WO1998057157A1 - Procede d'identification et/ou de dosage de substances biologiques, presentes dans un liquide conducteur, dispositif et capteur d'affinite utiles pour la mise en oeuvre de ce procede - Google Patents

Procede d'identification et/ou de dosage de substances biologiques, presentes dans un liquide conducteur, dispositif et capteur d'affinite utiles pour la mise en oeuvre de ce procede Download PDF

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WO1998057157A1
WO1998057157A1 PCT/FR1998/001213 FR9801213W WO9857157A1 WO 1998057157 A1 WO1998057157 A1 WO 1998057157A1 FR 9801213 W FR9801213 W FR 9801213W WO 9857157 A1 WO9857157 A1 WO 9857157A1
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vph
iph
zoq
max
pnc
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PCT/FR1998/001213
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Jean-René MARTIN
Eliane Souteyrand
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Ecole Centrale De Lyon
Centre National De La Recherche Scientifique (Cn
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6825—Nucleic acid detection involving sensors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/28—Electrolytic cell components
    • G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
    • G01N27/305—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells optically transparent or photoresponsive electrodes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings
    • G01N33/5438—Electrodes

Definitions

  • the field of the invention is that of the detection of products, preferably biological (“affins”), such as nucleic acids, or even biopolymers of protein nature.
  • the present invention relates, on the one hand, to a method of qualitative and / or quantitative analysis of SBC biological substances, preferably PN polynucleotides present in an LC conductive liquid (solution or gel) medium, via optoelectrochemical measurements and, on the other hand, the affinity devices and sensors intended for the implementation of this process.
  • the biological substances, more particularly but not limited to, targeted by the invention are the PN polynucleotides.
  • molecules composed of at least two nucleotides oligonucleotides and polynucleotides stricto sensu
  • the invention also relates to the compounds which may be involved in immunological coupling reactions [Ag antigen / Ac antibody], or even Enzyme / I / O substitute recognition.
  • PN C Complementary PolyNucleotide
  • This patent application describes a method for the qualitative and / or quantitative analysis of biological substances, in particular polynucleotides, antigens, antibodies, enzymes, substrates, in which a multilayer structure is used comprising a wafer. semiconductor covered with an insulator, the surface of which is functionalized by one of the species of the pairs of biological substances mentioned above, which are specifically identifiable.
  • the semiconductor containing the PN polynucleotides to be assayed or identified is polarized, the variations in the electrical signals induced by a charge effect phenomenon are collected directly and essentially linked to the pairings of the targeted biological substances with their complementary ligands. attached to the insulation, possibly via a sensitive membrane.
  • This measurement technique by electrical transduction does not require a reaction intermediary, any more than a specific marker or an enzymatic reaction. It gives satisfaction but nevertheless remains perfectible with regard to the simplicity of implementation and the access to a possibility of carrying out series of rapid measurements. different substrates, without using as many sensors as there are different types of substrates to analyze.
  • the charge effect phenomenon can be understood by measuring the electrochemical impedance of a semiconductor / insulator / sensitive membrane / conductive liquid structure.
  • the characterization of the field effect due to the variation of the surface charge induced by the pairing can be carried out using a polarized field effect transistor and on which the variations of the grid / source potential induced by the field effect.
  • electrochemical or optoelectrochemical transduction means • and on the other hand, electrochemical or optoelectrochemical transduction means.
  • US Pat. Nos. 4,591,550 and 5,500,188 disclose a method and a device for determining and dosing one or more substances contained in a gaseous or solid liquid medium and capable of modifying the characteristics of photoresponse of a photosensitive element, comprising means for recognizing said substances.
  • the latter involve a revelation mechanism by one or more tracer products capable of modifying the physicochemical characteristics of the analysis medium (pH, redox potential) and / or capable of being demonstrated by a colored or fluorescent radioactive marker.
  • the device used in this known method comprises one or more sensors each consisting of a semiconductor wafer (silicon covered with a layer of insulator SiO 2 or silicon nitride), the surface of the latter being optionally functionalized by means for recognizing the substances to be dosed and / or identified.
  • This device is also provided with means for biasing the semiconductor / insulator structure (eg circuit for applying a bias voltage, said circuit comprising on the one hand, a counter electrode and a reference electrode and being connected , on the other hand, to the semiconductor / insulator structure).
  • the the device further comprises means for irradiating the photosensitive element or elements as well as means for measuring the resulting electrical signals, for detection and / or identification of the substances considered.
  • each photosensitive element comprising the semiconductor / insulator structure is necessarily associated with lighting means, polarization means and measurement means. It follows an extreme complexity of the device in its variants aiming at the multidetection of different substances, both in terms of the structure as such and in terms of handling and processing of the resulting measurements and signals. .
  • the insulating layer of photosensitive elements according to this prior art is functionalized in the case where the substances to be analyzed are affine systems PN / PNc, E / S, Ag / Ac.
  • the recognition ligands functionalizing the insulating layer are systematically labeled. This is illustrated in particular for DNA or RNA analysis, in which the complementary recognition ligands are labeled with biotin (cf.
  • the tracer means are e.g. variations in pH or in Redox potential. It must be considered that these means are not the most reliable because there are many factors in the analysis medium, which is for example a conductive liquid, capable of interfering with these parameters, without this being linked to the dosage and identification of the targeted substances.
  • the signal measured at the exit of their sensor can be photopotential, photoconductance, photocapacitance or photoinductance, or combinations thereof (column 3, lines 36 and 37-US-A-5,500,188), it is specified lines 41 to 43 column 3 of this same patent that the measured signal is the result of a change of a direct current of an alternating current or of the effect from direct current to alternating current.
  • This preference with regard to the taking into account of the photocurrent as a resulting signal also emerges clearly and exclusively from the examples of these US patents, in which either the current necessary to maintain a constant potential between the element is taken into account.
  • the inventors have set themselves, in particular, as an essential objective to provide a method for identifying and assaying biological substances, preferably polynucleotides, this method having to integrate in particular the following specifications :
  • the inventors have had the merit of highlighting, in a completely surprising and unexpected manner, that the specific pairings between preferably biological molecules and more preferably still between complementary polynucleotide strands , induce a modification of the surface electric charge in a multilayer structure, semi-conductor Sc / insulator Is surface-functionalized. This modification occurs more precisely at the interface with a conductive liquid medium LC, said charging effect constituting the basic identification and metering signal, perceived directly or indirectly by optoelectrochemical transduction means.
  • Such an optoelectrochemical transduction measurement mode meets the desired specifications of simplicity, sensitivity, specificity, reliability and reproducibility.
  • the technique according to the invention also has the advantage of being reversible. Indeed, one can easily carry out the mismatching of the complementary species which reacted specifically at the level of the sensitive membrane of the semiconductor structure. The sensitive membrane can thus be regenerated after each use and this multiple times.
  • the SBCs are PN polynucleotides and the SBRs are PNc polynucleotides.
  • the present invention makes it possible to envisage, in particular, the recognition of nucleotide sequences, for example with a view to the detection of genetic diseases, the detection and characterization of viruses, bacteria and parasites or for the establishment of genetic maps, the study of gene expression and / or mutation.
  • nucleotide hybridization it is possible to exploit other specific apartments such as, for example, the biochemical mechanisms of immunological coupling, or even enzyme / substrate complexation, provided that the pairing causes a variation of electrical charges on the surface. of Is.
  • the principle of analysis which governs the process according to the invention is exclusively optoelectric or optoelectrochemical. This means that we are dealing with an affine biochemical recognition, that is to say one which does not involve chemical or enzymatic reactions and which takes place without the production or consumption of intermediate chemical species.
  • the revelation of this affine biochemical recognition is not done through an indirect detection using physicochemical means of revelation: colored tracers, fluorescent, radioactive, redox potentials, pH.
  • biochemical recognition takes place essentially, or even exclusively, by an optoelectronic transduction underlying the polarization of the Sc / Is structure relative to LC, as well as the periodic illumination of said structure.
  • the expression “electrically charged” means that during the affine interaction of PN C with PN, the electrical surface charge is modified.
  • the first step - a - of the method according to the invention consists in exclusively using So probes, in particular unmarked PNc, that is to say not carrying physicochemical revealing means (fluorescence, colorimetry, radioactivity , redox potential, pH).
  • the potential of flat bands Vbp is the potential that must be applied to the semiconductor with respect to the LC (electrolyte) medium in contact with the dielectric Is to obtain a zero curvature of the bands of the Se.
  • the modification of the surface charge corresponds to a variation of Vbp, which is itself a signature of the PN / PNc hybridization.
  • step b of the method according to the invention it is appropriate, in accordance with step b of the method according to the invention, to create an initial curvature of the Se, by adjusting firmness levels of Se and of the LC medium, preferably by imposing a DC bias voltage Vp on the structure Sc Is - PNc, with respect to the LC medium.
  • the adjustment of the Fermi level of the semiconductor Se substantially to its intrinsic level at the surface takes place by imposing a bias voltage Vp to Se with respect to at the LC, according to a scan between a negative voltage and a positive limit voltage, chosen so that the Fermi level of the Se passes through its intrinsic level at the surface, Vp thus evolving advantageously in a voltage range corresponding to the desertion regime and weak inversion of Se.
  • This continuous polarization is associated, on the one hand with the periodic illumination according to step c and on the other hand, with a measurement of the variations of Vbp according to step d.
  • This measurement is carried out as follows:> collection of the photopotential (Vph) at the terminals of the Se (between Se and LC) and / or of the photocurrent (Iph) calculation of the optoelectrochemical impedances in the Zop phase and / or in quadrature Zoq for each value of Vp ,
  • the Zop and Zoq optoelectrochemical impedances provide access to the energy properties of the Sc / Is-So structure as well as of its interfacial zone with the LC, and in particular to the various charge effects which may occur at the interfaces.
  • These optoelectrochemical impedances Zop and Zoq are linked to the photopotential Vph and to the current Ihv, generated following the periodic light excitation of Se, moreover subjected to a continuous polarization. Indeed, the modulated illumination - c - of Se by photons of energy greater than or equal to the width of its forbidden band, generates electron-hole pairs, charge carriers.
  • Vph and / or Iph and / or the impedimetric components Zop and / or Zoq are transfer functions connecting Vph to Ihv induced by the modulated illumination. More precisely, the optoelectrochemical impedances Zop and Zoq of the region of the space charge zone of Se are directly proportional to the effective values of the components in phase and in quadrature of the Vph measured. The proportionality coefficient depends on the intensity or power, of the illumination.
  • the photopotential is therefore the image of the opto-electrochemical impedance of the structure.
  • the illumination is not only low but also substantially sinusoidal.
  • - weak illumination is an illumination which leads to a second order perturbation of the structure with respect to the thermodynamic equilibrium in darkness. It is preferably less than or equal to 10 ⁇ W / cm 2 and preferably 1 ⁇ W / cm 2 .
  • the strong illumination is an illumination which strongly disturbs the thermodynamic balance of the structure in the dark. It is preferably greater than 10 ⁇ W / cm 2 .
  • the imposed potential Vpi is close to the potential corresponding to the inflection point of the sigmoidal curve of the photopotential Vph, the photocurrent Iph or the quadrature optoelectrochemical impedance Zoq as a function of the polarization potential Vp.
  • the term "vicinity" of the Fermi level relative to the intrinsic surface level of the Se is understood to mean the position close to the middle of the forbidden band of the semiconductor on its surface in contact with the insulator Is, in a range such that the semiconductor is on the surface in a situation of desertion or weak inversion, so that the photopotential Vph, and / or the photocurrent Iph, and / or the optoelectrochemical impedance in quadrature Zoq varies a lot with the polarization potential Vp.
  • Vpi corresponding approximately to the potential of the inflection point must be understood, according to the invention, by an uncertainty range of ⁇ 0.5 Volt.
  • the reference is in practice given by the maximum value that Vph, Iph or Zoq reaches in each of the characteristic sigmoidal curves.
  • Vph max, Iph max and Zoq max correspond in other words to the maximum value of photopotential, photocurrent and optoelectrochemical impedance in quadrature, respectively, when the semiconductor is in a strong inversion regime.
  • Variant (i) can be used in the case of a moderate variation in Vbp making it possible to establish a simple relationship (linear for example) between ⁇ Vph and ⁇ Vbp. In practice, it is preferable to use variant (ii) of step d according to the second embodiment of the method according to the invention.
  • Vph max / 2 is kept constant by adjusting the polarization Vp of the structure, preferably by electronic regulation.
  • the regulation ⁇ Vp corresponds to the ⁇ Vbp that one seeks to measure.
  • the electronic regulation that can be implemented in the context of variant (ii) taking into account ⁇ Vp, is carried out as follows:
  • this signal is possibly rectified so as to have a continuous signal v'ph,
  • Vph designates both the primary photopotential v ph measured between Se and LC as v ' ph corresponding to vph rectified and possibly amplified.
  • step cd 'illumination which is common to the two modes of implementation mentioned above, it should be specified that said illumination can be carried out opposite any zone of the external faces of the structure
  • the periodic illumination of the structure Sc / Is is therefore carried out either opposite the external face or faces of the Se, or opposite the external face or faces of the insulator Is, or opposite all the external faces of the structure.
  • the wavelength of the illumination ⁇ of such is chosen.
  • E band gap energy preferably between 100 and 3000 nm, E being the band gap energy of Se expressed in electronvolts.
  • This threshold ⁇ 0 is a function of the nature of the semiconductor. According to a third embodiment of the method according to the invention, it is possible to radically eliminate non-specific responses, by implementing a differential measurement, according to which, at least one other structure Sc is involved in the affinity sensor. / Is of reference, in which Is is not functionalized by So, and by following the difference between the Vbp measured by the 2 sensors, as well as the variation of this difference.
  • the measurement Sc / Is-So structure and the reference Sc / Is structure are brought into contact with the same LC medium. They are polarized in the same way, preferably by means of the same counter-electrode, a reference electrode not being necessary. Finally, in accordance with step c, they are subjected to the same illumination of modulated light. Furthermore, the means of interpretation of the collected signals used in step d are chosen so as to allow the difference between the flat band potentials VbpO and Vbpl specific to the two structures Sc / Is and Sc / Ts to be monitored. - So, respectively.
  • This arrangement makes it possible to obtain a very precise and continuous measurement of the variation of the Vbpl of the functionalized Sc / Is-So structure, by eliminating the parasitic phenomena which may appear and which are linked to parameters other than the pairing. and, in particular, that PN / PNc hybridization.
  • a fourth embodiment of the method according to the invention is characterized in that, in a prior step ao, different areas of the surface of an insulating layer Is of the same structure Sc / Is are functionalized, by several So probes different by the nature of the PNc which compose them, and we then carry out using this structure the LC analysis containing one or different PN substrates: - by successive illuminations of the areas of the surface of the Is, said zones each being functionalized by the same So (identical PNc), the nature of the So varying from one zone to another, - and by collecting and interpreting ⁇ Vbp.
