WO1999002974A1

WO1999002974A1 - Wellenfeldmikroskop, wellenfeldmikroskopieverfahren, auch zur dna-sequenzierung, und kalibrierverfahren für die wellenfeldmikroskopie

Info

Publication number: WO1999002974A1
Application number: PCT/DE1998/001908
Authority: WO
Inventors: Michael Hausmann; Christoph Cremer; Joachim Bradl; Bernhard Schneider
Original assignee: Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg
Priority date: 1997-07-10
Filing date: 1998-07-09
Publication date: 1999-01-21
Also published as: AU9251898A; EP0996854A1; DE19830596B4; DE19830596A1; EP1008845A1; WO1999002974A9

Abstract

Die Erfindung betrifft zwei neue Wellenfeldmikroskope Typ I und Typ II, die sich dadurch auszeichnen, daß sie jeweils ein Anregungs- und Beleuchtungssystem umfassen, das wenigstens eine reelle und eine virtuelle Beleuchtungsquelle und wenigstens ein Objektiv (im Fall von Typ II) bzw. zwei Objektive (im Fall von Typ I) umfaßt, wobei Beleuchtungsquellen und Objektiv (e) derart zueinander angeordnet sind, daß sie zur Erzeugung von ein-, zwei-, und dreidimensionalen stehenden Wellenfeldern im Objektraum geeignet sind. Das erfindungsgemäße Kalibrierverfahren ist an diese Wellenfeldmikroskope angepaßt und erlaubt geometrische Distanzmessungen zwischen fluorochrommarkierten Objektstrukturen, deren Distanz geringer als die Halbwertsbreite des Hauptmaximums der effektiven Punktbildfunktion sein kann. Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur wellenfeldmikroskopischen DNA-Sequenzierung.

Description

Wellenfeldmikroskop,

Wellenfeldmikroskopieverfahren, auch zur DNA-Sequenzierung, und Kalibrierverfahren für die Wellenfeldmikroskopie

B e s c h r e i b u n g

Die Erfindung betrifft ein Wellenfeldmikroskop mit einem Beleuchtungs- bzw. Anregungssystem, das wenigstens eine reelle und eine virtuelle Beleuchtungsquelle und wenigstens ein Objektiv umfaßt, wobei Beleuchtungsquellen und Objektiv (e) derart zueinander angeordnet sind, daß sie zur Erzeugung eines eindimensionalen stehenden Wellenfeldes geeignet sind, mit einem Objektraum, der Halte und Manovriervorrichtung(en) für ein Objekt umfaßt, und mit einem Detektionssystem, das ein Objektiv, ein Okular und einen Detektor umfaßt, sie betrifft außerdem ein daran angepaßtes Kalibrierverfahren für geometrische Distanzmessungen zwischen fiuorochrommarkierten Objektstrukturen, deren Distanz geringer als die Halbwertsbreite des Hauptmaximums der effektiven Punktbildfunktion sein kann, und sie betrifft ein darauf aufbauendes Verfahren zur wel- lenfeldmikroskopischen DNA- S equenzierung .

Stand der Technik

Durch den Einsatz hochspezifischer Marker, wie z.B. DNA-Proben oder Protein- Sonden, ist es möglich, in biologischen (Mikro-)Objekten, insbesondere in Zellen, Zellkernen, Zellorganellen oder auf Chromosomen, - im folgenden vereinfacht Objekt genannt — , nahezu beliebig kleine (Sub-)Strukturen zu markieren. Es können Strukturen in Dimensionen von einigen μm (10^"6 m) bis zu wenigen zehn nm (10^"9 m) spezifisch dargestellt werden. Die Marker sind üblicherweise mit Fluorochromen oder auch kolloidalen Mikro(gold-)partikel gekoppelt, um ihre optische Detektion und Abbildung zu erleichtern bzw überhaupt erst zu ermöglichen.

Um zwei Marker innerhalb desselben Objekts separat voreinander detektieren zu können, sind die betreffenden Marker häufig mit verschiedenfarbigen Fluorochromen gekoppelt. Das zur Verfügung stehende Farbemissionsspektrum der üblicherweise verwendeten Fluorochrome reicht von tiefblau über grün, rot bis in den infraroten Spektralbereich Es können aber auch Fluorochrome verwendet werden, die sich weder in ihrem Anregungsspektrum noch in ihrem Fluoreszenzspektrum unterscheiden, sondern bei denen die Lebensdauer ihrer Fluoreszenzemission als Parameter zur Unterscheidung genutzt wird Letztere haben den Vorteil, daß wellenlangenabhangige fokale Shifts nicht auftreten Fluorochrome können auch ein unterschiedliches Emissionsspektrum haben und damit verschiedene spektrale Signatur besitzen, aber mit derselben Photonenenergie anregbar sein, z B durch Mehrphotonenprozesse Auch in diesem Fall können wellenlangenabhangige fokale Shifts in der Anregung zwischen Fluorochromen verschiedener spektraler Signatur vermieden werden

Die vorstehend genannten, an spezifische (Sub-) Strukturen in biologischen Mikroobjek- ten bindbaren bzw gebundenen Fluorochrome werden im folgenden als Fluoreszenz- marker bezeichnet

Stimmen Anregungsspektrum und/oder Emissionsspektrum und/oder die Fluoreszenzlebensdauern zweier Fluoreszenzmarker uberein, so haben diese Fluoreszenzmarker hinsichtlich des betreffenden Parameters die gleiche spektrale Signatur Unterscheiden sich die Fluoreszenzmarker in einem oder mehreren für die Messung relevanten Parametern, so habe sie unterschiedliche spektrale Signatur

Unter Fluoreszenz wird im folgenden jede Photonenwechselwirkung verstanden, bei der zwischen dem Anregungsspektrum und dem Emissionsspektrum desselben Stoffes Unterschiede auftreten, die nicht auf monochromatische Absorption oder Streuung zurückgeführt werden können Dies schließt insbesondere auch Mehrphotonenwechselwirkungen ein, bei denen die Anregungswellenlangen großer sein können als die Emis- sionswellenlangen

Ferner wird hier der Begriff Fluoreszenz auch für die eng damit verwandten Phänomene der Lumineszenz, insbesondere die Phosphoreszenz verwendet Dies schließt insbesondere längere mittlere Fluoreszenzlebensdauern ein, z B Fluoreszenzlebensdauern im Bereich von bis zu mehreren oder vielen msec (Millisekunden) Im folgenden werden die eng verwandten Vorgange der Lumineszenz, Phosphoreszenz und Fluoreszenz als gleichermaßen erfindungsrelevant angesehen

Die Detektion und Abbildung von Fluoreszenzmarker in ausgedehnten biologischen Objekten und die quantitative Lokalisation bezuglich definierter Objektpunkte /Objektstrukturen (Distanz- und Winkelmessungen) wird mit lichtmikroskopischen Meßverfahren durchgeführt Hierbei spielt die sog "Punktbildfunktion" (point spread functi- on =PSF) oder "Punktantwort" des verwendeten Mikroskops oder allgemein des optischen Systems, d h dessen Fähigkeit, von einem "ideal punktformigen" Objekt ein ebenso ideal punktformiges Abbild zu erzeugen, eine entscheidende Rolle Die Punktbildfunktion ist ein charakteristisches Merkmal einer jeden abbildenden Optik und ein Maß für deren Qualität

Distanzmessungen zwischen Objektstrukturen hangen wesentlich von der effektiven — d h der lokal im markierten Objektpunkt gegebenen — Punktbildfunktion ab Diese effektive Punktbildfunktion wiederum hangt stark von der jeweiligen lokalen Brechzahl und der Absorption im Objekt, im Einbettungsmedium des Objektes, in der Immersions- flussigkeit und gegebenenfalls in den Deckglasern ab

Die effektive Punktbildfunktion unterscheidet sich im allgemeinen deutlich von der für das verwendete Mikroskop berechneten Punktbildfunktion Auch die unter technisch optimierten Randbedingungen gemessenen Punktbildfunktionen unterscheiden sich in der Regel von den unter praktischen Routinelaborbedingungen in biologischen Objekten erzielbaren effektiven Punktbildfünktionen

Da diese effektiven Punktbildfünktionen meist nicht zur Verfügung stehen, greift man zur Kalibrierung der Distanzmessungen auf ideale, berechnete Ergebnisse zurück bzw auf Kalibrierungsmessungen, die unter Standardbedingungen durchgeführt wurden, wie z B Reflexionsverfahren Beide Verfahren gehen jedoch zu Lasten der Präzision bei der dreidimensionalen Distanzmessung in biologischen Mikroobjekten, und die Folge ist eine erhebliche Unsicherheit in der Bestimmung der tatsachlichen raumlichen Distanz zwischen den Objektstrukturen, bei biologischen Objekten beinhalten solche quantitativen Großenabschatzungen Unsicherheiten von bis zu mehreren Mikrometern Bis in die jüngste Zeit herrschte in der Fachwelt die praktisch einhellige Überzeugung, daß zwei Objektstrukturen nur dann separiert werden können, wenn sie mindestens eine

Halbwertsbreite des Hauptmaximums der effektiven Punktbildfünktion von einander entfernt sind

Erst 1996 gelang es den Urhebern der vorliegenden Erfindung, ein Kalibrierverfahren für die Fernfeldmikroskopie (und auch die Flußfluorometrie) bereitzustellen, mit dem es möglich ist, Distanzmessungen zwischen Objektstrukturen, deren Abstand voneinander geringer ist als das Auflösungsvermögen des betreffenden Fernfeldmikroskops, d h die weniger als die Halbwertsbreite des Hauptmaximums der effektiven Punktbildfünktion voneinander entfernt liegen, unabhängig von der Lage der betreffenden Objektstrukturen im dreidimensionalen Raum, mit hoher Genauigkeit durchzuführen

Dieses Verfahren umfaßt die folgenden Schritte

• Vor, wahrend oder nach der Praparation des betreffenden Objekts auf bzw in einem Objekthalter, insbesondere Objekttragerplattchen, Objekttragerfaser/-kapillare oder Objekttragerflussigkeit, werden die zu untersuchenden bzw zu ortenden Strukturen (Meßstrukturen) mit Fluoreszenzfarbstoffen verschiedener und/oder gleicher spektraler Signatur markiert, d h solche zu ortende Strukturen (Meßstrukturen), die sich in unmittelbarer Nahe zueinander, nämlich innerhalb der Halbwertsbreite des Hauptmaximums ihrer effektiven Punktbildfünktion, befinden, werden mit Fluoreszenzfarbstoffen verschiedener spektraler Signatur markiert, wahrend solche Meßstrukturen, deren Abstand voneinander großer ist als die Halbwertsbreite des Hauptmaximums der effektiven Punktbildfünktion, mit Fluoreszenzfarbstoffen verschiedener oder gleicher spektraler Signatur markiert werden Zwei zu ortende Meßstrukturen dürfen immer dann mit der gleichen spektralen Signatur markiert sein, wenn sie z.B durch ihre relative Lage oder durch andere Kriterien eindeutig identifiziert werden können

• Mit den gleichen Fluoreszenzfarbstoffen werden Kalibriertargets definierter Große und raumlicher Anordnung markiert,

• die fluoreszierenden Kalibriertargets werden entweder zusammen mit den Objekten oder separat auf bzw in dem bzw einem Objekthalter (Objekttragerplattchen, Objekt- tragerfaser/-kapillare, Objekttragerflussigkeit o a ) präpariert • (Untersuchungs-)Objekt und Kalibriertargets werden unter übereinstimmenden Bedingungen, gleichzeitig oder nacheinander mikroskopisch oder flußfluorometrisch untersucht

• Jeweils zwei definierte Kalibriertargets verschiedener spektraler Signatur werden unter Berücksichtigung des wellenlangenabhangigen Abbildungs- und Lokalisations- verhaltens des jeweiligen optischen Systems (Mikroskop oder Flußfluorometer) vermessen, die dabei ermittelten Meßwerte gleich Ist-Werte werden mit den vorbekannten tatsachlichen Distanzwerten gleich Soll- Werten (d h den aufgrund der Geometrie berechneten Soll-Lokalisationen) verglichen, und die Differenz zwischen Ist-Werten und Soll-Werten, nämlich der Kalibrierwert, wird zur Korrektur des durch das optische System bedingten Versatzes in der Detektion unterschiedlicher E issionsloci insbesondere der Meß Strukturen verwendet

Mit anderen Worten Die Distanzmessung zwischen den (je nach Abstand voneinander) mit verschiedenen oder gleichen spektralen Signaturen markierten Objekt-(Sub-) Strukturen - im folgenden auch Meßstrukturen genannt - wird anhand der hochprazisen Lokalisation unabhängiger (Kalibrier-)Targets mit entsprechend spektraler Signatur und mit bekannter Große und raumlicher Anordnung, unter Berücksichtigung des wellenlangenabhangigen Abbildungs- und Lokalisationsverhaltens des jeweiligen optischen Systems durchgeführt, wobei die Kalibriermessung zwischen den (Kalibrier-) Targets und die Messung im biologischen Objekten unter gleichen System- und Randbedingungen stattfindet Diese Kalibriertargets haben dieselbe oder eine höhere Multispektralitat wie die zu messenden (Objekt-) Strukturen Sie können direkt in den biologischen Objekten angeordnet sein, oder als separate Präparate auf einem Objekthalter (Objekttragerplattchen oder Objekttragerfaser/-kapillare oder Objekttragerflussigkeit o a ) vorliegen oder Teil eines Objekthalters sein

