JP2000300266A - ポリペプチド及びｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 慢性関節リウマチにおけるＴ細胞レセプター
と結合する新規自己抗原ポリペプチド、このポリペプチ
ドをコードする新規ＤＮＡ及びこの自己抗原ポリペプチ
ドを使用した拮抗剤を提供する。 【解決手段】 配列表の配列番号１で表されるアミノ酸
配列を有し、ヒトカテプシンＤのエピトープ部位との相
同性を有するポリペプチド、そのアナログ又は修飾化合
物、配列表の配列番号２で表される塩基配列を有するＤ
ＮＡを含む配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列
を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、並びに、上
記ポリペプチドの少なくとも１種を有効成分として含有
する拮抗剤。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明が属する技術分野】本発明は、慢性関節リウマチ
における病巣に浸潤した病的Ｔ細胞のＴ細胞レセプター
と結合する新規自己抗原ポリペプチドに関する。上記ポ
リペプチドは、拮抗剤として使用することができ、医薬
品として有用である。

【０００２】

【従来の技術】慢性関節リウマチは、多発性関節炎を主
症状とする目下のところ原因が特定されていない慢性炎
症性疾患である。慢性関節リウマチ患者の関節病巣には
Ｔ細胞が浸潤しており、このＴ細胞は、病巣局所で自己
抗原を認識していると考えられている。従って、慢性関
節リウマチの病因解明のためにＴ細胞の認識する内在性
自己抗原を検出することは重要である。

【０００３】抗原は、マクロファージに取り込まれて部
分分解などのプロセッシングをうけた後、抗原提示細胞
の主要組織適合抗原系（ＭＨＣ）分子上に提示される。
この抗原は、ＭＨＣ分子と複合体を形成し、ＭＨＣ分子
とともにＴ細胞レセプターにより認識されて、その結
果、特定のＴ細胞クローンの増殖がおこり、分化を遂げ
与えられた機能を遂行することにより免疫応答がなされ
る。自己の体内で産生されたその個体自身の構成成分で
ある自己ポリペプチドも、外来性抗原と同様の機序によ
り、一旦エンドサイトーシスにより細胞外からマクロフ
ァージに取り込まれプロセッシングされていると考えら
れる。

【０００４】プロセッシングされたペプチドは、抗原性
の有無にかかわらず、ａ）アミノ酸の側鎖の生化学的性
質、ｂ）分子の大きさ、ｃ）高次構造等の特性に依存し
て、ＭＨＣ分子のＢｊｏｒｋｍａｎ’ｓ ｇｒｏｏｖｅ
と称される溝の中の、１０個のポケットと呼ばれる部分
にアンカーペプチドを介して結合される。このポリペプ
チド上にＴ細胞レセプターと結合するエピトープが存在
する場合にのみ、Ｔ細胞の活性化を引き起こすシグナル
が伝わり、Ｔ細胞クローンの増殖がおこる。

【０００５】この知見を基礎とすることにより、慢性関
節リウマチの関節局所に存在するＴ細胞の遺伝子、及
び、慢性関節リウマチ患者においてその出現頻度が高い
ＭＨＣクラスＩＩ分子の遺伝子（ＨＬＡ ＤＲ等）を用
い、遺伝子工学的手法により、Ｔ細胞レセプターが認識
する自己抗原のスクリーニングをすることができる。例
えば、第４２回日本リウマチ学会学術集会予稿集（大久
保ら、１９９８年４月９日発行）には、慢性関節リウマ
チにおけるＴ細胞の認識する自己抗原の遺伝子工学的検
出方法により、Ｔ細胞レセプターに対する親和性を有す
るポリペプチドを探索した結果、核内タンパク質や細胞
膜糖タンパク質等の関節病巣に豊富に存在し、組織破壊
により供給されているタンパク質分子群がＨＬＡ ＤＲ
分子と結合している可能性が示唆されており、このタン
パク質群のなかに、Ｔ細胞レセプターと親和性を示すク
ローンとしてカテプシンＤと一致するｃＤＮＡの存在が
報告されている。

【０００６】カテプシンＤは、慢性関節リウマチにおけ
る関節破壊に関与する酸性プロテアーゼの一種であり、
病巣関節の滑膜組織、骨・軟骨組織等に存在することが
知られている（例えば、井上ら、炎症、ｖｏｌ．１５，
ｎｏ．４，Ｊｕｌ．，１９９５）。

