等、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．２，３１７−３２２，１９９６に記載されている。３．５ｍｌのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中の抗体（１０．５ｍｇ）が５ｍｌのプロテインＡ−セファロース４ＦＦビーズ（ファルマシア社製）と混ぜられ、４℃で１時間保温した。ビーズは念入りにトリス緩衝化生理食塩水（ＴＢＳ，５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４，１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で洗浄し、２００ｍＭのほう酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）で１度洗浄し、結合していないタンパク質を取り除いた。結合抗体は２００ｍＭほう酸ナトリウム緩衝液に溶かした２０ｍＭジメチルピメルイミデイト（ｄｉｍｅｔｈｙｌｐｉｍｅｒｉｍｉｄａｔｅ）（ＤＭＰ）とインキュベートすることにより、ビーズに共有結合的に結合された。
ヒトＦａｓＬを発現するマウスＷＲ１９Ｌ細胞形質転換体（１Ａ１２細胞）はタナカ等、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．２，３１７−３２２，１９９６に記載された。１Ａ１２細胞（１×１０^５細胞／ｍｌ）が５％ＦＣＳが補充されたＲＰＭＩ１６４０培地で３日間培養され、約２Ｌの培地が集められた。培地中のタンパク質は硫安沈殿（５０−７０％）で集められ、ＰＢＳで透析された。タンパク質は、次いで、ＰＢＳで平衡化された抗ＦａｓＬ抗体結合プロテインＡセファロースのカラム（１ｍｌ）にかけられた。カラムは１５０ｍＭのＮａＣｌを含んだ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、ｐＨ８．６の２０ｍｌで洗浄され、カラムに吸着したＦａｓＬは１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭグリシン−ＨＣｌバッファー（ｐＨ２．２）で溶出された。溶出液は直ぐに１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で中和され、ＰＢＳに透析され、セントリコン（アミコン社製）を用いて濃縮された。
Ｎ末端アミノ酸配列を決定するために、６μｇの精製されたＦａｓＬが０．１％のＳＤＳが入っている１０−２０％のポリアクリルアミドゲル（第一純正化学社製）の電気泳動で分離された。タンパク質は、ブロッティング用のバッファーが０．０７５％ＳＤＳを含んでいた以外はフクナガ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５，１４００８−１４０１５，１９９０に記載のとおりＰＶＤＦ膜に３０Ｖで１６時間、電気ブロッティングされた。膜上のタンパク質はクマジーブリリアントブルーで染色することにより検出され、宝酒造株式会社に依頼してＮ末端のアミノ酸配列がエドマン分解で決定された。
（２）様々なヒトＦａｓＬの変異体を発現する形質転換体の確立
細胞内領域（８−６９番のアミノ酸）が欠けたヒトＦａｓＬの発現プラスミド（ｐＢＯＳＨＦＬＤ１）がタナカ等、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．２，３１７−３２２，１９９６に記載された。鋳型としてｐＢＯＳＨＦＬＤ１を用いた組み換えＰＣＲにより、切断部位に一連の欠失と点変異を有するヒトＦａｓＬ変異体用の発現プラスミド（ｐＢＯＳＨＦＬＤ４，ｐＢＯＳＨＦＬＤ５，およびｐＢＯＳＨＦＬＤ６）が、作られた。要約すると、１１１−１３３番のアミノ酸が欠失しているｐＢＯＳＨＦＬＤ４を構築するために、ＦａｓＬ ｃＤＮＡの５’部分がｐＥＦ−ＢＯＳベクターのセンスプライマー（ＢＯＳ６；ＣＣＴＣＡＧＡＣＡＧＴＧＧＴＴＣＡＡＡＧ）（ミズシマ、ナガタ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８，５３２２，１９９０）と、アンチセンス欠失プライマー（ＤＡ４；ＴＴＴＴＣＡＧＧＧＧＧＴＧＧＡＣＴＧＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＧＴＡＧＧＴＧＧＡＡＧ、ヒトＦａｓＬの１０５−１１０番と１３４−１３９番のアミノ酸をコードする配列）により増幅された。ｃＤＮＡの３’部分はＤＡ４プライマーに相補的なセンスプライマー（ＤＳ４）と、ＦａｓＬｃＤＮＡの３’非コード領域の配列を有するプライマー（ＨＦＬＰ３；ＧＣＴＣＴＡＧＡＡＣＡＴＴＣＴＣＧＧＴＧＣＣＴＧＴＡＡＣ）で増幅された。ＰＣＲの条件はタカハシ等、Ｃｅｌｌ，７６，９６９−９７６，１９９４に記載されたとおりである。