  • This fourth mode of implementation corresponds to the multidetection of substrates, in particular of PN, of different natures, in the field of genetics.
  • the multidetection according to the invention makes it possible to access methods of simple and rapid detection of viral diseases and genetic diseases. It is also possible to carry out tissue compatibility checks, as well as maps of heterogeneous populations of polynucleotides, for example genomes. It is also a tool for studying gene mutation, gene expression, or genomic sequencing.
  • the advantage of multidetection according to this fourth mode of implementation lies in the methodological and structural simplicity of the corresponding method and device.
  • step of direct or indirect measurement of ⁇ Vbp can be carried out in accordance with the procedure described for the first mode of implementation in one or other of these variants with low or high illumination, as well as according to the procedure specific to the second mode of implementation, whatever the variant (i ) or (ii) retained.
  • the invention is not limited to these four modes of implementation, but it also encompasses all possible measurement methods and the like, based on the recognition of the variation in the potential of flat bands ( ⁇ Vbp). of an Sc / Is-So structure having a sensitive zone made of So probes based on biological substances of SBR recognition (eg PNc) capable of reacting specifically with electrically charged biological substances SBC (eg PN) in an LC medium .
  • SBR recognition eg PNc
  • SBC electrically charged biological substances
  • the substrates to be analyzed are PNs, preferably chosen from the following list: nucleotides, oligonucleotides, polynucleotides, nucleic acids (DNA or RNA) as well as the analogs and mixtures of said substrates.
  • the So probes used in the method are specific recognition means, in particular unmarked PNc, that is to say not carrying means for revealing the PN / pairing.
  • PNc fluorescence, colorimetry, radioactivity
  • RNA DNA, gene, plasmid or any other genetic material
  • antigen-antibody hapten-antibody
  • cDNA / DNA cRNA / RNA
  • poly dT-mRNA eukaryote
  • lectin glycoconjugate marker for cells (or microorganisms) - cells (or microorganism)
  • HcG- tissue receptor eukaryote
  • T3 - TGB thyroxin binding protein
  • the method according to the invention firstly involves the immobilization of at least one type of these reactive PNc biological species to constitute the So probes. This can be done directly on the insulating layer or using an intermediate material (spacing compounds for example), attached to the Is insulation and capable of receiving by physical connection (eg adsorption-absorption) and / or chemical (eg covalent bond), the specific biological ligands PNc. According to the invention, it is perfectly conceivable to provide one of the heterospecific So probes, formed from PNc biological species of different natures, capable of reacting with their complement.
  • the LC conductive liquid medium used can be any buffer solution compatible with the biological substances considered PN.
  • This LC liquid medium advantageously has a conductivity equivalent to that of an aqueous NaCl solution having a concentration ranging from 0.005M to 3M and preferably of the order of 0.1 M.
  • the pH of the liquid medium can be between 0 and 12, preferably between 6 and 8 so as to favor the apartments by bioaffinity.
  • the stringency of the liquid medium can also be adjusted to promote hybridization.
  • Non-specific interactions by ion exchange or by hydrophobic interactions, can be eliminated in whole or in part using buffer of appropriate ionic strength, (e.g. Tris-HCl / Tris-base).
  • buffer of appropriate ionic strength e.g. Tris-HCl / Tris-base.
  • the measurement temperature can be between 0 and 50 ° C. It is more precisely controlled so as to favor the biochemical reactions concerned.
  • the present invention also relates to a device for implementing the method as described above, said device being characterized in that it comprises: - at least one affinity sensor formed by at least one structure
  • the So probe (s) comprise SBR ligands capable of specifically hybridizing with the biological substances SBC to be analyzed, contained in the conductive liquid medium LC, by causing a charge effect phenomenon, at l origin of ⁇ V bp of Se,
  • this device therefore includes
  • the measurements of the photopotential Vph and / or of the optoelectrochemical impedances in phase Zop and / or in quadrature Zoq are carried out in an open circuit configuration, that is to say that the measurement circuit must comprise a very high charge impedance.
  • the Iph photocurrent measurements are advantageously carried out in a closed circuit configuration (short circuit).
  • this device benefits from a low cost price. It can be easily produced on an industrial scale and offers high reliability and good reproducibility of measurement.
  • the measuring electrode (that is to say the multilayer structure Sc / Is-So) of the affinity sensor of the device, is formed by at least one Se plate, preferably in silicon, covered on one of its faces with at least one layer Is of insulator, preferably silica, on the surface of which are fixed at least one sensitive So probe comprising at least one biospecific pairing ligand, preferably PNc polynucleotides for specific recognition by hybridization, this sensor also comprising at least one ohmic contact allowing the connection of the Sc / Is-So structure, in particular, with the polarization means and / or the Vph measurement means.
  • the device further comprises this Sc / Is-So structure, at least one auxiliary electrode, possibly provided on the Is layer of the Sc / Is-So structure.
  • the layer of dielectric material blocking Is is for example, a layer of oxide and / or nitride or any other mineral or organic material of small thickness, preventing or limiting faradaic phenomena.
  • This structure is associated with a conductive liquid medium containing the SBC substances to be measured to detect or identify LC.
  • the silicon chosen as semiconductor is of the n or p type, moderately doped, preferably up to 10 15 to 10 19 c ⁇ r 3 , preferably 10 16 cm ′ 3 .
  • the thickness of the silicon wafer is, for example, between 0.01 and 2 mm.
  • the insulating layer Is advantageously consists of silica or silicon nitride. Its function is to annihilate possible faradaic processes which could disturb the measurements, by means of parasitic electrical signals. This layer Is also makes it possible to avoid the difficulties associated with possible corrosion of the semiconductor material by the conductive medium LC in contact.
  • the thickness of this layer Is is between 1 and 500 nanometers, preferably between 1 and 50, and more preferably still is of the order of 10 nanometers.
  • the dielectric layer Is supports the So PNc probes, which constitute what could be called bio-receptive membrane in contact with the LC medium.
  • FIG. 1 is a schematic representation of the device for qualitative and / or quantitative analysis of biological substances, preferably PN polynucleotides present in a conductive liquid medium LC, according to the invention.
  • FIGS. 2 and 3 are views in right cross section, of alternative embodiments of the affinity sensor shown in Figure 1.
  • FIG. 4 shows the diagram of the electrical circuit for measuring the optoelectrochemical impedances Zop, Zoq of the affinity sensor according to the invention, in accordance with the first embodiment of the method, in its low-light variant.
  • FIG. 5 shows the block diagram of a particular embodiment of the measuring device according to the invention corresponding to variant ii of the second embodiment of the method according to the invention.
  • - Figure 6 is a schematic representation in right cross section of an embodiment of the device according to the invention, namely the differential sensor corresponding to the third embodiment of the method.
  • - Figure 9 corresponds to the impedance curves obtained at each stage of development of an active functionalized structure for the recognition of single strands of DNA.
  • Figure 1 shows the device according to the invention which comprises an affinity sensor 1 formed by a structure 7 Sc / Is-So in contact, by its face supporting the So, with a conductive liquid medium LC, designated by the reference 2
  • This device also includes polarization means 3, lighting means 4, means 5 for measuring Vph, and a unit 6 for calculation and control comprising means for transforming the signals collected into a variation of Vbp and means calculation and interpretation of ⁇ Vbp in terms of identification and / or dosage of electrically charged biological substances to be analyzed, also designated SBC.
  • the affinity sensor 1 is constituted by a structure 7 Sc / Is-So, itself formed by a silicon wafer 7.1, a layer of insulator Is made of silica 7.2 and So probes designated by the reference 7.3, fixed on the surface of Is 7.2 insulation to functionalize it. According to a variant, it is possible to deposit optionally on the surface, a functional layer allowing better attachment of the So probes.
  • the affinity sensor 1 is provided on its external face opposite to that carrying the So 7.3 probes, with an ohmic contact 8 connected to the polarization means 3.
  • the contact ohmic 8 is isolated from the LC 2 medium by means of a peripheral seal 8 j . The latter cooperates by sealed contact with an insulating support 8 2 on which the sensor 1 rests.
  • these probes are constituted by Biological Substances of Specific Recognition (SBR) of SBCs.
  • the SBCs and the SBRs are PN and PNc polynucleotides.
  • a reference electrode 9 and a counter electrode 10 also bathe within the medium 2 conductor LC with the affinity sensor 1. These two electrodes 9 and 10 are connected to the polarization means 3.
  • a high load resistance is provided in the potentiostatic measurement circuit.
  • this high resistance R L is inserted in the connection connecting the counter-electrode to the biasing means 3.
  • the resistance R L is preferably greater than 100 k ⁇ , preferably 50 M ⁇ and more preferably still is of the order 100 M ⁇ .
  • Figures 2 and 3 each show an alternative embodiment of the affinity sensor 1 in which the structure 7 constitutes the bottom of a measurement cell comprising walls l j and a seal 1 2 ensuring the seal between the bottom 7 and said walls l t .
  • the variant of Figure 2 differs from that of Figure 3 in that the sensitive area comprising the So 7 probes 3 is delimited in the first whereas it is not in the second (the entire surface of FIS comprises So 7 probes 3 ).
  • the biasing means 3 of the device according to the invention are preferably constituted by an adapted potentiostat, for example having a strong time constant (greater than 1 s). It allows the polarization of the structure while not disturbing the photopotential Vph.
  • the lighting means 4 comprise at least one light source, in this case one, arranged
  • the light beam passes through an acousto-optical modulator (not shown in Fig.l) the controller of which is controlled by a low-frequency generator, designated by the reference 4.1 in Fig.l.
  • a filter makes it possible to adjust the light power to values lower, equal or greater, at the threshold determining the ranges of low illumination and of high illumination.
  • the light power is of the order of or less than or equal to 1 ⁇ W / cm 2 for the conditions of poor lighting and greater than 10 ⁇ W / cm 2 for the strong lighting.
  • the means 5 for measuring Vph are, in practice, constituted, for example, by an impedance adapter having an input impedance between 10 8 ⁇ and 10 12 ⁇ , more preferably of the order of 10 10 ⁇ .
  • the measuring means 5 also include a synchronous detection member controlled by the low frequency generator 4.1. which, as we have seen above, also determines the modulation of the illumination. This synchronous detection device gives the phase and quadrature components of Vph.
  • the microcomputer 6 comprises the means for transforming the signals collected into a variation of Vbp as well as the means of calculation and interpretation ⁇ Vbp, in terms of identification and / or determination of the biological substances in the case of PN polynucleotides.
  • the optoelectrochemical impedances Zop and Zoq are the transfer functions connecting Vph to the intensity of the illumination.
  • the effect of the illumination can be represented by a current generator in parallel with the space charge region whose impedance, denoted Zsc, includes the parameters linked to the surface.
  • Zd is the impedance of the dielectric. It can be represented by pure capacitance.
  • R el and R e2 are the impedances of the electrolytic solution, respectively, between the working electrode and the reference electrode, and between the reference electrode and the counter electrode.
  • Zp is the internal resistance of the potentiostat.
  • R L is the load resistance introduced into the potentiostatic measurement circuit. Its role is to confer on the measurement circuit the properties of an almost open circuit with respect to the photopotential, while allowing the polarization of the structure; its value must therefore be high enough compared to the other impedances involved in the measurement.
  • Vph is the measured photopotential and W l is the photopotential which appears across the semiconductor. According to the electrical diagram, the total current Ihv generated by the illumination has two components: I l which crosses the semiconductor and I 2 which circulates in the measurement circuit. We can then write the following relationships:
  • phase and quadrature optoelectrochemical impedances of the region of the space charge area of the semiconductor are directly proportional to the components of the photopotential measured: the proportionality coefficient depends on the intensity of the illumination.
  • the measurement of optoelectrochemical impedances can therefore be used for the detection of the apartment process, in particular of PN / PNc hybridization, which process is the quantitative and qualitative reflection of the SBCs (PN) to be analyzed.
  • Examples 1 and 2 below illustrate the low-light variant of the first embodiment of the method according to the invention.
  • the highly illuminating variant of this first mode consists in accessing the variations of the flat band potential Vbp of the Se, consecutive to the phenomenon of biological recognition, via the effective value of Vph (or according to a variant of Iph).
  • the modulated illumination - preferably at low frequency - which can be used is not necessarily sinusoidal, but can simply be periodic.
  • the surface charge varies with the presence of the target species PN in the LC medium designated by the reference 2
  • this results in a ⁇ Vbp which results in a sliding of the curve of the effective value of Vph, parallel to the axis of the polarization potentials of the structure.
  • Example 3 below illustrates this highly illuminating variant of the first embodiment of the method of the invention, using the appropriate device.
  • the structure Sc / Is-So is polarized, so that the level of firmness of the Se is in the vicinity of the intrinsic position at the surface of the Se.
  • the potential Vp then imposed is close to the potential corresponding to the inflection point of the sigmoidal curve of the effective value of Vph, Iph or Zoq.
  • Vph Vphi by playing on the initial continuous pola ⁇ sation, which will be a set value Vpi.
  • the effective value is then kept constant Vphi, Iphi or Zoqi, by adjusting Vp with respect to the setpoint Vpi of the structure, by means of electronic regulation. This polarization adjustment is directly the image of ⁇ Vbp.
  • the effective values of Vph, Iph and Zoq are
  • Vph. max Iph. max Zoq. max ⁇ wererespectively -, -, - i . They each represent substantially the ordinate of the point of inflection of the corresponding curve.
  • Example 4 illustrates the second mode of implementation without much light in variant (ii).
  • FIG. 5 shows the block diagram of an example of this particular embodiment of the device according to the invention.
  • Vph is chosen as the tracer signal.
  • the photopotential vph is detected at the terminals of the affinity sensor 1 (measuring cell) by means of an adapter impedance 14 having a high input impedance so as not to disturb the structure.
  • the signal is then amplified by means of a low frequency alternating amplifier 15, transformed into a continuous signal v'ph thanks to a synchronous detection 5 and to an RC circuit 16 which makes it possible to reduce the noise and to stabilize the regulation.
  • the continuous signal v'ph is amplified by means of a continuous amplifier 17, with gain G 17 .
  • Gl is the gain of all amplifiers 15 and 17 and synchronous detection 5.
  • the amplified continuous signal v'ph is then compared to a reference signal U using a differential amplifier 18.
  • U is adjusted to the value of Vpi which gives the photopotential a value half of the photopotential corresponding to the strong inversion (Vph.max / 2).
  • the difference in residual value ⁇ (v'ph-U) of these two signals is amplified by the differential amplifier 18 of gain G2 and the output voltage ⁇ (v'ph- U) is applied to structure 1 at the same time that the continuous polarization Vp imposed by a voltage generator 19 coupled to a summator 20.