【０００７】ヒトカテプシンＤについては、その塩基配
列もすでに知られており（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８５），８２（１
５），４９１０−１４）、癌浸潤の領域での遺伝子レベ
ルの研究等がなされており、組織破壊に関与するとの知
見がすでに得られている。例えば、特表平９−５０５９
９２号公報には、カテプシンＤがサイトカインによって
誘導されるプログラム細胞死を引き起こすことが示唆さ
れており、また、カテプシンＤに対するアンタゴニスト
を、サイトカインによって誘導されるプログラム細胞死
に対する防止用の活性薬剤として使用可能であることが
開示されている。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上述の現状
に鑑みて、慢性関節リウマチにおけるＴ細胞レセプター
と結合する新規自己抗原ポリペプチド、このポリペプチ
ドをコードする新規ＤＮＡ及びこの自己抗原ポリペプチ
ドを使用した拮抗剤を提供することを目的とするもので
ある。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明は、配列表の配列
番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドで
ある。本発明はまた、配列表の配列番号１で表されるア
ミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠
失、置換、付加又は修飾されたアミノ酸配列を有し、か
つ、慢性関節リウマチにおける病巣に浸潤したＴ細胞の
Ｔ細胞レセプターとの結合性を有するポリペプチドであ
る。本発明は、また、１６個のアミノ酸配列からなり、
少なくとも、ヒトカテプシンＤのエピトープ部位に存在
する、Ｌｅｕ Ｔｒｐ、Ｌｅｕ Ｇｌｙ及びＧｌｙの順
に並び、Ｌｅｕ ＴｒｐとＬｅｕ Ｇｌｙとは１つのア
ミノ酸残基を隔て、Ｌｅｕ ＧｌｙとＧｌｙとは４つの
アミノ酸残基を隔てるアミノ酸配列モチーフを有し、か
つ、慢性関節リウマチにおける病巣に浸潤したＴ細胞の
Ｔ細胞レセプターとの結合性を有する上記ポリペプチド
でもある。本発明は更に、配列表の配列番号２で表され
る塩基配列を有するＤＮＡである。本発明はまた、配列
表の配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペ
プチドをコードするＤＮＡである。本発明はまた、上記
いずれかのＤＮＡにおいて、１若しくは数個の核酸トリ
プレットが欠失、置換、付加又は修飾された塩基配列を
有するＤＮＡであって、かつ、慢性関節リウマチにおけ
る病巣に浸潤したＴ細胞のＴ細胞レセプターとの結合性
を有するポリペプチドをコードするＤＮＡである。本発
明はまた、配列表の配列番号２で表される塩基配列のＤ
ＮＡとストリンジェントな条件下でアニールし、かつ、
慢性関節リウマチにおける病巣に浸潤したＴ細胞のＴ細
胞レセプターとの結合性を有するポリペプチドをコード
するＤＮＡである。本発明は更にまた、上記ポリペプチ
ドの少なくとも１種を有効成分として含有する拮抗剤で
ある。以下に本発明を詳述する。

【００１０】

【発明の実施の形態】本発明のポリペプチドは、配列表
の配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する。上記ポ
リペプチドは、慢性関節リウマチにおける病巣に浸潤し
た病的Ｔ細胞のＴ細胞レセプターとの結合性を有するも
のである。

【００１１】上記配列表の配列番号１で表されるアミノ
酸配列を有するポリペプチドには、関節の滑膜組織の滑
膜細胞中に発現するヒトカテプシンＤのエピトープ部位
ＰｒｏＬｅｕ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｓ
ｐ Ｖａｌ Ｐｈｅ ＩｌｅＧｌｙ Ａｒｇ（配列表の
配列番号３）との相同性を有する部位があり、上記エピ
トープ部位に存在するＬｅｕ Ｔｒｐ、Ｌｅｕ Ｇｌｙ
及びＧｌｙ（上記配列の下線部で示す）の順に並び、Ｌ
ｅｕ ＴｒｐとＬｅｕ Ｇｌｙとは１つのアミノ酸残基
を隔て、Ｌｅｕ ＧｌｙとＧｌｙとは４つのアミノ酸残
基を隔てるアミノ酸配列モチーフを、アミノ酸番号７〜
１６番にかけて有する。上記配列表の配列番号１で表さ
れるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、文献未記載
の新規ポリペプチドである。

【００１２】なお、上記配列表の配列番号１で表される
アミノ酸配列を有するポリペプチドは、外来性抗原であ
るサイトメガロウイルスが持つアミノ酸配列Ａｓｐ Ｌ
ｅｕＣｙｓ Ｇｌｕ Ａｒｇ（配列表の配列番号４）と
も相同性があり、上記配列の下線部で示すモチーフを共
有する。従って、慢性関節リウマチにおけるＴ細胞の活
性化に、外来性ウイルスと自己抗原とのＴ細胞レセプタ
ー認識レベルにおける交差反応性が誘因となっているこ
とが示唆される。