Zwei oder mehrere fluoreszierende Meß Strukturen in intakten, dreidimensionalen biologischen Objekten, deren Abstand und Ausdehnung kleiner als die Halbwertsbreite des Hauptmaximums der effektiven Punktbildfünktion ist, können aufgrund ihrer unterschiedlichen spektralen Signatur (Fluoreszenzabsorptionswellenlangen und oder Fluores- zenzemissionswellenlangen und/oder Fluoreszenzemissionslebensdauern) diskriminiert werden, d h ihr Abstand untereinander kann bestimmt werden Die Abstandsmessung wird auf die Lokalisation der einzelnen Meßstrukturen reduziert und kann — nun auch in der optischen Fernfeldmikroskopie oder Flußfluorometrie — mit einer wesentlich höheren Genauigkeit als die Halbwertsbreite des Hauptmaximums der Punktbildfünktion durchgeführt werden Die Lokalisation des Schwerpunkts der betreffenden Meßstrukturen wird auf die Maximalintensitat ihres Fluoreszenzsignals angepaßt D h aus dem gemessenen (beugungsbegrenzten) Signals (^Intensitatskurve) eines Fluoreszenzpunktes (=fluoreszierende Meß Struktur) wird — unter Berücksichtigung der Gesamtinformation aus Haupt- und Nebenmaxima — der Schwerpunkt (das Baryzen- trum) des Signals bestimmt und damit der Ort der Meßstruktur Bei fehlerfreiem optischen System und infolgedessen idealer Symmetrie der gemessenen Intensitatsverteilung (= Verlauf der Intensitatskurve) kolokalisiert der Schwerpunkt (das Baryzentrum) der Intensitatskurve innerhalb der Lokalisationsgenauigkeit mit dem Hauptmaximum (=Maximum 0 Ordnung des Beugungsbildes) der gemessenen Intensitatsverteilung Dieses neue Kalibrierverfahren erlaubt es mittels optischer Fernfeld-Mikroskopie wie z B. der Wellenfeldmikroskopie (oder auch mittels Scanning-Flußfluorometrie,) geometrische Distanzen in biologischen Mikro-Objekten zu messen, wobei die zu bestimmenden Distanzen geringer sein können als die Halbwertsbreite des Hauptmaximums der effektiven Punktbildfünktion im Objekt Da der Informationsgehalt der damit durchgeführten Distanzbestimmungen einer bei erhöhter Auflosung gewonnenen Distanzmessung entspricht, kann (und wird im folgenden) auch abkürzend von "Auflosungsaquivalent" gesprochen werden

Die multispektrale Kalibrierung erlaubt es, in situ Messungen über das Abbildungsverhalten des Systems am konkreten biologischen Objekt durchzuführen Bei Verwendung der Fluoreszenzlebensdauer als alleinigem Parametertyp und/oder bei Anregung der Fluorochrome mit derselben bzw denselben Photonenenergie(n) entfallt aufgrund der Kalibrierung die in situ Korrektur des chromatischen Versatzes in der Objektebene Für hochstauflosende Fernfeld-Mikroskoptypen wie z B das Wellenfeldmikroskop und bei Verwendung geeigneter Fluoreszenzmarker ermöglicht dieses Kalibrierverfahren dreidimensionale geometrische Distanzmessungen in biologischen Objekten bis hinunter zu molekularer Präzision (d h Auflosungsaquivalent besser 10 nm) Zur Ermittlung von Ist- und Sollwerten, zu deren Vergleich und zur Bestimmung des

Korrekturwerts/Kalibrierwerts werden vorzugsweise die folgenden Verfahrensschritte durchgeführt

- ein oder mehrere Kalibriertargets B mit einem Abstand großer als die Halbwertsbreite des Hauptmaximum der effektiven Punktbildfünktion vom Schwerpunkt der N Meßstrukturen wird/werden mit einer beliebigen spektralen Signatur markiert,

- die Abstände d,k (i, k = 1 N, i ≠k ) der Schwerpunkte der spektral getrennten Beugungsfiguren der N Meßstrukturen und die Abstände d,_B der N Meßstrukturen zum Kalibriertarget B werden gemessen, wobei automatisierte Verfahren der Bildanalyse angewendet werden,

- für eine Meßstruktur werden die Strecken d_lk und d^ jeweils in der Ebene der schmälsten Punktbildfünktion sowie alle ubπgen Distanzen gemessen werden, wozu das Objekt axialtomographisch jeweils um einen definierten Winkel φ_m gedreht wird,

- optische Aberrationen aus den Kalibrierungsmessungen werden korrigiert, und an die korrigierten gemessenen Abstände d,k (φ_m ) und d,B (φ_m ) wird jeweils eine Cosinus- fünktion A,k cos ( φ _m + θ _lk) bzw A,B cos ( φ _m + θ ,_B) mit geeigneter Phasenverschiebung angepaßt,

- die Maxima A_lk und A,_B der Anpassungsfünktion von d, bzw d_ß werden durch den Vergroßerungsfaktor dividiert und als euklidischer Abstand D, bzw D_lB der N Meßstrukturen untereinander bzw der Abstände der Meßstrukturen zum Bezugspunkt B bestimmt

Für die Bestimmung der Maxima werden vorzugsweise zusatzlich die diesen entsprechenden Minima des Abstandes z,k, z& in der zu der Ebene der d,_k, d,_B orthogonalen Ebene herangezogen und analog ausgewertet

Die Ermittlung aller Koordinaten der N Meß Strukturen und ihrer Relativkoordinaten zum Bezugspunkt B, d h die Ermittlung der Positionen x„ y„ z, und X , y , Zk bzw der Abstände Xk - x, , yk - y, , z_k - z, und x_B - x, , yß - yi , z_B - z, , erfolgt erfmdungsgemaß auf der Grundlage der mikroskopisch gemessenen 3D-Abstande D,_k bzw D,_B , vorzugsweise unter Verwednung des folgenden Gleichungssystems D² _lk = (x_k - x,)² + (y_k - y,)² + (z_k - z, )² D²,B = (x_B - x,)² + (v_B - y.)² + (z_B - z, f = (XB - Xk)² + (VB - yk)² + (z_B - z_k)²

Zur Absicherung der ermittelten Meßergebnsisse sollte die vorstehend beschriebene Vorgehensweise für mehrere Kalibriertargets B und die gleichen N Meßstrukturen durchgeführt werden

Die Koordinaten und Abstände der N Meßstrukturen können anhand der Schwerpunkte ermittelt werden, die sich aus Schwerpunktmittelungen der Messungen zu allen Bezugspunkten ergeben

Insbesondere für graphische Darstellungen werden die ermittelten Positionen x,, y,, z, und X_B, V_B, Z_B vorzugsweise mit einer Punktbildfünktion gefaltet, die eine Halbwertsbreite mit dem jeweils erreichten Auflosungsaquivalent besitzt

Zur Fluorochrommarkierung von Meßstrukturen und Kalibriertargets werden vorzugsweise solche Fluorochrome verwendet, die im ultravioletten, sichtbaren und/oder infraroten Lichtwellenlangenbereich angeregt werden können und die im ultravioletten, sichtbaren und/oder infraroten Lichtwellenlangenbereich emittieren

Als Kalibriertargets können entweder biologische Kalibriertargets oder nicht-biologische bzw synthetische Kalibriertargets eingesetzt werden

Bei den biologischen Kalibriertargets handelt es sich um markierte Regionen des biologischen Objekts mit bekannter Distanz voneinander Die Markierung(en) der betreffenden Region(en) kann(konnen) beispielsweise mit geeigneten biochemischen Sonden durchgeführt werden Die Verwendung solcher biologischer Kalibriertargets hat gegenüber der Verwendung synthetischer Kalibriertargets, beispielsweise Kalibrierkugelchen, den praktischen Vorteil, daß bei der Kalibrierung neben den optischen Randbedingungen des Objektes zusatzlich praparativ bedingte Randeffekte in die Kalibrierung einfließen, wie z B das Verhältnis aus tatsachlichen Fluoreszenzsignal zu unspezifischem Hintergrund (das durch automatische Bildanalysealgorithmen bestimmt wird)

Als nicht-biologische bzw synthetische Kalibriertargets eignen sich ganz besonders Mikrokugelchen, die die gleiche oder eine höhere multispektrale Signatur als die zu ortenden Meßstrukturen aufweisen Sie werden wie die biologischen Objekte behandelt Solche Kalibriertargets sind vorzugsweise auf Objekthaltern in definierter Raumanordnung fixiert Die Fixierung kann bereits bei der Fabrikation der betreffenden Objektträger geschehen , was insbesondere für die Routinebenutzung von Vorteil ist Zur Behebung des bei allen bekannten Fernfeldmikroskopieverfahren bestehenden Problems, daß die Breite des Hauptmaximums der Punktbildfünktion und damit die Auflosungsgrenze von der relativen Lage im Raum abhangt, d h z B senkrecht zur optischen Achse (= lateral) schmaler ist als in Richtung der optischen Achse (= axial ), kann das genannte Kalibrierverfahren sehr gut mit den im Stand der Technik bekannten sog Mi- kroaxialtomographieverfahren kombiniert werden Bei diesen Mikroaxialtomographiever- fahren werden die (biologischen) Objekte in Kapillaren oder auf Glasfasern angeordnet und im bzw unter dem Mikroskop definiert um eine Achse, die normalerweise senkrecht zur optischen Achse des Mikroskops steht, gedreht werden, wobei Abstandsmessungen in derjenigen Richtung durchgeführt werden, die die schmälste Halbwertsbreite der effektiven Punktbildfünktion besitzt

Ein Fernfeld-Lichtmikroskopieverfahren, das sich für die Detektion und Abbildung von insbesondere sehr kleinen, durch Fluoreszenzmarker kenntlich gemachte Substrukturen in biologischen Objekten besonders eignet, weil es gegenüber den bekannten Epifluores- zenzmikroskopieverfahren oder der konfokalen Laser- Scanning-Mikroskopie den Vorteil aufweist, daß es auch in axialer Richtung - senkrecht zu den Wellenfronten - eine Tiefendiskriminierung und damit wesentlich verbesserte Auflosung ermöglicht (ihre Dimension kann bei hoher Numerischer Apertur wesentlich geringer als die Wellenlange des zur Anregung verwendeten Lichtes sein), ist das Wellenfeldmikroskopieverfahren Bei der Wellenfeldmikroskopie, wie sie z B in der US-Patentschrift 4,621,911 beschrieben ist, werden fluoreszierende bzw lumineszierende Präparate im optischen Mikroskop mit einem stehenden Wellenfeld beleuchtet (Standing Wave Field Fluore- scence Microscopy, SWFM) Ein stehendes Wellenfeld entsteht (nur) dort, wo Licht koharenzfahig überlagert wird Die Präparate werden in einer Zone aquidistanter ebener Wellenfronten angeordnet und zur Fluoreszenz oder Phosphoreszenz angeregt Der Abstand der Wellenfronten und ihre Phase können (insbesondere zur Bilderzeugung) variiert werden Aus einzelnen optischen Schnitten kann durch Computer-Bildverarbeitung die dreidimensionale Verteilung der fluoreszenten bzw lumineszenten Objektpunkte rekonstruiert werden Die ebenen Wellenfronten sind senkrecht zur optischen Achse des detektierenden Objektives angeordnet und werden durch kohärente Überlagerung zweier Laserstrahlen unter einem definierten Winkel θ zur optischen Achse des Mikroskopsystems erzeugt, wobei der Winkel θ den Abstand der Wellenfronten untereinander bestimmt — bei gegebener Wellenlange und Brechungsindex An Stelle von zwei sich kreuzenden Laserstrahlen kann das Wellenfeld auch dadurch erzeugt werden, daß ein Laserstrahl nach geeigneter Reflexion unter einem bestimmten Winkel (z B mit einem Spiegel) mit sich selbst zur Interferenz gebracht wird Die ebenen Wellenfronten zeichnen sich dadurch aus, daß der Intensitatsverlauf in Richtung senkrecht zu den Wellenfronten (co)sinusformig ist Die Fluoreszenz bzw Lumineszenz wird entweder durch entsprechende optische Filter spektral diskriminiert und in verschiedenen Strahlengangen geführt oder konfokal detek- tiert Die erzielbare Auflosung, d h die kleinste noch meßbare Distanz zwischen zwei punktformigen Objektstrukturen, die mit Fluorochromen gleicher spektraler Signatur markiert sind, ist entweder durch das Abbe-Kriterium (= das Maximum 0 Ordnung des Beugungsbildes eines Punktobjektes ist im 1 Minimum des Beugungsbildes eines zweiten Punktobjektes lokalisiert) oder durch die Halbwertsbreite des Hauptmaximums der effektiven Punktbildfünktion gegeben Sie hangt von der jeweiligen Wellenlange, der Numerischen Apertur des verwendeten Objektivs, sowie von den lokalen Brechzahlen der Objekte, des Einbettungsmediums, der eventuell verwendeten Deckglaser und der eventuell eingesetzter Immersionsflussigkeiten ab

Die bekannten Wellenfeldmikroskope sind im Prinzip wie folgt aufgebaut Sie umfassen

(I) ein Beleuchtungs- bzw Anregungssystem, bestehend aus wenigstens einer reellen und einer virtuellen Beleuchtungsquelle und wenigstens einem Objektiv, die derart zueinander angeordnet sind, daß sie zur Erzeugung eines eindimensionalen, sinusförmigen, stehenden Wellenfeldes geeignet sind,

(II) einen Objektraum, mit

Halte und Manovriervorrichtungen für das Objekt, und (πi) ein Detektionssystem, bestehend aus wenigstens einem Objektiv, wenigstens einem Okular und wenigstens einem Detektor, wobei es sich häufig um eine Kamera, insbesondere eine CCD-Kamera handelt, die so positioniert ist, daß der CCD-Chip in der Zwischenbildebene liegt