  • a low frequency signal generator 4.1 A low frequency signal generator 4.1.
  • BF allows, after amplification using an amplifier 2.1., To control the diode 4 whose beam excites the structure 1 and also to reference the synchronous detection 5.
  • the advantage of such an arrangement is that the electronically imposed potential is directly and linearly the image of the variations of the potential of flat bands Vbp, caused by the interactions at the surface of the dielectric. It is therefore independent of the properties of the structure and makes it possible to obtain good sensitivity and excellent reproducibility.
  • the cell (sensor) is similar to that described above with reference to FIG. 1.
  • the measurement of the photopotential being carried out by means of a measurement circuit having a high input impedance, it is possible to admit an ohmic contact of poor quality.
  • an electrode with a constant potential relative to the solution is required.
  • a reference pseudo-electrode constituted by a noble metal such as platinum, for example.
  • the electrode can be independent or be produced by deposition, in the form of a grid or an external ring, on the surface of the dielectric so as to satisfy the miniaturization of the sensor.
  • the illumination of the structure can be obtained by means of a laser diode or a light-emitting diode emitting in the wavelength range of visible or very near infrared, between 400 and 1000 nm with a light power. of the order of 0.1 ⁇ W at 100 m / cm 2 .
  • the impedance adapter 14 is replaced by a current / voltage converter.
  • Fig. 1 and 5 described above are arbitrarily called GENOPTEL.
  • said device is characterized in that the affinity sensor comprises at least one Sc / Is-So structure and at minus a reference structure Sc / Is not functionalized by So, so as to be able to carry out a differential measurement.
  • This embodiment which will be called DIGENOPT is represented in FIG. 6. It corresponds to the case where there is an affinity sensor 1 or measurement cell advantageously comprising two almost identical Sc / Is structures 31 and 32, one being functionalized by So, the other not. These two structures (or electrodes) are brought into contact with the same medium 2 LC and are polarized by means of the same counter-electrode 33. A reference electrode is not necessary.
  • the two Sc / Is structures 31 and 32 are each mounted at the tip of an element 36 which can be screwed into the body 35 of the sensor 1.
  • the body 35 comprises a cavity closed laterally by the electrodes 31 and 32, containing the medium LC - 2 -. Seals 37 are provided to seal between the different walls.
  • the top wall receives the lighting means 4 and 34.
  • the bottom is crossed by the counter-electrode 33.
  • the affinity sensor comprises at least one structure Sc / Is-So, in which the So probes are of different natures, the So probes of the same kind being grouped in the same zone of the Is layer, each zone being circumscribed in relation to the others so as to be able to be illuminated separately partially or entirely by the lighting means.
  • This embodiment arbitrarily designated by the expression GENMAP was made possible due to the fact that the principle of the measurement according to the invention is such that the photopotential and / or the photocurrent depends on the light flux but is practically independent to make the surface lit.
  • Multi-zone reading by the lighting means provides access to the local flat band potential of each specifically functionalized zone: - either by measuring the optoelectrochemical impedance according to the first mode of implementation - low or high lighting variant,
  • the acquisition of Vbp can be carried out according to any of the modes of implementing the method according to the invention.
  • FIG. 7 is a block diagram of the multisensor structure Sc / Is-So ! at So n .
  • the same references were used as in FIG. 1 to designate the lighting means 4, the probes S ⁇ j to So n identified by the reference 7.3, the layer Is 7.2. and the semiconductor wafer referenced by
  • This type of device opens the way to many and varied applications in the field of genetics: detection of viral diseases, and genetic diseases, verification of cell compatibility, creation of genome maps, expression or mutation of genes, etc.
  • the invention also relates to the affinity sensors, that is to say the measurement Sc / Is-So and reference Sc / Is structures, as described above.
  • the device used in this example corresponds to that shown in Fig.l.
  • the Sc / Is structure includes:
  • a semiconductor having a thickness of 0.03 mm is p-doped silicon at a height of approximately 10 15 cm- 3 , with an Au / Cr layer on the rear side ensuring ohmic contact.
  • an insulator Is is silica with a thickness of 10 nm obtained by thermal oxidation.
  • LIQUID LC MEDIUM TRIS lM BUFFER SOLUTION. This buffer solution of pH 7.1 is composed of 10 mM TrisHCl
  • the light power is 0.6 ⁇ W / cm 2 1.4.
  • Figure 8 attached shows the optoelectrochemical impedance curves Zop and Zoq as a function of Vp obtained for the structure described above.
  • the quadrature impedance is due to the capacity of the space charge area of the semiconductor, which is directly linked to the doping of the semiconductor.
  • the quadrature impedance is very low because the semiconductor is in an accumulation situation and the capacity of the space charge zone is very high.
  • the semiconductor passes successively from the inversion situation, to desertion, then to accumulation, when the polarization increases.
  • the impedance in phase presents a peak in the intermediate domain. This peak is due to the presence of interface states located between the semiconductor and the oxide layer.
  • the optoelectrochemical impedances give the energy information on the semiconductor and on the states of semiconductor surface but does not provide information on the dielectric layer. However, they make it possible to determine the potential of flat strips of the semiconductor.
  • the value of the flat strip potential is correlated to the position of the quadrature impedance curve with respect to the potential axis. This is the parameter that characterizes the surface load of the structure.
  • the DEVICE including the Sc / Is structure and the conductive medium
  • LC are the same as in Example 1, with the difference that the Sc / Is structure is functionalized by So probes constituted by PNc nucleotides complementary to PN target species contained in LC.
  • a polymeric layer of APTS (AminoPropylTriethoxySilane) is deposited.
  • the strands of oligonucleotides (dT) are grafted onto the surface by bromination: this method makes it possible to fix the nucleotide to the APTS without using the sites involved in the hybridization.
  • hybridization is obtained after having left the structure in contact with a solution containing complementary strands poly (dA) to those fixed on the surface.
  • Figure 9 corresponds to the impedance curves obtained at each stage of the development of a functionalized active structure for the recognition of single strands of DNA.
  • the curves in FIG. 9 show the displacement linked to the hybridization of the complementary PNc / PN DNA strands.
  • EXAMPLE 3 ANALYSIS OF POLYNUCLEOTIDES (PN) USING THE DEVICE ACCORDING TO THE INVENTION (FLG 1) - 1st METHOD OF IMPLEMENTING THE PROCEDURE - HIGHLY ILLUMINATED VARIANT
  • the DEVICE The device used is that described in Figure 5.
  • the measurement cell and the affinity sensor are those shown in Figure 2.
  • the modulated light is supplied by means of a light-emitting diode; the light power used is 10 mW / cm 2 .
  • the LC conductive liquid is an aqueous solution of 10 M tris (hydromethyl) aminomethane hydrochloride (Sigma) and 50 mM NaCl; the whole solution is at pH 7.1. The measurement is made at room temperature, i.e. 22 ° C, in the dark.
  • the Sc / Is-So structure is as described in the previous examples.
  • the probes are PNc, and more precisely oligos dT of 20 bases, deposited on the zone as represented in 7.3 of FIG. 2 from a solution composed of 20 ⁇ l of aqueous solution of n-bromosuccinimide in a concentration of 0.01 M added to 1 ml of 1M aqueous NaHCO 3 solution containing oligos (dT) 20 in a concentration of 1 mg / ml.
  • the structure is left overnight in contact with the Pnc solution, then thoroughly rinsed with the LC liquid, then mounted on the measuring cell. This cell is then filled with LC and the measurement chain initialized.
  • Figure 11 gives the response in ⁇ Vp over time of the functionalized structure Sc / Is-So where the probes are oligo dT.
  • Curve A corresponds to the response obtained when the sensor is in contact with an LC solution to which targets (polynucleotides dC in concentration of 1 ⁇ g / ml) have been added which are not complementary to the probes fixed on the sensor.
  • Curve B corresponds to the response obtained when the sensor is in contact with an LC solution to which targets (polynucleotides dA in concentration of 1 ⁇ g / ml) complementary to the probes fixed on the sensor have been added.

Abstract

L'invention a pour but de fournir un procédé perfectionné d'identification et/ou de dosage de polynucléotides PN présents dans un milieu liquide conducteur. Ce procédé consiste à faire intervenir un capteur d'affinité comprenant une structure multicouches semi-conducteur/isolant/sondes = polynucléotides PNc complémentaires aux PN du milieu. Selon ce procédé, on sélectionne des sondes PNc non marquées, on polarise le semi-conducteur, on l'éclaire périodiquement, on mesure les variations du potentiel de bande plate induites par un phénomène d'effet de charge directement et essentiellement lié aux appariements spécifiques entre PN et PNc, et enfin on interprète les signaux recueillis en terme d'identification et/ou de dosage des PN. L'invention concerne également le dispositif et le capteur utile pour la mise en oeuvre de ce procédé. Application: analyse en biologie moléculaire, e.g. diagnostic de maladies virales ou génétiques.

Description

PROCEDE D'IDENTIFICATION ET/OU DE DOSAGE DE SUBSTANCES BIOLOGIQUES, PRESENTES DANS UN LIQUIDE CONDUCTEUR, DISPOSITIF ET CAPTEUR D'AFFINITE UTILES POUR LA MISE EN OEUVRE DE CE PROCEDE
DOMAINE TECHNIQUE :
Le domaine de l'invention est celui de la détection de produits, de préférence biologiques («affins »), tels que les acides nucléiques, ou bien encore les biopolymères de nature protéïque.
Plus précisément, la présente invention concerne, d'une part, un procédé d'analyse qualitative et/ou quantitative de substances biologiques SBC, de préférence des polynucleotides PN présentes dans un milieu liquide (solution ou gel) conducteur LC, par l'intermédiaire de mesures optoélectrochimiques et, d'autre part, les dispositifs et les capteurs d'affinité destinés à la mise en oeuvre de ce procédé.
Les substances biologiques, plus particulièrement mais non limitativement, visées par l'invention sont les polynucleotides PN. Sous ce terme général, on englobe conformément à l'invention, les molécules composées d'au moins deux nucléotides (oligonucléotides et polynucleotides stricto sensu), dont notamment les acides nucléiques ARN ou ADN et toute structure génétique en comprenant. L'invention concerne également les composés susceptibles d'être impliqués dans des réactions de couplage immunologique [Antigène Ag/anticorps Ac], voire de reconnaissance Enzyme/Substitut E/S.
ART ANTERIEUR :
Pour détecter, identifier ou doser ces molécules, on a exploité leurs propriétés de bioaffinité, à savoir leur aptitude singulière à s'apparier spécifiquement avec leurs complémentaires, selon des mécanismes d'hybridation génétique PN/PNc, (PNC = PolyNucléotide complémentaire) de couplage immunologique Ag/Ac ou de reconnaissance E/S.
C'est ainsi que, dans le domaine immunologique, on connaît des méthodes qui sont fondées sur le couplage antigène/anticorps et qui font intervenir une étape de révélation des couples formés à l'aide de marqueurs radioactifs, enzymatiques, fluorescents, colorés ou analogues. De telles méthodes sont longues et complexes à mettre en oeuvre. De plus, les réactifs utilisés sont peu disponibles et onéreux. Enfin, ces méthodes ne permettent pas des mesures en continu et encore moins in vivo. Ces techniques ont été transposées avec leurs défauts au domaine de la détection de séquences nucléiques, qui doivent ainsi nécessairement être marquées pour pouvoir être dosées et/ou identifiées.
Dans un autre registre, il a été proposé de s'attacher à la détection des signaux physiques de toute nature, susceptibles d'être induits par les réactions biochimiques d'hybridation nucléotidique ou couplage immunologique. Pour ce faire, il convient, tout d'abord, d'isoler un type de signaux particuliers et caractéristiques, puis d'adopter un transducteur apte à convertir lesdits signaux en une grandeur physique mesurable. Ces signaux peuvent être, par exemple, la production d'une espèce chimique, une variation d'épaisseur, d'indice optique, de masse ou bien encore une variation de propriétés électriques. Les transducteurs peuvent donc être des capteurs électrochimiques, piézoélectriques, optiques ou électriques. Toute la difficulté réside dans la mise en évidence des signaux spécifiques de l'appariement et dans la mise au point d'un transducteur correspondant fiable, sensible et fidèle.
L'invention décrite dans la demande de brevet français n° 94 08688 s'insère parfaitement dans cet état de la technique fondé sur la détection des signaux électriques, induits par des hybridations PN/PNc ou par des réactions antigène- anticorps, dans un milieu liquide conducteur de l'électricité.
Cette demande de brevet décrit un procédé d'analyse qualitative et/ou quantitative de substances biologiques, en particulier, des polynucleotides, des antigènes, des anticorps, des enzymes, des substrats, dans lequel on met en oeuvre une structure multicouches comprenant une plaquette de semi-conducteur recouverte d'un isolant dont la surface est fonctionnalisée par l'une des espèces des paires de substances biologiques sus-visées, appariables spécifiquement. Selon ce procédé, on polarise le semi-conducteur contenant des polynucleotides PN à doser ou à identifier, on recueille les variations des signaux électriques induites par un phénomène d'effet de charge directement et essentiellement lié aux appariements des substances biologiques visées avec leurs ligands complémentaires fixés sur l'isolant, éventuellement par l'intermédiaire d'une membrane sensible.
Cette technique de mesure par transduction électrique ne nécessite pas d'intermédaire de réaction, pas plus que de marqueur spécifique ni de réaction enzymatique. Elle donne satisfaction mais reste néanmoins perfectible en ce qui concerne la simplicité de mise en oeuvre et l'accès à une possibilité de réalisation de séries de mesures rapides de différents substrats, sans utiliser autant de capteurs qu'il existe de natures différentes de substrats à analyser.
Selon cette technique, le phénomène d'effet de charges peut être appréhendé par mesure d'impédance électrochimique d'une structure semi-conducteur/isolant/ membrane sensible/liquide conducteur. Selon une variante, la caractérisation de l'effet de champ dû à la variation de la charge superficielle induite par l'appariement, peut être réalisée à l'aide d'un transistor à effet de champ polarisé et sur lequel on mesure les variations du potentiel grille/source induit par l'effet de champ.
Il existe par ailleurs, des propositions techniques d'identification et/ou de dosage de molécules biologiques, qui combinent
• d'une part, des moyens de révélation des substances à doser faisant appel à des marqueurs radioactifs, enzymatiques, fluorescents, colorés, modificateurs de potentiel redox ou de pH, ou analogues,
• et d'autre part, des moyens de transduction électrochimiques ou optoélectrochimiques.