【００１３】また、タンパク質中のアミノ酸残基のうち
には、ある生物学的機能を発揮するうえで必須ではない
ものが存在し、そのようなアミノ酸残基の置換、欠失、
付加物等により、そのタンパク質の生物活性に本質的な
影響を与えない場合があるという事実は、よく知られて
いる。従って、上記配列表の配列番号１で表されるアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドにおいて、慢性関節リウ
マチにおける病巣に浸潤したＴ細胞のＴ細胞レセプター
との結合性を発揮するうえで必須ではないアミノ酸の一
つ若しくは数個が置換、欠失、付加物若しくは修飾され
たもの、又は、その生物学的機能を発揮するために必須
ではない領域において、一つ若しくは数個のアミノ酸が
置換、欠失、付加物又は修飾されたアミノ酸配列であっ
ても、慢性関節リウマチにおける病巣に浸潤したＴ細胞
のＴ細胞レセプターとの結合性を有するかぎり、本発明
のポリペプチドである。

【００１４】本発明のＤＮＡは、配列表の配列番号２で
表される塩基配列を有するものである。上記ＤＮＡは、
上記配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列を有す
るポリペプチドをコードすることができる。配列表の配
列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡは、滑膜細
胞由来のヒトカテプシンＤのｃＤＮＡとサザン法により
アニールすることができる。

【００１５】これらの事実から、上記配列表の配列番号
１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、ヒ
ト滑膜細胞由来の自己抗原であると考えられる。

【００１６】上述の、第４２回日本リウマチ学会学術集
会予稿集（大久保ら、１９９８年４月９日発行）には、
Ｔ細胞レセプターと親和性を示すクローンとしてカテプ
シンＤに一致するクローンが存在したことが記載されて
いるが、カテプシンＤは４１２個のアミノ酸残基からな
る大きな分子であり（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８５），８２（１５），４
９１０−１４）、アミノ酸残基１６個程度のポリペプチ
ドとは全く異なるタンパク質である。従って、このよう
な事実からは、本発明のペプチドがＴ細胞レセプターと
結合性を有することは予想外である。

【００１７】本発明のＤＮＡには、上記配列表の配列番
号２で表される塩基配列を有するもの以外のＤＮＡも含
まれる。一般に、遺伝子コドンは１つのアミノ酸に対し
て縮重している。従って、上記配列表の配列番号２で表
される塩基配列以外にも配列表の配列番号１で表される
アミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
は存在し得るので、このようなＤＮＡもまた本発明のＤ
ＮＡである。

【００１８】本発明のＤＮＡはまた、上記いずれかのＤ
ＮＡにおいて、１若しくは数個の核酸トリプレットが欠
失、置換、付加又は修飾された塩基配列を有するＤＮＡ
であっても、慢性関節リウマチにおける病巣に浸潤した
Ｔ細胞のＴ細胞レセプターとの結合性を有するポリペプ
チドをコードすることができるかぎり、本発明のＤＮＡ
である。このようなＤＮＡには、上述したような、上記
配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポ
リペプチドにおいて、アミノ酸の一つ若しくは数個が置
換、欠失、付加又は修飾されたアミノ酸配列を有し、か
つ、慢性関節リウマチにおける病巣に浸潤したＴ細胞の
Ｔ細胞レセプターとの結合性を有するポリペプチドをコ
ードするＤＮＡが含まれる。

【００１９】本発明のＤＮＡはまた、配列表の配列番号
２で表される塩基配列のＤＮＡとストリンジェントな条
件下でアニールし、かつ、慢性関節リウマチにおける病
巣に浸潤したＴ細胞のＴ細胞レセプターとの結合性を有
するポリペプチドをコードするＤＮＡであってもよい。
なお、本明細書中、ストリンジェントな条件とは、当業
者において通常使用されている意味において使用するも
のとする。

【００２０】本発明のポリペプチドは、上述のように、
ヒトカテプシンＤとの相同性を有する。ヒトカテプシン
Ｄは、慢性関節リウマチ患者の病巣において増殖する滑
膜細胞に存在し、Ｔ細胞レセプターと結合する自己抗原
である。このヒトカテプンシンＤは、慢性関節リウマチ
病態に付随する上記配列表の配列番号１で表されるアミ
ノ酸配列を有する本発明のポリペプチドと相同性を有す
ることから、慢性関節リウマチを引き起こす抗原の一つ
であると推定される。この知見もまた、文献未記載の新
規知見である。