最初のＰＣＲ産物はアガロースゲル電気泳動で精製され、１：１で混合され、次いでプライマーＢＯＳ６とＨＥＬＰ３で第２回目のＰＣＲで増幅された。得られたＤＮＡ断片はＸｂａＩで消化され、ｐＥＦ−ＢＯＳベクターに挿入された。他の欠失や点変異は以下のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて同様な手法で作成された。つまり、ｐＢＯＳＨＦＬＤ５（１２８−１３１番のアミノ酸の欠失）に対しては、ＤＡ５（ＴＧＧＡＣＴＧＧＧＧＴＧＧＣＣＣＡＡＡＧＡＴＧＡＴＧＣＴＧＴ）とＤＳ５プライマー（ＤＡ５に相補的）、ｐＢＯＳＨＦＬＤ６（Ｌｙｓ−１２９をＡｌａに置換）に対しては、ＤＡ６（ＧＧＧＧＴＧＧＣＣＴＡＴＴＴＧＴＧＣＣＴＣＣＡＡＡＧＡＴＧＡＴＧＣ）とＤＳ６プライマー（ＤＡ６に相補的）である。マウスＷＲ１９Ｌ細胞はｐＰＵＲと一緒にピューロマイシン耐性遺伝子（クローンテック社製）を有する発現プラスミドを、エレクトロポーレーションでコートランスフェクションされた（イトウ等、Ｃｅｌｌ，６６，２３３−２４３，１９９１）。ピューロマイシン耐性形質転換体は８００ｎｇ／ｍｌピューロマイシンで選択され、ヒトＦａｓＬを発現する形質転換体のクローンはフローサイトメトリー用のビオチン化された抗ヒトＦａｓＬ抗体（４Ｈ９）およびＰＥ標識ストレプトアビジン（ベクトンディキンソン社製）を用いたＦＡＣＳ分析により選択された。
（３）細胞障害活性の分析
Ｆａｓ発現Ｗ４細胞やジャーカット細胞に対するヒト可溶型ＦａｓＬの細胞障害活性はタナカ等、ＥＭＢＯ Ｊ．，１４，１１２９−１１３５，１９９５に記載のとおりＭＴＴ法により決定された。これに対し、Ｆａｓ発現Ｗ４細胞やジャーカット細胞に対するＦａｓＬ発現形質転換体の細胞障害活性は基本的にはスダ等、Ｃｅｌｌ，７５，１１６９−１１７８，１９９３に記載されたとおり^５１Ｃｒ−放出分析で決定された。要約すると、Ｗ４やジャーカット細胞（１×１０^４）は^５１Ｃｒでラベルされ、様々な比でＦａｓＬ形質転換体と混合された。３７℃で４時間のインキュベーションの後、標的細胞からの^５１Ｃｒの特異的な放出が測定された。
初代肝細胞に対する可溶型ＦａｓＬやＦａｓＬ形質転換体の細胞障害活性は以下のように測定された。マウス肝細胞は１１週齢の雌のＣ３Ｈ／Ｈｅのマウス（ＳＬＣ，静岡から購入）から、アダチ等、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．１１，２９４−３００，１９９５に記載のとおり調製された。肝細胞（１×１０^５）は０．０３％Ｉ型コラーゲンでコートされた４８穴のプレートに植えられ、５％ＦＣＳを含むＤＭＥＭで２４時間培養された。肝細胞は、可溶型ＦａｓＬやＦａｓＬ形質転換体と一緒に３７℃で２２時間インキュベートされた。培地に放出されたＧＯＴの濃度は和光化学社製のトランスアミナーゼＣＩＩキットで測定された。
（４）免疫沈降とウエスタンブロッティング
ＦａｓＬ形質転換体は１０％ＦＣＳを含むＰＲＭＩ１６４０培地で培養され、培地中のＦａｓＬと細胞溶解物が免疫沈降に続くウエスタンブロッティングで分析された。要約すると、細胞は、１％ＮＰ４０、１ｍＭ〔ｐ−アミノーフェニル〕メタンスルホニルフルオライドハイドロクロライド、１μｇ／ｍｌのペプスタチン、および１μｇ／ｍｌのロイペプチンを含むＴＢＳ中で氷上で３０分インキュベーションすることより溶解した。１５，０００ｒｐｍで２０分間遠心した後、免疫沈降の為に上清が集められた。４×１０^５細胞の細胞溶解物（１００μｌ）や１００μｌの培地が４℃で４５分間２５μｌのプロテインＡセファロース４ＦＦビーズ（ファルマシア社製）に前もって吸収され、次いで、１０μｌの抗ＦａｓＬモノクローナル抗体（４Ｈ９）で修飾されたプロテインＡセファロースと４℃で一晩インキュベーションされた。ビーズは０．１％ＮＰ４０を含むＴＢＳで念入りに洗浄され、βメルカプトエタノールを含まない１０μｌのレミールサンプルバッファー（Ｌａｅｍｍｌｉ’ｓ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ）と懸濁された。サンプルは１０−２０％勾配ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、タンパク質は４℃、３０Ｖで、１５時間でＰＶＤＦ膜（ミリポア社製）に転写された。ＦａｓＬタンパク質はタナカ等、ＥＭＢＯ Ｊ．，１４，１１２９−１１３５，１９９５に記載のとおり、抗ＦａｓＬポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロッティングで検出された。
実施例で得られた結果は、以下のように表１、および図１〜７に表された。
表１には、野生型と変異ＦａｓＬを発現する形質転換体によるヒトＦａｓＬの可溶型の生産の結果が示された。