Malheureusement, une telle combinaison n'est pas de nature à supprimer les inconvénients liés aux techniques basées sur la révélation, ni à améliorer les techniques d'analyse électrochimique. C'est ainsi que les brevets américains N° 4 591 550 et 5 500 188 divulguent un procédé et un dispositif pour la détermination et le dosage d'une ou plusieurs substances contenues dans un milieu liquide gazeux ou solide et capables de modifier les caractéristiques de photoréponse d'un élément photosensible, comprenant des moyens de reconnaissance desdites substances. Ces derniers impliquent un mécanisme de révélation par un ou plusieurs produits traceurs susceptibles de modifier les caractéristiques physicochimiques du milieu d'analyse (pH, potentiel redox) et/ou susceptibles d'être mis en évidence par un marqueur radioactif coloré ou fluorescent. Il s'agit donc d'une technique hybride associant des moyens de transduction optoélectrochimique et des moyens de révélation physicochimiques. Le dispositif mis en oeuvre dans ce procédé connu comprend un ou plusieurs capteurs constitués chacun par une plaquette de semi-conducteur (silicium recouvert d'une couche d'isolant SiO2 ou nitrure de silicium), la surface de cette dernière étant éventuellement fonctionnalisée par des moyens de reconnaissance des substances à doser et/ou à identifier. Ce dispositif est également pourvu de moyens de polarisation de la structure semi-conducteur/isolant (e.g. circuit d'application d'une tension de polarisation, ledit circuit comprenant d'une part, une contre-électrode et une électrode de référence et étant relié, d'autre part, à la structure semi-conducteur/isolant). Le dispositif comporte, en outre, des moyens d'irradiation du ou des éléments photosensibles ainsi que des moyens de mesure de signaux électriques résultants, de détection et/ou d'identification des substances considérées.
Il est à noter que chaque élément photosensible comprenant la structure semi- conducteur/isolant est nécessairement associé à des moyens d'éclairement, des moyens de polarisation et des moyens de mesure. Il s'ensuit une extrême complexité du dispositif dans ses variantes visant la multidétection de substances différentes, à la fois sur le plan de la structure en tant que telle et sur le plan de la prise en charge et du traitement des mesures et des signaux résultants. La couche d'isolant des éléments photosensibles selon cet art antérieur, est fonctionnalisée dans le cas où les substances à analyser sont des systèmes affins PN/PNc, E/S, Ag/Ac. Dans ce cas, les ligands de reconnaissance fonctionnalisant la couche d'isolant sont systématiquement marqués. Cela est illustré notamment pour l'analyse d'ADN ou ARN, dans laquelle les ligands complémentaires de reconnaissance sont marqués avec le biotine (Cf. colonne 14 lignes 49 à 63 de l'US- A-5 500 188). Dans de telles configurations, on doit donc supporter tous les inconvénients liés à ces techniques de révélation par marqueur. Il convient d'ailleurs d'observer que celles qui font intervenir l'absorption ou l'émission de radiations lumineuses, risquent de surcroît de perturber l'irradiation d'activation prévue selon ce procédé.
Dans l'hypothèse où il ne s'agit pas de systèmes affins sous-tendant une fonctionnalisation spécifique de l'isolant des capteurs, les moyens traceurs sont e.g. des variations de pH ou de potentiel Redox. Il doit être considéré que ces moyens ne sont pas des plus fiables car il existe bon nombre de facteurs dans le milieu d'analyse, qui est par exemple un liquide conducteur, susceptibles d'interférer sur ces paramètres, sans que cela ne soit lié au dosage et à l'identification des substances visées.
De plus, bien qu'il n'exclut pas le fait que le signal mesuré au sortir de leur capteur puisse être le photopotentiel, la photoconductance, la photocapacitance ou la photoinductance, ou des combinaisons de celles-ci (colonne 3, lignes 36 et 37-US-A-5 500 188), il est précisé lignes 41 à 43 colonne 3 de ce même brevet que le signal mesuré est la résultante d'un changement d'un courant continu d'un courant alternatif ou de l'effet d'un courant continu sur un courant alternatif. Cette préférence quant à la prise en compte du photocourant comme signal résultant, ressort également de manière claire et exclusive des exemples de ces brevets US, dans lesquels on prend en compte soit le courant nécessaire pour maintenir un potentiel constant entre l'élément sensible et la référence (colonne 19 lignes 4 à 7), soit les variations de ce courant, qui correspondent aux changements de l' environnement chimique au voisinage de l'isolant de l'élément sensible (colonne 19 lignes 43 à 45) soit le potentiel requis pour maintenir un courant constant (colonne 19 lignes 62 à 65), soit la variation du courant d'alimentation des moyens d'irradiation nécessaires pour maintenir un potentiel constant entre la structure de mesure et la référence (colonne 20 lignes 42 à 49). Cela ressort également des passages colonne 26 lignes 7 à 9 et lignes 30 à 34. Il apparaît donc que le signal central pris en considération dans le procédé et le dispositif selon les brevets US-A-4 591 550 et 5 500 188, est le photocourant mesuré de manière directe ou indirecte. Or, la relation entre l'éclairement et ce photocourant est mal définie et englobe plusieurs phénomènes physiques. Il en résulte donc une incertitude sur l'interprétation des mesures.
Force est donc de constater, que cette proposition technique hybride évoquée ci- dessus, ne donne nullement satisfaction en matière d'analyse qualitative et/ou quantitative de substances, en particulier biologiques, et plus particulièrement encore polynucléotidiques. Les Demandeurs en veulent d'ailleurs pour preuve qu'il n'existe à ce jour sur le marché aucune application industrielle et commerciale de l'invention décrite dans ces brevets US N° 4 591 550 et 5 500 188.
BREF EXPOSE DE L'INVENTION :
Aussi, pour poser la problématique à la base de la présente invention, les inventeurs se sont fixés notamment comme objectif essentiel de fournir un procédé d'identification et de dosage de substances biologiques, de préférence de polynucleotides, ce procédé devant intégrer notamment les spécifications suivantes :
- spécificité,
- haute sensibilité,
- commodité de mise en oeuvre,
- «applicabilité » à une grande variété de substances biologiques, et notamment aux substances polynucléotidiques,
- faible coût de revient,
- miniaturisation possible de façon à permettre des mesures analytiques, in situ et/ou in vivo, de façon continue ou discontinue ;
- grande fiabilité - bonne reproductibilité - accès à la multidétection, c'est-à-dire l'identification et/ou le dosage de substances différentes (polynucleotides hétéroclites) contenues dans un seul et même milieu d'analyse,
- application au diagnostic de maladies virales, génétiques, dès lors qu'il s'agit de multidétection simple à mettre en oeuvre à interpréter vis-à-vis de polynucleotides. Pour satisfaire à ces objectifs, parmi d'autres, les inventeurs ont eu le mérite de mettre en évidence, de façon tout à fait surprenante et inattendue, que les appariements spécifiques entre des molécules de préférence biologiques et plus préférentiellement encore entre des brins polynucléotidiques complémentaires, induisent une modification de la charge électrique superficielle dans une structure multicouches, semi-conducteur Sc/isolant Is fonctionnalisé superficiellement. Cette modification intervient plus précisément à l'interface avec un milieu liquide conducteur LC, ledit effet de charge constituant le signal de base d'identification et de dosage, perçu de manière directe ou indirecte par des moyens de transduction optoélectrochimiques.
La mise en pratique de ce concept original et avantageux s'est exprimé au travers de la présente invention, qui a donc pour objet un procédé d'identification et/ou de dosage de Substances Biologiques - de préférence électriquement Chargées - (SBC), présentes dans un milieu Liquide Conducteur LC, à l'aide d'au moins un capteur d'affinité comprenant au moins une structure comportant au moins un matériau semi-conducteur Se, revêtu sur au moins l'une de ses faces d'au moins une couche d'isolant Is, cette dernière présentant à sa surface au moins une sonde So, en contact avec le milieu conducteur LC et comprenant une ou plusieurs Substances Biologiques de Reconnaissance spécifique (SBR) par interaction affine, des SBC du milieu LC sus-visé, caractérisé en ce qu'il consiste essentiellement à :
- a - sélectionner à titre de sonde(s) So, des SBR non-marquées,
- b - faire en sorte que le niveau de Fermi du Se corresponde sensiblement au, ou passe par le niveau intrinsèque en surface du Se,
- c - soumettre le Se à un éclairement périodique comprenant des photons dont l'énergie est > à l 'énergie de la bande interdite du Se,
- d - mesurer directement ou indirectement les variations ΔVbp du potentiel de bandes plates Vbp du Se, induites par un phénomène d'effet de charges directement et essentiellement lié aux appartements spécifiques des SBC du milieu conducteur LC avec leurs ligands complémentaires SBR de la ou des sondes So, à l'exclusion :
(i) des variations résultant d'éventuels effets de charges et/ou de transferts de charges provoqués par des réactions chimiques catalysées par des enzymes et dans lesquelles se produit une consommation d'une partie des substances à détecter, (ii) et des variations de la photoréponse liées à l'apparition dans le milieu LC d'au moins un produit traceur susceptible d'être révélé au travers de variations de pH ou de potentiel Redox, et/ou au travers de marqueurs, de préférence du type de ceux absorbant ou émettant des radiations (fluorescents, radioactifs, colorés, e.g.). - e - et interpréter les signaux recueillis en termes d'identification et/ou de dosage des SBC du LC.
Un tel mode de mesure par transduction optoélectrochimique répond aux spécifications recherchées de simplicité, sensibilité, spécificité, fiabilité et reproductibilité.
Par ailleurs, la technique selon l'invention présente également l'avantage d'être réversible. En effet, on peut aisément réaliser le désappariement des espèces complémentaires ayant réagi spécifiquement au niveau de la membrane sensible de la structure semi-conductrice. La membrane sensible peut être ainsi régénérée après chaque utilisation et ce à de multiples reprises.
De tels résultats avantageux étaient, a priori, difficilement prévisibles. En particulier, cette technique s'est révélée être d'une efficacité remarquable dans le cadre de la reconnaissance de séquences polynucléotidiques par hybridation des monobrins d'acides nucléiques (ligands), qui forment ces séquences, avec des monobrins polynucléotidiques complémentaires, immobilisés sur la couche d'isolant de la structure Sc/Is. Ainsi, selon un mode préféré de mise en oeuvre du procédé selon l'invention les SBC sont des polynucleotides PN et les SBR sont des polynucleotides PNc.
La présente invention permet d'envisager, notamment, la reconnaissance de séquences nucléotidiques, par exemple en vue de la détection de maladies génétiques, de la détection et la caractérisation de virus, de bactéries et de parasites ou pour l'établissement de cartes génétiques, l'étude de l'expression et/ou de la mutation des gènes. Outre, l'hybridation nucléotidique, il est envisageable d'exploiter d'autres appartements spécifiques que sont par exemple, les mécanismes biochimiques de couplage immunologique, voire de complexation enzyme/substrat, pour peu que Pappariement entraîne une variation de charges électriques à la surface de Is.
EXPOSE DETAD LE DE L'INVENTION :
Le principe d'analyse qui gouverne le procédé selon l'invention est exclusivement optoélectrique ou optoélectrochimique. Cela signifie que l'on a à faire à une reconnaissance biochimique affine, c'est-à-dire qui ne fait pas intervenir de réactions chimiques ou enzymatiques et qui se déroule sans production ou consommation d'espèces chimiques intermédiaires. En outre, la révélation de cette reconnaissance biochimique affine ne se fait pas au travers d'une détection indirecte à l'aide de moyens physicochimiques de révélation : traceurs colorés, fluorescents, radioactifs, potentiels redox, pH. Conformément à l'invention, la reconnaissance biochimique s'opère essentiellement, voire exclusivement par une transduction optoélectronique soustendant la polarisation de la structure Sc/Is par rapport à LC, ainsi que l'éclairement périodique de ladite structure.
Au sens de l'invention, l'expression « électriquement chargées » signifie que lors de l'interaction affine de la PNC avec la PN, la charge électrique de surface est modifiée.
La première étape - a - du procédé selon l'invention consiste à mettre exclusivement en oeuvre des sondes So, en particulier des PNc, non marqués, c'est-à- dire non porteurs de moyens de révélation physicochimiques (fluorescence, colorimétrie, radioactivité, potentiel redox, pH).
Dans le cas d'une structure fonctionnalisée en surface par des sondes constituées par des monobrins polynucléotidiques PNc par exemple d'ADN, l'hybridation de ces derniers avec les brins à doser ou à identifier dans le milieu LC entraîne un accroissement de charges sur la surface de la structure. Ceci conduit à une modification de la répartition des porteurs de charge dans la zone de charge d'espace du semi-conducteur, afin de satisfaire au nouvel équilibre thermodynamique de la structure. Cette nouvelle répartition se traduit par une modification de la courbure des bandes du semi-conducteur dans sa zone interfaciale en contact avec le diélectrique. Le potentiel de bandes plates Vbp est le potentiel qu'il faut appliquer au semi- conducteur par rapport au milieu LC (électrolyte) en contact avec le diélectrique Is pour obtenir une courbure nulle des bandes du Se. Conformément à l'invention, on mesure cette grandeur physique Vbp ou sa variation ΔVbp, de manière à caractériser l'état d'équilibre de la structure. Ainsi, la modification de la charge de surface correspond à une variation de Vbp, qui est elle-même une signature de l'hybridation PN/PNc. Pour qu'il y ait variation de la courbure de bandes du Se et donc de Vbp, il convient conformément à l'étape b du procédé selon l'invention, de créer une courbure de bande initiale du Se, en procédant à l'ajustement des niveaux de fermi du Se et du milieu LC, de préférence par l'imposition d'une tension de polarisation Vp continue à la structure Sc Is - PNc, par rapport au milieu LC. Conformément à un premier mode de mise en oeuvre du procédé selon l'invention, l'ajustement du niveau de Fermi du semi-conducteur Se sensiblement à son niveau intrinsèque en surface, s'opère en imposant une tension de polarisation Vp au Se par rapport au LC, selon un balayage entre une tension négative et une tension positive limites, choisies de telle sorte que le niveau de Fermi du Se passe par son niveau intrinsèque en surface, Vp évoluant ainsi avantageusement dans une gamme de tension correspondant au régime de désertion et de faible inversion du Se.
Cette polarisation continue est associée, d'une part à l'éclairement périodique selon l'étape c et d'autre part, à une mesure des variations de Vbp suivant l'étape d. Cette mesure est effectuée comme suit : > recueil du photopotentiel (Vph) aux bornes du Se (entre Se et LC) et/ou du photocourant (Iph) calcul des impédances optoélectrochimiques en phase Zop et/ou en quadrature Zoq pour chaque valeur de Vp,
> réalisation de la (ou des) courbe(s) Zop et/ou Zoq et/ou Vph et/ou Iph en fonction de Vp,
> et suivi du déplacement de cette (ou ces) courbe(s) parallèlement à l'axe des abscisses (potentiels Vp), ledit déplacement correspondant aux variations de Vbp recherchées.