【００２１】従って、本発明のポリペプチドは、ヒトカ
テプシンＤのアンタゴニストとして使用することができ
る。例えば、慢性関節リウマチ患者の病巣において、カ
テプシンＤに対する拮抗剤として使用することがありう
る。この場合、慢性関節リウマチのＴ細胞の自己免疫反
応を抑制することができる可能性があり、慢性関節リウ
マチ治療剤としての有用性が期待できる。

【００２２】このような拮抗剤には、安定剤等の周知の
その他の成分を、本発明の目的を阻害しない範囲で使用
することができる。また、薬理学的に許容される担体を
配合することができる。更に、所望の組織を標的に上記
拮抗剤を輸送するための手段を含んでいてもよい。

【００２３】

【実施例】以下に実施例等を掲げて本発明を更に詳しく
説明するが、本発明はこれらのみに限定されるものでは
ない。

【００２４】実施例１ （１）慢性関節リウマチのＴ細胞レセプターｃＤＮＡの
調製 慢性関節リウマチでは、病巣局所に浸潤するＴ細胞が、
ある程度のクロナリティーをもって存在していることが
知られている。成熟Ｔ細胞レセプターは、主としてα鎖
とβ鎖の２本のポリペプチド鎖がジスルフィド結合した
ヘテロ二量体からなる。この各鎖は、各々のＴ細胞ごと
の抗原特異性に対応して異なる可変部（Ｖ領域）と、一
定の生理活性をもつ定常部とからなっている。Ｔ細胞レ
セプターのＶβ遺伝子のコードするタンパク分子は、こ
のＴ細胞の抗原認識機能分子であり、直接抗原分子と接
触する部分として重要である。

【００２５】同意を得て採取された慢性関節リウマチ患
者の、ＨＬＡ（ヒト白血球抗原）タイピングにより、ク
ラスＩＩ ＤＲ Ｂ１＊０４０１及び＊０４０５陽性の
膝関節組織手術標本から浸潤Ｔ細胞を含む滑膜組織を採
取し、常法により、ｍＲＮＡを抽出し（ＲＮＡｓｏｌ
（Ｔｅ−Ｔｅｓｔ Ｉｎｃ．社製）を使用した）、逆転
写酵素（ギブコＢＲＬ社製）を用いて浸潤Ｔ細胞を含む
滑膜組織のｃＤＮＡを作成した。

【００２６】こうして得られたｃＤＮＡからＴ細胞レセ
プター遺伝子を得るために、山本らの方法（Ｉｎｔ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．，Ｎｏｖ．４（１１），１２１９−１２
２３（１９９２））により、Ｔ細胞レセプターＶβ遺伝
子特異的なＰＣＲ法を行った（Ｔａｋａｒａ，Ｔａｑ使
用）。増幅された滑膜組織浸潤Ｔ細胞レセプターのＶβ
遺伝子は、池田らの方法（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅ
ｕｍ．，Ｍａｒ．，３９（３），４４６−４５３（１９
９６））によりその塩基配列を決定した。

【００２７】こうして決定された塩基配列から、 ｉ）当該患者の膝関節以外の関節から得られたｃＤＮＡ
にも同じ塩基配列があること、 ｉｉ）末梢血Ｔ細胞にも同じ塩基配列を認めること、 ｉｉｉ）他の慢性関節リウマチ患者にも共通したアミノ
酸配列モチーフがあること、及び、ｉｖ）増幅したｃＤ
ＮＡを電気泳動してそのＤＮＡ量が多いこと の４点を満たすものを、Ｔ細胞レセプターｃＤＮＡ（Ｔ
ＣＲ Ｖβ３）として選択した。選択されたｃＤＮＡの
塩基配列を配列表の配列番号５に示す。配列番号５は、
ＨＬＡ ＤＲ Ｂ１＊０４１０＊０４０５の遺伝子背景
を持つ慢性関節リウマチ患者で、複数の関節と末梢血と
に共通して集積していたＴＣＲ Ｖβ３のｃＤＮＡの６
７番から２４０番の塩基配列である。

【００２８】（２）それぞれ１６個のアミノ酸残基から
なるランダムなアミノ酸配列を有するポリペプチド群を
規定するｃＤＡＮ群の調製 １つのアミノ酸は１つのコドン、すなわち、４種類の核
酸Ａ（アデニン）、Ｔ（チミン）、Ｇ（グアニン）及び
Ｃ（シトシン）からなる３つの核酸が組み合わされた３
塩基連鎖（トリプレット）によって規定されている。特
定のｃＤＮＡはベクターとよばれるプラスミドに組み込
むことによって、大腸菌や酵母等の宿主内に導入され
て、リコンビナントタンパクを作成できる。従って、生
化学的にランダムになるようにｃＤＮＡ群を作成し、こ
のようなｃＤＮＡの適当な数を組み込んだ宿主からは、
ランダムなアミノ酸配列のペプチド群が得られる。