Ein Nachteil dieses Wellenfeldmikroskops nach dem Stand der Technik, im folgenden "eindimensionales Wellenfeldmikroskop" ("SWFM") genannt, bzw der damit durchführbaren Wellenfeldmikroskopieverfahren besteht darin, daß das periodisch erzeugte Wellenfeld (bei epifluoreszenter Detektion in Verbindung mit Verfahren des Optical Sectioning) zu einer Mehrdeutigkeit in der Aufnahme bzw Abbildung einer Objektstruktur führt, deren Ausdehnung in Richtung senkrecht zu den Wellenfronten wesentlich großer als λ/2n ist (λ=Wellenlange der Anregung, n= effektiver Brechungsindex) Diese Mehrdeutigkeit erschwert zunächst eine effektive Nutzung der durch das Interferenzmuster erzielten Auflosungsverbesserung

Zur Durchführung von Distanzmessungen und anderen Untersuchungen der raumlichen Verhaltnisse von dreidimensionalen Objekten können die bekannten Fernfeldmikroskopieverfahren einschließlich der eindimensionalen Wellenfeldmikroskopie mit Axialtomographie kombiniert werden Hierzu werden die zu untersuchenden biologischen Objekte, ggf nach Ausrüstung mit Kalibriertargets, in oder auf einer Mikrokapillare oder Glasfaser als Objekthalter bzw Objektträger präpariert Die Kapillare/Faser hat einen exakt definierten Durchmesser, wobei verschiedene Durchmesser möglich sind Zur Festlegung dieser Kapillare/Faser auf dem Mikroskoptisch dient eine spezielle Halterung vorgeschlagen, die aus einem starren, vorzugsweise dorsiventral abgeplatteten Rahmen besteht, an bzw auf dem wenigstens eine Lagerbuchse montiert ist, in der eine Mikrokapillare oder Glasfaser um ihre Langsachse rotierfahig (vorzugsweise mit der Rotationsachse senkrecht zur optischen Achse des Mikroskops) gelagert werden kann (Die Lagerbuchse(n) sollten so angeordnet sein, daß die Rotationsachse der Kapillare/Faser senkrecht zur optischen Achse des Mikroskops verlauft ) Die Drehung der Untersuchungsobjekte in oder an der Kapillare/Faser erfolgt durch Drehung der Kapillare/Faser direkt, vorzugsweise vermittels eines Drehmotors Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Wellenfeldmikroskop der bekannten Art derart weiter zu bilden, daß es zur Erzeugung von ebenen Wellenfeldern in mehr als einer Dimension bei hoher Variabilität der Abstände der Interferenzmaxima geeignet ist, und das vorgenannte Kalibrierverfahren derart weiter zu entwickeln, daß es in Kombination mit einem solchen Wellenfeldmikroskop einsetzbar ist Darüber hinaus soll ein Verfahren zur wellenfeldmikroskopischen DNA- Sequenzierung geschaffen werden.

Eine Losung dieser Aufgabe besteht einerseits in der Bereitstellung der nachstehend beschriebenen sog "mehrdimensionalen Wellenfeldmikroskope", andererseits in der Bereitstellung des ebenfalls nachstehend beschriebenen, an die Anwendung eines mehrdimensionalen Wellenfeldmikroskops angepaßten Kalibπerverfahrens Darüber hinaus wird ein Verfahren zur "Fluoreszenz-DNA-Sequenzierung" bereit gestellt

Bei dem einen erfindungsgemaßen "mehrdimensionalen Wellenfeldmikroskop" (Typ I) handelt es sich um ein Wellenfeldmikroskop der eingangs genannten Art, das durch die nachfolgend aufgelisteten Merkmale gekennzeichnet ist

(1) Das Beleuchtungs- bzw Anregungssystem umfaßt in zwei oder allen drei Raumrichtungen wenigstens eine reelle oder virtuelle Beleuchtungsquelle für koharenzfahige Lichtstrahlen und wenigstens einen Reflektor oder Strahlteiler zur Auskopplung von Teilstrahlen oder eine weitere Beleuchtungsquelle für koharenzfahige Lichtstrahlen, denen jeweils wenigstens ein Objektiv zugeordnet ist, und die jeweils zur Erzeugung von Lichtwellenzugen geeignet sind, wobei die Lichtwellenzuge der einen Beleuchtungsquelle antiparallel oder in variabel einstellbaren Winkeln zu den Lichtwellenzugen des Reflektors bzw der anderen Beleuchtungsquelle ausgerichteten sind, und zwar derart, daß die von der einen Beleuchtungsquelle ausgesendeten Lichtwellenzuge mit denen des Reflektors bzw der anderen Beleuchtungsquelle zu einem stehenden Wellenfeld mit ebenen Wellenfronten interferieren

(2) Das Detektionssystem umfaßt wenigstens ein zur epifluoreszenten Detektion geeignetes und/oder wenigstens ein zur rasternden Punktdetektion geeignetes Detekti- onsobjektiv vorzugsweise hoher numerischer Apertur, welches mit seiner optischen Achse senkrecht zu den Wellenfronten eines der interferierenden Wellenfelder angeordnet ist und welches mit einem Objektiv des Anregungssystems identisch sein kann. Dem zur epifluoreszenten Detektion geeigneten Detektionsobjektiv ist ein flachiger (zweidimensionaler) Detektor, z B. eine Kamera vorgeordnet, wahrend dem zur rasternden Punktdetektion geeigneten Detektionsobjektiv wenigstens eine feststehende konfokale Detektionsringblende und/oder -lochblende und/oder wenigstens ein feststehender Detektionsschlitz vorgeordnet und ein Punktdetektor, insbesondere ein Photomultiplier, eine Photodiode oder eine Diodenarray nachgeordnet ist Unter "hoher" numerischer Apertur ist hier eine numerische Apertur > 1 und unter "niedriger" numerischer Apertur eine numerische Apertur < 1 zu verstehen.

Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform dieses Wellenfeldmikroskops (Typ I) ist in wenigstens einer Raumrichtung einem Objektiv hoher numerischer Apertur ein Objektiv niedriger numerischer Apertur oder ein Reflektor zugeordnet, und in einer oder beiden anderen Raumrichtung(en) sind entweder zwei Objektive niedriger numerischer Apertur oder ein Objektiv niedriger numerischer Apertur und ein Reflektor einander zugeordnet.

Bei dem anderen erfindungsgemäßen "mehrdimensionalen Wellenfeldmikroskop" (Typ

II) handelt es sich um ein Wellenfeldmikroskop der eingangs genannten Art, das durch die folgenden Merkmale charakterisiert ist.

(1) Das Beleuchtungs- bzw Anregungssystem umfaßt in wenigstens einer der drei Raumrichtungen wenigstens eine reelle oder virtuelle Beleuchtungsquelle für koharenzfahige Lichtstrahlen und wenigstens einen Strahlteiler zur Auskopplung von wenigstens einem Teilstrahl, denen ein gemeinsames Objektiv zugeordnet ist, in das die Lichttrahlen bzw. Lichtwellenzuge der Beleuchtungsquelle(n) und des/der Strahlteiler(s) derart eingekoppelt werden können, daß sie auf der hinteren (dem Objektraum abgewandten) Fokalebene zwei voneinander beabstandete Fokuspunkte erzeugen und in dem Raum zwischen den beiden Fokalebenen in variabel einstellbarem Winkel zueinander verlaufen und zu einem eindimensionalen stehenden Wellenfeld interferieren. (2) Das Detektionssystem umfaßt wenigstens ein zur epifluoreszenten Detektion geeignetes und/oder wenigstens ein zur rasternden Punktdetektion geeignetes Detektionsobjektiv vorzugsweise hoher numerischer Apertur, das auch mit einem Objektiv des Anregungssystems identisch sein kann. Dem zur epifluoreszenten Detektion geeigneten Detektionsobjektiv ist ein flächiger (zweidimensionaler) Detektor, z.B. eine Kamera vorgeordnet, während dem zur rasternden Punktdetektion geeigneten Detektionsobjektiv wenigstens eine feststehende konfokale Detektionsringblende und/oder -lochblende und/oder wenigstens ein feststehender Detektionsschlitz vorgeordnet und ein Punktdetektor, insbesondere ein Photomultiplier, eine Photodiode oder eine Diodenarray nachgeordnet ist.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform dieses Wellenfeldmikroskops (Typ II) weist das Beleuchtungs- bzw. Anregungssystem in derselben oder einer oder beiden anderen Raumrichtung(en) jeweils wenigstens eine weitere reelle oder virtuelle Beleuchtungsquelle für kohärenzfähige Lichtstrahlen und/oder wenigstens einen Strahlteiler zur Auskopplung von wenigstens einem Teilstrahl auf, dem/denen jeweils ein weiteres Objektiv zugeordnet ist, durch das der/die Lichtstrahlen (Lichtwellenzüge) in den Objektraum gelenkt und derart ausgerichtet sind, daß sie mit den Lichtstrahlen aus derselben oder aus der /den beiden anderen Raumrichtung(en) bzw. dem von diesen gebildeten ein- oder zweidimensionalen Wellenfeld zu einem zwei- bzw. dreidimensionalen Wellenfeld interferieren.

Eine weitere, sehr vorteilhaften Weiterbildung sämtlicher vorstehend genannten erfindungsgemäßen Wellenfeldmikroskope (Typ I und Typ II) zeichnet sich dadurch aus, daß der Objektraum eine Objekthalterung umfaßt, in bzw. an der das Objekt mit den Meßstrukturen und/oder gegebenenfalls den/die Kalibriertarget(s) um eine oder zwei orthogonal zueinander verlaufende Achsen drehbar in dem Wellenfeld gelagert ist, wobei für wenigstens eine Achse eine Drehbarkeit um 360-Grad (2π) bevorzugt ist. Mit diesen erfindungsgemaßen mehrdimensionalen Wellenfeldmikroskopen Typ I und Typ II ist es möglich, eine zeitlich sequentielle und/oder simultane Detektion mehrerer Objektebenen durch eine, zwei und/oder drei Objektive (bzw zu deren orthogonalen Achsen) durchzuführen Prazisionsdistanzmessungen von Punktobjekten gleicher oder verschiedener spektraler Signatur, deren Abstände kleiner als die Halbwertsbreiten der Hauptmaxima der effektiven Punktbildfünktionen sind, können in (allen) Raumrichtungen vorgenommen werden

Die feststehende(n) konfokale(n) Detektionsringblende(n), -lochblende und/oder der/die feststehende(n) Detektionsschlitz(e) in Kombination mit wenigstens einem geeigneten Lichtintensitatsdetektor bietet/bieten die vorteilhafte Möglichkeit, daß das Objekt in x-, y- und z-Richtung durch das Wellenfeld gerastert werden kann (Objekt- oder Stage- scanning)

Das erfindungsgemaße Wellenfeldmikroskop Typ II und die damit durchführbaren Wel- lenfeldmikroskopie hat — insbesondere gegenüber der bekannten eindimensionalen Wellenfeldmikroskopie — überdies den Vorteil, daß sowohl die laterale Auflosung (d h senkrecht zur optischen Achse) als auch die axiale Auflosung wesentlich verbessert ist Es ist erstmals eine Diskriminierung von flachenhaften Objekten in axialer Richtung ohne den Einsatz von konfokalen Systemen möglich Außerdem besteht die vorteilhafte Möglichkeit, daß man das Objekt wahrend der Untersuchung bzw zur Aufnahme / Datenregistrierung in lateraler Richtung verschieben kann Mit Hilfe von Bildverarbeitungs- und Rekonstruktionsverfahren laßt sich dann aus den somit erhaltenen Mehrfachaufhahmen eine höhere laterale Auflosung gewinnen Der erfindungsgemaße Aufbau Typ II mit einem Objektiv eignet sich außerdem auch zur Erzeugung eines eindimensionalen Wellenfeldes senkrecht zur optischen Achse eines Epifluoreszenzmikroskops und damit zur lateralen Auflosungsverbesserung desselben

Bei einer weiteren Ausführungsvariante dieser "Mehrdimensionalen Wellenfeldmikroskope" (Typ I und/oder Typ II) sind die das mehrdimensionale Wellenfeld erzeugende^) Beleuchtungsquelle(n) und/oder der/die Reflektor(en) und/oder der/die Strahlteiler und/oder das/die Objektiv(e) und damit das mehrdimensionale Wellenfeld um eine oder zwei orthogonal zueinander verlaufende Achsen drehbar angeordnet bzw montiert

Zur Abbildung der lateralen Objektbereiche eines im zwei- oder dreidimensionalen Wellenfeld feststehenden Objekts auf die Detektorringblende, -lochblende bzw den Detektorschlitz kann jedes erfindungsgemaße Wellenfeldmikroskop (Typ I und/oder Typ II) mit einem Scannerspiegel ausgerüstet sein, der derart angeordnet ist, daß er die betreffenden lateralen Objektbereiche mit der gewünschten, meist maximalen, Fluoreszenzin- tensitat abbildet

Bei einer besonders vorteilhaften Weiterbildung der erfindungsgemaßen mehrdimensionalen Wellenfeldmikroskope (Typ I und/oder Typ II), die für Zwei- oder Mehr-Photonen- Fluoreszenzanregungen geeignet ist, den sog "Wellenfeldmikroskopen mit kombinierter Mehr-Photonen-Fluoreszenzanregung", umfaßt das jeweilige Beleuchtungssystem in wenigstens einer der drei Raumrichtungen eine reelle Beleuchtungsquellen für die Zweioder Mehrphotonenanregung und in einer oder beiden anderen Raumrichtung(en) eine reelle und/oder virtuelle Beleuchtungsquelle für die Zwei- oder Mehrphotonenanregung Die damit erzeugten stehenden Wellenfelder (WFi ,WF₂, , WF,) weisen voneinander verschiedene Wellenlangen (λi, λ₂ , λ, ) auf, und die Distanzen (d_l5 d₂, , d,) zwischen ihren jeweiligen Wellenmaxima bzw Wellenminima betragen