野生型、欠失変異体（Ｄ４，Ｄ５）、または点変異（Ｄ６）を発現するマウスＷＲ１９Ｌ細胞形質転換体クローンは２０μＭのＢＢ２１１６の存在下で３７℃で２４時間培養され、次いで４×１０^５細胞／ｍｌ濃度でＢＢ２１１６なしで、３７℃で２４時間培養した。上清の細胞障害活性はＷ４細胞をターゲット細胞として用いてＭＴＴ分析を行なうことにより測定された。細胞障害活性の１ユニットは１００μｌ中の７．５×１０^４細胞に対して極大の２分の１の細胞障害活性を付与する希釈率として定義された。
図１には、精製されたヒト可溶型Ｆａｓリガンドが示された。
（Ａ）はＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析の結果である。精製された可溶型ヒトＦａｓＬ（６μｇ）が０．１％ＳＤＳの存在下１０−２０％勾配ポリアクリルアミドゲルで電気泳動により分析され、クマジーブリリアントブルーで染色された。サイズマーカーとして、分子量スタンダード（アマーシャム社、レインボウ^ＴＭ着色タンパク質マーカー）が並行して流され（Ｍ）、標準タンパク質のサイズがキロダルトン（ｋＤ）で示された。（Ｂ）は可溶型ＦａｓＬの細胞障害活性を示したものである。７．５×１０^４マウスＷ４やヒトジャーカット細胞が、９６穴マイクロタイタープレート中で提示した濃度の可溶型ＦａｓＬと３７℃で１５時間インキュベーションされた。細胞生存率はＭＴＴ分析を用いて測定され、ＦａｓＬなしで観察された生存率に対するパーセンテージとして表された。
図２には欠失や点変異を有するＦａｓＬ構築の概要図が示された。
野生型ヒトＦａｓＬ（ｗｉｌｄ）、欠失（Ｄ４およびＤ５）、および点変異（Ｄ６）の構造が概要的に示された。ＣＹＴ，ＴＭおよびＥＸＴは、それぞれヒトＦａｓＬの細胞内、膜貫通、および細胞外領域をあらわす。ヒトＦａｓＬの切断部位のアミノ酸配列（ＥＫＱＩ）が示された。Ｄ４とＤ５の構築では、それぞれ、１１１−１３３番と１２８−１３１番のアミノ酸配列が欠失させられ、Ｄ６の構築では、Ｌｙｓ１２９がＡｌａに置換された。
図３には、ヒトＦａｓＬ欠失変異による可溶型のＦａｓＬの非放出が示された。
形質転換体におけるヒトＦａｓＬの免疫的検出が示された。親株であるＷＲ１９Ｌ細胞（ＷＲ１９Ｌ）や、野生型のヒトＦａｓＬ（ｗｉｌｄ）やＤ４、Ｄ５やＤ６変異体を発現する形質転換体が２０μＭのＢＢ２１１６を含有する培地で４×１０^５細胞／ｍｌの濃度で２４時間培養された。細胞は次いでＢＢ２１１６のはいっていない培地に移され、さらに２４時間インキュベートされた。形質転換体の細胞溶解物（Ｃ）と上清（Ｓ）は抗ヒトＦａｓＬモノクローナル抗体（４Ｈ９）と免疫沈降に供された。免疫沈降物は上記のとおり、ウサギ抗ヒトＦａｓＬ抗体を用いてウエスタンブロッティングで分析された。サイズマーカーとして分子量スタンダード（アマーシャム社製、レインボーマーカー）が並行して電気泳動され、標準タンパク質のサイズはキロダルトン（ＫＤ）で示された。
図４は細胞表面上でのＦａｓＬの発現を示す。野生型ＦａｓＬ（クローン１Ａ１２と１Ｆ１０）、Ｄ４変異体（クローン４１Ｂ，４４Ｄ）、Ｄ５変異体（クローン５９Ａと５−２−２１）、またはＤ６変異体（クローン６１Ｂおよび６１７Ｃ）を発現するマウスＷＲ１９Ｌ細胞形質転換体が２０μＭＢＢ２１１６あり（破線）となし（実線）の培地で２４時間培養された。細胞はビオチン化された４Ｈ９抗ヒトＦａｓＬ抗体とＰＥ標識ストレプトアビジンで染色され、上記のとおり提示したフローサイトメトリーで分析された。
図５は膜結合型ＦａｓＬのＦａｓを過剰に発現するマウスＷ４細胞の殺傷力を示す。
親のＷＲ１９Ｌ細胞（白丸）と、野生型（クローン１Ｆ１０、黒丸）、Ｄ４変異体（クローン４４Ｄ、白四角）を発現する細胞形質転換体の細胞障害活性が^{５ １}Ｃｒで標識したＷ４をターゲットとして用いて、上記のとおり提示したエフェクター／ターゲット（Ｅ／Ｔ）比で測定された。
図６はヒトジャーカット細胞に対する膜結合型ＦａｓＬの増大された細胞障害活性を示す。親のマウスＷＲ１９Ｌ細胞（ＷＲ１９Ｌ）と、野生型（クローン１Ｆ１０）、またはＤ４変異体（クローン４４Ｄ）を発現するその形質転換体が２０μＭＢＢ２１１６あり（黒丸）となし（白丸）で２４時間培養された。細胞障害活性が^５１Ｃｒで標識したヒトジャーカット細胞をターゲットとして用いて、上記のとおり、提示したＥ／Ｔ比で測定された。