【００２９】それぞれ１６個のアミノ酸残基からなるラ
ンダムなアミノ酸配列を有するポリペプチド群を規定す
るｃＤＡＮ群の調製に際しては、周知の方法で人工的に
ＤＮＡを合成する方法を採用することもできるが、この
ようなランダムなアミノ酸配列をもつ１６個のアミノ酸
残基からなるペプチド群を得ることができるようなｃＤ
ＮＡ群は、既に市販されており、このようなものを適宜
使用してもよい。具体的には、例えば、クローンテック
社製のランダムペプチドライブラリー等を挙げることが
できる。本発明においては、このランダムペプチドライ
ブラリーを使用してペプチド群を調製した。

【００３０】（３）タンパク質とタンパク質との相互作
用を検出する酵母菌による発現システムの構築 Ｔ細胞レセプターと、上述のようにして得られる１６個
のアミノ酸残基からなり、ランダムなアミノ酸配列を有
するポリペプチド群抗原タンパク質との結合を遺伝子工
学的に模すために、Ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄシステムを用
いた。Ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄシステムは、タンパク質と
タンパク質との相互作用を細胞内で検出することができ
るように構築された発現システムとして知られている。

【００３１】この方法は、目的タンパク質を転写因子の
ＤＮＡ結合ドメインに融合し、転写因子の転写活性化ド
メインに目的タンパク質と相互作用するタンパク質を融
合させ、両者を同時に、酵母菌等の細胞内で発現させ、
タンパク質間相互作用をレポーター遺伝子の活性を指標
に検出するものである。この際、転写活性化ドメインと
融合するように構築したｃＤＮＡライブラリーを酵母細
胞に導入し、レポーター遺伝子の活性化が起こった酵母
細胞のコロニーをとると、目的タンパク質と相互作用す
るタンパク質のｃＤＮＡがクローニングされる。従っ
て、Ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄシステムによれば、あるタン
パク質に相互作用するタンパク質のｃＤＮＡをライブラ
リーからクローニングすることができる。

【００３２】このようなシステムとしては特に限定され
ず、上述の機能を発揮することができるようなシステム
を、当業者なら適宜構築することができる。また、この
ようなシステムはすでに市販されており、このようなも
ののうちから適宜選択して使用することができる。具体
的には、例えば、クローンテック社製のＴｗｏ−ｈｙｂ
ｒｉｄシステム（例えば、Ｂａｒｔｅｌ，ＰＬら、Ｕｓ
ｉｎｇ ｔｈｅ ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ
ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉ
ｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ． Ｉｎ ｃｅｌｌｕｌａ
ｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｄｅｖｅｌｏｐ
ｍｅｎｔ： ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃ
ｈ，Ｄ．Ａ．ハートレイ，オックスフォードユニバーシ
ティプレス，ｐｐ．１５３−１７９，１９９３に記載）
等を挙げることができる。

【００３３】Ｔ細胞レセプターと、上述のようにして得
られた１６個のアミノ酸残基からなり、ランダムなアミ
ノ酸配列を有するポリペプチド群抗原タンパクとの結合
を遺伝子工学的に模すために、酵母菌を発現細胞として
使用した上記クローンテック社製Ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ
システムを用いてクローニングを行い、Ｔ細胞レセプタ
ーとの結合性を有すると推定される１６個のアミノ酸残
基からなるポリペプチドをコードするｃＤＮＡを選択し
た。この塩基配列を配列表の配列番号２に示した。これ
に対応するアミノ酸配列は、Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｌｅｕ
Ｇｌｙ ＩｌｅＧｌｙ（配列表の配列番号１）である。
この配列は、ヒトカテプシンＤのエピトープ部位Ｐｒｏ
Ｌｅｕ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｓｐ
ＶａｌＰｈｅ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ａｒｇ（配列表の配列
番号３）と相同性を有することは注目に値する。

【００３４】（４）滑膜細胞からのｃＤＮＡの調製 Ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄシステムで得られた、慢性関節リ
ウマチ患者局所のＴ細胞レセプターとの結合性を持つと
推定される１６残基のアミノ酸配列を規定する、上述の
配列表の配列番号２の配列をもつｃＤＮＡが、滑膜細胞
に発現しているメッセージ（ｍＲＮＡ）と一致するもの
であるか否かを決定するために、滑膜細胞からｃＤＮＡ
を得た。滑膜細胞としては、慢性関節リウマチ患者の膝
関節手術時に同意のもとに得られた滑膜組織から血球を
排除した後、１０％ＦＣＳ、ＲＰＭＩ１６４０培養液中
で培養し、培養プラスチックプレートに接着性に自律増
殖した繊維芽細胞様の細胞を使用した。この滑膜細胞か
らのｃＤＮＡの作成は、常法に従い、ｍＲＮＡを抽出し
（ＲＮＡｓｏｌ（Ｔｅ−Ｔｅｓｔ Ｉｎｃ．社製）を使
用した）、逆転写酵素（ギブコＢＲＬ社製）を用いて実
施した。