2n cosθi bzw d₂ = λ₂/ 2n cosθ₂ bzw d, = λ,/ 2n cosθ, (mit n = Brechungsindex im Objektraum, θi, θ₂ , θ, = Kreuzungswinkel des Lichtwellenzugs der Wellenlange λi, λ₂ ,λ, mit der optischen Achse) Diese Wellenfelder WFι,WF₂ W, sind erfindungsgemaß derart zueinander ausgerichtet, daß sich mindestens ein Maximum zweier oder aller stehenden Wellen an derselben Stelle, nämlich dem Ort einer Mehrphototonenanregung, befindet

Geeignete Beleuchtungsquellen für die Zwei- oder Mehrphotonenanregung sind im Stand der Technik bekannt und z B in der Druckschrift von W Denk, J H Strickler, W W Webb, "Two-Photon Laser Scanning Fluorescence Microscopy", Science, Vol 248, pp 73-76 (6 April 1990) beschrieben, auf deren Inhalt hier ausdrucklich Bezug genom- men wird Diese Beleuchtungsquellen produzieren entweder Photonen unterschiedlicher

Wellenlangen oder kohärente Photonen gleicher Wellenlange

Ein besonderer Vorteil der Kombination aus Ein- und Zwei- oder Mehrphotonenanregung besteht in der gleichzeitigen Anregung von Fluoreszenzmarkern verschiedener spektraler Signatur Hierdurch können Fehler der Distanzmessung aufgrund der chromatischen Aberration im Objekt eliminiert werden Bei der Zwei-Photonen-Anregung wird ein Fluorochrommolekul dann angeregt, wenn zwei Photonen simultan die Energie für die Anregung eines Moleküls liefern Dabei können die zwei an der Anregung des Moleküls beteiligten Photonen dieselbe oder unterschiedliche Wellenlangen bzw Energeien besitzen Für eine koinzidente Anregung mit unterschiedlichen Wellenlangen (λi, λ₂) müssen bei der sog " Zwei-Photonen- Wellenfeldmikroskopie" in jeder jeweiligen Raumrichtung jeweils zwei Wellenfelder mit den Wellenlangen λi und λ installiert sein Die Wellenmaxima bzw Wellenminima der beiden stehenden Wellenfelder (WF1, WF2) haben dabei die Distanzen di = λi/ 2n cosθi bzw d₂ = λ₂/ 2n cosθ₂ (wobei gilt n = Brechungsindex im Objektraum, θi, θ₂ = Kreuzungswinkel des Laserstrahls der Wellenlange λi, λ₂ mit der optischen Achse) Da im allgemeinen die Distanzen di und d₂ verschieden sind, werden die beiden Wellenfelder pro Raumrichtung so ausgerichtet, daß ein Hauptmaximum beider stehender Wellen sich an derselben Stelle befindet Mehrphotonen-Effekte können dann nur dort auftreten, wo beide Wellenfelder sich überlagern Damit werden nur noch einzelne ^ι Streifen'" des Wellenfeldes einer Raumrichtung zur Mehrphotonenanregung genutzt Vieldeutigkeiten bei Objekten der Dimension großer d treten erst bei Dimensionen mit der Bedingung kιdχ = k₂d₂ (ki, k₂ sind ganze Zahlen) auf Durch eine Mehrphotonenanregung der fluoreszenzmarkierten Meßstrukturen und Kalibriertargets wird somit eine Eindeutigkeit der dreidimensionalen Abbildung erreicht Die Verwendung von Zwei- oder Mehrphotonenfluoreszenzanregungsverfahren ermöglicht ein schnelleres Abscannen bzw Abrastern des Objekts, d h der Objektpunkte, -linien und - ebenen und damit eine bessere Abbildungsqualitat insbesondere auch bei sich bewegenden Objekten Eine ebenfalls sehr vorteilhafte Weiterbildung des erfindungsgemaßen mehrdimensionalen Wellenfeldmikroskops zeichnet sich dadurch aus, daß eine Anordnung aus Lichtquelle, Objektiv und einem elektrisch leitenden Spiegel, die zur Erzeugung eines eindimensionalen, elektrischen Wellenfeldes geeignet ist, relativ zur Objekttragerhalterung vorgesehen ist, und zwar derart, daß die in dem Objekt befindlichen Meßstrukturen und/oder Kalibriertargets im Bedarfsfall (z B wenn sich diese an bzw in Molekulketten befinden) durch Anlegen des elektrischen Feldes — vor oder wahrend des mikroskopischen Meßvorgangs — ausgerichtet werden können (Die auf diese Weise raumlich ausgerichteten Molekulketten können dann anschließend noch mit immobilisierenden Substanzen fixiert werden ) Diese Variante des erfindungsgemaßen Wellenfeldmikroskops ist vor allem für die wellenmikroskopische DNA-Sequenzierung geeignet, wobei das eindimensionale elektrische Wellenfeld zur Kalibrierung bei der DNA- Sequenzierung dient

Zur Detektion des Lumineszenzlichtes wird vorzugsweise eine CCD-Kamera(s) in bekannter Weise eingesetzt Diese kann hinter der Detektorringblende oder -lochblende oder dem Detektorschlitz sitzen Anstelle der CCD-Kamera bzw des CCD-Chips kann das erfindungsgemaße mehrdimensionale Wellenfeldmikroskop aber auch mit einer elektronischen Bildaufnahmevorrichtung ausgerüstet sein, wie sie beispielsweise von Konfokalen Laser-Scan-Miksroskopen (CLSM) im Stand der Technik bekannt ist Erfindungs- gemaß kann prinzipiell jedes lichtempfindliche Detektionsgerate, insbesondere Photodi- ode(n), Photomultiplier, CCD-Kameras/ -Chips, CCD-Arrays, Avalanche Dioden, (Avalanche) Dioden Arrays, zweidimensionale (Avalanche) Dioden Matrizes hinter der hinter der Detektorringblende oder -lochblende oder dem Detektorschlitz angeordnet sein, um die Fluoreszenz zu detektieren und zu dokumentieren, wobei auch Fluoreszenzlebensdauermessungen vorgenommen werden können

Bei dem erfindungsgemaßen Kalibrierverfahren handelt es sich um ein Kalibrierverfahren der vorstehend genannten Art, das durch die folgenden Maßnahmen gekennzeichnet ist (1) Das biologische Objekt mit den fluorochrommarkierten Meßstrukturen und/oder den/die fluorochrommarkierten Kalibriertargets wird sequentiell oder simultan mit einzelnen (separaten), in zwei oder drei Raumrichtungen orthogonal zueinander verlaufenden, stehenden und zu einem zwei- oder dreidimensionalen Wellenfeld miteinander interferierenden Wellenfeldern beleuchtet, wobei die Fluorochrome zur Fluoreszenzemission angeregt werden

(2) Zur Detektion der Fluoreszenzintensitat wird/werden eine Kamera und/oder eine oder mehrere zweidimensionale Anordnung(en) aus Einzeldetektoren mit jeweils kreis-, ring- oder schlitzförmiger Blende oder eine Anordnung von mehreren kreis-, ring- oder schlitzförmigen Blenden verwendet

(3) Entweder das Objekt mit den Meßstrukturen und/oder die/den Kalibriertargets oder das ein- bzw zweidimensionale Wellenfeld oder beides wird wahrend des Meßvorgangs schrittweise um eine oder zwei orthogonal zueinander verlaufende Achsen gedreht, wobei die fluorochrommarkierten Meßstrukturen und/oder Kalibriertargets sequentiell oder simultan mit einem oder zwei einzelnen, orthogonal zueinander stehenden Wellenfeldern beleuchtet werden

Bei der simultanen Beleuchtung wird das Mikroobjekt mit den Meßstrukturen und den bzw die Kalibriertargets starr oder um eine Achse drehbar gelagert Zwei oder drei orthogonal zueinander verlaufende, stehende, ebene Wellenfelder werden zur Interferenz gebracht und beleuchten das Mikroobjekt simultan Bei zwei Wellenfeldern entstehen Ebenen mit einem zweidimensionalen symmetrischen Gitter aus Punkten maximaler und minimaler Intensität Bei der Verwendung von drei Wellenfeldern entsteht ein dreidimensionales Raumgitter aus symmetrisch regelmäßig angeordneten Punkten maximaler und minimaler Intensität Zwischen den Intensitatsma- xima und -minima liegt ein kontinuierlicher Intensitatsverlauf vor Bei der sequentiellen Beleuchtung wird das Mikroobjekt im Wellenfeld um zwei Achsen gedreht Wahrend oder nach der Detektion kann die Lage des Wellenfeldes relativ zum Objekt verändert werden Bei Verwendung geeigneter Fluoreszenzmarker erlaubt die Erfindung somit, dreidimensionale (3D), geometrische Distanzmessungen zwischen Fluoreszenztargets gleicher bzw verschiedener spektraler Signatur mit molekularer Präzision, d h mit einem 3D Auflosungsaquivalent bis zu besser als 10 nm und mit einer 3D Lokalisationsgenauigkeit bis zu besser als 1 nm Im Gegensatz zur Elektronenmikroskopie bzw zur optischen und nicht- optischen Nahfeldmikroskopie bleibt die dreidimensionale Struktur des zu untersuchenden Objektes intakt, da auf mechanische Schnitte verzichtet wird Damit können in dreidimensional konservierten Mikroobjekten 3D-Distanzmessungen in einem Bereich kleiner als die Halbwertsbreite der Hauptmaxima der effektiven Punktbildfünktionen vorgenommen werden Insbesondere eröffnet das Verfahren die Möglichkeit, dreidimensionale Distanzmessungen auch unter vitalen Bedingungen des biologischen Objektes durchzuführen Bei der DNA-Sequenzierung kann die Herstellung von Gelen und die elektropho- retische Auftrennung der DNA- Stucke entfallen Ebenso kann auf eine Autoradiographie verzichtet werden, da keine radioaktive Markierung durchgeführt wird Und auch lange DNA-Sequenzen (z B > 1 kbp) können ohne weiteres analysiert werden Diese erfindungsgemaße Verfahrensvariante erlaubt außerdem eine wesentlich verbesserte Bestimmung auch morphologischer Großen (z B Volumen, Oberflachen), sofern die multispektralen Fluoreszenzmarker in geeigneter Weise z B auf der Oberflache des Objektes, verteilt werden Beispielsweise kann auf diese Weise das Volumen eines sphärischen Mikroobjektes mit einem Radius von einigen 100 nm erheblich besser bestimmt werden als das mit herkömmlichen mit morphologischen Segmentierungstechniken, wie z B Cavalieri- und Voronoi Verfahren, oder auch Methoden des Volumenkonservierenden Gradual Thresholding möglich ist

Mit dem bzw den erfindungsgemaßen mehrdimensionalen Wellenfeldmikroskopen (Typ I und/oder Typ II) und dem erfindungsgemaßen Kalibrierverfahren ist es möglich eine mikroskopische DNA-Sequenzierung durchzuführen Hierfür wird erfindungsgemaß das nachfolgen beschriebene "Wellenfeldmikroskopieverfahren zur DNA-Sequenzierung" vorgeschlagen

(1) Es werden alle komplementären Subsequenzen der zu analysierenden DNA- Sequenz derart hergestellt, daß alle Subsequenzen am selben Nukleotid der zu analysierenden Sequenz beginnen.

(2) Die zu analysierenden Bruchstucke werden alle am 3'-Ende mit einem Bezugsfluoro- chrommarker α und am 5'-Ende und/oder an definierten Zwischenstellen mit einem Fluorochrommarker a, g, c,oder t — je nachdem ob das Nukleotid die Base Adenin (Marker a), Guanin (Marker g), Cytosin (Marker c) oder Thymin (Marker t) tragt — markiert, wobei die Fluorochrommarker a, g, c, t und α verschiedene spektrale Signatur aufweisen, und jeweils ein oder mehrere Fluorochrommolekule enthalten

(3) Die markierten DNA-Subsequenzen werden derart auf Trager fixiert, daß sie als lineare Sequenz vorliegen, und in ein ein- oder mehrdimensionales Wellenfeldmikroskop eingebracht

(4) Die linearen DNA-Subsequenzen werden so zu den stehenden Wellenfronten orientiert, daß eine exakte Abstandsmessung (Genauigkeit <1*10^'10 m) zwischen α und a bzw g, c oder t — nach Bestimmung der Intensitatsbaryzentren und Kalibrierung der Abbildungseingenschaften — durchgeführt werden kann, indem

(5) die Signale der Fluorochrommarker schrittweise, spektral getrennt voneinander registriert werden, und

(6) aus den Abstanden der fluoreszenten Markern und ihrer spektralen Signatur die DNA-Basensequenz des zu analysierenden DNA-Stuckes bestimmt wird

Mit diesem im Stand der Technik völlig neuartigen Verfahren können DNA-Fragmente in ihrer Lange nukleotidgenau vermessen werden, und auch ihre Basensequenz kann exakt bestimmt werden Gelelektrophorese und nachfolgende Bandenauswertung kann entfallen

Ausführungs- und Vergleichsbeispiele zur näheren Erläuterung der Erfindung :

BEISPIEL 1: Aufbau eines mehrdimensionalen Wellenfeldmikroskops Typ I mit drehbar gelagertem Objekt