図７はマウス肝細胞の可溶型と膜結合型のＦａｓＬの反応性を示す。（Ａ）には肝細胞に対する可溶型ＦａｓＬの細胞障害活性が示された。初代マウス肝細胞は１０μｇ／ｍｌのシクロヘキシミドがあり（黒丸）となし（白丸）でヒト可溶型ＦａｓＬの提示した濃度で３７℃で２２時間インキュベーションされた。インキュベーションの後、キットを用いて上清のＧＯＴ濃度が測定された。合計のＧＯＴ活性は０．１％ＮＰ−４０で細胞を溶解させた後で、細胞の溶解物中で測定された。特異的障害は合計のＧＯＴ活性に対する放出されたＧＯＴ濃度のパーセンテージとして表された。（Ｂ）にはマウス肝細胞に対する膜結合型ＦａｓＬの細胞障害活性が示された。マウス肝細胞は、ＷＲ１９Ｌ細胞（白丸）、またはＤ４変異体（クローンＤ４４、白四角）と、提示したＥ／Ｔ比で、３７℃で２２時間インキュベーションされた。インキュベーションの後、障害活性は上記のとおり測定された。（Ｃ）は可溶型ＦａｓＬによる膜結合型ＦａｓＬの細胞障害活性の阻害を示した。マウス肝細胞がＥ／Ｔ比２．０で、可溶型ＦａｓＬが提示した濃度で存在して、Ｄ４変異体を発現するＷＲ１９Ｌ細胞形質転換体と一緒に３７℃２２時間インキュベートされた。インキュベートの後、特異的障害活性が上記のとおり測定された。
〈ヒト可溶型Ｆａｓリガンドの精製〉
本発明者は以前、構成的にヒトＦａｓＬを発現する安定な形質転換体（１Ａ１２ Ｃｅｌｌ）を確立した。形質転換体は細胞表面にＦａｓＬを発現して、また培地中にも機能を持った可溶型ＦａｓＬを生産した（タナカ等、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．２，３１７−３２２，１９９６）。可溶型ヒトＦａｓＬを精製するために、１Ａ１２細胞は５％のＦＣＳを含むＰＲＭＩ培地で培養され、ＦａｓＬは抗ＦａｓＬ抗体（４Ｈ９）を固定したプロテインＡセファロースで親和的に精製された。およそ２００μｇの精製されたＦａｓＬがコンディションドメディウム２０００ｍｌから得られた。図１ａに提示したとおり、精製したＦａｓＬのポリアクリルアミドゲル電気泳動は分子量２６，０００に単一バンドを示し、これは活性化されたヒト末梢血リンパ球により生産される可溶型ＦａｓＬに似ていた（タナカ等、ＥＭＢＯ Ｊ．，１４，１１２９−１１３５，１９９５）。精製したＦａｓＬの細胞障害活性がＦａｓ発現マウスＷ４細胞をターゲットとして分析された時、それは２×１０^７ Ｕ／ｍｇの比活性を有し、これは基本的にＰｉｃｈｉａ Ｐａｓｔｏｒｉｓにより生産された組み換え可溶型ＦａｓＬと同じであった（タナカ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８，２３０３−２３０９，１９９７）。ヒトジャーカット細胞は内因性Ｆａｓを発現し、抗Ｆａｓ抗体誘導アポトーシスに感受性がある（タカハシ等、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２３，１９３５−１９４１，１９９３）。可溶型ＦａｓＬの細胞障害活性がジャーカット細胞を標的として分析されたとき、非常に弱い活性を示した。すなわち、可溶型ＦａｓＬの１μｇ／ｍｌが１５時間でたった３０％の細胞しか殺すことができず、ジャーカット細胞が、同じ条件で、可溶型ＦａｓＬに対し、マウスＷ４細胞より１０００倍以上非感受性であることを示す。
〈ＦａｓＬの切断位置〉
精製された可溶型ＦａｓＬのＮ末端のアミノ酸配列を決定するために該タンパク質はポリアクリルアミド上で電気泳動で分離され、ＰＶＤＦ膜に転写された。エドマン分解法による自動シークエンサーにおける精製された２６ｋＤａタンパク質の分析の結果、Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏの単一の配列が示された。この配列はヒトＦａｓＬの１３０〜１３７番のアミノ酸に正確に対応した。これらの結果から本発明者は、膜結合型として合成されたヒトＦａｓＬはＬｙｓ−１２９とＧｌｎ−１３０の間で切断されて可溶型になると結論づけた。
〈切断されないＦａｓＬを発現する細胞株の確立〉
切断されないＦａｓＬを発現する形質転換体を確立するために、切断部位に欠失や点変異がある一連の発現プラスミドを構築した。Ｄ４やＤ５は、それぞれ、−１９〜＋４と−２〜＋２のアミノ酸が欠失した欠失変異である。Ｄ６はＬｙｓ１２９をＡｌａに置き換えた点変異を持っている。これらの変異した遺伝子はヒトエロンゲーションファクター（ｐＥＦ）１α遺伝子のプロモーターの制御下におかれ、マウスＷＲ１９Ｌ細胞へ導入された。
変異ＦａｓＬが切断されるか否かを調べるために、それぞれの形質転換体は、メタロプロテアーゼ阻害剤ＢＢ２１１６を含有する培地中で２４時間培養され、次いで、阻害剤がはいっていない培地へ移された。それらを２４時間培養した後、培養上清中のＦａｓＬ活性とＦａｓＬタンパク質が分析された。表１に示すとおり、本来の切断部位を持つＦａｓＬの形質転換体は高濃度で培地中に可溶型ＦａｓＬを分泌した。切断部位における２３アミノ酸欠失変異遺伝子形質転換体（ＣＤ４）は全くＦａｓＬ活性を示さず、４アミノ酸欠失変異形質転換体（ＣＤ５）も、ほとんど、細胞障害活性を生じなかった。一方、−１でのＬｙｓからＡｌａへの点変異は依然ＦａｓＬの可溶型を生じた。形質転換体の培養上清と細胞破砕物は、次いで、抗ヒトＦａｓＬモノクローナル抗体（４Ｈ９）で免疫沈降され、免疫沈降は抗ヒトＦａｓＬポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロッティングで分析された。図２Ｂで示すとおり、それぞれのＦａｓＬ形質転換体から得られた細胞破砕物は３２〜３５ｋＤａの主要バンドを示し、それは欠失のサイズから予想されるものであった。野生型と点変異（Ｄ６）の上は分子量２６０００の可溶型ＦａｓＬを含むが、一方、可溶型ＦａｓＬタンパク質は欠失変異を発現する形質転換体（ＣＤ４とＣＤ５）の上清中では見られなかった。これらの結果は野生型とＤ６変異の上清中ではＦａｓＬ活性が検出され、Ｄ４とＤ５では検出されなかったことと一致する。