Les impédances optoélectrochimiques Zop et Zoq permettent d'accéder aux propriétés énergétiques de la structure Sc/Is-So ainsi que de sa zone interfaciale avec le LC, et notamment aux différents effets de charge pouvant intervenir aux interfaces. Ces impédances optoélectrochimiques Zop et Zoq sont liées au photopotentiel Vph et au courant Ihv, générés suite à l'excitation lumineuse périodique du Se, par ailleurs soumis à une polarisation continue. En effet, l'éclairement modulé - c - du Se par des photons d'énergie supérieure ou égale à la largeur de sa bande interdite, génère des paires électrons-trous, porteurs de charge. Ces derniers sont séparés sous l'effet du champ électrique existant dans la zone de charge d'espace du semi-conducteur Se (dans la zone en contact avec le diélectrique Is). Ce phénomène entraîne l'apparition de Ihv périodique dans le semi-conducteur Se, ce qui conduit aux bornes de la structure Sc/Is-So à un photopotentiel Vph périodique ou à un photocourant Iph périodique.
Il est donc possible d'utiliser indifféremment Vph et/ou Iph et/ou les composantes impédimétriques Zop et/ou Zoq, en tant que paramètres de transduction des phénomènes énergétiques d'effet de charge, directement liés aux appartements auxquels on s'intéresse. Dans le cas où la puissance de l'éclairement selon l'étape c est faible, les impédances optoélectrochimiques Zop et Zoq sont des fonctions de transfert reliant Vph à Ihv induit par l'éclairement modulé. Plus précisément, les impédances optoélectrochimiques Zop et Zoq de la région de la zone de charge d'espace du Se sont directement proportionnelles aux valeurs efficaces des composantes en phase et en quadrature du Vph mesuré. Le coefficient de proportionnalité dépend de l'intensité ou de la puissance, de l'éclairement.
Le photopotentiel est donc l'image de l'impédance opto-électrochimique de la structure.
Dans cette variante, on préfère que l'éclairement soit non seulement faible mais également sensiblement sinusoïdal.
Dans le cas où l'éclairement mis en oeuvre à l'étape c est fort, on accède aux variations de Vbp, dans le cadre de l'étape d, de préférence : en recueillant Vph et/ou Iph, β en établissant la courbe Vph = f (Vp) et/ou Iph = flNp), u et en suivant le déplacement de cette (ou ces) courbe(s) parallèlement à l'axe des abscisses (potentiels Vp), ledit déplacement correspond aux ΔVbp recherchées.
En effet, à fort éclairement, si la charge de surface varie du fait de l'appariement des PΝ du LC avec les PΝc des sondes So de la structure Sc/Is, il s'ensuit une modification du Vbp qui se traduit par un glissement de la courbe de la valeur efficace du photopotentiel Vph et/ou du photocourant Iph, parallèlement à l'axe des potentiels de polarisation de la structure.
Selon l'invention, les notions de faible et fort éclairement sont définies comme suit : - le faible éclairement est un éclairement qui conduit à une perturbation du second ordre de la structure par rapport à l'équilibre thermodynamique dans l'obscurité. Il est de préférence inférieur ou égal à 10 μW/cm2 et préférentiellement à 1 μW/cm2.
- le fort éclairement est un éclairement qui perturbe fortement l'équilibre thermodynamique de la structure dans l'obscurité. Il est de préférence supérieur à 10 μW/cm2.
Dans les variantes à faible et à fort éclairement évoquées ci-dessus, pour la description du premier mode de mise en oeuvre du procédé selon l'invention, les calculs de Zop et/ou Zoq, le pilotage et l'acquisition des mesures, ainsi que le traçage des courbes Zop et ou Zoq et/ou Vph et/ou Iph = f(Vp), se font par l'intermédiaire d'un microordinateur, selon des procédures connues en soi (notamment calcul des impédances selon la loi d'Ohm).
Conformément à un deuxième mode de mise en oeuvre du procédé selon l'invention, on adopte la méthodologie suivante :
Δ dans l'étape b : on fixe le niveau de Fermi du Se sensiblement au niveau intrinsèque en surface du Se, en imposant une tension de polarisation Vpi correspondant environ à l'abscisse du point d'inflexion de la courbe Vph = f (Vp) ou Zoq = f(Vp) ou Iph = f(Vp), Vph, Zoq et Iph étant tels que définis supra (p.9 1.4 à 7), de telle sorte que l'ordonnée de ce point d'inflexion corresponde environ à Vph max/2, Zoq max/2 ou Iph max/2 ;
Δ et dans l'étape d, on appréhende les variations ΔVbp de Vbp : (i) par la mesure de l'évolution de Vph et/ou Iph et/ou Zoq, dans le cas où les variations ΔVbp sont faibles et en considérant queVbp varie linéairement avec Vph, alors ΔVbp = KΔVph, où K représente la pente de la courbe Vph = f(Vp) au point d'inflexion ;
(ii) et/ou par la prise en compte des variations de la tension de polarisation ΔVp, rendues nécessaires pour réguler et maintenir constant Vph max/2, Zoq max/2 ou Iph max/2, cet ajustement ΔVp étant le reflet de ΔVbp. II s'agit donc selon ce mode de mise en oeuvre de polariser la structure
Sc/Is de telle sorte que le niveau de Fermi soit au voisinage de la position intrinsèque du semi-conducteur. Le potentiel imposé Vpi est voisin du potentiel correspondant au point d'inflexion de la courbe d'allure sigmoïdale du photopotentiel Vph, du photocourant Iph ou de l'impédance optoélectrochimique en quadrature Zoq en fonction du potentiel de polarisation Vp. Au sens de l'invention, on entend par « voisinage » du niveau de Fermi par rapport au niveau intrinsèque en surface du Se, la position voisine du milieu de la bande interdite du semiconducteur à sa surface au contact de l'isolant Is, dans une plage telle que le semiconducteur se trouve en surface en situation de désertion ou faible inversion, de telle sorte que le photopotentiel Vph, et/ou le photocourant Iph, et/ou l'impédance optoélectrochimique en quadrature Zoq varie beaucoup avec le potentiel de polarisation Vp.
Par suite, « Vpi correspondant environ au potentiel du point d'inflexion », doit s'entendre, selon l'invention, par une plage d'incertitude de ± 0,5 Volt. L'ordonnée du point d'inflexion de ces courbes Vph, Iph ou Zoq = f (Vp) est avantageusement choisie comme paramètre de référence à maintenir constant dans le cadre de cette régulation par ajustement de Vp. La référence est en pratique donnée par la valeur maximale qu'atteint Vph, Iph ou Zoq dans chacune des courbes sigmoïdales caractéristiques. Vph max, Iph max et Zoq max correspondent en d'autres termes à la valeur maximale du photopotentiel, du photocourant et de l'impédance optoélectrochimique en quadrature, respectivement, lorsque le semi-conducteur est en régime de forte inversion.
Dans la mesure où la détermination de la valeur de consigne Vpi passe par la prise en compte de l'abscisse et de l'ordonnée du point d'inflexion d'au moins l'une des courbes Vph ou Zoq ou Iph = flNp), il est prévu dans ce deuxième mode de mise en oeuvre d'établir au moins l'une desdites courbes, de préférence comme décrit supra pour le premier mode de mise en oeuvre.
La variante (i) de l'étape d selon ce deuxième mode de mise en oeuvre consiste à suivre ΔVbp par la mesure de la variation de Vph, Iph ou Zoq, après calibration. Cela revient à établir la courbe Vph et/ou Iph et/ou Zoq = f(t) et de considérer que toute variation ΔVph, Δlph ou ΔZoq correspond à une variation ΔVbp. La variante (i) est utilisable dans le cas d'une variation modérée du Vbp permettant d'établir une relation simple (linéaire par exemple) entre Δ Vph et ΔVbp. En pratique, on préfère recourir à la variante (ii) de l'étape d selon le deuxième mode de mise en oeuvre du procédé conforme à l'invention. Dans cette variante, on maintient Vph max/2 constant en ajustant la polarisation Vp de la structure, de préférence par l'intermédiaire d'une régulation électronique. Le ΔVp de régulation correspond au ΔVbp que l'on cherche à mesurer. Selon une disposition avantageuse de l'invention, la régulation électronique que l'on peut mettre en oeuvre dans le cadre de la variante (ii) de prise en compte de ΔVp, s'effectue de la façon suivante :
- on détecte vph, - on amplifie éventuellement le signal vph,
- on redresse éventuellement ce signal de manière à disposer d'un signal continu v'ph,
- on compare ce signal vph continu à un signal de référence U correspondant sensiblement à la valeur de v'ph max/2 (ordonnée de point d'inflexion de la courbe v'ph = F (Vp) soit v'ph max/2),
- on recueille la différence Δ (v'ph-U) entre V'ph et U,
- on amplifie éventuellement Δ(v'ph-U),
- on applique Δ(v'ph-U) éventuellement amplifiée entre Se et LC en complément de Vp, - on enregistre Δ(V'ph-U).
L'intérêt d'une telle procédure de régulation résulte du fait que le potentiel électriquement imposé est directement et linéairement l'image des variations de Vbp provoquées par les interactions à la surface du diélectrique Is. Il est donc indépendant des propriétés de la structure et permet d'obtenir une bonne sensibilité et une excellente reproductibilité de mesure.
Selon la nomenclature adoptée dans le présent exposé, Vph désigne aussi bien le photopotentiel primaire vph mesuré entre Se et LC que v'ph correspondant à vph redressé et éventuellement amplifié.
S 'agissant de l'étape c d' éclairement, qui est commune aux deux modes de mise en oeuvre évoqués ci-dessus, il y a lieu de préciser que ledit éclairement peut être effectué en regard de n'importe quelle zone des faces externes de la structure
Sc/Is-So, y compris sur son épaisseur le cas échéant, voire sur la totalité de l'extérieur de cette structure.
En d'autres termes, l'éclairement périodique de la structure Sc/Is est donc effectué soit en regard de la ou des faces externes du Se, soit en regard de la ou des faces externes de l'isolant Is, soit en regard de toutes les faces externes de la structure.
De préférence, pour l'étape c, on choisit la longueur d'onde de l'éclairement λ de telle
, , . , 1240 sorte qu elle soit supeπeure ou égale a λ0 = nm, de
E(énergie bande interdite) préférence comprise entre 100 et 3000 nm, E étant l'énergie de la bande interdite de Se exprimée en électron- volt.
Ce seuil λ0 est fonction de la nature du semi conducteur. Selon un troisième mode de mise en oeuvre du procédé selon l'invention, on peut éliminer radicalement les réponses non spécifiques, en mettant en oeuvre une mesure différentielle, selon laquelle, on fait intervenir dans le capteur d'affinité au moins une autre structure Sc/Is de référence, dans laquelle Is n'est pas fonctionnalisé par So, et en suivant la différence entre les Vbp mesurées par les 2 capteurs, ainsi que la variation de cette différence.
Dans ce troisième mode de mise en oeuvre la structure Sc/Is-So de mesure et la structure Sc/Is de référence sont mises au contact du même milieu LC. Elles sont polarisées de la même façon, de préférence au moyen d'une même contre-électrode, une électrode de référence n'étant pas nécessaire. Enfin, conformément à l'étape c, elles sont soumises à un même éclairement de lumière modulée. Par ailleurs, les moyens d'interprétation des signaux recueillis mis en oeuvre dans l'étape d sont choisis de manière à permettre le suivi de la différence entre les potentiels de bande plate VbpO et Vbpl propres aux deux structures Sc/Is et Sc/Ts- So, respectivement.
Cette disposition permet d'obtenir une mesure très précise et en continu de la variation du Vbpl de la structure Sc/Is-So fonctionnalisé, en s' affranchissant des phénomènes parasites pouvant apparaître et qui sont liés à d'autres paramètres que l'appariement et, en particulier, que l'hybridation PN/PNc. Un quatrième mode de mise en oeuvre du procédé selon l'invention est caractérisé, en ce que, dans une étape préalable ao, on fonctionnalise différentes zones de la surface d'une couche d'isolant Is d'une même structure Sc/Is, par plusieurs sondes So différentes de par la nature des PNc qui les composent, et on réalise ensuite à l'aide de cette structure l'analyse de LC contenant un ou différents substrats PN : - par éclairements successifs des zones de la surface de l'Is, lesdites zones étant chacune fonctionnalisée par une même So (PNc identiques), la nature des So variant d'une zone à l'autre, - et par recueil et interprétation des ΔVbp. Ce quatrième mode de mise en oeuvre correspond à la multidétection de substrats, en particulier de PN, de natures différentes, dans le domaine de la génétique. La multidétection selon l'invention permet d'accéder à des méthodes de détection simple et rapide de maladies virales et de maladies génétiques. Il est également envisageable de réaliser des vérifications de compatibilité tissulaire, de même que des cartographies de populations hétérogènes de polynucleotides, par exemple de génomes. Cela constitue en outre un outil pour l'étude de la mutation des gènes, de l'expression des gènes, ou du séquençage génomique. L'intérêt de la multidétection selon ce quatrième mode de mise en oeuvre réside dans la simplicité méthodologique et structurelle du procédé et du dispositif correspondants.
De manière commune aux troisième et quatrième modes de mise en oeuvre évoqués ci-dessus, à savoir respectivement la mesure différentielle et la multidétection, il y a lieu de noter que l'étape de mesure directe ou indirecte de ΔVbp peut être réalisée conformément à la procédure décrite pour le premier mode de mise en oeuvre dans l'une ou l'autre de ces variantes à faible ou à fort éclairement, de même que selon la procédure propre au deuxième mode de mise en oeuvre, quelle que soit la variante (i) ou (ii) retenue.
Il va de soi que l'invention n'est pas limitée à ces quatre modes de mise en oeuvre, mais elle englobe également toutes les méthodes de mesure envisageables et analogues, fondées sur la reconnaissance de la variation du potentiel de bandes plates (ΔVbp) d'une structure Sc/Is-So possédant une zone sensible faite de sondes So à base de substances biologiques de reconnaissance SBR (e.g. des PNc) aptes à réagir spécifiquement avec des susbtances biologiques électriquement chargées SBC (e.g. des PN) dans un milieu LC.
Avantageusement, les substrats à analyser sont des PN, de préférence choisis dans la liste suivante : nucléotides, oligonucléotides, polynucleotides, acides nucléiques (ADN ou ARN) ainsi que les analogues et les mélanges desdits substrats.
Conformément à l'invention, les sondes So mises en oeuvre dans le procédé sont des moyens de reconnaissance spécifique, en particulier des PNc, non-marqués, c'est-à- dire non porteurs de moyens de révélation de l'appariement PN/PNc (fluorescence, colorimétrie, radioactivité).