Die Basis stellt ein herkömmliches "eindimensionales" Wellenfeldmikroskop dar, das z B mit zwei sich gegenüber liegenden Objektiven hoher Numerischer Apertur oder mit einem Objektiv hoher gegenüber einem Objektiv niedriger numerischer Apertur oder mit einem Objektiv für zwei interferierende Laserstrahlen aufgebaut wird Durch die Objektive werden zwei Teilstrahlen eines Lasers so zur Interferenz gebracht, daß ein eindimen- sionales stehendes Wellenfeld entsteht Über ein oder zwei Objektiv(e) hoher Numerischer Apertur wird die Fluoreszenz detektiert Jeweils in einer oder in beiden orthogonalen Richtungen zur optischen Achse des Detektionsobjektivs werden jeweils zwei weitere Teilstrahlen des Lasers über Objektive niedrigerer Numerischer Apertur und/oder Fo- kussierlinsensysteme in geeignetem Abstand eingekoppelt und so miteinander und mit dem eindimensionalen stehenden Wellenfeld zur Interferenz gebracht, daß ein zwei- oder dreidimensionales symmetrisches Intensitatsmuster aus Intensitatsmaxima und -minima entsteht

In dieses "mehrdimensionale" Wellenfeldmikroskop wird zur Objektlagerung ein Mi- kroaxialtomograph eingebaut

Bei der Axialtomographie wird anstelle des Glas-Objekttragers eine Mikrokapillare oder eine Glasfasern eingesetzt, die drehbar gelagert ist und das (biologische) Objekt in sich aufnimmt (Kapillare) oder an dem das (biologische) Objekt geeignet aufgebracht ist (Kapillare/Faser) Manuell oder mit einem computergesteuerten Schrittmotor kann die Kapillare/Faser, die üblicherweise senkrecht zur optischen Achse des Detektionsobjektivs angeordnet wird, um die Faserachse um einen definierten Winkel gedreht werden Eine Drehung um einen Winkel von 360 Grad (2π) ist möglich Der Tragerhalter für die Kapillare/Faser ist auf einem Halbkreis drehbar gelagert Die Drehachse verlauft dabei senkrecht zur optischen Achse des Detektionsobjektivs

Die Detektion der raumlichen Anordnung der Mikrotargets und ihrer Distanz erfolgt mittels des erfindungsgemaßen Kalibrierverfahrens und digitaler Bildanalyse Mehrdeutigkeiten von Intensitatsverlaufen, d h z B Intensitatshaupt- und -nebenmaxima von fluoreszenten "Punkt" -targets, können mit Hilfe geeigneter Computeralgorithmen statistisch ausgewertet werden und damit zu einer Erhöhung der Lokalisationsprazision beitragen Bei ausgedehnten Objekten können Mehrdeutigkeiten durch Zwei- oder Mehr- Photonen Anregung mit Photonen verschiedener Wellenlange reduziert werden BEISPIEL 2: Distanzmessung zwischen Genabschnitten von Chromosomen in einem Zellkern mittels mehrdimensionaler Wellenfeldmikroskopie, erfindungsgemäßem Kalibrierverfahren und ggf. Axialtomographie

(I) In einem Zellkern nimmt das Chromatin der einzelnen Chromsomen definierte Teilregionen ein Innerhalb einer oder mehrerer solcher chromosomalenTeilregionen werden die zu ortenden Strukturen , d h die Meßstrukturen, z B kleine Chromosomenabschnitte wie Gene oder Teilstucke von Genen, mit einer im Stand der Technik bekannten Methode der Fluoreszenz in situ Hybridisierung spezifisch markiert, und zwar mit Fluorochromen verschiedener bestimmter spektraler Signaturen Mi, M₂, M₃, Die Abstände zwischen den Markierungsorten (den markierten Meßstrukturen) liegen unter der klassischen Auflosung, d h sie sind kleiner als die Halbwertsbreite des Hauptmaximum der effektiven Punktbildfünktion Die Markierung der (Objekt-) Strukturen (Meß Strukturen) erfolgt derart, daß die spektralen Signaturen an den zu ortenden Strukturen (Meßstrukturen) mit nahezu der gleichen Dynamik vertreten sind

Das biologische Objekt wird auf einer Glasfaser exakt definierten Durchmessers oder in einer runden oder rechteckigen Kapillare definierter Dimensionen präpariert

(II) Um die Distanzen zu bestimmen, werden mikroskopierbare Präparate mit Kalibriertargets hergestellt, und zwar unter den gleichen physikalischen und chemischen Versuchsbedingungen wie das Objekt bzw die zu ortenden Objektstrukturen

(= Meßstrukturen)

Als Kalibriertargets bzw als Präparate mit Kalibriertargets dienen beispielsweise a mikroinjizierbare Kugelchen einer spektralen Signatur (monochromatisch) Die Kugelchen sind nach bekannten Verfahren mit jeweils einem Fluorochrom, d h monochromatisch markiert und aufgrund ihrer Große von den auszumessenden (zu ortenden) Strukturen im Objekt (den Meßstrukturen) unterscheidbar Man injiziert solche Kalibrierkugelchen, die die im Objekt vorhandenen spektralen Signaturen der Meßstrukturen repräsentieren, ansonsten aber vorzugsweise identisch sind (hinsichtlich Große, Geometrie, Materialbeschaffenheit etc ) Mit anderen Worten Die spektralen Signaturen der Meßstrukturen sowie der Kalibriertargets werden so gewählt, daß unter den gegebenen Untersuchungsbedingungen die von ihnen emittierten Fluoreszenzemissionen getrennt voneinander analysiert werden können Die Injizierung und Fixierung der monochromatischen Kalibrierkugelchen erfolgt derart, daß sich die einzelnen Kugelchen verschiedener spektraler Signatur in Clustern direkt an der Glasfaser-Oberflache oder Kapillarwand anordnen, vorzugsweise in einer Querschnittsebene der Faser bzw Kapillare Bei Verwendung von Prazisionsfasern und/oder -kapillaren liegen die Kugelchen folglich in definierten Abstände voneinander bzw von einer Bezugsebene, Bezugsachse oder Bezugslinie

b) mikroinjizierbare Testkugelchen multispektraler Signatur (polychromatisch) und gleicher spektraler Dynamik

Die Kugelchen sind nach bekannten Verfahren mit jeweils allen bei den markierten (Objekt-) Strukturen (Meßstrukturen) vorkommenden spektralen Signaturen markiert Infolgedessen können sie an beliebige Stellen im zu vermessenden biologischen Objekt (hier Kern) injiziert werden Eine Sollgeometrie wie bei a) ist nicht erforderlich, da für jede Signatur die chromatischen Schwerpunkte an derselben Stelle lokalisiert sein sollen Zur Unterscheidung von den markierten (Objekt-)Strukturen (Meß Strukturen) können die Kugelchen entweder einer anderen Größenklasse angehören oder aber eine zusatzliche spektrale Signatur tragen, die bei den zu messenden Strukturen d h den Meßstrukturen (gemäß Praparationsprotokoll) nicht vorkommt

c) simultan markierte Chromosomenregionen bekannter Distanz an einem anderen Chromosom als demjenigen, das die zu ortenden Strukturen (Meßstrukturen) tragt Die Kalibriertargets, d h hier die Chromosomenregionen mit bekanntem Abstand voneinander, sind mit Hilfe einer Probenkombination von DNA-Sequenzen, die die verschiedenen spektralen Signaturen tragt, unterschiedlich markiert Eine Unterscheidung der chromosomalen Kalibriertargets von den zu ortenden (Chromosomen-) Strukturen (Meßstrukturen) kann beispielsweise durch unterschiedliche Fluoreszenzintensitat erfolgen oder durch ein unterschiedliches Intensitatsverhaltnis zwischen Fluorochromen verschiedener spektraler Signatur oder durch Verwendung eines zusatzlichen Fluorochroms mit abweichender spektraler Signatur, das bei der Fluoreszenzmarkierung der Meßtargets nicht verwendet wurde

Es ist auch möglich, daß die Kalibriertargets einer anderen Größenklasse angehören als die zur ortenden Meßstrukturen

(III) Die Distanzmessungen werden mit einem erfindungsgemaßen mehrdimensionalen Wellenfeldmikroskop, kombiniert mit Photomultiplier und/oder Kamera und Datenverarbeitungsanlage, durchgeführt Von dem biologische Mikroobjekt, hier im Beispiel einem Zellkern, wird eine Serie optischer Schnitte aufgenommen Die Meßstrukturen Mi, M₂, M₃, Mi besitzen / = 1,2, JL spektrale Signaturen Die spektrale Signatur der Kalibriertargets Ui, U₂, U₃, ,Uι unterscheiden sich von derjenigen der Meßstrukturen z B in Volumen, Durchmesser, Intensität oder in der Zahl der spektralen Signaturen (/ = 1,2, JL + ) Die Bilder der optischen Schnitte werden für jede spektrale Signatur getrennt aufgenommen und gegebenenfalls noch der Untergrund korrigiert Zur Auswertung werden zum einen die Kalibriertargets identifiziert und der chromatische Versatz bestimmt Dazu werden die Kalibriertargets unter jeder spektralen Signatur lokalisiert und die Abstände zwischen den Kalibriertargets mit Fluorochrommarkierungen verschiedener spektraler Signatur gemessen Die gemessenen Lokalisationen ( d h die gemessenen Targetabstande) werden mit den aufgrund der Geometrie berechneten Soll- Lokalisationen ( d h den tatsachlichen Targetabstanden) verglichen und daraus der spektral bedingte Versatz (Shift) bestimmt

Dieser Versatz (Shift) ist der Kalibrierwert für die gemessenen Distanzwerte zwischen den zu ortenden (Objekt-) Strukturen (Meßstrukturen)

Da dieser Versatz von den optischen Eigenschaften des Präparates abhangt (z B Brechzahlen in den Kernen und dem Praparationsmedium), sollte die Kalibrierung in situ erfolgen Das heißt im vorliegenden Beispiel, daß sich die Kalibriertargets neben den zu untersuchenden und markierten (chromosomalen) Strukturen (Meßstrukturen) im Kern befinden sollten

Zum anderen werden die Abstände zwischen den zu ortenden (Objekt-) Strukturen (Meßstrukturen) lokalisiert Man bestimmt dabei in jeder spektralen Signatur zunächst unabhängig voneinander die Position der Schwerpunkte der gemessenen Intensitatssigna- le, d.h es werden die Abstände zwischen den verschiedenen Farbsignalen bzw Farbpunkten der betreffenden Meßstrukturen, z B zwischen dem rotfluoreszierenden und dem grunfluoreszierenden Farbpunkt (von Intensitatsmaximum zu Intensitatsmaximum oder von Schwerpunkt/Baryzentrum zu Schwerpunkt/Baryzentrum) gemessen, und dieser Meßwert wird um den mit den Kalibriertargets ermittelten (durch die verschiedene spektrale Signatur bedingten) Versatz in hochpräziser Weise korrigiert Die korrigierten Positionen der Meßstrukturen werden in Bezug auf einen Vergleichspunkt angegeben. Dieser Vergleichspunkt kann z.B. ein beliebig ausgezeichneter fester Punkt im Objekt oder der Schwerpunkt eines Kalibriertargets (z B. eine markierte Chro- mosomenregionen) oder eines sonstwie ausgezeichneten Chromosomenterritoriums sein Es kann aber auch die Schwerpunktskoordinate aller Meßstrukturen innerhalb eines Chromosomenterritoriums sein

Bei Kalibriertargets in Gestalt von mikroinjizierbaren Testkugelchen mit multispektraler Signatur (polychromatisch) wird der chromatische Versatz aus dem Lokalisa- tionsunterschied der Schwerpunkte für jede Signatur bestimmt. Die dafür erforderliche Identifizierung der zu einem Kalibriertarget gehörenden Fluoreszenzemission kann beispielsweise durch volumenerhaltende Schwell wert verfahren oder durch Mittelung der Segmentierungsergebnisse bei Schwell wertvariation erfolgen.

Bei Kalibriertargets in Gestalt von fluorochrommarkierten Objektregionen mit multispektraler Signatur (polychromatisch) wird der chromatische Versatz genauso bestimmt.