タンパク質切断に対する変異ＦａｓＬの耐性を確かめるために、細胞表面でのＦａｓＬ発現をフローサイトメトリーで調べた。図４で示すとおり、ＢＢ２１１６の存在下で培養した場合、全ての形質転換体が細胞表面に高濃度のＦａｓＬを発現した。野生株や置換変異体を発現する形質転換体をＢＢ２１６なしで培養した場合、細胞表面でのＦａｓＬの発現濃度は著しく減少した（約１０分の１）。一方、欠失変異の形質転換体（ＣＤ４およびＣＤ５）は同じ条件下で細胞表面からほとんどＦａｓＬを失わなかった。これらの結果はＦａｓＬの細胞外領域の切断部位のＥＫＱＩ配列は膜結合型ＦａｓＬの開裂に不可欠であることを示した。一方、−１位での単一置換変異は効果がないことは、−１位のアミノ酸（Ｌｙｓ）は開裂に重要ではないことを示唆した。
〈膜結合型ＦａｓＬの増大された細胞障害活性〉
本発明者は次いで、可溶型ＦａｓＬを生じない膜結合型ＦａｓＬが機能を有するか否かを調べた。図５に示すとおり、開裂可能または開裂不可能ＦａｓＬ（ｗｔまたはＤ４変異体）を発現する形質転換体はＷ４細胞に対して同程度の細胞障害活性を示し、膜結合型ＦａｓＬは活性があり、切断部位での２３アミノ酸の欠失はＦａｓＬがＦａｓに結合してアポトーシスを誘導する能力に影響しないことを示した。
次いで、標的としてジャーカット細胞を用いて、これらの形質転換体の細胞障害活性が調べられた。図６に示すとおり、非変異のＦａｓＬを発現する形質転換体がエフェクターとして用いられた場合、細胞障害活性は非常に低かった。一方、開裂できないＦａｓＬを発現するＤ４形質転換体がエフェクターとして用いられた場合、それらは効率的にジャーカット細胞を殺傷した。ジャーカット細胞の膜結合型ＦａｓＬへの反応性はＷ４細胞に匹敵するか僅かに劣る。つまり、約５０％のＷ４細胞がＥ／Ｔ比５．０で特異的に殺傷されるのに対し、２０％以上のジャーカット細胞がＥ／Ｔ比３．０で殺傷される。これらの結果は、少なくともヒトジャーカット細胞に対して、膜結合型ＦａｓＬが可溶型ＦａｓＬより潜在的な細胞障害性が強いことを示した。従って、非変異のＦａｓＬを発現する形質転換体がＢＢ２１１６で前処理された場合、その細胞は開裂できないＤ４変異体で観察されたのと同様な、ジャーカット細胞に対する強い細胞障害活性を示した（図６）。
膜結合型ＦａｓＬの細胞障害活性が可溶性ＦａｓＬのそれより強いことを確認するために、さらに本発明者はマウス初代培養肝細胞を標的として用いた。マウス肝細胞はＦａｓ受容体を発現し、シクロヘキシミドの存在下で、アゴニスティックな抗Ｆａｓ抗体、Ｊｏ２により殺される（ニー等、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．，２１５，３３２−３３７，１９９４）。可溶型ＦａｓＬが細胞障害のエフェクターとして用いられた場合、同様な結果が得られた。つまり、可溶型ＦａｓＬは肝細胞に対してほとんど細胞障害活性を示さないが、１０μｇ／ｍｌのシクロヘキシミドがあれば細胞死がおこる（図７Ａ）。一方、開裂することができない欠失変異ＦａｓＬ（Ｄ４）を発現する形質転換体をエフェクターとして用いると、シクロヘキシミドなしで効果的に肝細胞を殺す（図７Ｂ）。同様に、開裂できるＦａｓＬ（ｗｔ）を発現する形質転換体は弱い細胞障害活性を肝細胞に対して示すけれども、その細胞障害活性はそのエフェクター細胞をＢＢ２１１６で前処理することにより、大幅に増大する（データは省略する）。
〈可溶型ＦａｓＬの阻害効果〉
上述したとおり、非変異のＦａｓＬの形質転換体は膜結合型のＦａｓＬを高濃度で発現する（図３）が、その細胞障害活性は低い（図６）。これらの結果は形質転換体により産生された可溶型ＦａｓＬが細胞障害活性に対して阻害的に働くことを示唆した。この可能性を調べるために、肝細胞が様々な濃度の可溶型ＦａｓＬて前処理され、肝細胞のＦａｓＬの膜結合型（Ｄ４変異体）に対する反応性が調べられた。図７Ｃに示すとおり、可溶型ＦａｓＬは用量依存的に細胞障害活性を阻害し、０．４μｇ／ｍｌの可溶型ＦａｓＬはＥ／Ｔ比２．０で細胞障害活性の半分を阻害するのに十分であった。