Bien que l'on privilégie des substances biologiques du type séquence polynucléotidique (ARN, ADN, gène, plasmide ou tout autre matériel génétique), cela n'exclut pas pour autant d'autres substances biologiques du type antigène, haptène, anticorps ou, de manière générale, toute espèce d'un couple formé par une macromoléculaire biologique et son complément spécifique. Comme exemples de couples ou de paires d' appartement spécifique, on peut citer : antigène-anticorps, haptène-anticorps, ADNc/ADN, ARNc/ARN, poly dT-ARNm, eucaryote, lectineglycoconjugué, marqueur de cellules (ou de microorganismes)-cellules (ou microorganisme), HcG- récepteur tissulaire et T3 - TGB (thyroxin binding protein). Le procédé selon l'invention passe tout d'abord par l'immobilisation d'au moins un type de ces espèces biologiques PNc réactives pour constituer la ou les sondes So. Celle-ci peut se faire directement sur la couche isolante ou à l'aide d'un matériau intermédiaire (composés d'espacement par exemple), accolé à l'isolant Is et apte à recevoir par liaison physique (e.g. adsorption-absorption) et/ou chimique (e.g. liaison covalente), les ligands biologiques spécifiques PNc. Selon l'invention, il est parfaitement envisageable de prévoir une des sondes So hétérospécifiques, formées d'espèces biologiques PNc de natures différentes, aptes à réagir avec leurs complémentaires.
Le milieu liquide conducteur LC utilisé peut être toute solution tampon compatible avec les substances biologiques considérées PN. Ce milieu liquide LC possède avantageusement une conductivité équivalente à celle d'une solution aqueuse de NaCl ayant une concentration pouvant aller de 0,005M à 3M et préférentiellement de l'ordre de 0,1 M.
Le pH du milieu liquide peut être compris entre 0 et 12, de préférence entre 6 et 8 de façon à favoriser les appartements par bioaffinité. La stringence du milieu liquide peut également être ajustée pour favoriser l'hybridation.
Les interactions non spécifiques, par échange d'ions ou par interactions hydrophobes, peuvent être supprimées en tout ou partie à l'aide de tampon de force ionique appropriée, (e.g. Tris-HCl/Tris-base).
Avantageusement, la température de mesure peut être comprise entre 0 et 50°C. Elle est contrôlée plus précisément de façon à favoriser les réactions biochimiques concernées.
La présente invention a également pour objet un dispositif pour la mise en oeuvre du procédé tel que décrit supra, ledit dispositif étant caractérisé en ce qu'il comprend : - au moins un capteur d'affinité formé par au moins une structure
Sc/Is-So dans laquelle la ou les sondes So comprennent des ligands SBR aptes à s'hybrider spécifiquement avec les substances biologiques SBC à analyser, contenues dans le milieu liquide conducteur LC, en provoquant un phénomène d'effet de charge, à l'origine des ΔVbp du Se,
- des moyens de polarisation du Se par rapport au LC,
- des moyens d' éclairement du Se du capteur,
- des moyens de mesure du photopotentiel Vph ou du photocourant Iph, - des moyens de transformation des signaux recueillis en variation de
Vbp, - et des moyens de calcul et d'interprétation des ΔVbp en termes d'identification et/ou de dosage des substances biologiques SBC. Grossièrement, ce dispositif comprend donc
- d'une part une ou des structures multicouches semi-conductrices simples, assimilables à des électrodes de mesure,
- de deuxième part, une source de lumière modulée pour l'éclairement de cette ou ces structures,
- et de troisième part, des périphériques électroniques de polarisation électrique, de mesure, de calcul et d'interprétation. Les mesures du photopotentiel Vph et/ou des impédances optoélectrochimiques en phase Zop et/ou en quadrature Zoq sont réalisées dans une configuration de circuit ouvert c'est-à-dire que le circuit de mesure doit comporter une très forte impédance de charge. Les mesures de photocourant Iph sont réalisées avantageusement dans une configuration de circuit fermé (court-circuit).
Ces moyens techniques relèvent de technologies classiques et parfaitement maîtrisées par les hommes de l'art.
En outre, ce dispositif bénéficie d'un faible coût de revient. Il peut être produit aisément à l'échelle industrielle et offre une grande fiabilité et une bonne reproductibilité de mesure.
De surcroît, le caractère déjà miniaturisé voire « miniaturisable » des capteurs d'affinité constituant le dispositif, ouvre des perspectives prometteuses notamment pour certaines applications in vivo ou in vitro.
De manière préférée, mais non limitative, l'électrode de mesure (c'est-à- dire la structure multicouches Sc/Is-So) du capteur d'affinité du dispositif, est formée par au moins une plaquette de Se, de préférence en silicium, recouverte sur l'une de ses faces d'au moins une couche Is d'isolant de préférence en silice, à la surface de laquelle sont fixées au moins une sonde So sensible comprenant au moins un ligand d'appariement biospécifique, de préférence des polynucleotides PNc de reconnaissance spécifique par hybridation, ce capteur comportant également au moins un contact ohmique permettant la connexion de la structure Sc/Is-So, notamment, avec les moyens de polarisation et/ou les moyens de mesure de Vph.
Le dispositif comprend outre cette structure Sc/Is-So, au moins une électrode auxiliaire, éventuellement prévue sur la couche Is de la Structure Sc/Is-So. Avantageusement, la couche de matériau diélectrique bloquant Is est par exemple, une couche d'oxyde et/ou de nitrure ou tout autre matériau minéral ou organique de faible épaisseur, empêchant ou limitant les phénomènes faradiques. Cette structure est associée à un milieu liquide conducteur contenant les substances SBC à doser à détecter ou à identifier LC.
En pratique, le silicium choisi à titre de semi-conducteur est du type n ou p moyennement dopé, de préférence à hauteur de 1015 à 1019 cπr3, de préférence 1016 cm'3. L'épaisseur de la plaquette de silicium est, par exemple, comprise entre 0,01 et 2 mm. La couche isolante Is est avantageusement constituée de silice ou de nitrure de silicium. Elle a pour fonction d'anihiler d'éventuels processus faradiques qui pourraient perturber les mesures, par l'intermédiaire de signaux électriques parasites. Cette couche Is permet également d'éviter les difficultés liées à une possible corrosion du matériau semi-conducteur par le milieu conducteur LC en contact. L'épaisseur de cette couche Is est comprise entre 1 et 500 nanomètres, de préférence entre 1 et 50, et plus préférentiellement encore est de l'ordre de 10 nanomètres. La couche diélectrique Is supporte les sondes So PNc, lesquelles constituent ce qu'on pourrait dénommer membrane bio-réceptrice en contact avec le milieu LC.
DESCRD7TTON DES FIGURES :
- La Figure 1 est une représentation schématique du dispositif d'analyse qualitative et/ou quantitative de substances biologiques, de préférence polynucléotidiques PN présent dans un milieu liquide conducteur LC, conforme à l'invention.
- Les Figures 2 et 3 sont des vues en coupe transversale droite, de variantes de réalisation du capteur d'affinité montré à la Figure 1.
- La Figure 4 représente le schéma du circuit électrique de mesure des impédances optoélectrochimiques Zop, Zoq du capteur d'affinité selon l'invention, conformément au premier mode de mise en oeuvre du procédé, dans sa variante faible éclairement.
- La Figure 5 représente le schéma synoptique d'une forme d'exécution particulière du dispositif de mesure selon l'invention correspondant à la variante ii de la deuxième forme de mise en oeuvre du procédé selon l'invention. - La Figure 6 est une représentation schématique en coupe transversale droite d'une forme d'exécution du dispositif selon l'invention, à savoir le capteur différentiel correspondant au troisième mode de mise en oeuvre du procédé.
- La Figure 7 annexée est un schéma de principe de la structure multicapteur Sc/Is-So! à Son.
- La figure 8 annexée montre les courbes Zop et Zoq = F(Vp) obtenues.
- La Figure 9 correspond aux courbes d'impédances obtenues à chaque étape d'élaboration d'une structure active fonctionnalisée pour la reconnaissance de brins simples d'ADN. - La Figure 10 est une courbe Vph = F(Vp) obtenue à l'exemple 3 pour illustrer un premier mode de mise en oeuvre du procédé à fort éclairement.
- La Figure 11 donne la réponse en ΔVp de la structure fonctionnalisée pour la détection d'oligonucléotides. Exemple 4 - 2ème mode de mise en oeuvre - variante (ii) -
La présente invention sera comprise à la lumière de la description qui suit, d'exemples de réalisation du dispositif et de mise en oeuvre du procédé qu'elle concerne, en référence aux dessins annexés. Ces illustrations non limitatives font ressortir de nombreux avantages et variantes de l'invention.
***
La Figure 1 montre le dispositif selon l'invention qui comprend un capteur d'affinité 1 formé par une structure 7 Sc/Is-So au contact, par sa face supportant les So, avec un milieu liquide conducteur LC, désigné par la référence 2. Ce dispositif comporte également des moyens de polarisation 3, des moyens d'éclairement 4, des moyens 5 de mesure de Vph, et une unité 6 de calcul et de commande comprenant des moyens de transformation des signaux recueillis en variation de Vbp et des moyens de calcul et d'interprétation des ΔVbp en terme d'identification et/ou de dosage des substances biologiques électriquement chargées à analyser, également désignées SBC. Le capteur d'affinité 1 est constitué par une structure 7 Sc/Is-So, elle-même formée par une plaquette Se de silicium 7.1, une couche d'isolant Is en silice 7.2 et des sondes So désignées par la référence 7.3, fixées sur la surface de l'isolant Is 7.2 pour fonctionnaliser cette dernière. Selon une variante, on peut déposer éventuellement à la surface, une couche fonctionnelle permettant de mieux accrocher les sondes So. Le capteur d'affinité 1 est pourvu sur sa face externe opposée à celle porteuse des sondes So 7.3, d'un contact ohmique 8 relié aux moyens de polarisation 3. Le contact ohmique 8 est isolé du milieu LC 2 par l'intermédiaire d'un joint 8j périphérique. Ce dernier coopère par contact étanche avec un support isolant 82 sur lequel repose en somme le capteur 1. Avantageusement, ces sondes sont constituées par des Substances Biologiques de Reconnaissance spécifique (SBR) des SBC. Dans le présent exemple, les SBC et les SBR sont des polynucleotides PN et PNc.
Une électrode de référence 9 et une contre-électrode 10 baignent également au sein du milieu 2 conducteur LC avec le capteur d'affinité 1. Ces deux électrodes 9 et 10 sont connectées aux moyens de polarisation 3. Conformément à une caractéristique préférée de l'invention, une résistance de charge élevée est prévue dans le circuit potentiostatique de mesure. Avantageusement, cette résistance élevée RL est insérée dans la connexion reliant la contre-électrode aux moyens de polarisation 3. En pratique, la résistance RL est préférablement supérieure à 100 kΩ, de préférence 50 MΩ et plus préférentiellement encore est de l'ordre de 100 MΩ. Les Figures 2 et 3 montrent chacune une variante de réalisation du capteur d'affinité 1 dans laquelle la structure 7 constitue le fond d'une cellule de mesure comprenant des parois lj et un joint 12 assurant l'étanchéité entre le fond 7 et lesdites parois lt.
Les éléments communs aux Figures 1 à 3 sont désignés par les mêmes références.
La variante de la Figure 2 se distingue de celle de la Figure 3 en ce que la zone sensible comprenant les sondes So 73 est délimitée dans la première alors qu'elle ne l'est pas dans la seconde (toute la surface de FIS comporte des sondes So 73). Les moyens de polarisation 3 du dispositif selon l'invention sont, de préférence, constitués par un potentiostat adapté, ayant par exemple une forte constante de temps (supérieure à 1 s). Il permet la polarisation de la structure tout en ne perturbant pas le photopotentiel Vph.
Dans l'exemple montré sur le schéma synoptique de la Fig. 1, qui correspond à une réalisation préférée de l'invention, les moyens d'éclairement 4 comportent au moins une source de lumière, en l'occurence une, disposée
" soit en regard de la membrane bioréceptrice 7.3. formée par les sondes So fixées sur l'isolant Is 7.2,
" soit en regard de la face du Se 7.1 opposée à la face 7.3. porteuse du contact ohmique 8 (hypothèse symbolisée par des pointillés sur le schéma de la Figure 1),
" soit en regard de tout ou partie de l'extérieur de la structure 7. Cette source lumineuse 4 est, par exemple, constituée par un laser tel qu'un laser hélium-néon ayant une longueur d'onde d'émission égale = 632,8 nm. Avantageusement, le faisceau lumineux traverse un modulateur acousto-optique (non représenté sur Fig.l) dont le contrôleur est piloté par un générateur basse fréquence, désigné par la référence 4.1 sur la Fig.l.
Un filtre non représenté permet d'ajuster la puissance lumineuse à des valeurs inférieures, égales ou supérieures, au seuil déterminant les plages de faible éclairement et de fort éclairement. De préférence, la puissance lumineuse est de l'ordre ou inférieure ou égale à 1 μW/cm2 pour les conditions de faible éclairement et supérieure à 10 μW/cm2 pour le fort éclairement.
Les moyens 5 de mesure de Vph sont, en pratique, constitués, par exemple, par un adaptateur d'impédance présentant une impédance d'entrée comprise entre 108Ω et 1012Ω, plus préférentiellement de l'ordre de 1010 Ω. Les moyens de mesure 5 comprennent également un organe de détection synchrone piloté par le générateur basse fréquence 4.1. qui, on l'a vu ci-dessus, détermine par ailleurs, la modulation de l'éclairement. Cet organe de détection synchrone donne les composantes en phase et en quadrature de Vph.
Le micro-ordinateur 6 comprend les moyens de transformation des signaux recueillis en variation de Vbp ainsi que les moyens de calcul et d'interprétation ΔVbp, en termes d'identification et/ou de dosage des substances biologiques en l'occurence des polynucleotides PN.