Als fluorochrommarkierte Kalibrierregionen eignen sich insbesondere auch Zentromer- regionen, die mit einer Probenkombination von solchen DNA-Sequenzen hybridisiert werden, die alle an dieselben chromosomalen DNA-Abschnitte binden, jedoch mit Fluorochromen unterschiedlichen spektraler Signatur markiert wird. Erfolgt die Hybridisierung unter hoch stringenten Bedingungen, liegen pro Zellkern zwei Markierungsregionen vor; bei nieder-stringenten Bedingungen werden aufgrund zusatzlicher Nebenbindungsregionen zusatzliche Zentromerregionen markiert, so daß die Zahl der Kalibrierungsregionen ansteigt Das ist u U sehr von Vorteil (IV) Die beschriebenen Meßverfahren können auch in Kombination mit Axialtomographie durchgeführt werden Hierfür wird das biologische Mikroobjekt, z B ein Zellkern, in dem die zu ortenden Meßstrukturen bereits mit Fluorochromen markiert sind und das auch bereits Kalibriertargets enthalt (zur Praparation siehe Beispiel 1), auf einer Glasfaser oder in der Mikrokapillare angeordnet Mit dem Axialtomograph wird das Objekt Schritt für Schritt um einen definierten Winkel gedreht unter ggf automatischer Refo- kussierung Von jedem Winkelschritt wird ein kompletter 2D oder 3D-Bildstapel aufgenommen

Die Drehung erfolgt in der Art, daß jeweils ein Abstand zwischen zwei Meßstrukturen bzw Kalibriertargets (d h zwischen deren Fluoreszenzintensitatsschwerpunkten) maximal wird Der maximale gemessene Abstand entspricht dem tatsachlichen Abstand

Ist man nur an den Abstanden zwischen den Meßstrukturen bzw Kalibriertargets, d h nicht an ihrer absoluten raumlichen Anordnung interessiert, kann man nun von einer der bekannten Meßstrukturen bzw Kalibriertargets aus fortfahren, den Abstand zu einer dritten Meßstruktur bzw einem dritten Kalibriertarget zu maximieren und zu bestimmen Sind die Abstände zwischen den Meßstrukturen bzw Kalibriertargets großer als die Halbwertsbreite des Hauptmaximums der Punktbildfünktion, so genügt eine einzige spektrale Signatur, sind die Abstände dagegen kleiner, müssen die Meßstrukturen bzw Kalibriertargets durch multispektrale Signatur unterschieden werden Die Schwerpunkte (Maxima) der Signale dienen der Lokalisierung Sofern die untersuchten Meßstrukturen einen Durchmesser haben, der kleiner als die Halbwertsbreite des Hauptmaximums der effektiven Punktbildfünktion ist, werden alle Beugungsbilder der Meß Strukturen bzw Kalibriertargets durch eine scharfe Punktbildfünktion bestimmt, so daß die Maxima optimal bestimmt werden können

Ist man an der absoluten Anordnung der Meßstrukturen bzw Kalibriertargets im Raum interessiert, so müssen die jeweiligen Schwerpunkte (sog "Baryzentren") präzise bestimmt werden Durch mehrmaliges Wiederholen der gesamten Meßprozedur und statistische Auswertung kann die absolute Lokalisierung der Meßstrukturen bzw Kalibriertargets, d h die Winkelmessung, verbessert werden Anstatt wie vorstehend beschrieben die Kalibrierung und die Distanzmessung zwischen den zu ortenden Strukturen, d h Meß Strukturen, in demselben biologischen Objekt durchzuführen, kann man auch die Kalibrierung unabhängig von den Meß Strukturen an gleichartigen biologischen Objekten durchführen Bei dieser Verfahrensvariante ist die Unterscheidung zwischen den Fluoreszenzsignalen der Kalibriertargets und denjenigen der Meßstrukturen erleichtert Anhand der mit den Kalibriertargets ermittelten Werte des optischen Versatzes kann man Eichkurven für die Distanzmessungen zwischen den Meßstrukturen erstellen Derartige Eichkurven machen z B Angaben über den spektralen Versatz als Funktion von Brechungsindex und Absorption des verwendeten Immersionsmediums, der verwendeten Optik, Filter und Detektionseinheiten, der verwendeten Auswertealgorithmen, der verwendeten biologischen Objekte, der Lokalisation der Meßstrukturen bzw Kalibriertargets in ihnen etc Die Verwendung der Information aus diesen speziellen Eichkurven zur erfindungsgemaßen Distanzmessung bietet sich insbesondere in solchen Fallen an , bei denen einer größere Prazisionstoleranz verwendet erlaubt ist

BEISPIEL 3: Untersuchung und Darstellung von dreidimensional ausgedehnten Objekten mittels mehrdimensionaler Wellenfeldmikroskopie, erfindungsgemäßem Kalibrierverfahren und simultaner Bildaufnahme

Üblicherweise wird von einem biologischen Mikroobjekt ein 3 D-Datensatz durch sequentielle Registrierung gewonnen, z B in der konfokalen Laserscanningmikroskopie durch punktweises oder linienweises Abscannen des 3D-Objektvolumens, ein zweites Verfahren beruht auf der Registrierung der Fluoreszenzemission aus der Objektebene durch Positionierung eines Detektorarrays in der zu der Objektebene konjugierten Zwischenbildebene üblicherweise ist die Position dieser Zwischenbildebene fixiert, um SD- Informationen über das biologische Objekt zu erhalten, wird dieses sequentiell durch die zu der festen Zwischenbildebene konjugierte Objektebene hindurch bewegt, jedesmal wird ein 2D-Bilddatensatz der betreffenden Fluoreszenzemission registriert, und/oder das Objekt wird mit Hilfe axialtomographischer Verfahren um verschiedene Drehwinkel gedreht, wobei jedesmal 2D-Datensatze der zu der festen Zwischenbildebene konjugierten Objektebene registriert werden

Diese sequentielle Registrierung von Objektpunkten, Objekt nien oder Objektebenen hat verschiedene Nachteile Z B kann ein Ausbleichen der Registrierung des 3D-Datensatzes zu einer Verschiebung der erfindungsgemaß bestimmten 3D-Schwerpunkte der Fluoreszenzverteilung von markierten Objektpunkten einer bestimmten spektralen Signatur führen Ein anderer Nachteil besteht darin, daß die 3D-Datenaufhahme nicht schnell genug erfolgt, um auch bei nicht permanent stabil, d h sich bewegenden Objekten, insbesondere bei in vivo Markierungen wie z B bei fluoreszenzmarkierten Chromosomenregionen in Kernen lebender Zellen, die sich unter physiologischen Bedingungen mit Geschwindigkeiten bis zu einigen nm/sec (mittlere Verschiebung) bewegen können, eine befriedigende Bildqualitat zu gewährleisten

Um auch bei sich bewegenden Objekten eine befriedigende Abbildungsqualltat zu erhalten, sieht die vorliegende Erfindung eine simultane Aufnahme des 3D-Datensatzes eines fluoreszenzmarkierten Objektes vor Hierzu wird das vom Objekt emittierte Fluoreszenzlicht einer gegebenen spektralen Signatur durch optische Elemente, z B Teilerspiegel, aufgespalten in N Teilstrahlen und auf N Detektorarrays abgebildet, die sich in N verschiedenen Zwischenbildebenen befinden, die zu N verschiedenen Objektebenen konjugiert sind Eine einfache Abschätzung aufgrund der Abbildungsgleichung ergibt, daß die Abstände der Zwischenbildebenen (Detektorebenen) bei simultaner Registrierung eines Objektbereiches mit 10 μm axialer Ausdehnung und eines Objektivs von konventioneller Bildweite und hoher numerischer Apertur z B um einen Bereich in der Größenordnung < 20 cm variiert werden müssen (abhangig vom verwendeten Objektiv) Durch weitere N Zwischenoptiken können die für Hochprazisionsdistanzmessungen in relevanten Objektbereichen zu registrierenden N Objektebenen auch auf verschiedene Bereiche desselben, geeignet groß dimensionierten Detektorarrays (bzw auf L < N Detektorarrays) abgebildet werden In diesem Falle entspricht einem bestimmten Ausschnitt des/der L Detektorarrays eine der N konjugierten Objektebenen Beispielsweise wird ein kleiner Objektbereich von wenigen μm Ausdehnung zur Vermessung in der Wellenfeldmikroskopie zunächst so grob positioniert, daß sein Schwerpunkt etwa im Zentrum des durch die Detektionspunktbildf nktion für eine bestimmte (Zwischen)Bildebene B₀ gegebenen Beobachtungsvolumens des zur Registrierung verwendeten Mikroskopobjektivs liegt, das vom 3D-Objekt ausgehende Fluoreszenzlicht wird nach seinen spektralen Signaturen getrennt und in N Teilstrahlen aufgespalten, die auf N Detektorarrays (von z B je 8 x 8, 16 x 16 oder 64 x 64 Pixelgroße) abgebildet werden, deren Positionierung die Registrierung der Fluoreszenzemission aus N konjugierten Objektebenen um das Maximum der Detektionspunktbildfünktion (bezogen auf die Bildebene B₀ ) gestattet Beispielsweise sind bei simultaner Aufnahme von Objekten mit einem Abstand von jeweils 20 nm nach einer einfachen Abschätzung unter obigen Annahmen Verschiebungen der konjugierten Zwischenbildebenen um jeweils wenige 100 μm (in der Nahe des Maximums der Punktbildfünktion) erforderlich, bzw entsprechend kleine optische individuelle Korrekturen sind bei simultaner Detektion der relevanten Objektausschnitte auf einem einzigen (oder L < N) Detektorarray(s) entsprechender Pixelzahlen auszuführen Bei einer Teilung der Fluoreszenzemission z B in N=20 Teilstrahlen gleicher Intensität vermindert sich die Anzahl der von jedem der N=20 Detektorarray(s) (bzw - Ausschnitte) pro Zeiteinheit registrierten Photonenzahl um etwa den gleichen Faktor Die Lokalisationsgenauigkeit eines fluoreszenzmarkierten Objektes vermindert sich dann aufgrund der verschlechterten Photonenstatistik um schätzungsweise einen Faktor 20 Dieser Nachteil kann durch eine Erhöhung der Registrierungszeit um den Faktor N (z.B N=20) beseitigt werden In diesem Falle dauert die simultane Registrierung des Objektes etwa ebensolange wie bei sequentieller Registrierung Bei Objekten mit Ausbleichverhalten besteht der Vorteil der simultanen dreidimensionalen Registrierung jedoch in einer für alle Targets (einer gegebenen spektralen Signatur) des Beobachtungsvolumens ahnlichen (bzw ahnlicherem) Ausbleichverhalten, durch Ausbleichen verursachte Verschiebungen des Schwerpunktes des Fluoreszenzemissionsbildes werden hierdurch vermindert Bei Objekten mit zeitlich dynamischer Struktur (z B markierte Zellen in vivo) wird bei einer gegenüber der sequentiellen Registrierung um den Faktor N verkürzten Aufhahme- zeit (z B 1 sec statt 20 sec) die Lokalisationsgenauigkeit der einzelnen Objektpunkte um schätzungsweise den Faktor \N (bei N=20 z B 4 5) vermindert

Beispielsweise ergibt sich bei einer 3D Lokalisationsgenauigkeit im Wellenfeldmikroskop von ca ± 3 nm, erhalten mit sequentiellen Aufnahmezeiten von 1 sec pro Bildebene, unter den genannten Bedingungen bei simultaner Registrierung ( 1 sec) eine Verminderung auf eine Lokalisationsgenauigkeit auf schätzungsweise ± 4 5 • 3 nm « 14 nm bei simulta- ner Aufnahme von 20 Objektebenen unter sonst gleichen Bedingungen Bei einer (als Beispiel) angenommenen Objektbewegung (mittlere Verschiebung) von 5 nm/sec wäre die tatsachliche Lokalisationsungenauigkeit bei einer sequentiellen Aufnahme mit einer Gesamtregistrierungszeit von 20 sec bereits ohne Berücksichtigung von Ausbleicheffekten jedoch erheblich großer Erfindungsgemaß ist hier die beschriebene simultane Registrierung von Objektebenen nicht nur hinsichtlich einer optischen Achse, sondern auch hinsichtlich zwei und drei orthogonalen optischen Achsen

Bei Bedarf kann diese erfindungsgemaße simultane Bildaufnahme ohne weiteres mit einer herkömmlichen sequentiellen Bildaufhahme kombiniert werden

BEISPIEL 4 : DNA-Sequenzierung mittels mehrdimensionaler Wellenfeldmikroskopie

Mittels bekannter Verfahren wie z B der Polymerase-Kettenreaktion werden alle komplementären Subsequenzen der zu analysierenden DNA-Sequenz herstellt Die Subsequenzen beginnen alle am selben Nukleotid der zu analysierenden Sequenz Die zu analysierenden Bruchstucke werden alle am 3' Ende mit einem Bezugsfluorochrommarker α markiert Am anderen Ende, dem 5'-Ende, bzw an definierten Zwischenstellen werden sie jeweils mit einem Fluorochrommarker a, g, c, t verschiedener spektraler Signatur markiert, je nachdem ob das Nukleotid die Base Adenin (Marker a), Guamn (Marker g), Cytosin (Marker c) oder Thymin (Marker t) tragt

Alle Typen der verwendeten Fluorochrommarker unterscheiden sich in ihrer spektralen Signatur derart, daß die Fluorochrommarker α, a, g, c, t (ggf noch weitere) getrennt voneinander detektiert werden können, ein bestimmter Fluorochrommarker kann erfindungsgemaß von einem bis vielen Fluorochrommolekulen des gleichen oder verschiedenen Typs gebildet werden, wobei die Lange und Zusammensetzung der Fluorochrommarker erfindungsgemaß so gewählt wird, daß Distanzmessungen zwischen den Schwerpunkten der Intensitatsverteilungen von anfangsstandigem Fluorochrommarker α und endstandigen Fluoreszenzmarkern (entweder a, oder g, oder c, oder t, oder ggf weitere für weitere Basen) mit dem Verfahren der mehrdimensionalen Wellenfeldmikroskopie möglich ist, d h Linkermolekule für Fluoreszenzmarker müssen dabei beispielsweise kurzer als 1/2 Nukleotiddurchmesser sein Erfindungsgemaß ist auch die Verwendung von längeren Linkermolekulen möglich, sofern diese eine Konfiguration von so hoher Steifigkeit besitzen, daß die durch sie verursachte Distanzvariation genügend klein ist, beispielsweise < 1/2 Nukleotiddurchmesser betragt

Diese so markierten Subsequenzen repräsentieren die zu analysierende DNA-Sequenz vollständig Die Fluoreszenzmarker a, g, c, t bzw das Bezugsfluorochrom α können jeweils ein oder mehrere Fluorochrommolekule enthalten Die DNA-Subsequenzen werden alle so auf geeignete Trager fixiert, daß sie als lineare Sequenz vorliegen

Die fluorochrommarkierten DNA-Stucke werden mit Hilfe von DNA-Combing- Techniken linear ausgerichtet Im Unterschied zum herkömmlichen "eindimensionalen" Wellenfeldmikroskop ist bei dem erfindungsgemaßen mehrdimensionalen Wellenfeldmikroskop eine zusatzliche präzise Ausrichtung der DNA-Strange in Richtung der optischen Achse des Systems nicht mehr notwendig Die DNA-Sequenzen werden vorzugsweise auf eine viereckige Glasfaser aufgebracht, deren Brechungsindex sich von demjenigen des umgebenden Mediums in minimaler Weise unterscheidet, wobei die Ausrichtung in einem bestimmten Winkel, insbesondere orthogonal zur Achse der Glasfaser erfolgt, und wobei der mittlere Abstand der Schwerpunkte der DNA-Sequenzen voneinander großer ist als die maximale Halbwertsbreite der zur Registrierung der Fluoreszenzsignale verwendeten Punktbildfünktionen Ein weiteres Verfahren bindet das 3' Ende an ein Mikrokugelchen der spektralen Signatur αund streckt anschließend den DNA-Faden mit dem Werkzeug der optischen Pinzette, wobei der "Pinzettenlaser" in seiner Wellenlange geeignet gewählt werden muß