【００３５】（５）Ｔ細胞レセプター結合タンパク質の
ｃＤＮＡと滑膜細胞ｃＤＮＡとのサザンハイブリダイゼ
ーション 上述の、Ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄシステムで得られた慢性
関節リウマチ患者局所のＴ細胞レセプターとの結合性を
持つと推定される１６残基のアミノ酸配列を規定する配
列表の配列番号２の配列をもつｃＤＮＡを、常法に従
い、ビオチン化プローブとし、これを用いて上記（４）
で得られた滑膜細胞からのｃＤＮＡに対して、常法に従
ってサザンハイブリダイゼーションを行った。ハイブリ
ダイゼーションの条件は、４５％ホルムアミド／５×Ｓ
ＳＣ／１×Ｄｅｎｈａｒｄｔ／２０ｍＭＮａＰＯ₄ ，ｐ
Ｈ６．５／１０％Ｎａ−デキトストラン硫酸に変性サケ
精巣ＤＮＡを２００μｇ／ｍＬ加えたハイブリダイゼー
ション液に、Ｎａ−デキトストラン硫酸を含まない溶液
でのプレハイブリダイゼーション後に、４２℃、１６時
間浸漬して反応させるものであった。

【００３６】上記ビオチン化プローブの結合を認めたメ
ンブレンからＤＮＡのバンドに対応する部分を切り取っ
てＤＮＡを回収し、制限酵素（ＤｒａＩ、トーヨーボー
社製）で処理した後、塩基配列解析用ＴＡベクター（タ
カラ社製）に挿入し、塩基配列を決定した。このように
して決定した塩基配列のうちに、配列表の配列番号６に
示したものが見いだされた。この塩基配列は、カテプシ
ンＤの塩基配列の３６１番から４８０番に一致するもの
であった。従って、回収されたＤＮＡはカテプシンＤの
ものであった。

【００３７】（６）Ｔ細胞の反応性の解析 上述の、ヒトカテプシンＤのアミノ酸配列のなかで、上
記（３）により実験的に得られたＴ細胞レセプターと結
合する配列（すなわち、配列表の配列番号１のアミノ酸
配列）と類似した配列は、Ｌｅｕ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ｌ
ｅｕ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｇｌ
ｙ（配列表の配列番号３のアミノ配列のうち、アミノ酸
番号２〜１１の配列に相当）である。Ｈａｍｍｅｎらは
ＨＬＡ ＤＲ Ｂ１＊０４０１のアンカーとなるアミノ
酸配列をすでに示しているが（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，
ｖｏｌ．１７６，Ｏｃｔｏｂｅｒ １９９２，１００７
−１０１３）、これによるとＨＬＡ ＤＲ分子と第一番
目の位置で結合するアミノ酸配列は芳香族アミノ酸を含
む配列であるとされている。また、クラスＩＩ分子に結
合するタンパク質のアミノ酸残基数は１２〜２０個であ
るとされている。そこで、ヒトカテプシンＤの上記Ｌｅ
ｕ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ ＡｓｐＶａｌ
Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｇｌｙ配列のトリプトファンを含む部
位とその前後の２０アミノ酸残基の配列について、この
範囲の配列から、２０アミノ酸残基からなるペプチド
を、２アミノ酸残基ずつずらせた配列のそれぞれについ
て合成し、これらとＨＬＡ ＤＲ Ｂ１＊０４０１をも
つＢ細胞クローンとの親和性を解析した（Ｓ．Ｗｏｕｌ
ｆｅ，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ−Ｒｈｅｕｍ．ｖｏｌ．３
８，Ｎｏ．１２，１９９５，ｐｐ１７４４−１７５３記
載の方法によった）ところ、Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｔｒｐ
Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｖａｌ ＰｈｅＩｌ
ｅ Ｇｌｙ Ａｒｇ（配列表の配列番号３）が最もＨＬ
Ａ ＤＲ Ｂ１＊０４０１分子との親和性が高いことが
確認できた。従って、この配列がＴ細胞レセプターとの
結合部を含むと考えられる。