Le schéma du circuit électrique de mesure est représenté sur la Fig. 4. Dans la variante à faible éclairement, les impédances optoélectrochimiques Zop et Zoq sont les fonctions de transfert reliant Vph à l'intensité de l'éclairement. Comme le montre la Fig. 4, l'effet de l'éclairement peut être représenté par un générateur de courant en parallèle avec la région de charge d'espace dont l'impédance, notée Zsc, inclut les paramètres liés à la surface. Zd, est l'impédance du diélectrique. Elle peut être représentée par une capacitance pure. Rel et Re2 sont les impédances de la solution electrolytique, respectivement, entre l'électrode de travail et l'électrode de référence, et entre l'électrode de référence et la contre-électrode. Zp est la résistance interne du potentiostat. RL est la résistance de charge introduite dans le circuit potentiostatique de mesure. Son rôle est de conférer au circuit de mesure les propriétés de circuit quasi ouvert vis-à-vis du photopotentiel, tout en permettant la polarisation de la structure ; sa valeur doit donc être suffisamment élevée par rapport aux autres impédances intervenant dans la mesure. Vph est le photopotentiel mesuré et Wl est le photopotentiel qui apparaît aux bornes du semi-conducteur. D'après le schéma électrique, le courant total Ihv généré par l'éclairement a deux composantes : Il qui traverse le semiconducteur et I2 qui circule dans le circuit de mesure. On peut alors écrire les relations suivantes :
Ihv ≈ lx + 12 = (Vj / Zsc) + (VX/(RL + Rej + Re2 + Zd + Zp)) si RL » Rel + Re2 + Zd + Zp alors : Vph = Vj et Ihv = (Vph / Zsc) + (Vph/RL) d'où Zsc = Vph / Ihv.
Ainsi, les impédances optoélectrochimiques en phase et en quadrature de la région de la zone de charge d'espace du semi-conducteur sont directement proportionnelles aux composantes du photopotentiel mesuré : le coefficient de proportionnalité dépend de l'intensité de l'éclairement.
La mesure des impédances optoélectrochimiques peut donc être utilisée pour la détection du processus d' appartement, en particulier d'hybridation de PN/PNc, lequel processus étant le reflet quantitatif et qualitatif des SBC (PN) à analyser.
Les Exemples 1 et 2 ci-après illustrent la variante faible éclairement du premier mode de mise en oeuvre du procédé selon l'invention.
S 'agissant de la variante fort éclairement de ce premier mode, il consiste à accéder aux variations du potentiel de bande plate Vbp du Se, consécutives au phénomène de reconnaissance biologique, par l'intermédiaire de la valeur efficace de Vph (ou selon une variante de Iph). Dans ce cas, l'éclairement modulé - de préférence à basse fréquence - utilisable n'est pas nécessairement sinusoïdal, mais peut être simplement périodique. Ainsi, dans le dispositif de la Figure 1, si la charge de surface varie avec la présence de l'espèce cible PN dans le milieu LC désigné par la référence 2, cela entraîne un ΔVbp, qui se traduit par un glissement de la courbe de la valeur efficace de Vph, parallèlement à l'axe des potentiels de polarisation de la structure. L'exemple 3 ci-après illustre cette variante fort éclairement du premier mode de mise en oeuvre du procédé de l'invention, à l'aide du dispositif adapté.
Selon le deuxième mode de mise en oeuvre du procédé de l'invention, on polarise la structure Sc/Is-So, de telle sorte que le niveau de fermi du Se soit au voisinage de la position intrinsèque en surface du Se. Le potentiel Vp alors imposé est voisin du potentiel correspondant au point d'inflexion de la courbe d'allure sigmoïdale de la valeur efficace de Vph, de Iph ou de Zoq.
La mesure de la variation de la valeur efficace de Vph de Iph ou de Zoq après calibration, permet d'accéder au ΔVbp.
Selon la variante (U), on ajuste la valeur efficace de Vph à une valeur
, , Vph.max τ r , . . , , . . proche de sa valeur = Vphi en jouant sur la polaπsation continue initiale, qui sera une valeur de consigne Vpi. On maintient ensuite constante la valeur efficace de Vphi, Iphi ou de Zoqi, en ajustant Vp par rapport à la valeur de consigne Vpi de la structure, au moyen d'une régulation électronique. Cet ajustement de la polarisation est directement l'image de ΔVbp. Les valeurs efficaces de Vph, de Iph et de Zoq sont
Vph. max Iph. max Zoq. max ^„ respectivement — , — , — i . Elles représentent chacune sensiblement l'ordonnée du point d'inflexion de la courbe correspondante.
L'exemple 4 illustre le deuxième mode de mise en oeuvre sans fort éclairement dans la variante (ii).
Pour la mise en oeuvre de cette variante (ii), on a recours à une forme particulière d'exécution du dispositif selon l'invention caractérisé en ce qu'il comprend des moyens d'évaluation de la variation du signal Vph ou Iph, ou Zoq par rapport à une référence U imposée par une polarisation Vp se surajoutant à l'éclairement ainsi que des moyens de correction et de régulation de la variation par action sur les moyens de polarisation. La Figure 5 annexée présente le schéma synoptique d'un exemple de cette forme particulière d'exécution du dispositif selon l'invention. Dans cet exemple, on choisit Vph comme signal traceur.
Comme le montre cette Figure 5, dans laquelle les éléments communs avec ceux de la Figure 1, sont repérés par les mêmes références, le photopotentiel vph est détecté aux bornes du capteur d'affinité 1 (cellule de mesure) au moyen d'un adaptateur d'impédance 14 présentant une forte impédance d'entrée de manière à ne pas perturber la structure. Le signal est ensuite amplifié au moyen d'un amplificateur alternatif basse fréquence 15, transformé en un signal continu v'ph grâce à une détection synchrone 5 et à un circuit RC 16 qui permet de diminuer le bruit et de stabiliser la régulation. Le signal continu v'ph est amplifié au moyen d'un amplificateur continu 17, de gain G17. Gl est le gain de l'ensemble amplificateurs 15 et 17 et détection synchrone 5. Le signal continu v'ph amplifié est ensuite comparé à un signal de référence U à l'aide d'un amplificateur différentiel 18. U est ajusté à la valeur de Vpi qui donne au photopotentiel une valeur moitié du photopotentiel correspondant à la forte inversion (Vph.max/2). La différence de valeur résiduelle Δ(v'ph-U) de ces deux signaux est amplifiée par l'amplificateur différentiel 18 de gain G2 et la tension de sortie Δ (v'ph- U) est appliquée à la structure 1 en même temps que la polarisation continue Vp imposée par un générateur de tension 19 couplé à un sommateur 20. Un générateur de signal basse fréquence 4.1. (BF) permet, après amplification à l'aide d'un amplificateur 2.1., de commander la diode 4 dont le faisceau excite la structure 1 et également de référencer la détection synchrone 5. Le microordinateur 6, qui est notamment relié à un organe 22 d'acquisition de la variable Δ(v'ph-U), permet de suivre et d'enregistrer la variation de polarisation de la structure ΔVp occasionnée par la variation du potentiel de bandes plates (ΔVbp).
L'intérêt d'un tel montage est que le potentiel électroniquement imposé est directement et linéairement l'image des variations du potentiel de bandes plates Vbp, provoquées par les interactions à la surface du diélectrique. Il est donc indépendant des propriétés de la structure et permet d'obtenir une bonne sensibilité et une excellente reproductibilité. La cellule (capteur) est semblable à celle décrite supra en référence à la Figure 1. La mesure du photopotentiel étant réalisée au moyen d'un circuit de mesure possédant une forte impédance d'entrée, il est possible d'admettre un contact ohmique de médiocre qualité. Pour mesurer le photopotentiel du semiconducteur par rapport à la solution, une électrode possédant un potentiel constant par rapport à la solution est nécessaire. Cependant, du fait de la forte impédance du circuit de mesure, il est possible d'utiliser une pseudo-électrode de référence constituée par un métal noble tel que le platine, par exemple. L'électrode peut être indépendante ou être réalisée par dépôt, sous forme d'une grille ou d'un anneau externe, sur la surface du diélectrique de façon à satisfaire à la miniaturisation du capteur. L'éclairement de la structure peut être obtenu au moyen d'une diode laser ou d'une diode électroluminescente émettant dans le domaine de longueur d'onde du visible ou du très proche infra-rouge, entre 400 et 1000 nm avec une puissance lumineuse de l'ordre de 0,1 μW à 100 m/cm2. Il est tout à fait technologiquement concevable d'envisager l'éclairement de la structure par la face arrière et même d'intégrer au capteur la partie génératrice de la lumière. Ces possibilités techniques permettraient de disposer d'un capteur de très faibles dimensions, dont seule la face avant serait au contact de la solution et qui serait ainsi, de part la nature des matériaux qui la composent, très peu sensible à l'agression chimique.
Il est tout à fait possible d'utiliser comme signal traceur Iph. Dans ce cas, l'adaptateur d'impédance 14 est remplacé par un convertisseur courant/tension. Les formes d'exécution du dispositif selon l'invention représentées aux
Fig. 1 et 5 décrites supra sont dénommées arbitrairement GENOPTEL.
Conformément à une autre forme d'exécution du dispositif selon l'invention, correspondant au troisième mode de mise en oeuvre du procédé, ledit dispositif est caractérisé en ce que le capteur d'affinité comprend au moins une structure Sc/Is-So et au moins une structure de référence Sc/Is non fonctionnalisée par So, de manière à pouvoir réaliser une mesure différentielle. Cette forme d'exécution que l'on appelera DIGENOPT est représentée à la Figure 6. Elle correspond au cas où l'on a un capteur d'affinité 1 ou cellule de mesure comprenant avantageusement deux structures Sc/Is 31 et 32 quasi identiques, l'une étant fonctionnalisée par So, l'autre non. Ces deux structures (ou électrodes) sont mises en contact avec le même milieu 2 LC et sont polarisées au moyen d'une même contre-électrode 33. Une électrode de référence n'est pas nécessaire. Elles sont éclairées de manière identique par une lumière modulée fournie par une diode 4. L'acheminement de la lumière vers le milieu LC 2 se fait par l'intermédiaire d'un conducteur optique 34, ménagé au travers du corps 35 du capteur 1. Les deux structures Sc/Is 31 et 32 (électrodes) sont montées chacune à la pointe d'un élément 36 vissable dans le corps 35 du capteur 1.
Le corps 35 comprend une cavité fermée latéralement par les électrodes 31 et 32, contenant le milieu LC - 2 -. Des joints 37 sont prévus pour assurer l'étanchéité entre les différentes parois. La paroi du dessus recoît les moyens d'éclairement 4 et 34. Le fond est traversé par la contre-électrode 33. Les périphériques électroniques adaptés permettent de suivre la différence de leur Vbp respectif = Vbpl - VbpO.
On terminera l'illustration non limitative du dispositif de l'invention, en décrivant une dernière forme d'exécution, mais non la moindre, qui est celle selon laquelle le dispositif est caractérisé en ce que le capteur d'affinité comprend au moins une structure Sc/Is-So, dans laquelle les sondes So sont de différentes natures, les sondes So de même nature étant regroupées dans une même zone de la couche d'Is, chaque zone étant circonscrite par rapport aux autres de manière à pouvoir être éclairée séparément partiellement ou en totalité par les moyens d'éclairement. Cette forme d'exécution arbitrairement désignée par l'expression GENMAP, a été rendue possible en raison du fait que le principe de la mesure selon l'invention est telle que le photopotentiel et/ou le photocourant dépend du flux de lumière mais est pratiquement indépendant de Faire de la surface éclairée. Il est donc ainsi envisageable de réaliser sur la même structure Sc/Is des régions différemment fonctionnalisées qui répondent de manière spécifique à différentes espèces cibles (e.g. PN., à PNn), la lecture de l'appariement ou de l'hybridation étant effectué au moyen d'un faisceau lumineux par scrutation successive ou de manière simultanée par plusieurs faisceaux lumineux. Une telle structure Sc/Is est assimilable à un multicapteur biologique donnant accès à la multidétection. Les différentes zones de la surface de Fis peuvent être délimitées ou non physiquement.
La lecture multizone par les moyens d'éclairement permet d'accéder au potentiel de bande plate local de chaque zone fonctionnalisée spécifiquement : - soit par mesure de l'impédance optoélectrochimique selon le premier mode de mise en oeuvre - variante faible ou fort éclairement,
- soit par mesure de la valeur efficace de Vph-variante (i) du deuxième mode de mise en oeuvre,
- soit par prise en compte des variations de Vp permettant la régulation et le maintien de Vph à une valeur proche de sa valeur moyenne (variante ii du deuxième mode de mise en oeuvre).
En d'autres termes, l'acquisition de Vbp peut s'effectuer selon l'un quelconque des modes de mise en oeuvre du procédé selon l'invention.
La Figure 7 annexée est un schéma de principe de la structure multicapteur Sc/Is-So! à Son. On a repris les mêmes références que sur la Figure 1 pour désigner les moyens d'éclairement 4, les sondes Sθj à Son repérées par la référence 7.3, la couche Is 7.2. et la plaquette de semi-conducteur Se référencée par
7.1. On retrouve également le contact ohmique 8.
APPLICATION INDUSTRIELLE :
Ce type de dispositif ouvre la voie des applications nombreuses et variées dans le domaine de la génétique : détection de maladies virales, et de maladies génétiques, vérification de la compatibilité cellulaire, réalisation de cartes de génomes, expression ou mutation de gènes etc.
L'intérêt de ce dispositif comparativement aux autres dispositifs utilisés pour la multidétection, réside dans sa simplicité de réalisation et dans la simplicité du mode de lecture associé à la reconnaissance directe du processus d'hybridation.
Selon un autre de ces aspects, l'invention concerne également les capteurs d'affinité, c'est-à-dire les structures Sc/Is-So de mesure et Sc/Is de référence, telles que décrites supra.
Les exemples qui suivent permettront de mieux comprendre l'invention et de faire ressortir tous ses avantages et ses variantes, tant sur le plan du procédé que sur celui du dispositif. EXEMPLES EXEMPLE 1 : MESURE DES IMPÉDANCES OPTOÉLECTROCHIMIQUES A L'AIDE DU DISPOSITIF DE L'INVENTION COMPRENANT UNE STRUCTURE SC/ÏS ELEMENT DE BASE DU BIOCAPTEUR 1.1. APPAREILLAGE
Le dispositif mis en oeuvre dans cet exemple correspond à celui représenté à la Fig.l.
La structure Sc/Is comprend :
- un semiconducteur ayant une épaisseur de 0,03 mm est du Silicium dopé p à hauteur d'environ 1015 cm-3, avec en face arrière une couche Au/Cr assurant le contact ohmique.
- et un isolant Is est de la silice d'une épaisseur de 10 nm obtenue par oxydation thermique.
1.2. MILIEU LIQUIDE LC : SOLUTION TAMPON TRIS lM. Cette solution tampon de pH 7.1 est composée de 10 mM TrisHCl
(Sigma) et 50 mMNaCl.
/.3. LES CONDIΉONS EXPÉRIMENTALES SONT LES SUIVANTES : la fréquence des modulations de la lumière est de 316 Hertz. La source lumineuse est un laser hélium-néon émettant un éclairement de longueur d'onde λ = 632,8 nm.
La puissance lumineuse est de 0,6 μW/cm2 1.4. RESULTATS
La figure 8 annexée montre les courbes d'impédances optoélectrochimiques Zop et Zoq en fonction de Vp obtenues pour la structure décrite précédemment.