Nach Linearisierung bzw Orientierung der DNA-Sequenzen wird das so hergestellte Präparat fixiert und die molekulare Bewegung z B durch Temperaturerniedrigung reduziert Alternativ können die DNA-Enden auch in eine kristallin geordnete Festkorper- struktur eingebettet werden Für die Messung wurden zu Zwecken der Kalibrierung weitere, insbesondere polychromatische Mikroobjekte auf die Glasfaser, den DNA- Objekttrager oder in den Fixierungsfestkorper der DNA-Enden eingebracht Die Kalibrierungsobjekte enthalten zusatzlich eine spektrale Signatur, die nicht a, t, c oder g ist Die Linearisierung der DNA-Strange kann entfallen, wenn alle Nukleotiden bei der Syn- these des zu analysierenden DNA-Komplementarstranges geeignet fluoreszenzmarkiert werden

Die fixierten DNA-Sequenzen werden in ein mehrdimensionales Wellenfeldmikroskop eingebracht, wobei die linearen DNA-Subsequenzen so zu den stehenden Wellenfronten orientiert werden, daß eine exakte Abstandsmessung (Genauigkeit <1«10^"10 m) zwischen oc und a bzw g, c oder t — nach Bestimmung der Intensitatsbaryzentren und Kalibrierung der Abbildungseingenschaften — möglich ist

Die Messung erfolgt bei in situ Kalibrierung unter Anwendung des erfindungsgemaßen Kalibrierverfahrens Die Signale der Fluorochrommarker werden im Wellenfeldmikroskop mit geeignet angepaßten Schrittweiten spektral getrennt voneinander registriert (bevorzugt in digitaler Weise) Aus den Abstanden der fluoreszenten Markern und ihrer spektralen Signatur laßt sich die DNA-Basensequenz des zu analysierenden DNA- Stuckes bestimmen

Statt einer spektralen Trennung oder zusatzlich zu ihr können auch Fluoreszenzlebensdauerparameter analysiert werden In einer ersten Phase der Auswertung wird eine Grobbestimmung der Schwerpunkte der Fluorochrommarker- Signale vorgenommen und auf der Grundlage dieser Information die zu einer DNA-Sequenz gehörenden Signale nach den oben genannten Distanzkriterien von den zu einer anderen DNA-Sequenz gehörenden Signalen getrennt, in einer zweiten Phase der Auswertung werden die spektral getrennt registrierten, modulierten Signale der Fluorochrommarker mit Hilfe von geeignet angepaßten Funktionen analysiert, hieraus werden die Abstände z B der Schwerpunkte der anfangs- und endstandigen Fluorochrommarker-Signale einer DNA-Sequenz voneinander mit molekularer Präzision bestimmt, wobei die an den Kalibrierungsobjekten vorgenommenen Messungen für eine Korrektur von Distanzaberrationen, z B chromatischer Verschiebungen, herangezogen werden, in einer dritten Phase der Auswertung werden die den Langen der DNA-Sequenzen entsprechenden Abstände der Fluorochrommarker-Signale nach zunehmender Lange getrennt nach Typus des endstandigen Fluorochrommarkers (z B a, g, c, t) geordnet, die so erreichte Anordnung entspricht dem bei einem herkömmlichen Verfahren erzielten Muster, dem dann nach bekannten Methoden die gewünschte Sequenzinformation entnommen werden kann Bei Makromolekülen linearer Sequenz bzw bekannter geordneter Struktur geht man analog vor, wobei die Zahl und Art der Fluorochrommarker von Zahl und Art der Mole- kulbausteine abhangt

Falls die Vermessung einzelner DNA-Strange deren Ausrichtung in Richtung der optischen Achse erforderlich macht, kann erfindungsgemaß wie folgt verfahren werden Das bekannte Ende der DNA-Kette wird zusatzlich zu einem Fluoreszenzmarker der spektralen Signatur α mit einem chemischen "Marker" markiert Der Rest der DNA- Kettenpraparation, insbesondere die Markierung der endstandigen Fluoreszenzmarker a, c, g und t (Stopnukleoüde) wird wie anfangs beschrieben durchgeführt Die endstandigen Basen und/oder die Marker der Stopnukleoüde und ggf weitere Basen der auszurichtenden DNA-Ketten tragen eine elektrische Ladung (z B negativ)

Die Ausrichtung der DNA-Ketten kann vor oder wahrend der Mikroskopie erfolgen, zunächst wird das Verfahren der Ausrichtung vor der Mikroskopie beschrieben

Die präparierten DNA-Ketten werden in Losung in einem Puffer niedriger Ionenstarke auf einen speziell beschichteten Objektträger (oder Deckglas, was im folgenden auch als Objektträger bezeichnet werden soll) aufgebracht, der das chemisch markierte 3' Ende jeder DNA-Kette binden ("ankleben") kann Der Losung wird nun eine immobilisierende Komponente zugegeben, die nach einer bestimmten Zeit eine Aushärtung der DNA- Ketten in Losung bewirkt Der Objektträger wird mit einem (unbeschichteten) Deckglas abgedeckt und versiegelt, wobei der Abstand von Objektträger zum Deckglas mit einem geeigneten "Spacer" (z B einer dünnen Membran) auf einen wohldefinierten Wert eingestellt werden kann Der so versiegelte Objektträger wird einem geeigneten homogenen, statischen elektrischen Feld ausgesetzt, welches die elektrisch geladenen Basen ausrichtet Die Polung des elektrischen Feldes (beispielsweise des eines Kondensators) muß hierbei so angelegt sein, daß bei negativ (positiv) geladenen Basen die Kathode (Anode) bei dem beschichteten Objektträger (mit den "angeklebten" 3' Enden) und die Anode (Kathode) bei dem unbeschichteten Deckglas liegt Die elektrischen Feldlinien verlaufen senkrecht zur Objekttrageroberflache und die Starke des elektrischen Feldes wird ausreichend hoch gewählt, um eine Ausrichtung der DNA-Ketten in der Losung zu bewirken Nachdem die so ausgerichteten DNA-Ketten in dem Zwischenraum Objektträger - Deckglas immobilisiert sind, werden sie mit dem mehrdimensionalen Wellenfeldmikroskop wie vorstehend beschrieben aufgenommen bzw vermessen

Soll die Orientierung der DNA-Ketten wahrend der mikroskopischen Aufnahme erfolgen, wird das oben beschriebenen elektrische Feld erfindungsgemaß nach dem folgenden Verfahren aufgebaut.

Der beschichtete Objektträger ist ein elektrisch leitender Spiegel hinreichender Planitat Die Losung der DNA-Ketten (niedrige Ionenstarke) ist geeignet viskos und es werden keine immobilisierenden Komponenten der Lösung zugegeben Auch hier wird wieder (ggf unter Verwendung eines geeigneten Spacers) ein Deckglas aufgebracht und versiegelt. Das Wellenfeld wird nun mit nur einem Objektiv in Verbindung mit dem Spiegel erzeugt, wobei das aus dem Objektiv austretende Anregungslicht vom Spiegel reflektiert wird und sich ein eindimensionales Wellenfeld (parallel zur Fokalebene oder zur Spiegeloberfläche) ausbildet. Das Anlegen einer positiven (negativen) Spannung bei der Verwendung von negativ (positiv) geladenen Basen bewirkt ebenfalls eine Ausrichtung der DNA-Ketten senkrecht zur Oberflache des Spiegels, also entlang der optischen Achse des Mikroskops und die nun wie vorstehend beschrieben sequenziert werden können Auch bei diesem Verfahren muß die Starke des elektrischen Feldes groß genug sein, um die Ausrichtung der DNA-Ketten zu bewirken; thermische Bewegungen der Moleküle können z.B. durch Temperaturerniedrigung reduziert werden.

Analog diesem Beispiel kann mit beliebigen anderen linearisierten Makromolekülen verfahren werden.

BEISPIEL 5: Mehrdimensionales Wellenfeldmikroskop Typ H mit lateraler räumlich modulierter Fluoreszenzanregung

Das mehrdimensionale Wellenfeldmikroskop Typ II umfaßt in der Raumrichtungen x eine reelle Beleuchtungsquelle für koharenzfahige Lichtstrahlen, einen Strahlteiler zur Auskopplung von Teilstrahlen als virtuelle Beleuchtungsquelle, und ein erstes Objektiv, das diesen beiden Beleuchtungsquellen zugeordnet ist In dieses erste Objektiv werden die Lichtstrahlen bzw Lichtwellenzuge der Beleuchtungsquellen derart eingekoppelt, daß sie auf der hinteren, dem Objektraum abgewandten Fokalebene (diese Ebene wird auch "back focal plane" genannt ) zwei voneinander beabstandete Fokuspunkte erzeugen bzw aufweisen und in dem Raum zwischen den beiden Fokalebenen in einem bestimmten Winkel aufeinander zu verlaufen und zu einem eindimensionalen stehenden Wellenfeld interferieren

Fokussiert man einen Lichtstrahl (Lichtwellenzug) mit einem geeigneten Abstand zur optischen Achse in diese Fokalebene, (die optische Achse steht senkrecht auf der Fokalebene und verlauft durch deren Mittelpunkt) so verlaßt im Objektraum ein paralleles Lichtbundel mit ebenen Wellenfronten das Objektiv, und zwar unter einem bestimmten Winkel zur optischen Achse Dieser Winkel ist variabel einstellbar, je nach dem, mit welchem Abstand zu optischer Achse die Lichtstrahlen in das Objektiv eingekoppelt werden und um welche Art von Objektiv es sich handelt

Koppelt man den zweiten Lichtstrahlen (Lichtwellenzuge) unter einem solchen Winkel zu dem ersten und zur optischen Achse in dasselbe Objektiv ein, daß sein Fokuspunkt auf der hinteren Fokalebene diametral gegenüber dem Fokuspunkt des ersten Lichtstrahls liegt, daß also Fokuspunkt 1 — optische Achse — Fokuspunkt 2 eine Linie auf der hinteren Fokalebene bilden, entsteht in dem Raum zwischen den beiden Fokalebenen ein zweites paralleles Lichtbundel mit ebenen Wellenfronten, das in einem bestimmten Winkel zu dem ersten verlauft und mit diesem im Objektraum zu einem eindimensionalen stehenden Wellenfeld mit Streifen maximaler Lichtintensitat interferiert

Dem ersten Objektiv ist ein zweites Objektiv mit Abstand spiegelbildlich gegenüber angeordnet, so daß diese beiden Objektive auf zwei gegenüber liegenden Seiten des dreidimensionalen Objektraums liegen Diesem zweiten Objektiv ist eine dritte und eine vierte (reelle oder virtuelle) Beleuchtungsquelle für koharenzfahige Lichtstrahlen so zugeordnet, daß man die Lichtstrahlen beider Beleuchtungsquellen — wie für das erste Objektiv beschrieben — auf die hintere, d h dem Objektraum abgewandte Fokalebene dieses zweiten Objektives fokussieren kann, in dem Raum zwischen den beiden Fokalebenen dieses zweiten Objektives zu einem eindimensionalen stehenden Wellenfeld inter- ferieren lassen kann, und im Objektraum mit dem eindimensionalen stehenden Wellenfeld des ersten Objektives so zur Interferenz bringen kann, so daß ein dreidimensionales Wellenfeld entsteht, mit Punkten maximaler Intensität, die sich im dreidimensionalen Raum fortsetzen

Für die Erzeugung eines zweidimensionalen Wellenfeldes (d h Punkte maximaler Intensität in einer Ebene), wird der beschriebene Aufbau insoweit abgewandelt, daß man entweder erstes und zweites Objektiv einsetzt, eines davon aber nur mit einer Beleuchtungsquelle kombiniert, oder man setzt nur ein einziges Objektiv ein und kombiniert dieses mit einer dritten Beleuchtungsquelle, deren koharenzfahige Lichtstrahlen man derart zu den Lichtstrahlen der beiden anderen Beleuchtungsquellen in dieses einzige Objektiv einkoppelt, daß die korrespondierenden drei Fokuspunkte auf der Fokalebene ein gleichschenkliges Dreieck bilden, durch dessen Mittelpunkt die optische Achse verlauft Im Objektraum verlassen alle drei Lichtstrahlen das Mikroskopobjektiv mit dem gleichen Winkel zur optischen Achse aber jeder in eine andere Richtung

Diese Variante des erfindungsgemaßen Wellenfeldmikroskops Typ II zur Erzeugung eines mehrdimensionalen Wellenfeldmikroskops unter Verwendung eines einzigen Objektivs kann auch zur Erzeugung eines dreidimensionalen Wellenfelds eingesetzt werden Dazu lenkt man vier Lichtstrahlen in dasselbe Objektiv und zwar derart, daß die dazu korrespondierenden vier Fokuspunkte in der hinteren Fokalebene ein gleichseitiges Viereck bilden