本発明において、ヒトＦａｓＬの可溶型はヒトＦａｓＬ発現プラスミドにより形質転換されたマウスＴ細胞株で生産された。精製されたヒトＦａｓＬのＮ末端アミノ酸配列の決定は可溶型ヒトＦａｓＬがＬｙｓ１２９とＧｌｎ１３０の間で開裂して、放出されることを明らかにした。ＦａｓＬの切断部位近傍のアミノ酸配列（Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ）はヒト、ラット、およびマウスで観察され（タカハシ等、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６，１５６７−１５７４，１９９４）、そして切断部位近傍の４〜２３アミノ酸の欠失は可溶型ヒトＦａｓＬの上清中への放出を阻害した。この結果は、ＦａｓＬを認識して分解するプロテアーゼにとって、切断部位近傍の該アミノ酸配列が重要であることを示唆する。
ＩＩ型の膜タンパク質として合成されるＴＮＦファミリー構成員のなかで、ＴＮＦαとＣＤ４０リガンドは可溶型になることが示された（ペレ等、Ｃｅｌｌ，６３，２５１−２５８，１９９０；ピエトラベール等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，５９６５−５９６７，１９９６）。ＴＮＦαとＣＤ４０リガンドの切断部位は、それぞれＬｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｌａ／Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ、およびＡｓｎ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ／Ｍｅｔ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙである（アガーウォール等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０，２３４５−２３５４，１９８５；グラフト等、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２５，１７４９−１７５４，１９９５）。これらの配列はＦａｓＬ（Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ／Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ）と明白な類似性は示さず、ＴＮＦα、ＦａｓＬ、およびＣＤ４０リガンドは異なった基質特異性をもった別個のプロテアーゼにより分解されることを示す。これに対し、ＦａｓＬとＴＮＦαの放出はどちらもマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）阻害剤（ＢＢ２１１６）により阻害され（ジーリング等、Ｎａｔｕｒｅ ３７０，５５５−５５７，１９９４；マックジーハム等、Ｎａｔｕｒｅ，３７０，５５８−５６１，１９９４；モーラー等、Ｎａｔｕｒｅ，３７０，２１８−２２０，１９９４；タナカ等、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．２，３１７−３２２，１９９６）、ＴＮＦαとＦａｓＬを開裂するプロテアーゼは似た活性部位を有することを示唆する。最近、ＴＮＦαを分解するプロテアーゼ（ＴＡＣＥ，ＴＮＦα変換酵素）が同定されＡ Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ Ａｎｄ Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅドメインを有する膜タンパク質であるＡＤＡＭファミリープロテアーゼの構成員であることが示された（ブラック等、Ｎａｔｕｒｅ ３８５，７２９−７３３，１９９７；モス等、Ｎａｔｕｒｅ，３８５，７３３−７３６，１９９７）。今まで、このファミリーの１０以上が知られている（ハワード等、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１９９６；ウォルフスバーグ等、Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｂｉｏｌ．，１６９，３７８−３８３，１９９５；ヤガミ等、Ｎａｔｕｒｅ，３７７，６５２−６，１９９５）。あるものは精巣や筋肉で特異的に発現して、特異的な機能を有しているが、これに対し他のものはむしろ至るところで発現し、機能は不明である。ＦａｓＬを切断するプロテアーゼもＡＤＡＭファミリープロテアーゼの一員であるようだ。ＴＮＦα切断部位近傍の配列を有する１２アミノ酸ペプチドはＴＡＣＥを特定し、それを精製するためにうまく用いられた（ブラック等、Ｎａｔｕｒｅ ３８５，７２９−７３３，１９９７；モス等、Ｎａｔｕｒｅ，３８５，７３３−７３６，１９９７）。この研究で明らかにされたヒトＦａｓＬの切断部位の情報により本発明者はＦａｓＬの開裂に関与するプロテアーゼを特定するのに用いるペプチド基質を設計できる。