【００３８】この配列表の配列番号３の配列をもつ合成
ポリペプチドを抗原としてＴ細胞の反応性を確認した。
治療のために採取された４例の慢性関節リウマチ患者関
節廃液から得られたＴ細胞１×１０⁵ ／ｍＬをＲＰＭＩ
１６４０培養液中で、上記合成ポリペプチド１０μＭと
ともに５日間培養した後、培養上清中のＩＦＮγとＩＬ
−４をＥＬＩＳＡ法にて測定した。コントロールとして
は、上記合成ポリペプチドの代わりにＨＬＡ ＤＲ Ｂ
１＊０４０１分子との親和性が高いことがすでに知られ
ているヘマグルチニン３０７−３１８合成ペプチドＰｒ
ｏ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ａｓｎ
Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ａｌａ（配列表の
配列番号７）を使用した。この結果、この配列表の配列
番号３の配列をもつ合成ポリペプチドは、慢性関節リウ
マチ患者関節廃液由来Ｔ細胞において、コントロールの
ペプチドと比較して平均２０％増のＩＬ−４の産生を示
した。

【００３９】この合成ポリペプチドで刺激した後のＴ細
胞ｍＲＮＡを回収し、上記（１）におけると同様の方法
によりＴ細胞レセプターのＶβ３における塩基配列を解
析したところ、抗原の結合に最も重要といわれている相
補性決定部位ＣＤＲ３において、ＨＬＡ ＤＲ Ｂ１＊
０４０１／０４０５の遺伝子背景を持つ慢性関節リウマ
チ患者で、配列表の配列番号６の塩基配列のうちの対応
する配列（１４２番から１８２番の塩基配列に相当）が
認められた。

【００４０】この結果、上記ヒトカテプシンＤの、Ｐｒ
ｏ Ｌｅｕ Ｔｒｐ Ｉｌｅ ＬｅｕＧｌｙ Ａｓｐ
Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ａｒｇ（配列表の配
列番号３）のアミノ酸配列のポリペプチドが、Ｔ細胞レ
セプターと特異的に結合し、サイトカイン産生も認めら
れることから、Ｔ細胞の反応性活性化が確認された。

【００４１】また、この方法によれば、患者のわずかな
組織断片から得られた遺伝子により、慢性関節リウマチ
の自己抗原を効果的にスクリーニングすることができ
る。

【００４２】

【発明の効果】本発明は、上述の構成よりなるので、慢
性関節リウマチにおけるＴ細胞レセプターと結合する本
発明の新規自己抗原ポリペプチド又はそのアナログ若し
くは修飾ポリペプチドを使用して、特にカテプシンＤの
アンタゴニストとして、慢性関節リウマチのＴ細胞の自
己免疫反応、特にカテプシンＤのＴ細胞反応活性化を抑
制することにより、慢性関節リウマチ治療に役立つ医薬
組成物を提供することが可能である。

【００４３】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> St. MARIANNA UNIVERSITY SCHOOL OF MEDICINE SANTEN PHARMACEUTICAL CO., LTD. <120> ポリペプチド及びＤＮＡ <130> 99J13R <160> 9 <210> 1 <211> 16 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> 慢性関節リウマチにおけるT 細胞レセプターへの結合性を有するペプチド <400> 1 His Glu Leu Gly Lle Val Leu Trp Cys Leu Gly Arg Thr Thr Val Gly 5 10 15 <210> 2 <211> 48 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <221> CDS <222> (1)...(48) <223> 配列番号1 で表されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードするDNA <400> 2 cat gag ctg ggc atc gtt ttg tgg tgt ttg ggg aga ctc ctt gta ggt 48 His Glu Leu Gly Lle Val Leu Trp Cys Leu Gly Arg Thr Thr Val Gly 5 10 15 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> homosapiens <220> <223> ヒトカテプシンD のエピトープ部位 <400> 3 Pro Leu Trp Ile Leu Gly Asp Val Phe Ile Gly Arg 5 10 <210> 4 <211> 14 <212> PRT <213> cytomegalovirus <400> 4 Asp Leu Pro Leu Trp Cys Leu Cys Arg Leu Lys Cys Glu Arg 5 10 <210> 5 <211> 174 <212> DNA <213> homosapiens <220> <221> CDS <222> (1)...(162) <223> HLA DR B1*0410*0405 の遺伝子背景を持つ慢性関節リウマチ患者で、複数 の関節と末梢血とに共通して集積していたTCR V β3 のcDNAの67番から240 番の 塩基配列 <400> 5 aga gag aag aag gag cgc ttc tcc ctg att ctg gag tcc gcc agc acc 48 Arg Glu Lys Lys Glu Arg Phe Ser Leu Ile Leu Glu Ser Ala Ser Thr 1 5 10 15 aac cag aca tct atg tac ctc tgt gcc agc agc tct gtg gca ggg ata 96 Asn Gln Thr Ser Met Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Ser Val Ala Gly Ile 20 25 30 ggg ggt ctc tat ggc tac acc ttc ggt tcg ggg acc agg tta acc gtt 144 Gly Gly Leu Tyr Gly Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr Arg Leu Thr Val 35 40 45 gta gag gac ctg aac aag gtgttcccac cc 174 Val Glu Asp Leu Asp Lys 50 <210> 6 <211> 120 <212> DNA <213> homosapiens <220> <221> CDS <222> (1)...(120) <223> ヒトカテプシンD の361 番から480 番に対応する塩基配列 <400> 6 tgg gtc ccc tcc atc cac tgc aaa ctg ctg gac atc gct tgc tgg atc 48 Trp Val Pro Ser Ile His Cys Lys Leu Leu Asp Ile Ala Cys Trp Ile 1 5 10 15 cac cac aag tac aac agc gac aag tcc agc acc tac gtg aag aat ggt 96 His His Lys Tyr Asn Ser Asp Lys Ser Ser Thr Tyr Val Lys Asn Gly 20 25 30 acc tcg ttt gac atc cac tat ggc 120 Thr Ser Phe Asp Ile His Tyr Gly 35 40 <210> 7 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> ヘマグルチニン307-318 <400> 7 Pro Lys Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala 5 10