Claims

A n s p r ü c h e

Wellenfeldmikroskop mit einem Beleuchtungs- bzw Anregungssystem, das eine Beleuchtungsquelle, ein erstes Objektiv und ein zweites Objektiv oder einen Reflektor umfaßt, wobei erstes Objektiv und zweites Objektiv oder Reflektor derart zueinander angeordnet sind, daß sie zur Erzeugung eines eindimensionalen stehenden Wellenfeldes geeignet sind, mit einem Objektraum, der Halte und Manovriervorrichtung(en) für ein Objekt umfaßt, und mit einem Detektionssystem, das ein Objektiv, ein Okular und einen Detektor umfaßt, dadurch gekennzeichnet, daß das Beleuchtungs- bzw Anregungssystem in zwei oder allen drei Raumrichtungen wenigstens eine reelle oder virtuelle Beleuchtungsquelle für koharenzfahige Lichtstrahlen und wenigstens einen Reflektor oder Strahlteiler zur Auskopplung von Teilstrahlen oder eine weitere Beleuchtungsquelle für koharenzfahige Lichtstrahlen umfaßt, denen jeweils wenigstens ein Objektiv zugeordnet ist, und die jeweils zur Erzeugung von Lichtwellenzugen geeignet sind, wobei die Lichtwellenzuge der einen Beleuchtungsquelle antiparallel oder in variabel einstellbaren Winkeln zu den Lichtwellenzugen des Reflektors bzw der anderen Beleuchtungsquelle ausgerichteten sind, derart, daß die von der einen Beleuchtungsquelle ausgesendeten Lichtwellenzuge mit denen des Reflektors bzw der anderen Beleuchtungsquelle zu einem stehenden Wellenfeld mit ebenen Wellenfronten interferieren, und daß das Detektionssystem wenigstens ein zur epifluoreszenten Detektion geeignetes und/oder wenigstens ein zur rasternden Punktdetektion geeignetes Detektionsobjektiv vorzugsweise hoher numerischer Apertur, welches mit seiner optischen Achse senkrecht zu den Wellenfronten eines der interferierenden Wellenfelder angeordnet ist, umfaßt, das auch mit einem Objektiv des Anregungssystems identisch sein kann, wobei dem zur epifluoreszenten Detektion geeigneten Detektionsobjektiv ein flachiger (zweidimensionaler) Detektor, z B eine Kamera vorgeordnet ist, und dem zur rasternden Punktdetektion geeigneten Detektionsobjektiv wenigstens eine feststehende konfokale Detektionsringblende und/oder -lochblende und/oder wenigstens ein feststehender Detektionsschlitz vorgeordnet und ein Punktdetektor, insbesondere ein Photomultiplier, eine Photodiode oder eine Diodenarray nachgeordnet ist Wellenfeldmikroskop nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in wenigstens einer Raumrichtung einem Objektiv hoher numerischer Apertur ein Objektiv niedriger numerischer Apertur oder ein Reflektor zugeordnet ist, und in einer oder beiden anderen Raumrichtung(en) entweder zwei Objektive niedriger numerischer Apertur oder ein Objektiv niedriger numerischer Apertur und ein Reflektor einander zugeordnet sind.

Wellenfeldmikroskop mit einem Beleuchtungs- bzw Anregungssystem, das eine Beleuchtungsquelle und ein Objektiv umfaßt, die derart zueinander angeordnet sind, daß sie zur Erzeugung eines stehenden Wellenfeldes geeignet sind, mit einem Objektraum, der Halte- und Manovriervorrichtung(en) für ein Objekt umfaßt, und mit einem Detektionssystem, das ein Objektiv, ein Okular und einen Detektor umfaßt, dadurch gekennzeichnet, daß das Beleuchtungs- bzw Anregungssystem in wenigstens einer der drei Raumrichtungen wenigstens eine reelle oder virtuelle Beleuchtungsquelle für koharenzfahige Lichtstrahlen und wenigstens einen Strahlteiler zur Auskopplung von wenigstens einem Teilstrahl aufweist, denen ein gemeinsames Objektiv zugeordnet ist, in das die Lichtstrahlen bzw Lichtwellenzuge der Beleuchtungsquelle(n) und des/der Strahlteiler(s) derart einkoppelbar sind, daß sie auf der hinteren (dem Objektraum abgewandten) Fokalebene zwei voneinander beabstandete Fokuspunkte aufweisen und in dem Raum zwischen den beiden Fokalebenen in variabel einstellbarem Winkel zueinander verlaufen und zu einem eindimensionalen stehenden Wellenfeld interferieren, und daß das Detektionssystem wenigstens ein zur epifluoreszenten Detektion geeignetes und/oder wenigstens ein zur rasternden Punktdetektion geeignetes Detektionsobjektiv vorzugsweise hoher numerischer Apertur umfaßt, das auch mit einem Objektiv des Anregungssystems identisch sein kann, wobei dem zur epifluoreszenten Detektion geeigneten Detektionsobjektiv ein flachiger (zweidimensionaler) Detektor, z.B eine Kamera vorgeordnet ist, und dem zur rasternden Punktdetektion geeigneten Detektionsobjektiv wenigstens eine feststehende konfokale Detektionsringblende und/oder -lochblende und/oder wenigstens ein feststehender Detektionsschlitz vorgeordnet und ein Punktdetektor, insbesondere ein Photomultiplier, eine Photodiode oder eine Diodenarray nachgeordnet ist Wellenfeldmikroskop nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Beleuchtungs- bzw Anregungssystem in derselben oder einer oder beiden anderen Raumrichtung(en) jeweils wenigstens eine weitere reelle oder virtuelle Beleuchtungsquelle für koharenzfahige Lichtstrahlen und/oder wenigstens einen Strahlteiler zur Auskopplung von wenigstens einem Teilstrahl aufweist, dem/denen jeweils ein weiteres Objektiv zugeordnet ist, durch das der/die Lichtstrahlen (Lichtwellenzuge) in den Objektraum gelenkt und derart ausgerichtet sind, daß sie mit den Lichtstrahlen aus derselben oder aus der /den beiden anderen Raumrichtung(en) bzw. dem von diesen gebildeten ein- oder zweidimensionalen Wellenfeld zu einem zwei- bzw. dreidimensionalen Wellenfeld interferieren.

Wellenfeldmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Objektraum eine Objekthalt erung umfaßt, in bzw. an der das Objekt mit den Meßstrukturen und/oder gegebenenfalls Kalibriertarget(s) um eine oder zwei orthogonal zueinander verlaufende Achsen drehbar in dem Wellenfeld gelagert ist, wobei für wenigstens eine Achse eine Drehbarkeit um 360-Grad (2π) bevorzugt ist.

Wellenfeldmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die das mehrdimensionale Wellenfeld erzeugende(n) Beleuchtungsquellen und/oder der/die Reflektoren und/oder der/die Strahlteiler und/oder das/die Objektiv(e) und damit das mehrdimensionale Wellenfeld um eine oder zwei orthogonal zueinander verlaufende Achsen drehbar ist/sind.

Wellenfeldmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß im Detektionssystem ein Scanner Spiegel vorgesehen und derart angeordnet ist, daß er zur Abbildung der lateralen Objektbereiche mit der gewünschten, vorzugsweise maximalen Fluoreszenzintensitat geeignet ist. Wellenfeldmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Beleuchtungssystem in wenigstens einer der drei Raumrichtungen eine reelle Beleuchtungsquelle für die Zwei- oder Mehrphotonenanregung und in einer oder beiden anderen Raumrichtung(en) eine reelle und/oder virtuelle Beleuchtungsquelle für die Zwei- oder Mehrphotonenanregung umfaßt, und daß die damit erzeugten stehenden Wellenfelder (WFi ,WF₂, , WF,) voneinander verschiedene Wellenlangen (λi, λ₂ λ, ) und Distanzen (di, d₂, , d,) zwischen den jeweiligen Wellenmaxima bzw Wel- lenminima von di = λi/ 2n cosθi bzw d₂ = λ₂/ 2n cosθ₂ bzw d, = λ 2n cosθ, aufweisen (mit n = Brechungsindex im Objektraum, θi, θ₂ , θ, = Kreuzungswinkel des Lichtwellenzugs der Wellenlange λi, λ ,λ, mit der optischen Achse), und wobei die Wellenfelder WFι,WF₂ W, derart zueinander ausgerichtet sind, daß sich mindestens ein Maximum zweier oder aller stehenden Wellen an derselben Stelle (nämlich dem Ort einer Mehrphototonenanregung) befindet

Wellenfeldmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß eine Anordnung aus Beleuchtungsquelle, Objektiv und einem elektrisch leitenden Spiegel, die zur Erzeugung eines eindimensionalen, elektrischen Wellenfeldes geeignet ist, relativ zur Objekttragerhalt erung vorgesehen ist, und zwar derart, daß die in dem Objekt befindlichen Meßstrukturen und/oder Kalibriertargets durch Anlegen des elektrischen Feldes — vor oder wahrend des mikroskopischen Meßvorgangs — ausrichtbar sind

Wellenfeldmikroskopieverfahren zur DNA-Sequenzierung unter Verwendung eines Wellenfeldmikroskops nach einem der Ansprüche 1 bis 9, gekennzeichnet durch folgende Verfahrensschritte es werden alle komplementären Subsequenzen der zu analysierenden DNA-Sequenz derart hergestellt, daß alle Subsequenzen am selben Nukleotid der zu analysierenden Sequenz beginnen, die zu analysierenden Bruchstucke werden alle am 3'-Ende mit einem Bezugsfluorochrommarker α und am 5'-Ende und/oder an definierten Zwischenstellen mit einem Fluorochrommarker a, g, c,oder t — je nachdem ob das Nukleotid die Base Adenin (Marker a), Guanin (Marker g), Cytosin (Marker c) oder Thymin (Marker t) tragt — markiert, wobei die Fluorochrommarker a, g, c, t und α verschiedene spektrale Signatur aufweisen, und jeweils ein oder mehrere Fluorochrommolekule enthalten, die markierten DNA-Subsequenzen werden derart auf Trager fixiert, daß sie als lineare Sequenz vorliegen, und in ein mehrdimensionales Wellenfeldmikroskop eingebracht, wobei die linearen DNA-Subsequenzen so zu den stehenden Wellenfronten orientiert werden, daß eine exakte Abstandsmessung (Genauigkeit <1«10^"10 m) zwischen α und a bzw g, c oder t nach Bestimmung der Intensitatsbaryzentren und Kalibrierung der Abbildungseingenschaften durchführbar ist, indem die Signale der Fluorochrommarker schrittweise, spektral getrennt voneinander registriert werden, und aus den Abstanden der fluoreszenten Markern und ihrer spektralen Signatur die DNA-Basensequenz des zu analysierenden DNA-Stuckes bestimmt wird

Kalibrierverfahren für die mehrdimensionale Wellenfeldmikroskopie nach einem der Ansprüche 1 bis 10, bei dem vor, wahrend oder nach der Praparation des betreffenden Objekts auf einem bzw in einem Objekthalter, insbesondere Objekttragerplattchen, Objekttragerfaser, Objekt- tragerkapillare oder Objekttragerflussigkeit, die zu untersuchenden bzw zu ortenden Objektstrukturen — ist gleich Meßstrukturen — mit Fluoreszenzfarbstoffen verschiedener oder gleicher spektraler Signatur markiert werden, wobei zumindest solche zu ortenden Meßstrukturen, deren Abstand voneinander geringer ist als die Halbwertsbreite des Hauptmaximums der effektiven Punktbildfünktion, mit Fluoreszenzfarbstoffen verschiedener spektraler Signatur markiert werden, mit den gleichen Fluoreszenzfarbstoffen Kalibriertargets definierter Große und raumlicher Anordnung markiert werden, die fluoreszierenden Kalibriertargets entweder zusammen mit den Objekten bzw Meßstrukturen oder separat auf bzw in dem/ einem Objekthalter präpariert werden,

Meßstrukturen und Kalibriertargets unter übereinstimmenden Bedingungen, gleichzeitig oder nacheinander mikroskopisch untersucht werden, und bei dem jeweils zwei definierte Kalibriertargets verschiedener spektraler Signatur unter Berücksichtigung des wellenlangenabhangigen Abbildungs- und Lokalisa- tionsverhaltens des jeweiligen optischen Systems vermessen werden, die dabei ermittelten Messwerte — gleich Ist-Werte — mit den vorbekannten tatsachlichen Distanzwerten — gleich Soll- Werten — verglichen werden, und aus der Differenz zwischen Ist-Werten und Soll- Werten ein Korrekturwert — ist gleich Kalibrierwert — bestimmt wird, mit dem der durch das optische System bedingte Versatz in der Detektion unterschiedlicher Emissionsloci, insbesondere der Meßstrukturen, korrigiert wird, dadurch gekennzeichnet, daß das biologische Objekt mit den fluorochrommarkierten Meßstrukturen und/oder fluorochrommarkierten Kalibriertarget(s) sequentiell oder simultan mit einzelnen (separaten), in zwei oder drei Raumrichtungen orthogonal zueinander verlaufenden, stehenden und zu einem zwei- oder dreidimensionalen Wellenfeld miteinander interferierenden Wellenfeldern beleuchtet wird, wobei die Fluorochrome zur Fluoreszenzemission angeregt werden, daß zur Detektion der Fluoreszenzintensitat eine Kamera und/oder eine oder mehrere zweidimensionale Anordnung(en) aus Einzeldetektoren mit jeweils kreis-, ring- oder schlitzförmiger Blende oder eine Anordnung von mehreren kreis-, ring- oder schlitzförmigen Blenden verwendet wird/werden, daß entweder das Objekt mit den Meßstrukturen und/oder Kalibriertarget(s) oder das ein- bzw zweidimensionale Wellenfeld oder beides wahrend des Meßvorgangs schrittweise um eine oder zwei orthogonal zueinander verlaufende Achsen gedreht wird, wobei die fluorochrommarkierten Meßstrukturen und/oder Kalibriertargets sequentiell oder simultan mit einem oder zwei einzelnen, orthogonal zueinander stehenden Wellenfeldern beleuchtet werden