ＴＮＦαとＣＤ４０リガンドで示されたとおり（ペレ等、Ｃｅｌｌ，６３，２５１−２５８，１９９０；ピエトラベール等、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２６，７２５−７２８，１９９６）、膜結合型ＦａｓＬは機能を有しており、ＦａｓＬはその機能を発揮するのに細胞内に入る必要はないことは確実である。ＦａｓＬのＦａｓへの結合はＦＡＤＤやＦＬＩＣＥのようないくつかのシグナル要素とＦａｓ受容体を含むＤＩＳＣ（Ｄｅａｔｈ−Ｉｎｄｕｃｉｎｇ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｃｏｍｐｌｅｘ）の形成を誘導し、細胞を殺す。本発明者はある細胞は可溶型および膜結合型ＦａｓＬに異なった反応性を有することを見出した。過剰にＦａｓを発現するマウスＷ４細胞は可溶型のＦａｓＬて効率的に殺されるが、適当な濃度の内因性Ｆａｓを発現するヒトジャーカット細胞やマウス初代培養肝細胞は可溶型ＦａｓＬに耐性である。一方、ジャーカット細胞と肝細胞は効果的に膜結合型ＦａｓＬて殺される。この現象はどのように説明できるであろうか。ＴＮＦがレセプターに結合した場合、そのＴＮＦ／ＴＮＦレセプター複合体は、インターナライズし、分解され、レセプターのダウンレギュレーションを引き起こす（ツジモト等、Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８２，７６２６−７６３０，１９８５；ワタナベ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．，Ｃｈｅｍ．，２６３，１０２６２−１０２６６，１９８８）。同様なインターナリゼーションと分解がＦａｓＬ／Ｆａｓ系でも生じるのかもしれない。可溶型ＦａｓＬ／Ｆａｓ複合体は容易にインターナライズするかもしれない。膜結合型ＦａｓＬとＦａｓのインターナリゼーションは遅延するようだ。最近、メデマ等（メデマ等、ＥＭＢＯ Ｊ．，１６，２７９４−２８０４，１９９７）は、Ｆａｓ誘導アポトーシスの最も早いシグナル伝達分子の１つであるＦＬＩＣＥは細胞質膜でＤＩＳＣ中のみで活性化されるに違いないと報告した。Ｆａｓ受容体が可溶型ＦａｓＬにより迅速にインターナライズされる場合、膜結合型ＦａｓＬにより誘導されるＤＩＳＣは長くとどまりＦＬＩＣＥを活性化するのに対して、可溶型ＦａｓＬによるＦＬＩＣＥの活性化は非常に少ない。Ｗ４細胞はジャーカット細胞や肝細胞よりＦａｓを数多く発現するため、弱いシグナルの合計は細胞を殺すのに十分である。さらに可溶型ＦａｓＬがＦａｓ受容体の急速なダウンレギュレーションを起こしたら、膜結合型ＦａｓＬの細胞障害活性を阻害するだろう。本発明者は、Ｆａｓが誘導するアポトーシスを協調して刺激する（膜結合性ＦａｓＬとは）別の膜分子の存在の可能性を除外することはできないが、上記の説明は可能性のある説明であると考える。
本発明者は、最近ヒトＨＢＶのエンベロープ遺伝子を肝臓で発現するトランスジェニックマウスがエンベロープ類蛋白を認識するＣＴＬクローンを少量（３×１０^６細胞）注射されたとき、マウスは肝炎を起こしてＦａｓ依存性態様で死んだことを示した（コンドウ等、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．，３，４０９−４１３，１９９７）。一方、同様の効果を示すには大量の組み換え可溶型ＦａｓＬが必要であった（タナカ等、１５８，２３０３−２３０９，１９９７）。これらの結果は膜結合型ＦａｓＬこそがインビボで機能性ＦａｓＬてあるという上述の結果から説明される。同様の発見が、前にＴＮＦαで報告された、つまり、可溶型ＴＮＦでなく膜結合型ＴＮＦαが細胞死を起こすＴＮＦタイプＩＩ受容体を活性化し（グレル等、Ｃｅｌｌ，８３，７９３−８０２，１９９５）、可溶型ＴＮＦでなく膜結合型ＴＮＦαがリーシュマニアに対する防御活性化に関与することが示された（シペックとウィリー、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７４，７５５−７５９，１９９１）。最近、サロルザノ等がメタロプロテアーゼ阻害剤（ＢＢ２１１６）がマウスにおけるＣｏｎＡ誘導肝炎を起こし得ることが示された（サロルザノ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８，４１４−４１９，１９９７）。ＣｏｎＡ活性化Ｔ細胞からのＴＮＦとＦａｓＬの放出の抑制はより多くの肝細胞の細胞死を起こし得る。