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 大久保 光夫 埼玉県川越市藤原町12−２ Ｆターム(参考） 4B024 BA63 CA04 DA12 EA04 GA11 HA01 HA15 4H045 AA11 BA10 CA40 DA50 DA86 EA22 EA54 FA74

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表の配列番号１で表されるアミノ酸
   配列を有するポリペプチド。
2. 【請求項２】 配列表の配列番号１で表されるアミノ酸
   配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置
   換、付加又は修飾されたアミノ酸配列を有し、かつ、慢
   性関節リウマチにおける病巣に浸潤したＴ細胞のＴ細胞
   レセプターとの結合性を有するポリペプチド。
3. 【請求項３】 １６個のアミノ酸配列からなり、少なく
   とも、ヒトカテプシンＤのエピトープ部位に存在する、
   Ｌｅｕ Ｔｒｐ、Ｌｅｕ Ｇｌｙ及びＧｌｙの順に並
   び、Ｌｅｕ ＴｒｐとＬｅｕ Ｇｌｙとは１つのアミノ
   酸残基を隔て、Ｌｅｕ ＧｌｙとＧｌｙとは４つのアミ
   ノ酸残基を隔てるアミノ酸配列モチーフを有する請求項
   ２記載のポリペプチド。
4. 【請求項４】 配列表の配列番号２で表される塩基配列
   を有するＤＮＡ。
5. 【請求項５】 配列表の配列番号１で表されるアミノ酸
   配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
6. 【請求項６】 配列表の配列番号２で表される塩基配列
   を有するＤＮＡにおいて、１若しくは数個の核酸トリプ
   レットが欠失、置換、付加又は修飾された塩基配列を有
   するＤＮＡであって、かつ、慢性関節リウマチにおける
   病巣に浸潤したＴ細胞のＴ細胞レセプターとの結合性を
   有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、及び、配列表
   の配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプ
   チドをコードするＤＮＡにおいて、１若しくは数個の核
   酸トリプレットが欠失、置換、付加又は修飾された塩基
   配列を有するＤＮＡであって、かつ、慢性関節リウマチ
   における病巣に浸潤したＴ細胞のＴ細胞レセプターとの
   結合性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡからな
   る群から選択されたＤＮＡ。
7. 【請求項７】 配列表の配列番号２で表される塩基配列
   のＤＮＡとストリンジェントな条件下でアニールし、か
   つ、慢性関節リウマチにおける病巣に浸潤したＴ細胞の
   Ｔ細胞レセプターとの結合性を有するポリペプチドをコ
   ードするＤＮＡ。
8. 【請求項８】 ヒト滑膜細胞に由来する請求項４記載の
   ＤＮＡ。
9. 【請求項９】 配列表の配列番号１で表されるアミノ酸
   配列を有するポリペプチド、及び、配列表の配列番号１
   で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のア
   ミノ酸が欠失、置換、付加又は修飾されたアミノ酸配列
   を有し、かつ、慢性関節リウマチにおける病巣に浸潤し
   たＴ細胞のＴ細胞レセプターとの結合性を有するポリペ
   プチドからなる群から選択される少なくとも１種のポリ
   ペプチドを有効成分として含有することを特徴とする拮
   抗剤。
10. 【請求項１０】 慢性関節リウマチ治療剤である請求項
    ９記載の拮抗剤。