Dans le domaine de polarisation négative, l'impédance en quadrature est due à la capacité de la zone de charge d'espace du semi-conducteur, celle-ci est directement liée au dopage du semiconducteur. Dans le domaine de polarisation positive, l'impédance en quadrature est très faible car le semi-conducteur est en situation d'accumulation et la capacité de la zone de charge d'espace est très élevée. Dans le domaine de polarisation intermédiaire, le semiconducteur passe successivement de la situation d'inversion, à la désertion, puis à l'accumulation, lorsque la polarisation augmente. L'impédance en phase présente un pic dans le domaine intermédiaire. Ce pic est dû à la présence d'états d'interface situés entre le semiconducteur et la couche d'oxyde. Ainsi, les impédances optoélectrochimiques donnent les informations énergétiques sur le semi-conducteur et sur les états de surface du semiconducteur mais ne donne pas d'informations sur la couche diélectrique. Cependant, elles permettent de déterminer le potentiel de bandes plates du semiconducteur. La valeur du potentiel de bandes plates est corrélée à la position de la courbe d'impédance en quadrature par rapport à l'axe des potentiels. C'est le paramètre qui permet de caractériser la charge de surface de la structure.
EXEMPLE 2 : APPLICATION DES MESURES D'IMPEDANCES SELON L'EXEMPLE A LA DETECTION BIOLOGIQUE : PN = ADN (OLIGO dT) 1ER MODE DE MISE EN OEUVRE- VARIANTE FAIBLE ECLAIREMENT
2.1. LE DISPOSITIF Le dispositif utilisé, y compris la structure Sc/Is et le milieu conducteur
LC, sont les mêmes qu'à l'exemple 1, à la différence près que la structure Sc/Is est fonctionnalisée par des sondes So constituées par des nucléotides PNc complémentaires à des espèces cibles PN contenues dans LC.
2.2. FONCTIONNAUSAΗON DE LA SURFACE DE L 'ISOLANT IS PAR DES SONDES SO CONSTITUES PAR DES OLIGONUCLEOTIDES dT DE 20 BASES
Après hydroxylation de la surface de Si/So2, on dépose une couche polymérique d'APTS (AminoPropylTriéthoxySilane). Les brins d'oligonucléotides (dT) sont greffés sur la surface par bromation : cette méthode permet de fixer à l'APTS le nucléotide sans utiliser les sites intervenant dans l'hybridation. Enfin l'hybridation est obtenue après avoir laissé la structure au contact d'une solution contenant des brins complémentaires poly (dA) à ceux fixés sur la surface.
2.3. RESULTATS
La Figure 9 correspond aux courbes d'impédances obtenues à chaque étape d'élaboration d'une structure active fonctionnalisée pour la reconnaissance de brins simples d'ADN.
Les courbes de la Figure 9 montrent le déplacement lié à l'hybridation des brins complémentaires PNc /PN d'ADN.
EXEMPLE 3 : ANALYSE DE POLYNUCLEOTIDES (PN) A L'AIDE DU DISPOSITIF SELON L'INVENTION (FLG 1) - 1ER MODE DE MISE EN OEUVRE DU PROCEDE - VARIANTE FORT ECLAIREMENT
La Fig. 10 représente la courbe Vph = f(Vp) GENOPTRODE EXEMPLE 4 : ANALYSE DE POLYNUCLEOTIDES (PN) A L'AIDE D'UNE VARIANTE DU DISPOSITIF SELON L'INVENTION (FIGURE 5), SELON LE DEUXIEME MODE DE MISE EN OEUVRE DU PROCEDE - VARIANTE (ii)
4.1. LE DISPOSITIF Le dispositif utilisé est celui décrit en Figure 5. La cellule de mesure et le capteur d'affinité sont ceux représentés sur la Figure 2. La lumière modulée est fournie au moyen d'une diode électroluminescente ; la puissance lumineuse utilisée est de lO mW/cm2.
4.2. CONDITIONS EXPERIMENTALES ET FONCTIONNAUSATION Le liquide conducteur LC est une solution aqueuse de 10 M tris(hydromethyl)aminomethane hydrochloride (Sigma) et 50 mM NaCl ; l'ensemble de la solution est à pH 7.1. La mesure est faite à température ambiante, soit 22° C, dans l'obscurité.
La structure Sc/Is-So est telle que décrite dans les exemples précédents. Dans cet exemple, les sondes sont des PNc, et plus précisémment des oligos dT de 20 bases, déposées sur la zone comme représenté en7.3 de la figure 2 à partir d'une solution composée de 20 μl de solution aqueuse de n-bromosuccinimide en concentration de 0,01 M ajoutée à 1 ml de solution aqueuse 1M NaHCO3 contenant des oligos (dT)20 en concentration de lmg/ml. La structure est laissée une nuit en contact avec la solution des Pnc, puis abondamment rincée avec le liquide LC, puis montée sur la cellule de mesure. Cette cellule est alors remplie de LC et la chaine de mesure initialisée.
4.3 RESULTATS
La Figure 11 donne la réponse en ΔVp au cours du temps de la structure fonctionnalisée Sc/Is-So où les sondes sont des oligo dT.
La courbe A correspond à la réponse obtenue lorsque le capteur est en contact avec une solution LC à laquelle on a ajouté des cibles (polynucleotides dC en concentration de lμg/ml) non complémentaire aux sondes fixées sur le capteur.
La courbe B correspond à la réponse obtenue lorsque le capteur est en contact avec une solution LC à laquelle on a ajouté des cibles (polynucleotides dA en concentration de 1 μg/ml) complémentaires aux sondes fixées sur le capteur.

Claims

REVENDICATIONS :
1 - Procédé d'identification et/ou de dosage de Substances Biologiques (SBC) présentes dans un milieu Liquide Conducteur LC, à l'aide d'au moins un capteur d'affinité comprenant au moins une structure comportant au moins un matériau semi-conducteur Se, revêtu sur au moins l'une de ses faces d'au moins une couche d'isolant Is, cette dernière présentant à sa surface au moins une sonde So, en contact avec le milieu conducteur LC et comprenant une ou plusieurs Substances Biologiques de Reconnaissance spécifique par interaction affine (SBR), des SBC du milieu LC sus-visé, caractérisé en ce qu'il consiste essentiellement à :
- a - sélectionner à titre de sonde(s) So, des SBR non-marquées,
- b - faire en sorte que le niveau de Fermi du Se corresponde sensiblement au, ou passe par le niveau intrinsèque en surface du Se, - c - soumettre le Se à un éclairement périodique comprenant des photons dont l'énergie est > à l 'énergie de la bande interdite du Se,
- d - mesurer directement ou indirectement les variations ΔVbp du potentiel de bandes plates Vbp du Se, induites par un phénomène d'effet de charges directement et essentiellement lié aux appariements spécifiques des SBC du milieu conducteur LC avec leurs ligands complémentaires SBR de la ou des sondes So, à l'exclusion : (i) des variations résultant d'éventuels effets de charges et/ou de transferts de charges provoqués par des réactions chimiques catalysées par des enzymes et dans lesquelles se produit une consommation d'une partie des substances à détecter, (ii) et des variations de la photoréponse liées à l'apparition dans le milieu LC d'au moins un produit traceur susceptible d'être révélé au travers de variations de pH ou de potentiel Redox, et/ou au travers de marqueurs, de préférence du type de ceux absorbant ou émettant des radiations (fluorescents, radioactifs, colorés, e.g.). - e - et interpréter les signaux recueillis en termes d'identification et/ou de dosage des SBC du LC. 2 - Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que les SBC sont des polynucleotides PN et en ce que les SBR sont des polynucleotides PNc.
3 - Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé
• en ce que, dans l'étape b, on polarise le Se par rapport au LC en imposant une tension de polarisation Vp selon un balayage entre une tension négative et une tension positive limites, choisies de telle sorte que le niveau de Fermi du Se passe par son niveau intrinsèque en surface, Vp évoluant ainsi avantageusement dans une gamme de tension correspondant au régime de désertion et de faible inversion du Se, • et en ce que, selon l'étape d, on mesure ΔVbp :
> en recueillant le photopotentiel Vph aux bornes du Se, (entre Se et LC) et/ou le photocourant Iph,
> en calculant éventuellement les impédances optoélectrochimiques en phase Zop et/ou en quadrature Zoq, pour chaque valeur de Vp, > en établissant la (ou les) courbe(s) Zop et/ou Zoq et/ou Vph et/ou
Iph en fonction de Vp,
> et en suivant le déplacement de cette (ou ces) courbe(s) parallèlement à l'axe des abscisses (potentiels Vp), ledit déplacement correspondant aux variations de Vbp recherchées. 4 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'on met en oeuvre un faible éclairement, sensiblement sinusoïdal.
5 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'on met en oeuvre un fort éclairement.
6 - Procédé selon les revendications 3 et 5, caractérisé en ce que, selon l'étape d, on appréhende les variations de Vbp : a en recueillant Vph et/ou Iph, en établissant la courbe Vph = f (Vp) et/ou Iph = f (Vp) ; a et en suivant le déplacement de cette (ces) courbe(s) parallèlement à l'axe des abscisses (potentiels Vp), ledit déplacement correspond aux ΔVbp recherchées.
7 - Procédé selon la revendication 1 et la revendication 3, caractérisé
• en ce que, dans l'étape b, on fixe le niveau de Fermi du (Se) sensiblement au niveau intrinsèque en surface du (Se), en imposant une tension de polarisation Vpi correspondant environ, à l'abscisse du point d'inflexion de la courbe Vph = f (Vp), ou Zoq = f (Vp) Iph = f (Vp) ; Vph, Zoq et Iph étant tels que défini dans la revendication 3, de telle sorte que l'ordonnée de ce point d'inflexion corresponde à environ Vph max/2, Zoq max/1 ou Iph max/2,
• et en ce que, selon l'étape d, on appréhende les variations de Vbp : (i) par la mesure de l'évolution de Vph et/ou Iph et/ou Zoq, (ii) et/ou par la prise en compte des variations de la tension de polarisation ΔVp, rendues nécessaires pour maintenir constant Vph max/2, Zoq max/2, ou Iph max/2, cet ajustement ΔVp étant le reflet de ΔVbp.
8 - Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que, pour la prise en compte (ii) de ΔVp ;
- on détecte vph,
- on amplifie éventuellement le signal vph,
- on redresse éventuellement ce signal de manière à disposer d'un signal continu v'ph, - on compare ce signal v'ph continu à un signal de référence U correspondant sensiblement à la valeur de v'ph max/2 (ordonnée de point d'inflexion de la courbe v' h = F(Vp), soit v'ph max/2),
- on recueille la différence Δ(V'ph-U) entre V 'ph et U,
- on amplifie éventuellement Δ(v'ph-U), - on applique Δ(v'ph-U) éventuellement amplifiée entre Se et LC en complément de Vp,
- on enregistre Δ(v'ph-U).
9 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que, pour l'étape c, on choisit la longueur d'onde de l'éclairement λ de telle sorte qu » e «lle soi •t supe -π •eure ou é .ga1le a λ1 0 = 1240 nm, de
E(énergie bande interdite) préférence comprise entre 100 et 3000 nm.
10 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que l'on met en oeuvre une mesure différentielle, en faisant intervenir dans le capteur d'affinité au moins une autre structure Sc Is de référence, dans laquelle Is n'est pas fonctionnalisé par So, et en suivant la différence entre les Vbp mesurées par les 2 capteurs, ainsi que la variation de cette différence.
11 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 10, caractérisé en ce que, (dans une étape préalable ao), on fonctionnalise la surface d'une couche d'isolant Is d'une même structure Sc/Is, par plusieurs sondes So différentes de par la nature des PNc qui les composent, et on réalise ensuite à l'aide de cette structure l'analyse de LC contenant différents substrats PN : - par éclairements successifs des zones de la surface de Fis, lesdites zones étant chacune fonctionnalisée par une même So (PNc identiques), la nature des So variant d'une zone à l'autre,
- et par recueil et interprétation des ΔVbp. 12 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 11, caractérisé en ce que les substrats à analyser PN sont choisis dans la liste suivante : nucléotides, oligonucléotides, polynucleotides, acides nucléiques (ADN/ ARN) et leurs mélanges.
13 - Dispositif pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce qu'il comprend : - au moins un capteur d'affinité formé par au moins une structure
Sc/Is-So dans laquelle la ou les sondes So comprennent des ligands SBR aptes à s'hybrider spécifiquement avec les substances biologiques SBC à analyser, contenues dans le milieu liquide conducteur LC, en provoquant un phénomène d'effet de charge, à F origine des ΔVbp du Se,
- des moyens de polarisation du Se par rapport au LC,
- des moyens d'éclairement du Se du capteur,
- des moyens de mesure du photopotentiel Vph ou du photocourant Iph, - des moyens de transformation des signaux recueillis en variation de
Vbp,
- et des moyens de calcul et d'interprétation des ΔVbp en termes d'identification et/ou de dosage des substances biologiques SBC.
14 - Dispositif selon la revendication 13 caractérisé en ce que la structure Sc/Is-So de son capteur d'affinité est formée par au moins une plaquette de Se de préférence en silicium, recouverte sur l'une de ses faces d'une couche Is d'isolant de préférence en silice, à la surface de laquelle sont fixées des sondes So sensibles comprenant des polynucleotides PNc de reconnaissance spécifique par hybridation, ce capteur comportant également au moins un contact ohmique permettant la connexion de la structure Sc Is-So, notamment, avec les moyens de polarisation et/ou les moyens de mesure de Vph ou Iph,
• et en ce qu'il comporte également au moins une électrode auxiliaire, éventuellement prévue sur la couche Is de la structure Sc/Is-So. 15 - Dispositif selon la revendication 13 ou 14 caractérisé en ce qu'il comprend des moyens d'évaluation de la variation du signal Vph par rapport à une référence U, ainsi que des moyens de correction de cette variation par action sur les moyens de polarisation.
16 - Dispositif selon l'une quelconque des revendications 13 à 15, caractérisé en ce que le capteur d'affinité comprend au moins une structure Sc/Is-So et au moins une structure de référence non fonctionnalisée par So, de manière à pouvoir réaliser une mesure différentielle.
17 - Dispositif selon l'une quelconque des revendications 13 à 15, caractérisé en ce que le capteur d'affinité comprend au moins une structure Sc/Is-So dans laquelle les sondes (So) sont de différentes natures, les sondes So de même nature étant regroupées dans une même zone sur la couche d'Is, chaque zone pouvant être éclairée séparément et/ou successivement par les moyens d'éclairement.
18 - Capteur d'affinité tel que défini dans l'une quelconque des revendications 13, 14, 16 et 17.
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