本発明者は、可溶型ＦａｓＬを発見したとき、Ｆａｓ受容体は多くの組織で発現されるので可溶型ＦａｓＬが全身性組織破壊を引き起こすと考えた（タナカ等、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．２，３１７−３２２，１９９６；タナカ等、ＥＭＢＯ Ｊ．，１４，１１２９−１１３５，１９９５）。しかし可溶型でなく膜結合型ＦａｓＬに細胞障害活性が見つかったのでＦａｓＬ誘導細胞死は局所的な反応であることが示唆される。免疫系の監視では、細胞障害性リンパ球がウイルス感染細胞や癌細胞を認識し、活性化される。細胞表面で発現したＦａｓＬは標的細胞を局所的に殺し、放出によりダウンレギュレートされる。この機構が無関係な健康な細胞を殺さないことを保証する。血清中に可溶型のヒトＦａｓＬを保有するヒト疾患全てではなく、一部のみが肝炎と好中球減少症を示したことは（タナカ等、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．２，３１７−３２２，１９９６）、可溶型ＦａｓＬそのものは普通の細胞に対して無毒である事と一致する。細胞が例えばＦａｓ発現の正の調節によりＦａｓ誘導アポトーシスに感作させれば、これら細胞は可溶型ＦａｓＬで殺されるだろう。
ＦａｓＬは目や精巣で構成的に発現され、免疫回避に対するその役目が示唆される（ベルグロ等、Ｎａｔｕｒｅ ３７７，６３０−６３２，１９９５；グリフィス等、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７０，１１８９−１１９２，１９９５）。この現象を応用して、いくつかのグループは最近移植で免疫の攻撃から逃げるためにＦａｓＬを発現しようとした。ある報告では、ＦａｓＬを発現する筋芽細胞と共に移植したランゲルハンスβ細胞は長く生き残った（ロー等、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７３，１０９−１１２，１９９６）が、一方、他の報告では、ＦａｓＬを発現するβ細胞または腫瘍細胞は好中球を増やし、ＦａｓＬを発現しない細胞より速やかに殺された（アリソン等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９４，３９４３−３９４７，１９９７；セイノ等、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３，１６５−１７０，１９９７）。以前、タラップ等は可溶型ＴＮＦを生産する腫瘍細胞が炎症をおこすが、一方、膜結合型ＴＮＦを生産する細胞は炎症をおこさないことを報告した（タラップ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４９，２０７６−２０８１，１９９２）。これにより、移植片で膜結合型ＦａｓＬだけを産生する様に設計されたＦａｓＬを発現することは興味深いかもしれない。
産業上の利用可能性
本発明により、Ｆａｓアンタゴニストとして機能する可溶性Ｆａｓリガンド、細胞障害活性に優れた新規な膜結合性Ｆａｓリガンド誘導体および該ペプチドをコードするＤＮＡが提供され、ＦａｓＬ誘導アポトーシスが関与する疾患の、治療および予防等に寄与することができる。
【配列表】

【図面の簡単な説明】
図１は、精製されたヒト可溶型Ｆａｓリガンドを示す図である。
（Ａ）は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析の結果を示す。
（Ｂ）は、可溶性ＦａｓＬの細胞障害活性を示すグラフである。
図２は、欠失や点変異を有するＦａｓＬ構築の概要図である。
図３は、形質転換体におけるヒトＦａｓＬの免疫的検出結果を示す図である。
図４は、細胞表面上でのＦａｓＬの発現結果を示す図である。
図５は、膜結合型ＦａｓＬのＦａｓを過剰に発現するマウスＷ４細胞の細胞障害結果を示す図である。
図６は、ヒトジャーカット細胞に対する膜結合型ＦａｓＬの増大された細胞障害活性の結果を示す図である。
図７（Ａ）は、肝細胞に対する可溶型ＦａｓＬの細胞障害活性を示し、（Ｂ）は、マウス肝細胞に対するＦａｓＬの細胞障害活性を示し、（Ｃ）は、可溶型ＦａｓＬによる膜結合型ＦａｓＬの細胞障害活性結果を示す図である。

Claims (5)

1. 天然型ヒトＦａｓリガンドのＮ末端から１１１〜１３３番のアミノ酸のうち、１２８〜１３１番を含む連続した４個〜２３個のいずれかの個数のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列を含有する新規Ｆａｓリガンド誘導体。
2. プロテアーゼ耐性及び細胞傷害活性を有する、請求項１に記載の新規Ｆａｓリガンド誘導体。
3. Ｎ末端から８〜６９番のアミノ酸が欠失した、請求項１または２に記載の新規Ｆａｓリガンド誘導体。
4. 配列番号１または２に記載したアミノ酸配列を含有する新規Ｆａｓリガンド誘導体。
5. 請求項１〜４のいずれかに記載の新規Ｆａｓリガンド誘導体をコードするＤＮＡ。

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